CN109852608A - 一种昆虫肠道微生物dna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种昆虫肠道微生物DNA的提取方法。本发明提供的昆虫肠道微生物DNA的提取方法，通过呕吐剂处理昆虫获得昆虫肠道内容物，不涉及到宿主组织研磨和破碎过程，可避免宿主DNA和RNA污染，该方法操作简单、便捷、高效率，可在10min内获取高质量的昆虫幼虫的肠道内容物，与传统普遍方法相比，提取时间节省了12倍。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种昆虫肠道微生物DNA的提取方法。
背景技术
昆虫消化能力强、适应能力广，这和其肠道微生物有密切关系。相关研究表明昆虫肠道中含有大量的纤维素类水解酶，蛋白类水解酶、污染物降解酶等等，如何开发此类酶资源是目前的热点领域。此外，在昆虫的一些科学研究中常常要进行昆虫肠道菌群分析，昆虫肠道基因资源的开发以及相关基因转录热点研究等，因此获取昆虫肠道微生物DNA是满足这些需求的前提。但是昆虫肠道细小，难以从肠道内获取其内容物，而提取高纯度的DNA更是难上加难。现阶段，常采用抽取昆虫肠段的方法获取其肠道内容物，再通过内容物提取DNA，但其操作时间长、过程复杂，而且在操作过程中还可能将宿主DNA或RNA提取出来影响后续的研究。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种简单、便捷、高效率的昆虫肠道微生物DNA的提取方法。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：一种昆虫肠道微生物DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)用乙醇清洗昆虫体表，再使用无菌水进行清洗；
(2)将步骤(1)处理好的昆虫，用呕吐剂和无菌水进行处理，使得昆虫呕吐获得其肠道内容物；
(3)将步骤(2)所得肠道内容物进行离心，并收集含有肠道微生物群的沉淀；
(4)使用试剂盒对步骤(3)所得沉淀进行DNA提取，即获得所述DNA；
(5)对步骤(4)所得的DNA进行浓度和纯度检测。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(2)中，所述呕吐剂的浓度为0.01～1％，所述呕吐剂选自吐温-20、吐温-60、吐温-80、矿物油中的至少一种。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(2)中，所述呕吐剂为吐温-20，所述吐温-20的浓度为0.01～1％。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(3)中，所述肠道内容物的离心速度为600～12000rpm/min，离心时间为5min。
提取昆虫幼虫肠道微生物DNA的普遍方法，一种是直接在昆虫腹部破坏肠道，获得肠道内容物，另一中是传统的肠道微生物提取方法，即从昆虫尾部抽取肠段，然后加入石英砂研磨碎，再然后离心获得肠道内容物，此两种操作中很容易携带大量的宿主组织，导致肠道微生物群DNA中混有大量的宿主DNA或RNA，不利于获取较纯的肠道微生物群DNA。根据本发明的提取昆虫幼虫肠道微生物DNA的方法，加入呕吐剂，获得其内容物，该方法操作简便、快捷、高效，能够获得较高浓度的DNA，同时能够保证肠道微生物群DNA的纯度，将宿主DNA或RNA的污染降低到最小，对后续肠道微生物群的基因组测序研究、基因挖掘等具有重要意义。
作为本发明的优选实施方式，所述昆虫为选自双翅目、鳞翅目、同翅目、直翅目、蜚蠊目、膜翅目、半翅目和鞘翅目昆虫中的至少一种。
作为本发明的优选实施方式，所述昆虫选自双翅目和鞘翅目昆虫中的至少一种。
作为本发明的优选实施方式，所述昆虫为黑水虻幼虫和大麦虫。黑水虻隶属于昆虫纲双翅目昆虫，其幼虫含有较多的蛋白质、脂肪、微量元素和丰富的氨基酸、矿物质，是家禽、家畜和鱼类良好的饲料来源。大麦虫隶属于昆虫纲鞘翅目昆虫，其含有多种糖类、氨基酸、维生素、激素、酶及矿物质磷、铁、钾、钠、钙，具有很高的营养价值和药用价值。以黑水虻幼虫和大麦虫为例，提供一种高效地、专门用于昆虫幼虫(即无翅类昆虫除外)肠道微生物群的DNA提取方法，为开展肠道微生物结构及功能的研究、以及进一步探讨肠道微生物与昆虫的共生关系奠定基础。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(1)中，使用所述无菌水进行清洗3～6次；所述步骤(2)中，所述无菌水的加入量为50～100ml。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(4)中，所述试剂盒为Qiagen试剂盒；进一步的，Qiagen试剂盒为QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit。
与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明提供的昆虫肠道微生物DNA的提取方法，通过呕吐剂处理昆虫获得昆虫肠道内容物，不涉及到宿主组织研磨和破碎过程，可避免宿主DNA和RNA污染；本发明提供的昆虫肠道微生物DNA的提取方法，操作简单、便捷、高效率，该方法可在10min内获取高质量的昆虫幼虫的肠道内容物，与传统普遍方法相比，提取时间节省了12倍。
附图说明
图1为本发明的实施例1、对比例1和对比例2分别采用不同方法获得的黑水虻幼虫肠道内容物图；
图2为本发明的实施例1、对比例1和对比例2分别采用不同方法提取的黑水虻幼虫肠道微生物DNA的三元相图；
图3为本发明的实施例1、对比例1和对比例2分别采用不同方法提取的黑水虻幼虫肠道微生物DNA在属水平上的菌群构成结果图；
图4为本发明的实施例1和对比例2分别采用不同方法提取的黑水虻幼虫肠道微生物DNA的observed species和Chao1指数比较结果图；
图5为实施例2和对比例3分别采用不同方法提取的大麦虫幼虫肠道微生物DNA的浓度和纯度结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例是用本发明所述昆虫肠道微生物DNA的提取方法对黑水虻幼虫肠道微生物DNA的提取：
一种黑水虻幼虫肠道微生物DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)取黑水虻幼虫100条，用70％乙醇清洗昆虫体表，再使用无菌水进行清洗6次；
(2)将步骤(1)处理好的昆虫，置于试管中，加入无菌水50ml，然后再加入0.1％吐温-20，使得昆虫呕出其肠道内容物；
(3)将步骤(2)所得肠道内容物收集于离心管中以12000rpm/min的转速离心5min，并收集含有肠道微生物群的沉淀；
(4)使用Qiagen试剂盒(QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit)对步骤(3)所得沉淀进行DNA提取，即获得所述DNA；
(5)对步骤(4)所得的DNA用Nanodrop One测定其浓度，用紫外分光光度法测其纯度。
试验结果:步骤(5)重复三次，取平均值，获得肠道内容物如图1中的HF3所示，提取DNA的时间、浓度和纯度如表1中的HF3-1、HF3-2、HF3-3所示。
实施例2
本实施例是用本发明所述昆虫肠道微生物DNA的提取方法对大麦幼虫肠道微生物DNA的提取：
一种大麦幼虫肠道微生物DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)取大麦虫幼虫100条，用70％乙醇清洗昆虫体表，再使用无菌水进行清洗3次；
(2)将步骤(1)处理好的昆虫，置于试管中，加入无菌水50ml，然后再加入0.1％吐温-20，使得昆虫呕出其肠道内容物；
(3)将步骤(2)所得肠道内容物收集于离心管中以600rpm/min的转速离心5min，并收集含有肠道微生物群的沉淀；
(4)使用Qiagen试剂盒(QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit)对步骤(3)所得沉淀进行DNA提取，即获得所述DNA；
(5)对步骤(4)所得的DNA用Nanodrop One测定其浓度，用紫外分光光度法测其纯度。
试验结果:步骤(5)重复三次，取平均值，获得DNA的浓度和纯度如图5中的DM1所示。
对比例1
本对比例用现有技术中已知的一种方法对黑水虻幼虫肠道微生物DNA的提取：
一种黑水虻幼虫肠道微生物DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)取黑水虻幼虫100条，用70％乙醇清洗昆虫体表，再使用无菌水进行清洗6次；
(2)用刀片破坏每条黑水虻的腹部，使其肠道内容物流出；
(3)将步骤(2)所得肠道内容物收集于离心管中以12000rpm/min的转速离心5min，含有肠道微生物群的沉淀；
(4)使用Qiagen试剂盒(QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit)对步骤(3)所得沉淀进行DNA提取，即获得所述DNA；
(5)对步骤(4)所得的DNA用Nanodrop One测定其浓度，用紫外分光光度法测其纯度。
试验结果:步骤(5)重复三次，取平均值，获得肠道内容物如图1中的HF1所示，提取DNA的时间、浓度和纯度如表1中HF1-1、HF1-2和HF1-3所示。
对比例2
本对比例用现有技术中已知的另一种方法对黑水虻幼虫肠道微生物DNA的提取：
一种黑水虻幼虫肠道微生物DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)取黑水虻幼虫100条，用70％乙醇清洗昆虫体表，再使用无菌水进行清洗6次；
(2)用镊子从每条黑水虻的尾部抽取肠段，然后加入石英砂研磨粉碎，将研磨后的混合物液加入离心管中，以600rpm/min的转速离心去除组织；
(3)取步骤(2)离心管中的上层液加入另一离心管中，以12000rpm/min的转速离心5min，并收集含有肠道微生物群的沉淀
(4)使用Qiagen试剂盒(QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit)对步骤(3)所得沉淀进行DNA提取，即获得所述DNA；
(5)对步骤(4)所得的DNA用Nanodrop One测定其浓度，用紫外分光光度法测其纯度。
试验结果:步骤(5)重复三次，取平均值，获得肠道内容物如图1中的HF2所示，提取DNA的时间、浓度和纯度如表1中的HF2-1、HF2-2、HF2-3所示。
对比例3
本对比例用现有技术中已知的一种方法对大麦虫幼虫肠道微生物DNA的提取：
一种大麦虫幼虫肠道微生物DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)取大麦虫幼虫100条，用70％乙醇清洗昆虫体表，再使用无菌水进行清洗3次；
(2)用镊子从每条黑水虻的尾部抽取肠段，然后加入石英砂研磨粉碎，将研磨后的混合物液加入离心管中，以600rpm/min的转速离心去除组织；
(3)取步骤(2)离心管中的上层液加入另一离心管中，以12000rpm/min的转速离心5min，并收集含有肠道微生物群的沉淀；
(4)使用Qiagen试剂盒(QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit)对步骤(3)所得沉淀进行DNA提取，即获得所述DNA；
(5)对步骤(4)所得的DNA用Nanodrop One测定其浓度，用紫外分光光度法测其纯度。
试验结果:步骤(5)重复三次，取平均值，获得DNA的浓度和纯度如图5中的DM2所示。
一、昆虫肠道内容物和其DNA提取结果分析
1.实施例1、对比例1和对比例2分别采用不同的方法对黑水虻肠道内容物进行提取，并对内容物中微生物的DNA进行了提取，其结果如图1和表1所示，分析如下：
表1不同方法提取黑水虻幼虫肠道内容物DNA浓度、纯度和耗费时间
从图1可以看出，实施例1获取的黑水虻幼虫肠道内容物HF3、对比例2获取的黑水虻幼虫肠道内容物HF2，两者明显多于对比例1获取的肠道内容物HF1，但是HF2与HF3相比，HF2能够看到肠道组织碎片，这样提取的肠道微生物DNA中有可能包含宿主组织的DNA或RNA，从而影响后续的分析。
从表1可知，实施例1、对比例1和对比例2获得肠道内容物分别为HF3、HF1和HF2，无论是从DNA浓度还是纯度上，对比例1的方法获取黑水虻幼虫肠道内容物的DNA和实施例1、对比例2都相差较大，而对比例2和实施例1获取的肠道内容物DNA浓度和纯度相对较高；但是对比例2获取肠道内容物的方法需要抽取昆虫肠段，提取DNA耗时2h，是实施例1提取方法的12倍，由此可见，实施例1的提取方法更为高效。
综上所述，实施例1获取的黑水虻幼虫肠道内容物多且不存在包含宿主组织的DNA或RNA的可能；实施例1的方法提取黑水虻幼虫肠道内容物的DNA不仅浓度和纯度高，而且提取效率高，由此可见，实施例1采用本发明的方法提取黑水虻幼虫肠道微生物DNA无论在浓度和纯度上，还是提取效率上均好于对比例1和对比例2。
2.实施例2与对比例3分别采用不同方法对大麦虫幼虫肠道内容物进行提取，并对内容物中微生物的DNA进行了提取，其结果如图5所示，分析如下：
从图5可知，采用实施例2的方法获得大麦虫肠道内容物的DNA浓度DM1明显高于对比例3的DNA浓度DM2，实施例2获得DNA纯度，即A260/280和A260/230的值也明显高于对比例3，由此可见，实施例2采用本发明的方法提取大麦虫幼虫肠道微生物DNA在浓度上和纯度上要高于对比例3。
二、对实施例1、对比例1和对比例2提取的黑水虻幼虫肠道微生物DNA进行16s V3-V4区高通量测序，分析其菌群多样性和结构。
首先，在各个分类水平(Phylum、Class、Order、Family、Genus)下，比较样本之间优势物种的差异，分别选取实施例1、对比例1和对比例2三种方法提取的黑水虻幼虫肠道微生物DNA在各分类水平上平均丰度排名前10的物种，生成ternaryplot(三元相图)，以便直观查看在不同分类水平上三组样本优势物种的差异，结果如图2所示。
其次，比较实施例1、对比例1和对比例2的DNA样品在属水平上平均丰度排名前十的物种，结果如图3所示。
第三，进一步通过observed species和Chao1指数比较实施例1和对比例2两种方法提取的黑水虻幼虫肠道微生物DNA中包含物种的丰富度，结果如图4所示。
从图2可知，实施例1、对比例1和对比例2三种方法提取的黑水虻幼虫肠道微生物DNA在各分类水平上的平均丰度，HF1和HF2有142个相似OTU，HF2和HF3有150个相似OTU，HF1和HF3有155个相似OTU，说明从获得样本优势物种所占比例上比较，实施例1的提取法对优势物种DNA提取效果优于对比例1和对比例2。
从图3可知，对比例1的提取方法对Morganella sp.的提取效果不佳，而实施例1和对比例2的提取方法获得的菌群多样性较高，能够反映黑水虻幼虫肠道内菌群的真实构成情况。
依据observed species和Chao1指数越高说明物种的丰度度越高，提取DNA中包含的物种信息越多，肠道微生物DNA的提取效果越好，从图4可知，HF2和HF3在统计学上没有差异(P＞0.05)，但是HF3的observed species指数和Chao1指数均高于HF2，说明实施例1的提取方法获得黑水虻幼虫肠道内菌群物种的丰度、DNA中包含的物种信息和肠道微生物DNA的提取效果均好于对比例2。
综上所述，实施例1提取黑水虻幼虫肠道微生物DNA的方法，通过呕吐剂处理昆虫获得昆虫肠道内容物，操作简单、便捷、高效率，还可避免宿主DNA和RNA的污染，提取的DNA的浓度、纯度均较高，能够真实的反应昆虫肠道内微生物的真实构成情况和物种丰度。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种昆虫肠道微生物DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用乙醇清洗昆虫体表，再使用无菌水进行清洗；
(2)将步骤(1)处理好的昆虫，用呕吐剂和无菌水进行处理，使得昆虫呕吐获得其肠道内容物；
(3)将步骤(2)所得肠道内容物进行离心，并收集含有肠道微生物群的沉淀；
(4)使用试剂盒对步骤(3)所得沉淀进行DNA提取，即获得所述DNA；
(5)对步骤(4)所得的DNA进行浓度和纯度检测。
2.根据权利要求1所述的昆虫肠道微生物DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述呕吐剂的浓度为0.01～1％，所述呕吐剂选自吐温-20、吐温-60、吐温-80、矿物油中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的昆虫肠道微生物DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述呕吐剂为吐温-20，所述吐温-20的浓度为0.01～1％。
4.根据权利要求1所述的昆虫肠道微生物DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述肠道内容物的离心速度为600～12000rpm/min，离心时间为5min。
5.根据权利要求1所述的昆虫肠道微生物DNA的提取方法，其特征在于，所述昆虫选自双翅目、鞘翅目、鳞翅目、同翅目、直翅目、蜚蠊目、膜翅目和半翅目昆虫中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的昆虫肠道微生物DNA的提取方法，其特征在于，所述昆虫选自双翅目和鞘翅目昆虫中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的昆虫肠道微生物DNA的提取方法，其特征在于，所述昆虫为黑水虻幼虫和大麦虫。
8.根据权利要求1所述的昆虫肠道微生物DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中，使用所述无菌水进行清洗3～6次；所述步骤(2)中，所述无菌水的加入量为50～100ml。
9.根据权利要求1所述的昆虫肠道微生物DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述试剂盒为Qiagen试剂盒。
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