CN112176062A - 检测nras基因突变的核酸组合物及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测NRAS基因突变的核酸组合物及其试剂盒。该核酸组合物包括：序列如SEQ ID No.1所示的第一正向引物；序列如SEQ ID No.2所示的第二正向引物；序列如SEQ ID No.3所示的第三正向引物；序列如SEQ ID No.4所示的第一反向引物；序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物；序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针；及序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针。上述核酸组合物对NRAS基因突变的特异性较高，检测灵敏度较高。

Description

检测NRAS基因突变的核酸组合物及其试剂盒
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种检测NRAS基因突变的核酸组合物及其试剂盒。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的消化道肿瘤之一，是当今世界发病率排名第三的恶性肿瘤，每年新发病人接近1000000例，在恶性肿瘤死亡率中高居第二。在中国，结直肠癌的发病率和死亡率都呈现逐年上升的趋势，已成为严重威胁我国国民健康和生命的一种疾病。提高结直肠癌的预防、诊断和治疗水平，对维护国民健康幸福，降低国家疾病负担具有重要意义。
2004年，FDA批准了西妥昔单抗用于晚期转移性结直肠癌治疗，然而进一步研究发现，NRAS基因的突变使结直肠癌患者对西妥昔单抗的治疗产生耐药性。此外NRAS基因突变状态与非小细胞肺癌对吉非替尼、厄罗替尼等靶向治疗药物的原发性耐药有关，也是肺癌患者生存的预后指标之一。
目前，NRAS基因突变检测的主要方法有以下几种：1)Sanger测序法；直接测序法一直以来是基因突变检测的金标准，但是测序法存在很多缺点，比如耗时长，后续要对PCR产物进行处理，程序复杂，容易出现污染导致结果不准确。另外，测序法的灵敏度低，特别是在混合模板时检出率低，一般需要突变丰度达到20％以上才能准确检测。2)高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，HRM)是通过饱和燃料结合于PCR扩增产物监控其形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，其敏感性在5％左右。3)扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)是根据引物3’端末位碱基必须与其模板DNA链互补才能进行有效的扩增。基于此，设计针对基因突变位点的引物序列，可以检测突变基因，该检测方法的灵敏度在1％左右。这些方法的检测灵敏度较低，不能满足实际需求。
发明内容
基于此，有必提供一种灵敏度较高的检测NRAS基因突变的核酸组合物。
此外，还有必要提供一种检测NRAS基因突变的试剂盒。
一种检测NRAS基因突变的核酸组合物，包括：
序列如SEQ ID No.1所示的第一正向引物，所述第一正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12A突变；
序列如SEQ ID No.2所示的第二正向引物，所述第二正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12D突变；
序列如SEQ ID No.3所示的第三正向引物，所述第三正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12V突变；
序列如SEQ ID No.4所示的第一反向引物，所述第一反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61H突变；
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；
序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物；
序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针；及
序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针；
其中，所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
上述核酸组合物中，第一正向引物对NRAS基因的12号密码子的G12A突变具有较高的特异性，第二正向引物对NRAS基因的12号密码子的G12D突变具有较高的特异性，第三正向引物对NRAS基因的12号密码子的G12V突变具有较高的特异性，第一反向引物对NRAS基因的61号密码子的Q61H突变具有较高的特异性，能够分别检测NRAS基因的12号密码子的G12A突变、12号密码子的G12D突变、12号密码子的G12V突变、61号密码子的Q61H突变，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的NRAS基因的的12号密码子的G12A突变、12号密码子的G12D突变、12号密码子的G12V突变、61号密码子的Q61H突变中的一种，灵敏度较高。
一种检测NRAS基因突变的核酸组合物，包括：
序列如SEQ ID No.9所示的第四正向引物，所述第四正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12R突变；
序列如SEQ ID No.10所示的第五正向引物，所述第五正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12C突变；
序列如SEQ ID No.11所示的第六正向引物，所述第六正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12S突变；
序列如SEQ ID No.12所示的第二反向引物，所述第二反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61P突变；
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；
序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物；
序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针；及
序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针；
其中，所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
一种检测NRAS基因突变的核酸组合物，包括：
序列如SEQ ID No.13所示的第七正向引物，所述第七正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13A突变；
序列如SEQ ID No.14所示的第三反向引物，所述第三反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61R突变；
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；
序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物；
序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针；及
序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针；
其中，所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
一种检测NRAS基因突变的核酸组合物，包括：
序列如SEQ ID No.15所示的第八正向引物，所述第八正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13D突变；
序列如SEQ ID No.16所示的第四反向引物，所述第四反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61K突变；
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；
序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物；
序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针；及
序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针；
其中，所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
一种检测NRAS基因突变的核酸组合物，包括：
序列如SEQ ID No.17所示的第九正向引物，所述第九正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13V突变；
序列如SEQ ID No.18所示的第五反向引物，所述第五反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61L突变；
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；
序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物；
序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针；及
序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针；
其中，所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
一种检测NRAS基因突变的核酸组合物，包括：
序列如SEQ ID No.19所示的第十正向引物，所述第十正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13C突变；
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；
序列如SEQ ID No.20所示的第三通用探针。
一种检测NRAS基因突变的核酸组合物，包括：
序列如SEQ ID No.21所示的第十一正向引物，所述第十一正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13R突变；
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；
序列如SEQ ID No.20所示的第三通用探针。
一种检测NRAS基因突变的试剂盒，包括上述检测NRAS基因突变的核酸组合物。
其中一个实施例中，还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针；
进一步地，所述内控基因为RPPH基因，所述内控引物对的序列如SEQ ID No.22及SEQ ID No.23所示，所述内控探针的序列如SEQ ID No.24。
其中一个实施例中，还包括：还包括质控引物对和质控探针；
进一步地，所述质控引物对的序列如SEQ ID No.25及SEQ ID No.5所示，所述质控探针的序列如SEQ ID No.7所示。
其中一个实施例中，还包括核酸提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶混合液中的至少一种。
附图说明
图1为Tube1管中G12A、G12D、G12V和Q61P突变位点检测能力测试图；
图2为Tube2管中G12R、G12S、G12C和Q61P突变位点检测能力测试图；
图3为Tube3管中G13A和Q61R突变位点检测能力测试图；
图4为Tube4管中G13D和Q61K突变位点检测能力测试图；
图5为Tube5管中G3V和Q61L突变位点检测能力测试图；
图6为Tube6管中G3C突变位点检测能力测试图；
图7为Tube7管中G13R突变位点检测能力测试图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本研究第一实施方式提供一种检测NRAS基因突变的核酸组合物，能够检测NRAS基因突变，检测灵敏度较高。具体地，该检测NRAS基因突变的核酸组合物，包括：序列如SEQ IDNo.1所示的第一正向引物，第一正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12A突变；序列如SEQ ID No.2所示的第二正向引物，第二正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12D突变；序列如SEQ ID No.3所示的第三正向引物，第三正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12V突变；序列如SEQ ID No.4所示的第一反向引物，第一反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61H突变；序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物；序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针；及序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针；其中，第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，第一荧光报告基团与第二荧光报告基团不同。
上述核酸组合物中，第一正向引物对NRAS基因的12号密码子的G12A突变具有较高的特异性，第二正向引物对NRAS基因的12号密码子的G12D突变具有较高的特异性，第三正向引物对NRAS基因的12号密码子的G12V突变具有较高的特异性，第一反向引物对NRAS基因的61号密码子的Q61H突变具有较高的特异性，能够分别检测NRAS基因的12号密码子的G12A突变、12号密码子的G12D突变、12号密码子的G12V突变、61号密码子的Q61H突变，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的NRAS基因的的12号密码子的G12A突变、12号密码子的G12D突变、12号密码子的G12V突变、61号密码子的Q61H突变中的一种，灵敏度较高。
具体地，SEQ ID No.1所示的序列为：AAACTGGTGGTGGTTGGAGC。如SEQ ID No.2所示的序列为：TGGTGGTGGTTGGAACA。如SEQ ID No.3所示的序列为：CTGGTGGTGGTTGGAGAA。如SEQID No.4所示的序列为：TCATGGCACTGTACTCTT。如SEQ ID No.5所示的序列为：TATGGTGGGATCATATTCAT。如SEQ ID No.6所示的序列为：ACAAGTGGTTATAGATGGTGAA。如SEQID No.7所示的序列为：GACGGTTGGAGCAGGTGGTGTTGGGTC。如SEQ ID No.8所示的序列为：CAACTGTACTCTTCTTGTCCAGCTGTATTTG。
第一荧光报告基因及第二荧光报告基团均选自TXR、HEX及FAM中的一种。第一荧光淬灭基团及第二荧光淬灭基团均选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，第一荧光报告基因为FAM。第一荧光淬灭基团为BHQ1。第二荧光报告基因为TXR。第二荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是，第一荧光报告基团和第二荧光报告基因均不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，第一荧光淬灭基团和第二荧光淬灭基团均不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中，利用特异性ARMS引物扩增NRAS基因常见的突变型，同时荧光探针抑制野生型基因的扩增，起到了富集突变模板的作用，从而提高突变基因的检测灵敏度；另一方面对扩增产物进行熔解分析，荧光探针在未杂交时，荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭，不产生荧光；而处于杂交状态时，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。样品中有突变基因，则会出现熔解峰；若没有突变基因，则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针，以便于对NRAS基因突变检测进行内控，有利于提高检测的准确性。
进一步地，内控基因为RPPH基因，即RNA 5’焦磷酸水解酶。内控引物对的序列如SEQ ID No.22及SEQ ID No.23所示。内控探针的序列如SEQ ID No.24。
具体地，如SEQ ID No.22所示的序列为：GCGGATGCCTCCTTT。如SEQ ID No.23所示的序列为：ACCTCACCTCAGACATTGAA。如SEQ ID No.24所示的序列为：AGCTTGGAACAGACTCACGGCCAGCT。其中，如SEQ ID No.22所示的序列为正向引物，如SEQ IDNo.23所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团，内控与第一荧光报告基团及第二荧光报告基团均不同。
进一步地，内控荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，内控荧光报告基因为HEX。内控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测NRAS基因突变的核酸组合物能够用于检测NRAS基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第二实施方式提供一种检测NRAS基因突变的核酸组合物，能够检测NRAS基因突变，检测灵敏度较高。具体地，该检测NRAS基因突变的核酸组合物，包括：序列如SEQ IDNo.9所示的第四正向引物，第四正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12R突变；序列如SEQ ID No.10所示的第五正向引物，第五正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12C突变；序列如SEQ ID No.11所示的第六正向引物，第六正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12S突变；序列如SEQ ID No.12所示的第二反向引物，第二反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61P突变；序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物；序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针；序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针；其中，第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，第一荧光报告基团与第二荧光报告基团不同。
上述核酸组合物中，第四正向引物对NRAS基因的12号密码子的G12R突变具有较高的特异性，第五正向引物对NRAS基因的12号密码子的G12C突变具有较高的特异性，第六正向引物对NRAS基因的12号密码子的G12S突变具有较高的特异性，第二反向引物对NRAS基因的61号密码子的Q61P突变具有较高的特异性，能够分别检测NRAS基因的12号密码子的G12R突变、12号密码子的G12C突变、12号密码子的G12S突变、61号密码子的Q61P突变，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的NRAS基因的12号密码子的G12R突变、12号密码子的G12C突变、12号密码子的G12S突变、61号密码子的Q61P突变中的一种，灵敏度较高。
具体地，SEQ ID No.9所示的序列为：CTGGTGGTGGTTGGAGAA。如SEQ ID No.10所示的序列为：ACTGGTGGTGGTTGGATC。如SEQ ID No.11所示的序列为：CTGGTGGTGGTTGGAGGA。如SEQ ID No.12所示的序列为：TCATGGCACTGTACTCTTG。如SEQ ID No.5所示的序列为：TATGGTGGGATCATATTCAT。如SEQ ID No.6所示的序列为：ACAAGTGGTTATAGATGGTGAA。如SEQID No.7所示的序列为：GACGGTTGGAGCAGGTGGTGTTGGGTC。如SEQ ID No.8所示的序列为：CAACTGTACTCTTCTTGTCCAGCTGTATTTG。
第一荧光报告基因及第二荧光报告基团均选自TXR、HEX及FAM中的一种。第一荧光淬灭基团及第二荧光淬灭基团均选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，第一荧光报告基因为FAM。第一荧光淬灭基团为BHQ1。第二荧光报告基因为TXR。第二荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是，第一荧光报告基团和第二荧光报告基因均不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，第一荧光淬灭基团和第二荧光淬灭基团均不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中，利用特异性ARMS引物扩增NRAS基因常见的突变型，同时荧光探针抑制野生型基因的扩增，起到了富集突变模板的作用，从而提高突变基因的检测灵敏度；另一方面对扩增产物进行熔解分析，荧光探针在未杂交时，荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭，不产生荧光；而处于杂交状态时，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。样品中有突变基因，则会出现熔解峰；若没有突变基因，则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针，以便于对NRAS基因突变检测进行内控，有利于提高检测的准确性。
进一步地，内控基因为RPPH基因，即RNA 5’焦磷酸水解酶。内控引物对的序列如SEQ ID No.22及SEQ ID No.23所示。内控探针的序列如SEQ ID No.24。
具体地，如SEQ ID No.22所示的序列为：GCGGATGCCTCCTTT。如SEQ ID No.23所示的序列为：ACCTCACCTCAGACATTGAA。如SEQ ID No.24所示的序列为：AGCTTGGAACAGACTCACGGCCAGCT。其中，如SEQ ID No.22所示的序列为正向引物，如SEQ IDNo.23所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团，内控与第一荧光报告基团及第二荧光报告基团均不同。
进一步地，内控荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，内控荧光报告基因为HEX。内控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测NRAS基因突变的核酸组合物能够用于检测NRAS基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第三实施方式提供一种检测NRAS基因突变的核酸组合物，能够检测NRAS基因突变，检测灵敏度较高。具体地，该检测NRAS基因突变的核酸组合物，包括：序列如SEQ IDNo.13所示的第七正向引物，第七正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13A突变；序列如SEQ ID No.14所示的第三反向引物，第三反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61R突变；序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物；序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针；序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针；其中，第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，第一荧光报告基团与第二荧光报告基团不同。
上述核酸组合物中，第七正向引物对NRAS基因的13号密码子的G13A突变具有较高的特异性，第三反向引物对NRAS基因的61号密码子的Q61R突变具有较高的特异性，能够分别检测NRAS基因的13号密码子的G13A突变、61号密码子的Q61R突变，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的NRAS基因的13号密码子的G13A突变、61号密码子的Q61R突变中的一种，灵敏度较高。
具体地，SEQ ID No.13所示的序列为：TGGTGGTTGGAGCAGGA。如SEQ ID No.14所示的序列为：TCATGGCACTGTACTCTTC。如SEQ ID No.5所示的序列为：TATGGTGGGATCATATTCAT。如SEQ ID No.6所示的序列为：ACAAGTGGTTATAGATGGTGAA。如SEQ ID No.7所示的序列为：GACGGTTGGAGCAGGTGGTGTTGGGTC。如SEQ ID No.8所示的序列为：CAACTGTACTCTTCTTGTCCAGCTGTATTTG。
第一荧光报告基因及第二荧光报告基团均选自TXR、HEX及FAM中的一种。第一荧光淬灭基团及第二荧光淬灭基团均选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，第一荧光报告基因为FAM。第一荧光淬灭基团为BHQ1。第二荧光报告基因为TXR。第二荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是，第一荧光报告基团和第二荧光报告基因均不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，第一荧光淬灭基团和第二荧光淬灭基团均不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中，利用特异性ARMS引物扩增NRAS基因常见的突变型，同时荧光探针抑制野生型基因的扩增，起到了富集突变模板的作用，从而提高突变基因的检测灵敏度；另一方面对扩增产物进行熔解分析，荧光探针在未杂交时，荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭，不产生荧光；而处于杂交状态时，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。样品中有突变基因，则会出现熔解峰；若没有突变基因，则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针，以便于对NRAS基因突变检测进行内控，有利于提高检测的准确性。
进一步地，内控基因为RPPH基因，即RNA 5’焦磷酸水解酶。内控引物对的序列如SEQ ID No.22及SEQ ID No.23所示。内控探针的序列如SEQ ID No.24。
具体地，如SEQ ID No.22所示的序列为：GCGGATGCCTCCTTT。如SEQ ID No.23所示的序列为：ACCTCACCTCAGACATTGAA。如SEQ ID No.24所示的序列为：AGCTTGGAACAGACTCACGGCCAGCT。其中，如SEQ ID No.22所示的序列为正向引物，如SEQ IDNo.23所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团，内控与第一荧光报告基团及第二荧光报告基团均不同。
进一步地，内控荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，内控荧光报告基因为HEX。内控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测NRAS基因突变的核酸组合物能够用于检测NRAS基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第四实施方式提供一种检测NRAS基因突变的核酸组合物，能够检测NRAS基因突变，检测灵敏度较高。具体地，该检测NRAS基因突变的核酸组合物，包括：序列如SEQ IDNo.15所示的第八正向引物，第八正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13D突变；序列如SEQ ID No.16所示的第四反向引物，第四反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61K突变；序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物；序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针；序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针；其中，第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，第一荧光报告基团与第二荧光报告基团不同。
上述核酸组合物中，第八正向引物对NRAS基因的13号密码子的G13D突变具有较高的特异性，第四反向引物对NRAS基因的61号密码子的Q61K突变具有较高的特异性，能够分别检测NRAS基因的13号密码子的G13D突变、61号密码子的Q61K突变，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的NRAS基因的13号密码子的G13D突变、61号密码子的Q61K突变中的一种，灵敏度较高。
具体地，SEQ ID No.15所示的序列为：TGGTGGTTGGAGCAGGTA。如SEQ ID No.16所示的序列为：CATGGCACTGTACTCTTCT。如SEQ ID No.5所示的序列为：TATGGTGGGATCATATTCAT。如SEQ ID No.6所示的序列为：ACAAGTGGTTATAGATGGTGAA。如SEQ ID No.7所示的序列为：GACGGTTGGAGCAGGTGGTGTTGGGTC。如SEQ ID No.8所示的序列为：CAACTGTACTCTTCTTGTCCAGCTGTATTTG。
第一荧光报告基因及第二荧光报告基团均选自TXR、HEX及FAM中的一种。第一荧光淬灭基团及第二荧光淬灭基团均选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，第一荧光报告基因为FAM。第一荧光淬灭基团为BHQ1。第二荧光报告基因为TXR。第二荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是，第一荧光报告基团和第二荧光报告基因均不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，第一荧光淬灭基团和第二荧光淬灭基团均不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中，利用特异性ARMS引物扩增NRAS基因常见的突变型，同时荧光探针抑制野生型基因的扩增，起到了富集突变模板的作用，从而提高突变基因的检测灵敏度；另一方面对扩增产物进行熔解分析，荧光探针在未杂交时，荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭，不产生荧光；而处于杂交状态时，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。样品中有突变基因，则会出现熔解峰；若没有突变基因，则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针，以便于对NRAS基因突变检测进行内控，有利于提高检测的准确性。
进一步地，内控基因为RPPH基因，即RNA 5’焦磷酸水解酶。内控引物对的序列如SEQ ID No.22及SEQ ID No.23所示。内控探针的序列如SEQ ID No.24。
具体地，如SEQ ID No.22所示的序列为：GCGGATGCCTCCTTT。如SEQ ID No.23所示的序列为：ACCTCACCTCAGACATTGAA。如SEQ ID No.24所示的序列为：AGCTTGGAACAGACTCACGGCCAGCT。其中，如SEQ ID No.22所示的序列为正向引物，如SEQ IDNo.23所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团，内控与第一荧光报告基团及第二荧光报告基团均不同。
进一步地，内控荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，内控荧光报告基因为HEX。内控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测NRAS基因突变的核酸组合物能够用于检测NRAS基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第五实施方式提供一种检测NRAS基因突变的核酸组合物，能够检测NRAS基因突变，检测灵敏度较高。具体地，该检测NRAS基因突变的核酸组合物，包括：序列如SEQ IDNo.17所示的第九正向引物，第九正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13V突变；序列如SEQ ID No.18所示的第五反向引物，第五反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61L突变；序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物；序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针；序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针；其中，第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，第一荧光报告基团与第二荧光报告基团不同。
上述核酸组合物中，第九正向引物对检测NRAS基因的13号密码子的G13V突变具有较高的特异性，第五反向引物对检测NRAS基因的61号密码子的Q61L突变具有较高的特异性，能够分别检测NRAS基因的13号密码子的G13V突变、61号密码子的Q61L，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的NRAS基因的13号密码子的G13V突变、61号密码子的Q61L突变中的一种，灵敏度较高。
具体地，SEQ ID No.17所示的序列为：TGGTGGTTGGAGCAGGA。如SEQ ID No.18所示的序列为：TCATGGCACTGTACTCTTC。如SEQ ID No.5所示的序列为：TATGGTGGGATCATATTCAT。如SEQ ID No.6所示的序列为：ACAAGTGGTTATAGATGGTGAA。如SEQ ID No.7所示的序列为：GACGGTTGGAGCAGGTGGTGTTGGGTC。如SEQ ID No.8所示的序列为：CAACTGTACTCTTCTTGTCCAGCTGTATTTG。
第一荧光报告基因及第二荧光报告基团均选自TXR、HEX及FAM中的一种。第一荧光淬灭基团及第二荧光淬灭基团均选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，第一荧光报告基因为FAM。第一荧光淬灭基团为BHQ1。第二荧光报告基因为TXR。第二荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是，第一荧光报告基团和第二荧光报告基因均不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，第一荧光淬灭基团和第二荧光淬灭基团均不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中，利用特异性ARMS引物扩增NRAS基因常见的突变型，同时荧光探针抑制野生型基因的扩增，起到了富集突变模板的作用，从而提高突变基因的检测灵敏度；另一方面对扩增产物进行熔解分析，荧光探针在未杂交时，荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭，不产生荧光；而处于杂交状态时，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。样品中有突变基因，则会出现熔解峰；若没有突变基因，则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针，以便于对NRAS基因突变检测进行内控，有利于提高检测的准确性。
进一步地，内控基因为RPPH基因，即RNA 5’焦磷酸水解酶。内控引物对的序列如SEQ ID No.22及SEQ ID No.23所示。内控探针的序列如SEQ ID No.24。
具体地，如SEQ ID No.22所示的序列为：GCGGATGCCTCCTTT。如SEQ ID No.23所示的序列为：ACCTCACCTCAGACATTGAA。如SEQ ID No.24所示的序列为：AGCTTGGAACAGACTCACGGCCAGCT。其中，如SEQ ID No.22所示的序列为正向引物，如SEQ IDNo.23所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团，内控与第一荧光报告基团及第二荧光报告基团均不同。
进一步地，内控荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，内控荧光报告基因为HEX。内控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测NRAS基因突变的核酸组合物能够用于检测NRAS基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第六实施方式提供一种检测NRAS基因突变的核酸组合物，能够检测NRAS基因突变，检测灵敏度较高。具体地，该检测NRAS基因突变的核酸组合物，包括：序列如SEQ IDNo.19所示的第十正向引物，第十正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13C突变；序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；序列如SEQ ID No.20所示的第三通用探针。
上述核酸组合物中，第十正向引物对检测NRAS基因的13号密码子的G13C突变有较高的特异性，能够分别检测NRAS基因的13号密码子的G13C突变，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的NRAS基因的13号密码子的G13C突变，灵敏度较高。
具体地，SEQ ID No.19所示的序列为：GGTGGTGGTTGGAGCAG。如SEQ ID No.5所示的序列为：TATGGTGGGATCATATTCAT。如SEQ ID No.20所示的序列为：CAAGTTGGAGCAGGTGGTGTTTTG。
第三通用探针的两端分别连接有第三荧光报告基团和第三荧光淬灭基团。进一步地，第三荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。第三荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，第三荧光报告基因为FAM。第三荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，第三荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，第三荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中，利用特异性ARMS引物扩增NRAS基因常见的突变型，同时荧光探针抑制野生型基因的扩增，起到了富集突变模板的作用，从而提高突变基因的检测灵敏度；另一方面对扩增产物进行熔解分析，荧光探针在未杂交时，荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭，不产生荧光；而处于杂交状态时，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。样品中有突变基因，则会出现熔解峰；若没有突变基因，则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针，以便于对NRAS基因突变检测进行内控，有利于提高检测的准确性。
进一步地，内控基因为RPPH基因，即RNA 5’焦磷酸水解酶。内控引物对的序列如SEQ ID No.22及SEQ ID No.23所示。内控探针的序列如SEQ ID No.24。
具体地，如SEQ ID No.22所示的序列为：GCGGATGCCTCCTTT。如SEQ ID No.23所示的序列为：ACCTCACCTCAGACATTGAA。如SEQ ID No.24所示的序列为：AGCTTGGAACAGACTCACGGCCAGCT。其中，如SEQ ID No.22所示的序列为正向引物，如SEQ IDNo.23所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团，内控与第三荧光报告基团不同。
进一步地，内控荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，内控荧光报告基因为HEX。内控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测NRAS基因突变的核酸组合物能够用于检测NRAS基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第七实施方式提供一种检测NRAS基因突变的核酸组合物，能够检测NRAS基因突变，检测灵敏度较高。具体地，该检测NRAS基因突变的核酸组合物，包括：序列如SEQ IDNo.21所示的第十一正向引物，第十一正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13R突变；序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；序列如SEQ ID No.20所示的第三通用探针。
上述核酸组合物中，第十一正向引物对NRAS基因的13号密码子的G13R突变具有较高的特异性，能够分别检测NRAS基因的13号密码子的G13R突变，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的NRAS基因的13号密码子的G13R突变，灵敏度较高。
具体地，SEQ ID No.21所示的序列为：GTGGTGGTTGGAGCAG。如SEQ ID No.5所示的序列为：TATGGTGGGATCATATTCAT。如SEQ ID No.20所示的序列为：CAAGTTGGAGCAGGTGGTGTTTTG。
第三通用探针的两端分别连接有第三荧光报告基团和第三荧光淬灭基团。进一步地，第三荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。第三荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，第三荧光报告基因为FAM。第三荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，第三荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，第三荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中，利用特异性ARMS引物扩增NRAS基因常见的突变型，同时荧光探针抑制野生型基因的扩增，起到了富集突变模板的作用，从而提高突变基因的检测灵敏度；另一方面对扩增产物进行熔解分析，荧光探针在未杂交时，荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭，不产生荧光；而处于杂交状态时，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。样品中有突变基因，则会出现熔解峰；若没有突变基因，则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针，以便于对NRAS基因突变检测进行内控，有利于提高检测的准确性。
进一步地，内控基因为RPPH基因，即RNA 5’焦磷酸水解酶。内控引物对的序列如SEQ ID No.22及SEQ ID No.23所示。内控探针的序列如SEQ ID No.24。
具体地，如SEQ ID No.22所示的序列为：GCGGATGCCTCCTTT。如SEQ ID No.23所示的序列为：ACCTCACCTCAGACATTGAA。如SEQ ID No.24所示的序列为：AGCTTGGAACAGACTCACGGCCAGCT。其中，如SEQ ID No.22所示的序列为正向引物，如SEQ IDNo.23所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团，内控与第三荧光报告基团不同。
进一步地，内控荧光报告基团选自TXR、HEX及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，内控荧光报告基因为HEX。内控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测NRAS基因突变的核酸组合物能够用于检测NRAS基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究一实施方式还提供一种检测NRAS基因突变的试剂盒，包括上述各实施方式的检测NRAS基因突变的核酸组合物中的至少一种。该检测NRAS基因突变的试剂盒能够较为准确检测NRAS基因突变，检测灵敏度较高。
进一步地，检测NRAS基因突变的试剂盒还包括核酸提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶混合液中的至少一种。
其中，酶混合液例如可以包括酶Ⅰ混合液和酶Ⅱ混合液。酶Ⅰ混合液为不具有5’端到3’端外切酶活性的Taq酶和抗体等混合物。酶Ⅱ混合液为5’端到3’端外切酶活性和抗体等混合物。
检测NRAS基因突变的核酸组合物还包括：还包括质控引物对和质控探针。此种设置能够提高检测准确性。
进一步地，质控引物对的序列如SEQ ID No.25及SEQ ID No.5所示，质控探针的序列如SEQ ID No.7所示。
具体地，SEQ ID No.25所示的序列为：GATTACTGGTTTCCAACAGGTT。SEQ ID No.5所示的序列为：TATGGTGGGATCATATTCAT。SEQ ID No.7所示的序列为：GACGGTTGGAGCAGGTGGTGTTGGGTC。其中，SEQ ID No.31所示的引物为正向引物。SEQ ID No.5所示的引物为反向引物。
质控探针的两端分别连接有质控荧光报告基团和质控荧光淬灭基团。质控荧光报告基团与质控荧光报告基团不同。进一步地，质控荧光报告基因选自CY5及FAM中的一种。质控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，质控荧光报告基因为FAM。质控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，质控荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，质控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测NRAS基因突变的试剂盒能够用于检测NRAS基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究一实施方式还提供一种NRAS基因突变的检测方法，检测灵敏度较低，能够用于NRAS基因突变的非疾病的治疗和诊断的检测，例如用于NRAS基因突变的实验性研究。
具体地，向待测样品中加入上述各实施方式的检测NRAS基因突变的核酸组合物中的至少一种进行PCR扩增反应，根据反应结果进行检测分析。
本研究的NRAS基因突变的检测方法能够非疾病的治疗和诊断的检测NRAS基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1
提供一种检测NRAS基因突变的试剂盒，其试剂盒组成详见表1。
试剂盒包括检测NRAS基因突变的核酸组合物(如表2和表3所示)、dNTPs、PCR反应液、酶混合液、阳性对照品和空白对照品。
其中，酶混合液包括酶Ⅰ混合液和酶Ⅱ混合液。酶Ⅰ混合液为不具有5’端到3’端外切酶活性的Taq酶和抗体等混合物。酶Ⅱ混合液为5’端到3’端外切酶活性和抗体等混合物。其中，Taq酶购于TAKARA生物公司和广州百旺生物技术有限公司，抗体购于TOYOBO公司。
第一管的反应液体系(即Tube1管，用于检测如下突变：G12A、G12D、G12V、Q61H)包括：4mM的MgCl2、10mM的Tris、50mM的KCl、200mg/mL的BSA、0.1mM的dNTPs、0.25μM的G12A-F1、0.25μM的G12D-F18、0.25μM的G12V-F8、2.5μM的N12-R、0.25μM的G12C-P、0.25μM的Q61H-R1、1.25μM的61-F、0.25μM的Q61-PR、0.1μM的RPPH-F5、0.3μM的RPPH-R2、0.1μM的RPPH-P、0.4μL的酶I混合液。总体积为20μL。
第二管的反应液体系(即Tube2管，用于检测如下突变：G12R、G12S、G12C、Q61P)包括：4mM的MgCl2、10mM的Tris、50mM的KCl、200mg/mL的BSA、0.1mM的dNTPs、0.25μM的G12R-F1、0.25μM的G12C-F12、0.25μM的G12S-F11、2.5μM的N12-R、0.5μM的G12C-P、0.1μM的Q61P-R3、1.25μM的61-F、0.25μM的Q61-PR、0.1μM的RPPH-F5、0.3μM的RPPH-R2、0.1μM的RPPH-P、0.4μL的酶Ⅰ混合液。总体积为20μL。
第三管的反应液体系(即Tube3管，用于检测如下突变：G13A、Q61R)包括：4mM的MgCl2、10mM的Tris、50mM的KCl、200mg/mL的BSA、0.1mM的dNTPs、0.25μM的G13A-F20、2.5μM的N12-R、0.1μM的G12C-P、0.25μM的Q61R-R10、1.25μM的61-F、0.1μM的Q61-PR、0.1μM的RPPH-F5、0.3μM的RPPH-R2、0.1μM的RPPH-P、0.4μL酶Ⅰ混合液。总体积为20μL。
第四管的反应液体系(即Tube4管，用于检测如下突变：G13D、Q61K)包括：4mM的MgCl2、10mM的Tris、50mM的KCl、200mg/mL的BSA、0.1mM的dNTPs、0.1μM的G13D-F2、2.5μM的N12-R、0.25μM的G12C-P、0.5μM的Q61K-R8、1.25μM的61-F、0.25μM的Q61-PR、0.1μM的RPPH-F5、0.3μM的RPPH-R2、0.1μM的RPPH-P、0.4μL酶Ⅰ混合液。总体积为20μL。
第五管的反应液体系(即Tube5管，用于检测如下突变：G13V、Q61L)包括：4mM的MgCl2、10mM的Tris、50mM的KCl、200mg/mL的BSA、0.1mM的dNTPs、0.25μM的G13V-F20、2.5μM的N12-R、0.1μM的G12C-P、0.25μM的Q61K-R8、1.25μM的61-F、0.1μM的Q61L-R8、0.1μM的RPPH-F5、0.3μM的RPPH-R2、0.1μM的RPPH-P、0.4μL酶Ⅰ混合液。总体积为20μL。
第六管的反应液体系(即Tube6管，用于检测如下突变：G13C)包括：4mM的MgCl2、10mM的Tris、50mM的KCl、200mg/mL的BSA、0.1mM的dNTPs、0.25μM的G13C-F1、1.25μM的N12-R、0.25μM的G12S-P、0.1μM的RPPH-F5、0.3μM的RPPH-R2、0.1μM的RPPH-P、0.4μL酶Ⅰ混合液。总体积为20μL。
第七管的反应液体系(即Tube7管，用于检测如下突变：G13R)包括：4mM的MgCl2、10mM的Tris、50mM的KCl、200mg/mL的BSA、0.1mM的dNTPs、0.25μM的G13R-F1、2.5μM的N12-R、0.1μM的G12S-P、0.1μM的RPPH-F5、0.3μM的RPPH-R2、0.1μM的RPPH-P、0.4μL酶Ⅰ混合液。总体积为20μL。
第八管的反应液体系(即Tube8管，用于质控)包括：4mM的MgCl2、10mM的Tris、50mM的KCl、200mg/mL的BSA、0.1mM的dNTPs、0.3μL的酶Ⅱ混合液、0.3μM的N12-F、0.3μM的N12-R、0.225μM的G12C-P。总体积为20μL。
表1检测NRAS基因突变的核酸组合物
Figure BDA0002721219960000281
Figure BDA0002721219960000291
表2检测NRAS基因突变的试剂盒的组成
Figure BDA0002721219960000292
Figure BDA0002721219960000301
表3人类NRAS基因第12、13和61密码子上的16种突变
Figure BDA0002721219960000302
Figure BDA0002721219960000311
实施例2
采用实施例1的检测NRAS基因突变的试剂盒的检测限
取人类NRAS基因野生型基因组，人NRAS基因各突变型质粒及TE buffer缓冲液，制备同时含有5ng/μL的人NRAS野生型DNA及含量分别为野生型的10％、1％和0.1％的人NRAS各突变型基因质粒，记录阳性检出率。结果显示，我们的试剂盒能检测到5ng野生型背景下0.1％突变变DNA。
具体实施步骤如下：
1、待测样本的提取
组织样本使用QIAGEN的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit进行提取，血浆样本使用QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit进行提取。提取过程应严格按照说明书要求进行。组织样本提取后的核酸稀释为浓度2～100ng/μL，血浆提取后的核酸浓度应不少于2ng/μL，纯度都应满足A260/A280比值范围在1.6～2.3之间。模板可直接用于后续实验或置于-20℃冰箱保存备用，避免反复冻融。
2、试剂配置
(1)根据所测的待检样本的基因组DNA浓度，用纯化水进行稀释至推荐的浓度为5ng/μL，放置冰上待用。
(2)根据检测样品数量及实验设计，取对应检测需要的8联管、NRAS质控PCR反应液、NRAS-酶Ⅰ混合液、NRAS-酶Ⅱ混合液、NRAS阳性对照、超纯水一起放置冰上或4℃冰箱里。
(3)将8联管、NRAS阳性对照及样本混匀后微离心，放置冰上；DNA聚合酶和纯化水微离心后置冰上；按照表4配置混合液mixA，按照表5的反应体系进行配置混合液mix B，每个样品、阳性对照及NTC各配制一个混合液mix A和一个混合液mix B。
表4混合液mixA配液组份表
组分 1反应(μL) 倍数(7.2)
NRAS-酶Ⅰ混合液 0.4 2.88μL
超纯水 0.6 4.32μL
样品DNA/阳性对照/超纯水 4 28.8μL
总体积 5 36.0μL
表5混合液mixB配液组份表
组分 1反应(μL) N反应(μL)
NRAS-酶Ⅱ混合液 0.3 0.3×NμL
NRAS质控PCR反应液 15.7 15.7×NμL
总体积 16 16×NμL
(4)将8联管放入PCR仪器中，按照加样布局排列，推荐排列布局详见表6。
表6 PCR仪96孔板的布局
Figure BDA0002721219960000321
3、PCR扩增及荧光检测
将各反应管按照一定顺序放入荧光定量PCR仪上，按照表7设置反应程序：
表7 Light Cycler 480荧光定量PCR仪上的反应程序
Figure BDA0002721219960000331
4、检验结果的解释
(1)试剂盒有效性情况判断：
(a)空白对照在熔解分析后，FAM、HEX和CY5通道无明显熔解峰；若分析后出现明显熔解峰，可能为试剂受到污染或操作过程中污染，请排除污染源后重新检测。
(b)阳性对照管在熔解曲线分析后：Tube1的FAM通道熔解峰Tm值在65±1℃范围内，CY5通道的熔解峰Tm值在65±1℃范围内，HEX通道的熔解峰在72±1℃范围内；Tube2的FAM通道的熔解峰Tm值在65±1℃范围内，CY5通道的熔解峰Tm值在58±1℃范围内，HEX通道的熔解峰在72±1℃范围内；Tube3的FAM通道的熔解峰Tm值在61±1℃范围内，CY5通道的熔解峰Tm值在64±1℃范围内，HEX通道的熔解峰在72±1℃范围内；Tube4的FAM通道的熔解峰Tm值在59±1℃范围内，CY5通道的熔解峰Tm值在60±1℃范围内，HEX通道的熔解峰在72±1℃范围内；Tube5的FAM通道的熔解峰Tm值在60±1℃范围内，CY5通道的熔解峰Tm值在60±1℃范围内，HEX通道的熔解峰在72±1℃范围内；Tube6的FAM通道的熔解峰Tm值在57±1℃范围内，HEX通道的熔解峰的Tm值在72±1℃范围内；Tube7的FAM通道的熔解峰Tm值在58±1℃范围内，HEX通道的熔解峰在72±1℃范围内。
(2)样本有效性的判断：
(a)质控PCR反应液：FAM通道Ct值≥26.0，说明所加入的样本基因组DNA含量过低，只有突变DNA含量较高的样本可以检测出突变类型，也可能为DNA样本中存在着PCR抑制剂，建议重新制备样本或者增加使用量进行检测；
(b)质控PCR反应液：FAM通道23≤Ct值<26，说明所加入的样本基因组DNA量适中；
(c)质控PCR反应液：FAM通道Ct值<23，说明所加入样本基因组DNA过量，建议稀释后重新检测；
(d)质控PCR反应液管用于判断样本的有效性，通过扩增曲线判定样本的情况。
(3)检测结果的判定：若满足(1)和(2)要求，表明此时检测成功，对样本管进行分析。样本分析的标准结合下表8和附加情况进行判断分析。
表8结果判断标准
Figure BDA0002721219960000341
Figure BDA0002721219960000351
(1)若Tube1管内FAM通道出现熔解峰，则G12A、G12D和G12V有一个突变，但不能区分具体是哪种突变。
(2)若Tube2管内FAM通道出现熔解峰，则G12C、G12R和G12S有一个突变，但不能区分具体是哪种突变。
检测结果详见图1～图7。图1为Tube1管中G12A、G12D、G12V和Q61P突变位点检测能力测试图。图2为Tube2管中G12R、G12S、G12C和Q61P突变位点检测能力测试图。图3为Tube3管中G13A和Q61R突变位点检测能力测试图。图4为Tube4管中G13D和Q61K突变位点检测能力测试图。图5为Tube5管中G3V和Q61L突变位点检测能力测试图。图6为Tube6管中G3C突变位点检测能力测试图。图7为Tube7管中G13R突变位点检测能力测试图。图1～图7中，横坐标为温度，单位为℃，纵坐标的“-dF/dT”表示荧光强度的变化对温度变化的求导。
从图1～图7可以看出，上述检测NRAS基因突变的试剂盒，能够检测出5ng野生型背景下突变比例为0.1％的上述16种NRAS基因突变，检测灵敏度和特异性较高。
上述检测NRAS基因突变的试剂盒能够用于检测NRAS基因第12、13和61密码子上的16种突变，检测范围广，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测，整个过程闭管操作，简便快捷，同时大大降低污染几率，特异性强，灵敏度高达千分之一，有助于高效筛选恶性肿瘤免疫治疗和靶向治疗的检测对象，为临床用药提供理论依据。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 苏州中科先进技术研究院有限公司
<120> 检测NRAS基因突变的核酸组合物及其试剂盒
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaactggtgg tggttggagc 20
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggtggtggt tggaaca 17
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctggtggtgg ttggagaa 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcatggcact gtactctt 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tatggtggga tcatattcat 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acaagtggtt atagatggtg aa 22
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gacggttgga gcaggtggtg ttgggtc 27
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caactgtact cttcttgtcc agctgtattt g 31
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctggtggtgg ttggagaa 18
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actggtggtg gttggatc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctggtggtgg ttggagga 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcatggcact gtactcttg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggtggttgg agcagga 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcatggcact gtactcttc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tggtggttgg agcaggta 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catggcactg tactcttct 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggtggttgg agcagga 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcatggcact gtactcttc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggtggtggtt ggagcag 17
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caagttggag caggtggtgt tttg 24
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<211> 16
<212> DNA
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gtggtggttg gagcag 16
<210> 22
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcggatgcct ccttt 15
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acctcacctc agacattgaa 20
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agcttggaac agactcacgg ccagct 26
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gattactggt ttccaacagg tt 22

Claims (11)

1.一种检测NRAS基因突变的核酸组合物，其特征在于，包括：
序列如SEQ ID No.1所示的第一正向引物，所述第一正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12A突变；
序列如SEQ ID No.2所示的第二正向引物，所述第二正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12D突变；
序列如SEQ ID No.3所示的第三正向引物，所述第三正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12V突变；
序列如SEQ ID No.4所示的第一反向引物，所述第一反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61H突变；
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；
序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物；
序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针；及
序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针；
其中，所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
2.一种检测NRAS基因突变的核酸组合物，其特征在于，包括：
序列如SEQ ID No.9所示的第四正向引物，所述第四正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12R突变；
序列如SEQ ID No.10所示的第五正向引物，所述第五正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12C突变；
序列如SEQ ID No.11所示的第六正向引物，所述第六正向引物用于检测NRAS基因的12号密码子的G12S突变；
序列如SEQ ID No.12所示的第二反向引物，所述第二反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61P突变；
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；
序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物；
序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针；及
序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针；
其中，所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
3.一种检测NRAS基因突变的核酸组合物，其特征在于，包括：
序列如SEQ ID No.13所示的第七正向引物，所述第七正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13A突变；
序列如SEQ ID No.14所示的第三反向引物，所述第三反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61R突变；
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；
序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物；
序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针；及
序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针；
其中，所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
4.一种检测NRAS基因突变的核酸组合物，其特征在于，包括：
序列如SEQ ID No.15所示的第八正向引物，所述第八正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13D突变；
序列如SEQ ID No.16所示的第四反向引物，所述第四反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61K突变；
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；
序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物；
序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针；及
序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针；
其中，所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
5.一种检测NRAS基因突变的核酸组合物，其特征在于，包括：
序列如SEQ ID No.17所示的第九正向引物，所述第九正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13V突变；
序列如SEQ ID No.18所示的第五反向引物，所述第五反向引物用于检测NRAS基因的61号密码子的Q61L突变；
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；
序列如SEQ ID No.6所示的第一通用正向引物；
序列如SEQ ID No.7所示的第一通用探针；及
序列如SEQ ID No.8所示的第二通用探针；
其中，所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，所述第一荧光报告基团与所述第二荧光报告基团不同。
6.一种检测NRAS基因突变的核酸组合物，其特征在于，包括：
序列如SEQ ID No.19所示的第十正向引物，所述第十正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13C突变；
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；
序列如SEQ ID No.20所示的第三通用探针。
7.一种检测NRAS基因突变的核酸组合物，其特征在于，包括：
序列如SEQ ID No.21所示的第十一正向引物，所述第十一正向引物用于检测NRAS基因的13号密码子的G13R突变；
序列如SEQ ID No.5所示的第一通用反向引物；
序列如SEQ ID No.20所示的第三通用探针。
8.一种检测NRAS基因突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～7任一项所述的检测NRAS基因突变的核酸组合物。
9.根据权利要求8所述的检测NRAS基因突变的试剂盒，其特征在于，还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针；
进一步地，所述内控基因为RPPH基因，所述内控引物对的序列如SEQ ID No.22及SEQID No.23所示，所述内控探针的序列如SEQ ID No.24。
10.根据权利要求8所述的检测NRAS基因突变的试剂盒，其特征在于，还包括：还包括质控引物对和质控探针；
进一步地，所述质控引物对的序列如SEQ ID No.25及SEQ ID No.5所示，所述质控探针的序列如SEQ ID No.7所示。
11.根据权利要求8～10任一项所述的检测NRAS基因突变的试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶混合液中的至少一种。
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