CN112176062A - 检测nras基因突变的核酸组合物及其试剂盒 - Google Patents
检测nras基因突变的核酸组合物及其试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112176062A CN112176062A CN202011088625.XA CN202011088625A CN112176062A CN 112176062 A CN112176062 A CN 112176062A CN 202011088625 A CN202011088625 A CN 202011088625A CN 112176062 A CN112176062 A CN 112176062A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- sequence shown
- mutation
- detecting
- nras gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101150073096 NRAS gene Proteins 0.000 title claims abstract description 194
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 104
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 title claims abstract description 90
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 87
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 87
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 87
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 136
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 149
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 149
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 148
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 110
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 65
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims description 62
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 38
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 25
- 102200006531 rs121913529 Human genes 0.000 claims description 13
- 102200006537 rs121913529 Human genes 0.000 claims description 13
- 102200006539 rs121913529 Human genes 0.000 claims description 13
- 102220117341 rs11554290 Human genes 0.000 claims description 11
- 102200006538 rs121913530 Human genes 0.000 claims description 10
- 102200006540 rs121913530 Human genes 0.000 claims description 10
- 102200006541 rs121913530 Human genes 0.000 claims description 10
- 102200007373 rs17851045 Human genes 0.000 claims description 10
- 102200006532 rs112445441 Human genes 0.000 claims description 9
- 102220197780 rs121434596 Human genes 0.000 claims description 9
- 102200006520 rs121913240 Human genes 0.000 claims description 9
- 102200006525 rs121913240 Human genes 0.000 claims description 9
- 102200006533 rs121913535 Human genes 0.000 claims description 9
- 102200006648 rs28933406 Human genes 0.000 claims description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 7
- 102200006657 rs104894228 Human genes 0.000 claims description 7
- 102220014333 rs112445441 Human genes 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 99
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 50
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 50
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 50
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 47
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 26
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 14
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 8
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 7
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 7
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 6
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000744505 Homo sapiens GTPase NRas Proteins 0.000 description 5
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 4
- 102100039788 GTPase NRas Human genes 0.000 description 4
- 101100467579 Homo sapiens NRAS gene Proteins 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 3
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 102220002639 rs80338842 Human genes 0.000 description 2
- 206010052358 Colorectal cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000005411 L01XE02 - Gefitinib Substances 0.000 description 1
- 239000005551 L01XE03 - Erlotinib Substances 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229960001433 erlotinib Drugs 0.000 description 1
- AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N erlotinib Chemical compound C=12C=C(OCCOC)C(OCCOC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=CC(C#C)=C1 AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 229960002584 gefitinib Drugs 0.000 description 1
- XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N gefitinib Chemical compound C=12C=C(OCCCN3CCOCC3)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000047526 human NRAS Human genes 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种检测NRAS基因突变的核酸组合物及其试剂盒。该核酸组合物包括:序列如SEQ ID No.1所示的第一正向引物;序列如SEQ ID No.2所示的第二正向引物;序列如SEQ ID No.3所示的第三正向引物;序列如SEQ ID No.4所示的第一反向引物;序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物;序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针;及序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针。上述核酸组合物对NRAS基因突变的特异性较高,检测灵敏度较高。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域,特别是涉及一种检测NRAS基因突变的核酸组合物及其试剂盒。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的消化道肿瘤之一,是当今世界发病率排名第三的恶性肿瘤,每年新发病人接近1000000例,在恶性肿瘤死亡率中高居第二。在中国,结直肠癌的发病率和死亡率都呈现逐年上升的趋势,已成为严重威胁我国国民健康和生命的一种疾病。提高结直肠癌的预防、诊断和治疗水平,对维护国民健康幸福,降低国家疾病负担具有重要意义。
2004年,FDA批准了西妥昔单抗用于晚期转移性结直肠癌治疗,然而进一步研究发现,NRAS基因的突变使结直肠癌患者对西妥昔单抗的治疗产生耐药性。此外NRAS基因突变状态与非小细胞肺癌对吉非替尼、厄罗替尼等靶向治疗药物的原发性耐药有关,也是肺癌患者生存的预后指标之一。
目前,NRAS基因突变检测的主要方法有以下几种:1)Sanger测序法;直接测序法一直以来是基因突变检测的金标准,但是测序法存在很多缺点,比如耗时长,后续要对PCR产物进行处理,程序复杂,容易出现污染导致结果不准确。另外,测序法的灵敏度低,特别是在混合模板时检出率低,一般需要突变丰度达到20%以上才能准确检测。2)高分辨率熔解曲线(high-resolution melting,HRM)是通过饱和燃料结合于PCR扩增产物监控其形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术,其敏感性在5%左右。3)扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)是根据引物3’端末位碱基必须与其模板DNA链互补才能进行有效的扩增。基于此,设计针对基因突变位点的引物序列,可以检测突变基因,该检测方法的灵敏度在1%左右。这些方法的检测灵敏度较低,不能满足实际需求。
发明内容
基于此,有必提供一种灵敏度较高的检测NRAS基因突变的核酸组合物。
此外,还有必要提供一种检测NRAS基因突变的试剂盒。
一种检测NRAS基因突变的核酸组合物,包括:
序列如SEQ ID No.1所示的第一正向引物,所述第一正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12A突变;
序列如SEQ ID No.2所示的第二正向引物,所述第二正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12D突变;
序列如SEQ ID No.3所示的第三正向引物,所述第三正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12V突变;
序列如SEQ ID No.4所示的第一反向引物,所述第一反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61H突变;
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;
序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物;
序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针;及
序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针;
其中,所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团,所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团,所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
上述核酸组合物中,第一正向引物对NRAS基因的12号密码子的G12A突变具有较高的特异性,第二正向引物对NRAS基因的12号密码子的G12D突变具有较高的特异性,第三正向引物对NRAS基因的12号密码子的G12V突变具有较高的特异性,第一反向引物对NRAS基因的61号密码子的Q61H突变具有较高的特异性,能够分别检测NRAS基因的12号密码子的G12A突变、12号密码子的G12D突变、12号密码子的G12V突变、61号密码子的Q61H突变,检测灵敏度较高。经试验验证,上述核酸组合物能够检测0.1%的NRAS基因的的12号密码子的G12A突变、12号密码子的G12D突变、12号密码子的G12V突变、61号密码子的Q61H突变中的一种,灵敏度较高。
一种检测NRAS基因突变的核酸组合物,包括:
序列如SEQ ID No.9所示的第四正向引物,所述第四正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12R突变;
序列如SEQ ID No.10所示的第五正向引物,所述第五正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12C突变;
序列如SEQ ID No.11所示的第六正向引物,所述第六正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12S突变;
序列如SEQ ID No.12所示的第二反向引物,所述第二反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61P突变;
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;
序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物;
序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针;及
序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针;
其中,所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团,所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团,所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
一种检测NRAS基因突变的核酸组合物,包括:
序列如SEQ ID No.13所示的第七正向引物,所述第七正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13A突变;
序列如SEQ ID No.14所示的第三反向引物,所述第三反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61R突变;
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;
序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物;
序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针;及
序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针;
其中,所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团,所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团,所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
一种检测NRAS基因突变的核酸组合物,包括:
序列如SEQ ID No.15所示的第八正向引物,所述第八正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13D突变;
序列如SEQ ID No.16所示的第四反向引物,所述第四反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61K突变;
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;
序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物;
序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针;及
序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针;
其中,所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团,所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团,所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
一种检测NRAS基因突变的核酸组合物,包括:
序列如SEQ ID No.17所示的第九正向引物,所述第九正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13V突变;
序列如SEQ ID No.18所示的第五反向引物,所述第五反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61L突变;
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;
序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物;
序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针;及
序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针;
其中,所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团,所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团,所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
一种检测NRAS基因突变的核酸组合物,包括:
序列如SEQ ID No.19所示的第十正向引物,所述第十正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13C突变;
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;
序列如SEQ ID No.20所示的第三通用探针。
一种检测NRAS基因突变的核酸组合物,包括:
序列如SEQ ID No.21所示的第十一正向引物,所述第十一正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13R突变;
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;
序列如SEQ ID No.20所示的第三通用探针。
一种检测NRAS基因突变的试剂盒,包括上述检测NRAS基因突变的核酸组合物。
其中一个实施例中,还包括:用于检测内控基因的内控引物对和内控探针;
进一步地,所述内控基因为RPPH基因,所述内控引物对的序列如SEQ ID No.22及SEQ ID No.23所示,所述内控探针的序列如SEQ ID No.24。
其中一个实施例中,还包括:还包括质控引物对和质控探针;
进一步地,所述质控引物对的序列如SEQ ID No.25及SEQ ID No.5所示,所述质控探针的序列如SEQ ID No.7所示。
其中一个实施例中,还包括核酸提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶混合液中的至少一种。
附图说明
图1为Tube1管中G12A、G12D、G12V和Q61P突变位点检测能力测试图;
图2为Tube2管中G12R、G12S、G12C和Q61P突变位点检测能力测试图;
图3为Tube3管中G13A和Q61R突变位点检测能力测试图;
图4为Tube4管中G13D和Q61K突变位点检测能力测试图;
图5为Tube5管中G3V和Q61L突变位点检测能力测试图;
图6为Tube6管中G3C突变位点检测能力测试图;
图7为Tube7管中G13R突变位点检测能力测试图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进,因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本研究第一实施方式提供一种检测NRAS基因突变的核酸组合物,能够检测NRAS基因突变,检测灵敏度较高。具体地,该检测NRAS基因突变的核酸组合物,包括:序列如SEQ IDNo.1所示的第一正向引物,第一正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12A突变;序列如SEQ ID No.2所示的第二正向引物,第二正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12D突变;序列如SEQ ID No.3所示的第三正向引物,第三正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12V突变;序列如SEQ ID No.4所示的第一反向引物,第一反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61H突变;序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物;序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针;及序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针;其中,第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团,第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团,第一荧光报告基团与第二荧光报告基团不同。
上述核酸组合物中,第一正向引物对NRAS基因的12号密码子的G12A突变具有较高的特异性,第二正向引物对NRAS基因的12号密码子的G12D突变具有较高的特异性,第三正向引物对NRAS基因的12号密码子的G12V突变具有较高的特异性,第一反向引物对NRAS基因的61号密码子的Q61H突变具有较高的特异性,能够分别检测NRAS基因的12号密码子的G12A突变、12号密码子的G12D突变、12号密码子的G12V突变、61号密码子的Q61H突变,检测灵敏度较高。经试验验证,上述核酸组合物能够检测0.1%的NRAS基因的的12号密码子的G12A突变、12号密码子的G12D突变、12号密码子的G12V突变、61号密码子的Q61H突变中的一种,灵敏度较高。
具体地,SEQ ID No.1所示的序列为:AAACTGGTGGTGGTTGGAGC。如SEQ ID No.2所示的序列为:TGGTGGTGGTTGGAACA。如SEQ ID No.3所示的序列为:CTGGTGGTGGTTGGAGAA。如SEQID No.4所示的序列为:TCATGGCACTGTACTCTT。如SEQ ID No.5所示的序列为:TATGGTGGGATCATATTCAT。如SEQ ID No.6所示的序列为:ACAAGTGGTTATAGATGGTGAA。如SEQID No.7所示的序列为:GACGGTTGGAGCAGGTGGTGTTGGGTC。如SEQ ID No.8所示的序列为:CAACTGTACTCTTCTTGTCCAGCTGTATTTG。
第一荧光报告基因及第二荧光报告基团均选自TXR、HEX及FAM中的一种。第一荧光淬灭基团及第二荧光淬灭基团均选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,第一荧光报告基因为FAM。第一荧光淬灭基团为BHQ1。第二荧光报告基因为TXR。第二荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是,第一荧光报告基团和第二荧光报告基因均不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,第一荧光淬灭基团和第二荧光淬灭基团均不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中,利用特异性ARMS引物扩增NRAS基因常见的突变型,同时荧光探针抑制野生型基因的扩增,起到了富集突变模板的作用,从而提高突变基因的检测灵敏度;另一方面对扩增产物进行熔解分析,荧光探针在未杂交时,荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭,不产生荧光;而处于杂交状态时,荧光基团与淬灭基团分开,产生荧光。样品中有突变基因,则会出现熔解峰;若没有突变基因,则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中,上述核酸组合物还包括:用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针,以便于对NRAS基因突变检测进行内控,有利于提高检测的准确性。
进一步地,内控基因为RPPH基因,即RNA 5’焦磷酸水解酶。内控引物对的序列如SEQ ID No.22及SEQ ID No.23所示。内控探针的序列如SEQ ID No.24。
具体地,如SEQ ID No.22所示的序列为:GCGGATGCCTCCTTT。如SEQ ID No.23所示的序列为:ACCTCACCTCAGACATTGAA。如SEQ ID No.24所示的序列为:AGCTTGGAACAGACTCACGGCCAGCT。其中,如SEQ ID No.22所示的序列为正向引物,如SEQ IDNo.23所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团,内控与第一荧光报告基团及第二荧光报告基团均不同。
进一步地,内控荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,内控荧光报告基因为HEX。内控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是,内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测NRAS基因突变的核酸组合物能够用于检测NRAS基因突变,检测用时短,完成一次检测用时只需1.5h;无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性;结果判读简单,准确。只需看熔解曲线的峰和TM值,即可判读阴阳性;灵敏度和特异性高,一般可以检测到0.1%的突变DNA;能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第二实施方式提供一种检测NRAS基因突变的核酸组合物,能够检测NRAS基因突变,检测灵敏度较高。具体地,该检测NRAS基因突变的核酸组合物,包括:序列如SEQ IDNo.9所示的第四正向引物,第四正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12R突变;序列如SEQ ID No.10所示的第五正向引物,第五正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12C突变;序列如SEQ ID No.11所示的第六正向引物,第六正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12S突变;序列如SEQ ID No.12所示的第二反向引物,第二反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61P突变;序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物;序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针;序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针;其中,第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团,第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团,第一荧光报告基团与第二荧光报告基团不同。
上述核酸组合物中,第四正向引物对NRAS基因的12号密码子的G12R突变具有较高的特异性,第五正向引物对NRAS基因的12号密码子的G12C突变具有较高的特异性,第六正向引物对NRAS基因的12号密码子的G12S突变具有较高的特异性,第二反向引物对NRAS基因的61号密码子的Q61P突变具有较高的特异性,能够分别检测NRAS基因的12号密码子的G12R突变、12号密码子的G12C突变、12号密码子的G12S突变、61号密码子的Q61P突变,检测灵敏度较高。经试验验证,上述核酸组合物能够检测0.1%的NRAS基因的12号密码子的G12R突变、12号密码子的G12C突变、12号密码子的G12S突变、61号密码子的Q61P突变中的一种,灵敏度较高。
具体地,SEQ ID No.9所示的序列为:CTGGTGGTGGTTGGAGAA。如SEQ ID No.10所示的序列为:ACTGGTGGTGGTTGGATC。如SEQ ID No.11所示的序列为:CTGGTGGTGGTTGGAGGA。如SEQ ID No.12所示的序列为:TCATGGCACTGTACTCTTG。如SEQ ID No.5所示的序列为:TATGGTGGGATCATATTCAT。如SEQ ID No.6所示的序列为:ACAAGTGGTTATAGATGGTGAA。如SEQID No.7所示的序列为:GACGGTTGGAGCAGGTGGTGTTGGGTC。如SEQ ID No.8所示的序列为:CAACTGTACTCTTCTTGTCCAGCTGTATTTG。
第一荧光报告基因及第二荧光报告基团均选自TXR、HEX及FAM中的一种。第一荧光淬灭基团及第二荧光淬灭基团均选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,第一荧光报告基因为FAM。第一荧光淬灭基团为BHQ1。第二荧光报告基因为TXR。第二荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是,第一荧光报告基团和第二荧光报告基因均不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,第一荧光淬灭基团和第二荧光淬灭基团均不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中,利用特异性ARMS引物扩增NRAS基因常见的突变型,同时荧光探针抑制野生型基因的扩增,起到了富集突变模板的作用,从而提高突变基因的检测灵敏度;另一方面对扩增产物进行熔解分析,荧光探针在未杂交时,荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭,不产生荧光;而处于杂交状态时,荧光基团与淬灭基团分开,产生荧光。样品中有突变基因,则会出现熔解峰;若没有突变基因,则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中,上述核酸组合物还包括:用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针,以便于对NRAS基因突变检测进行内控,有利于提高检测的准确性。
进一步地,内控基因为RPPH基因,即RNA 5’焦磷酸水解酶。内控引物对的序列如SEQ ID No.22及SEQ ID No.23所示。内控探针的序列如SEQ ID No.24。
具体地,如SEQ ID No.22所示的序列为:GCGGATGCCTCCTTT。如SEQ ID No.23所示的序列为:ACCTCACCTCAGACATTGAA。如SEQ ID No.24所示的序列为:AGCTTGGAACAGACTCACGGCCAGCT。其中,如SEQ ID No.22所示的序列为正向引物,如SEQ IDNo.23所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团,内控与第一荧光报告基团及第二荧光报告基团均不同。
进一步地,内控荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,内控荧光报告基因为HEX。内控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是,内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测NRAS基因突变的核酸组合物能够用于检测NRAS基因突变,检测用时短,完成一次检测用时只需1.5h;无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性性;结果判读简单,准确。只需看熔解曲线的峰和TM值,即可判读阴阳性;灵敏度和特异性高,一般可以检测到0.1%的突变DNA;能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第三实施方式提供一种检测NRAS基因突变的核酸组合物,能够检测NRAS基因突变,检测灵敏度较高。具体地,该检测NRAS基因突变的核酸组合物,包括:序列如SEQ IDNo.13所示的第七正向引物,第七正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13A突变;序列如SEQ ID No.14所示的第三反向引物,第三反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61R突变;序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物;序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针;序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针;其中,第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团,第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团,第一荧光报告基团与第二荧光报告基团不同。
上述核酸组合物中,第七正向引物对NRAS基因的13号密码子的G13A突变具有较高的特异性,第三反向引物对NRAS基因的61号密码子的Q61R突变具有较高的特异性,能够分别检测NRAS基因的13号密码子的G13A突变、61号密码子的Q61R突变,检测灵敏度较高。经试验验证,上述核酸组合物能够检测0.1%的NRAS基因的13号密码子的G13A突变、61号密码子的Q61R突变中的一种,灵敏度较高。
具体地,SEQ ID No.13所示的序列为:TGGTGGTTGGAGCAGGA。如SEQ ID No.14所示的序列为:TCATGGCACTGTACTCTTC。如SEQ ID No.5所示的序列为:TATGGTGGGATCATATTCAT。如SEQ ID No.6所示的序列为:ACAAGTGGTTATAGATGGTGAA。如SEQ ID No.7所示的序列为:GACGGTTGGAGCAGGTGGTGTTGGGTC。如SEQ ID No.8所示的序列为:CAACTGTACTCTTCTTGTCCAGCTGTATTTG。
第一荧光报告基因及第二荧光报告基团均选自TXR、HEX及FAM中的一种。第一荧光淬灭基团及第二荧光淬灭基团均选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,第一荧光报告基因为FAM。第一荧光淬灭基团为BHQ1。第二荧光报告基因为TXR。第二荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是,第一荧光报告基团和第二荧光报告基因均不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,第一荧光淬灭基团和第二荧光淬灭基团均不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中,利用特异性ARMS引物扩增NRAS基因常见的突变型,同时荧光探针抑制野生型基因的扩增,起到了富集突变模板的作用,从而提高突变基因的检测灵敏度;另一方面对扩增产物进行熔解分析,荧光探针在未杂交时,荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭,不产生荧光;而处于杂交状态时,荧光基团与淬灭基团分开,产生荧光。样品中有突变基因,则会出现熔解峰;若没有突变基因,则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中,上述核酸组合物还包括:用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针,以便于对NRAS基因突变检测进行内控,有利于提高检测的准确性。
进一步地,内控基因为RPPH基因,即RNA 5’焦磷酸水解酶。内控引物对的序列如SEQ ID No.22及SEQ ID No.23所示。内控探针的序列如SEQ ID No.24。
具体地,如SEQ ID No.22所示的序列为:GCGGATGCCTCCTTT。如SEQ ID No.23所示的序列为:ACCTCACCTCAGACATTGAA。如SEQ ID No.24所示的序列为:AGCTTGGAACAGACTCACGGCCAGCT。其中,如SEQ ID No.22所示的序列为正向引物,如SEQ IDNo.23所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团,内控与第一荧光报告基团及第二荧光报告基团均不同。
进一步地,内控荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,内控荧光报告基因为HEX。内控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是,内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测NRAS基因突变的核酸组合物能够用于检测NRAS基因突变,检测用时短,完成一次检测用时只需1.5h;无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性;结果判读简单,准确。只需看熔解曲线的峰和TM值,即可判读阴阳性;灵敏度和特异性高,一般可以检测到0.1%的突变DNA;能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第四实施方式提供一种检测NRAS基因突变的核酸组合物,能够检测NRAS基因突变,检测灵敏度较高。具体地,该检测NRAS基因突变的核酸组合物,包括:序列如SEQ IDNo.15所示的第八正向引物,第八正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13D突变;序列如SEQ ID No.16所示的第四反向引物,第四反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61K突变;序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物;序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针;序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针;其中,第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团,第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团,第一荧光报告基团与第二荧光报告基团不同。
上述核酸组合物中,第八正向引物对NRAS基因的13号密码子的G13D突变具有较高的特异性,第四反向引物对NRAS基因的61号密码子的Q61K突变具有较高的特异性,能够分别检测NRAS基因的13号密码子的G13D突变、61号密码子的Q61K突变,检测灵敏度较高。经试验验证,上述核酸组合物能够检测0.1%的NRAS基因的13号密码子的G13D突变、61号密码子的Q61K突变中的一种,灵敏度较高。
具体地,SEQ ID No.15所示的序列为:TGGTGGTTGGAGCAGGTA。如SEQ ID No.16所示的序列为:CATGGCACTGTACTCTTCT。如SEQ ID No.5所示的序列为:TATGGTGGGATCATATTCAT。如SEQ ID No.6所示的序列为:ACAAGTGGTTATAGATGGTGAA。如SEQ ID No.7所示的序列为:GACGGTTGGAGCAGGTGGTGTTGGGTC。如SEQ ID No.8所示的序列为:CAACTGTACTCTTCTTGTCCAGCTGTATTTG。
第一荧光报告基因及第二荧光报告基团均选自TXR、HEX及FAM中的一种。第一荧光淬灭基团及第二荧光淬灭基团均选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,第一荧光报告基因为FAM。第一荧光淬灭基团为BHQ1。第二荧光报告基因为TXR。第二荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是,第一荧光报告基团和第二荧光报告基因均不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,第一荧光淬灭基团和第二荧光淬灭基团均不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中,利用特异性ARMS引物扩增NRAS基因常见的突变型,同时荧光探针抑制野生型基因的扩增,起到了富集突变模板的作用,从而提高突变基因的检测灵敏度;另一方面对扩增产物进行熔解分析,荧光探针在未杂交时,荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭,不产生荧光;而处于杂交状态时,荧光基团与淬灭基团分开,产生荧光。样品中有突变基因,则会出现熔解峰;若没有突变基因,则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中,上述核酸组合物还包括:用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针,以便于对NRAS基因突变检测进行内控,有利于提高检测的准确性。
进一步地,内控基因为RPPH基因,即RNA 5’焦磷酸水解酶。内控引物对的序列如SEQ ID No.22及SEQ ID No.23所示。内控探针的序列如SEQ ID No.24。
具体地,如SEQ ID No.22所示的序列为:GCGGATGCCTCCTTT。如SEQ ID No.23所示的序列为:ACCTCACCTCAGACATTGAA。如SEQ ID No.24所示的序列为:AGCTTGGAACAGACTCACGGCCAGCT。其中,如SEQ ID No.22所示的序列为正向引物,如SEQ IDNo.23所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团,内控与第一荧光报告基团及第二荧光报告基团均不同。
进一步地,内控荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,内控荧光报告基因为HEX。内控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是,内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测NRAS基因突变的核酸组合物能够用于检测NRAS基因突变,检测用时短,完成一次检测用时只需1.5h;无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性;结果判读简单,准确。只需看熔解曲线的峰和TM值,即可判读阴阳性;灵敏度和特异性高,一般可以检测到0.1%的突变DNA;能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第五实施方式提供一种检测NRAS基因突变的核酸组合物,能够检测NRAS基因突变,检测灵敏度较高。具体地,该检测NRAS基因突变的核酸组合物,包括:序列如SEQ IDNo.17所示的第九正向引物,第九正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13V突变;序列如SEQ ID No.18所示的第五反向引物,第五反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61L突变;序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物;序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针;序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针;其中,第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团,第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团,第一荧光报告基团与第二荧光报告基团不同。
上述核酸组合物中,第九正向引物对检测NRAS基因的13号密码子的G13V突变具有较高的特异性,第五反向引物对检测NRAS基因的61号密码子的Q61L突变具有较高的特异性,能够分别检测NRAS基因的13号密码子的G13V突变、61号密码子的Q61L,检测灵敏度较高。经试验验证,上述核酸组合物能够检测0.1%的NRAS基因的13号密码子的G13V突变、61号密码子的Q61L突变中的一种,灵敏度较高。
具体地,SEQ ID No.17所示的序列为:TGGTGGTTGGAGCAGGA。如SEQ ID No.18所示的序列为:TCATGGCACTGTACTCTTC。如SEQ ID No.5所示的序列为:TATGGTGGGATCATATTCAT。如SEQ ID No.6所示的序列为:ACAAGTGGTTATAGATGGTGAA。如SEQ ID No.7所示的序列为:GACGGTTGGAGCAGGTGGTGTTGGGTC。如SEQ ID No.8所示的序列为:CAACTGTACTCTTCTTGTCCAGCTGTATTTG。
第一荧光报告基因及第二荧光报告基团均选自TXR、HEX及FAM中的一种。第一荧光淬灭基团及第二荧光淬灭基团均选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,第一荧光报告基因为FAM。第一荧光淬灭基团为BHQ1。第二荧光报告基因为TXR。第二荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是,第一荧光报告基团和第二荧光报告基因均不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,第一荧光淬灭基团和第二荧光淬灭基团均不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中,利用特异性ARMS引物扩增NRAS基因常见的突变型,同时荧光探针抑制野生型基因的扩增,起到了富集突变模板的作用,从而提高突变基因的检测灵敏度;另一方面对扩增产物进行熔解分析,荧光探针在未杂交时,荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭,不产生荧光;而处于杂交状态时,荧光基团与淬灭基团分开,产生荧光。样品中有突变基因,则会出现熔解峰;若没有突变基因,则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中,上述核酸组合物还包括:用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针,以便于对NRAS基因突变检测进行内控,有利于提高检测的准确性。
进一步地,内控基因为RPPH基因,即RNA 5’焦磷酸水解酶。内控引物对的序列如SEQ ID No.22及SEQ ID No.23所示。内控探针的序列如SEQ ID No.24。
具体地,如SEQ ID No.22所示的序列为:GCGGATGCCTCCTTT。如SEQ ID No.23所示的序列为:ACCTCACCTCAGACATTGAA。如SEQ ID No.24所示的序列为:AGCTTGGAACAGACTCACGGCCAGCT。其中,如SEQ ID No.22所示的序列为正向引物,如SEQ IDNo.23所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团,内控与第一荧光报告基团及第二荧光报告基团均不同。
进一步地,内控荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,内控荧光报告基因为HEX。内控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是,内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测NRAS基因突变的核酸组合物能够用于检测NRAS基因突变,检测用时短,完成一次检测用时只需1.5h;无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性;结果判读简单,准确。只需看熔解曲线的峰和TM值,即可判读阴阳性;灵敏度和特异性高,一般可以检测到0.1%的突变DNA;能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第六实施方式提供一种检测NRAS基因突变的核酸组合物,能够检测NRAS基因突变,检测灵敏度较高。具体地,该检测NRAS基因突变的核酸组合物,包括:序列如SEQ IDNo.19所示的第十正向引物,第十正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13C突变;序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;序列如SEQ ID No.20所示的第三通用探针。
上述核酸组合物中,第十正向引物对检测NRAS基因的13号密码子的G13C突变有较高的特异性,能够分别检测NRAS基因的13号密码子的G13C突变,检测灵敏度较高。经试验验证,上述核酸组合物能够检测0.1%的NRAS基因的13号密码子的G13C突变,灵敏度较高。
具体地,SEQ ID No.19所示的序列为:GGTGGTGGTTGGAGCAG。如SEQ ID No.5所示的序列为:TATGGTGGGATCATATTCAT。如SEQ ID No.20所示的序列为:CAAGTTGGAGCAGGTGGTGTTTTG。
第三通用探针的两端分别连接有第三荧光报告基团和第三荧光淬灭基团。进一步地,第三荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。第三荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,第三荧光报告基因为FAM。第三荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是,第三荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,第三荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中,利用特异性ARMS引物扩增NRAS基因常见的突变型,同时荧光探针抑制野生型基因的扩增,起到了富集突变模板的作用,从而提高突变基因的检测灵敏度;另一方面对扩增产物进行熔解分析,荧光探针在未杂交时,荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭,不产生荧光;而处于杂交状态时,荧光基团与淬灭基团分开,产生荧光。样品中有突变基因,则会出现熔解峰;若没有突变基因,则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中,上述核酸组合物还包括:用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针,以便于对NRAS基因突变检测进行内控,有利于提高检测的准确性。
进一步地,内控基因为RPPH基因,即RNA 5’焦磷酸水解酶。内控引物对的序列如SEQ ID No.22及SEQ ID No.23所示。内控探针的序列如SEQ ID No.24。
具体地,如SEQ ID No.22所示的序列为:GCGGATGCCTCCTTT。如SEQ ID No.23所示的序列为:ACCTCACCTCAGACATTGAA。如SEQ ID No.24所示的序列为:AGCTTGGAACAGACTCACGGCCAGCT。其中,如SEQ ID No.22所示的序列为正向引物,如SEQ IDNo.23所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团,内控与第三荧光报告基团不同。
进一步地,内控荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,内控荧光报告基因为HEX。内控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是,内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测NRAS基因突变的核酸组合物能够用于检测NRAS基因突变,检测用时短,完成一次检测用时只需1.5h;无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性;结果判读简单,准确。只需看熔解曲线的峰和TM值,即可判读阴阳性;灵敏度和特异性高,一般可以检测到0.1%的突变DNA;能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第七实施方式提供一种检测NRAS基因突变的核酸组合物,能够检测NRAS基因突变,检测灵敏度较高。具体地,该检测NRAS基因突变的核酸组合物,包括:序列如SEQ IDNo.21所示的第十一正向引物,第十一正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13R突变;序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;序列如SEQ ID No.20所示的第三通用探针。
上述核酸组合物中,第十一正向引物对NRAS基因的13号密码子的G13R突变具有较高的特异性,能够分别检测NRAS基因的13号密码子的G13R突变,检测灵敏度较高。经试验验证,上述核酸组合物能够检测0.1%的NRAS基因的13号密码子的G13R突变,灵敏度较高。
具体地,SEQ ID No.21所示的序列为:GTGGTGGTTGGAGCAG。如SEQ ID No.5所示的序列为:TATGGTGGGATCATATTCAT。如SEQ ID No.20所示的序列为:CAAGTTGGAGCAGGTGGTGTTTTG。
第三通用探针的两端分别连接有第三荧光报告基团和第三荧光淬灭基团。进一步地,第三荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。第三荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,第三荧光报告基因为FAM。第三荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是,第三荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,第三荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中,利用特异性ARMS引物扩增NRAS基因常见的突变型,同时荧光探针抑制野生型基因的扩增,起到了富集突变模板的作用,从而提高突变基因的检测灵敏度;另一方面对扩增产物进行熔解分析,荧光探针在未杂交时,荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭,不产生荧光;而处于杂交状态时,荧光基团与淬灭基团分开,产生荧光。样品中有突变基因,则会出现熔解峰;若没有突变基因,则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中,上述核酸组合物还包括:用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针,以便于对NRAS基因突变检测进行内控,有利于提高检测的准确性。
进一步地,内控基因为RPPH基因,即RNA 5’焦磷酸水解酶。内控引物对的序列如SEQ ID No.22及SEQ ID No.23所示。内控探针的序列如SEQ ID No.24。
具体地,如SEQ ID No.22所示的序列为:GCGGATGCCTCCTTT。如SEQ ID No.23所示的序列为:ACCTCACCTCAGACATTGAA。如SEQ ID No.24所示的序列为:AGCTTGGAACAGACTCACGGCCAGCT。其中,如SEQ ID No.22所示的序列为正向引物,如SEQ IDNo.23所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团,内控与第三荧光报告基团不同。
进一步地,内控荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,内控荧光报告基因为HEX。内控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是,内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测NRAS基因突变的核酸组合物能够用于检测NRAS基因突变,检测用时短,完成一次检测用时只需1.5h;无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性;结果判读简单,准确。只需看熔解曲线的峰和TM值,即可判读阴阳性;灵敏度和特异性高,一般可以检测到0.1%的突变DNA;能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究一实施方式还提供一种检测NRAS基因突变的试剂盒,包括上述各实施方式的检测NRAS基因突变的核酸组合物中的至少一种。该检测NRAS基因突变的试剂盒能够较为准确检测NRAS基因突变,检测灵敏度较高。
进一步地,检测NRAS基因突变的试剂盒还包括核酸提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶混合液中的至少一种。
其中,酶混合液例如可以包括酶Ⅰ混合液和酶Ⅱ混合液。酶Ⅰ混合液为不具有5’端到3’端外切酶活性的Taq酶和抗体等混合物。酶Ⅱ混合液为5’端到3’端外切酶活性和抗体等混合物。
检测NRAS基因突变的核酸组合物还包括:还包括质控引物对和质控探针。此种设置能够提高检测准确性。
进一步地,质控引物对的序列如SEQ ID No.25及SEQ ID No.5所示,质控探针的序列如SEQ ID No.7所示。
具体地,SEQ ID No.25所示的序列为:GATTACTGGTTTCCAACAGGTT。SEQ ID No.5所示的序列为:TATGGTGGGATCATATTCAT。SEQ ID No.7所示的序列为:GACGGTTGGAGCAGGTGGTGTTGGGTC。其中,SEQ ID No.31所示的引物为正向引物。SEQ ID No.5所示的引物为反向引物。
质控探针的两端分别连接有质控荧光报告基团和质控荧光淬灭基团。质控荧光报告基团与质控荧光报告基团不同。进一步地,质控荧光报告基因选自CY5及FAM中的一种。质控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中,质控荧光报告基因为FAM。质控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是,质控荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团,也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是,质控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团,也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测NRAS基因突变的试剂盒能够用于检测NRAS基因突变,检测用时短,完成一次检测用时只需1.5h;无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性;结果判读简单,准确。只需看熔解曲线的峰和TM值,即可判读阴阳性;灵敏度和特异性高,一般可以检测到0.1%的突变DNA;能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究一实施方式还提供一种NRAS基因突变的检测方法,检测灵敏度较低,能够用于NRAS基因突变的非疾病的治疗和诊断的检测,例如用于NRAS基因突变的实验性研究。
具体地,向待测样品中加入上述各实施方式的检测NRAS基因突变的核酸组合物中的至少一种进行PCR扩增反应,根据反应结果进行检测分析。
本研究的NRAS基因突变的检测方法能够非疾病的治疗和诊断的检测NRAS基因突变,检测用时短,完成一次检测用时只需1.5h;无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性;结果判读简单,准确。只需看熔解曲线的峰和TM值,即可判读阴阳性;灵敏度和特异性高,一般可以检测到0.1%的突变DNA;能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明,均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1
提供一种检测NRAS基因突变的试剂盒,其试剂盒组成详见表1。
试剂盒包括检测NRAS基因突变的核酸组合物(如表2和表3所示)、dNTPs、PCR反应液、酶混合液、阳性对照品和空白对照品。
其中,酶混合液包括酶Ⅰ混合液和酶Ⅱ混合液。酶Ⅰ混合液为不具有5’端到3’端外切酶活性的Taq酶和抗体等混合物。酶Ⅱ混合液为5’端到3’端外切酶活性和抗体等混合物。其中,Taq酶购于TAKARA生物公司和广州百旺生物技术有限公司,抗体购于TOYOBO公司。
第一管的反应液体系(即Tube1管,用于检测如下突变:G12A、G12D、G12V、Q61H)包括:4mM的MgCl2、10mM的Tris、50mM的KCl、200mg/mL的BSA、0.1mM的dNTPs、0.25μM的G12A-F1、0.25μM的G12D-F18、0.25μM的G12V-F8、2.5μM的N12-R、0.25μM的G12C-P、0.25μM的Q61H-R1、1.25μM的61-F、0.25μM的Q61-PR、0.1μM的RPPH-F5、0.3μM的RPPH-R2、0.1μM的RPPH-P、0.4μL的酶I混合液。总体积为20μL。
第二管的反应液体系(即Tube2管,用于检测如下突变:G12R、G12S、G12C、Q61P)包括:4mM的MgCl2、10mM的Tris、50mM的KCl、200mg/mL的BSA、0.1mM的dNTPs、0.25μM的G12R-F1、0.25μM的G12C-F12、0.25μM的G12S-F11、2.5μM的N12-R、0.5μM的G12C-P、0.1μM的Q61P-R3、1.25μM的61-F、0.25μM的Q61-PR、0.1μM的RPPH-F5、0.3μM的RPPH-R2、0.1μM的RPPH-P、0.4μL的酶Ⅰ混合液。总体积为20μL。
第三管的反应液体系(即Tube3管,用于检测如下突变:G13A、Q61R)包括:4mM的MgCl2、10mM的Tris、50mM的KCl、200mg/mL的BSA、0.1mM的dNTPs、0.25μM的G13A-F20、2.5μM的N12-R、0.1μM的G12C-P、0.25μM的Q61R-R10、1.25μM的61-F、0.1μM的Q61-PR、0.1μM的RPPH-F5、0.3μM的RPPH-R2、0.1μM的RPPH-P、0.4μL酶Ⅰ混合液。总体积为20μL。
第四管的反应液体系(即Tube4管,用于检测如下突变:G13D、Q61K)包括:4mM的MgCl2、10mM的Tris、50mM的KCl、200mg/mL的BSA、0.1mM的dNTPs、0.1μM的G13D-F2、2.5μM的N12-R、0.25μM的G12C-P、0.5μM的Q61K-R8、1.25μM的61-F、0.25μM的Q61-PR、0.1μM的RPPH-F5、0.3μM的RPPH-R2、0.1μM的RPPH-P、0.4μL酶Ⅰ混合液。总体积为20μL。
第五管的反应液体系(即Tube5管,用于检测如下突变:G13V、Q61L)包括:4mM的MgCl2、10mM的Tris、50mM的KCl、200mg/mL的BSA、0.1mM的dNTPs、0.25μM的G13V-F20、2.5μM的N12-R、0.1μM的G12C-P、0.25μM的Q61K-R8、1.25μM的61-F、0.1μM的Q61L-R8、0.1μM的RPPH-F5、0.3μM的RPPH-R2、0.1μM的RPPH-P、0.4μL酶Ⅰ混合液。总体积为20μL。
第六管的反应液体系(即Tube6管,用于检测如下突变:G13C)包括:4mM的MgCl2、10mM的Tris、50mM的KCl、200mg/mL的BSA、0.1mM的dNTPs、0.25μM的G13C-F1、1.25μM的N12-R、0.25μM的G12S-P、0.1μM的RPPH-F5、0.3μM的RPPH-R2、0.1μM的RPPH-P、0.4μL酶Ⅰ混合液。总体积为20μL。
第七管的反应液体系(即Tube7管,用于检测如下突变:G13R)包括:4mM的MgCl2、10mM的Tris、50mM的KCl、200mg/mL的BSA、0.1mM的dNTPs、0.25μM的G13R-F1、2.5μM的N12-R、0.1μM的G12S-P、0.1μM的RPPH-F5、0.3μM的RPPH-R2、0.1μM的RPPH-P、0.4μL酶Ⅰ混合液。总体积为20μL。
第八管的反应液体系(即Tube8管,用于质控)包括:4mM的MgCl2、10mM的Tris、50mM的KCl、200mg/mL的BSA、0.1mM的dNTPs、0.3μL的酶Ⅱ混合液、0.3μM的N12-F、0.3μM的N12-R、0.225μM的G12C-P。总体积为20μL。
表1检测NRAS基因突变的核酸组合物
表2检测NRAS基因突变的试剂盒的组成
表3人类NRAS基因第12、13和61密码子上的16种突变
实施例2
采用实施例1的检测NRAS基因突变的试剂盒的检测限
取人类NRAS基因野生型基因组,人NRAS基因各突变型质粒及TE buffer缓冲液,制备同时含有5ng/μL的人NRAS野生型DNA及含量分别为野生型的10%、1%和0.1%的人NRAS各突变型基因质粒,记录阳性检出率。结果显示,我们的试剂盒能检测到5ng野生型背景下0.1%突变变DNA。
具体实施步骤如下:
1、待测样本的提取
组织样本使用QIAGEN的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit进行提取,血浆样本使用QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit进行提取。提取过程应严格按照说明书要求进行。组织样本提取后的核酸稀释为浓度2~100ng/μL,血浆提取后的核酸浓度应不少于2ng/μL,纯度都应满足A260/A280比值范围在1.6~2.3之间。模板可直接用于后续实验或置于-20℃冰箱保存备用,避免反复冻融。
2、试剂配置
(1)根据所测的待检样本的基因组DNA浓度,用纯化水进行稀释至推荐的浓度为5ng/μL,放置冰上待用。
(2)根据检测样品数量及实验设计,取对应检测需要的8联管、NRAS质控PCR反应液、NRAS-酶Ⅰ混合液、NRAS-酶Ⅱ混合液、NRAS阳性对照、超纯水一起放置冰上或4℃冰箱里。
(3)将8联管、NRAS阳性对照及样本混匀后微离心,放置冰上;DNA聚合酶和纯化水微离心后置冰上;按照表4配置混合液mixA,按照表5的反应体系进行配置混合液mix B,每个样品、阳性对照及NTC各配制一个混合液mix A和一个混合液mix B。
表4混合液mixA配液组份表
组分 | 1反应(μL) | 倍数(7.2) |
NRAS-酶Ⅰ混合液 | 0.4 | 2.88μL |
超纯水 | 0.6 | 4.32μL |
样品DNA/阳性对照/超纯水 | 4 | 28.8μL |
总体积 | 5 | 36.0μL |
表5混合液mixB配液组份表
组分 | 1反应(μL) | N反应(μL) |
NRAS-酶Ⅱ混合液 | 0.3 | 0.3×NμL |
NRAS质控PCR反应液 | 15.7 | 15.7×NμL |
总体积 | 16 | 16×NμL |
(4)将8联管放入PCR仪器中,按照加样布局排列,推荐排列布局详见表6。
表6 PCR仪96孔板的布局
3、PCR扩增及荧光检测
将各反应管按照一定顺序放入荧光定量PCR仪上,按照表7设置反应程序:
表7 Light Cycler 480荧光定量PCR仪上的反应程序
4、检验结果的解释
(1)试剂盒有效性情况判断:
(a)空白对照在熔解分析后,FAM、HEX和CY5通道无明显熔解峰;若分析后出现明显熔解峰,可能为试剂受到污染或操作过程中污染,请排除污染源后重新检测。
(b)阳性对照管在熔解曲线分析后:Tube1的FAM通道熔解峰Tm值在65±1℃范围内,CY5通道的熔解峰Tm值在65±1℃范围内,HEX通道的熔解峰在72±1℃范围内;Tube2的FAM通道的熔解峰Tm值在65±1℃范围内,CY5通道的熔解峰Tm值在58±1℃范围内,HEX通道的熔解峰在72±1℃范围内;Tube3的FAM通道的熔解峰Tm值在61±1℃范围内,CY5通道的熔解峰Tm值在64±1℃范围内,HEX通道的熔解峰在72±1℃范围内;Tube4的FAM通道的熔解峰Tm值在59±1℃范围内,CY5通道的熔解峰Tm值在60±1℃范围内,HEX通道的熔解峰在72±1℃范围内;Tube5的FAM通道的熔解峰Tm值在60±1℃范围内,CY5通道的熔解峰Tm值在60±1℃范围内,HEX通道的熔解峰在72±1℃范围内;Tube6的FAM通道的熔解峰Tm值在57±1℃范围内,HEX通道的熔解峰的Tm值在72±1℃范围内;Tube7的FAM通道的熔解峰Tm值在58±1℃范围内,HEX通道的熔解峰在72±1℃范围内。
(2)样本有效性的判断:
(a)质控PCR反应液:FAM通道Ct值≥26.0,说明所加入的样本基因组DNA含量过低,只有突变DNA含量较高的样本可以检测出突变类型,也可能为DNA样本中存在着PCR抑制剂,建议重新制备样本或者增加使用量进行检测;
(b)质控PCR反应液:FAM通道23≤Ct值<26,说明所加入的样本基因组DNA量适中;
(c)质控PCR反应液:FAM通道Ct值<23,说明所加入样本基因组DNA过量,建议稀释后重新检测;
(d)质控PCR反应液管用于判断样本的有效性,通过扩增曲线判定样本的情况。
(3)检测结果的判定:若满足(1)和(2)要求,表明此时检测成功,对样本管进行分析。样本分析的标准结合下表8和附加情况进行判断分析。
表8结果判断标准
(1)若Tube1管内FAM通道出现熔解峰,则G12A、G12D和G12V有一个突变,但不能区分具体是哪种突变。
(2)若Tube2管内FAM通道出现熔解峰,则G12C、G12R和G12S有一个突变,但不能区分具体是哪种突变。
检测结果详见图1~图7。图1为Tube1管中G12A、G12D、G12V和Q61P突变位点检测能力测试图。图2为Tube2管中G12R、G12S、G12C和Q61P突变位点检测能力测试图。图3为Tube3管中G13A和Q61R突变位点检测能力测试图。图4为Tube4管中G13D和Q61K突变位点检测能力测试图。图5为Tube5管中G3V和Q61L突变位点检测能力测试图。图6为Tube6管中G3C突变位点检测能力测试图。图7为Tube7管中G13R突变位点检测能力测试图。图1~图7中,横坐标为温度,单位为℃,纵坐标的“-dF/dT”表示荧光强度的变化对温度变化的求导。
从图1~图7可以看出,上述检测NRAS基因突变的试剂盒,能够检测出5ng野生型背景下突变比例为0.1%的上述16种NRAS基因突变,检测灵敏度和特异性较高。
上述检测NRAS基因突变的试剂盒能够用于检测NRAS基因第12、13和61密码子上的16种突变,检测范围广,检测用时短,完成一次检测用时只需1.5h;无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性;结果判读简单,准确。只需看熔解曲线的峰和TM值,即可判读阴阳性;灵敏度和特异性高,一般可以检测到0.1%的突变DNA;能够适用于血浆或者FFPE样本的检测,整个过程闭管操作,简便快捷,同时大大降低污染几率,特异性强,灵敏度高达千分之一,有助于高效筛选恶性肿瘤免疫治疗和靶向治疗的检测对象,为临床用药提供理论依据。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 苏州中科先进技术研究院有限公司
<120> 检测NRAS基因突变的核酸组合物及其试剂盒
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaactggtgg tggttggagc 20
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggtggtggt tggaaca 17
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctggtggtgg ttggagaa 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcatggcact gtactctt 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tatggtggga tcatattcat 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acaagtggtt atagatggtg aa 22
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gacggttgga gcaggtggtg ttgggtc 27
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caactgtact cttcttgtcc agctgtattt g 31
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctggtggtgg ttggagaa 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
actggtggtg gttggatc 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctggtggtgg ttggagga 18
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcatggcact gtactcttg 19
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tggtggttgg agcagga 17
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcatggcact gtactcttc 19
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tggtggttgg agcaggta 18
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
catggcactg tactcttct 19
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tggtggttgg agcagga 17
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcatggcact gtactcttc 19
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggtggtggtt ggagcag 17
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caagttggag caggtggtgt tttg 24
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtggtggttg gagcag 16
<210> 22
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gcggatgcct ccttt 15
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acctcacctc agacattgaa 20
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agcttggaac agactcacgg ccagct 26
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gattactggt ttccaacagg tt 22
Claims (11)
1.一种检测NRAS基因突变的核酸组合物,其特征在于,包括:
序列如SEQ ID No.1所示的第一正向引物,所述第一正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12A突变;
序列如SEQ ID No.2所示的第二正向引物,所述第二正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12D突变;
序列如SEQ ID No.3所示的第三正向引物,所述第三正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12V突变;
序列如SEQ ID No.4所示的第一反向引物,所述第一反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61H突变;
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;
序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物;
序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针;及
序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针;
其中,所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团,所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团,所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
2.一种检测NRAS基因突变的核酸组合物,其特征在于,包括:
序列如SEQ ID No.9所示的第四正向引物,所述第四正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12R突变;
序列如SEQ ID No.10所示的第五正向引物,所述第五正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12C突变;
序列如SEQ ID No.11所示的第六正向引物,所述第六正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12S突变;
序列如SEQ ID No.12所示的第二反向引物,所述第二反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61P突变;
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;
序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物;
序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针;及
序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针;
其中,所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团,所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团,所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
3.一种检测NRAS基因突变的核酸组合物,其特征在于,包括:
序列如SEQ ID No.13所示的第七正向引物,所述第七正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13A突变;
序列如SEQ ID No.14所示的第三反向引物,所述第三反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61R突变;
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;
序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物;
序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针;及
序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针;
其中,所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团,所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团,所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
4.一种检测NRAS基因突变的核酸组合物,其特征在于,包括:
序列如SEQ ID No.15所示的第八正向引物,所述第八正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13D突变;
序列如SEQ ID No.16所示的第四反向引物,所述第四反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61K突变;
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;
序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物;
序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针;及
序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针;
其中,所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团,所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团,所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
5.一种检测NRAS基因突变的核酸组合物,其特征在于,包括:
序列如SEQ ID No.17所示的第九正向引物,所述第九正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13V突变;
序列如SEQ ID No.18所示的第五反向引物,所述第五反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61L突变;
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;
序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物;
序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针;及
序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针;
其中,所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团,所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团,所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
6.一种检测NRAS基因突变的核酸组合物,其特征在于,包括:
序列如SEQ ID No.19所示的第十正向引物,所述第十正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13C突变;
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;
序列如SEQ ID No.20所示的第三通用探针。
7.一种检测NRAS基因突变的核酸组合物,其特征在于,包括:
序列如SEQ ID No.21所示的第十一正向引物,所述第十一正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13R突变;
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物;
序列如SEQ ID No.20所示的第三通用探针。
8.一种检测NRAS基因突变的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1~7任一项所述的检测NRAS基因突变的核酸组合物。
9.根据权利要求8所述的检测NRAS基因突变的试剂盒,其特征在于,还包括:用于检测内控基因的内控引物对和内控探针;
进一步地,所述内控基因为RPPH基因,所述内控引物对的序列如SEQ ID No.22及SEQID No.23所示,所述内控探针的序列如SEQ ID No.24。
10.根据权利要求8所述的检测NRAS基因突变的试剂盒,其特征在于,还包括:还包括质控引物对和质控探针;
进一步地,所述质控引物对的序列如SEQ ID No.25及SEQ ID No.5所示,所述质控探针的序列如SEQ ID No.7所示。
11.根据权利要求8~10任一项所述的检测NRAS基因突变的试剂盒,其特征在于,还包括核酸提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶混合液中的至少一种。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011088625.XA CN112176062A (zh) | 2020-10-13 | 2020-10-13 | 检测nras基因突变的核酸组合物及其试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011088625.XA CN112176062A (zh) | 2020-10-13 | 2020-10-13 | 检测nras基因突变的核酸组合物及其试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112176062A true CN112176062A (zh) | 2021-01-05 |
Family
ID=73949366
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202011088625.XA Pending CN112176062A (zh) | 2020-10-13 | 2020-10-13 | 检测nras基因突变的核酸组合物及其试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN112176062A (zh) |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104372103A (zh) * | 2014-12-05 | 2015-02-25 | 武汉友芝友医疗科技有限公司 | 一种nras基因突变检测试剂盒 |
CN105087793A (zh) * | 2015-08-13 | 2015-11-25 | 广州和实生物技术有限公司 | Nras基因多点突变单管快速检测方法及试剂盒 |
US20160108479A1 (en) * | 2013-08-14 | 2016-04-21 | Qiagen Mansfield, Inc. | Compositions and methods for multiplex analysis of nras and braf nucleic acids |
CN105779587A (zh) * | 2016-01-13 | 2016-07-20 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 用于检测人类nras基因7种突变的探针、引物及试剂盒 |
CN105986018A (zh) * | 2015-02-06 | 2016-10-05 | 上海赛安生物医药科技有限公司 | Nras基因突变检测体系及其试剂盒 |
CN106399514A (zh) * | 2016-09-28 | 2017-02-15 | 广州凯普医药科技有限公司 | Nras基因突变检测试剂盒 |
US20170198355A1 (en) * | 2014-05-30 | 2017-07-13 | Minli Mo | Nras gene mutation detection kit |
CN107022620A (zh) * | 2017-04-28 | 2017-08-08 | 上海赛安生物医药科技有限公司 | N‑ras基因突变检测引物探针及其试剂盒 |
CN107937525A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-04-20 | 益善生物技术股份有限公司 | 基于液相芯片法的nras突变检测试剂盒和延伸引物 |
-
2020
- 2020-10-13 CN CN202011088625.XA patent/CN112176062A/zh active Pending
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20160108479A1 (en) * | 2013-08-14 | 2016-04-21 | Qiagen Mansfield, Inc. | Compositions and methods for multiplex analysis of nras and braf nucleic acids |
US20170198355A1 (en) * | 2014-05-30 | 2017-07-13 | Minli Mo | Nras gene mutation detection kit |
CN104372103A (zh) * | 2014-12-05 | 2015-02-25 | 武汉友芝友医疗科技有限公司 | 一种nras基因突变检测试剂盒 |
CN105986018A (zh) * | 2015-02-06 | 2016-10-05 | 上海赛安生物医药科技有限公司 | Nras基因突变检测体系及其试剂盒 |
CN105087793A (zh) * | 2015-08-13 | 2015-11-25 | 广州和实生物技术有限公司 | Nras基因多点突变单管快速检测方法及试剂盒 |
CN105779587A (zh) * | 2016-01-13 | 2016-07-20 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 用于检测人类nras基因7种突变的探针、引物及试剂盒 |
CN106399514A (zh) * | 2016-09-28 | 2017-02-15 | 广州凯普医药科技有限公司 | Nras基因突变检测试剂盒 |
CN107022620A (zh) * | 2017-04-28 | 2017-08-08 | 上海赛安生物医药科技有限公司 | N‑ras基因突变检测引物探针及其试剂盒 |
CN107937525A (zh) * | 2017-12-08 | 2018-04-20 | 益善生物技术股份有限公司 | 基于液相芯片法的nras突变检测试剂盒和延伸引物 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
刘彦魁等: "结直肠癌 NRAS 基因突变检测及其临床意义", 《现代肿瘤医学》, vol. 26, no. 10, 31 May 2018 (2018-05-31), pages 1551 - 1554 * |
祝继原等: "结直肠癌患者KRAS,NRAS和BRAF基因突变检测分析", 《哈尔滨医科大学学报》, vol. 51, no. 6, 31 December 2017 (2017-12-31), pages 500 - 503 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107034277B (zh) | 一种检测低丰度基因突变的方法 | |
CN101092644B (zh) | 非小细胞肺癌疗效相关的egfr基因突变的快速检测 | |
CN110541033B (zh) | Egfr基因突变检测用组合物及检测方法 | |
CN112322733A (zh) | 检测egfr基因突变的核酸组合物及试剂盒和egfr基因突变的检测方法 | |
CN107513578A (zh) | 一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法 | |
CN106498028B (zh) | Egfr的t790m突变的诊断方法及试剂盒 | |
CN106498029B (zh) | 提高egfr的t790m突变的诊断效率的方法 | |
EP3494236B1 (en) | Method for conducting early detection of colon cancer and/or of colon cancer precursor cells and for monitoring colon cancer recurrence | |
CN106811512B (zh) | 一种快速检测人y染色体azf区微缺失的方法、试剂盒及其制备 | |
CN110564861A (zh) | 人类Y染色体STR基因座和InDel位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用 | |
CN117305437A (zh) | 一种人运动神经元存活基因的检测引物探针组合、试剂盒及检测方法 | |
KR101775953B1 (ko) | 돌연변이 유전자 검사 방법 및 킷트 | |
CN110295218B (zh) | 量化靶基因的突变型等位基因负担的方法 | |
CN107058548A (zh) | c‑kit基因突变检测引物探针及其试剂盒 | |
CN107022620A (zh) | N‑ras基因突变检测引物探针及其试剂盒 | |
CN116751865A (zh) | 一种用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒、其方法和应用 | |
CN108728538B (zh) | Alk基因融合检测引物、方法及试剂盒 | |
CN109136367B (zh) | 提高braf基因v600e突变的诊断效率的方法 | |
CN112176062A (zh) | 检测nras基因突变的核酸组合物及其试剂盒 | |
CN111349691A (zh) | Egfr基因缺失突变检测用组合物、试剂盒及检测方法 | |
CN108913774A (zh) | 一种c-KIT体细胞突变基因检测试剂盒及其检测方法 | |
CN115927623A (zh) | 检测结直肠癌和/或胃癌的生物标记物组合、试剂盒及其应用 | |
CN112063701A (zh) | 检测kras基因突变的核酸组合物及其试剂盒和检测方法 | |
CN116555423A (zh) | 肺癌甲基化标志物组合、检测产品及其应用 | |
CN108998535B (zh) | 一种kras基因多重突变位点检测试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210105 |