CN104561244A - 基于二代测序技术的微生物单细胞转录组分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于二代测序技术的微生物单细胞转录组分析方法,包括如下步骤：(1)微生物单细胞的分离；（2）总RNA的抽提；（3）总RNA的线性扩增；（4）RNA测序文库的构建；（5）RNA测序文库的分析。使用本发明的方法不仅可以实现对不同微生物细胞个体间的基因表达差异的分析，还可以实现对极端环境下不可培养的微生物进行单细胞水平的生理功能分析；此外，这一方法可以适用于真核生物单细胞的分析，肿瘤发生和演化、干细胞的诱导及发育等重要的生物学和医学研究领域等都有着非常广阔的应用。

Description

基于二代测序技术的微生物单细胞转录组分析方法

技术领域

本发明涉及的是一种分子生物学和转录组学分析的方法，具体是涉及一种基于二代测序技术的微生物单细胞转录组分析方法。

背景技术

非基于培养的单细胞基因组学技术已成功实现，并被应用于各种微生物生态学研究。而对微生物细胞进行分析的难点在于，大多数微生物，如细菌和古细菌细胞，有着难以有效裂解的细胞外膜结构；原核微生物的RNA半衰期短、稳定性低；此外，细胞大小远小于哺乳动物细胞（10～30皮克），因此细胞内的RNA分子的总浓度很低，大约为每个细胞4～10菲克,这一RNA浓度远低于真核生物细胞中的RNA浓度，为RNA抽提和分析提生了很多挑战。虽然针对真核生物单细胞的全转录组分析技术已经建立，但针对原核微生物单细胞的全转录组分析的技术一直没能够完全建立。

微生物学家过去通常假定在相同条件下生长的微生物细胞是均一的，可以通过其生理型、表型、基因型或其他参数的平均值进行表征。尽管一直以来这一共识被成功地用于众多研究并取得一定的成绩，然而最近的研究却表明，即使对于同源基因组完全相同的微生物种群，在细胞和分子水平的细胞异质性要远超出以前所认为的范围。研究表明，同源细胞群体中的异质性可能产生于单个基因的随机表达，而这种随机性一旦被放大到某个程度，将导致细胞水平上的异质性，并最终决定微生物种群内个体的不同命运。同时，自然界中复杂的化学、物理和生物因素，如微尺度下的化学梯度或温度差异、微生物间相互作用，甚至基因型的变化，都会进一步放大这种细胞间的异质性。现在人们逐渐认识到，使用分子或表型的平均值去衡量整个群体的性状，所得到的结论可能有失偏颇,只有从单细胞角度来研究才更接近真实状况,因此,很有必要从单细胞的水平来获得相关信息。

此外，对单一微生物细胞分析的另一个重要意义在于从环境中获取的99％以上的微生物无法在实验室中进行培养，因此不能使用传统的微生物学方法进行研究。同时，许多不可培养的微生物中可能包含有细菌和古细菌域的新属种。这可能与产生多种有价值的生物过程直接相关,如生物修复、微生物生产和封存甲烷与二氧化碳、替代能源、碳、氮和金属元素的全球循环。虽然单细胞基因组学技术已成功实现，由于其仅仅提供了细胞在遗传结构与代谢潜力方面的信息，而无法揭示代谢功能以及环境参数相关的基因的表达动力学数据。

发明内容

本发明的目的是提供能够提供对细胞的代谢功能及转录组表达的动力学数据的一种基于二代测序技术的微生物单细胞转录组分析方法。

本发明的第二个目的是提供一种上述方法的用途。

本发明的技术方案概述如下：

基于二代测序技术的微生物单细胞转录组分析方法,包括如下步骤：

(1)微生物单细胞的分离：

将新鲜微生物细胞培养样本，在常温下离心收集，立即悬浮于RNA保护剂RNALater溶液中；使用显微注射系统在倒置显微镜下进行单细胞的选取分离，并将分离得到的微生物单细胞重悬于RNALater溶液中；

（2）总RNA的抽提：

对步骤（1）所获取的微生物单细胞，利用美国ZYMO公司的ZYMO RNA MicroPrep试剂盒进行微生物单细胞总RNA的抽提操作；

（3）总RNA的线性扩增：

对步骤（2）所获取的微生物单细胞总RNA进行线性扩增，利用美国NuGen公司的NuGenOneDirect试剂盒，分别进行cDNA第一链的合成、cDNA第二链的合成、SPIA扩增、扩增产物的分离纯化，得到cDNA文库；

（4）RNA测序文库的构建：

对步骤（3）所获取的cDNA文库，使用美国NuGen公司的NuGen Encore试剂盒，按照试剂盒说明书进行RNA测序文库的构建;

（5）RNA测序文库的分析：

对步骤（4）所获取的RNA测序文库，使用美国Illumina公司的Solexa Sequencer测序仪，按照说明书进行RNA测序文库的分析。

上述方法用于制备原核生物单细胞或真核生物单细胞的RNA-Seq测序文库的应用。

本发明的优点：

基于现有技术对微生物单细胞分析的困难，本实验室通过微生物单细胞分析的每个步骤，如总RNA抽提，总RNA的线性扩增，以及用于RNA测序文库的构建的多种商业试剂盒的应用效果比较评价，获得了一套完整的技术流程，最终实现了对微生物单细胞进行基于二代测序技术的全转录组分析。使用本发明的方法不仅可以实现对不同微生物细胞个体间的基因表达差异的分析，还可以实现对极端环境下不可培养的微生物进行单细胞水平的生理功能分析；此外，这一方法可以适用于真核生物单细胞的分析，肿瘤发生和演化、干细胞的诱导及发育等重要的生物学和医学研究领域等都有着非常广阔的应用。

附图说明

图1为单细胞RNA线性扩增的示意图。

图2为单细胞cDNA文库末端修复的示意图。

图3为利用End-It DNA End-Repair Kit对cDNA文库进行末端补齐的示意图。

图4为单细胞转录组的主成分（Principle Component Analysis）分析图,显示细胞细胞间的转录组差异。

具体实施方式

下面对本发明的实施操作做详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施案例。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

本实施例选择原核微生物蓝细菌集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)为实验材料，该菌购自美国菌种保藏中心ATCC，菌株代码ATCC27184.对缺氮条件下生长的6个集胞藻6803单细胞的转录组（缺氮培养24和72小时）以及相对应时间的群体细胞转录组进行了分析。基于二代测序技术的微生物单细胞转录组分析方法,包括如下步骤：

（1）微生物单细胞的分离：

将新鲜微生物蓝细菌集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)细胞培养样本，在常温下离心收集，立即悬浮于RNA保护剂RNALater溶液中充分重悬；使用NARISHIGE IM-9C显微注射系统(Narishige,Tokyo,JP)在Olympus IX71倒置显微镜下进行单细胞的选取分离，并将分离得到的微生物单细胞重悬于RNALater溶液中；

（2）总RNA的抽提：

利用美国ZYMO公司的ZYMO RNA MicroPrep试剂盒对步骤（1）所获取的微生物单细胞进行总RNA的提取：

1)向细胞悬液中加入Lysis Buffer，充分混匀后，12,000x g离心1分钟；

2）向离心液中加入无水乙醇，充分混匀后，将混合液转移至Zymo-Spin IC Column中，12,000x g离心1分钟，弃去液体部分；

3）向Zymo-Spin IC Column中加入Prep Buffer，12,000x g离心1分钟，弃去液体部分；4）向Zymo-Spin IC Column中加入Wash Buffer，12,000x g离心1分钟，弃去液体部分并重复一次；

5)将Zymo-Spin IC Column在12,000x g离心2分钟，弃去液体部分；

6）将Zymo-Spin IC Column放于洁净的收集管上，加入6μl无RNase水，室温下静置1分钟后，10,000x g离心30秒，获得单细胞总RNA；

（3）总RNA的线性扩增：

对步骤（2）所获取的微生物单细胞总RNA进行线性扩增，利用美国NuGen公司的NuGenOneDirect试剂盒，分别进行cDNA第一链的合成、cDNA第二链的合成、SPIA扩增、扩增产物的分离纯化，得到cDNA文库；具体步骤为：

1）向步骤（2）中分离得到的单细胞总RNA中加入A1溶液，混合均匀后，65℃保温2分钟，降温至4℃；再向其中依次加入试剂盒本身提供的A2、A3、D1缓冲液，混合均匀后进行cDNA第一链合成；合成条件为：4℃保温2分钟，25℃保温30分钟，48℃保温30分钟，95℃保温5分钟，之后于4℃保温；

2）向合成好的第一链cDNA中依次加入试剂盒本身提供的B1、B2溶液，混合均匀后进行cDNA第二链合成；合成条件为：4℃保温1分钟，25℃保温10分钟，50℃保温30分钟，80℃保温20分钟，之后于4℃保温；

3）向合成好的cDNA第二链中加入RNAclean磁珠悬液并混匀，室温下保温20分钟后将试管放于SPRIPlate Super Magnet Plate上静置5分钟；移去液体并加入70%乙醇静置30秒清洗后，移去乙醇并重复清洗两次；室温下静置至少15分钟以风干磁珠；

4）向风干的磁珠中依次加入试剂盒本身提供的C1、C2、C3溶液并重悬磁珠，将重悬液转移至新的试管中并进行SPIA扩增，扩增条件为：4℃保温1分钟，47℃保温90分钟，95℃保温5分钟，之后于4℃保温；

5）将完成SPIA扩增的试管放在磁性分离板（SPRIPlate Super Magnet Plate）上静置5分钟，转移上清液至新的试管中，并向其中加入试剂盒本身提供的E1溶液，混合均匀后，95℃保温5分钟，降温至4℃；向其中依次加入试剂盒本身提供的E2、E3溶液，混合均匀后进行SPIA后修饰；反应条件为：4℃保温1分钟，30℃保温10分钟，42℃保温60分钟，75℃保温10分钟，之后于4℃保温；

6）向完成SPIA后修饰的溶液中加入试剂盒本身提供的缓冲液ERC并混匀，之后将混合液加入分离柱Qiagen MinElute Spin Column(Qiagen,Shanghai)，离心1分钟后弃去液体部分，加入Buffer PE，离心1分钟后弃去液体部分，再次离心2分钟；用滤纸吸取残余液体后，将MinElute Spin Column放于洁净的离心管上，向其中加入D1溶液，室温静置1分钟后，离心1分钟，得到纯化的单细胞cDNA文库；

（4）RNA测序文库的构建：

对步骤（3）所获取的cDNA文库，使用美国NuGen公司的NuGen Encore试剂盒(NuGgen,San Carlos,CA)，按照试剂盒说明书进行RNA测序文库的构建：

1）向步骤（3）中纯化得到的单细胞cDNA文库中依次加入试剂盒本身提供的ER1、ER2、ER3、D1溶液，混合均匀后进行末端修复；反应条件为：25℃保温30分钟，70℃保温10分钟，之后于4℃保温；

2）向完成末端修复的溶液中依次加入试剂盒本身提供的L1、L2、L3、D1溶液，混合均匀后进行连接；反应条件为：25℃保温10分钟，65℃保温10分钟，之后于4℃保温；

3）向完成连接的溶液中加入FR1、FR2溶液，混合均匀后进行最终修复；反应条件为：72℃保温2分钟，25℃保温；

4）向完成最终修复的溶液中加入RNAClean XP磁珠并混合均匀，室温下静置10分钟后放在磁铁上静置5分钟，移去上清液后加入70%乙醇静置30秒洗涤后移去上清液，并再次洗涤，移去上清液后静置10分钟，磁珠风干后移去磁铁并加入TE buffer，混合均匀后静置5分钟，放回磁铁上静置5分钟，将上清液转移至洁净试管中，得到纯化的RNA测序文库；

（5）RNA测序文库的分析：

对步骤（4）所获取的RNA测序文库，使用美国Illumina公司的Solexa Sequencer测序仪，按照常规的二代RNA测序方法进行RNA测序文库的分析。

表1：使用本发明的方法对蓝细菌单细胞转录组分析结果综合：

实施例2

cDNA文库的质量监控

将实施例1步骤（3）中得到的cDNA文库进行连接、转化、克隆，随机挑选克隆进行测序：

1）利用美国Epicentre公司的End-It DNA End-Repair Kit试剂盒对cDNA文库进行末端补齐，再利用CLONESMART Blunt Cloning Kits将纯化的cDNA文库与10X End-Repair Buffer、dNTP、ATP、End-Repair Enzyme Mix混合均匀，室温保温培育45分钟后，70℃保温10分钟终止反应。

2）利用CLONESMART Blunt Cloning Kits将末端补齐的cDNA文库与4X CloneSmart VectorPremix、CloneSmart DNA Ligase混合均匀，室温下保温培育30分钟后进行Escherichia coli转化构建克隆文库，并从文库中随机挑选单克隆进行测序分析。

实施例3

RNA测序文库的定量

利用美国KAPPA Biosystems公司的KAPPA Library Quantification Kit试剂盒对实施例1步骤（4）中得到的RNA测序文库进行定量测定：

1）用Library Dilution Buffer对待定量的文库样本进行1：500稀释，将稀释好的文库样本与DNA标品分别与KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix Containing Primer Premix混合，进行定量qPCR分析；qPCR条件为：95℃初始变性5分钟；95℃变性30秒，60℃延伸45秒，循环35次

2）根据qPCR的结果，利用DNA标品对待定量样品进行相对定量。

表2：KAPA Library Quantification Kit对RNA测序文库的定量结果

单位：nM

选择原核微生物蓝细菌集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)为实验材料仅是为了举例，证明此方法可以成功地应用于微小的原核微生物的单细胞转录组分析，但本发明同样可以应用于其他原核，真核微生物以及高等生物的单细胞转录组分析。

Claims (2)

1.基于二代测序技术的微生物单细胞转录组分析方法,其特征在于包括如下步骤：

(1)微生物单细胞的分离：

将新鲜微生物细胞培养样本，在常温下离心收集，立即悬浮于RNA保护剂RNALater溶液中；使用显微注射系统在倒置显微镜下进行单细胞的选取分离，并将分离得到的微生物单细胞重悬于RNALater溶液中；

（2）总RNA的抽提：

对步骤（1）所获取的微生物单细胞，利用美国ZYMO公司的ZYMO RNA MicroPrep试剂盒进行微生物单细胞总RNA的抽提操作；

（3）总RNA的线性扩增：

对步骤（2）所获取的微生物单细胞总RNA进行线性扩增，利用美国NuGen公司的NuGenOneDirect试剂盒，分别进行cDNA第一链的合成、cDNA第二链的合成、SPIA扩增、扩增产物的分离纯化，得到cDNA文库；

（4）RNA测序文库的构建：

对步骤（3）所获取的cDNA文库，使用美国NuGen公司的NuGen Encore试剂盒，按照试剂盒说明书进行RNA测序文库的构建;

（5）RNA测序文库的分析：

对步骤（4）所获取的RNA测序文库，使用美国Illumina公司的Solexa Sequencer测序仪，按照说明书进行RNA测序文库的分析。

2.权利要求1的方法用于制备原核生物单细胞或真核生物单细胞的RNA-Seq测序文库的应用。