CN110551815A - 检测人Ras基因突变的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

检测人Ras基因突变的试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及基因突变检测领域，具体讲，涉及一种检测人Ras基因突变的试剂盒及其使用方法。本申请的试剂盒对人Kras基因的第2号、第3号外显子和Nras基因第3号外显子的相关突变进行定性检测，用于指导爱必妥、帕尼单抗等EGFR抗体药物的靶向用药，从而降低医生治疗风险以及患者经济负担。

Description

检测人Ras基因突变的试剂盒及其使用方法
技术领域
本申请涉及基因突变检测领域，具体讲，涉及一种检测人Ras基因突变的试剂盒及其使用方法。
背景技术
大量临床研究资料证实，Kras基因突变状态与针对EGFR的药物，如Cetuximab(爱必妥)和Panitumumab(帕尼单抗)等的疗效有关，因此Kras基因突变检测已被写入最新版的《NCCN结直肠癌临床实践指南》，所有转移性结直肠癌患者都应检测Kras基因状态，只对Kras基因野生型患者推荐介绍抗EGFR药物治疗。2013年ESMO上更新了PRIME研究的最新数据，提示在使用帕尼单抗或者说抗EGFR单抗治疗转移性结直肠癌患者前，不仅需要检测Kras基因的突变热点第2外显子，还要检测其他外显子和Nras基因。经过这样更精细检测和挑选的患者，才是帕尼单抗联合化疗最大的获益人群。
目前基因突变检测常用的方法有以下几种：
1、核苷酸序列测定技术：是基因突变的经典检测方法，也是检测基因突变的金标准，目前国内外报道的EGFR基因突变的检测不少采用DNA测序法，该方法可靠直观，并可检测出多位点的变异。
2、聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性分析(RFLP)技术：PCR-RFLP是在RFLP分析方法的基础上发展建立的一种更为简便的DNA分型技术。PCR-RFLP的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。PCR结合RFLP分析技术能有效地鉴别野生株和变异株，实验简便、快速，无需特殊仪器，适合于一般实验室应用及大规模临床检验使用，但灵敏度不够，易污染，并且不可发现新的位点变异。
3、基因芯片技术：基因芯片(genechip)，又称基因微矩阵(microarray)，其原理是将大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作为探针有序地和高密度地排列固定于玻璃或硅等载体上，然后与待测的有荧光标记的样品核酸按碱基配对的原则进行杂交，通过激光共聚焦系统检测杂交信号强度，经计算机分析处理数据资料，获取样品分子的数量和序列信息，从而可对核酸序列进行大规模、高通量的研究.基因芯片技术由于其具有大通量、快速、灵敏、平行检测基因的优势，已在生物学的各个领域中得到广泛的应用。但由于目前技术还不够成熟，所以有一定的假阳性和假阴性率，实验数据不容易解释，不可检测出新位点的变异。
4、变性高效液相色谱(DHPLC)技术：DHPLC技术是一种高通量、主动化的基因突变检测技术。该技术已在医学、癌症、药物等研究领域开展，与SSCP和DNA直接测序等突变检测技巧相比，DHPLC具有敏锐性更高，特异性更强，便宜省时等优点。但缺点也很明显，如可判断有否突变，不能确定SNP的位置和类型，需用标准样品或结合测序验证，而且仪器价格昂贵，也制约了在临床的开展。
鉴于此，为了对人Kras基因的相关突变进行定性检测，用于指导Cetuximab(爱必妥)、Panitumumab(帕尼单抗)等EGFR抗体药物的靶向用药，特提出本申请。
发明内容
本申请的发明目的在于提出一种检测人Ras基因突变的试剂盒及其使用方法。
为了完成本申请的目的，采用的技术方案为：
本申请涉及一种检测人Ras基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包括Ras基因反应液1、Ras基因反应液3、Ras基因反应液5和Ras内参基因反应液；
其中，所述Ras基因反应液1用于检测Kras基因第2号外显子，所述Ras基因反应液3用于检测Kras基因第3号外显子的基因突变，所述Ras基因反应液5用于检测Nras基因第3号外显子，所述Ras内参基因反应液用于检测内参基因；
其中，所述Ras基因反应液1中包括由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示的上游引物、由SEQ ID NO:13所示的下游引物、由SEQ ID NO:14所示的探针、由SEQ ID NO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ ID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:23所示的内控探针；
所述Ras基因反应液3中包括由SEQ ID NO:1所示的上游引物、由SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:9所示的下游引物、由SEQ ID NO:10所示的探针、由SEQ ID NO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ ID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:23所示的内控探针；
所述Ras基因反应液5中包括由SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:17所示的上游引物、SEQ ID NO:18所示的下游引物、由SEQ ID NO:19所示的探针、由SEQ ID NO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ ID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:23所示的内控探针；
所述Ras内参基因反应液中包括由SEQ ID NO:20所示的内参基因上游引物、由SEQID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:22所示的内参基因探针；
所述探针的两端标记有荧光基团。
可选的，SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQID NO:14所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ ID NO:22所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的5’端标记有Hex、3’端标记有TAMRA。
可选的，所述核酸扩增试剂中还包括Ras基因MIX 3反应液，所述Ras基因MIX 3反应液中含有Taq酶、UNG酶和dNTPs。
可选的，所述试剂盒中还包括对照品，所述对照品包括阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为工艺用水，所述阳性对照中含有Ras基因突变质粒以及内参质粒，所述Ras基因突变质粒选自Kras-G12A、Kras-G12R、Kras-G12D、Kras-G12C、Kras-G12S、Kras-G12V、Kras-G13C、Kras-G13D、Kras-Q61R、Kras-Q61L、Kras-Q61H1、Kras-Q61H2、Nras-Q61K、Nras-Q61R、Nras-Q61L、Nras-Q61H1和Nras-Q61H2中的至少一种；优选含有Kras-G12D、Kras-Q61L和Nras-Q61K质粒。
可选的，所述试剂盒所适用的样本选自组织样本，所述组织样本优选石蜡包埋切片。
可选的，所述Ras基因MIX3反应液中含有Taq酶0.4～0.6体积份，UNG酶0.2～0.3体积份；
优选的，所述Ras基因MIX3反应液中含有Taq酶0.46体积份，UNG酶0.23体积份；
其中，UNG酶的活性单位为1U/μl，Taq酶的活性单位为5U/μl。
本申请还涉及用于检测人Ras基因突变的引物和探针，包括用于检测Kras基因第2号外显子的引物和探针、用于检测Kras基因第3号外显子的引物和探针、用于检测Nras基因第3号外显子的引物和探针和用于检测内参基因的引物和探针；所述用于检测Kras基因第2号外显子的引物和探针包括由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示的上游引物、由SEQ IDNO:13所示的下游引物、由SEQ ID NO:14所示的探针、由SEQ ID NO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ ID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:23所示的内控探针；所述用于检测Kras基因第3号外显子的引物和探针包括由SEQ ID NO:1所示的上游引物、由SEQ IDNO:2～SEQ ID NO:9所示的下游引物、由SEQ ID NO:10所示的探针、由SEQ ID NO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ ID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:23所示的内控探针；所述用于检测Nras基因第3号外显子的引物和探针包括由SEQ ID NO:15～SEQ IDNO:17所示的上游引物、SEQ ID NO:18所示的下游引物、由SEQ ID NO:19所示的探针、由SEQID NO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ ID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ IDNO:23所示的内控探针；所述用于检测内参基因的引物和探针包括由SEQ ID NO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ ID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:22所示的内参基因探针；所述探针的两端标记有荧光基团。
可选的，SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQID NO:14所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ ID NO:22所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的5’端标记有Hex、3’端标记有TAMRA。
本申请还涉及该试剂盒的使用方法，至少包括以下步骤：
(1)扩增试剂准备：配制PCR反应液体系：将Ras基因反应液1、Ras基因反应液3、Ras基因反应液5分别与Ras基因MIX 3反应液混合，得到相应的PCR反应液预混液；
(2)加样：分别取阴性对照、待检样本DNA液、阳性对照，依次加至分别装有相应的所述PCR反应液预混液的离心管中；
(3)PCR扩增：
(4)检测，处理和分析数据。
本申请的技术方案至少具有以下有益的效果：
本申请试剂盒采用PCR结合实时荧光探针技术，基于荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer，FRET)，通过检测PCR过程的荧光讯号而得知靶基因的初始浓度，具有检测过程简化、反应速度快、灵敏度高、特异性强、可重复性好、闭管操作等技术优势，适于临床推广应用。本申请试剂盒对人类Kras基因的第2号、第3号外显子和Nras基因第3号外显子的相关突变进行定性检测，可用于指导Cetuximab(爱必妥)、Panitumumab(帕尼单抗)等EGFR抗体药物的靶向用药，从而降低医生治疗风险以及患者经济负担。
本申请试剂盒可从石蜡包埋病理组织或切片等提取的人类基因组DNA中检测Kras和Nras基因相关的17种突变：检测分别Kras基因第2号外显子(G12D、G12A、G12R、G12C、G12V、G12S、G13C、G13D)、Kras基因第3号外显子(Q61L、Q61R、Q61H)、Nras基因第3号外显子(Q61K、Q61L、Q61R、Q61H)的突变，符合率为100％。
本申请试剂盒的最低检出量低，可检测在低至5ng/μl野生型基因组DNA背景下，对含5％Kras或Nras基因突变DNA的样本，均能检出。
本申请试剂盒的精密度高，在相应的反应液中重复做10次，均能检出，且其实验数据CV值均小于10％。
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。
具体实施方式
本申请实施例涉及一种检测人Ras基因突变的试剂盒，包括核酸扩增试剂，核酸扩增试剂包括Ras基因反应液1、Ras基因反应液3、Ras基因反应液5和Ras内参基因反应液。其中，Ras基因反应液1用于检测Kras基因第2号外显子的基因突变，Ras基因反应液3用于检测Kras基因第3号外显子的基因突变，Ras基因反应液5用于检测Nras基因第3号外显子的基因突变。Ras内参基因反应液检测用于对试剂、样本中DNA质量以及实验操作的质控，选择的检测区域是人相对保守的区段，大小约100～150bp，与检测基因的片段长度和扩增效率相当，这样即使DNA有降解，内参基因的检测仍能真实地反映有效的DNA量。
具体的，本申请实施例的试剂盒具体如表1所示：
表1
其中，各Ras基因反应液中引物和探针的序列具体如表2所示：
表2：
其中，探针的两端标记有荧光基团；可选的，SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ ID NO:22所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的5’端标记有Hex、3’端标记有TAMRA，并不限于此。
具体的，引物和探针的核苷酸序列具体如表3所示：
表3：
具体的，阳性对照质粒的核苷酸序列具体如表4所示：
表4：
优选的，阳性对照中含有Kras-G12D、Kras-Q61L和Nras-Q61K质粒。
可选的，试剂盒所适用的样本选自组织样本，所述组织样本优选石蜡包埋切片。
可选的，Ras基因MIX 3反应液中含有Taq酶0.4～0.6体积份，UNG酶0.2～0.3体积份；
优选的，Ras基因MIX 3反应液中含有Taq酶0.46体积份，UNG酶0.23体积份；其中，UNG酶的活性单位为1U/μl，Taq酶的活性单位为5U/μl。
可选的，Ras基因MIX 3反应液中还含有dNTPs 20～200μM，以及适量KCl、适量Tris-HCl、MgCl2 1.0～4.0mM以及适量DTT。
本申请实施例还提出用于检测人Ras基因突变的引物和探针，包括用于检测Kras基因第2号外显子的引物和探针、用于检测Kras基因第3号外显子的引物和探针、用于检测Nras基因第3号外显子的引物和探针、用于检测内参基因的引物和探针；用于检测Kras基因第2号外显子的引物和探针含有由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示的上游引物、由SEQ IDNO:13所示的下游引物、由SEQ ID NO:14所示的探针、由SEQ ID NO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ ID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:23所示的内控探针；用于检测Kras基因第3号外显子的引物和探针含有由SEQ ID NO:1所示的上游引物、由SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:9所示的下游引物、由SEQ ID NO:10所示的探针、由SEQ ID NO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ ID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:23所示的内控探针；用于检测Nras基因第3号外显子的引物和探针含有由SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:17所示的上游引物、SEQ ID NO:18所示的下游引物、由SEQ ID NO:19所示的探针、由SEQ IDNO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ ID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:23所示的内控探针；用于检测内参基因的引物和探针：由SEQ ID NO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ ID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:22所示的内参基因探针；探针的两端标记有荧光基团。
可选的，SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQID NO:14所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ ID NO:22所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的5’端标记有Hex、3’端标记有TAMRA。
本申请试剂盒的样品要求为：
本申请试剂盒适用于从石蜡包埋切片等标本中提取的人类基因组DNA的检测。石蜡包埋切片有效年限为10年。建议使用商业化的试剂盒来提取。优选QIAGEN石蜡组织DNA提取试剂盒，CatNO.56404。提取完的DNA建议立即进行检测，否则请于-20℃保存。
本申请试剂盒的使用方法为：
1.在每次检测中，必须对试剂盒中的阴性对照和Ras阳性对照同时进行检测。
2.扩增试剂准备：
从试剂盒中取出各种反应液及Ras基因MIX 3反应液，室温融化并振荡混匀后，短暂离心数秒，各PCR反应液体系1人份均按如下配制：9μL PCR反应液(Ras基因反应液1、Ras基因反应液3、Ras基因反应液5、Ras内参基因反应液)+13μL Ras基因MIX3反应液(PCR管数应为样本数、1个阴性对照及1个阳性对照之和)。
3.加样：
分别取阴性对照、待检样本DNA液或阳性对照各3μL，依次加至分别装有上述不同PCR反应混合液的离心管中，盖紧管盖，快速离心10秒，将其移至检测区。
4.PCR扩增：
4.1扩增条件设定
根据不同的PCR仪，扩增条件如表5所示：
表5：
反应体系为25μl。
4.2检测通道设定
根据不同的PCR仪，检测通道设定如表6所示：
表6：
4.3参比荧光设定
根据不同的PCR仪，参比荧光设定如表7所示：
表7：
机型 参比荧光设定
StratageneMx3000p、ABIPRISM7500 none
BIO-RADCFX96 /
(其中，突变由FAM信号指示，内控由HEX信号指示)。
5.检测：
(1)基线的确定：软件默认为3～15个循环的平均荧光信号为基线。在实验中，一般选择曲线波动较小，较稳定的那段作为基线，用户可根据实际情况自行酌情调整。终点要避免覆盖信号已经开始有明显增长的地方。且以起点与终点之间最好能间隔8个循环以上为原则。
(2)阈值的确定：在阴性对照无扩增的情况下，阈值设定在无典型扩增曲线样本的最高点，且阴性对照未检出为原则，确定起始阈值。
(3)注意：不同的反应液应分别单独确定各自的基线和阈值后，再进行各自分析。
计算机自动处理和分析数据。
【阳性判断值或者参考区间】
本申请试剂盒对含5％Kras、Nras基因突变DNA的样本，均能检出。
【检验结果的解释】
其中：ΔCT值的计算方法：ΔCT值＝目的基因CT值—内参基因CT值。
1、有效性判定：
(1)阴性对照有效性判定，如表8所示：
表8：
项目 有效性判定
Ras基因反应液1 C<sub>T</sub>值均应≥38或显示“Undet”，或ΔC<sub>T</sub>值≥6
Ras基因反应液3 C<sub>T</sub>值均应≥38或显示“Undet”，或ΔC<sub>T</sub>值≥6
Ras基因反应液5 C<sub>T</sub>值均应≥38或显示“Undet”，或ΔC<sub>T</sub>值≥6
Ras内参基因反应液 C<sub>T</sub>值均应≥38或显示“Undet”
(2)阳性对照有效性判定如表9所示：
表9：
项目 有效性判定
Ras基因反应液1 C<sub>T</sub>值＜36；且ΔC<sub>T</sub>值＜6
Ras基因反应液3 C<sub>T</sub>值＜36；且ΔC<sub>T</sub>值＜6
Ras基因反应液5 C<sub>T</sub>值＜36；且ΔC<sub>T</sub>值＜6
Ras内参基因反应液 C<sub>T</sub>值＜36
2.结果判定：
(1)当标本内参基因CT值＜36时，结果判定如表10所示：
表10：
(2)当标本内参基因CT值≥36时，结果判定如表11所示：
表11：
注：若需检测样本低至5％的突变，内参基因的CT值需＜29。
(3)当标本目的基因CT值≥36时，且待测样品的内控HEX信号不升起，加入的DNA含有PCR抑制剂或DNA加入数量不够，需要重新提取DNA后再做或增加DNA用量后再做。
下面通过具体实施例进一步说明本申请，如无特殊说明，本申请所用到的原料均为市售原料。
实施例1
一种检测人Ras基因突变的试剂盒，其组成如表12所示：
表12：
试剂盒各组分的包装及含量如表13所示：
表13：
实施例2：本申请试剂盒的准确性检测
采用实施例1的试剂盒对准确性质控品进行检测。选取检定合格的并经过定值的12种不同Kras基因突变型的质粒DNA液各1份，组成Kras基因突变型的准确性质控品，5种不同Nras基因突变型的质粒DNA液各1份，组成Nras基因突变型的准确性质控品，上述17份质粒DNA与100ng/μl的正常人基因组DNA按摩尔比1:1混合，组成本试剂盒的准确性质控品，准确性质控品的具体组成如表14所示：
表14
将制备得到的准确性质控品进行检测，得到的实验结果如表15所示：
表15
本申请的试剂盒检测包括含突变型的质粒的准确性质控品样本，其阳性符合率为100％。
实施例3：本申请试剂盒的分析特异性检测
采用实施例1的试剂盒对特异性参考品进行检测。选取检定合格的正常人基因组DNA、肺癌Kras和Nras野生型基因组DNA和肠癌Kras和Nras野生型基因组DNA各一份作为本申请试剂盒的特异性参考品。其中，特异性参考品的配制方法如表16所示：
表16
将制备得到的分析特异性参考品进行检测，得到的实验结果如表17所示：
表17
采用本申请的试剂盒检测特异性参考品，其阴性符合率为100％。
实施例4：本申请试剂盒的精密度检测
采用实施例1的试剂盒对精密度参考品进行检测：选取检定合格的2种Kras基因突变型的质粒DNA液、1种Nras基因突变型的质粒DNA液，组成本试剂盒的精密度质控品。其中，精密度参考品的组成如表18所示：
表18
将制备得到精密度参考品的每一批做10个孔，重复实验3次；得到的实验结果如表19所示：
表19
本申请的试剂盒对各精密度质控品，在相应的反应液中重复做10次，均能检出，且其实验数据CV值≤5％。
实施例5：本申请试剂盒的最低检出量检测
采用实施例1的试剂盒对最低检出量参考品进行检测。选取检定合格的2种Kras基因突变型的质粒DNA液、1种Nras基因突变型的质粒DNA液，与50ng/μl正常人基因组DNA按摩尔比1:19混合，组成本试剂盒的检测限质控品。其中，最低检出量参考品的组成如表20所示：
表20
将制备得到的最低检出量参考品重复实验3次，得到的实验结果如表21所示：
表21
本申请的试剂盒对最低检出量参考品进行检测，证实本申请试剂盒在低至5ng/μl野生型基因组DNA背景下，对含5％Kras或Nras基因突变DNA的样本，均能检出。
本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。
序列表
<110> 苏州云泰生物医药科技有限公司
<120> 检测人Ras基因突变的试剂盒及其使用方法
<160> 41
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacatgttct aatatagtca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcactcttg cctacgccaa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcactcttg cctacgccat 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaggcactct tgcctaggt 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaggcactct tgcctaccca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcactcttgc ctacgccact 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcactcttgc ctacgccaca 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggcactcttg cctacgcgag 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcactcttgc ctacgccacg 20
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggcctgctga aaatgactga ata 23
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tattctcgac acagcaggta k 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tattctcgac acagcaggtc gy 22
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ataattactc cttaatgtca gct 23
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgagggacc agtacatgag ga 22
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
catactggat acagctggga 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atactggata cagctggacc y 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
catactggat acagctggta k 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acaaagatca tcctttcaga g 21
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgagagacca atacatgagg aca 23
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caatatcagc cttaggtgcg 20
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gaaagggaaa gacatagaaa gtgaa 25
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
catctccgaa agccaacaag ga 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
catctccgaa agccaacaag ga 22
<210> 24
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggtacgttat gtgtgacatg ttctaatata gtcacatttt cattattttt attataaggc 60
ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag ctgctggcgt aggcaagagt 120
gccttgacga tacagctaat tcagaatcat tttgtggacg aatatgatcc aacaatagag 180
gtaaatcttg ttttaatatg catattactg gtgcaggacc attctttgat acagataaag 240
gtttctctga ccattttcat gagtacttat tacaagataa ttatgctgaa agttaagtta 300
tctgaaatgt accttgggtt tcaagttata tgtaaccatt aatatgggaa ctttactttc 360
cttgggagtt tgtcagggtc catgatgttc actctctgtg cattttgatt ggaagtgtat 420
ttcagagttt cgtgagaggg taaatcgtcg acctgcaggc atgcaagctt ggcgtaatca 480
tggtcatagc tgtttcctgt 500
<210> 25
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ggtacgttat gtgtgacatg ttctaatata gtcacatttt cattattttt attataaggc 60
ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag ctcgtggcgt aggcaagagt 120
gccttgacga tacagctaat tcagaatcat tttgtggacg aatatgatcc aacaatagag 180
gtaaatcttg ttttaatatg catattactg gtgcaggacc attctttgat acagataaag 240
gtttctctga ccattttcat gagtacttat tacaagataa ttatgctgaa agttaagtta 300
tctgaaatgt accttgggtt tcaagttata tgtaaccatt aatatgggaa ctttactttc 360
cttgggagtt tgtcagggtc catgatgttc actctctgtg cattttgatt ggaagtgtat 420
ttcagagttt cgtgagaggg taaatcgtcg acctgcaggc atgcaagctt ggcgtaatca 480
tggtcatagc tgtttcctgt 500
<210> 26
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ggtacgttat gtgtgacatg ttctaatata gtcacatttt cattattttt attataaggc 60
ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag ctgatggcgt aggcaagagt 120
gccttgacga tacagctaat tcagaatcat tttgtggacg aatatgatcc aacaatagag 180
gtaaatcttg ttttaatatg catattactg gtgcaggacc attctttgat acagataaag 240
gtttctctga ccattttcat gagtacttat tacaagataa ttatgctgaa agttaagtta 300
tctgaaatgt accttgggtt tcaagttata tgtaaccatt aatatgggaa ctttactttc 360
cttgggagtt tgtcagggtc catgatgttc actctctgtg cattttgatt ggaagtgtat 420
ttcagagttt cgtgagaggg taaatcgtcg acctgcaggc atgcaagctt ggcgtaatca 480
tggtcatagc tgtttcctgt 500
<210> 27
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ggtacgttat gtgtgacatg ttctaatata gtcacatttt cattattttt attataaggc 60
ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag cttgtggcgt aggcaagagt 120
gccttgacga tacagctaat tcagaatcat tttgtggacg aatatgatcc aacaatagag 180
gtaaatcttg ttttaatatg catattactg gtgcaggacc attctttgat acagataaag 240
gtttctctga ccattttcat gagtacttat tacaagataa ttatgctgaa agttaagtta 300
tctgaaatgt accttgggtt tcaagttata tgtaaccatt aatatgggaa ctttactttc 360
cttgggagtt tgtcagggtc catgatgttc actctctgtg cattttgatt ggaagtgtat 420
ttcagagttt cgtgagaggg taaatcgtcg acctgcaggc atgcaagctt ggcgtaatca 480
tggtcatagc tgtttcctgt 500
<210> 28
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ggtacgttat gtgtgacatg ttctaatata gtcacatttt cattattttt attataaggc 60
ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag ctagtggcgt aggcaagagt 120
gccttgacga tacagctaat tcagaatcat tttgtggacg aatatgatcc aacaatagag 180
gtaaatcttg ttttaatatg catattactg gtgcaggacc attctttgat acagataaag 240
gtttctctga ccattttcat gagtacttat tacaagataa ttatgctgaa agttaagtta 300
tctgaaatgt accttgggtt tcaagttata tgtaaccatt aatatgggaa ctttactttc 360
cttgggagtt tgtcagggtc catgatgttc actctctgtg cattttgatt ggaagtgtat 420
ttcagagttt cgtgagaggg taaatcgtcg acctgcaggc atgcaagctt ggcgtaatca 480
tggtcatagc tgtttcctgt 500
<210> 29
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ggtacgttat gtgtgacatg ttctaatata gtcacatttt cattattttt attataaggc 60
ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag ctgttggcgt aggcaagagt 120
gccttgacga tacagctaat tcagaatcat tttgtggacg aatatgatcc aacaatagag 180
gtaaatcttg ttttaatatg catattactg gtgcaggacc attctttgat acagataaag 240
gtttctctga ccattttcat gagtacttat tacaagataa ttatgctgaa agttaagtta 300
tctgaaatgt accttgggtt tcaagttata tgtaaccatt aatatgggaa ctttactttc 360
cttgggagtt tgtcagggtc catgatgttc actctctgtg cattttgatt ggaagtgtat 420
ttcagagttt cgtgagaggg taaatcgtcg acctgcaggc atgcaagctt ggcgtaatca 480
tggtcatagc tgtttcctgt 500
<210> 30
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggtacgttat gtgtgacatg ttctaatata gtcacatttt cattattttt attataaggc 60
ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag ctggttgcgt aggcaagagt 120
gccttgacga tacagctaat tcagaatcat tttgtggacg aatatgatcc aacaatagag 180
gtaaatcttg ttttaatatg catattactg gtgcaggacc attctttgat acagataaag 240
gtttctctga ccattttcat gagtacttat tacaagataa ttatgctgaa agttaagtta 300
tctgaaatgt accttgggtt tcaagttata tgtaaccatt aatatgggaa ctttactttc 360
cttgggagtt tgtcagggtc catgatgttc actctctgtg cattttgatt ggaagtgtat 420
ttcagagttt cgtgagaggg taaatcgtcg acctgcaggc atgcaagctt ggcgtaatca 480
tggtcatagc tgtttcctgt 500
<210> 31
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ggtacgttat gtgtgacatg ttctaatata gtcacatttt cattattttt attataaggc 60
ctgctgaaaa tgactgaata taaacttgtg gtagttggag ctggtgacgt aggcaagagt 120
gccttgacga tacagctaat tcagaatcat tttgtggacg aatatgatcc aacaatagag 180
gtaaatcttg ttttaatatg catattactg gtgcaggacc attctttgat acagataaag 240
gtttctctga ccattttcat gagtacttat tacaagataa ttatgctgaa agttaagtta 300
tctgaaatgt accttgggtt tcaagttata tgtaaccatt aatatgggaa ctttactttc 360
cttgggagtt tgtcagggtc catgatgttc actctctgtg cattttgatt ggaagtgtat 420
ttcagagttt cgtgagaggg taaatcgtcg acctgcaggc atgcaagctt ggcgtaatca 480
tggtcatagc tgtttcctgt 500
<210> 32
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ggaacaatgt cttttcaagt cctttgccca tttttaaatt gaattttttg ttgttgagtt 60
gtatataaca ccttttttga agtaaaaggt gcactgtaat aatccagact gtgtttctcc 120
cttctcagga ttcctacagg aagcaagtag taattgatgg agaaacctgt ctcttggata 180
ttctcgacac agcaggtcga gaggagtaca gtgcaatgag ggaccagtac atgaggactg 240
gggagggctt tctttgtgta tttgccataa ataatactaa atcatttgaa gatattcacc 300
attataggtg ggtttaaatt gaatataata agctgacatt aaggagtaat tatagttttt 360
attttttgag tctttgctaa tgccatgcat ataatattta ataaaaattt ttaaataatg 420
<210> 33
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ggaacaatgt cttttcaagt cctttgccca tttttaaatt gaattttttg ttgttgagtt 60
gtatataaca ccttttttga agtaaaaggt gcactgtaat aatccagact gtgtttctcc 120
cttctcagga ttcctacagg aagcaagtag taattgatgg agaaacctgt ctcttggata 180
ttctcgacac agcaggtcta gaggagtaca gtgcaatgag ggaccagtac atgaggactg 240
gggagggctt tctttgtgta tttgccataa ataatactaa atcatttgaa gatattcacc 300
attataggtg ggtttaaatt gaatataata agctgacatt aaggagtaat tatagttttt 360
attttttgag tctttgctaa tgccatgcat ataatattta ataaaaattt ttaaataatg 420
<210> 34
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ggaacaatgt cttttcaagt cctttgccca tttttaaatt gaattttttg ttgttgagtt 60
gtatataaca ccttttttga agtaaaaggt gcactgtaat aatccagact gtgtttctcc 120
cttctcagga ttcctacagg aagcaagtag taattgatgg agaaacctgt ctcttggata 180
ttctcgacac agcaggtcac gaggagtaca gtgcaatgag ggaccagtac atgaggactg 240
gggagggctt tctttgtgta tttgccataa ataatactaa atcatttgaa gatattcacc 300
attataggtg ggtttaaatt gaatataata agctgacatt aaggagtaat tatagttttt 360
attttttgag tctttgctaa tgccatgcat ataatattta ataaaaattt ttaaataatg 420
<210> 35
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ggaacaatgt cttttcaagt cctttgccca tttttaaatt gaattttttg ttgttgagtt 60
gtatataaca ccttttttga agtaaaaggt gcactgtaat aatccagact gtgtttctcc 120
cttctcagga ttcctacagg aagcaagtag taattgatgg agaaacctgt ctcttggata 180
ttctcgacac agcaggtcat gaggagtaca gtgcaatgag ggaccagtac atgaggactg 240
gggagggctt tctttgtgta tttgccataa ataatactaa atcatttgaa gatattcacc 300
attataggtg ggtttaaatt gaatataata agctgacatt aaggagtaat tatagttttt 360
attttttgag tctttgctaa tgccatgcat ataatattta ataaaaattt ttaaataatg 420
<210> 36
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gagggacaaa ccagataggc agaaatgggc ttgaatagtt agatgcttat ttaaccttgg 60
caatagcatt gcattccctg tggtttttaa taaaaattga acttccctcc ctccctgccc 120
ccttaccctc cacaccccca ggattcttac agaaaacaag tggttataga tggtgaaacc 180
tgtttgttgg acatactgga tacagctgga aaagaagagt acagtgccat gagagaccaa 240
tacatgagga caggcgaagg cttcctctgt gtatttgcca tcaataatag caagtcattt 300
gcggatatta acctctacag gtactaggag cattattttc tctgaaagga tgatctttgt 360
gttctgaatc tttatgggga aatgaggtta ccacactagg gaagatagag ctttttaatt 420
atgggaagag ttggttttag gttgtttgac attgagaatc tagggtaatt actgaaagtt 480
aatactggaa tttattttac 500
<210> 37
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gagggacaaa ccagataggc agaaatgggc ttgaatagtt agatgcttat ttaaccttgg 60
caatagcatt gcattccctg tggtttttaa taaaaattga acttccctcc ctccctgccc 120
ccttaccctc cacaccccca ggattcttac agaaaacaag tggttataga tggtgaaacc 180
tgtttgttgg acatactgga tacagctgga cgagaagagt acagtgccat gagagaccaa 240
tacatgagga caggcgaagg cttcctctgt gtatttgcca tcaataatag caagtcattt 300
gcggatatta acctctacag gtactaggag cattattttc tctgaaagga tgatctttgt 360
gttctgaatc tttatgggga aatgaggtta ccacactagg gaagatagag ctttttaatt 420
atgggaagag ttggttttag gttgtttgac attgagaatc tagggtaatt actgaaagtt 480
aatactggaa tttattttac 500
<210> 38
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gagggacaaa ccagataggc agaaatgggc ttgaatagtt agatgcttat ttaaccttgg 60
caatagcatt gcattccctg tggtttttaa taaaaattga acttccctcc ctccctgccc 120
ccttaccctc cacaccccca ggattcttac agaaaacaag tggttataga tggtgaaacc 180
tgtttgttgg acatactgga tacagctgga ctagaagagt acagtgccat gagagaccaa 240
tacatgagga caggcgaagg cttcctctgt gtatttgcca tcaataatag caagtcattt 300
gcggatatta acctctacag gtactaggag cattattttc tctgaaagga tgatctttgt 360
gttctgaatc tttatgggga aatgaggtta ccacactagg gaagatagag ctttttaatt 420
atgggaagag ttggttttag gttgtttgac attgagaatc tagggtaatt actgaaagtt 480
aatactggaa tttattttac 500
<210> 39
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gagggacaaa ccagataggc agaaatgggc ttgaatagtt agatgcttat ttaaccttgg 60
caatagcatt gcattccctg tggtttttaa taaaaattga acttccctcc ctccctgccc 120
ccttaccctc cacaccccca ggattcttac agaaaacaag tggttataga tggtgaaacc 180
tgtttgttgg acatactgga tacagctgga cacgaagagt acagtgccat gagagaccaa 240
tacatgagga caggcgaagg cttcctctgt gtatttgcca tcaataatag caagtcattt 300
gcggatatta acctctacag gtactaggag cattattttc tctgaaagga tgatctttgt 360
gttctgaatc tttatgggga aatgaggtta ccacactagg gaagatagag ctttttaatt 420
atgggaagag ttggttttag gttgtttgac attgagaatc tagggtaatt actgaaagtt 480
aatactggaa tttattttac 500
<210> 40
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gagggacaaa ccagataggc agaaatgggc ttgaatagtt agatgcttat ttaaccttgg 60
caatagcatt gcattccctg tggtttttaa taaaaattga acttccctcc ctccctgccc 120
ccttaccctc cacaccccca ggattcttac agaaaacaag tggttataga tggtgaaacc 180
tgtttgttgg acatactgga tacagctgga catgaagagt acagtgccat gagagaccaa 240
tacatgagga caggcgaagg cttcctctgt gtatttgcca tcaataatag caagtcattt 300
gcggatatta acctctacag gtactaggag cattattttc tctgaaagga tgatctttgt 360
gttctgaatc tttatgggga aatgaggtta ccacactagg gaagatagag ctttttaatt 420
atgggaagag ttggttttag gttgtttgac attgagaatc tagggtaatt actgaaagtt 480
aatactggaa tttattttac 500
<210> 41
<211> 383
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
caatatcagc cttaggtgcg gctccacagc cccagtgtcc ctcaccttcg gggtgcatcg 60
ctggtaacat ccacccagat cactgggcag catgtggcac catctcacaa ttgccagtta 120
acgtcttcct tctctctctg tcatagggac tctggatccc agaaggtgag aaagttaaaa 180
ttcccgtcgc tatcaaggaa ttaagagaag caacatctcc gaaagccaac aaggaaatcc 240
tcgatgtgag tttctgcttt gctgtgtggg ggtccatggc tctgaacctc aggcccacct 300
tttctcatgt ctggcagctg ctctgctcta gaccctgctc atctccacat cctaaatgtt 360
cactttctat gtctttccct ttc 383

Claims (9)

1.一种检测人Ras基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包括Ras基因反应液1、Ras基因反应液3、Ras基因反应液5和Ras内参基因反应液；所述Ras基因反应液1用于检测Kras基因第2号外显子，所述Ras基因反应液3用于检测Kras基因第3号外显子，所述Ras基因反应液5用于检测Nras基因第3号外显子，所述Ras内参基因反应液用于检测内参基因：
其中，所述Ras基因反应液1中包括由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示的上游引物、由SEQ ID NO:13所示的下游引物、由SEQ ID NO:14所示的探针、由SEQ ID NO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ ID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:23所示的内控探针；
所述Ras基因反应液3中包括由SEQ ID NO:1所示的上游引物、由SEQ ID NO:2～SEQ IDNO:9所示的下游引物、由SEQ ID NO:10所示的探针、由SEQ ID NO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ ID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:23所示的内控探针；
所述Ras基因反应液5中包括由SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:17所示的上游引物、SEQ IDNO:18所示的下游引物、由SEQ ID NO:19所示的探针、由SEQ ID NO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ ID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:23所示的内控探针；
所述Ras内参基因反应液中包括由SEQ ID NO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ IDNO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:22所示的内参基因探针；
所述探针的两端标记有荧光基团。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ ID NO:22所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的5’端标记有Hex、3’端标记有TAMRA。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂中还包括Ras基因MIX3反应液，所述Ras基因MIX 3反应液中含有Taq酶、UNG酶和dNTPs。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括对照品，所述对照品包括阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为工艺用水，所述阳性对照中含有Ras基因突变质粒以及内参质粒，所述Ras基因突变质粒选自Kras-G12A、Kras-G12R、Kras-G12D、Kras-G12C、Kras-G12S、Kras-G12V、Kras-G13C、Kras-G13D、Kras-Q61R、Kras-Q61L、Kras-Q61H1、Kras-Q61H2、Nras-Q61K、Nras-Q61R、Nras-Q61L、Nras-Q61H1和Nras-Q61H2中的至少一种；优选含有Kras-G12D、Kras-Q61L和Nras-Q61K质粒。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒所适用的样本选自组织样本，所述组织样本优选石蜡包埋切片。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Ras基因MIX 3反应液中含有Taq酶0.4～0.6体积份，UNG酶0.2～0.3体积份；
优选的，所述Ras基因MIX 3反应液中含有Taq酶0.46体积份，UNG酶0.23体积份；
其中，UNG酶的活性单位为1U/μl，Taq酶的活性单位为5U/μl。
7.一种检测人Ras基因突变的引物和探针，其特征在于，包括用于检测Kras基因第2号外显子的引物和探针、用于检测Kras基因第3号外显子的引物和探针、用于检测Nras基因第3号外显子的引物和探针和用于检测内参基因的引物和探针；
所述用于检测Kras基因第2号外显子的引物和探针包括由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示的上游引物、由SEQ ID NO:13所示的下游引物、由SEQ ID NO:14所示的探针、由SEQID NO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ ID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ IDNO:23所示的内控探针；
所述用于检测Kras基因第3号外显子的引物和探针包括由SEQ ID NO:1所示的上游引物、由SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:9所示的下游引物、由SEQ ID NO:10所示的探针、由SEQ IDNO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ ID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:23所示的内控探针；
所述用于检测Nras基因第3号外显子的引物和探针包括由SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:17所示的上游引物、SEQ ID NO:18所示的下游引物、由SEQ ID NO:19所示的探针、由SEQ IDNO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ ID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:23所示的内控探针；
所述用于检测内参基因的引物和探针包括由SEQ ID NO:20所示的内参基因上游引物、由SEQ ID NO:21所示的内参基因下游引物、由SEQ ID NO:22所示的内参基因探针；
所述探针的两端标记有荧光基团。
8.根据权利要求7所述的引物和探针，其特征在于，SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ IDNO:22所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的5’端标记有Hex、3’端标记有TAMRA。
9.一种如权利要求1～6任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
(1)扩增试剂准备：
配制PCR反应液体系：将Ras基因反应液1、Ras基因反应液3、Ras基因反应液5分别与Ras基因MIX 3反应液混合，得到相应的PCR反应液预混液；
(2)加样：
分别取阴性对照、待检样本DNA液、阳性对照，依次加至分别装有相应的所述PCR反应液预混液的离心管中
(3)PCR扩增：
(4)检测，处理和分析数据。
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