CN101294218B - 三疣梭子蟹ptssr36微卫星DNA标记的检测技术 - Google Patents
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Abstract
一种三疣梭子蟹ptssr36微卫星DNA标记的检测技术，其特点是：首先提取三疣梭子蟹基因组DNA并稀释备用；再利用三疣梭子蟹基因组文库中的ptssr36微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对三疣梭子蟹不同地理群或三疣梭子蟹群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得三疣梭子蟹在ptssr36核心序列区高度遗传变异的多态性图谱。可快捷的获得三疣梭子蟹的ptssr36遗传标记基因座位呈现高度遗传变异的多态性图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出三疣梭子蟹在此位点的每个个体的基因型。主要应用于三疣梭子蟹群体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建等。
Description
技术领域
本发明属于三疣梭子蟹微卫星DNA分子遗传标记技术，具体说是一种三疣梭子蟹ptssr36微卫星DNA标记的检测技术。
背景技术
本发明做出之前，国内外在其他蟹类中有相关的研究报道，Pamela C.Jensen等在对邓杰内斯蟹(Cancer magister)的研究中，设计了99个微卫星引物，并对其中的9个进行了合成。在进一步的研究中，依据其扩增产物的多态性情况、等位基因大小和是否易于计数等特点选取了6个引物应用于进一步的研究。利用尼龙膜杂交法，Masatsugu takhano等在锯缘青蟹(正蟳，Scyllaserrata)中发现5个具有可变性的微卫星位点。David Gopurenko等在锯缘青蟹(沙蟳，Scylla paramamosain)的研究中筛选到5个微卫星位点。利用常规方法，E.S Yap等在远海梭子蟹(Portunus pelagicus)中筛选到7个含有二核苷酸重复单元、1个含有四核苷酸重复单元的微卫星位点。O.Puebla等在蛛雪蟹(Chionoecetes opilio)中筛选出5个微卫星标记。H.S.AN等利用PCR筛选法，在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)基因组富集文库中筛选出9个新的微卫星位点。B.
等在中华绒螯蟹中筛选到12个具有高度多态性的微卫星位点。这些重要经济蟹类的微卫星DNA标记的开发，已应用于亲缘关系鉴定、种群多样性研究中。目前在国内，除常玉梅等报道了中华绒螯蟹微卫星DNA的筛选情况外，很少有蟹类微卫星方面的研究报道。至今为止，尚未见有三疣梭子蟹微卫星DNA检测技术方面的报道。
微卫星(microsatellites)或称简单序列重复(simple sequence repeats，SSR)是指由1～6个核苷酸组成的简单串联重复DNA序列。迄今研究过的所有生物种类中都发现了它的存在，并且分布密度很大。由于微卫星广泛分布于基因组中，具有密度大、多态性丰富、高度杂合且稳定性好、遵循孟德尔分离定律共显性遗传、易于PCR扩增等特点，已成为近年来最引人注目的新型DNA标记，并广泛应用于生物资源的家系谱系认证、基因连锁分析、遗传图谱构建、种质鉴定、种群遗传多样性等许多研究领域。
发明内容
本发明的目的是提出一种三疣梭子蟹ptssr36微卫星DNA标记的检测技术，主要利用建立的三疣梭子蟹部分基因组文库中的ptssr36的微卫星DNA序列，使用Oligo(Version 6.31)和Primer Premier(Version 5.00)软件在其核心序列的两端设计相应的PCR引物，将引物序列合成后对三疣梭子蟹的个体进行PCR检测，从而快速地检测三疣梭子蟹每个个体在此微卫星区的遗传变异，获得该引物对三疣梭子蟹在ptssr36序列区的遗传变异图谱，通过该图谱直观地表现出每个个体的基因型。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种三疣梭子蟹ptssr36微卫星DNA标记的检测技术，其特征在于其技术操作程序为：首先提取三疣梭子蟹基因组DNA并稀释备用；再利用三疣梭子蟹基因组文库中的ptssr36微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对三疣梭子蟹不同地理群或三疣梭子蟹群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得三疣梭子蟹在ptssr36核心序列区高度遗传变异的多态性图谱。
提取三疣梭子蟹基因组DNA，将其稀释为50ng/μl，每个PCR反应中加入2μl，反应总体积为25μl。
ptssr36微卫星核心序列的特异性引物序列分别为：正链5’-GGTCTATCAAGGCGTTACAGG-3’，负链3’-GTGGAATCAGTGGAGGAGGAAG-5’，使用该引物时的退火温度为53℃。
PCR扩增的加样参数为：每个PCR反应总体积为25μl，包括100ng三疣梭子蟹基因组DNA；10X PCR Buffer，2.5μl；Mg++ 2.0mmol/L；Tag酶1u；dNTP各0.1mmol/L；本发明的引物各0.2μmol/L；加ddH2O至25μl。使用该引物时设置PCR仪的程序参数为：94℃变性2min；94℃40sec，53℃1min，72℃，1min，25个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
PCR产物的检测：将PCR产物在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，12W恒功率电泳1～1.5h进行分离。将胶板通过10％的冰醋酸溶液20min→蒸馏水6min→0.1％的硝酸银溶液25min→3％的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应即可得到三疣梭子蟹在ptssr36基因座位高度遗传变异的多态性图谱。
应用该引物和所述的技术方法，可以检测三疣梭子蟹的每个个体在ptssr36微卫星核心区的遗传变异，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱即可读出基因型，方便、快捷、准确。其次，相对于其它分子遗传标记技术而言微卫星标记符合孟德尔遗传模式，呈共显性遗传，因此，可以区分个体是纯合子和杂合子状态。
本发明适用于三疣梭子蟹群体遗传标记、系谱认证、遗传图谱构建等应用。ptssr36的PCR引物是本发明的核心，可在三疣梭子蟹总群检测中呈现高度遗传变异的多态性。
本发明技术具有以下优点：
(1)本发明可快捷的获得三疣梭子蟹的ptssr36遗传标记基因座位呈现高度遗传变异的多态性图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出三疣梭子蟹在此位点的每个个体的基因型；
(2)本发明主要应用于三疣梭子蟹群体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建等。
附图说明
图1本发明的ptssr36引物对三疣梭子蟹20个个体的检测图谱，编号1-20是三疣梭子蟹的20个个体，M是DL2000标准分子量。
具体实施方式
下面通过实施例详细叙述本发明在三疣梭子蟹ptssr36微卫星核心序列DNA分子遗传标记技术方法。首先提取三疣梭子蟹基因组DNA并稀释备用；再利用三疣梭子蟹基因组文库中的含有ptssr36微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对三疣梭子蟹不同地理群或三疣梭子蟹群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得三疣梭子蟹在ptssr36核心序列区高度遗传变异的多态性图谱。
1、三疣梭子蟹基因组DNA的提取：取肌肉组织100mg，剪碎后放入1.5ml离心管中，加入pH8.0的TE溶液(10mmol/L Tris-CI，10mmol/L EDTA)500μl，用研磨棒研磨。加入10％SDS溶液25μl，混匀。加入20mg/ml蛋白酶K4μl，混匀，55℃消化2.5～3h。重蒸酚抽提两次，每次10min，12000转/min离心5min，取上清；酚∶氯仿(1∶1)抽提一次，10min，12000转/min离心5min，取上清；氯仿抽提一次5min，5000g离心5min，取上清。加入1/25体积的5mol/L NaCl溶液，混匀后再加入两倍体积的-20℃的无水乙醇沉淀DNA15min；挑出的DNA，用70％的乙醇洗涤数十分钟，使DNA干燥，用灭菌水500μl充分溶解后，定量将其稀释成50ng/μl的浓度备用。
2、微卫星引物的设计：在三疣梭子蟹基因组文库基础上，利用微卫星DNA两侧的序列在同一物种相对于核心序列的高度保守性，在ptssr36核心序列的两端设计特异性引物，用其扩增出该位点的微卫星DNA片段。由于微卫星核心序列突变率相对较高，造成微卫星DNA核心序列重复次数的增加或减少，即微卫星DNA序列长度的变化，这是检测微卫星多态性的主要依据。本发明的ptssr36微卫星核心序列区域两端的特异性引物序列为：正链5’-GGTCTATCAAGGCGTTACAGG-3’，负链3’-GTGGAATCAGTGGAGGAGGAAG-5’，使用该引物时，其退火温度是53℃。
3、PCR扩增：
首先加样，加样量如下：三疣梭子蟹基因组DNA(50ng/μl)，2μl；10XPCR Buffer，2.5μl；Mg++(25mmol/L)，2μl；Tag酶(5u/μl)，0.2μl；dNTP(各2.5mmol/L)，2μl；本发明的引物(各10Pmol/μl)，2μl；加灭菌水至25μl。其次，进行PCR反应，其PCR扩增仪程序参数为：94℃变性2min；94℃40sec，53℃1min，72℃1min，25个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
4、PCR产物的检测：PCR反应结束后，将产物在8％的变性聚丙烯酰氨的凝胶中进行电泳，电泳仪的功率为12瓦，电泳的时间在1～1.5h左右，即可终止。将胶板通过10％的冰醋酸溶液20min→蒸馏水6min→0.1％的硝酸银溶液25min→3％的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应即得到如图1所示的多态性图谱。
Claims (4)
1.一种三疣梭子蟹ptssr36微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于其技术操作程序为：首先提取三疣梭子蟹基因组DNA并稀释备用；再利用三疣梭子蟹基因组文库中的ptssr36微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对三疣梭子蟹不同地理群或三疣梭子蟹群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得三疣梭子蟹在ptssr36核心序列区高度遗传变异的多态性图谱；ptssr36微卫星核心序列的特异性引物序列分别为：正链5’-GGTCTATCAAGGCGTTACAGG-3’，负链3’-GTGGAATCAGTGGAGGAGGAAG-5’，使用该引物时的退火温度为53℃。
2.按照权利要求1所述的三疣梭子蟹ptssr36微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于提取三疣梭子蟹基因组DNA，将其稀释为50ng/μl，每个PCR反应中加入2μl，反应总体积为25μl。
3.按照权利要求1所述的三疣梭子蟹ptssr36微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于其PCR扩增的加样参数为：每个PCR反应总体积为25μl，包括100ng三疣梭子蟹基因组DNA；10X PCR Buffer，2.5μl；Mg++2.0mmol/L；Tag酶1u；dNTP各0.1mmol/L；本技术的引物各0.2μmol/L；加ddH2O至25μl；使用该引物时设置PCR仪的程序参数为：94℃变性2min；94℃40sec，53℃1min，72℃，1min，25个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
4.按照权利要求1所述的三疣梭子蟹ptssr36微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于对PCR产物的检测：将PCR产物在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，12W恒功率电泳1～1.5h进行分离；将胶板通过10％的冰醋酸溶液20min→蒸馏水6min→0.1％的硝酸银溶液25min→3％的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应即可得到三疣梭子蟹在ptssr36基因座位高度遗传变异的多态性图谱。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20110601 |