CN104372103A - 一种nras基因突变检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于生物技术以及医学领域，涉及一种NRAS基因突变检测试剂盒及检测方法。本发明的检测试剂盒包括第1-7号试剂，分别包括正向引物、反向引物和探针。本发明的优点在于：采用荧光定量PCR方法对NRAS基因突变区域序列进行特异性扩增检测，在6个单管中一次检测17个突变位点，在保证高灵敏度和特异性的同时兼顾更多的突变位点。本发明实施例提供的检测试剂盒灵敏度高，特异性好，是一种性能优良的人类NRAS基因突变检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于生物技术以及医学领域，尤其涉及一种人类NRAS基因突变检测试剂盒。
背景技术
NRAS基因定位于染色体1p31，是具有GTP酶活性的RAS家族成员之一，是细胞生长、增殖和分化中的关键调节因子。正常的RAS蛋白定位于细胞内膜，对GTP和GDP具有高度亲和力，并具有GTP酶的活性。通常情况下，细胞内的RAS蛋白与GDP结合处于非活化状态，在受到上游途径效应因子刺激时，RAS蛋白发生构型变化转变为能与GTP结合的构型而成为活化状态，活化的RAS蛋白与下游效应分子相互作用，实现细胞生长信号传导，而这种作用发生后，RAS蛋白凭借GTP酶活性将GTP水解为GDP，并且使活化的RAS蛋白去活化，转变为非活性状态的RAS蛋白。RAS蛋白通过与GDP和GTP结合并水解GTP完成其对正常细胞生长信号传递和调节功能。RAS基因突变使得其丧失了GTP酶活性，阻止了GTP与RAS蛋白的解离，使得结合有GTP的RAS蛋白一直保持活性状态，导致持续激活下游效应因子，从而引起正常细胞的增殖生长失控向癌细胞转化。自82年以来，已经在膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、胃癌以及造血系统肿瘤中检测出了RAS癌基因的异常。KRAS基因突变通常出现在胰腺癌、肺癌以及结直肠癌实体瘤细胞中，HRAS一般在膀胱癌肿瘤中较为常见，而NRAS常常出现在血液肿瘤和黑色素瘤细胞中。
表1：人类NRAS基因的17种突变
其中，Cosmic ID为突变数据库Cosmic中记录的突变类型编号。
前期大量研究证实转移性结直肠癌患者KRAS基因2号外显子上的突变不能从抗EGFR靶向治疗中获益，2011版《NCCN结直肠癌临床实践指南》。明确指出只有KRAS野生型患者才建议接受EGFR抑制剂(如西妥昔单抗和帕尼单抗)治疗。但近两年来有更多文献报道，KRAS基因2号外显子以外的RAS突变(例如NRAS突变和KRAS基因3号外显子突变)也是抗EGFR靶向治疗的不良预后因子。Douillard JY(2013)等人的一组结直肠癌前瞻性-回顾性研究表明，接受帕尼单抗联合FOLFOX4治疗的患者的其他RAS突变情况可以预测治疗疗效，没有RAS突变的转移性结直肠癌患者使用帕尼单抗联合FOLFOX4治疗可以改善患者总体生存率和无进展生存率。
黑色素瘤近年来已成为发病率增长最快的恶性肿瘤，年增长率约为3％-5％。在黑色素瘤中NRAS突变率一般为20-30％，其中Q61突变占到86％，G12、G13分别为7％和4.5％。最常见的突变依次为Q61K、Q61R、Q61L、G12D。在黑色素瘤中NRAS突变与BRAF抑制剂抵抗、黑色素瘤预后、黑色素瘤MEK靶向用药相关。Nazarian et al.(2010)从BRAF V600E阳性的黑色素瘤细胞系中分离出对vemurafenib抗性细胞系，发现其中一个亚组细胞的NRAS有Q61K突变，导致MAPK通路重新活化，将这个细胞系中NRAS基因敲除后，该细胞又会回复对vemurafenib的响应。由此可以看出NRAS突变是BRAF抑制剂治疗后获得性抵抗的原因之一。Jakob(2012)回顾性研究了677例临床IV期病人的肿瘤基因突变与预后情况，结果显示677例病人中47％具有BRAF突变，20％具有NRAS突变，32％为BRAF和NRAS野生型。肿瘤突变类型与IV期病人脑转移风险显著相关(P＝0.008)，BRAF突变(24％)和NRAS突变(23％)的患者比野生型患者更易发生脑转移。在313例非眼色素层黑色素瘤IV期患者诊断后6个月内进行突变分析，NRAS突变患者中位生存期为8.2个月，明显短于野生型患者(15.1个月，p＝0.004)。对临床数据进行多因素风险分析，结果显示NRAS突变是一个总体生存率的独立不良预后因子(HR 2.05，vs WT，p＝0.005)。MEK162(ARRY 438162)是一种针对MEK1/2蛋白的MEK抑制剂新药。前临床实验中证实，7个NRAS突变的培养细胞对MEK162敏感，一个II期临床实验中，给71个NRAS或BRAF突变的黑色素瘤晚期患者使用MEK162，疾病控制率分别为63％和53％，这是第一个证明对RAS突变有效的靶向药物。因此，对人类NRAS基因突变情况进行检测能指导医生对黑色素瘤等癌症患者进行治疗和预后。
目前针对基因突变的检测方法很多，如直接测序法、焦磷酸测序法、高分辨率溶解曲线检测法(High Resolution Melting Analysis，HRM)、荧光定量PCR法等。其中最常见方法为测序法，该方法费用较低，但操作耗时长且灵敏度低；高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，在临床推广存在一定的困难；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方法用于NRAS基因突变检测的较少，同时检测突变位点个数也比较有限。因此，需要建立一种快速有效、能一次检测多个突变位点的NRAS基因突变检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种NRAS基因突变检测试剂盒及其检测方法。
在本发明的一个方面，提供了一种用于检测受试者中NRAS基因突变的试剂盒，包括分开设置的第1-7号试剂，其中：a.该第1号试剂包含：序列为SEQ ID NO:1的反向引物、序列为SEQ ID NO:2的正向引物、序列为SEQ ID NO:3的正向引物、序列为SEQ ID NO:4的正向引物、序列为SEQ IDNO:5的正向引物、序列为SEQ ID NO:6的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:7的探针；b.该第2号试剂包含：序列为SEQ ID NO:1的反向引物、序列为SEQ ID NO:8的正向引物、序列为SEQ ID NO:9的正向引物、序列为SEQID NO:10的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:7的探针；c.该第3号试剂包含：序列为SEQ ID NO:11的反向引物、序列为SEQ ID NO:12的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:13的探针；d.该第4号试剂包含：序列为SEQ ID NO:11的反向引物、序列为SEQ ID NO:14的正向引物、序列为SEQID NO:15的正向引物、序列为SEQ ID NO:16的正向引物和核酸序列为SEQID NO:13的探针；e.该第5号试剂包含：序列为SEQ ID NO:17的反向引物、序列为SEQ ID NO:18的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:19的探针；f.该第6号试剂包含：序列为SEQ ID NO:20的反向引物、序列为SEQ ID NO:21的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:22的探针；g.该第7号试剂包含：序列为SEQ ID NO:23的正向引物、序列为SEQ ID NO:11的反向引物和核酸序列为SEQ ID NO:13的探针；并且，所述的核酸序列分别为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:22的探针在核酸的5’端连接有荧光报告基团，在核酸的3’端连接有荧光淬灭基团；优选地，所述的受试者是人类癌症患者；进一步优选地，所述的受试者是人类癌症患者中的黑色素瘤和血液肿瘤患者。
在本发明的一个优选的方面：在第1号试剂中，序列为SEQ ID NO:1的反向引物、序列为SEQ ID NO:2的正向引物、序列为SEQ ID NO:3的正向引物、序列为SEQ ID NO:4的正向引物、序列为SEQ ID NO:5的正向引物、序列为SEQ ID NO:6的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:7的探针的物质的量比为0.2μM-1.2μM：0.067μM-0.4μM：0.067μM-0.4μM：0.13μM-0.8μM：0.033μM-0.2μM：0.1μM-0.6μM：0.1μM-0.5μM；在第2号试剂中，序列为SEQ ID NO:1的反向引物、序列为SEQ ID NO:8的正向引物、序列为SEQ ID NO:9的正向引物、序列为SEQ ID NO:10的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:7的探针的物质的量比为0.2μM-1.2μM：0.067μM-0.4μM：0.033μM-0.2μM：0.2μM-1.2μM：0.1μM-0.5μM；在第3号试剂中，序列为SEQ ID NO:11的反向引物、序列为SEQ ID NO:12的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:13的探针的物质的量比为0.2μM-1μM：0.2μM-1μM：0.1μM-0.5μM；在第4号试剂中，序列为SEQ ID NO:11的反向引物、序列为SEQ ID NO:14的正向引物、序列为SEQ ID NO:15的正向引物、序列为SEQ ID NO:16的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:13的探针的物质的量比为0.1μM-0.6μM：0.05μM-0.3μM：0.05μM-0.3μM：0.1μM-0.6μM：0.1μM-0.5μM；在第5号试剂中，序列为SEQ ID NO:17的反向引物、序列为SEQ ID NO:18的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:19的探针的物质的量比为0.2μM-1μM：0.2μM-1μM：0.1μM-0.5μM；在第6号试剂中，序列为SEQ ID NO:20的反向引物、序列为SEQ ID NO:21的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:22的探针的物质的量比为0.2μM-1μM：0.2μM-1μM：0.1μM-0.5μM；在第7号试剂中，序列为SEQ ID NO:23的正向引物、序列为SEQ ID NO:11的反向引物和核酸序列为SEQ ID NO:13的探针的物质的量比为0.2μM-1μM：0.2μM-1μM：0.1μM-0.5μM。
在本发明优选的方面，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、ROX、CY3和CY5，或者为波长范围相似的其它荧光报告基团；所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2和NFQ；并且荧光报告基团与荧光报告基团的搭配需根据荧光能量共振转移原理来选择；优选地，所述探针中，核酸的3’端采用了MGB-NFQ修饰。
在本发明优选的方面，所述第1-7号试剂中还包含PCR缓冲液、ROX参比染料、Taq酶的一种或多种；优选地，所述的PCR缓冲液组成为Tris-HCl、(NH)2SO4、MgCl2、Tween 20、dNTPs；进一步优选地，所述的Tris-HCl、(NH)2SO4、MgCl2、Tween 20和dNTPs的量分别为50-100mM、5-30mM、1-8mM、5％-15％、和100-200μM。
在本发明一个优选的方面，所述PCR缓冲液包含PCR添加剂；优选地，所述的PCR添加剂为DMSO、甜菜碱、BSA、甲酰胺或甘油。
在本发明优选的方面，所述的试剂盒还包括第8号试剂，并且所述的第8号试剂是Taq酶。
在本发明优选的方面，所述的试剂盒还包括第9号试剂，并且所述的第9号试剂是空白对照；优选地，所述的空白对照是pH为8.0的10mM Tris-HCl。
在本发明优选的方面，所述的试剂盒还包括第10号试剂，并且所述的第10号试剂是弱阳性对照；优选地，所述的弱阳性对照是含有NRAS基因6种突变类型质粒和内标质粒的混合液。
在本发明优选的方面，所述第1-7号试剂中包含的dATP、dUTP、dCTP和dGTP构成的dNTPs混合液和UNG酶，形成抗污染系统；优选地，所述的dATP、dUTP、dCTP和dGTP的物质的量比例为0.1mM-0.5mM：0.2mM-1mM：0.1mM-0.5mM：0.1mM-0.5mM。。
在本发明优选的方面，所述第1-6号试剂中包含根据特定基因序列设计的内标引物探针，形成内标系统；优选地，所述内标系统优选的内标引物探针的核酸序列分别为SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26，其中SEQ ID NO:26为5’端连接有荧光报告基团、3’端连接有荧光淬灭基团的探针；更优选地，核酸序列为SEQ ID NO:26的内标探针荧光报告基团为VIC，荧光淬灭基团为TAMRA。
在本发明优选的方面，所述的试剂盒还包酶混合液、空白对照、弱阳性质控、强阳性质控、点样用指示剂和样品稀释液等试剂盒辅助成分中的一种或多种。
在本发明优选的方面，所述试剂盒还包括可用于核酸提取的第11号、第12号、第13号和第14号试剂，并且所述的第11-14号试剂包括蛋白酶K、裂解液、洗涤液和洗脱液。
本发明还提供了以下的技术方案：
一种NRAS基因突变检测试剂盒，包括分开设置的第1-7号试剂：其中第1号试剂包含引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、，探针SEQ ID NO:7；第2号试剂包含引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，探针SEQ ID NO:7；第3号试剂包含引物SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，探针SEQ ID NO:13；第4号试剂包含引物SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16，探针SEQ ID NO:13；第5号试剂包含引物SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18，探针SEQ ID NO:19；第6号试剂包含引物SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21，探针SEQ ID NO:22；第7号试剂包含引物SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:11，探针SEQ ID NO:13。其中探针SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:22的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。
本发明的另一目的在于提供一种NRAS基因突变的检测方法，该检测方法利用本发明的检测试剂盒进行，该检测方法包括以下步骤：
(1)获得待测样品基因组DNA；
(2)取本发明的检测试剂盒，将上述获得的基因组DNA先后取相同的量加入所述第1-7号试剂中并同时进行PCR反应，根据第1-6号试剂和第7号试剂Ct值的差值△Ct判断是否具有相应的基因突变。
本发明的优点在于：
(1)采用荧光定量PCR方法对NRAS基因突变区域序列进行特异性扩增检测，在6个单管中一次检测17个突变位点，在保证高灵敏度和特异性的同时兼顾更多的突变位点。
(2)本发明实施例提供的检测方法简单有效，操作简单快速，结果判读简单客观，是一种有效检测人类NRAS基因突变的方法；本发明实施例提供的检测试剂盒灵敏度高，特异性好，是一种性能优良的人类NRAS基因突变检测试剂盒。
附图简要说明
图1是本发明实施例提供的检测试剂盒的一个阴性检测结果图；
图2是本发明实施例提供的检测试剂盒的一个阳性检测结果图；
图3是本发明实施例提供的检测试剂盒的另一个阴性检测结果图；
图4是本发明实施例提供的检测试剂盒的另一个阳性检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种针对人类NRAS基因突变的检测试剂盒，包括分开设置的第1-7号试剂，第1-7号试剂依次用于检测NRAS基因G12C/G12S/G12D/G12A/G12V、G13R/G13D/G13V、A59D、Q61K/Q61L/Q61R/Q61H(CAA>CAT)/Q61H(CAA>CAC)、K117N(AAG>AAC)/K117N(AAG>AAT)、A146T等17种突变型和NRAS野生型：其中第1号试剂包含引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、，探针SEQ ID NO:7；第2号试剂包含引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，探针SEQ ID NO:7；第3号试剂包含引物SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，探针SEQ ID NO:13；第4号试剂包含引物SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16，探针SEQ ID NO:13；第5号试剂包含引物SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18，探针SEQ ID NO:19；第6号试剂包含引物SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21，探针SEQ ID NO:22；第7号试剂包含引物SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:11，探针SEQ ID NO:13。其中探针SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:22的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。
具体地，上述第1-7号试剂可与其他组分构成PCR反应体系，也可自身包含有PCR反应所必需的组分以进行荧光定量PCR检测。在第1-7号试剂各自单独作为PCR反应体系时，该第1-7号试剂除了各自包含其对应的引物探针SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:23之外，还包含PCR缓冲液、ROX参比染料、Taq酶，并可通过加水补充体积。如第1-7号试剂作为一个整体形成一个试剂盒时，第1-7号试剂除了各自包含其对应的引物探针之外，还包含PCR缓冲液、ROX参比染料、Taq酶，并可通过加水补充体积。
具体地，上述第1-7号试剂作为一个整体与其它试剂组合形成一个试剂盒时，第1-7号试剂可只含各自对应的引物探针、PCR缓冲液、ROX参比染料，第1-7号试剂中的Taq酶组分可分出来形成第8号试剂，以提高试剂盒稳定性。
具体地，上述试剂盒还可添加第9-10号试剂作为辅助试剂：其中第9号试剂为空白对照，组成为10mM Tris-HCl(PH 8.0)；其中第10号试剂为弱阳性对照，组成为含有NRAS基因6种突变类型质粒和内标质粒的混合液，用于试剂的质量控制。
具体地，上述第1-7号试剂还包含抗污染系统，即由一定比例的dATP、dUTP、dCTP和dGTP构成的dNTPs混合液和UNG酶，结合UNG酶形成抗污染系统。
具体地，上述第1-7号试剂还包含内标系统，即在第1-6号试剂每个单管中加入内标系统引物探针SEQ ID NO:24-SEQ ID NO:26，探针SEQ ID NO:26的荧光报告基团为VIC，荧光淬灭基团为TAMRA。
具体地，上述第1-7号试剂中的PCR缓冲液组成为Tris-HCl、(NH)2SO4、MgCl2、Tween 20、dNTPs，还包含有PCR添加剂BSA、Betaine、DMSO。
具体地，上述引物、探针及阻断核酸序列分别为：
反向引物SEQ ID NO:1 5’-CAGGTCAGCGGGCTACCACT-3’，
正向引物SEQ ID NO:2 5’-AAACTGGTGGTGGTTGGAGGAT-3’，
正向引物SEQ ID NO:3 5’-AAACTGGTGGTGGTTGGAGGAA-3’，
正向引物SEQ ID NO:4 5’-CTGGTGGTGGTTGGAGCACA-3’，
正向引物SEQ ID NO:5 5’-CTGGTGGTGGTTGGAGCTGC-3’，
正向引物SEQ ID NO:6 5’-CTGGTGGTGGTTGGAGCTGT-3’，
探针SEQ ID NO:7 5’-AAAGCGCACTGACAATCC-3’，
正向引物SEQ ID NO:8 5’-AAGTGGTGGTTGGAGCAGCTC-3’，
正向引物SEQ ID NO:9 5’-GGTGGTGGTTGGAGCAGGAGT-3’，
正向引物SEQ ID NO:10 5’-GTGGTGGTTGGAGCAGGAGA-3’，
反向引物SEQ ID NO:11 5’-CCTAGTACCTGTAGAGGTTAATATCCGC-3’，
正向引物SEQ ID NO:12 5’-CTGTTTGTTGGACATACTGGATACTGA-3’，
探针SEQ ID NO:13 5’-ACCAATACATGAGGACAGGC-3’，
正向引物SEQ ID NO:14 5’-TGGACATACTGGATACAGCTGGTCT-3’，
正向引物SEQ ID NO:15 5’-TGGACATACTGGATACAGCTGGACTT-3’，
正向引物SEQ ID NO:16 5’-GACATACTGGATACAGCTGGACGC-3’，
反向引物SEQ ID NO:17 5’-CAACTGATGCAAACTCTTGCACA-3’，
正向引物SEQ ID NO:18 5’-ACCTATGGTGCTAGTGGGAAACAGT-3’，
探针SEQ ID NO:19 5’-CAAGCCCACGAACTGG-3’，
反向引物SEQ ID NO:20 5’-TGAATATGGATCACATCTCTACCAGAGT-3’，
正向引物SEQ ID NO:21 5’-GGATTCCATTCATTGAAACCTGAA-3’，
探针SEQ ID NO:22 5’-CCAGACAGGTATGGTACAGCT-3’，
正向引物SEQ ID NO:23 5’-GATGGTGAAACCTGTTTGTTGGAC-3’，
正向引物SEQ ID NO:24 5’-GGCAGCCGAGCCACATC-3’，
反向引物SEQ ID NO:25 5’-CGGTCGCAGCCCAGG-3’，
探针SEQ ID NO:26 5’-CAGACACCATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’。
具体地，上述探针序列5’端连接的荧光基团可以为FAM或VIC荧光基团，此外还可选用其他合适的荧光基团，例如ROX，HEX。该探针序列3’端连接的淬灭基团NFQ可为本领域技术人员熟知的淬灭基团。探针5’端的荧光基团与3’端的淬灭基团相互靠近的时候，荧光报告基团不能发出荧光，但随着PCR扩增反应的进行，5’端的荧光基团随着探针的水解而脱落下来，从而能发出荧光，通过检测荧光信号的积累可以对未知模板进行定量分析。该探针的3’端连接有MGB(Minor Groove Binder)基团，MGB分子结合到DNA螺旋小沟，通过稳定MGB探针/模板联合体提高杂交的检验效果。该MGB基团可以将探针的Tm值提高10℃左右，因此对于同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，特异性更强。
本发明实施例提供的检测试剂盒特异性好，灵敏度高，检测周期短，实现了对于样品的准确、快速检测。
本发明实施例还提供一种针对NRAS基因突变的检测方法，该检测方法利用本发明实施例提供的检测试剂盒进行，该检测方法包括以下步骤：
(1)获得待测样品基因组DNA；
(2)将所述基因组DNA先后取相同的量加入所述第1-7号试剂中，然后按一定条件进行PCR反应，根据第1-6号试剂和第7号试剂Ct值的差值△Ct判断是否具有相应的基因突变。
具体地，例如，含有第7号试剂的PCR反应体系FAM通道对应的Ct值为质控值Ct0，而含有第1号试剂的PCR反应体系FAM通道对应的Ct值为Ct1，△Ct＝Ct1-Ct0。首先根据质控值Ct0作为上样量是否适当的标准：Ct0≤23则上样量偏大，建议稀释后重新检测；23≤Ct0≤30则上样量合适，检测结果有效；30<Ct0<34则上样量偏低，只有突变DNA含量较高的样本可以检测出突变类型；Ct≥34则上样量太低，需重新制备样本或增加使用量进行检测。在对上样量进行判定的同时可对NRAS基因突变的结果进行判定：△Ct值大于或等于8时，则样品无NRAS基因G12C/G12S/G12D/G12A/G12V突变或突变丰度低于本试剂盒突变检测下限，如图1和3所示；△Ct小于8，则样品存在NRAS基因突变，突变类型可能为G12C/G12S/G12D/G12A/G12V中的任一种，如图2和4所示。
具体地，本发明实施例提供的检测方法的检测下限为0.1％，即突变丰度高于0.1％的样品可以被检测到。
本发明实施例中，还可以通过上调△Ct值来检测突变丰度低于0.1％的样品。
具体地，上述含有第1-6试剂的PCR反应体系的反应体积可以为任何适用于荧光定量PCR反应的体积。本发明的优选实施例中上述含有第1-6号试剂的PCR反应体系的反应体积为25μl，可按照如下比例配制：
上述PCR缓冲液中含有dNTPs、镁离子等进行PCR反应所必需的组分。
具体地，上述含有第7号试剂的PCR反应体系的反应体积可以为任何适用于荧光定量PCR反应的体积。优选地，上述含有第7号试剂的PCR反应体系的反应体积为25μl，可按照如下比例配制：
上述PCR缓冲液中含有dNTPs、镁离子等进行PCR反应所必需的组分。
具体地，在进行NRAS基因突变检测时，上述第1-7号试剂在相同反应条件下进行。优选地，上述第1-7号试剂的PCR反应条件为：
37℃10min；
95℃5min；
95℃15s，60℃60s(收集信号)，40个循环；
在上述40个循环中，每个循环后收集FAM和VIC荧光信号，该过程由反应仪器自动完成。
本发明实施例中采用了荧光定量PCR方法，对NRAS基因17种突变类型进行特异性扩增检测，利用MGB修饰的Taqman探针，实现17种突变高灵敏度和特异性扩增，利用该结果与质控反应体系的检测结果的比较实现了在NRAS基因17种突变的检出。本发明建立的检测方法简单有效，检测特异性好、灵敏度高，操作简单快速，结果判读简单客观，是一种有效检测人类NRAS基因突变的方法。
以下通过具体实施例对本发明进行详细阐述。
实施例1
制备NRAS基因突变检测试剂盒，具体包括以下步骤：
1.合成引物及探针序列
合成引物探针序列SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:26；其中特异性探针序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:22，在5’端标记FAM荧光基团，3’端标记有淬灭基团NFQ-MGB修饰基团，另一特异性探针SEQ ID NO:26，在5’端标记VIC荧光基团，3’端标记有淬灭基团TAMRA。
将上述引物序列分别配制成100μM的母液储存，将上述探针序列分别配制成100μM的母液储存。
2.荧光定量PCR反应体系的制备
分别制备含有第1-6号试剂的突变检测反应体系和含有第7号试剂的质控检测反应体系，各组分如下表2所示：
表2第1-7号试剂的组分
上述PCR缓冲液含有dNTP、镁离子等PCR反应所必需的组分。
实施例2
用实施例1制备的NRAS基因突变检测试剂盒对待测样品进行检测。
本实施例中收集100例临床病理诊断为结直肠癌患者的石蜡包埋组织切片，并从中提取基因组DNA，用实施例1中得到的NRAS基因突变检测试剂盒检测待测样品中是否存在NRAS基因突变，同时采用传统测序的方法进行验证，具体操作步骤为：
1.样品基因组DNA的提取
使用DNA提取试剂盒(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit,Cat No.56404)提取上述肺癌患者的组织标本的基因组DNA。DNA提取方法参照说明书进行，操作步骤简述如下：将临床采集的石蜡包埋组织(≤25mg)放置在1.5ml的离心管中，加入1200μl的二甲苯，剧烈涡旋10s，12000rpm室温离心5min。弃上清，注意不要倒掉沉淀。加入1200μl无水乙醇，以除去残留的二甲苯，轻轻涡旋。12000rpm室温离心5min。弃上清，再次加入1200μl无水乙醇，轻轻涡旋。12000rpm室温离心5min。弃上清，打开离心管，在37℃孵育10-15min，直至乙醇完全蒸发。加入180μl buffer ATL。加入20μl蛋白酶K，彻底涡旋，56℃孵育2h左右，直到该组织完全溶解(在孵育过程中可以偶尔涡旋)，之后涡旋15s，加入200μl buffer AL，涡旋后加入200μl无水乙醇，混合后再次彻底涡旋震荡。将最后的混合物加入到离心柱上，8000rpm离心1min，弃废液。加入500μl buffer AW1，8000rpm离心1min，弃废液。加入500μl buffer AW2，12000rpm离心3min，弃废液后12000rpm离心1min，将离心柱放置在新的1.5ml离心管中，加入50-200μl buffer AE，室温放置1min,12000rpm离心1min。取2μl所得溶液测OD值以确定DNA浓度，然后将样品DNA稀释到10ng/μl，分别取5μl并加入至实施例1中制得的试剂盒中并进行下一步的PCR反应。
2.样本的荧光定量PCR检测
将步骤1中稀释后的DNA样品依次取5μl分别加入实施例1的试剂盒的第1-7号试剂中，使7种试剂总体积均为25μl，并放入荧光定量PCR仪，按如下所示设置PCR反应程序后进行扩增反应：
95℃5min；
95℃15s，60℃1min，40个循环；
每个循环后收集FAM和VIC荧光信号，并设置ROX荧光校正。
3.样本的检测结果分析
本发明利用设计特异性ARMS引物和MGB修饰的荧光探针，并通过收集FAM荧光信号检测发生突变DNA模板的扩增，通过质控检测反应体系的质控值Ct0判断样本是否有效，通过突变检测反应体系突变检测值Ct1与质控值Ct0的差值△Ct判断是否发生NRAS基因突变。
具体的结果判读标准如下：
Ct0<23则上样量偏大，建议稀释后重新检测；23≤Ct0≤30则上样量合适，检测结果有效；30<Ct0<34则上样量偏低，只有突变DNA含量较高的样本可以检测出突变类型；Ct≥34则上样量太低，需重新制备样本或增加使用量进行检测；
以突变检测值Ct1与质控值Ct0的差值△Ct作为NRAS基因突变的判断标准，△Ct值≥8则检测结果为阴性，即样品无NRAS基因G12C/G12S/G12D/G12A/G12V突变或突变丰度低于0.1％，如图1所示；△Ct值＜8则检测结果为阳性，即样品存在NRAS基因突变，突变类型可能为G12C/G12S/G12D/G12A/G12V中的任一种，如图2所示。第2-6号试剂判读参照第1号试剂，△Ct值界限分别为8、9、9、8和9。
本实施例中100例临床标本的检测结果如下：
NRAS基因野生型样本95例，其中87例样本突变检测无Ct值，如图1所示，8例样本突变检测值Ct1与质控值Ct0的差值△Ct≥8，其中一个检测结果如图3所示；
NRAS基因突变样本5例，突变检测值Ct1与质控值Ct0的差值△Ct＜8，其中一个检测结果如图4所示。
上述检测结果中有2例样本用本发明的检测方法检测为NRAS基因突变阳性，而测序结果为野生型，后再次重复测序结果表明为这2例样品分别发生NRAS基因Q61K/Q61L/Q61R/Q61H(CAA>CAT)/Q61H(CAA>CAC)突变和G13R/G13D/G13V突变，突变丰度较低。其余98例样本测序结果与荧光定量PCR检测结果一致。
以上结果表明本发明实施例提供的检测试剂盒用于人类NRAS基因17种突变检测结果可靠，与直接测序的符合率≥98％，且本发明检测方法灵敏度高于传统测序方法，操作简单快速，利于大规模推广。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种用于检测受试者中NRAS基因突变的试剂盒，包括分开设置的第1-7号试剂，其中：
a.该第1号试剂包含：序列为SEQ ID NO:1的反向引物、序列为SEQ IDNO:2的正向引物、序列为SEQ ID NO:3的正向引物、序列为SEQ ID NO:4的正向引物、序列为SEQ ID NO:5的正向引物、序列为SEQ ID NO:6的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:7的探针；
b.该第2号试剂包含：序列为SEQ ID NO:1的反向引物、序列为SEQ IDNO:8的正向引物、序列为SEQ ID NO:9的正向引物、序列为SEQ ID NO:10的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:7的探针；
c.该第3号试剂包含：序列为SEQ ID NO:11的反向引物、序列为SEQID NO:12的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:13的探针；
d.该第4号试剂包含：序列为SEQ ID NO:11的反向引物、序列为SEQID NO:14的正向引物、序列为SEQ ID NO:15的正向引物、序列为SEQ IDNO:16的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:13的探针；
e.该第5号试剂包含：序列为SEQ ID NO:17的反向引物、序列为SEQID NO:18的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:19的探针；
f.该第6号试剂包含：序列为SEQ ID NO:20的反向引物、序列为SEQID NO:21的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:22的探针；
g.该第7号试剂包含：序列为SEQ ID NO:23的正向引物、序列为SEQID NO:11的反向引物和核酸序列为SEQ ID NO:13的探针；
并且，所述的核酸序列分别为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:22的探针在核酸的5’端连接有荧光报告基团，在核酸的3’端连接有荧光淬灭基团；
优选地，所述的受试者是人类癌症患者；进一步优选地，所述的受试者是人类癌症患者中的黑色素瘤和血液肿瘤患者。
2.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
在第1号试剂中，序列为SEQ ID NO:1的反向引物、序列为SEQ ID NO:2的正向引物、序列为SEQ ID NO:3的正向引物、序列为SEQ ID NO:4的正向引物、序列为SEQ ID NO:5的正向引物、序列为SEQ ID NO:6的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:7的探针的物质的量比为：0.2μM-1.2μM：0.067μM-0.4μM：0.067μM-0.4μM：0.13μM-0.8μM：0.033μM-0.2μM：0.1μM-0.6μM：0.1μM-0.5μM；
在第2号试剂中，序列为SEQ ID NO:1的反向引物、序列为SEQ ID NO:8的正向引物、序列为SEQ ID NO:9的正向引物、序列为SEQ ID NO:10的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:7的探针的物质的量比为0.2μM-1.2μM：0.067μM-0.4μM：0.033μM-0.2μM：0.2μM-1.2μM：0.1μM-0.5μM；
在第3号试剂中，序列为SEQ ID NO:11的反向引物、序列为SEQ ID NO:12的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:13的探针的物质的量比为0.2μM-1μM：0.2μM-1μM：0.1μM-0.5μM；
在第4号试剂中，序列为SEQ ID NO:11的反向引物、序列为SEQ ID NO:14的正向引物、序列为SEQ ID NO:15的正向引物、序列为SEQ ID NO:16的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:13的探针的物质的量比为0.1μM-0.6μM：0.05μM-0.3μM：0.05μM-0.3μM：0.1μM-0.6μM：0.1μM-0.5μM；；
在第5号试剂中，序列为SEQ ID NO:17的反向引物、序列为SEQ ID NO:18的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:19的探针的物质的量比为0.2μM-1μM：0.2μM-1μM：0.1μM-0.5μM；
在第6号试剂中，序列为SEQ ID NO:20的反向引物、序列为SEQ ID NO:21的正向引物和核酸序列为SEQ ID NO:22的探针的物质的量比为0.2μM-1μM：0.2μM-1μM：0.1μM-0.5μM；
在第7号试剂中，序列为SEQ ID NO:23的正向引物、序列为SEQ ID NO:11的反向引物和核酸序列为SEQ ID NO:13的探针的物质的量比为0.2μM-1μM：0.2μM-1μM：0.1μM-0.5μM。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、ROX、CY3和CY5，或者为波长范围相似的其它荧光报告基团；所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2和NFQ；并且荧光报告基团与荧光报告基团的搭配需根据荧光能量共振转移原理来选择；
优选地，所述探针中，核酸的3’端采用了MGB-NFQ修饰。
4.权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述第1-7号试剂中还包含PCR缓冲液、ROX参比染料、Taq酶的一种或多种；
优选地，所述的PCR缓冲液组成为Tris-HCl、(NH)2SO4、MgCl2、Tween 20和dNTPs。
进一步优选地，所述的Tris-HCl、(NH)2SO4、MgCl2、Tween 20和dNTPs的浓度分别为50-100mM、5-30mM、1-8mM、5％-15％、和100-200μM。
5.权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括第8号试剂，并且所述的第8号试剂是Taq酶。
6.权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括第9号试剂，并且所述的第9号试剂是空白对照；
优选地，所述的空白对照是pH为8.0的10mM Tris-HCl。
7.权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括第10号试剂，并且所述的第10号试剂是弱阳性对照；
优选地，所述的弱阳性对照是含有NRAS基因6种突变类型质粒和内标质粒的混合液。
8.权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述第1-7号试剂中包含的dATP、dUTP、dCTP和dGTP构成的dNTPs混合液和UNG酶，形成抗污染系统；
优选地，所述的dATP、dUTP、dCTP和dGTP的物质的量比例为0.1mM-0.5mM：0.2mM-1mM：0.1mM-0.5mM：0.1mM-0.5mM。
9.如权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述第1-6号试剂中包含根据特定基因序列设计的内标引物探针，形成内标系统；
优选地，所述内标系统优选的内标引物探针的核酸序列分别为SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26，其中SEQ ID NO:26为5’端连接有荧光报告基团、3’端连接有荧光淬灭基团的探针；
更优选地，核酸序列为SEQ ID NO:26的内标探针荧光报告基团为VIC，荧光淬灭基团为TAMRA。
10.如权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包酶混合液、空白对照、弱阳性质控、强阳性质控、点样用指示剂和样品稀释液等试剂盒辅助成分中的一种或多种。
11.如权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括可用于核酸提取的第11号、第12号、第13号和第14号试剂，并且所述的第11-14号试剂包括蛋白酶K、裂解液、洗涤液和洗脱液。
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|---|---|
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Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104745719A (zh) * | 2015-04-28 | 2015-07-01 | 上海允英医疗科技有限公司 | 用于ret融合基因检测的引物、探针及检测试剂盒 |
| CN104762410A (zh) * | 2015-04-29 | 2015-07-08 | 上海允英医疗科技有限公司 | 用于全ras突变检测的引物、探针及检测试剂盒 |
| CN104774954A (zh) * | 2015-04-23 | 2015-07-15 | 上海允英医疗科技有限公司 | 用于hras突变检测的引物、探针及检测试剂盒 |
| CN105779587A (zh) * | 2016-01-13 | 2016-07-20 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 用于检测人类nras基因7种突变的探针、引物及试剂盒 |
| CN106399514A (zh) * | 2016-09-28 | 2017-02-15 | 广州凯普医药科技有限公司 | Nras基因突变检测试剂盒 |
| CN107630076A (zh) * | 2016-07-18 | 2018-01-26 | 丰技生物科技股份有限公司 | Nras基因的突变位点的检测方法 |
| CN107893107A (zh) * | 2017-11-30 | 2018-04-10 | 深圳美因医学检验实验室 | 一种用于黑色素瘤基因筛查的荧光定量pcr检测系统及其应用 |
| CN110551815A (zh) * | 2018-05-30 | 2019-12-10 | 苏州云泰生物医药科技有限公司 | 检测人Ras基因突变的试剂盒及其使用方法 |
| CN111500688A (zh) * | 2020-04-30 | 2020-08-07 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 用于同步检测nras基因的第2、3、4号外显子基因突变的方法 |
| CN112176062A (zh) * | 2020-10-13 | 2021-01-05 | 苏州中科先进技术研究院有限公司 | 检测nras基因突变的核酸组合物及其试剂盒 |
| CN114774539A (zh) * | 2022-03-03 | 2022-07-22 | 杭州联川生物技术股份有限公司 | 检测结直肠癌多基因变异的引物、探针、试剂盒及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102676648A (zh) * | 2011-03-07 | 2012-09-19 | 重庆医科大学附属儿童医院 | 白血病诊疗的基因芯片 |
| CN102994619A (zh) * | 2011-09-13 | 2013-03-27 | 广州益善生物技术有限公司 | 一种nras基因突变检测特异性引物和液相芯片 |
| CN103402517A (zh) * | 2010-11-19 | 2013-11-20 | 葛兰素史密斯克莱知识产权（第2号）有限公司 | 使用braf抑制剂的治疗方法 |
| CN103429238A (zh) * | 2011-01-12 | 2013-12-04 | 勃林格殷格翰国际有限公司 | 极光激酶/mek双重抑制剂的抗癌疗法 |
| US20140234836A1 (en) * | 2010-11-15 | 2014-08-21 | Exact Sciences Corporation | Mutation Detection Assay |
-
2014
- 2014-12-05 CN CN201410735327.3A patent/CN104372103B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140234836A1 (en) * | 2010-11-15 | 2014-08-21 | Exact Sciences Corporation | Mutation Detection Assay |
| CN103402517A (zh) * | 2010-11-19 | 2013-11-20 | 葛兰素史密斯克莱知识产权（第2号）有限公司 | 使用braf抑制剂的治疗方法 |
| CN103429238A (zh) * | 2011-01-12 | 2013-12-04 | 勃林格殷格翰国际有限公司 | 极光激酶/mek双重抑制剂的抗癌疗法 |
| CN102676648A (zh) * | 2011-03-07 | 2012-09-19 | 重庆医科大学附属儿童医院 | 白血病诊疗的基因芯片 |
| CN102994619A (zh) * | 2011-09-13 | 2013-03-27 | 广州益善生物技术有限公司 | 一种nras基因突变检测特异性引物和液相芯片 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MANICKAM JANAKIRAMAN ET AL: "Genomic and Biological Characterization of Exon 4 KRAS Mutations in Human Cancer", 《CANCER RES.》 * |
| 杨建刚等: "急性髓系白血病中Nras基因点突变的检测以及信号传导通路蛋白的表达", 《现代医学》 * |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104774954A (zh) * | 2015-04-23 | 2015-07-15 | 上海允英医疗科技有限公司 | 用于hras突变检测的引物、探针及检测试剂盒 |
| CN104745719A (zh) * | 2015-04-28 | 2015-07-01 | 上海允英医疗科技有限公司 | 用于ret融合基因检测的引物、探针及检测试剂盒 |
| CN104762410A (zh) * | 2015-04-29 | 2015-07-08 | 上海允英医疗科技有限公司 | 用于全ras突变检测的引物、探针及检测试剂盒 |
| CN105779587B (zh) * | 2016-01-13 | 2020-08-25 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 用于检测人类nras基因7种突变的探针、引物及试剂盒 |
| CN105779587A (zh) * | 2016-01-13 | 2016-07-20 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 用于检测人类nras基因7种突变的探针、引物及试剂盒 |
| CN107630076A (zh) * | 2016-07-18 | 2018-01-26 | 丰技生物科技股份有限公司 | Nras基因的突变位点的检测方法 |
| CN106399514A (zh) * | 2016-09-28 | 2017-02-15 | 广州凯普医药科技有限公司 | Nras基因突变检测试剂盒 |
| CN107893107A (zh) * | 2017-11-30 | 2018-04-10 | 深圳美因医学检验实验室 | 一种用于黑色素瘤基因筛查的荧光定量pcr检测系统及其应用 |
| CN110551815A (zh) * | 2018-05-30 | 2019-12-10 | 苏州云泰生物医药科技有限公司 | 检测人Ras基因突变的试剂盒及其使用方法 |
| CN111500688A (zh) * | 2020-04-30 | 2020-08-07 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 用于同步检测nras基因的第2、3、4号外显子基因突变的方法 |
| CN112176062A (zh) * | 2020-10-13 | 2021-01-05 | 苏州中科先进技术研究院有限公司 | 检测nras基因突变的核酸组合物及其试剂盒 |
| CN114774539A (zh) * | 2022-03-03 | 2022-07-22 | 杭州联川生物技术股份有限公司 | 检测结直肠癌多基因变异的引物、探针、试剂盒及其应用 |
| CN114774539B (zh) * | 2022-03-03 | 2024-01-12 | 杭州联川生物技术股份有限公司 | 检测结直肠癌多基因变异的引物、探针、试剂盒及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104372103B (zh) | 2017-05-24 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 430075, C2-1 building, Optics Valley biological city, 666 hi tech Avenue, East Lake hi tech Development Zone, Wuhan, Hubei, Wuhan Applicant after: WUHAN YOUZHIYOU MEDICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Address before: 430075, C2-1 building, Optics Valley biological city, 666 hi tech Avenue, East Lake hi tech Development Zone, Wuhan, Hubei, Wuhan Applicant before: Wuhan YZY Biopharma Co., Ltd. |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP02 | Change in the address of a patent holder |
Address after: 430075 East Lake hi tech Development Zone, Wuhan, 388, No. two, No., Wuhan Optics Valley international bio pharmaceutical enterprise accelerator, 1-2, 23, 1, 4, 5 Patentee after: WUHAN YOUZHIYOU MEDICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Address before: 430075, C2-1 building, Optics Valley biological city, 666 hi tech Avenue, East Lake hi tech Development Zone, Wuhan, Hubei, Wuhan Patentee before: WUHAN YOUZHIYOU MEDICAL TECHNOLOGY CO., LTD. |