CN102115782B - 用于定量检测K-ras突变的试剂盒 - Google Patents

用于定量检测K-ras突变的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于定量检测K-ras突变的试剂盒。具体地说，本发明涉及与分子靶向抗癌药物疗效相关的K-ras基因突变检测方法及检测试剂盒。尤其涉及一种在K-ras基因突变热点区域检测突变的荧光定量PCR检测方法、试剂盒及其应用。本发明对K-ras基因特定位点的突变进行检测，并可对分子靶向抗肿瘤药EGFR酪氨酸激酶抑制剂进行疗效预测，进而对肿瘤患者的临床个体化用药方案提供指导。

Description

用于定量检测K-ras突变的试剂盒
发明背景 
K-ras基因属于ras癌基因家族，因其编码21kD的ras蛋白又名p21基因。K-ras基因是EGFR信号通路的重要分子之一，其编码产物处在EGFR通路的下游，在肿瘤细胞的生长、增殖、血管生成等过程中起着重要的“开关”作用。发生突变时，K-ras蛋白处于持续活性状态，失去对细胞生长的正常调控，可导致细胞持续生长、阻止细胞凋亡。不同肿瘤组织中K-ras基因突变率不同，其中胰腺癌82％，结肠癌43％，肺癌30％，甲状腺癌29％，膀胱、肝、肾和子宫癌10％或低于10％(BosJ.L.et al，Cancer Res，1989，49(17)：4682-4689)。由于突变K-ras的持续激活与EGFR活性是否被抑制无关，使得患者不能从抗EGFR治疗中获益(Amado R.G.et al，J.Clin.Oncol.，2008，26(10)：1626-1634；Lièvre A.et al，J.Clin.Oncol.，2008；26(3)：374-379)。因此通过对K-ras基因的突变检测，可以对抗EGFR药物的治疗效果做出一定的前瞻性评估，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而达到良好的预后。 
目前K-ras基因突变点主要集中于第12、13位氨基酸密码子(张健杰等，西安交通大学学报，2005，26(4)：349-351；何晓文等，中华消化杂志，2002，22(1)：26-28)，其中12密码子GGT碱基突变为GTT或GAT碱基为最常见的突变类型。本发明通过实时定量PCR方法检测分子靶向抗肿瘤药疗效相关的肿瘤相关基因K-ras 12、13密码子5种类型的突变情况，来预测爱必妥等分子靶向药物的治疗效果。 
本发明采用的检测方法具有以下几个优点：操作简单，易于标准化。其它方法如等位基因特异的寡核苷酸探针杂交法，对杂交的条件非常敏感，需要严格控制实验条件；限制性片段长度多态性实验需投入相当的人力操作，且不能定量。实验周期短，2小时内就可以完成。不需要测序验证结果，而直接测序法与高分辨溶解曲线分析需要4天-2周。敏感度高，我们通过对实验条件进行优化，突变检测的敏感度可达到1％，而直接测序法敏感度20-50％。特异性高，免疫组化方法假阳性与假阴性率高，且不能确定点突变的位置和类型；定量准确，这是本发明实验方法最独特的优点，通过绝对定量法处理数据，从而绘制标准曲线，精确 测定样本中野生型与突变型基因的含量，进而得到突变型基因所占比例，辅助临床诊断和用药。另外，本发明安全无毒性，其它方法如错配碱基的化学断裂法需要用到同位素和剧毒化学试剂。 
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种K-ras基因突变的定量检测试剂盒。定量检测K-ras基因12密码子(SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2)2155位GGT碱基突变为GTT、AGT、GAT或TGT碱基；13密码子(SEQ IDNO：1；SEQ ID NO：2)GGC碱基突变为GAC碱基的情况。 
为解决上述问题，本发明提供包含Taq酶、10×Taq缓冲液、MgCl2、dNTP混合液及可特异性扩增K-ras基因突变位点序列的PCR引物与可特异性识别野生型与突变型序列的探针的定量检测试剂盒及检测方法： 
(1)分别在K-ras基因12、13密码子突变位点附近设计上下游引物，以及根据每个突变位点的突变情况设计特异性的探针，该探针可与K-ras特定位点的野生型或欲检测的突变型序列特异性结合，从而确定该位点有无发生所检测的基因突变。 
(2)为精确定量所测K-ras突变比例，本发明设计了标准品。 
(3)对待测样品与标准品进行荧光定量PCR检测。 
(4)由标准品检测结果得到用于定量的标准曲线，由标准曲线计算得到待测样品核酸的K-ras基因突变占总体K-ras基因的比例。 
所述步骤(1)之前还包括：对待测样品中的核酸进行提取、纯化和浓度测定。 
荧光定量PCR检测所用探针在适宜的PCR条件下与K-ras基因突变位置的碱基序列特异性结合。所述探针优选在5’端连接有荧光发光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。所述的荧光发射基团选自：FAM、TET、HEX、ROX；所述的荧光淬灭基团选自：BHQ、TAMARA。优选地，所述荧光发射基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为BHQ。所述探针的序列优选为SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28。 
所述标准品至少包括质粒、基因组DNA或化学合成序列中的一种。 优选地，所述标准品包含野生型质粒和/或突变型质粒，其中野生型质粒包含K-ras基因野生型序列，突变型质粒包含K-ras基因突变型序列。更优选地，所述标准品由野生型质粒和/或突变型质粒组成。 
所述待检样品包括新鲜组织、石蜡包埋组织、细胞株、血液、胸腔积液、腹腔积液、唾液、消化液、尿液、唾液、粪便。 
所述引物由上游引物与下游引物组成。所述引物优选为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7。 
所述的K-ras基因突变的定量检测试剂盒包括选自以下的试剂：如上所述的引物、探针和标准品。所述试剂盒优选还包括Taq酶、10×Taq缓冲液、MgCl2、dNTP混合液。优选的引物与探针的比例为2∶1-10∶1，优选的正向与反向引物之间的比例为1∶3-3∶1。标准品包括以上所述的质粒按一定比例的混合，野生型质粒和突变型质粒的含量的比例分别为：0％-100％。 
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。 
图1是本发明实施例2所用质粒标准品构建方法示意图。 
图2是本发明实施例2野生型质粒图谱，箭头所指即为载体中插入野生型PCR产物序列的位置。 
图3是本发明实施例2K-ras野生型质粒测序图 
图4是本发明实施例2突变型质粒标准品测序结果图，箭头所指为碱基突变位点。其中图A是K-ras 12密码子GGT→GTT突变质粒测序图，图B是K-ras 12密码子GGT→AGT突变质粒测序图，图C是K-ras12密码子GGT→GAT突变质粒测序图，图D是K-ras 12密码子GGT→TGT突变质粒测序图，图E是K-ras 13密码子GGC→GAC突变质粒测序图 
图5是本发明实施例3的标准品扩增曲线图，其中图A是K-ras野生型质粒标准品扩增曲线，图B是K-ras 12密码子GGT→GTT突变质粒标准品扩增曲线，图C是K-ras 12密码子GGT→AGT突变质粒标准品扩增曲线，图D是K-ras 12密码子GGT→GAT突变质粒标准品扩增曲线，图E是K-ras 12密码子GGT→TGT突变质粒标准品扩增曲线，图F是K-ras 13密码子GGC→GAC突变质粒标准品扩增曲线。 
图6是根据图4绘制的标准曲线图，其中图A是K-ras野生型质粒标准曲线，图B是K-ras 12密码子GGT→GTT突变质粒标准曲线，图C是K-ras 12密码子GGT→AGT突变质粒标准曲线，图D是K-ras 12密码子GGT→GAT突变质粒标准曲线，图E是K-ras 12密码子GGT→TGT突变质粒标准曲线，图F是K-ras 13密码子GGC→GAC突变质粒标准曲线。 
图7是本发明实施例3检测的石蜡包埋组织样本K-ras 12密码子野生型(图A)与GGT→TGT突变型(图B)荧光定量PCR扩增曲线图，新鲜组织样本K-ras 12密码子野生型(图C)与GGT→GTT突变型(图D)荧光定量PCR扩增曲线图，全血样本13密码子野生型(图E)与GGC→GAC突变型(图F)荧光定量PCR扩增曲线图，细胞系样本K-ras 12密码子野生型(图G)与GGT→AGT突变型(图H)荧光定量PCR扩增曲线图。 
图8是本发明的定量方法示意图。 
实施例
以下的实施例用于为本领域中的普通技术人员提供有关如何实施和使用本发明的完整披露和描述，并且这些例子并非意在对发明人所认为的发明范围进行限制，亦非意指下文的实验是被实施的全部实验而且是仅可实施的实验。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南第三版(Sambrook J.)，或按照厂商所建议的条件。 
实施例1：人类新鲜肿瘤组织、石蜡包埋组织、外周血、胸水、人类细胞系基因组DNA抽提
我们所测试的人类癌细胞系包括非小细胞肺癌(NSCLC)(A549、H460、H838和H1703)、乳腺癌(MCF-7、BT474和HuL 100)、恶性多间皮瘤细胞系(H513、H2052、H290、MS-1和H28)、结肠癌细胞系(SW480)、头颈癌细胞系(U87)、子宫颈癌(Hela)、肉瘤细胞系(Mes-SA、Saos-2和A204)。 
所测试的人类新鲜肿瘤组织、外周血、石蜡包埋组织包括NSCLC、间皮瘤、结肠癌、恶性黑素瘤、肾癌、食道癌、甲状腺癌、恶性毒瘤和 卵巢癌。 
标本DNA抽提 
可以使用Qiagen公司、Promega公司、Roche公司的DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA，使用Gene公司Nanodrop ND1000型核酸微量测量仪检测所提DNA浓度与纯度(OD260/OD280约为1.8，OD260/OD230大于2.0)。下面以使用Promega公司的DNA提取试剂盒为例介绍样本DNA提取步骤： 
1.新鲜组织DNA抽提 
(1)用剪刀切取约黄豆粒大小的组织，置于研钵中，将组织剪碎，加液氮研成粉末。 
(2)加入600μl预冷的裂解液于研钵中，用1ml大枪头吹打6次，尽量使组织粉末与裂解液混匀，转移混合物到1.5ml EP管中，上下颠倒6次混匀后65℃水浴20分钟。 
(3)加3μl的RNA酶，上下颠倒6次混匀，37℃水浴20分钟。 
(4)冷却到室温，加200μl蛋白沉淀剂，上下颠倒6次混匀，冰上放置5分钟后13,000*g，室温离心4分钟。 
(5)转移上清至事先加600μl异丙醇(室温)的新EP管中，轻柔混匀6次后13,000*g，室温离心1分钟。 
(6)弃上清，加600μl 70％乙醇(室温)至沉淀中，上下颠倒6次混匀后13,000*g，室温离心1分钟。 
(7)吸干乙醇，空气干燥15分钟。 
(8)沉淀加入40μl DNA溶解液，65℃1小时或4℃过夜。 
2.石蜡包埋组织DNA抽提 
(1)将1mg或少于1mg的组织放入1.5ml离心管内。 
(2)加入新鲜制备的100μl温育缓冲液/蛋白酶K溶液。根据样品的类型，56℃温育过夜。 
(3)取出温育的样品管，加入两倍体积的裂解缓冲液。 
(4)高速涡旋振荡树脂10秒钟至树脂完全悬浮，加入7μl完全悬浮的树脂。高速涡旋振荡3秒钟后室温温育5分钟。 
(5)高速涡旋振荡2秒钟，将管子放在 
Figure GYZ000007017122700051
磁分离架上。磁分离立刻进行。
(6)小心去除所有溶液，不要触碰管壁上的树脂。 
(7)加入100μl裂解缓冲液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡2秒钟。 
(8)将管子放回到磁分离架上，并去除所有的裂解液。 
(9)加入100μl配制的1x洗涤液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡2秒钟。 
(10)将管子放回到磁分离架上，去掉所有洗涤液。 
(11)重复步骤9和10两次，共3次洗涤，并确保在最后一次洗涤后，除去所有的液体。 
(12)打开盖子，将管子放在磁分离架上，空气中干燥5分钟。 
(13)加入25μl洗脱液。 
(14)盖上管盖并高速涡旋振荡2秒钟。65℃温育5分钟。 
(15)取出温育的管子，高速涡旋振荡2秒钟。立即放到磁分离架上。 
(16)将DNA溶液小心地转移到选定的容器中。 
3.全血DNA抽提 
(1)收集抗凝全血300μl，加入900μl细胞裂解液，用1ml枪头吹打混匀6次，尽量使全血与细胞裂解液混匀，室温放置10分钟，期间用1ml枪头吹打混匀3次。 
(2)13,000*g，室温离心20秒后弃上清，剧烈震荡，加入300μl预冷的裂解液，用1ml枪头吹打混匀至沉淀完全溶解。 
(3)加1.5μl的RNA酶，上下颠倒6次混匀，37℃水浴20分钟。 
(4)冷却到室温，加100μl蛋白沉淀剂，上下颠倒6次混匀，冰上放置5分钟后13,000*g，室温离心4分钟。 
(5)转移上清至事先加300μl异丙醇(室温)的新EP管中，轻柔混匀6次后13,000*g，室温离心1分钟。 
(6)弃上清，加1ml 70％乙醇(室温)至沉淀中，上下颠倒6次混匀13,000*g，室温离心1分钟。 
(7)吸干乙醇，空气干燥15分钟。 
(8)沉淀加入40μl DNA溶解液，65℃1小时或4℃过夜。 
4.胸水DNA抽提 
(1)收集胸水5ml，2000rpm室温离心10分钟，取上清加入1ml细胞裂解液，颠倒混匀6次，室温放置10分钟。 
(2)13,000*g，室温离心20秒后弃上清，剧烈震荡，加入1ml预冷的 裂解液，混匀至沉淀完全溶解。 
(3)加3μl的RNA酶，上下颠倒6次混匀，37℃水浴20分钟。 
(4)冷却到室温，加200μl蛋白沉淀剂，上下颠倒6次混匀，冰上放置5分钟后13,000*g，室温离心4分钟。 
(5)转移上清至事先加5ml异丙醇(室温)的新EP管中，轻柔混匀6次后13,000*g，室温离心1分钟。 
(6)弃上清，加1ml 70％乙醇(室温)至沉淀中，上下颠倒6次混匀13,000*g，室温离心1分钟。 
(7)吸干乙醇，空气干燥15分钟。 
(8)沉淀加入40μl DNA溶解液，65℃1小时或4℃过夜。 
5.细胞系DNA抽提 
(1)收集至少约1×106的细胞并转移至1.5ml的EP管中，13,000*g，室温离心10秒，如果是贴壁细胞，收集细胞前要用胰酶消化。 
(2)弃上清，加200μl PBS洗细胞，13,000*g，室温离心10秒后，弃上清，剧烈震荡至沉淀混悬。 
(3)加入600μl预冷的裂解液，用1ml大枪头吹打混匀至没有肉眼可见的细胞块。 
(4)加3μl的RNA酶，上下颠倒6次混匀，37℃水浴20分钟。 
(5)冷却到室温，加200μl蛋白沉淀剂，上下颠倒6次混匀，冰上放置5分钟后13,000*g，室温离心4分钟。 
(6)转移上清至事先加600μl异丙醇(室温)的新EP管中，轻柔混匀6次后13,000*g，室温离心1分钟。 
(7)弃上清，加600μl 70％乙醇(室温)至沉淀中，上下颠倒6次混匀后13,000*g，室温离心1分钟。 
(8)吸干乙醇，空气干燥15分钟。 
(9)沉淀加入40μl DNA溶解液，65℃1小时或4℃过夜。 
实施例2：含突变型与野生型检测序列的质粒标准品的准备
1.野生型质粒构建(图1，图2)
1.1载体的准备 
TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。 
1.2插入片段的准备 
使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经步骤1提取的样本基因组DNA，反应体系与扩增条件如下表(表1、表2、表3)： 
表1：PCR反应体系(50μl)
Figure GYZ000007017122700081
表2：PCR引物 
Figure GYZ000007017122700082
表3：PCR扩增条件 
1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。 
1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。 
1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。 
1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为含野生型序列的标准品(图3)。 
2.突变型质粒构建：设计突变点处的突变引物，利用DPN1法得到含突变型序列的标准品。
2.1根据希望得到的突变序列，设计突变点处的突变引物(表4)。 
表4：突变引物 
Figure GYZ000007017122700091
2.2以5ng野生型质粒为模板，利用突变引物以及Pfu酶，突变目标位点。扩增体系与条件如表1、表4、表3。 
在制备含K-ras基因12密码子GGT→GTT突变序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入K-ras-1-F(SEQ ID NO：7)与K-ras-1-R(SEQ IDNO：8)引物；在制备含K-ras基因12密码子GGT→AGT突变序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入K-ras-2-F(SEQ ID NO：9)与K-ras-2-R(SEQ ID NO：10)引物；在制备含K-ras基因12密码子GGT→GAT突变序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入K-ras-3-F(SEQ ID NO：11)与K-ras-3-R(SEQ ID NO：12)引物；在制备含K-ras基因12密码子GGT→TGT突变序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入K-ras-4-F(SEQ IDNO：13)与K-ras-4-R(SEQ ID NO：14)引物；在制备含K-ras基因13密码子GGC→GAC突变序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入 K-ras-5-F(SEQ ID NO：15)与K-ras-5-R(SEQ ID NO：16)引物。 
2.3利用DPN1酶对步骤2.2.得到的产物进行处理，37℃温育1小时后产物回收，在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得。 
2.4利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。 
2.5将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为含突变型序列的标准品(图4)。 
实施例3：以肺癌与子宫颈癌样本为例：人类细胞系、人类新鲜肿瘤组织、外周血、石蜡包埋组织基因组DNA K-ras突变检测
1.荧光定量PCR反应模板为实施例1提取的肺癌与子宫颈癌样本基因组DNA与实施例2制备的标准品，以双蒸水为阴性对照。为制作标准曲线，标准品倍比稀释为1ng/μl、0.5ng/μl、0.25ng/μl、0.125ng/μl、0.0625ng/μl、0.03125ng/μl。 
2.反应体系及反应条件(表2、表5、表6、表7)，其中标记探针荧光发射基团选自：FAM、TET、HEX、ROX；荧光淬灭基团选自：BHQ、TAMARA。 
表5：荧光定量PCR反应体系(20μl/管) 
检测K-ras基因12、13密码子突变情况，需要配置6个体系，除探针不同外，体系中所用的其他试剂是相同的。若检测K-ras基因12、13 密码子野生型基因，体系中需要加入K-ras-w1(SEQ ID NO：17)或K-ras-w2(SEQ ID NO：18)探针；若检测K-ras基因12密码子GGT→GTT突变型基因，体系中需要加入K-ras-11(SEQ ID NO：19)或K-ras-12(SEQ ID NO：20)探针；若检测K-ras基因12密码子GGT→AGT突变型基因，体系中需要加入K-ras-21(SEQ ID NO：21)或K-ras-22(SEQ IDNO：22)探针；若检测K-ras基因12密码子GGT→GAT突变型基因，体系中需要加入K-ras-31(SEQ ID NO：23)或K-ras-32(SEQ ID NO：24)探针；若检测K-ras基因12密码子GGT→TGT突变型基因，体系中需要加入K-ras-41(SEQ ID NO：25)或K-ras-42(SEQ ID NO：26)探针；若检测K-ras基因13密码子GGC→GAC突变型基因，体系中需要加入K-ras-51(SEQ ID NO：27)或K-ras-52(SEQ ID NO：28)探针。 
表6：探针 
Figure GYZ000007017122700111
表7：扩增条件 
Figure GYZ000007017122700112
Figure GYZ000007017122700121
3.绘制标准曲线 
根据步骤3中标准品所得CT值结果绘制绘制标准曲线。图5为质粒标准品扩增曲线，在图中，上升的5条曲线自左到右依次分别代表倍比稀释为0.5ng/μl、0.25ng/μl、0.125ng/μl、0.0625ng/μl、0.03125ng/μl的质粒标准品的扩增曲线。横轴指循环数，纵轴指荧光检测值。由此可进一步绘制用于计算的标准曲线(图6)。在图6中，横轴为模板拷贝数的对数值，纵轴为CT值。其中模板拷贝数＝质量/分子量×6.02×1023，本实验中质粒由pMD18-T载体与插入片段共同组成，由于插入片段碱基长度基本一致，最大的差距仅有二十几个碱基的长度，相对于PMD18-T载体2692bp的长度影响不大，所以野生型与突变型质粒标准品的拷贝数之比≈质量之比。 
4.标本K-ras基因特定突变型比例计算 
根据标准曲线，由样本的CT值求出反应的野生型与突变型基因组DNA的拷贝数，从而求得突变型K-ras DNA与K-ras DNA总量(该位点野生型加所有突变型)的比值。如图7所示测得某肺癌石蜡包埋组织样本K-ras 12密码子野生型CT值为19.15(图7A)，GGT→TGT突变型为20.74(图7B)，则分别由对应的标准曲线公式(图6)可以求得各自的拷贝数，由此可知突变型与野生型的含量之比为30∶70，推测组织中有约30％的K-ras基因发生12密码子GGT→TGT突变。 
5.检测结果 
本实施例对48例肺癌与胰腺癌的组织、全血与细胞系标本进行了K-ras基因突变的检测。共检测到10例发生突变，具体的突变例数见表8，突变比例即该样本中突变基因与未突变基因的比值见表9 
表8：K-ras突变例数 
Figure GYZ000007017122700131
表9：K-ras突变比例 
Figure GYZ000007017122700132
Figure IYZ249001081290900011
Figure IYZ249001081290900021
Figure IYZ249001081290900031
Figure IYZ249001081290900051
Figure IYZ249001081290900071
Figure IYZ249001081290900081
Figure IYZ249001081290900091
Figure IYZ249001081290900101

Claims (4)

1.一种K-ras基因突变的定量检测试剂盒，其中所述突变为K-ras基因12密码子2155位GGT碱基突变为GTT、AGT、GAT或TGT碱基；或者13密码子GGC碱基突变为GAC碱基，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)一种聚合酶链式反应引物，所述引物为SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：6；
(2)一种荧光定量PCR探针，所述探针为：
用于检测K-ras基因12密码子GGT→GTT突变型基因的SEQ IDNO：19或SEQ ID NO：20；
用于检测K-ras基因12密码子GGT→AGT突变型基因的SEQ IDNO：21或SEQ ID NO：22；
用于检测K-ras基因12密码子GGT→GAT突变型基因的SEQ IDNO：23或SEQ ID NO：24；
用于检测K-ras基因12密码子GGT→TGT突变型基因的SEQ IDNO：25或SEQ ID NO：26；或
用于检测K-ras基因13密码子GGC→GAC突变型基因的SEQ IDNO：27或SEQ ID NO：28；以及
(3)一种标准品，该标准品包含野生型质粒和突变型质粒，其中野生型质粒包含K-ras基因野生型序列，突变型质粒包含K-ras基因突变型序列，所述突变型质粒包含的K-ras基因突变型序列为K-ras基因12密码子2155位GGT碱基突变为GTT、AGT、GAT或TGT碱基；或者13密码子GGC碱基突变为GAC碱基。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针5’端连接有荧光发光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的荧光发光基团是：FAM、TET、HEX或ROX；所述荧光淬灭基团是：BHQ或TAMARA。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，引物与探针的比例为2∶1-10∶1，正向与反向引物之间的比例为1∶3-3∶1。
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Assignee: Zhongguancun Technology Leasing Co., Ltd

Assignor: BEIJING ACCB BIOTECH Ltd.

Contract record no.: X2021980013219

Denomination of invention: Kit for quantitative detection of K-ras mutation

Granted publication date: 20140618

License type: Exclusive License

Record date: 20211124

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Denomination of invention: Kit for quantitative detection of K-ras mutation

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Granted publication date: 20140618

Pledgee: Zhongguancun Technology Leasing Co., Ltd

Pledgor: BEIJING ACCB BIOTECH Ltd.

Registration number: Y2021980013701

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