CN108048539A - 用XcmI检测人口腔癌LINC00520易感基因rs4144657多态性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用XcmI检测人口腔癌LINC00520易感基因rs4144657多态性的方法，包括以下步骤：抽提样品的基因组DNA；提供扩增人LINC00520基因多态性rs4144657位点附近序列的正向引物和反向引物，以提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；使用限制性内切酶对获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定LINC00520基因多态性rs4144657的各基因型。本发明的方法简单、快速、安全、准确、灵敏度高,值得在临床和研究中推广,并可借鉴用于其它多态性基因的分型。

Description

用XcmI检测人口腔癌LINC00520易感基因rs4144657多态性的 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用XcmI检测人口腔癌LINC00520易感基因rs4144657多态性的方法。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括碱基的置换/插入和缺失等形式。SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。现已广泛用于简单和复杂疾病的遗传连锁分析、关联分析及疾病易感基因的定位，指导易感基因克隆。
CAPs(cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites)CAPs技术又称为限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术。PCR-RFLP的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用限制性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。此项技术大大提高了目的DNA的含量和相对特异性，而且方法简便，分型时间短。这种方法与RFLP相比，不同的是以扩增替代了酶切，避免了RFLP繁琐的DNA酶切、转移、杂交等步骤。
口腔癌(Oral cancer，OC)是口腔最常见的疾病，是世界上第十一大最常见的恶性肿瘤，90％以上是口腔粘膜来源的鳞状细胞癌。该肿瘤的发病率和死亡率根据诊断的地理位置呈变异性，但在过去十年中，青年患者，尤其是舌癌患者的百分比有所增加。我国每年口腔癌的新发病例就有近4.65万人。由于口腔癌发病率高，预后较差，主要累及颌面部，对人身心健康影响大，因此防治工作不容忽视。由于口腔内血液循环丰富，加上舌机械运动频繁，口腔内菌群分布多样，癌变后会造成口腔被感染，菌群失调，严重者会出现淋巴转移。2010年，据统计中国有34319例新诊断的口腔癌，其中包括23096名男性和11223名女性。2010年口腔癌的粗发病率为2.61/100000，占总体新发癌症病例的1.11％。
口腔癌是基因和环境等多因素协同或序贯作用、神经-内分泌-免疫调控下，对阶段进行性发展具有高低特异性的疾病。长链非编码RNA表达失调与口腔肿瘤发生之间关系密切。近年来LINC00520在肿瘤领域的研究取得了较大进展，但其在口腔癌领域的研究开展相对较少，因此将一定功能相关的LINC00520位点多态性与口腔癌结合起来可以更好的探讨其对口腔癌形成过程的作用，揭示其与口腔癌发生的关联性进而探讨其中的具体分子机制。
长链非编码基因间RNA(long intergenic non-protein coding RNA 520，LINC00520)其编码基因位于人类染色体14q22.3。LINC00520长约20kb,为高度保守的长链非编码RNA，在多种组织中广泛地表达。LINC00520是2012年新发现的基因，它与西班牙儿童肥胖具有相关性。2014年全基因组研究显示LINC00520与孟加拉国成年人体重相关的一个基因表型。LncRNA在不同癌症患者与健康者中的差异表达也预示着LncRNA可能与癌症的发生发展密切相关。LINC00520在由致癌PI3K转化的乳腺上皮细胞中增加，其表达增加依赖于突变PIK3CA的敲除。表达谱分析强调LINC00520在人类乳腺癌中升高，尤其在基底样乳腺癌中优先富集。研究表明ShRNA介导LINC00520的消耗阻止乳腺癌细胞的迁移LINC00520由致癌基因Src、PIK3CA和STAT3调节，可能有助于乳腺癌的分子病因学研究。2015年陈明政等研究表明LINC00520在细胞株HK-1中呈低表达，LINC00520在非鼻咽癌组表达水平高于鼻咽癌组。LINC00520在鼻咽癌与鼻咽良性疾病中表达水平的改变提示其差异表达与鼻咽癌的发生发展有关。
综上所述，为了最终实现降低口腔癌的发病率，本领域迫切需要口腔癌易感基因，并开发操作简单、成本低、适用范围广泛的检测口腔癌易感基因的试剂盒。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种操作简单、成本低、适用范围广泛的用XcmI检测人口腔癌LINC00520易感基因rs4144657多态性的方法，采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法，是采用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的DNA片段，然后将待检测的DNA片段用限制性内切酶酶切，限制性内切酶识别并切割特异的基因序列，然后将酶切后的产物进行电泳，再由限制性内切酶图谱(restriction map)分析此段序列的特异酶切位点，藉由片段的多样性来比对不同来源基因序列的差异性。简而言之，就是先PCR扩增相应的目的DNA片段，而后进行限制性内切酶酶切反应，电泳后根据片段的切开情况来判断多态基因型。此方法重复性好，操作较简单，成本低，酶切结果容易辨识。因此，本发明的目的是提供一种操作简单、成本低、适用范围广泛的检测人口腔癌易感基因LINC00520多态性rs4144657的方法及检测试剂盒。
其技术方案如下：
用XcmI检测人口腔癌LINC00520易感基因rs4144657多态性的方法，包括以下步骤：
(a)抽提样品的基因组DNA；
(b)提供扩增人LINC00520基因多态性rs4144657位点附近序列的正向引物和反向引物，以步骤(a)提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；
(c)使用限制性内切酶对(b)中获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；
(d)将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定LINC00520基因多态性rs4144657的各基因型。其中，经电泳后有一条条带者为TT基因型，两条条带者为CC基因型，三条条带者为CT基因型。
进一步，步骤(b)中所述正向引物和反向引物的设计与合成具体为：碱基序列信息从NCBI的dbSNP数据库获取，在CHIP网站上进行核对，确定LINC00520多态位点碱基变异数据。
含LINC00520rs4144657的部分基因序列如SEQ:ID:NO:1所示；基因序列的第501个碱基Y代表了C/T多态，即为rs4144657的多态性位点。将以上序列粘贴至引物设计软件PrimerPremier 6.0中，设置引物长度和扩增目的片段长度等参数进行引物设计，根据GC含量和退火温度等选择最优上下游引物，再将此引物与Pubmed中的Blast序列比对功能(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行引物比对，最终确定的上下游引物为：
正向引物序列如SEQ:ID:NO:2所示；反向引物序列：如SEQ:ID:NO:3所示，按照正向引物序列和反向引物序列合成引物，引物的合成采用固相合成法，或者委托生物公司合成并检测正向和反向引物。
进一步，步骤(b)中PCR扩增反应中制备PCR扩增体系具体为：2×Taq PCR Mix 7.5μl、上游引物和下游引物各0.3μl、模板DNA 1.0μl，最后用双蒸水补充总体积至15μl。
PCR反应条件：第一个阶段为预变性阶段，94℃/5min；第二个阶段包括三个步骤共35个循环，依次设置为94℃/30s、64℃退火时间45s、72℃/45s；第三个阶段72℃/5min。扩增后的产物序列如SEQ:ID:NO:4所示。
进一步，步骤(c)中进行酶切的酶切体系具体为：PCR扩增产物5μl、上限制性内切酶0.5μl、Buffer 1.0μl，最后用双蒸水补充总体积至15μl。混匀后置于水浴锅中37℃水浴1-16小时。
进一步，步骤(d)琼脂糖凝胶电泳，确定基因多态性具体为：将酶切产物用3％的琼脂糖凝胶在4-10V/cm的条件下，电泳20-40min，至紫外灯下能分清明显的条带后并拍照鉴定。对于不同的基因型，rs4144657位点不同基因型展现出不同的条带，TT基因型为275bp的一个片段；CC基因型为120bp及155bp的两个片段；CT基因型为275bp，120bp及155bp的三个片段。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明采用PCR产物进行酶切电泳后即可进行基因型的鉴定工作，因此在实际运用中具有很大的灵活性，加之检测方法简单易行，因此是一种进行单碱基突变位点基因型鉴定的好方法。设计出的LINC00520多态性rs4144657的上下游引物，正向引物序列：5’-CTCAGCAAACCTCCAGCCAAGTAGT-3’，反向引物序列：5’-ACACAGTGACAACAGCCACCAATGT-3’以及限制性内切酶XcmI的使用。本发明所提供得检测人口腔癌易感基因LINC00520多态性rs4144657的方法简单、快速、安全、准确、灵敏度高,值得在临床和研究中推广,并可借鉴用于其它多态性基因的分型。
附图说明
图1是IL-1RA rs4144657位点的电泳图谱；
图2是LINC00520rs4144657位点CC基因型测序图谱(反向测序)；
图3是LINC00520rs4144657位点CT基因型测序图谱(反向测序)；
图4是LINC00520rs4144657位点TT基因型测序图谱(反向测序)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。
本发明的方法包括以下步骤：
(a)抽提样品的基因组DNA；
(b)提供扩增人LINC00520基因多态性rs4144657位点附近序列的正向引物和反向引物，rs4144657上游引物:5’-CTCAGCAAACCTCCAGCCAAGTAGT-3’，rs4144657下游引物:5’-ACACAGTGACAACAGCCACCAATGT-3’，以步骤(a)提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；
(c)使用限制性内切酶对(b)中获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；
(d)将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定LINC00520基因多态性rs4144657的各基因型。其中，经电泳后有一条条带者为TT基因型，两条条带者为CC基因型，三条条带者为CT基因型。
上述方法中涉及的扩增、抽提基因组、酶切等技术均可采用本领域的常规操作方法。本发明提供了一种检测口腔癌易感基因的方法，由于识别特定位点的限制性内切酶XcmI适用范围广，价钱较为经济，进而大大降低了检测SNP的成本。经序列分析发现，检测该C/T多态的方法可使用表1中的4种酶，其中表中前3种酶均含一错配碱基，此错配碱基的位置离突变位点都比较接近，这大大增加了引物设计的难度，加之要求上游或下游引物必须包含此错配碱基，这又使引物的设计增加了难度。综合考虑简单操作性与经济实用性，限制性内切酶XcmI是最佳选择。
表1中提供的限制性内切酶的价格从NEB公司(http://www.neb-china.com)，限制性内切酶的选择从WatCut限制性内切酶分析软件上获取(http://watcut.uwaterloo.ca/template.php？act＝snp_new)，以此作为限制性内切酶识别位点和价格的参考。
表1几种限制性内切酶识别序列及其价格
在本发明的实施中，正向引物和反向引物的设计采用Primer6.0软件进行，设计的原则综合考虑引物对PCR扩增的灵敏度、特异度以及扩增效率的影响。按照碱基互不配对的原则设计引物，引物长度一般在15～30碱基之间，过长或过短均会造成特异性差，过长还会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。引物GC含量在40％～60％之间，Tm值最好接近72℃，GC含量过高或过低都不利于引发反应。碱基要随机分布，引物自身及引物之间不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。扩增产物的单链不能形成二级结构。引物应具有特异性，引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测，以确保其与其它基
因不具有互补性。在此基础上，最终选取的
上游引物为5’-CTCAGCAAACCTCCAGCCAAGTAGT-3’，
下游引物为5’-ACACAGTGACAACAGCCACCAATGT-3’。
由此引物扩增出的面的片段275bp，扩增产物如下：
下划线部分分别为正向引物和反向引物，第114位碱基Y代表C/T多态即SNP位点rs4144657。该长为275bp的扩增产物经限制性内切酶XcmI酶切后可产生275bp，155bp(该片段下游序列相比上游序列由于XcmI酶切产生的粘性末端减少六个单链碱基)，120bp(该片段下游序列相比上游序列由于XcmI酶切产生的粘性末端增加六个单链碱基)共三种片段类型。基因型判定结果：TT突变基因型，长为275bp；CC野生基因型，长为120bp及155bp两条带；CT杂合基因型，长为275bp，120bp及155bp三条带。
凝胶电泳分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，琼脂糖(Agarose)是一种线性多糖聚合物，系从红色海藻产物琼脂中提取而来的。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的，可用于DNA片段的电泳。聚丙烯酰胺凝胶主要有两种方式：一是用于分离和纯化双链DNA片段的非变性聚丙烯酰胺凝胶，二是用于分离及纯化单链DNA片段的变性聚丙烯酰胺凝胶。但综合考虑实用性、便利性以及经济性，使用琼脂糖凝胶电泳不失为一种最佳选择。在本发明中，目的扩增产物使用5U限制性核酸内切酶XcmI水浴锅中酶切1-16h。酶切产物采用3％的琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下根据不同的条带判断野生纯合基因型，杂合基因型以及突变纯合基因型。
在本发明中，PCR扩增体系的反应条件并不受特别的限制，基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在94℃变性，再迅速冷却至64℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至72℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于待测DNA也没有较高的浓度及纯度要求，既可以是人体体液或组织中提取的DNA，也可以是经过预先降解处理的基因组。但为了方便实施以及减少受试者痛苦，一般优先选择从血液中进行基因组DNA的提取。
本发明提供了一种检测口腔癌易感性基因的方法，还公开了相应的检测试剂盒，该试剂盒含有扩增位点的引物。利用本发明检测位点的基因型，方法简单易行，快速高效，成本低廉，为口腔癌的诊断提供了一个简捷的新途径。
在本发明的具体实施方案中，本发明检测人LINC00520基因多态rs4144657的具体步骤如下：
(l)提取待测人基因组DNA模板，所述人基因组DNA模板为人体任何部分取得的人基因组模板。
(2)PCR扩增基因组DNA，对提取的模板基因组DNA进行PCR扩增，获得含多态附近序列的PCR产物。
(3)对PCR扩增产物用限制性核酸内切酶XcmI进行酶切反应，得到酶切产物；
(4)酶切产物进行琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下根据不同的条带判断野生纯合基因型，杂合基因型以及突变纯合基因型。
下面对上述各个主要步骤进行详细描述：
1材料与方法
1.1主要仪器与试剂
仪器：BCD-228CH冰箱(新飞电器)，HH-2数显恒温水浴锅(华峰仪器)，SmartGel凝胶成像仪(北京赛智创业)，GT9612梯度PCR仪(百泰克生物)，WD900SL23-2型号微波炉(格兰仕电器)，DG-300C型电泳仪(鼎国昌盛生物)等。
试剂：NEP004-1DNA提取试剂盒(鼎国昌盛生物)，50bp DNA Ladder(莱枫生物)，2×TaqPCR Mix(莱枫生物)，XcmI(NEB)，琼脂糖(SIGMA)等。
1.2引物设计
碱基序列信息从NCBI的dbSNP数据库获取，在CHIP网站上进行核对，确定LINC00520多态位点碱基变异数据。
含LINC00520rs4144657的部分基因序列如下：
CTTCTCCCCA基因序列的第501个碱基Y代表了C/T多态，即为rs4144657的多态性位点。将以上序列粘贴至引物设计软件Primer Premier 6.0中，设置引物长度和扩增目的片段长度等参数进行引物设计，根据GC含量和退火温度等选择最优上下游引物，再将此引物与Pubmed中的Blast序列比对功能(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行引物比对，最终确定的上下游引物为：
正向引物序列：5’-CTCAGCAAACCTCCAGCCAAGTAGT-3’，
反向引物序列：5’-ACACAGTGACAACAGCCACCAATGT-3’，按照正向引物序列和反向引物序列合成引物，引物的合成可以采用本领域通用的方法(如固相合成法)，亦可委托生物公司合成并检测正向和反向引物。
1.3限制性内切酶的选择
根据dbSNP中位点的碱基序列，用WatCut在线限制性内切酶分析软件，在线搜索获得可识别突变位点的限制性内切酶的信息，综合考虑其酶切特异性及经济适用性选择最佳的限制性内切酶XcmI。
1.4从全血中提取待测样本的基因组DNA
严格按照离心柱型DNA提取试剂盒操作步骤提取基因组DNA。
l)在1.5ml离心管中加入300μl血细胞后，再加入900μl细胞裂解液混和均匀，在冰上放置10min后，在离心机中12000rpm离心1min，弃上清，再次加入900μl细胞裂解液，用枪吹起沉淀并混匀后，重复上述步骤；
2)向沉淀物中加入600μl solution B溶液，用移液枪轻轻吹起沉淀后，加入10μl蛋白酶K混匀，在65℃水浴锅中放置30min后，12000rpm离心5min；
3)将离心管中的上清转入编号的新的离心管中，再向新的离心管中加入500μl无水乙醇，期间可能会出现絮状沉淀物，该絮状物即为DNA；
4)将混匀的液体转入离心柱中(若一次转不完，可分次转入)，室温静置2min，再12000
rpm离心1min，弃废液；
5)加入700μl已加入相应体积无水乙醇的solution C漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃废液；
6)加入700μl已加入相应体积无水乙醇的solution D漂洗液，室温静置2min，12000
rpm离心1min，弃废液；
7)加入500μl solution D漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液；
8)再次离心2min，将离心柱置于新的编过号的离心管中，敞口放入37℃恒温箱内10
min直至无明显乙醇味；
9)在硅基质膜中央加入已经预热到65℃的solution E 100μl，室温放置5min，12000rpm离心1min，重复上述步骤一次，终离心后的液体即为提取出的基因组DNA；
10)吸取2μl提取出的DNA用Nano Photometer Pearl微量分光光度计测定其浓度和纯度。
2结果
2.1PCR扩增
(1)根据提取基因组DNA的浓度，将研究对象的DNA进行稀释，使终浓度为20μg/μl。
(2)PCR扩增体系为2×Taq PCR Mix 7.5μl、上游引物和下游引物各0.3μl、模板DNA 1.0μl，最后用双蒸水补充总体积至15μl。
(3)PCR反应条件：第一个阶段为预变性阶段，94℃/5min；第二个阶段包括三个步骤共35个循环，依次设置为94℃/30s、64℃退火时间45s、72℃/45s；第三个阶段72℃/5min。扩增后的产物序列为：
下划线部分分别为正向引物和反向引物，第114位碱基Y代表C/T多态即SNP位点rs4144657。
2.2酶切反应
酶切体系为PCR扩增产物5μl、上限制性内切酶0.5μl、Buffer 1.0μl，最后用双蒸水补充总体积至15μl。混匀后置于水浴锅中37℃水浴1-16小时。
2.3基因型的判定
琼脂糖凝胶电泳，确定基因多态性：将酶切产物用3％的琼脂糖凝胶在4-10V/cm的条件下，电泳20-40min，至紫外灯下能分清明显的条带后并拍照鉴定。对于不同的基因型，rs4144657位点不同基因型展现出不同的条带(见图1)，TT基因型为275bp的一个片段；CC基因型为120bp及155bp的两个片段；CT基因型为275bp，120bp及155bp的三个片段。各基因型均经测序以进一步鉴定，测序结果(见图2-图4)显示与现有技术测得的结果完全相同。
下面是实施本发明的若干实施例：
实施例1.人口腔癌组织标本测定人LINC00520rs4144657多态性
在本发明的具体实施方案中，检测人LINC00520基因多态rs4144657的具体步骤如下：(l)获取手术切取的口腔癌组织，采用酚-氯仿法提取口腔癌组织的基因组DNA作为待测DNA，提取步骤如下：
1)将口腔癌组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取0.1g的组织进行碾磨，加入1ml的灭菌水，颠倒混匀，10000rpm离心10min，弃上清，以上步骤重复两次
2)加入200μl的DNA裂解液，5μl的蛋白酶K混匀，55℃水浴消化过夜。
3)消化完成后加入等体积的酚氯仿混合液(1:1)，剧烈震荡，使其变成奶咖色。12000rpm离心10min。
4)取上清时避免触及中间介质以及下层液体。加入等体积的氯仿后颠倒混匀。12000rm离心10min。
5)取上清，注意避免触及中间介质以及下层液体。加入1/10的醋酸钠以及2.5倍的无水乙醇，颠倒混匀，12000rpm离心10min，弃上清。
6)加入1ml 70％乙醇，使其白色沉淀悬浮，颠倒混匀数次，12000rpm离心10min，弃上清，室温静置5-10min使乙醇挥发干净。
7)加入50μl灭菌水溶解DNA，即得口腔癌组织基因组DNA。
(2)碱基序列信息从NCBI的dbSNP数据库获取，在CHIP网站上进行核对，明确准确无误后采用Primer Premier 6.0设计各位点引物，结合退火温度、GC含量以及Pubmed中的Blast序列比对结果(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)等信息筛选出最优引物为：
正向引物序列：5’-CTCAGCAAACCTCCAGCCAAGTAGT-3’，
反向引物序列：5’-ACACAGTGACAACAGCCACCAATGT-3’，
进行PCR引物扩增，制备PCR扩增体系：2×TaqPCRMix7.5μl，双蒸水5.9μl，上游引物0.3μl，下游引物0.3μl以及模板DNA1.0μl，充分混匀后即得15.0μl。PCR扩增反应体系；按照第一阶段：94℃变性5min，第二阶段共包括35个循环三个步骤，首先94℃变性30s，64℃退火45s，最后72℃延伸45s，第三阶段：72℃延伸5min，最终4℃储存以备用，即得长为275bp的PCR扩增产物；
(3)扩增后的SNP片段用限制性核酸内切酶XcmI 5U水浴锅中酶切1-16h，PCR反应产物5μl，限制性内切酶0.5μl，Buffer1.0μl以及无核酸酶纯水8.5μl共计15μl酶切体系，于水浴锅中37℃酶切1-16h，即得酶切产物。所述的识别CCAN5^N4TGG序列的限制性内切酶为内切酶XcmI及其同裂酶；所述的识别CCN5^N2GG序列的限制性内切酶为内切酶AfiI及其同裂酶；所述的识别GGTGAN8^序列的限制性内切酶为内切酶AsuHPI及其同裂酶；所述的识别C^TRYAG序列的限制性内切酶为内切酶BfmI及其同裂酶。但后三种酶需要将引物定点突变，综合考虑经济实用性以及简单操作性最终选择XcmI进行酶切鉴定；
(4)酶切产物采用3％的琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下根据不同的条带判断野生纯合基因型，杂合基因型以及突变纯合基因型(见表2)。
表2rs4144657位点基因型判定
实施例2.人外周血全血标本测定人LINC00520rs4144657多态性
与实施例1的步骤基本相同，只是采用下面的方法从人外周血中中提取基因组DNA作为待测DNA。
按照NEP004-1全血基因组DNA提取试剂盒的操作步骤进行待测血样基因组DNA的提取，具体步骤如下：
l)在1.5ml离心管中加入300μl血细胞后，再加入900μl细胞裂解液混和均匀，在冰上放置10min后，在离心机中12000rpm离心1min，弃上清，再次加入900μl细胞裂解液，用枪吹起沉淀并混匀后，重复上述步骤；
2)向沉淀物中加入600μl solution B溶液，用移液枪轻轻吹起沉淀后，加入10μl蛋白酶K混匀，在70℃水浴锅中放置10min后，12000rpm离心5min。
3)将离心管中的上清转入编号的新的离心管中，再向新的离心管中加入500μl无水乙醇，期间可能会出现絮状沉淀物，该絮状物即为DNA；
4)将混匀的液体转入离心柱中(若一次转不完，可分次转入)，室温静置2min，再12000
rpm离心1min，弃废液；
5)加入700μl已加入相应体积无水乙醇的solution C漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃废液；
6)加入700μl已加入相应体积无水乙醇的solution D漂洗液，室温静置2min，12000
rpm离心1min，弃废液；
7)加入500μl solution D漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液；
8)再次离心2min，将离心柱置于新的编号的离心管中，敞口放入37℃恒温箱内10min直至无明显乙醇味；
9)在硅基质膜中央加入已经预热到65℃的solution E 100μl，室温放置5min，12000rpm离心1min，重复上述步骤一次，终离心后的液体即为提取出的基因组DNA。
提取完基因组DNA后按照案例一的步骤进行基因型的鉴定，鉴定结果如下：将酶切产物用3％的琼脂糖凝胶电泳后于紫外灯下拍照鉴定。对于不同的基因型，rs4144657位点不同基因型展现出不同的条带(见图1)，CC纯合野生基因型，120bp及155bp两条带；CT杂合基因型，长为275bp，120bp及155bp三条带；TT纯合突变基因型，长为275bp一条带。各基因型均经测序以进一步鉴定，测序结果(见图2-图4)显示与现有技术测得的结果完全相同。
本发明提供一种操作简单、成本低、适用范围广泛的检测人口腔癌易感基因LINC00520多态性rs4144657的方法，此方便、快捷的检测人口腔癌易感基因LINC00520多态性rs4144657的方法有望预测口腔癌的易感性，可用于临床的早期诊断。
SNP检测技术已经很成熟，主要有以下几种检测方法：PCR-RFLP、TaqMan探针法、HRM法、SNapShot法、dHPLC、illuminaBeadXpress法等。因此，采用其他方法也同样可以完成SNP的检测，如测序法可以直接测出DNA序列中的所有突变位点的碱基替代情况，但该方法需要昂贵的仪器和较长的步骤，成本较高；AS-PCR的扩增效率较低，扩增特异性差，因此PCR产物的特异性与稳定性无法保障，同时，分型结果也较容易误判，稳定性较差；Taqman荧光探针法需要昂贵的仪器和较长的步骤,成本较高，难以在实验室中普及使用。鉴于本发明所使用的限制性内切酶价格低廉，且引物合成以及各试剂均较为经济，加之PCR-RFLP操作简单，重复性好，因此，不失为一个较好的选择。
本发明采用PCR产物进行酶切电泳后即可进行基因型的鉴定工作，因此在实际运用中具有很大的灵活性，加之检测方法简单易行，因此是一种进行单碱基突变位点基因型鉴定的好方法。技术关键点是设计出的LINC00520多态性rs4144657的上下游引物，正向引物序列：5’-CTCAGCAAACCTCCAGCCAAGTAGT-3’，反向引物序列：5’-ACACAGTGACAACAGCCACCAATGT-3’以及限制性内切酶XcmI的使用。本发明所提供得检测人口腔癌易感基因LINC00520多态性rs4144657的方法简单、快速、安全、准确、灵敏度高,值得在临床和研究中推广,并可借鉴用于其它多态性基因的分型。
以上所述仅为本发明最佳实施方式，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 郑州大学第一附属医院
<120> 用XcmI检测人口腔癌LINC00520易感基因rs4144657多态性的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1001
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcaacaattt gttcaaagtc tctaccttaa aggattttgg ggttctggtt tttgttttta 60
cctgccctgg taactcttct aagaatgagc caagaagaag acaaccttct aagatacttt 120
tcctgccctc caagggctgt ggagaatctg atagggttgg agctgccctc tcctcttccc 180
agagacactg ccccacaatc ccatcaagtc tgactggtac caacgactcc agggggcctc 240
tgccttcaga actgtatagg cctgtgtggg caccagtctt tacatccatg ttccctctcc 300
ctcgaggacc caggttgacc tgtccaagag ctctctcatc atgctgaatt ttggtgacag 360
catagggtga gcctgtggat tctacagctc agcaaacctc cagccaagta gtttcccttc 420
atatggttcc ccagtcttta catgtggcat ccaagaaggg aaagtatccc ctctcccttg 480
atgagatgtc agcccctcac yacacatggc ctgggtgcta ggaggaccca tacgggctag 540
ggaggggcca ctgggagggg aatgtgtagg gggcagaccc catctagctg cttcttgatg 600
agcctggcat ggagtgtttg atccaaatct tgacagcaca ttggtggctg ttgtcactgt 660
gtggcaggac ttgcagttga gcttcttgtg ccttggactt cttgtgactt ggacctcagc 720
ctccattgaa gaccgtaaca caagtcccaa cttacaaaca aatgagggaa tgaatgagct 780
ttggcattgg aaaaacctgg gttcaaatcc tggctactct acttcctgtg tcagttgctt 840
cacttttcta aatataaatt gtgttccttc tgttttggct tctaggaaac cccgagccaa 900
acgtatggcc acctctgacc actcgaccag cccagcatgg tgtacatttc tgggtagctt 960
atcacgcctt ccaagcattg cctttatctt ccttctcccc a 1001
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcagcaaac ctccagccaa gtagt 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acacagtgac aacagccacc aatgt 25
<210> 4
<211> 275
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcagcaaac ctccagccaa gtagtttccc ttcatatggt tccccagtct ttacatgtgg 60
catccaagaa gggaaagtat cccctctccc ttgatgagat gtcagcccct cacyacacat 120
ggcctgggtg ctaggaggac ccatacgggc tagggagggg ccactgggag gggaatgtgt 180
agggggcaga ccccatctag ctgcttcttg atgagcctgg catggagtgt ttgatccaaa 240
tcttgacagc acattggtgg ctgttgtcac tgtgt 275

Claims (5)

1.用XcmI检测人口腔癌LINC00520易感基因rs4144657多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)抽提样品的基因组DNA；
(b)提供扩增人LINC00520基因多态性rs4144657位点附近序列的正向引物和反向引物，以步骤(a)提取的待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；
(c)使用限制性内切酶对(b)中获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；
(d)将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定LINC00520基因多态性rs4144657的各基因型；其中，经电泳后有一条条带者为TT基因型，两条条带者为CC基因型，三条条带者为CT基因型。
2.根据权利要求1所述的用XcmI检测人口腔癌LINC00520易感基因rs4144657多态性的方法，其特征在于，步骤(b)中所述正向引物和反向引物的设计与合成具体为：碱基序列信息从NCBI的dbSNP数据库获取，在CHIP网站上进行核对，确定LINC00520多态位点碱基变异数据；
含LINC00520rs4144657的部分基因序列如SEQ:ID:NO:1所示；基因序列的第501个碱基Y代表了C/T多态，即为rs4144657的多态性位点；将以上序列粘贴至引物设计软件PrimerPremier 6.0中，设置引物长度和扩增目的片段长度参数进行引物设计，根据GC含量和退火温度选择最优上下游引物，再将此引物与Pubmed中的Blast序列比对功能http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi进行引物比对，最终确定的上下游引物为：
正向引物序列如SEQ:ID:NO:2所示；反向引物序列：如SEQ:ID:NO:3所示，按照正向引物序列和反向引物序列合成引物，引物的合成采用固相合成法，或者委托生物公司合成并检测正向和反向引物。
3.根据权利要求1所述的用XcmI检测人口腔癌LINC00520易感基因rs4144657多态性的方法，其特征在于，步骤(b)中PCR扩增反应中制备PCR扩增体系具体为：2×Taq PCR Mix7.5μl、上游引物和下游引物各0.3μl、模板DNA 1.0μl，最后用双蒸水补充总体积至15μl；
PCR反应条件：第一个阶段为预变性阶段，94℃/5min；第二个阶段包括三个步骤共35个循环，依次设置为94℃/30s、64℃退火时间45s、72℃/45s；第三个阶段72℃/5min；扩增后的产物序列如SEQ:ID:NO:4所示。
4.根据权利要求1所述的用XcmI检测人口腔癌LINC00520易感基因rs4144657多态性的方法，其特征在于，步骤(c)中进行酶切的酶切体系具体为：PCR扩增产物5μl、上限制性内切酶0.5μl、Buffer 1.0μl，最后用双蒸水补充总体积至15μl；混匀后置于水浴锅中37℃水浴1-16小时。
5.根据权利要求1所述的用XcmI检测人口腔癌LINC00520易感基因rs4144657多态性的方法，其特征在于，步骤(d)琼脂糖凝胶电泳，确定基因多态性具体为：将酶切产物用3％的琼脂糖凝胶在4-10V/cm的条件下，电泳20-40min，至紫外灯下能分清明显的条带后并拍照鉴定；对于不同的基因型，rs4144657位点不同基因型展现出不同的条带，TT基因型为275bp的一个片段；CC基因型为120bp及155bp的两个片段；CT基因型为275bp，120bp及155bp的三个片段。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105567847A (zh) * 2016-02-22 2016-05-11 郑州大学 一种用MspI检测人胃癌易感基因IL-1RN多态性rs9005的方法
CN105925712A (zh) * 2016-06-28 2016-09-07 郑州大学第附属医院 一种用XmnI鉴定人食管癌RAD51基因rs45549040多态性的方法
CN106319071A (zh) * 2016-09-30 2017-01-11 郑州大学第附属医院 用BsmAI鉴定人乳腺癌LINC‑ROR基因rs4801078多态性的方法
CN106434877A (zh) * 2016-08-29 2017-02-22 郑州大学 HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法
CN106434925A (zh) * 2016-09-30 2017-02-22 郑州大学第附属医院 用NsiI鉴定人乳腺癌LINC‑ROR基因rs6420545多态性的方法
CN106498034A (zh) * 2016-09-30 2017-03-15 河南省肿瘤医院 一种用BseNI鉴定人乳腺癌MALAT1基因rs619586多态性的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105567847A (zh) * 2016-02-22 2016-05-11 郑州大学 一种用MspI检测人胃癌易感基因IL-1RN多态性rs9005的方法
CN105925712A (zh) * 2016-06-28 2016-09-07 郑州大学第附属医院 一种用XmnI鉴定人食管癌RAD51基因rs45549040多态性的方法
CN106434877A (zh) * 2016-08-29 2017-02-22 郑州大学 HaeIII检测食管癌易感基因PTEN多态性方法
CN106319071A (zh) * 2016-09-30 2017-01-11 郑州大学第附属医院 用BsmAI鉴定人乳腺癌LINC‑ROR基因rs4801078多态性的方法
CN106434925A (zh) * 2016-09-30 2017-02-22 郑州大学第附属医院 用NsiI鉴定人乳腺癌LINC‑ROR基因rs6420545多态性的方法
CN106498034A (zh) * 2016-09-30 2017-03-15 河南省肿瘤医院 一种用BseNI鉴定人乳腺癌MALAT1基因rs619586多态性的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WI_SSAHASNP: "ss12273729", 《NCBI》 *
张建祖: "ADH1B R48H多态性与口腔癌的关联研究", 《包头医学院学报》 *

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