CN110438223A

CN110438223A - 检测Kras基因点突变的引物、探针及其试剂盒与检测方法

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Publication number: CN110438223A
Application number: CN201810489924.0A
Authority: CN
Inventors: 房健民; 蒋明; 于丽华
Original assignee: SUZHOU RESEARCH INSTITUTE OF TONGJI UNIVERSITY
Current assignee: SUZHOU RESEARCH INSTITUTE OF TONGJI UNIVERSITY
Priority date: 2018-05-03
Filing date: 2018-05-21
Publication date: 2019-11-12
Anticipated expiration: 2038-05-21
Also published as: CN110438223B

Abstract

本发明涉及基因技术领域，尤其涉及检测Kras基因点突变的引物、探针及其试剂盒与检测方法。本发明提供了检测基因点突变的荧光定量PCR引物、探针组合以及检测方法，该方法操作简单方便，既可对Kras基因的8种突变类型进行分型检测又可一个反应同时对Kras基因的8种突变类型进行定性检测。提供的引物、探针的特异性强，灵敏度高：突变检测选择性可达到0.01％；结果判读简单明确，只需根据Ct值判定样品突变结果，无需△Ct值的换算和熔解曲线分析。

Description

检测Kras基因点突变的引物、探针及其试剂盒与检测方法

本申请要求于2018年05月03日提交中国专利局、申请号为201810413462.4、发明名称为“检测Kras基因点突变的引物、探针及其试剂盒与检测方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及基因技术领域，尤其涉及检测Kras基因点突变的引物、探针及其试剂盒与检测方法。

背景技术

Kras基因是ras基因家族成员之一，是与人类肿瘤相关的基因，位于12号染色体短臂上。Kras基因编码21kDa的ras蛋白，是表皮生长因子受体EGFR信号通路中的一种重要蛋白，Kras基因突变可介导EGFR的异常激活，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控产生癌变，Kras基因突变检测可了解患者的癌基因突变情况。研究发现Kras基因突变与EGFR靶向药物的治疗效果密切相关，可导致肺癌、结直肠癌等肿瘤治疗中对EGFR的靶向用药失效。Kras基因突变多发生在N端12、13和61密码子，15％～30％的非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer,NSCLC)存在Kras密码子12和13突变，其已被证实是靶向药物厄洛替尼或吉非替尼治疗的负相关因素。另外的研究表明，32％的结直肠癌患者存在Kras突变，西妥昔单抗和帕尼单抗对Kras突变的结直肠癌患者无效，只有Kras基因野生型患者才能从EGFR单抗中获益，美国国家癌症综合治疗联盟《结直肠癌临床实践指南》(V3,2011)已明确指出结直肠癌患者在使用EGFR靶向药物(如西妥昔单抗和帕尼单抗)治疗前必须进行Kras基因突变检测，只有Kras基因野生型患者才建议使用。此外，研究发现Kras基因突变患者的预后较差。因此，Kras基突变检测有助于了解EGFR靶向药物的敏感性，并且可用于了解肿瘤的发生发展、预后和治疗效果。

生物组织中的基因突变通常为稀有突变，往往存在于大量野生型基因背景下。点突变的检测相比移码突变更容易受野生型背景的干扰,因此点突变的检测需要一种高分辨率和高灵敏度的检测方法。传统的基因点突变检测方法包括免疫组化、荧光原位杂交和Sanger测序法，对样本进行检测普遍存在固有的方法学上的局限性，包括检测材料要求苛刻，灵敏度低，假阳性率高等。后来出现的PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法将PCR与限制性酶切及电泳检测相结合，可适当提高突变检测灵敏度，但该实验操作较繁琐，检测周期长，酶切不完全易产生假阳性结果，并且不能适用于所有的点突变类型。ARMS-PCR技术的出现使野生型背景下对点突变基因的检出效率大大提高，检测灵敏度可接近1％。随后又出现多种ARMS-PCR相关的改进技术，例如酶切富集PCR结合ARMS PCR技术在同一反应体系中采用适当的限制性内切酶酶切野生型基因，再进行模板富集和突变检测,该方法虽然可降低野生型基因背景，但受酶切位点的限制该技术同样只适用于某些点突变类型，并且其采用的较高Tm值的富集引物在第二步扩增中亦可与模板结合扩增，会产生假阳性结果。近年来又出现了在ARMS-PCR技术基础上的非特异性基因阻滞技术ASB荧光PCR及其衍生方法cast-PCR，通过在ARMS PCR反应体系中加入阻滞引物，特异性阻滞野生型模板的扩增，使突变基因的检测特异性获得了提升。目前的基因点突变检测技术检测灵敏度和选择性最高可达到1％～0.1％，即要求检测样品中突变细胞占总细胞数0.1％～1％以上。

目前的技术仍然都是以肿瘤组织为主要检测标本，研究发现肿瘤患者血浆DNA含量较正常人高，尤其是在癌症转移病人的血浆中更高，甚至可达到4000ng/ml，肿瘤患者血浆中的肿瘤细胞，与原发病灶有较好的同源性，因此可通过检测肿瘤患者血浆中DNA的突变情况来了解肿瘤DNA的突变情况。由于外周血获取方便快捷，病人也更容易接受，是更为理想的检测样本。可是血浆中DNA突变率往往小于0.1％，现有技术的检测灵敏度和特异性不能满足血液样品检测的需求。

现有基因点突变PCR检测方法在检测复杂的样本时仍然存在一些问题：1)检测灵敏度不够高，对一些基因点突变含量较低的样品，尤其是血液样品，仍无法有效检出突变基因，易出现假阴性结果；2)错误率高，在大量野生型基因背景下，引物容易发生错配出现漏检和错检3)引物探针设计复杂或需要多重扩增引物，成本较高；4)检测结果判断复杂，需要计算△Ct值或需要结合熔解曲线分析；5)操作复杂，受检测灵敏度和特异性限制，不能一个反应同时检测多种点突变类型，增加了操作的复杂性。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供检测Kras基因点突变的引物、探针及其试剂盒与检测方法，本发明提供的检测方法操作简便，特异性强、灵敏度高、结果判断简单明确。

本发明提供了一种检测基因点突变的荧光定量PCR引物、探针组合，其包括等位基因特异性引物、基因座特异性引物、封闭引物、检测探针；

因特异性引物、基因座特异性引物、封闭引物、检测探针；

所述等位基因特异性引物与突变型模板结合，其3’端第4～6位设置突变位点；

所述封闭引物与野生型模板结合而不与突变型模板结合，其3’端不能延伸；

所述基因座特异性引物，与模板的非突变区域结合；

所述检测探针与突变型模板结合，其5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。

本发明中，所述等位基因特异性引物为反向引物；所述封闭引物为反向引物，所述基因座特异性引物为正向引物。

本发明中，所述封闭引物经锁核酸修饰；所述封闭引物3’端设置修饰非荧光基团。

所述非荧光基团为小沟结合剂或磷酸基团。

本发明所述基因座特异性引物为互补于突变型等位基因模板序列的3’并且在相对链上的靶序列区域，与等位基因特异性引物的扩增片段在50～300bp；

本发明中，所述检测探针，其与突变等位基因特异性引物结合链相同的寡核苷酸序列，含有可指示扩增的信号传导分子。

本发明中，所述封闭引物3’末端经磷酸化修饰。

本发明中，所述锁核酸的修饰位点是包含突变等位基因相对应的野生型等位基因位点的碱基。

如等位基因特异性引物与封闭引物的Tm值差值△Tm＜5，所述封闭引物可采用碱基修饰的方法提高Tm值。

本发明提供的引物、探针组合中，还包括内控引物和内控探针。

本发明中，所述内控引物探针为可扩增基因组中不含突变位点的任意保守区域。

本发明还提供了一种检测基因点突变的荧光定量PCR方法，其以本申请所述的引物、探针组合，对待测样品进行扩增；

所述扩增包括高温扩增和低温扩增两个阶段；高温扩增阶段和低温扩增阶段的退火温度相差4～6℃。

人类Kras基因位于基因组第12号染色体上，Kras基因组DNA序列见Genbank：NG_007524.1，Kras基因点突变主要集中在外显子2和外显子3上，现有的Kras基因突变检测试剂盒通常检测Kras基因7种常见点突变类型，我们在对一百多例肺癌临床样本的Kras基因突变检测中发现Kras基因G37T点突变亦较常见，故除7种常见点突变类型，本发明将Kras基因G37T突变纳入检测范围，本发明检测的Kras基因点突变类型见表1。

表1.Kras基因8种常见点突变类型

突变名称	碱基变化	氨基酸变化
			Kras-M1	GGT>AGT(G34A)	Gly>Ser(G12S)
Kras-M2	GGT>TGT(G34T)	Gly>Cys(G12C)
			Kras-M3	GGT>CGT(G34C)	Gly>Arg(G12R)
Kras-M4	GGT>GTT(G35T)	Gly>Val(G12V)
			Kras-M5	GGT>GAT(G35A)	Gly>Asp(G12D)
Kras-M6	GGT>GCT(G35C)	Gly>Ala(G12A)
			Kras-M7	GGC>TGC(G37T)	Gly>Cys(G13C)
Kras-M8	GGC>GAC(G38A)	Gly>Asp(G13D)

本发明针对Kras基因的8种常见点突变类型采用多种手段的组合来改善PCR扩增过程中突变型和野生型等位基因变体的区分能力(通过增大△Ct值)。针对突变等位基因设计优化筛选等位基因特异性引物及探针、针对野生型位点设计封闭引物，同时根据内控基因序列设计内控引物、探针，将其包含在不同或同一个反应体系中，并采用突变富集扩增的反应条件，对Kras基因点突变进行分型检测或单体系多点突变检测。

本发明提供了一种检测Kras基因点突变Kras-M1的荧光定量PCR引物、探针组合，

包括等位基因特异性引物、基因座特异性引物、封闭引物、检测探针；

所述等位基因特异性引物包含SEQ ID NO.53所示的核苷酸序列；

所述封闭引物核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示；

所述基因座特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示；

所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No:49所示。

一些实施例中，检测Kras基因点突变Kras-M1的等位基因特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

本发明提供了一种检测Kras基因点突变Kras-M2的荧光定量PCR引物、探针组合，包括等位基因特异性引物、基因座特异性引物、封闭引物、检测探针；

所述等位基因特异性引物包含SEQ ID NO.54所示的核苷酸序列；

所述封闭引物核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示；

所述基因座特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示；

所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No:49所示。

一些实施例中，检测Kras基因点突变Kras-M2的等位基因特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。

本发明提供了一种检测Kras基因点突变Kras-M3的荧光定量PCR引物、探针组合，

所述等位基因特异性引物包含SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列；

所述封闭引物核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示；

所述基因座特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示；

所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:49所示。

一些实施例中，检测Kras基因点突变Kras-M3的等位基因特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示。

本发明提供了一种检测Kras基因点突变Kras-M4的荧光定量PCR引物、探针组合，包括等位基因特异性引物、基因座特异性引物、封闭引物、检测探针；

所述等位基因特异性引物包含SEQ ID NO.56所示的核苷酸序列；

所述封闭引物核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示；

所述基因座特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示；

所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No:49所示。

一些实施例中，检测Kras基因点突变Kras-M4的等位基因特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。

本发明提供了一种检测Kras基因点突变Kras-M5的荧光定量PCR引物、探针组合，包括等位基因特异性引物、基因座特异性引物、封闭引物、检测探针；

所述等位基因特异性引物包含SEQ ID NO.57所示的核苷酸序列；

所述封闭引物核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示；

所述基因座特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示；

所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No:49所示。

一些实施例中，检测Kras基因点突变Kras-M5的等位基因特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示。

本发明提供了一种检测Kras基因点突变Kras-M6的荧光定量PCR引物、探针组合，包括等位基因特异性引物、基因座特异性引物、封闭引物、检测探针；

所述等位基因特异性引物包含SEQ ID NO.58所示的核苷酸序列；

所述封闭引物核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示；

所述基因座特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示；

所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No:49所示。

一些实施例中，检测Kras基因点突变Kras-M6的等位基因特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示。

本发明提供了一种检测Kras基因点突变Kras-M7的荧光定量PCR引物、探针组合，包括等位基因特异性引物、基因座特异性引物、封闭引物、检测探针；

所述等位基因特异性引物包含SEQ ID NO.59所示的核苷酸序列；

所述封闭引物核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示；

所述基因座特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示；

所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No:49所示。

一些实施例中，检测Kras基因点突变Kras-M7的等位基因特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示。

本发明提供了一种检测Kras基因点突变Kras-M8的荧光定量PCR引物、探针组合，包括等位基因特异性引物、基因座特异性引物、封闭引物、检测探针；

所述等位基因特异性引物包含SEQ ID NO.60所示的核苷酸序列；

所述封闭引物核苷酸序列如SEQ ID NO:47所示；

所述基因座特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示；

所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No:49所示。

一些实施例中，检测Kras基因点突变Kras-M8的等位基因特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:42所示。

本发明提供的上述引物、探针组合中，还包括内控引物和内控探针；所述内控基因为actin。

本发明提供的检测Kras基因点突变的试剂盒，包括检测Kras基因点突变Kras-M1～8任一项所述的引物、探针组合中的至少一项以及内控引物和内控探针。

本发明提供的试剂盒中，等位基因特异性引物包括8条引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42所示；

封闭引物包括2条引物，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47所示；

基因座特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示；

检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No:49所示。

本发明中，所述Kras封闭引物，至少包含ACGCCACCAGC的碱基序列，其3’末端采用磷酸化修饰。

或，Kras封闭引物，至少包含ACG+CCA+C+CAGC的碱基序列，其中+代表锁核酸修饰，并且封闭引物3’末端采用磷酸化修饰。

或，Kras封闭引物，至少包含ACGCCACCAGC的碱基序列，其3’末端采用MGB修饰。

本发明所述检测探针序列5’端标记有Fam报告荧光染料，3’端标记有BHQ1淬灭荧光染料。

本发明所述检测Kras基因点突变的引物、探针组合，还包括内控引物和内控探针；所述内控基因为actin。

内控探针5’端标记有JOE报告荧光染料，3’端标记有BHQ1淬灭荧光染料。

本发明还提供了一种检测Kras基因点突变的试剂盒，其包括检测Kras基因点突变的引物、探针组合，和荧光定量PCR试剂。

所述荧光定量PCR试剂包括Taq酶。本发明实施例中，采用的Taq酶为Premix Taq^TMHot Start。

本发明还提供了一种检测Kras基因点突变的荧光定量PCR方法，以本发明提供的检测Kras基因点突变的引物、探针组合，对待测样品进行扩增；

本发明实施例中，扩增的条件包括：

本发明实施例中，扩增的反应体系中包括：

本发明中，用于检测高野生型背景下的稀有点突变DNA。

本发明中，用于检测的DNA样品为基因组DNA(gDNA)。

本发明中，所述DNA样品可为血液或组织来源。

本发明提供的引物、探针的检测选择性可达到0.01％。

本发明提供的方法，根据扩增的Ct值判定样品突变结果，当突变检测Ct值<30时，突变阳性；突变Ct值≧30时，内控Ct值<30时，突变阴性；突变Ct值≧30时，内控Ct值≧30时，建议重新检测。

本发明还提供了Kras基因点突变Kras-M8在制备肺癌检测标志物中的应用。

本发明提供了检测基因点突变的荧光定量PCR引物、探针组合以及检测方法，更具体的提供了检测Kras基因点突变的荧光定量PCR引物、探针组合。本发明的有益效果包括：(1)操作简单方便：本发明的检测方法是针对Kras基因8种常见点突变位点设计的，既可对Kras基因的8种突变类型进行分型检测又可一个反应同时对Kras基因的8种突变类型进行定性检测，每种样品只需加样一次，操作简单，降低了使用成本；(2)特异性强，灵敏度高：等位基因特异性引物、封闭引物与突变富集扩增方法结合，突变检测选择性可达到0.01％；(3)结果判读简单明确：只需根据Ct值判定样品突变结果，无需△Ct值的换算和熔解曲线分析；(4)闭管检测，污染可能性小；(5)安全，整个反应体系无有害物质；(6)适用范围广:可以血浆为检测对象，采样方便，需要量少，可在临床大规模使用，也适用于突变模板含量较少的体液或组织样品的Kras突变检测。

附图说明

图1.显示了一个示例性实施例7中本发明方法3例突变阳性组织样品的检测结果及对应的测序结果，两种方法检测结果一致；

图2.显示一个示例性实施例8中采用本发明方法检测的血浆突变样品对应的组织测序结果；

图3.显示了一个示例性实施例9采用本发明方法的Kras单体系多点突变定性检测试剂对Kras基因G34T突变的检测灵敏度，可检测到1～10个拷贝的突变DNA；

图4.显示了一个示例性实施例10采用本发明方法的Kras单体系多点突变定性检测试剂对Kras G34A突变检测的选择性，可检测到3×10⁴拷贝野生型DNA背景下的3个拷贝的突变DNA。

具体实施方式

本发明提供了检测Kras基因点突变的引物、探针及其试剂盒与检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

复杂样本中的突变型等位基因的扩增经常被一些因素干扰，所述因素包括：突变型等位基因特异性引物错配至野生型等位基因并发生延伸。此类错配和延伸在检测包含过量的野生型等位基因和少量突变型等位基因的样品时尤其严重。当野生型等位基因过量到一定程度，突变型等位基因特异性引物的错配和延伸可以阻碍突变型等位基因的检测。当使用基于PCR的方法时，含有野生型等位基因的样品中的突变型等位基因的区分依赖于突变型等位基因的选择性扩增，同时防止该样品中存在的野生型等位基因的扩增或使其扩增最小化。所述因素还包括：样本中基因含量稀少且片段化严重，如外周血中ctDNA，一方面使得PCR灵敏度无法有效检出目标基因，另一方面野生型等位基因会进一步降低突变型等位基因的检出率。所述因素还包括：当同一体系中存在多种突变型等位基因特异性引物时，这些引物会产生相互干扰，降低检出效率。

研究发现，多种手段，其单独使用或组合在一起使用可增强ARMS-PCR对复杂样本中不同等位基因变体的区分能力，如增大突变型等位基因特异性引物对突变型等位基因模板与野生型等位基因模板匹配能力的差别，能够提升对两种等位基因变体的区分能力。此类手段包括，例如，使用下列一项或多项:(a)加尾的突变型等位基因特异性引物,以调整等位基因特异性引物的Tm值；(b)引入错配碱基的突变型等位基因特异性引物，以降低突变型等位基因特异性引物与野生型等位基因模板的结合能力；(c)突变富集扩增的反应条件，采用较高退火温度的预循环，该温度条件下仅有突变模板能被结合扩增，突变模板被富集，然后采用较低退火温度的循环扩增进行高效扩增。上述手段通过系统降低突变型等位基因特异性引物对模板结合能力来降低其错配几率。另一类手段针对野生型等位基因模板进行阻滞或中和以降低其对突变型等位基因特异性引物的结合能力，但不影响突变型特异性引物对突变模板的结合能力。例如使用下列一项或多项：(a)野生型等位基因特异性封闭引物，其被设计为与野生型等位基因互补，可阻止突变型等位基因特异性引物结合到样品中的野生型等位基因并进行扩增；(b)野生型等位基因特异性封闭引物可以设计为包含修饰碱基的封闭引物以增大其Tm值，增强对靶序列的结合力；和(c)增加封闭引物和等位基因特异性引物Tm值的差值即增加两者的△Tm值提高突变检测的特异性和选择性。

上述手段，尤其是当组合使用时，一方面能够影响等位基因特异性PCR的区分存在于样品中的突变型和野生型等位基因的能力。因此，本说明书大体上涉及新的扩增方法利用上述手段的组合以改善PCR过程中突变型和野生型等位基因变体的区分能力(通过增大△Ct值)。在一些实施方式中，本方法可以涉及高水平的选择性，其中可以检出至少1000-1000000例如大约1000-10000大约10000-100000，大约20000至25000，大约30000至300000，大约40000至400000，大约50000至500000，大约75000至750000或大约100000-1000000或其中的任意部分范围的野生型分子背景中的1-100个突变分子。

上述手段，尤其是当组合使用时，一方面能够提高体系中稀有基因的检出能力。因此，本说明书大体上涉及新的扩增方法利用上述手段的组合以改善PCR过程中稀有的突变型等位基因变体的检出灵敏度。在一些实施方式中，本方法可以涉及高水平的灵敏度，其中可检出10-100微升反应体系中的至少1-10个拷贝的突变分子，例如可检测10-25微升反应体系，大约25-50微升反应体系或大约50-100微升反应体系或其中任意部分范围中的1-10个拷贝的突变分子。

上述手段，尤其是当组合使用时，另一方面能够降低体系中多条等位基因特异性引物的相互干扰。因此，本说明书大体上涉及新的扩增方法利用上述手段的组合以在同一体系中使用多条突变型等位基因特异性引物，一次性定性检出可能存在的突变。在一些实施方式中，本方法可以在同时存在某基因1-8种点突变的样品中确定是否存在该基因突变，例如可对同时存在某基因1-3种点突变,3-5种点突变或5-8种点突变或其中任意部分范围的样品检测确定是否存在该基因突变。

术语定义解释：

为了解释本说明书及其相关的权利要求的目的，适用下列定义，在所有适当的情况下，单数形式的术语也包括复数形式。如果出现下文给出的任意定义与任何其他文献(包括通过引用方式并入本文的任何文献)中使用的该词语相矛盾的情况，一律以下文给出的定义为准，除非明确指出了相反含义。

如本说明书使用的术语“等位基因”一般是指DNA区段例如同源染色体上的相同物理基因座上的备选DNA序列。等位基因可以指：单一细胞或生物体内的同源染色体上存在的相同物理基因座之间有差异的，或者多个细胞或生物体内的相同物理基因座之间有差异的DNA序列(等位基因变体)。在一些情况下，等位基因可以对应于特定物理基因座上的单核苷酸差异。在一些情况下，等位基因可以对应于核苷酸(单个或多个)插入或删除。本说明书中使用的突变型等位基因是指与肿瘤发生发展或耐药等事件相关的等位基因突变体，野生型等位基因是指存在于正常生物体内的未发生突变的等位基因。

如本说明书使用的术语"等位基因特异性引物"是指与包含目标等位基因的序列杂交并且当用于PCR中时可以被延伸以完成第一链cDNA合成的寡核苷酸序列。等位基因特异性引物特异于给定的靶DNA或基因座的特定等位基因，并且可以被设计为检测靶序列中的少至1个核苷酸的差异。等位基因特异性引物可以包含等位基因特异性核苷酸部分、靶标特异性部分和/或尾巴。突变型等位基因特异性引物:是指与包含目标突变等位基因的序列杂交并且当用于PCR中时，可以被延伸以完成第一链cDNA合成的寡核苷酸序列。本说明书使用的术语突变型等位基因特异性引物(本文中也称作“突变型特异性引物”、“突变引物”)的等位基因特异性核苷酸部分位于3’末端，选择使用高度区分性碱基，其与突变的等位基因位点匹配，与相应的野生型等位基因错配，该引物可选择性扩增突变型等位基因模板，从而区分出相应突变类型。例如，当检测的等位基因包含A/G或C/T突变时(G和T为突变等位基因)，G或T可被用作等位基因特异性引物的3’末端等位基因特异性核苷酸部分。

如本说明书使用的术语“错配碱基”是指在等位基因特异性引物中，引入与其模板的互补序列中不匹配的碱基，用于降低引物和模板的Tm值，例如与模板匹配的等位基因特异性引物序列为GCAGGCTATTTCAAG，则引物GCAGGCTATTTCgAG为在其倒数第3位引入错配碱基g的等位基因特异性引物，引入错配碱基的等位基因特异性引物与野生型模板的结合Tm值进一步降低，结合能力降低，有利于提高突变检测的特异性。

如本说明书使用的术语"野生型等位基因特异性封闭引物"(在本文中也称作"封闭探针"、"封闭引物"、"封闭剂")是指这样的寡核苷酸序列：其结合至包含位于与突变型特异性引物所结合的链相同、相对或互补的链上的野生型等位基因DNA的链，并减少或阻止野生型等位基因的扩增。如本说明书更详细地讨论，野生型等位基因特异性封闭探针一般包含修饰，例如在核糖环的3'-OH处，所述修饰阻止引物被聚合酶延伸。野生型等位基因特异性封闭引物可以被设计为与突变型等位基因特异性引物所退火的链相同的链退火，并且可以以封闭基团(例如"不可延伸的封闭部分")在其3'末端进行修饰。因此，野生型封闭引物可以被设计为，紧密结合至野生型等位基因，以抑制野生型等位基因的扩增，同时允许突变型等位基因特异性引物结合至相同链上的突变型等位基因，并延伸扩增。在示例性的实施方式中，等位基因特异性封闭引物不包括一些标记物，例如荧光、放射性或化学发光标记物。

如本说明书使用的术语"检测探针"是指可指示扩增的多种信号传导分子中的任意一种。例如，SYBRGreen和其他DNA结合染料是检测探针。可以是基于序列的检测探针，例如5’核酸酶探针。一些检测探针是本领域已知的，例如探针、茎环分子信标、MGB探针、Scorpion^TM探针、锁核酸(LNA)探针、肽核酸(PNA)探针等。检测探针可以包含报告荧光染料，例如6-羧基荧光素(6-FAM)或JOE，可以包含淬灭剂部分，例如四甲基罗丹明(TAMRA)、BHQ1等。TaqMan检测探针是一种15-40bp的寡核苷酸探针，其5’端标记报告荧光基团，3’端标记淬灭荧光基团，其序列与模板DNA中的某一段互补。

如本说明使用的术语“基因座特异性引物”是指在PCR反应中与等位基因特异性引物的延伸产物杂交并且能够实现所属产物的第二链cDNA合成的寡核苷酸序列。因此，在一些实施方式中，等位基因特异性引物作为正向PCR引物，基因座特异性引物作为反向PCR引物，反之亦可。

如本说明书使用的术语“突变富集扩增”是指在聚合酶链反应中先进行较高退火温度的若干个循环的预扩增使突变模板被特异性扩增而得到富集，然后进行较低退火温度的若干循环高效扩增对模板进行突变检测。突变富集扩增反应的预扩增提高了突变模板的比例，使突变模板在后面的高效扩增阶段更易被检测到。

如本说明书使用的术语寡核苷酸的Tm或熔解温度是指单链寡核苷酸的群体中的50％的分子与它们的互补序列杂交并且其余50％分子未与所述互补序列杂交时的温度(以摄氏度表示)。可以通过熔解曲线的方式和经验确定引物或探针的Tm值。

如本说明书使用的术语△Tm是指两种单链寡核苷酸Tm值的差值。例如封闭引物和突变引物间的△Tm＝Tm封闭引物-Tm突变引物。

如本说明书使用的术语“检测特异性”：是指某测定法区分来自匹配模板和野生型模板的扩增的能力。特异性经常表示为△Ct＝Ct野生型-Ct匹配。

如本说明书使用的术语“检测灵敏度”：是指在给定的检测方法中能够被检出的模板的最小量(拷贝数或质量)。

如本说明书使用的术语检测选择性：是指可用于测定混合物中的少数突变等位基因而无来自多数野生型等位基因的干扰的程度。选择性经常表示为比例或百分率。例如，能够在存在100个野生型模板的情况下检出1个突变模板的测定被称作具有1：100或1％的选择性。比值越低说明选择性越好。

如本说明书使用的术语：Ct或Ct值是指循环阈值，代表PCR扩增测定的循环数：在该循环数时，来自指示扩增代数的报告分子的信号荧光首次变为在阈值水平之上可检出。

如本说明书使用的术语：德尔塔Ct或△Ct是指信号通过固定阈值时，两个不同样品或反应之间的循环数差异。△Ct可用于鉴定针对等位基因的匹配引物与错配引物之间的特异性。在一些实施例中，错配引物与匹配引物之间的△Ct的计算被用作等位基因特异性PCR的区分能力的一个度量。任何增大突变等位基因匹配引物进行扩增反应的Ct值与野生型模板检测Ct值之间差异(即△Ct值)的因素，都将产生更大的等位基因区分能力。

如本说明书使用的术语：分型检测是指可区分样品中存在的基因突变的具体突变类型的检测。例如Kras基因突变存在多种突变类型，对某一样品的Kras基因突变检测确定其为kras基因G34A突变即为对该样品的Kras突变分型检测。

如本说明书使用的术语：单体系多点突变检测是指可通过一个反应体系的检测判断是否存在某基因多种可能的点突变，不具体区分该基因突变类型的检测。例如Kras基因存在8种较常见的点突变类型，可通过单体系多点突变检测试剂确定某样品中存在Kras基因8种常见突变类型中的一种或多种，而不区分具体其突变类型。

组合物、方法和试剂盒

在一个方面，本发明提供了用于鉴定和/或定量核酸样品中的等位基因突变体的组合物。这些组合物中的一些可以包含:(a)突变型等位基因特异性引物；(b)野生型等位基因特异性封闭探针；(c)检测探针；和/或(d)基因座特异性引物，或其任意组合。在组合物的一些实施方式中，组合物还可以包含聚合酶，dNTP，适合用于PCR扩增的试剂和/或缓冲剂；和/或模板序列或核酸样品。在一些实施方式中，聚合酶可以是热稳定性的,例如Taq DNA聚合酶。

在另一个方面，本发明提供了组合物，其包含:(i)突变型等位基因特异性引物，其中所述突变型等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于靶序列的突变型等位基因；和(ii)野生型等位基因特异性封闭探针，其互补于包含野生型等位基因变体的靶序列的区域，其中所述区域包含对应于突变型等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分的结合位置的位置。

在进一步的实施方式中，组合物还可以包括检测探针。

在其它实施方式中，进一步提供了用于预扩增的组合物，如下文进一步详细描述。

在另一个方面，本发明提供了用于扩增突变型等位基因特异性序列的方法。这些方法中的一些可以包括:(a)较高退火温度下使突变型等位基因特异性引物与包含突变型等位基因的核酸分子杂交，进行预扩增，富集突变模板；(b)正常退火温度下使突变型等位基因特异性引物与包含突变型等位基因的核酸分子杂交，进行正常扩增；(c)使野生型等位基因特异性封闭引物与包含野生型等位基因的核酸分子杂交，其中所述野生型等位基因对应于与突变型等位基因相同的基因座；(d)使基因座特异性检测探针与核酸分子杂交；(e)使基因座特异性引物与突变型等位基因特异性引物的延伸产物杂交；和(d)PCR扩增突变型等位基因。

在一些实施方式中，组合物、方法和/或试剂盒与多种仪器例如来自AppliedBiosystems(Foster City,CA)的SDS仪器相容。

突变型等位基因特异性引物

本发明引物设计采用Oligo7软件，并通过NCBI的Primer-BLAST比对筛选高特异性引物。

突变型等位基因特异性引物的设计优化：1)突变型等位基因特异性引物3’端设计为与突变等位基因匹配而与野生型等位基因错配，通过匹配和错配碱基引物延伸效率的不同区分突变等位基因；2)突变等位基因特异性引物的Tm值设计为在较高退火温度时只结合突变模板，对野生型等位基因无法结合扩增，在一些实施方式中突变型等位基因特异性引物Tm值低于较低退火温度5-8℃，例如采用较低退火温度为60℃，设计突变等位基因特异性引物的Tm值可以为52-55℃；在一些示例性实施方式中可通过在等位基因特异性引物的5’端引入错配碱基尾巴来调整其Tm值；3)突变型等位基因特异性引物的优化，在一些示例性实施方式中通过检测灵敏度和特异性分析，可在某些突变型等位基因特异性引物靠近3’端4-6bp处引入错配碱基进一步增加引物对突变等位基因和野生型碱基的区分能力。在一些实施方式中突变等位基因特异性引物是15-30bp的寡核苷酸。

突变富集扩增反应条件：1)采用较高退火温度的预扩增和较低退火温度的第二步扩增，预扩增退火温度较第二步退火温度高4-8℃，例如一些示例性实施方式中可采用预扩增退火温度为64℃，第二步扩增退火温度60℃；2)退火温度与所设计的突变等位基因特异性引物的Tm值相匹配，在较高退火温度的预扩增阶段，突变等位基因特异性引物仅与突变等位基因模板结合扩增，不能与野生型等位基因模板结合，从而使突变等位基因在预扩增时得到富集扩增，在第二步较低退火温度时突变等位基因被进一步有效扩增。由于第一步骤扩增采用较高的退火/延伸温度，而突变等位基因特异性引物的Tm值较低，因此扩增效率不佳，因此第二步扩增采用较低的退火/延伸温度以提高PCR扩增的效率。该反应条件设计为增强突变检测的灵敏度和选择性。

野生型等位基因特异性封闭探针

野生型等位基因封闭引物的设计：虽然突变等位基因特异性引物可对突变等位基因和和野生型等位基因进行选择性扩增，但其区分能力会受到样品中的突变等位基因和野生型等位基因比例的影响，在高野生型等位基因背景下经常会发生错配碱基的扩增而产生假阳性结果，从而使检测的选择性受到局限，野生型等位基因封闭引物针对该局限而设计。1)野生型等位基因封闭引物设计为与野生型等位基因匹配的寡核苷酸序列，匹配位点位于寡核苷酸序列的靠近中部，可与野生型等位基因模板有效结合，与突变等位基因模板因错配而无法有效结合；2)野生型等位基因封闭引物3’端为不可延伸的封闭部分。在一些示例性实施方式中，不可延伸的封闭部分是磷酸化修饰碱基；其他封闭修饰物包括氨基化修饰、MGB修饰等；3)野生型等位基因封闭引物的Tm值高于突变型等位基因特异性引物的Tm值并接近或高于退火温度，退火时封闭引物可优先于野生型等位基因结合而阻止野生型模板的扩增，同时可降低野生型等位基因背景，有利于突变等位基因特异性引物的特异性扩增；4)为增强野生型等位基因封闭引物的特异性和区分能力，可对其碱基进行修饰，在一些示例性实施方式中对封闭引物的区分性碱基进行锁核酸(LNA)修饰，可增强封闭引物对野生型等位基因的结合能力和区分能力，有利于增强某些突变检测的选择性；亦可对封闭引物的区分性碱基进行如小沟结合剂修饰，同样有利于增强某些突变检测的选择性。

检测探针

检测探针：设计为与突变等位基因特异性引物结合链相同的寡核苷酸序列，并且其结合位点与突变等位基因特异性引物靠近。例如，SYBRGreen和其他DNA结合染料是检测探针。可以是基于序列的检测探针，例如5’核酸酶探针。一些检测探针是本领域已知的，例如探针、茎环分子信标、MGB探针、Scorpion^TM探针、锁核酸(LNA)探针、肽核酸(PNA)探针等。检测探针可以包含报告荧光染料，例如6-羧基荧光素(6-FAM)或JOE，可以包含淬灭剂部分，例如四甲基罗丹明(TAMRA)、BHQ1等。TaqMan检测探针是一种15-40bp的寡核苷酸探针，其5’端标记报告荧光基团，3’端标记淬灭荧光基团，其序列与模板DNA中的某一段互补。

在一些实施例中检测探针Tm值高于突变等位基因特异性引物约5-10度。在一些实施方式中通过探针是5’-核酸酶探针，探针5’采用荧光染料标记。报告荧光染料可选但不限于FAM/HEX/TET/JOE/VIC/FITC/CY3/CY5中的一种，淬灭荧光染料可选但不限于TRAMA/ROX/DABCY1/BHQ1/BHQ2/MGB-NFQ中的一种。通过检测扩增步骤中探针可检测性质的变化例如荧光判断突变情况。

另外的成分

基因座特异性引物，设计为互补于突变型等位基因模板序列的3’并且在相对链上的靶序列区域。

适合于实施本发明的聚合酶是本领域熟知的，可以从多个来源获得。热稳定性DNA聚合酶可以从多种商业途径获得，使用本领域技术人员熟知的方法。优选的热稳定性的DNA聚合酶可以包括但不限于：TaqDNA聚合酶或其突变体、衍生物或片段。

核酸的多种来源和/或制备方法

本发明所公开的组合物、方法和/或试剂盒中的核酸样品的来源包括但不限于，人类细胞，例如循环血液、培养的细胞、肿瘤细胞。DNA可以是基因组或者质粒或其他载体中的DNA。本发明用于检测基因组DNA中的突变，可以是人类的、动物的或其他。在一些实施方式中，模板序列或核酸样品可以是gDNA。在其他实施方式中，模板序列或核酸样品可以使cDNA。DNA或RNA模板序列或核酸样品可以是任意类型的组织，包括例如福尔马林固定的石蜡包埋组织样品。

本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1.Kras基因引物探针设计

人类Kras基因位于基因组第12号染色体上，Kras基因的基因组DNA序列见GenebankNG_007524.1,编码Kras基因的全长cDNA序列如SEQ ID No:1所示(NCBIReference Sequence:NM_004985.4)。

根据kras基因8种主要耐药相关基因集中在外显子2上，Kras基因外显子2序列如SEQ ID No：2所示。

SEQ ID No：2：GCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAG

1)设计阳性质控品

本发明所采用的阳性质控品为采用基因重组技术构建的kras突变质粒，设计并采用pCR Blunt II TOPO质粒载体(Invitrogen life technologies)构建8种含有Kras基因不同突变等位基因序列的重组质粒作为质控品，并经测序证实突变序列。现有kras基因突变检测试剂盒检测8种Kras常见突变类型。每种质控品具体含有的Kras基因序列如下(表2)：

表2.突变质粒Kras基因序列

2)设计突变型特异性引物

采用Oligo7软件，并通过NCBI的Primer-BLAST工具比对设计高特异性引物。通过探索性实验确定突变等位基因特异性引物设计为反向引物具有更好的检测特异性，针对Kras基因8种不同点突变序列分别设计多种突变型特异性引物，包括引入错配碱基的等位基因特异性引物(见表3)，其中小写碱基为引入的错配碱基，并控制其Tm值，以便筛选出与富集扩增反应条件相适应的最佳引物。

本发明实施例富集扩增反应条件采用的较高退火温度为64℃，设计突变特异性引物时控制引物的Tm值范围为50-60℃。

表3.突变特异性引物的设计

3)基因座特异性引物

与突变等位基因特异性引物相对应，设计为正向引物，8种不同点突变可采用共同的正向引物。正向引物设计为常规引物，与等位基因特异性引物的扩增片段尽可能短，以便于含有片段化DNA样本的检测。引物序列见表4。

表4.基因座特异性引物设计

引物名称	引物序列	长度(bp)	SEQ ID
				KRAS-F	TGACATGTTCTAATATAGTCACATT	25	SEQ ID No：45.

4)野生型等位基因特异性封闭引物

基于kras基因8种点突变对应的野生型等位基因，结合锁核酸修饰技术设计野生型等位基因特异性封闭引物。封闭引物序列与野生型等位基因位点完全匹配，包括引入修饰的碱基，封闭引物Tm值要大于等于退火温度，确保其在退火时与野生型模板结合起封闭作用，并且封闭引物3’末端经修饰，使其在DNA聚合酶作用下不能被延伸。为使检测选择性达到0.01％，对其中适当位置碱基进行锁核酸修饰，由于锁核酸修饰封闭引物会使引物Tm值增加5-10度，从而采用较短的核苷酸序列。分别针对野生型等位基因设计有和没有锁核酸修饰的封闭引物，锁核酸修饰封闭引物包含三个或四个修饰碱基，修饰碱基为Kras突变等位基因对应的野生型基因，以增强封闭引物对野生型等位基因的区分能力。封闭引物3’端碱基均采用磷酸化修饰，用于阻止其在PCR扩增中的延伸。由于8种点突变位点在外显子上的位置靠近，因此可采用相同的封闭引物。具体序列如下表5，序列中"+"后的碱基表示锁核酸修饰的碱基。

表5.封闭引物设计

名称	序列	长度bp	SEQ ID
				KRAS-B1	TGCCTACGCCACCAGCTC-PO4	18	SEQ ID No：46.
KRAS-B2	CCTACG+CCA+C+CAGC-PO4	14	SEQ ID No：47.
				KRAS-B3	CCTACG+C+CA+C+CAGCTC-PO4	16	SEQ ID No：48.

5)设计检测探针

检测探针的设计采用Taqman探针的设计原则，检测探针与等位基因特异性引物结合相同的DNA模板，并且其结合位点尽量靠近等位基因特异性引物结合位点。8种不同的点突变可采用共同的检测探针，检测探针序列5’端标记有Fam报告荧光染料，3’端标记有BHQ1淬灭荧光染料。具体序列如表6。

表6.检测探针序列

6)设计内控基因引物探针

内控基因片段的扩增用作反应的内参照，指示反应是否正常进行并用于提示检测反应中的模板量，内控引物扩增区域为不含突变位点的保守区域，本发明选择人Beta-actin基因(genbank NC_000007.14)设计内控引物、探针。内控引物探针的设计遵循常规的引物和Taqman探针的设计原则。内控探针5’端标记有JOE报告荧光染料，3’端标记有BHQ1淬灭荧光染料。内控引物探针序列见表7。

表7.内控引物探针序列

实施例2.富集扩增反应条件有利于提高点突变检测的特异性和选择性

本实施例中采用的检测样品：野生型样品采用100ng野生型人基因组DNA，突变样品采用1％突变率的突变样品，突变样品通过将不同突变阳性质控品质粒与野生型人基因组DNA按比例混合制备。

反应体系为每个测定反应混合物(25μl)包括1×Premix Taq^TM Hot Start(TakaraBio Inc，R028A)，每种突变类型不同等位基因特异性引物的测试采用相同的反应体系，除等位基因特异性引物不同外，其他组分均相同，采用250nM检测探针KRAS-P，250nM基因座特异性引物KRAS-F，500nM封闭引物KRAS-B1，100nM内控引物F-actinH和R-actinH，200nM P-actinH。

分别采用富集扩增的反应条件和常规反应条件对相同的野生型和突变样品进行检测。(1)富集扩增反应条件为95℃预变性5min，然后10个循环95℃10s，64℃1min，再运行35个循环95℃10s，60℃1min，第三步退火时检测荧光信号。(2)对比反应条件为95℃预变性5min，然后10个循环95℃10s，60℃1min，再运行35个循环95℃10s，60℃1min，第三步退火时检测荧光信号。

检测结果见表8，采用突变富集扩增反应条件对野生型样品检测Ct值高于对比条件检测的Ct值，而对1％突变率样品检测采用突变富集扩增反应条件的△Ct值明显高于对比条件，说明突变富集扩增反应条件能增加突变检测的特异性和选择性，有利于高野生型背景下的点突变检测。

表8.富集扩增的反应条件和常规反应条件的检测特异性比较

实施例3.Kras基因等位基因特异性引物中引入适当突变碱基可提高某些突变检测的特异性和选择性

本实施例中采用的检测样品：野生型样品采用380ng野生型人基因组DNA，突变样品采用0.1％和0.01％突变率的突变样品，突变样品通过将不同突变阳性质控品质粒与野生型人基因组DNA按比例混合制备。

荧光定量PCR反应条件：95度温育5分钟；然后10个循环的“95度10秒，64度1分钟”，然后再进行35个循环的“95度10秒60度1分钟”，60度退火时检测荧光信号。

本实施例针对Kras基因8种点突变类型，通过对未引入突变碱基的等位基因特异性引物和3’端倒数第4-6位引入适当突变碱基的等位基因特异性进行比较确定引入突变碱基是否可改善突变检测的特异性和选择性。将不同等位基因特异性引物分别对总模板量380ng的野生型模板、0.1％和0.01％突变率的样品进行检测，通过△Ct值(即Ctwild-Ctmut)的比较确定每种突变类型的最佳突变等位基因特异性引物，△Ct值越大说明引物的检测特异性越好。检测结果(见表9)表明Kras-M1，Kras-M2，Kras-M8等位基因特异性引物3’端倒数第4-6位引入适当的突变碱基可使其对野生型和突变等位基因检测的△Ct值增大，较未引入突变碱基的等位基因特异性引物(WT)检测特异性和选择性明显改善。

表9.等位基因特异性引物引入适当突变碱基可增加突变检测特异性和选择性

实施例4.调整等位基因特异性引物的Tm值与阻滞引物Tm值差值及与富集扩增反应条件相适应可提高突变检测的选择性

本实施例所采用的检测样品：野生型样品采用380ng野生型人基因组DNA，突变模板采用0.1％突变率的突变样品，突变样品通过将不同突变质粒与野生型基因组DNA按比例混合制备。

本实施例反应体系：每个测定反应混合物(25μl)包括1×Premix Taq^TM Hot Start(Takara Bio Inc，R028A)，每种突变类型不同等位基因特异性引物的测8试采用相同的反应体系，除等位基因特异性引物不同外，其他组分均相同，采用250nM检测探针KRAS-P，250nM基因座特异性引物KRAS-F，500nM封闭引物KRAS-B1(Tm值62.2℃)，100nM内控引物F-actinH和R-actinH，200nM P-actinH。荧光定量PCR反应条件如前所述：95度温育5分钟；然后10个循环的“95度10秒，64度1分钟”，然后再进行35个循环的“95度10秒60度1分钟”，60度退火时检测荧光信号。

本实施例用于说明通过等位基因特异性引物Tm值的调整，可筛选出具有最好突变检测选择性的突变引物。以Kras-M3、Kras-M4、Kras-M5、Kras-M6、Kras-M7的引物优化筛选为例进行说明。针对Kras-M3、Kras-M4、Kras-M5、Kras-M6、Kras-M7分别设计不同Tm值的等位基因特异性引物，通过对总模板量380ng的野生型、0.1％和0.01％突变率的样品进行检测，根据检测△Ct值(Ctwild-Ctmut)对引物进行筛选。根据特异性分析结果(见表10)，KM3-R2、KM4-R2、KM5-R2、KM6-R2、KM7-R2具有更好的突变检测的特异性，有利于高野生型背景下的点突变检测。

对Kras突变每种突变类型筛选的等位基因特异性引物的Tm值与封闭引物Tm值的差值与检测选择性的关系进行分析，通过对野生型样品和0.01％突变率样品的检测Ct值差值即△Ct值比较，发现等位基因特异性引物Tm值与封闭引物Tm值差值大于5度(见表11)，且等位基因特异性引物Tm值与较高退火温度相比低7-12度，才能达到最佳的检测选择性，选择性至少可达到0.01％(△Ct>3)。如果等位基因特异性引物Tm值与封闭引物Tm值差值大于5度仍不能达到0.01％的检测选择性，则应考虑采用锁核酸修饰是的封闭引物。

表10.调整等位基因特异性引物Tm值筛选最佳引物

表11.Kras等位基因特异性引物与封闭引物Tm值差值与检测选择性的关系

实施例5.采用锁核酸修饰的封闭引物可增强Kras基因点突变检测的特异性

本实施例采用的检测样品：野生型样品采用野生型人基因组DNA，突变模板采用0.1％和0.01％突变率的突变样品，突变样品通过将不同突变质粒与野生型人基因组DNA按比例混合制备。

反应体系为每个测定反应混合物(25μl)包括1×Premix Taq^TM Hot Start(TakaraBio Inc，R028A)，除封闭引物不同外，其他组分均相同，采用250nM突变等位基因特异性引物(不同突变类型所采用的突变引物见表10)，250nM基因座特异性引物Kras-F，250nM检测探针Kras-P，500nM封闭引物，100nM内控引物F-actinH和R-actinH，200nM内控探针P-actinH。荧光定量PCR反应条件如前所述。

本实施例每种分型检测试剂分别采用不同的封闭引物对野生型样品和0.1％、0.01％突变率的样品进行检测，检测结果(见表12)表明Kras基因M8点突变采用含有锁核酸修饰封闭引物KRAS-B2的分型试剂具有更好的检测特异性，其△Ct值明显大于含有KRAS-B1和KRAS-B3的分型试剂，说明采用经锁核酸修饰封闭引物可明显改善Kras基M8分型试剂的检测特异性，并且采用3个锁核酸修饰碱基的封闭引物体系的检测特异性好于采用4个锁核酸修饰碱基的封闭引物体系。

表12.采用不同封闭引物的Kras突变检测试剂检测特异性比较

实施例6.Kras分型试剂突变检测的选择性

根据Kras等位基因特异性引物和封闭引物的优化筛选结果，确定Kras分型试剂的引物探针组合见表13，并采用该组合进行Kras分型试剂突变检测选择性的分析。

所采用的反应体系：每个测定反应混合物(25μl)包括1×Premix Taq^TM Hot Start(Takara Bio Inc，R028A)，除等位基因特异性引物、封闭引物不同外，其他组分均相同，采用250nM TaqMan探针Kras-P，250nM基因座特异性引物Kras-F，500nM封闭引物Kras-B1或Kras-B2，100nM内控引物F-actinH和R-actinH，200nM内控探针P-actinH。

所采用的反应条件：95度温育5分钟；然后10个循环的“95度10秒，64度1分钟”，然后再进行35个循环的“95度10秒，60度1分钟”，60度退火时检测荧光信号。

表13.Kras分型试剂引物探针组合

本实施例通过在一定量野生型DNA背景下检测不同突变率的样品来分析Kras分型试剂突变检测的选择性。

野生型DNA采用野生型人基因组DNA，突变模板采用Kras突变质粒，分别将100ng/μl野生型DNA和不同浓度的突变质粒按比例混合，每种突变类型分别制备0.1％和0.01％突变率的突变样品，然后分别取5μl模板采用本发明分型试剂进行检测。检测结果(见表14)表明，不同分型试剂对相应的0.1％和0.01％突变率样品的突变检测Ct值均小于相应野生型模板检测Ct值，说明本发明Kras分型试剂突变检测的选择性均可达到0.01％。

表14.Kras分型检测试剂的突变检测选择性

分型试剂	Ctwild	Ctmut-0.1％(△Ct)	Ctmut-0.01％(△Ct)
				Kras-M1	31.49	22.74(8.75)	24.77(6.72)
Kras-M2	33.2	24.78(8.42)	27.65(5.55)
				Kras-M3	35	24.1(10.9)	27.98(7.02)
Kras-M4	34.15	22.11(12.89)	25.47(9.53)
				Kras-M5	34.25	25.07(9.18)	26.99(7.26)
Kras-M6	35	22.33(12.67)	26.39(8.61)
				Kras-M7	35	26.06(8.94)	27.77(7.23)
Kras-M8	35	25.22(9.78)	28.66(6.34)

实施例7.Kras分型试剂对癌症病人组织样品的检测

对40例肺腺癌患者组织样品提取DNA(由上海市肺科医院提供)，采用TIANGEN血液组织基因组提取试剂盒(离心柱型)提取组织基因组DNA，具体操作步骤按说明书进行。

核酸样品的浓度采用Eppendorf紫外分光光度计测定，控制DNA提取的质量OD260/280≧1.8。

每样品分别取20ng样品DNA，采用本发明分型试剂进行Kras突变检测。反应体系和条件如前所述。采用自动化基线和1e4的人工阈值用于计算循环阈值(Ct)。根据Ct临界值判定突变情况：例如当突变检测Ct值<30时，突变阳性；突变Ct值≧30时，内控Ct值<30时，突变阴性；突变Ct值≧30时，内控Ct值≧30时，建议重新检测。

根据Kras突变临界值判断样品突变情况。将检测结果与测序结果比较，显示我们的检测结果与测序结果相符合，说明我们的检测试剂具有较高的检测准确性，图1为代表性的检测结果。

实施例8.Kras分型试剂对非小细胞癌症病人血浆样品的检测

采用本发明引物探针组合对20例非小细胞肺癌患者血浆提取的DNA进行Kras突变检测。血浆DNA采用TIANamp Micro DNA Kit微量样品基因组DNA提取试剂盒提取。具体操作步骤如下：

(1)取200μl血浆到2ml的离心管中；

(2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀；

(3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，期间颠倒混匀数次；简短离心以除去管内壁的液滴；

(4)加入200μl无水乙醇，如室温超过25℃，将乙醇置冰上预冷，轻轻颠倒混匀，室温放置5分钟；

(5)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中)，13,400×g离心30s；

(6)将收集管中的液体重复加入吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中)，13,400×g离心30s；

(7)弃废液，将吸附柱CR2放入收集管中；

(8)向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD(使用前已加入无水乙醇)，13,400×g离心30s，弃废液，将吸附柱CR2放入收集管中；

(9)向吸附柱CR2中加入700μl漂洗液PW(使用前已加入无水乙醇)，13,400×g离心30s，弃废液，将吸附柱CR2放入收集管中；

(10)向吸附柱CR2中加入500μl漂洗液PW(使用前已加入无水乙醇)，13,400×g离心30s，弃废液；

(11)将吸附柱CR2放入收集管中，13,400×g离心2min，倒掉废液，将吸附柱CR2置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(12)将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μl无菌水(pH8.0)，室温放置5min，13,400×g离心2min，将溶液收集到离心管中。

荧光PCR检测和结果分析

每样品取5μl样本DNA采用本发明分型试剂进行Kras基因突变检测。反应体系和条件如前所述，根据突变检测临界值判断突变情况。将血浆检测结果与对应组织样品检测结果及组织测序结果进行比较，见表15，表16和图2，表明血浆样品检测结果与组织样品检测结果及测序结果完全一致。

表15.20例非小细胞肺癌病人血浆样品检测结果

表16.20例非小细胞肺癌病人组织样品检测结果

实施例9.Kras单体系多点定性检测试剂突变检测灵敏度

根据Kras等位基因特异性引物和封闭引物的优化筛选结果，确定Kras多点定性检测体系的引物探针组合体系见表17。并采用该组合体系进行Kras多点定性检测选择性的分析。

采用的反应体系：每个测定反应混合物(25μl)包括

1×Premix Taq^TM Hot Start(Takara Bio Inc，R028A)，

采用250nM等位基因特异性引物，

250nM TaqMan探针，

250nM基因座特异性引物，

500nM封闭引物，

100nM内控引物F-actinH和R-actinH，

200nM P-actinH。

采用的反应条件：95度温育5分钟；然后10个循环的“95度10秒，64度1分钟”，然后再进行35个循环的“95度10秒，60度1分钟”，60度退火时检测荧光信号。

表17.Kras定性检测试剂的引物探针组合

本实施例采用上述确定的kras多点定性检测试剂组合体系进行突变检测灵敏度分析。

检测样品采用经线性化的Kras G34T突变质粒。根据质量浓度换算将待测质粒浓度调整为10⁹拷贝/μl浓度，然后用DNA稀释液依次10倍梯度稀释至1拷贝/μl浓度，对1～10⁶拷贝/μl浓度标准品每个浓度取5μl采用本发明引物探针组合试剂进行检测来确定突变检测的灵敏度。检测结果表明kra s多点定性检测试剂具有较高的检测灵敏度，1～10个拷贝突变模板即可检出(见图3)。

实施例10.Kras单体系多点突变定性检测试剂突变检测的选择性

本实施例通过在一定量野生型DNA背景下检测不同浓度的Kras G34A突变来分析Kras组合试剂突变检测的选择性。野生型DNA采用健康人全血基因组DNA，突变模板采用线性化的Kras G34A突变质粒，分别将100ng/μl野生型DNA和不同浓度的突变质粒按比例混合，制备不同突变率的模板，然后分别取5μl模板采用本发明定性检测试剂进行检测，PCR反应实施方式和条件如前所示，检测结果(见图4)表明，不同突变率模板内控Ct值相似，而野生型模板突变检测为阴性(Ct>30)，突变率0.01％～20％的样品突变检测Ct值均小于野生型模板突变检测Ct值，说明本发明Kras定性检测试剂G34A突变检测的选择性可达到0.01％。

实施例11.Kras单体系多点突变定性检测试剂对野生型样本的检测

本实施例采用10个经测序证实为野生型的人全血基因组DNA样本，分别对3个不同量(1ng，20ng，100ng)的野生型模板应用本发明Kras组合试剂进行Kras突变定性检测分析。PCR扩增反应实施方法和条件如前所述。反应结束，获得每个样品的突变检测Ct值和内控Ct值，观察每个样本的内控Ct值均<30,对野生型样品突变检测Ct值均大于30(见表18)，说明本发明定性检测试剂在1ng～100ng模板范围内，突变检测Ct值<30可作为基因组样品Kras突变检测阳性的临界值。

表18.野生型样本Kras多点定性检测试剂突变检测

实施例12.Kras单体系多点定性检测试剂对非小细胞癌症病人血浆样品的检测

采用本发明的kras多点定性检测试剂对20例非小细胞肺癌患者血浆提取的DNA分别进行Kras突变多点定性检测。血浆DNA采用TIANamp Micro DNA Kit微量样品因组DNA提取试剂盒提取。提取方法同前。

荧光PCR检测和结果分析

分别取5μl样本DNA采用本发明多点定性检测试剂进行Kras基因突变检测。反应体系和条件如前所述，根据突变检测临界值判断突变情况。将本发明试剂的血浆检测结果与组织测序结果进行比较，见表19，血浆样品突变检测结果与组织样品测序结果完全一致。

表19.20例非小细胞肺癌病人血浆样品检测结果和组织测序结果

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 同济大学苏州研究院

<120> 检测Kras基因点突变的引物、探针及其试剂盒与检测方法

<130> MP1809556

<160> 60

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5765

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

tcctaggcgg cggccgcggc ggcggaggca gcagcggcgg cggcagtggc ggcggcgaag 60

gtggcggcgg ctcggccagt actcccggcc cccgccattt cggactggga gcgagcgcgg 120

cgcaggcact gaaggcggcg gcggggccag aggctcagcg gctcccaggt gcgggagaga 180

ggcctgctga aaatgactga atataaactt gtggtagttg gagctggtgg cgtaggcaag 240

agtgccttga cgatacagct aattcagaat cattttgtgg acgaatatga tccaacaata 300

gaggattcct acaggaagca agtagtaatt gatggagaaa cctgtctctt ggatattctc 360

gacacagcag gtcaagagga gtacagtgca atgagggacc agtacatgag gactggggag 420

ggctttcttt gtgtatttgc cataaataat actaaatcat ttgaagatat tcaccattat 480

agagaacaaa ttaaaagagt taaggactct gaagatgtac ctatggtcct agtaggaaat 540

aaatgtgatt tgccttctag aacagtagac acaaaacagg ctcaggactt agcaagaagt 600

tatggaattc cttttattga aacatcagca aagacaagac agggtgttga tgatgccttc 660

tatacattag ttcgagaaat tcgaaaacat aaagaaaaga tgagcaaaga tggtaaaaag 720

aagaaaaaga agtcaaagac aaagtgtgta attatgtaaa tacaatttgt acttttttct 780

taaggcatac tagtacaagt ggtaattttt gtacattaca ctaaattatt agcatttgtt 840

ttagcattac ctaatttttt tcctgctcca tgcagactgt tagcttttac cttaaatgct 900

tattttaaaa tgacagtgga agtttttttt tcctctaagt gccagtattc ccagagtttt 960

ggtttttgaa ctagcaatgc ctgtgaaaaa gaaactgaat acctaagatt tctgtcttgg 1020

ggtttttggt gcatgcagtt gattacttct tatttttctt accaattgtg aatgttggtg 1080

tgaaacaaat taatgaagct tttgaatcat ccctattctg tgttttatct agtcacataa 1140

atggattaat tactaatttc agttgagacc ttctaattgg tttttactga aacattgagg 1200

gaacacaaat ttatgggctt cctgatgatg attcttctag gcatcatgtc ctatagtttg 1260

tcatccctga tgaatgtaaa gttacactgt tcacaaaggt tttgtctcct ttccactgct 1320

attagtcatg gtcactctcc ccaaaatatt atattttttc tataaaaaga aaaaaatgga 1380

aaaaaattac aaggcaatgg aaactattat aaggccattt ccttttcaca ttagataaat 1440

tactataaag actcctaata gcttttcctg ttaaggcaga cccagtatga aatggggatt 1500

attatagcaa ccattttggg gctatattta catgctacta aatttttata ataattgaaa 1560

agattttaac aagtataaaa aattctcata ggaattaaat gtagtctccc tgtgtcagac 1620

tgctctttca tagtataact ttaaatcttt tcttcaactt gagtctttga agatagtttt 1680

aattctgctt gtgacattaa aagattattt gggccagtta tagcttatta ggtgttgaag 1740

agaccaaggt tgcaaggcca ggccctgtgt gaacctttga gctttcatag agagtttcac 1800

agcatggact gtgtccccac ggtcatccag tgttgtcatg cattggttag tcaaaatggg 1860

gagggactag ggcagtttgg atagctcaac aagatacaat ctcactctgt ggtggtcctg 1920

ctgacaaatc aagagcattg cttttgtttc ttaagaaaac aaactctttt ttaaaaatta 1980

cttttaaata ttaactcaaa agttgagatt ttggggtggt ggtgtgccaa gacattaatt 2040

ttttttttaa acaatgaagt gaaaaagttt tacaatctct aggtttggct agttctctta 2100

acactggtta aattaacatt gcataaacac ttttcaagtc tgatccatat ttaataatgc 2160

tttaaaataa aaataaaaac aatccttttg ataaatttaa aatgttactt attttaaaat 2220

aaatgaagtg agatggcatg gtgaggtgaa agtatcactg gactaggaag aaggtgactt 2280

aggttctaga taggtgtctt ttaggactct gattttgagg acatcactta ctatccattt 2340

cttcatgtta aaagaagtca tctcaaactc ttagtttttt ttttttacaa ctatgtaatt 2400

tatattccat ttacataagg atacacttat ttgtcaagct cagcacaatc tgtaaatttt 2460

taacctatgt tacaccatct tcagtgccag tcttgggcaa aattgtgcaa gaggtgaagt 2520

ttatatttga atatccattc tcgttttagg actcttcttc catattagtg tcatcttgcc 2580

tccctacctt ccacatgccc catgacttga tgcagtttta atacttgtaa ttcccctaac 2640

cataagattt actgctgctg tggatatctc catgaagttt tcccactgag tcacatcaga 2700

aatgccctac atcttatttc ctcagggctc aagagaatct gacagatacc ataaagggat 2760

ttgacctaat cactaatttt caggtggtgg ctgatgcttt gaacatctct ttgctgccca 2820

atccattagc gacagtagga tttttcaaac ctggtatgaa tagacagaac cctatccagt 2880

ggaaggagaa tttaataaag atagtgctga aagaattcct taggtaatct ataactagga 2940

ctactcctgg taacagtaat acattccatt gttttagtaa ccagaaatct tcatgcaatg 3000

aaaaatactt taattcatga agcttacttt ttttttttgg tgtcagagtc tcgctcttgt 3060

cacccaggct ggaatgcagt ggcgccatct cagctcactg caacctccat ctcccaggtt 3120

caagcgattc tcgtgcctcg gcctcctgag tagctgggat tacaggcgtg tgccactaca 3180

ctcaactaat ttttgtattt ttaggagaga cggggtttca ccctgttggc caggctggtc 3240

tcgaactcct gacctcaagt gattcaccca ccttggcctc ataaacctgt tttgcagaac 3300

tcatttattc agcaaatatt tattgagtgc ctaccagatg ccagtcaccg cacaaggcac 3360

tgggtatatg gtatccccaa acaagagaca taatcccggt ccttaggtag tgctagtgtg 3420

gtctgtaata tcttactaag gcctttggta tacgacccag agataacacg atgcgtattt 3480

tagttttgca aagaaggggt ttggtctctg tgccagctct ataattgttt tgctacgatt 3540

ccactgaaac tcttcgatca agctacttta tgtaaatcac ttcattgttt taaaggaata 3600

aacttgatta tattgttttt ttatttggca taactgtgat tcttttagga caattactgt 3660

acacattaag gtgtatgtca gatattcata ttgacccaaa tgtgtaatat tccagttttc 3720

tctgcataag taattaaaat atacttaaaa attaatagtt ttatctgggt acaaataaac 3780

aggtgcctga actagttcac agacaaggaa acttctatgt aaaaatcact atgatttctg 3840

aattgctatg tgaaactaca gatctttgga acactgttta ggtagggtgt taagacttac 3900

acagtacctc gtttctacac agagaaagaa atggccatac ttcaggaact gcagtgctta 3960

tgaggggata tttaggcctc ttgaattttt gatgtagatg ggcatttttt taaggtagtg 4020

gttaattacc tttatgtgaa ctttgaatgg tttaacaaaa gatttgtttt tgtagagatt 4080

ttaaaggggg agaattctag aaataaatgt tacctaatta ttacagcctt aaagacaaaa 4140

atccttgttg aagttttttt aaaaaaagct aaattacata gacttaggca ttaacatgtt 4200

tgtggaagaa tatagcagac gtatattgta tcatttgagt gaatgttccc aagtaggcat 4260

tctaggctct atttaactga gtcacactgc ataggaattt agaacctaac ttttataggt 4320

tatcaaaact gttgtcacca ttgcacaatt ttgtcctaat atatacatag aaactttgtg 4380

gggcatgtta agttacagtt tgcacaagtt catctcattt gtattccatt gatttttttt 4440

ttcttctaaa cattttttct tcaaacagta tataactttt tttaggggat ttttttttag 4500

acagcaaaaa ctatctgaag atttccattt gtcaaaaagt aatgatttct tgataattgt 4560

gtagtaatgt tttttagaac ccagcagtta ccttaaagct gaatttatat ttagtaactt 4620

ctgtgttaat actggatagc atgaattctg cattgagaaa ctgaatagct gtcataaaat 4680

gaaactttct ttctaaagaa agatactcac atgagttctt gaagaatagt cataactaga 4740

ttaagatctg tgttttagtt taatagtttg aagtgcctgt ttgggataat gataggtaat 4800

ttagatgaat ttaggggaaa aaaaagttat ctgcagatat gttgagggcc catctctccc 4860

cccacacccc cacagagcta actgggttac agtgttttat ccgaaagttt ccaattccac 4920

tgtcttgtgt tttcatgttg aaaatacttt tgcatttttc ctttgagtgc caatttctta 4980

ctagtactat ttcttaatgt aacatgttta cctggaatgt attttaacta tttttgtata 5040

gtgtaaactg aaacatgcac attttgtaca ttgtgctttc ttttgtggga catatgcagt 5100

gtgatccagt tgttttccat catttggttg cgctgaccta ggaatgttgg tcatatcaaa 5160

cattaaaaat gaccactctt ttaattgaaa ttaactttta aatgtttata ggagtatgtg 5220

ctgtgaagtg atctaaaatt tgtaatattt ttgtcatgaa ctgtactact cctaattatt 5280

gtaatgtaat aaaaatagtt acagtgacta tgagtgtgta tttattcatg aaatttgaac 5340

tgtttgcccc gaaatggata tggaatactt tataagccat agacactata gtataccagt 5400

gaatctttta tgcagcttgt tagaagtatc ctttatttct aaaaggtgct gtggatatta 5460

tgtaaaggcg tgtttgctta aacttaaaac catatttaga agtagatgca aaacaaatct 5520

gcctttatga caaaaaaata ggataacatt atttatttat ttccttttat caaagaaggt 5580

aattgataca caacaggtga cttggtttta ggcccaaagg tagcagcagc aacattaata 5640

atggaaataa ttgaatagtt agttatgtat gttaatgcca gtcaccagca ggctatttca 5700

aggtcagaag taatgactcc atacatatta tttatttcta taactacatt taaatcatta 5760

ccagg 5765

<210> 2

<211> 122

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

gcctgctgaa aatgactgaa tataaacttg tggtagttgg agctggtggc gtaggcaaga 60

gtgccttgac gatacagcta attcagaatc attttgtgga cgaatatgat ccaacaatag 120

ag 122

<210> 3

<211> 482

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

cgatggagga gtttgtaaat gaagtacagt tcattacgat acacgtctgc agtcaactgg 60

aattttcatg attgaatttt gtaaggtatt ttgaaataat ttttcatata aaggtgagtt 120

tgtattaaaa ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc 180

taatatagtc acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa 240

acttgtggta gttggagcta gtggcgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca 300

gaatcatttt gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat 360

attactggtg caggaccatt ctttgataca gataaaggtt tctctgacca ttttcatgag 420

tacttattac aagataatta tgctgaaagt taagttatct gaaatgtacc ttgggtttca 480

ag 482

<210> 4

<211> 482

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

cgatggagga gtttgtaaat gaagtacagt tcattacgat acacgtctgc agtcaactgg 60

aattttcatg attgaatttt gtaaggtatt ttgaaataat ttttcatata aaggtgagtt 120

tgtattaaaa ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc 180

taatatagtc acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa 240

acttgtggta gttggagctt gtggcgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca 300

gaatcatttt gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat 360

attactggtg caggaccatt ctttgataca gataaaggtt tctctgacca ttttcatgag 420

tacttattac aagataatta tgctgaaagt taagttatct gaaatgtacc ttgggtttca 480

ag 482

<210> 5

<211> 482

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

cgatggagga gtttgtaaat gaagtacagt tcattacgat acacgtctgc agtcaactgg 60

aattttcatg attgaatttt gtaaggtatt ttgaaataat ttttcatata aaggtgagtt 120

tgtattaaaa ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc 180

taatatagtc acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa 240

acttgtggta gttggagctc gtggcgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca 300

gaatcatttt gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat 360

attactggtg caggaccatt ctttgataca gataaaggtt tctctgacca ttttcatgag 420

tacttattac aagataatta tgctgaaagt taagttatct gaaatgtacc ttgggtttca 480

ag 482

<210> 6

<211> 482

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

cgatggagga gtttgtaaat gaagtacagt tcattacgat acacgtctgc agtcaactgg 60

aattttcatg attgaatttt gtaaggtatt ttgaaataat ttttcatata aaggtgagtt 120

tgtattaaaa ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc 180

taatatagtc acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa 240

acttgtggta gttggagctg ttggcgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca 300

gaatcatttt gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat 360

attactggtg caggaccatt ctttgataca gataaaggtt tctctgacca ttttcatgag 420

tacttattac aagataatta tgctgaaagt taagttatct gaaatgtacc ttgggtttca 480

ag 482

<210> 7

<211> 482

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

cgatggagga gtttgtaaat gaagtacagt tcattacgat acacgtctgc agtcaactgg 60

aattttcatg attgaatttt gtaaggtatt ttgaaataat ttttcatata aaggtgagtt 120

tgtattaaaa ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc 180

taatatagtc acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa 240

acttgtggta gttggagctg atggcgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca 300

gaatcatttt gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat 360

attactggtg caggaccatt ctttgataca gataaaggtt tctctgacca ttttcatgag 420

tacttattac aagataatta tgctgaaagt taagttatct gaaatgtacc ttgggtttca 480

ag 482

<210> 8

<211> 482

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

cgatggagga gtttgtaaat gaagtacagt tcattacgat acacgtctgc agtcaactgg 60

aattttcatg attgaatttt gtaaggtatt ttgaaataat ttttcatata aaggtgagtt 120

tgtattaaaa ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc 180

taatatagtc acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa 240

acttgtggta gttggagctg ctggcgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca 300

gaatcatttt gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat 360

attactggtg caggaccatt ctttgataca gataaaggtt tctctgacca ttttcatgag 420

tacttattac aagataatta tgctgaaagt taagttatct gaaatgtacc ttgggtttca 480

ag 482

<210> 9

<211> 482

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

cgatggagga gtttgtaaat gaagtacagt tcattacgat acacgtctgc agtcaactgg 60

aattttcatg attgaatttt gtaaggtatt ttgaaataat ttttcatata aaggtgagtt 120

tgtattaaaa ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc 180

taatatagtc acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa 240

acttgtggta gttggagctg gttgcgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca 300

gaatcatttt gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat 360

attactggtg caggaccatt ctttgataca gataaaggtt tctctgacca ttttcatgag 420

tacttattac aagataatta tgctgaaagt taagttatct gaaatgtacc ttgggtttca 480

ag 482

<210> 10

<211> 482

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

cgatggagga gtttgtaaat gaagtacagt tcattacgat acacgtctgc agtcaactgg 60

aattttcatg attgaatttt gtaaggtatt ttgaaataat ttttcatata aaggtgagtt 120

tgtattaaaa ggtactggtg gagtatttga tagtgtatta accttatgtg tgacatgttc 180

taatatagtc acattttcat tatttttatt ataaggcctg ctgaaaatga ctgaatataa 240

acttgtggta gttggagctg gtagcgtagg caagagtgcc ttgacgatac agctaattca 300

gaatcatttt gtggacgaat atgatccaac aatagaggta aatcttgttt taatatgcat 360

attactggtg caggaccatt ctttgataca gataaaggtt tctctgacca ttttcatgag 420

tacttattac aagataatta tgctgaaagt taagttatct gaaatgtacc ttgggtttca 480

ag 482

<210> 11

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttgcctacgc cact 14

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cactcttgcc tacgacact 19

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

actcttgcct acgacact 18

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcactcttgc ctacgacact 20

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccgcttgcct acgccaca 18

<210> 16

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cttgcctacg ccaca 15

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

actcttgcct acgacaca 18

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcactcttgc ctacgacaca 20

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cactcttgcc tacgacaca 19

<210> 20

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ttgcctacgc cacg 14

<210> 21

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cttgcctacg ccacg 15

<210> 22

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ctcttgccta cgccacg 17

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

actcttgcct acgccacg 18

<210> 24

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gctcttgcct acgccaa 17

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cactcttgcc tacgccaa 18

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gcactcttgc ctacgccaa 19

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ggcactcttg cctacgccaa 20

<210> 28

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cgccttgcct acgccat 17

<210> 29

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gtcttgccta cgccat 16

<210> 30

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

actcttgcct acgccat 17

<210> 31

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cgccttgcct acgccag 17

<210> 32

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ctcttgccta cgccag 16

<210> 33

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

actcttgcct acgccag 17

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cactcttgcc tacgccag 18

<210> 35

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

actcttgcct acgca 15

<210> 36

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gcactcttgc ctacgca 17

<210> 37

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

cactcttgcc tacgca 16

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

ggcactcttg cctacgca 18

<210> 39

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

cactcttgcc tacgt 15

<210> 40

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gcactcttgc ctacgt 16

<210> 41

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

aggcactctt gcatacgt 18

<210> 42

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

ggcactcttg catacgt 17

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

aggcactctt gcccacgt 18

<210> 44

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

aaggcactct tgcccacgt 19

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

tgacatgttc taatatagtc acatt 25

<210> 46

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

tgcctacgcc accagctc 18

<210> 47

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

cctacgccac cagc 14

<210> 48

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

cctacgccac cagctc 16

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

attcagtcat tttcagcagg cctt 24

<210> 50

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

tatcgccgcg ctcgtc 16

<210> 51

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

cccacgatgg aggggaaga 19

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

caacggctcc ggcatgtgca 20

<210> 53

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

ttgcctacga cact 14

<210> 54

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

ttgcctacga caca 14

<210> 55

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

ttgcctacgc cacg 14

<210> 56

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

cttgcctacg ccaa 14

<210> 57

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

tcttgcctac gccat 15

<210> 58

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

cttgcctacg ccag 14

<210> 59

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

ctcttgccta cgca 14

<210> 60

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

actcttgcat acgt 14

Claims

1.一种检测基因点突变的荧光定量PCR引物、探针组合，其特征在于，包括等位基因特异性引物、基因座特异性引物、封闭引物、检测探针；

所述基因座特异性引物，与模板的非突变区域结合；

2.根据权利要求1所述的引物、探针组合，其特征在于，所述等位基因特异性引物与封闭引物的Tm值差值△Tm≥5。

3.根据权利要求1或2所述的引物、探针组合，其特征在于，所述封闭引物的序列经锁核酸修饰；所述封闭引物3’端设置修饰非荧光基团。

4.根据权利要求1～3任一项所述的引物、探针组合，其特征在于，还包括内控引物和内控探针。

5.一种检测基因点突变的荧光定量PCR方法，其特征在于，以权利要求1～4任一项所述的引物、探针组合，对待测样品进行扩增；

6.一种检测Kras基因点突变Kras-M1的荧光定量PCR引物、探针组合，其特征在于，

所述等位基因特异性引物包含SEQ ID NO.53所示的核苷酸序列；

所述封闭引物核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示；

所述基因座特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示；

所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No:49所示。

7.一种检测Kras基因点突变Kras-M2的荧光定量PCR引物、探针组合，其特征在于，

所述等位基因特异性引物包含SEQ ID NO.54所示的核苷酸序列；

所述封闭引物核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示；

所述基因座特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示；

所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No:49所示。

8.一种检测Kras基因点突变Kras-M3的荧光定量PCR引物、探针组合，其特征在于，

所述等位基因特异性引物包含SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列；

所述封闭引物核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示；

所述基因座特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示；

所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No:49所示。

9.一种检测Kras基因点突变Kras-M4的荧光定量PCR引物、探针组合，其特征在于，

所述等位基因特异性引物包含SEQ ID NO.56所示的核苷酸序列；

所述封闭引物核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示；

所述基因座特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示；

所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No:49所示。

10.一种检测Kras基因点突变Kras-M5的荧光定量PCR引物、探针组合，其特征在于，包括等位基因特异性引物、基因座特异性引物、封闭引物、检测探针；

所述等位基因特异性引物包含SEQ ID NO.57所示的核苷酸序列；

所述封闭引物核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示；

所述基因座特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示；

所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No:49所示。

11.一种检测Kras基因点突变Kras-M6的荧光定量PCR引物、探针组合，其特征在于，包括等位基因特异性引物、基因座特异性引物、封闭引物、检测探针；

所述等位基因特异性引物包含SEQ ID NO.58所示的核苷酸序列；

所述封闭引物核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示；

所述基因座特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示；

所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No:49所示。

12.一种检测Kras基因点突变Kras-M7的荧光定量PCR引物、探针组合，其特征在于，包括等位基因特异性引物、基因座特异性引物、封闭引物、检测探针；

所述等位基因特异性引物包含SEQ ID NO.59所示的核苷酸序列；

所述封闭引物核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示；

所述基因座特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示；

所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No:49所示。

13.一种检测Kras基因点突变Kras-M8的荧光定量PCR引物、探针组合，其特征在于，包括等位基因特异性引物、基因座特异性引物、封闭引物、检测探针；

所述等位基因特异性引物包含SEQ ID NO.60所示的核苷酸序列；

所述封闭引物核苷酸序列如SEQ ID NO:47所示；

所述基因座特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示；

所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No:49所示。

14.根据权利要求6～13任一项所述的引物、探针组合，其特征在于，还包括内控引物和内控探针；所述内控基因为actin。

15.一种检测Kras基因点突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求6～13任一项所述的引物、探针组合中的至少一项，以及权利要求14所述的引物、探针组合。

16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，其中：

等位基因特异性引物包括8条引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:42所示；

基因座特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示；

检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No:49所示。

17.一种检测Kras基因点突变的荧光定量PCR方法，其特征在于，以权利要求6～13任一项所述的引物、探针组合中的至少一项对待测样品进行扩增；

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述扩增的条件包括：

19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述扩增的反应体系中包括：

20.Kras基因点突变Kras-M8在制备肺癌检测标志物中的应用。