CN106191253B - 基于gbs技术的北京鸭简化基因测序方法 - Google Patents

基于gbs技术的北京鸭简化基因测序方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于GBS技术的北京鸭简化基因测序方法，提取北京鸭基因组DNA，利用限制性内切酶MseI酶切基因组DNA，然后回收酶切片段，添加如SEQ ID NO:1‑12所示的特异接头序列，并选取550～580bp大小的带有接头序列的酶切片段构建GBS文库，在对文库进行质控后，进行高通量测序，将测序结果比对到鸭参考基因组上，并对比对结果进行质控，最终获得北京鸭基因组信息。本方法操作简单，结果准确，适用于北京鸭的实际育种工作。

Description

基于GBS技术的北京鸭简化基因测序方法
技术领域
本发明涉及分子生物学和高通量测序技术领域，具体地说，涉及一种基于GBS技术的北京鸭简化基因测序方法。
背景技术
北京鸭是我国具有巨大经济价值的农业动物品种之一，在全球拥有广阔的消费市场，尤其在亚洲最受欢迎(Zhu F.,Yuan J.M.,Zhang Z.H.,Hao J.P.,Yang Y.Z.,Hu S.Q.,Yang F.X.,Qu L.J.&Hou Z.C.(2015)De novo transcriptome assembly andidentification of genes associated with feed conversion ratio and breastmuscle yield in domestic ducks.Anim Genet 46,636-45)。同时，北京鸭也是群体遗传和生物进化领域优质的试验材料(Li H.F.,Zhu W.Q.,Song W.T.,Shu J.T.,Han W.&ChenK.W.(2010)Origin and genetic diversity of Chinese domestic ducks.MolPhylogenet Evol 57,634-40；Hou Z.C.,Yang F.X.,Qu L.J.,Zheng J.X.,Brun J.M.,Basso B.,Pitel F.,Yang N.&Xu G.Y.(2012)Genetic structure of Eurasian andNorth American mallard ducks based on mtDNA data.Anim Genet 43,352-5)。然而，有关北京鸭的研究一直受到基因组信息测定难度所限，由于鸭缺乏相对应的基因芯片测定平台，而北京鸭全基因重测序具有价格过于高昂和参考基因组质量低的缺点。
基因组简化是一类简化基因组复杂性的测序技术，其原理主要通过限制型内切酶截断基因组复杂区域的方式来捕获适宜的基因组标记，此类方法的优点在于能够高效优质地测定大规模生物群体的单核苷酸标记(SNP)，并且具有良好的同一性和性价比。基因组简化技术主要有三种，分别是简化复杂性文库(RRL)、限制性内切标记测序(RAD-seq)和简化基因组测序(基于测序的基因分型，genotyping by sequencing,GBS)。GBS是这三类技术中对于基因型分析最为适宜的方法，其测定的标记稳定性高，成本易于控制(Davey J.W.,Hohenlohe P.A.,Etter P.D.,Boone J.Q.,Catchen J.M.&Blaxter M.L.(2011)Genome-wide genetic marker discovery and genotyping using next-generationsequencing.Nat Rev Genet 12,499-510.)。GBS已广泛应用于玉米、小麦等作物的功能基因组研究和基因组选择中，同时在猪、鱼类等动物的群体遗传研究中也逐步增多。GBS技术的关键点有两个，一是对于限制性内切酶种类有极高的依赖性，另一个是文库大小和barcode接头序列设置。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于GBS技术的北京鸭简化基因测序方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的一种基于GBS技术的北京鸭简化基因测序方法，提取北京鸭基因组DNA，利用限制性内切酶MseI酶切基因组DNA，然后回收酶切片段，添加如SEQ ID NO:1-12所示的特异接头序列，并选取550～580bp大小的带有接头序列的酶切片段构建GBS文库，在对文库进行质控后，进行高通量测序，将测序结果比对到鸭参考基因组上，并对比对结果进行质控，最终获得北京鸭基因组信息。
本发明用于北京鸭基因组简化的最适限制性内切酶为MseI。所述限制性内切酶是根据电子酶切分析和实际酶切试验双重结果印证下选取的最适内切酶。在电子酶切中，通过模拟不同限制性内切酶的作用特性，预测不同酶对于北京鸭的酶切结果，根据酶切片段分布、简并位点影响、酶切片段数、酶稀有程度几个方面选取候选内切酶，然后对电子酶切结果进行实际酶切的试验，比较不同酶实际酶切效果，以此筛选最适酶。
所述限制性内切酶在北京鸭基因组酶切消化过程中有显著的优势，可以高效、快捷的降低北京鸭基因组复杂性，得到的GBS标记均匀分布于基因组各部分，且标记间特异性良好、序列冗余性低，同时所述酶易于获得，价格相对低廉，可用于大规模北京鸭群体的酶切实验中。
前述的方法，酶切反应体系为：北京鸭基因组DNA 100ng、10×酶切反应缓冲液5μL、10000U/mL限制性内切酶MseI 1μL，ddH2O补至总反应体积50μL。酶切反应条件为：37℃水浴反应1-2小时，然后水浴15分钟灭活内切酶。4℃保存。
前述的方法，添加接头序列所用的连接反应体系为：回收的酶切片段2.5μL，Ligation Mix 2 2.5μL，接头序列2.5μL；反应条件为：30℃反应10分钟。所用试剂盒为TruSeq DNA PCR-Free。
前述的方法，GBS文库的构建方法为：以选取的大小为550～580bp的带有接头序列的酶切片段为模板进行PCR扩增，同时引入index接头序列(TruSeq DNA PCR-Free试剂盒自带随机序列)，PCR扩增产物以Ampure XP beads回收洗脱即为GBS文库。
前述的方法，对构建的GBS文库进行质控的方法如下：采用KAPA LibraryQuantification Kits进行文库定量，具体操作按试剂盒标准进行。将定量的文库按1:5体积比加水稀释，然后取1μL稀释后的文库用Agilent Technologies 2100Bioanalyzer进行电泳分析，将DNA片段分布范围在550～580bp内的文库作为合格文库。
前述的方法，在进行高通量测序后，将测序结果去除接头序列和Q20过低(<90％)的数据。然后再将测序结果比对到鸭参考基因组上。
优选地，序列比对采用的软件为BWA。
前述的方法，对比对结果进行质控包括对SNP位点信息进行质控，去除单个测量个体中覆盖深度低于4的检出位点，同时去除总样本中缺失率高于5的检出位点。
本发明提供的用于北京鸭简化基因组测序的特异barcode接头序列，所述barcode接头序列如SEQ ID NO:1-12所示。用于添加到以限制性内切酶MseI酶切北京鸭基因组DNA后回收的酶切片段上。
所述的特异性接头主要指GBS文库构建时所用的barcode序列。特异性接头barcode序列是一段碱基序列，给每个样品的序列加入特异性接头，有利于区分不同测序数据的来源。所述特异性接头主要使用BARTAB软件进行设计，在确保序列特异性、连接效率的前提下，经过建库试验检测后筛选得到。
所述特异性接头的使用，能够使多个样本文库在后期能够混合上机测序，这样使得多个样本能够并行测序，极大的缩短操作时间，提高测序效率，降低数据冗余。另外，在文库中加入合适的barcode接头，能够有效校正GBS序列的GC不平衡，提高测序的准确度。
本发明提供的用于北京鸭简化基因组的最佳GBS片段长度范围参数。所述参数主要指GBS文库中合理的测序长度范围为550～580bp。所述范围参数主要由实际测序试验反复验证得出，采用此参数能够使测序结果在高测序深度的基础上满足预期的基因组覆盖率，达到最佳SNP的最大检出率，进一步控制测序花费。
本发明还提供用于SNP检出的最佳质量控制参数。所述质量控制参数主要用于筛选高质量SNP位点信息。由于基因组测序的随机性，不同个体间基因组测序存在差异，个别个体会产生假阳性结果，极易影响分型结果。本发明在大量统计实验基础上建立有效的结果质控标准，以此最大程度的减少GBS技术中的假阳性错误，提高技术准确性。
本发明提供的SNP质控标准如下：1)去除单个测量个体中覆盖深度低于4的检出位点；2)去除总样本中缺失率高于5的检出位点。
本方法还适用于与北京鸭血统相近的鸭种的简化基因测序。
本发明提供了一种基于GBS技术的北京鸭简化基因测序方法，本发明利用限制性内切酶MseI对北京鸭基因组进行处理，并以特异性接头连接的方式，建立一种规范、高效率、高性价比的北京鸭简化基因测序及基因分型方法。实验证明，本方法可以稳定、准确、快速的测定北京鸭群体的基因型信息。本发明为北京鸭的分子遗传标记寻找提供了一个简单易行、价格低廉的全基因组分型平台，弥补了相关基因分型技术的缺陷。利用本发明提供的方法测定出北京鸭分子遗传标记能够广泛应用于北京鸭的生物学研究和农业育种工作中，为北京鸭功能基因组研究、基因组选择技术的开展提供极大的便利，对北京鸭品种保护以及开发利用具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中简化基因组测序检出SNP位点的基因组分布情况。由于北京鸭参考基因组序列过多，主要列出最长的前30条参考序列。横坐标为染色体物理长度，纵坐标代表最长前30染色体。每个灰点分别代表10000bp窗口中检出SNP位点密度，颜色深浅代表密度高低。
图2为本发明实施例1中北京鸭GBS基因分型方法的流程图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中的百分号“％”，若未特别说明，均为质量百分含量。文库构建及测序均由北京贝瑞何康生物公司完成。所用生物样本为南口种鸭育种中心提供的50个北京鸭样本。
实施例1基于GBS技术的北京鸭简化基因测序及基因分型方法
一、北京鸭GBS基因分型
1、选取50只6周龄北京鸭，采用胫静脉采血的方式采集3ml血液，用传统酚仿法提取基因组DNA，ddH2O溶解，经过凝胶电泳确认基因组完整性后，-20℃保存备用。
2、选取适量质检合格的基因组DNA，使用Qiagen DNA纯化试剂盒进行过柱纯化，以去除蛋白、糖类和盐分等杂质，避免杂质影响酶切效率，并对纯化产物用Qubit做精确定量，以控制酶切时间。
3、取100ng纯化基因组DNA，以MseI充分酶切，酶切体系(50μL):1μL限制性内切酶MseI(100000U/mL)，100ng DNA，5μL 10×buffer，剩余用ddH2O补齐至50μL。酶切反应条件为，37℃水浴1-2小时，然后水浴15分钟灭活内切酶。
4、连接预先设计合成的GBS-barcode特异接头序列。barcode接头序列如SEQ IDNO:1-12所示。
5、将6-12个连接有不同barcode的酶切连接产物充分混匀，然后以Ampure XPbeads核酸纯化试剂盒回收洗脱。
添加接头序列所用的连接反应体系为：回收的酶切片段2.5μL，Ligation Mix 22.5μL，接头序列2.5μL；反应条件为：30℃反应10分钟。所用试剂盒为TruSeq DNA PCR-Free。
6、将上述回收产物以2％琼脂糖凝胶电泳分离，精确切胶选择大小为550-580bp的DNA片段，回收洗脱。
7、以上述回收产物为模板进行PCR扩增，同时引入index接头序列(TruSeq DNAPCR-Free试剂盒自带随机序列)，PCR产物以Ampure XP beads回收洗脱即为GBS文库，取小样跑胶验证，大小应在620bp左右。
8、采用qPCR方法对文库进行质控，合格文库安排上机。
质控的具体方法如下：采用KAPA Library Quantification Kits进行文库定量，具体操作按试剂盒标准进行。将定量的文库按1:5体积比加水稀释，然后取1μL稀释后的文库用Agilent Technologies 2100Bioanalyzer进行电泳分析，将DNA片段分布范围在550～580bp内的文库作为合格文库。
9、收集测序数据，去除接头序列和Q20<90％的数据。
10、使用BWA软件将数据比对到鸭参考基因组上，质控后使用Gatk软件进行基因型信息分析。
11、对基因型信息进行质控，去除单个测量个体中覆盖深度低于4的检出位点，同时去除总样本中缺失率高于5的检出位点。
12、用shell和R脚本对结果进行评估。
结果显示，采用上述方法获得63.25GB的数据量，去除接头后reads长度范围为从115到118bp，其中96.12％的数据能对应到鸭参考基因组上，平均错配率为0.84％。平均每个个体基因组覆盖率达到13％，其中总共检测到46042个GBS片段，这些片段长度范围为398-499bp，中位数为465bp。经过数据质控以及基因分型处理，总共检测到169010个SNP，平均每个个体检测到55920个SNP，基因组平均扫描密度为70SNP/MB，平均每个GBS标记检测到41.23个SNP(图1)。
实验结果显示，本方法能够有效检测北京鸭基因组核苷酸位点变异信息，提供足够数量的SNP位点作为遗传标记，同时这些位点均匀分布在北京鸭的基因组上，为后续北京鸭育种工作提供丰富的遗传信息。
北京鸭GBS基因分型方法的流程图见图2。
二、验证分型结果
为验证上述分型方法的准确度，采用限制性片段长度多态性聚合酶链式反应技术(RFLP-PCR)进行北京鸭基因分型。RFLP-PCR的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化分割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，因而产生不同长度的DNA片段，从而分辨不同基因型。该方法相对特异性好，操作简单，分型时间短。本实施例中选取基因组分型的47个个体，对其24个检出位点进行分型。
根据检测位点上下游延伸各200bp序列为模板，采用Primer Premier 6.0软件进行引物设计，一共设计24对引物，其引物序列如下(5′-3′)：
PRKCE1F ATCCTCTGTCTCTTAGCAACCA
PRKCE1R GCACTGCAAACTACTATCCCGA
EVC1F TCAGACCCTGCCTGTAGTGA
EVC1R GCTCAAACTGCCCATCCTGA
ARHGEF261F TCAGACGAGCTGTCTCTCCA
ARHGEF261R CGTGAACAGACAGGGAGCAA
SVIL1F AACACCATTTGGTGAGGCCA
SVIL1R AAACTGCAGCAGGTGGAGAG
FGF91F ACAGTTCAGAGGCTCACACT
FGF91R TGGTAGCATCCTCACGGAGA
CHRM31F AAATGGTCCAAAACCTAACACAGG
CHRM31R CTCCAGAGATCCTTCTTGCCTTT
IL1RAPL21F TCTTGGAGGTTCAGAGGAGGTA
IL1RAPL21R AAGTACAGTGATTCCGTGGCA
DNAI11F TAGGAAAACTGTGGGTCCCTTT
DNAI11R AACAGACAGAATGGGTCACG
MAN1A21F ACTTTGCACTTGGACAGTTTCTG
MAN1A21R TTGACCATTTGCATAGCATGAGA
HEPACAM21F TCCTCATTCACTTGGGATTGCC
HEPACAM21R CTTTGACAGTGCAGAAAAGCCTC
NRXN11F CAACACTTTTCTCCCATGGATGC
NRXN11R GCAAATAGAAAAGCAGGTATGCAA
ACTN21F TGTTTAAGCTCATAGCTCCTTGC
ACTN21R TCTGCAGTATTTCTTCCACTCTGT
DMGDH1F AATTGTAGGGGTTGGACGGG
DMGDH1R AAACCCTGTCTCTCCATGCC
URI11F GTTTCACAGATGAAGAAACAGATGG
URI11R AGTCAGTGGTACCAGAGGCTTT
CNTN41F GAGTTGCAACAGACTTGTTCGG
CNTN41R TGGGGAAAGAGGCCTAGAGTGA
E1F TCCCATGCATAGACACTGAGC
E1R GCTGCTAGGGTTTGTGTCTCTTA
E2F CTGGGCAGAGGAACATCGTTT
E2R TTTTCATGTGAGCTTCCTCTCAG
E3F CACATGTAAACGTGCTGTGTACT
E3R ACTCCTCGGAGTGCCACTTG
E4F CTTATGTGCGCTTTGGAGAGGA
E4R TACCACCATCATGCTCCCACTG
E5F GCTTGCTTCATTCAGTAGGTCAC
E5R CACTCCAGGTCATGTTGATAGT
X1F TGCTTTACAGAAGCCCAAGACA
X1R CATGCATGTATGCCCGGTTT
X2F AAAGGATGGTGACGTAGGTGAT
X2R TCTAGAGCACACATCACACCAA
X4F CTTAGGGCAGAAGGGAACACAA
X4R TCTGAACTCCTAATCTGAGTACCTT
X5F TTGCTATTAGTAACCAGAGAAGGGT
X5R ACAGGATGGTTGTGAGCTGATG
以所提取的北京鸭基因组DNA为模板，所用PCR反应体系为(20.0μL)：北京鸭基因组DNA 80-100ng,10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.0μL，dNTPs(2.5mM)2.0μL，Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)1.0μL，上、下游引物(10μmol/l)各1μl，用ddH2O补充反应体系至20.0μL。
PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸35s，共35个循环；最后72℃延伸10min，-20℃长期保存。
酶切反应由5种内切酶(HindIII、BglII、NdeI、EcoRI、XbaI)完成。将准备好的PCR产物作为模板，所用酶切反应体系为(20.0μL)：PCR产物1.0μL，10×NE buffer 12.5μL，内切酶100U，ddH2O补充反应体系至20.0μL。
酶切反应条件为：37℃反应1小时，反应后4℃保存。
取5.0μL酶切产物进行2.0％琼脂糖凝胶电泳检测。根据酶切条带数进行分型，结果见表1。表1中序列名为检出位点所处的参考基因组序列名，突变位置代表检出位点在相应参考基因组序列的绝对位置，突变位点指检出位点的突变碱基，原有位点指检出位点的原有碱基，内切酶指在酶切分型中所采用的限制性内切酶，检出率指测序分型与酶切分型的相符程度。
结果表明，所验证的47个样本的基因型基本与简化基因组结果相符，简化基因组的准确率达到99％以上。
表1检测序列信息
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.基于GBS技术的北京鸭简化基因测序方法，其特征在于，提取北京鸭基因组DNA，利用限制性内切酶MseI酶切基因组DNA，然后回收酶切片段，添加如SEQ ID NO:1-12所示的特异接头序列，并选取550～580bp大小的带有接头序列的酶切片段构建GBS文库，在对文库进行质控后，进行高通量测序，将测序结果比对到鸭参考基因组上，并对比对结果进行质控，最终获得北京鸭基因组信息。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酶切反应体系为：北京鸭基因组DNA100ng、10×酶切反应缓冲液5μL、100000U/mL限制性内切酶MseI 1μL，ddH2O补至总反应体积50μL；酶切反应条件为：37℃反应1-2小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，添加接头序列所用的连接反应体系为：回收的酶切片段2.5μL，Ligation Mix 2 2.5μL，接头序列2.5μL；反应条件为：30℃反应10分钟；所用试剂盒为TruSeq DNA PCR-Free。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，GBS文库的构建方法为：以选取的大小为550～580bp的带有接头序列的酶切片段为模板进行PCR扩增，同时引入index接头，PCR扩增产物以Ampure XP beads回收洗脱即为GBS文库。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对构建的GBS文库进行质控的方法如下：采用KAPA Library Quantification Kits进行文库定量，将定量的文库加水稀释，然后用Agilent Technologies 2100Bioanalyzer进行电泳分析，将DNA片段分布范围在550～580bp内的文库作为合格文库。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行高通量测序后，将测序结果去除接头序列和Q20<90％的数据，然后再将测序结果比对到鸭参考基因组上。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，序列比对采用的软件为BWA。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，对比对结果进行质控包括对SNP位点信息进行质控，去除单个测量个体中覆盖深度低于4的检出位点，同时去除总样本中缺失率高于5的检出位点。
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