CN102162009B

CN102162009B - 日本蟳Jassr131微卫星DNA标记的检测方法

Info

Publication number: CN102162009B
Application number: CN2011100437166A
Authority: CN
Inventors: 刘萍; 李健; 宋春妮
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2011-02-19
Filing date: 2011-02-19
Publication date: 2013-02-13
Anticipated expiration: 2031-02-19
Also published as: CN102162009A

Abstract

一种日本蟳Jassr131微卫星DNA标记的检测方法，其特点是：首先提取日本蟳基因组DNA并稀释备用；再利用日本蟳微卫星富集文库中的Jassr131微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对日本蟳不同地理群或群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得日本蟳在Jassr131核心序列区高度遗传变异的多态性图谱。Jassr131微卫星核心序列的特异性引物序列分别为：正链5’-CCAGGGAATTGAAACACT-3’，负链3’-TATGAAGGCTCTGCGAAA-5’，退火温度为50℃。方法简便，所得结果可直观地检测出日本蟳在此位点的每个个体的基因型。

Description

日本蟳Jassr131微卫星DNA标记的检测方法

技术领域

本发明属于日本蟳微卫星DNA分子遗传标记技术，具体说是一种日本蟳Jassr131微卫星DNA标记的检测方法。

背景技术

本发明做出之前，国内外在其他蟹类中有相关的研究报道，Pamela C.Jensen等在对邓杰内斯蟹(Cancer magister)的研究中，设计了99个微卫星引物，并对其中的9个进行了合成。利用尼龙膜杂交法，Masatsugu takhano等在锯缘青蟹(正蟳，Scylla serrata)中发现5个具有可变性的微卫星位点。David Gopurenko等在锯缘青蟹(沙蟳，Scylla paramamosain)的研究中筛选到5个微卫星位点。利用常规方法，E.S Yap等在远海梭子蟹(Portunuspelagicus)中筛选到7个含有二核苷酸重复单元、1个含有四核苷酸重复单元的微卫星位点。H.S.AN等利用PCR筛选法，在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)基因组富集文库中筛选出9个新的微卫星位点。B.

等在中华绒螯蟹中筛选到12个具有高度多态性的微卫星位点。国内的宋来鹏、李晓萍等从基因组文库和微卫星富集文库中筛选了30多个多态性的微卫星标记，并进行了标记多态信息含量做出了评价；刘磊等应用这些标记进行了家系鉴定的系谱认证分析；罗云等将这些标记应用到日本蟳遗传图谱构建中。至今为止，尚未见有关日本蟳微卫星DNA检测技术方面的报道。

微卫星(microsatellites)或称简单序列重复(simples equence repeats，SSR)是指由1～6个核苷酸组成的简单串联重复DNA序列。迄今研究过的所有生物种类中都发现了它的存在，并且分布密度很大。由于微卫星广泛分布于基因组中，具有密度大、多态性丰富、高度杂合且稳定性好、遵循孟德尔分离定律共显性遗传、易于PCR扩增等特点，已成为近年来最引人注目的新型DNA标记，并广泛应用于生物资源的家系谱系认证、基因连锁分析、遗传图谱构建、种质鉴定、种群遗传多样性等许多研究领域。

发明内容

本发明是针对目前尚未有对日本蟳微卫星DNA检测技术公开的现状，提出一种日本蟳Jassr131微卫星DNA标记的检测方法，可快捷的获得日本蟳的Jassr131遗传标记基因座位呈现高度遗传变异的多态性图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出日本蟳在此位点的每个个体的基因型。

本发明检测技术主要利用磁珠富集法建立的日本蟳微卫星富集文库中Jassr131的微卫星DNA序列，使用Primer(Version 5.00)软件在其核心序列的两端设计相应的PCR引物，将引物序列合成后对日本蟳个体进行PCR扩增，从而快速地检测日本蟳每个个体在此微卫星区的遗传变异，从而获得该引物对日本蟳在Jassr131序列区的遗传变异图谱，通过该图谱直观地表现出每个个体的基因型。

本发明的技术方案是：一种日本蟳Jassr131微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于，操作程序为：首先提取日本蟳基因组DNA并稀释备用；再利用日本蟳基因组文库中的Jassr131微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对日本蟳不同地理群或群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得日本蟳在Jassr131核心序列区高度遗传变异的多态性图谱；Jassr131微卫星核心序列的特异性引物序列分别为：正链5’-CCAGGGAATTGAAACACT-3’，负链3’-TATGAAGGCTCTGCGAAA-5’，使用该引物时的退火温度为50℃。

对上述技术方案的改进：提取日本蟳基因组DNA，将其稀释为50ng/μL，每个PCR反应中加入3μL，反应总体积为20μL。

对上述技术方案的进一步改进：所述PCR扩增的加样参数为：每个PCR反应总体积为20μL，包括50ng日本蟳基因组DNA3μL；2.5mmol/L dNTP 1.6μL；含15mmol/L Mg²⁺的10×PCR Buffer2μL；5U/μL Taq0.2μL；本发明的引物10mmol/L各1μL；最后加ddH₂O至20μL；使用该引物时设置PCR仪的程序参数为：95℃预变性5min；95℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃再延伸10min；4℃保存。

对上述技术方案的进一步改进：对PCR产物的检测：将PCR产物在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，12W恒功率电泳1～1.5h进行分离；将胶板通过10％的冰醋酸溶液20min→蒸馏水6min→0.1％的硝酸银溶液25min→3％的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应即可得到日本蟳在Jassr131基因座位高度遗传变异的多态性图谱。

应用上述引物和检测技术可以检测日本蟳的每个个体在Jassr131微卫星核心区的遗传变异，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱即可读出基因型，方便、快捷、准确。其次，相对于其它分子遗传标记技术而言微卫星标记符合孟德尔遗传模式，呈共显性遗传，因此，可以区分个体是纯合子和杂合子状态。

本发明适用于日本蟳群体遗传标记、系谱认证、遗传图谱构建等应用。Jassr131的PCR引物是本发明的核心，可在日本蟳的群体检测中呈现高度遗传变异的多态性。

本发明技术具有以下优点：

(1)本发明可快捷的获得日本蟳的Jassr131遗传标记基因座位呈现高度遗传变异的多态性图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出日本蟳在此位点的每个个体的基因型；

(2)本发明主要应用于日本蟳群体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建等。

附图说明

图1为本发明的Jassr131引物对日本蟳28个体的检测图谱，编号1-28，M是标准分子量。

具体实施方式

下面通过实施例详细叙述本发明在日本蟳Jassr131微卫星核心序列DNA分子遗传标记技术方法。首先提取日本蟳基因组DNA并稀释备用；再利用日本蟳基因组文库中的含有Jassr131微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对日本蟳不同地理群或群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得日本蟳在Jassr131核心序列区高度遗传变异的多态性图谱(如图1所示)。

日本蟳在Jassr131核心序列如下：

GATCTTCCAGGGAATTGAAACACTAATTTGGCATTTTAGAGTAAGCTATCTAATTTTTTTTTCAGCAAGTCTCTCTGTTATTTATTGATTGATAGATTAGTGCTTGAGTGAGTGAGTGAGTGGGTGAACGAGTGGGTGAGTCAGTGAGTCAGTGAGTGAGTGAGTGAGTGCAAATGAACGAGTGAATAGAATAAACTAATTAAGTGAATGTGTGACTGACCGAGTGAATCTGAATTGTCATTTTGAGGTGAGCCAGCTAGACATTTCGCAGAGCCTTCATATCCTTAA

上述核心序列中的标下划线的为引物序列区。

1、日本蟳基因组DNA的提取：取肌肉组织100mg，剪碎后放入1.5ml离心管中，加入pH8.0的TE溶液(10mmol/L Tris-CI，10mmol/L EDTA)500μL，用研磨棒研磨。加入10％SDS溶液25μL，混匀。加入20mg/ml蛋白酶K 4μL，混匀，55℃消化2.5～3h。重蒸酚抽提两次，每次10min，12000转/min离心5min，取上清；酚∶氯仿(1∶1)抽提一次，10min，12000转/min离心5min，取上清；氯仿抽提一次5min，5000g离心5min，取上清。加入1/25体积的5mol/LNaCl溶液，混匀后再加入两倍体积的-20℃的无水乙醇沉淀DNA 15min；挑出的DNA，用70％的乙醇洗涤数十分钟，使DNA干燥，用灭菌水500μL充分溶解后，定量将其稀释成50ng/μL的浓度备用。

2、微卫星引物的设计：在日本蟳微卫星富集文库基础上，利用微卫星DNA两侧的序列在同一物种相对于核心序列的高度保守性，在Jassr131核心序列的两端设计特异性引物，用其扩增出该位点的微卫星DNA片段。由于微卫星核心序列突变率相对较高，造成微卫星DNA核心序列重复次数的增加或减少，即微卫星DNA序列长度的变化，这是检测微卫星多态性的主要依据。本发明的Jassr131微卫星核心序列区域两端的特异性引物序列为：正链5’-CCAGGGAATTGAAACACT-3’，负链3’-TATGAAGGCTCTGCGAAA-5’，使用该引物时的退火温度为50℃。

3、PCR扩增：

首先加样，加样量如下：包括50ng日本蟳基因组DNA3μL；2.5mmol/L dNTP1.6μL；含15mmol/L Mg²⁺的10×PCR Buffer2μL；5U/μL Taq0.2μL；本发明的引物10mmo l/L各1μL；最后加ddH₂O至20μL。其次，进行PCR反应，其PCR扩增仪程序参数为：95℃预变性5min；95℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃再延伸10min；4℃保存。

4、PCR产物的检测：PCR反应结束后，将产物在8％的变性聚丙烯酰氨的凝胶中进行电泳，电泳仪的功率为12W，电泳的时间在1～1.5h左右，即可终止。将胶板通过10％的冰醋酸溶液20min→蒸馏水6min→0.1％的硝酸银溶液25min→3％的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应即得到如图1所示的多态性图谱。

Claims

1.一种日本蟳Jassrl31微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于，操作程序为：首先提取日本蟳基因组DNA并稀释备用；再利用日本蟳基因组文库中的Jassrl 31微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对日本蟳不同地理群或群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得日本蟳在Jassrl 31核心序列区高度遗传变异的多态性图谱；Jassrl31微卫星核心序列的特异性引物序列分别为：正链5’-CCAGGGAATTGAAACACT-3’，负链5’-TATGAAGGCTCTGCGAAA-3’，使用该引物时的退火温度为50℃。

2.按照权利要求1所述的日本蟳Jassrl31微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于，提取日本蟳基因组DNA，将其稀释为50ng/μL，每个PCR反应中加入3μL，反应总体积为20μL。

3.按照权利要求1或2所述的日本蟳Jassrl31微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的加样参数为：每个PCR反应总体积为20μL，包括50ng/μL日本蟳基因组DNA3μL；2.5mmol/L dNTP 1.6μL；含15mmol/L Mg²⁺的10×PCR Buffer2μL；5U/μL的Taq酶0.2μL；引物10mmo l/L各1μL；最后加ddH₂O至20μL；使用该引物时设置PCR仪的程序参数为：95℃预变性5min；95℃变性45s，49℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃再延伸10min；4℃保存。

4.按照权利要求1或2所述的日本蟳Jassrl31微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于，对PCR产物的检测：将PCR产物在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，12W恒功率电泳1～1.5h进行分离；将胶板通过10％的冰醋酸溶液20min→蒸馏水6min→0.1％的硝酸银溶液25min→3％的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应即可得到日本蟳在Jassrl 31基因座位高度遗传变异的多态性图谱。

5.按照权利要求3所述的日本蟳Jassrl 31微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于，对PCR产物的检测：将PCR产物在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，12W恒功率电泳1～1.5h进行分离；将胶板通过10％的冰醋酸溶液20min→蒸馏水6min→0.1％的硝酸银溶液25min→3％的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应即可得到日本蟳在Jass r131基因座位高度遗传变异的多态性图谱。