CN106434925A - 用NsiI鉴定人乳腺癌LINC‑ROR基因rs6420545多态性的方法 - Google Patents
用NsiI鉴定人乳腺癌LINC‑ROR基因rs6420545多态性的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用Nsil鉴定人乳腺癌LINC‑ROR基因rs6420545多态性的方法，包括以下步骤：抽提样品的基因组DNA；提供扩增人LINC‑ROR基因多态性rs6420545位点附近序列的正向引物和反向引物，以提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；使用限制性内切酶对获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定LINC‑ROR基因多态性rs6420545的各基因型。本发明建立的方法简单、快速、安全、准确、灵敏度高,值得在临床和研究中推广，并可借鉴用于其它多态性基因的分型。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用NsiI鉴定人乳腺癌LINC-ROR基因rs6420545多态性的方法。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。CAPs(cleaved amplificationpolymorphism sequence-tagged sites)CAPs技术又称为PCR-RFLP，限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术。PCR-RFLP的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。此项技术大大提高了目的DNA的含量和相对特异性，而且方法简便，分型时间短。这种方法与RFLP相比，不同的是以扩增替代了酶切，避免了RFLP繁琐的DNA酶切、转移、杂交等步骤。
LINC-ROR(Long Intergenic Non-Protein Coding RNA,Regulator OfReprogramming)属于长链非编码RNA，位于人类染色体18。LINC-ROR已被确定为促进诱导人类多能干细胞(iPSCs)，被认为在miRNA介导的人类胚胎干细胞的自我更新中抑制核转录因子。据报道，作为一种竞争性内源性RNA，lincRNA ROR通过与miR-145结合在三阴性乳腺癌的发生、侵袭过程发挥重要作用。此外lincRNA ROR可以与miR-145竞争性结合在调节子宫内膜癌干细胞分化的过程中发挥重要作用。
Rs6420545位于人LINC-ROR(美国国立卫生研究院国立医学图书馆生物信息技术中心，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。通常该多态在人群中存在三种LINC-ROR基因的基因型：CC型(人基因组rs6420545多态位点的两个等位基因碱基均为C)，CT型(人基因组rs6420545多态位点的两个等位基因碱基分别为C和T)和TT型(人基因组rs6420545多态位点LINC-ROR的两个等位基因碱基均为T)。
目前人基因多态rs6420545的鉴定常采用PCR-RFLP方法。目前鉴定人LINC-ROR基因多态rs6420545时常使用的限制性内切酶价格昂贵(关于部分内切酶的参考价格可参考后面的表1)，实验成本高，难以在实验室中普及使用。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种操作简单、成本低、适用范围广泛的用NsiI鉴定人乳腺癌LINC-ROR基因rs6420545多态性的方法，通过PCR-RFLP技术的改进，来开发经济、快速的检测人LINC-ROR rs6420545基因多态性的试剂盒。
其技术方案如下：
一种用NsiI鉴定人乳腺癌LINC-ROR基因rs6420545多态性的方法，包括以下步骤：
(a)抽提样品的基因组DNA；
(b)提供扩增人LINC-ROR基因多态性rs6420545位点附近序列的正向引物和反向引物，rs6420545上游引物如SEQ:ID:NO:1所示，rs6420545下游引物如SEQ:ID:NO:2所示，以步骤(a)提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；
(c)使用限制性内切酶对(b)中获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；
(d)将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定LINC-ROR基因多态性rs6420545的各基因型。其中，经电泳后有两条条带者为CC基因型，三条条带者为CT基因型，一条条带者为TT基因型。
进一步，步骤(b)中所述正向引物和反向引物的设计与合成具体为：在NCBI的dbSNP数据库中，查找LINC-RORrs6420545的核苷酸序列如SEQ:ID:NO:3所示，基因序列的第790个碱基Y代表了C/T多态，即为rsrs6420545的多态性位点。将以上序列粘贴至引物设计软件PrimerPremier6.0中，设置引物长度和扩增目的片段长度等参数进行引物设计，根据GC含量和退火温度等选择最优上下游引物，再将此引物与Pubmed中的Blast序列比对功能(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行引物比对，最终确定的上下游引物为正向引物序列，引物的合成可以采用固相合成法，或者委托生物公司合成。
进一步，步骤(b)中PCR扩增反应具体为：
(1)根据提取基因组DNA的浓度，将研究对象的DNA进行稀释，使终浓度为20μg/μl。
(2)PCR扩增体系为2×Taq PCR Mix 7.5μl、上游引物和下游引物各0.3μl、模板DNA1.0μl，最后用双蒸水补充总体积至15μl。
(3)PCR反应条件：第一个阶段为预变性阶段，94℃/5min；第二个阶段包括三个步骤共35个循环，依次设置为94℃/30s、57.6℃退火时间45s、72℃/45s；第三个阶段72℃/5min，扩增后的产物序列如SEQ:ID:NO:4所示。
进一步，步骤(c)中进行酶切的酶切体系具体为：PCR扩增产物5μl、上限制性内切酶0.5μl、Buffer1.0μl，最后用双蒸水补充总体积至15μl。混匀后置于水浴锅中37℃水浴4～16小时。
进一步，步骤(d)具体为：将酶切产物用3％的琼脂糖凝胶在4-10V/cm的条件下，电泳20-40min，至紫外灯下能分清明显的条带后并拍照鉴定。对于不同的基因型，rs6420545位点不同基因型展现出不同的条带，TT突变基因型，长为473bp一条带；CC野生基因型，长为143bp和330bp两条带；CT杂合基因型，长为473bp，143bp和330bp三条带。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明PCR产物进行酶切电泳后即可进行基因型的鉴定工作，因此在实际运用中具有很大的灵活性，加之检测方法简单易行，因此是一种进行单碱基突变位点基因型鉴定的好方法。技术关键点是设计出的LINC-ROR多态性rs6420545的上下游引物，正向引物序列：5’-CTCCAGCCTAGATGACAGA-3，rs6420545反向序列:5’-CACAGCAGCACTATTCCTAT-3’以及限制性内切酶NsiI的使用。本发明所提供的检测人乳腺癌易感基因LINC-ROR多态性rs6420545的方法操作简单、成本低、适用范围广泛。
附图说明
图1是PCR扩增反应程序；
图2是LINC-RORrs6420545位点的电泳图谱；
图3是LINC-RORrs6420545位点CC基因型测序图谱；
图4是LINC-RORrs6420545位点CT基因型测序图谱；
图5是LINC-RORrs6420545位点TT基因型测序图谱。
具体实施方式
下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。
本发明的方法包括以下步骤：
该方法包括以下步骤：
(a)抽提样品的基因组DNA；
(b)提供扩增人LINC-ROR基因多态性rs6420545位点附近序列的正向引物和反向引物，rs6420545上游引物:5’-CTCCAGCCTAGATGACAGA-3’，rs6420545下游引物:5’-CACAGCAGCACTATTCCTAT-3’，以步骤(a)提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；
(c)使用限制性内切酶对(b)中获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；
(d)将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定LINC-ROR基因多态性rs6420545的各基因型。其中，经电泳后有两条条带者为CC基因型，三条条带者为CT基因型，一条条带者为TT基因型。
上述方法中涉及的扩增、抽提基因组、酶切等技术均可采用本领域的常规操作方法。
本发明提供了一种检测乳腺癌易感基因的方法，由于识别特定位点的限制性内切酶NsiI适用范围广，价钱较为经济，进而大大降低了检测SNP的成本。经序列分析发现，检测该C/T多态的方法可使用表1中的9种酶，其中表中前三种酶均含一错配碱基，此错配碱基的位置离突变位点往往很是接近，这大大增加了引物设计的难度，加之要求上游或下游引物必须包含此错配碱基，这对引物的设计又增加了新的难度。后面几种酶并不是常见的酶，目前在几家试剂公司均没有这些酶的出售。综合考虑简单操作性与经济实用性，限制性内切酶NsiI是最好选择。
表1中提供的限制性内切酶的价格从NEB公司(http://www.neb-china.com)，限制性内切酶的选择从WatCut限制性内切酶分析软件上获取(http://watcut.uwaterloo.ca/template.php？act＝snp_new)，以此作为限制性内切酶识别位点和价格的参考。
表1 几种限制性内切酶识别序列及其价格
在本发明的实施中，正向引物和反向引物的设计采用Primer6.0软件进行，设计的原则综合考虑引物对PCR扩增的灵敏度、特异度以及扩增效率的影响。按照碱基互不配对的原则设计引物，引物长度一般在15～30碱基之间，过长或短均会造成特异性差，过长还会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。引物GC含量在40％～60％之间，Tm值最好接近72℃，GC含量过高或过低都不利于引发反应。碱基要随机分布，引物自身及引物之间不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端ΔG值较低。扩增产物的单链不能形成二级结构。引物应具有特异性，引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测，以确保其与其它基因不具有互补性。在此基础上，最终选取的上游引物:5’-CTCCAGCCTAGATGACAGA-3，rs6420545下游引物:5’-CACAGCAGCACTATTCCTAT-3’。由此引物扩增出的面的片段473bp，扩增产物如下：
ctccagcctagatgacagagtgagacccagtctcaaaaacaaaaacaaaaaacaaaaaTTCCcaccattttaaagtgcacaattcagtggttttcactatatttacaatgttgtacaaccatcaccattatctagttccagaatatattcgtcagcccccaaaaaaagctgtacttgttagcagacactcccaattccccctgccactgatacccctgtcctcagccccttggaaaccactaatctactgtccatctctacagagttgcctagtccagacacttcatataaatggagcccagttagcatcatgtctgcaaggttcatgYatgctgtagcatgtatcagaactcccttcctttttatgactgaataatattccatagtatggatagacaacattttatctctttatcggttgatggacatttaggttatttctactgctatctaataggaata gtgctgctgtg(473bp)
下划线部分分别为正向引物和反向引物，第329位bpY代表C/T多态即SNP位点rs6420545。该长为473bp的扩增产物经限制性内切酶NsiI酶切后可产生330bp，143bp片段类型。基因型判定结果：TT突变基因型，长为473bp一条带；CC野生基因型，长为143bp和330bp两条带；CT杂合基因型，长为473bp，143bp和330bp三条带。
凝胶电泳分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，琼脂糖(Agarose)是一种线性多糖聚合物，系从红色海藻产物琼脂中提取而来的。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的，可用于DNA片段的制备电泳。聚丙烯酰胺凝胶主要有两种方式：一是用于分离和纯化双链DNA片段的非变性聚丙烯酰胺凝胶，二是用于分离及纯化单链DNA片段的变性聚丙烯酰胺凝胶。但综合考虑实用性、便利性以及经济性，使用琼脂糖凝胶电泳不失为一种最佳选择。在本发明中，引物扩增条件如图1所示，目的扩增产物使用限制性核酸内切酶NsiI 5U水浴锅中酶切6～14h。酶切产物采用3％的琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下根据不同的条带判断野生纯合基因型，杂合基因型以及突变纯合基因型。
在本发明中，PCR扩增体系的反应条件并不受特别的限制，基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性)。而对于待测DNA也没有较高的浓度及纯度要求，既可以是人体体液或组织中提取的DNA，也可以是经过预先降解处理的基因组。但为了方便实施以及减少受试者痛苦，一般优先选择从血液中进行基因组DNA的提取。
本发明经过研究，首次证明了LINC-ROR基因单核苷酸多态性位点rs6420545位于内含子3’-UTR中，在此基础上本发明提供了一种检测乳腺癌易感性基因的方法，利用本发明检测位点的基因型，方法简单易行，快速高效，成本低廉，为乳腺癌的诊断提供了一个简捷的新途径。
下面将本发明的具体实施方案予以详细的描述，但需要强调的是，本项发明并不受限于所述的具体实施方式。
在本发明的具体实施方案中，本发明检测人乳腺癌LINC-ROR基因多态rs6420545的具体步骤如下：
(l)提取待测人乳腺癌基因组DNA模板，所述人基因组DNA模板为人体任何部分取得的人基因组模板。
(2)PCR扩增基因组DNA，对提取的模板基因组DNA进行PCR扩增，获得含多态附近序列的PCR产物。
(3)对PCR扩增产物用限制性核酸内切酶NsiI进行酶切反应，得到酶切产物；
(4)酶切产物进行琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下根据不同的条带判断野生纯合基因型，杂合基因型以及突变纯合基因型。
下面对上述各个主要步骤进行详细描述：
1材料与方法
1.1主要仪器与试剂
仪器：BCD-228CH冰箱(新飞电器)，HH-2数显恒温水浴锅(华峰仪器)，SmartGel凝胶成像仪(北京赛智创业)，GT9612梯度PCR仪(百泰克生物)，WD900SL23-2型号微波炉(格兰仕电器)，DG-300C型电泳仪(鼎国昌盛生物)等。
试剂：NEP004-1DNA提取试剂盒(鼎国昌盛生物)，50bpDNALadder(莱风生物)，2×TaqPCRMix(莱风生物)，MspI(Thermo)，琼脂糖(SIGMA)等。
1.2引物设计
在NCBI的dbSNP数据库中，查找LINC-RORrs6420545的核苷酸序列如下：
CCTGCTGATCCCATTCCTGAGACCTGGAAGAACTGAAATGCCATCAATAGAGATGTTTGCTGGGGTATCAAGCTAGATGTGGTAATGCTGTGTGCAGAAGGAGAGGGCGATGGGGAACATGGTGCTTTTCCTTTGTGTGACAATTTTGCTATGAGACAAATTTCACATAACACATAACCTACCATTTTGGGCTTTTggctgggtgcagtggctcatgcttgtaatcctagcactttgggaggctgagctgggcggatcacttgagcccaggagttcgagaccagcctgggaaacatggcaaaaccccctctctacaaaataataataataataataataacaaaaattagccaggcatgctggcactcacctgtagtctcagctgcttgagaggctgaggcaggaggatcacctgagcccatgaggttgaggctgcagtgtgccatgattgtaccactgcac tccagcctagatgacagagtgagacccagtctcaaaaacaaaaacaaaaaacaaaaaTTCCcaccattttaaagtgcacaattcagtggttttcactatatttacaatgttgtacaaccatcaccattatctagttccagaatatattcgtcagcccccaaaaaaagctgtacttgttagcagacactcccaattccccctgccactgatacccctgtcctcagccccttggaaaccactaatctactgtccatctctacagagttgcctagtccagacacttcatataaatggagcccagttagcatcatgtctgcaaggttcatgYatgctgtagcatgtatcagaactcccttcctttttatgactgaataatattccatagtatggatagacaacattttatctctttatcggttgatggacatttaggttatttctactgctatctaataggaatag tgctgctgtgaacacttgtgtccaagtttctctgtgggaccatgttttcaactctcttgggtgtatacctaggagcaaagttgcagggtcatatgggaaccctatgtttaactttttgagaaactgccagaccaaactgttttccaaaggggctgcaccatttcacattcccaccagtggtgcatgagtattctgctttacccacattctcatttacacttattttttttctttttaaaaaagttataaccattcaactgggtgggaactggcatcttattgtgtttttgatttgcatttccctcttggctaatgctgttgagTGTGCAGCTGAAGTTTAGTGAGCACACTACTCACCTATAACTCATAAGTGGAGCAGGTATGAGATTGAGTCCACAACTTCAGATATTCAAGCAATGAACTTTATGTTTCTTCAACATTGCCAGTTTCCATGTTGAACCTTCATTCTGCCACAGTTATGTAACAGGAGCCCAAAGTAACAGTGCCTTAAACTGGGAAAGTT
基因序列的第790个碱基Y代表了C/T多态，即为rsrs6420545的多态性位点。将以上序列粘贴至引物设计软件PrimerPremier6.0中，设置引物长度和扩增目的片段长度等参数进行引物设计，根据GC含量和退火温度等选择最优上下游引物，再将此引物与Pubmed中的Blast序列比对功能(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行引物比对，最终确定的上下游引物为正向引物序列：5’-CTCCAGCCTAGATGACAGA-3，rs6420545反向序列:5’-CACAGCAGCACTATTCCTAT-3’，引物的合成可以采用本领域通用的方法(如固相合成法)，亦可委托生物公司合成。
1.3限制性内切酶的选择
根据dbSNP中五个位点的碱基序列，用WatCut在线限制性内切酶分析软件，在线搜索获得可识别突变位点的限制性内切酶的信息，综合考虑其酶切特异性及经济适用性选择最佳的限制性内切酶NsiI。
1.4从全血中提取待测样本的基因组DNA
严格按照离心柱型DNA提取试剂盒操作步骤提取基因组DNA。
l)在1.5ml离心管中加入300μl血细胞后，再加入900μl细胞裂解液混和均匀，在冰上放置10min后，在离心机中12000rpm离心1min，弃上清，再次加入900μl细胞裂解液，用枪吹起沉淀并混匀后，重复上述步骤；
2)向沉淀物中加入600μl solutionB溶液，用移液枪轻轻吹起沉淀后，加入10μl蛋白酶K混匀，在70℃水浴锅中放置10min后，12000rpm离心5min；
3)将离心管中的上清转入编过号的新的离心管中，再向新的离心管中加入500μl无水乙醇，期间可能会出现絮状沉淀物，该絮状物即为DNA；
4)将混匀的液体转入离心柱中(若一次转不完，可分次转入)，室温静置2min，再12000rpm离心1min，弃废液；
5)加入700μl已加入相应体积无水乙醇的solutionC漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃废液；
6)加入700μl已加入相应体积无水乙醇的solutionD漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃废液；
7)加入500μlsolutionD漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液；
8)再次离心2min，将离心柱置于新的编过号的离心管中，敞口放入37℃恒温箱内10min直至无明显乙醇味；
9)在硅基质膜中央加入已经预热到65℃的solutionE100μl，室温放置5min，12000rpm离心1min，重复上述步骤一次，终离心后的液体即为提取出的基因组DNA；
10)吸取2μl提取出的DNA用NanoPhotometerPearl微量分光光度计测定其浓度和纯度。
2结果
2.1PCR扩增
(1)根据提取基因组DNA的浓度，将研究对象的DNA进行稀释，使终浓度为20μg/μl。
(2)PCR扩增体系为2×TaqPCRMix7.5μl、上游引物和下游引物各0.3μl、模板DNA1.0μl，最后用双蒸水补充总体积至15μl。
(3)PCR反应条件：第一个阶段为预变性阶段，94℃/5min；第二个阶段包括三个步骤共35个循环，依次设置为94℃/30s、57.6℃退火时间45s、72℃/45s；第三个阶段72℃/5min。扩增后的产物序列为：
ctccagcctagatgacagagtgagacccagtctcaaaaacaaaaacaaaaaacaaaaaTTCCcaccattttaaagtgcacaattcagtggttttcactatatttacaatgttgtacaaccatcaccattatctagttccagaatatattcgtcagcccccaaaaaaagctgtacttgttagcagacactcccaattccccctgccactgatacccctgtcctcagccccttggaaaccactaatctactgtccatctctacagagttgcctagtccagacacttcatataaatggagcccagttagcatcatgtctgcaaggttcatgYatgctgtagcatgtatcagaactcccttcctttttatgactgaataatattccatagtatggatagacaacattttatctctttatcggttgatggacatttaggttatttctactgctatctaataggaata gtgctgctgtg(473bp)
下划线部分分别为正向引物和反向引物，第329位bpY代表C/T多态即SNP位点rs6420545。
2.2酶切反应
酶切体系为PCR扩增产物5μl、上限制性内切酶0.5μl、Buffer1.0μl，最后用双蒸水补充总体积至15μl。混匀后置于水浴锅中37℃水浴4-16小时。
2.3基因型的判定
将酶切产物用3％的琼脂糖凝胶在4-10V/cm的条件下，电泳20～40min，至紫外灯下能分清明显的条带后并拍照鉴定。对于不同的基因型，rs6420545位点不同基因型展现出不同的条带(见图2)，TT突变基因型，长为473bp一条带；CC野生基因型，长为143bp和330bp两条带；CT杂合基因型，长为473bp，143bp和330bp三条带。各基因型均经测序以进一步鉴定，测序结果(见图3-5)显示与现有技术测得的结果完全相同。
下面是实施本发明的若干实施例：
实施例1.人乳腺癌组织标本测定人LINC-ROR rs6420545多态性。
在本发明的具体实施方案中，检测人乳腺癌LINC-ROR基因多态rs6420545的具体步骤如下：
(l)获取手术切取的乳腺癌组织，采用酚-氯仿法提取乳腺癌组织的基因组DNA作为待测DNA，提取步骤如下：
1)将乳腺癌组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取0.1g的组织进行碾磨，加入1ml的灭菌水，颠倒混匀，10000rpm离心10min，弃上清，以上步骤重复两次
2)加入200μl的DNA裂解液，5μl的蛋白酶K混匀，55℃水浴消化过夜。
3)消化完成后加入等体积的酚氯仿混合液(1:1)，剧烈震荡，使其变成奶咖色。12000rpm离心10min。
4)取上清时避免触及中间介质以及下层液体。加入等体积的氯仿后颠倒混匀。12000rm离心10min。
5)取上清，注意避免触及中间介质以及下层液体。加入1/10的醋酸钠以及2.5倍的无水乙醇，颠倒混匀，12000rpm离心10min，弃上清。
6)加入1ml70％乙醇，使其白色沉淀悬浮，颠倒混匀数次，12000rpm离心10min，弃上清，室温静置5-10min使乙醇挥发干净。
7)加入50μl灭菌水溶解DNA，即得胃癌组织基因组DNA。
(2)碱基序列信息从NCBI的dbSNP数据库获取，在CHIP网站上进行核对，明确准确无误后采用PrimerPremier6.0设计各位点引物，结合退火温度、GC含量以及Pubmed中的Blast序列比对结果(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)等信息筛选出最优引物为正向引物序列：5’-CTCCAGCCTAGATGACAGA-3，rs6420545反向序列:5’-CACAGCAGCACTATTCCTAT-3’，进行PCR引物扩增，制备PCR扩增体系：2×TaqPCRMix7.5μl，双蒸水5.9μl，上游引物0.3μl，下游引物0.3μl以及模板DNA1.0μl，充分混匀后即得15.0μlPCR扩增反应体系；按照第一阶段：94℃变性5min，第二阶段共包括35个循环三个步骤，首先94℃变性30s，56℃退火45s，最后72℃延伸45s，第三阶段：72℃延伸5min，最终4℃储存以备用，即得长为473bp的PCR扩增产物；
(3)扩增后的SNP片段用限制性核酸内切酶NsiI5U水浴锅中酶切6～14h，PCR反应产物5μl，限制性内切酶0.5μl，Buffer1.0μl以及无核酸酶纯水8.5μl共计15μl酶切体系，于水浴锅中37℃酶切6-14h，即得酶切产物。所述的识别CCATCN4^序列的限制性内切酶为内切酶NsiI及其同裂酶；所述的识别A^CRYGT序列的限制性内切酶为内切酶AflIII及其同裂酶；所述的识别A^CATGT序列的限制性内切酶为内切酶PciI及其同裂酶；所述的识别GCATCN5^序列的限制性内切酶为内切酶SfaNI及其同裂酶。所述的识别RCATG^Y序列的限制性内切酶为内切酶BstnsI及其同裂酶。所述的识别GCATG^C序列的限制性内切酶为内切酶SphI及其同裂酶。所述的识别TG^CA序列的限制性内切酶为内切酶Hpych4V及其同裂酶.但后几种酶需要将引物定点突变或者价格太高，综合考虑经济实用性以及简单操作性最终选择NsiI进行酶切鉴定；
(4)酶切产物采用3％的琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下根据不同的条带判断野生纯合基因型，杂合基因型以及突变纯合基因型(见表2)。
表2 rs6420545位点基因型判定
实施例2.人乳腺癌患者外周血全血标本测定人LINC-ROR rs6420545多态性
与实施例1的步骤基本相同，只是采用下面的方法从人乳腺癌外周血中提取基因组DNA作为待测DNA。
按照NEP004-1全血基因组DNA提取试剂盒的操作步骤进行待测血样基因组DNA的提取，具体步骤如下：
l)在1.5ml离心管中加入300μl血细胞后，再加入900μl细胞裂解液混和均匀，在冰上放置10min后，在离心机中12000rpm离心1min，弃上清，再次加入900μl细胞裂解液，用枪吹起沉淀并混匀后，重复上述步骤；
2)向沉淀物中加入600μlsolutionB溶液，用移液枪轻轻吹起沉淀后，加入10μl蛋白酶K混匀，在70℃水浴锅中放置10min后，12000rpm离心5min。
3)将离心管中的上清转入编过号的新的离心管中，再向新的离心管中加入500μl无水乙醇，期间可能会出现絮状沉淀物，该絮状物即为DNA；
4)将混匀的液体转入离心柱中(若一次转不完，可分次转入)，室温静置2min，再12000rpm离心1min，弃废液；
5)加入700μl已加入相应体积无水乙醇的solution C漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃废液；
6)加入700μl已加入相应体积无水乙醇的solution D漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃废液；
7)加入500μl solution D漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液；
8)再次离心2min，将离心柱置于新的编过号的离心管中，敞口放入37℃恒温箱内10min直至无明显乙醇味；
9)在硅基质膜中央加入已经预热到65℃的solutionE100μl，室温放置5min，12000rpm离心1min，重复上述步骤一次，终离心后的液体即为提取出的基因组DNA。
提取完毕基因组DNA后按照案例一的步骤进行基因型的鉴定，鉴定结果如下：将酶切产物用3％的琼脂糖凝胶电泳后于紫外灯下拍照鉴定。对于不同的基因型，rs6420545位点不同基因型展现出不同的条带(见图2)，TT突变基因型，长为473bp一条带；CC野生基因型，长为143bp和330bp两条带；CT杂合基因型，长为473bp，143bp和330bp三条带。各基因型均经测序以进一步鉴定，测序结果(见图3～5)显示与现有技术测得的结果完全相同。
本发明意在提供一种操作简单、成本低、适用范围广泛的检测人乳腺癌易感基因LINC-ROR多态性rs6420545的方法，提供此方便、快捷的检测人乳腺癌易感基因LINC-ROR多态性rs6420545的方法有望预测乳腺癌的易感性，可用于临床的早期诊断。
SNP检测技术已经很成熟，主要有以下几种检测方法：PCR-RFLP、TaqMan探针法、HRM法、SNapShot法、dHPLC、illuminaBeadXpress法等。因此，采用其他方法也同样可以完成SNP的检测，如测序法可以直接测出DNA序列中的所有突变位点的碱基替代情况，但该方法需要昂贵的仪器和较长的步骤，成本较高；AS-PCR的扩增效率较低，扩增特异性差，因此PCR产物的特异性与稳定性无法保障，同时，分型结果也较容易误判，稳定性较差；Taqman荧光探针法需要昂贵的仪器和较长的步骤,成本较高，难以在实验室中普及使用。鉴于本发明所使用的限制性内切酶价格低廉，且引物合成以及各试剂均较为经济，加之PCR-RFLP操作简单，重复性好，因此不失为一个较好的选择。
本项发明在于PCR产物进行酶切电泳后即可进行基因型的鉴定工作，因此在实际运用中具有很大的灵活性，加之检测方法简单易行，因此是一种进行单碱基突变位点基因型鉴定的好方法。技术关键点是设计出的LINC-ROR多态性rs6420545的上下游引物，正向引物序列：5’-CTCCAGCCTAGATGACAGA-3，rs6420545反向序列：5’-CACAGCAGCACTATTCCTAT-3’以及限制性内切酶NsiI的使用。本发明所提供的检测人乳腺癌易感基因LINC-ROR多态性rs6420545的方法操作简单、成本低、适用范围广泛。
以上所述，仅为本发明最佳实施方式，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (5)
1.一种用NsiI鉴定人乳腺癌LINC-ROR基因rs6420545多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)抽提样品的基因组DNA；
(b)提供扩增人LINC-ROR基因多态性rs6420545位点附近序列的正向引物和反向引物，rs6420545上游引物如SEQ:ID:NO:1所示，rs6420545下游引物如SEQ:ID:NO:2所示，以步骤(a)提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；
(c)使用限制性内切酶对(b)中获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；
(d)将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定LINC-ROR基因多态性rs6420545的各基因型；其中，经电泳后有两条条带者为CC基因型，三条条带者为CT基因型，一条条带者为TT基因型。
2.根据权利要求1所述的用NsiI鉴定人乳腺癌LINC-ROR基因rs6420545多态性的方法，其特征在于，步骤(b)中所述正向引物和反向引物的设计与合成具体为：在NCBI的dbSNP数据库中，查找LINC-RORrs6420545的核苷酸序列如SEQ:ID:NO:3所示，基因序列的第790个碱基Y代表了C/T多态，即为rsrs6420545的多态性位点；将以上序列粘贴至引物设计软件PrimerPremier6.0中，设置引物长度和扩增目的片段长度等参数进行引物设计，根据GC含量和退火温度等选择最优上下游引物，再将此引物与Pubmed中的Blast序列比对功能(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行引物比对，最终确定的上下游引物为正向引物序列，引物的合成可以采用固相合成法，或者委托生物公司合成。
3.根据权利要求1所述的用NsiI鉴定人乳腺癌LINC-ROR基因rs6420545多态性的方法，其特征在于，步骤(b)中PCR扩增反应具体为：
(1)根据提取基因组DNA的浓度，将研究对象的DNA进行稀释，使终浓度为20μg/μl；
(2)PCR扩增体系为2×Taq PCR Mix 7.5μl、上游引物和下游引物各0.3μl、模板DNA1.0μl，最后用双蒸水补充总体积至15μl；
(3)PCR反应条件：第一个阶段为预变性阶段，94℃/5min；第二个阶段包括三个步骤共35个循环，依次设置为94℃/30s、57.6℃退火时间45s、72℃/45s；第三个阶段72℃/5min，扩增后的产物序列如SEQ:ID:NO:4所示。
4.根据权利要求1所述的用NsiI鉴定人乳腺癌LINC-ROR基因rs6420545多态性的方法，其特征在于，步骤(c)中进行酶切的酶切体系具体为：PCR扩增产物5μl、上限制性内切酶0.5μl、Buffer 1.0μl，最后用双蒸水补充总体积至15μl；混匀后置于水浴锅中37℃水浴4～16小时。
5.根据权利要求1所述的用NsiI鉴定人乳腺癌LINC-ROR基因rs6420545多态性的方法，其特征在于，步骤(d)具体为：将酶切产物用3％的琼脂糖凝胶在4～10V/cm的条件下，电泳20～40min，至紫外灯下能分清明显的条带后并拍照鉴定；对于不同的基因型，rs6420545位点不同基因型展现出不同的条带，TT突变基因型，长为473bp一条带；CC野生基因型，长为143bp和330bp两条带；CT杂合基因型，长为473bp，143bp和330bp三条带。
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