CN110295218B

CN110295218B - 量化靶基因的突变型等位基因负担的方法

Info

Publication number: CN110295218B
Application number: CN201910219083.6A
Authority: CN
Inventors: 陈志丞; 许家祯
Original assignee: Chang Gung Memorial Hospital
Current assignee: Chang Gung Memorial Hospital
Priority date: 2018-03-22
Filing date: 2019-03-21
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2039-03-21
Also published as: TWI780315B; US11414698B2; CN110295218A; TW201940702A; US20190292586A1

Abstract

本发明涉及量化在体内的靶基因的突变型等位基因负担的方法及试剂盒。本发明也揭示核酸试剂供应用于制备用来量化在体内的靶基因的突变型等位基因负担的试剂盒的用途，该核酸试剂包括：第一质粒、第二质粒以及反应混合物，其中，使用该试剂盒来量化该靶基因的突变型等位基因负担的步骤包括：提供包括突变型等位基因序列以及内部对照序列的第一质粒，以及包括野生型等位基因序列以及该内部对照序列的第二质粒，以及使该个体的DNA进行定量聚合酶链式反应来测量该靶基因的突变型等位基因表达水平，依据通过该第一与第二质粒的连续稀释所建立的该靶基因的突变型等位基因负担的标准曲线来推定在该个体内的靶基因的突变型等位基因负担。

Description

量化靶基因的突变型等位基因负担的方法

【技术领域】

本发明是有关于一种通过使用重组型质粒对(recombinant plasmid pair)作为标准品(standard)来量化靶基因的突变型等位基因负担(mutant allele burden)的方法。

【背景技术】

典型的骨髓增生性肿瘤(myeloproliferative neoplasms,MPNs)是多潜能性造血干细胞疾病(multipotent hematopoietic stem cell disorders)，其特征在于各种血球的过量生成。MPNs包括三种主要的临床实体(clinical entities)，亦即，真性红血球增多症(polycythemia vera,PV)、原发性血小板增多症(essential thrombocythemia,ET)以及原发性骨髓纤维化(primary myelofibrosis,PMF)。构成世界卫生组织(World HealthOrganization,WHO)分类的诊断规范(diagnostic criteria)的MPNs的遗传背景的一个特点是MPN-限制的驱动突变(MPN-restricted driver mutations)，包括在詹纳斯氏激酶2(Janus kinase 2,JAK2)、钙网伴护蛋白(calreticulin,CALR)以及骨髓增生性白血病病毒(myeloproliferative leukemia virus,MPL)中的那些。在互斥的驱动基因(mutuallyexclusive driver genes)中的任一突变会导致下游的信息级联(signaling cascade)的持续活化，其继而导致造血前驱细胞(hematopoietic precursor cell)的株落增生(clonal proliferation)以及最终分化的、完全地功能性血球的过量生成。

关于典型的MPNs，在JAK2中的突变包括JAK2 V617F热点突变(hotspot mutation)以及外显子12突变(exon 12mutations)。特别地，JAK2 V617F的等位基因负担(alleleburden)在MPNs中具有重要的病理学与临床意义。先前的研究已经证实：在小鼠模型中，JAK2 V617F同型接合性(homozygosity)能驱动表现型(phenotypic)自ET转换至PV，并且如同在临床研究中所见，即使在一个特定的MPN亚型中，在PV中的等位基因负担高于ET所具者是与独特的疾病表现型相关的。例如，具有较高的JAK2 V617F的等位基因负担的MPN病患更可能遭受严重的血栓事件(thrombotic events)。这些研究强调了精密的测定与在患病个体中JAK2V617F突变型等位基因负担的量化的重要性。

大量的诊断技术已经被应用于MPNs中的JAK2 V617F突变的检测，包括直接测序、焦磷酸测序(pyrosequencing)、变性高效能液相层析法(denaturing high performanceliquid chromatography)、限制酶分解(restriction enzyme digestion)、熔化曲线分析(melting curve analysis)、扩增-受阻突变系统(amplification-refractory mutationsystem)，以及等位基因-特异性聚合酶链式反应(allele-specific polymerase chainreaction,AS-PCR)。在这些诊断技术中，AS-PCR似乎是最常被使用的方法，并且容许低至1％的等位基因负担的检测；然而，所获得的结果通常是含糊的。已经有投入很大的努力来改进检测与定量JAK2 V617F突变的准确性，例如等位基因-特异性环-介导恒温扩增法(allele-specific loop-mediated isothermal amplification)、在一定量PCR(quantitative PCR,q-PCR)反应中添加野生型JAK2阻断剂[非-可延展的双去氧寡核苷酸(non-extendible dideoxy oligonucleotide)、锁核酸(locked nucleic acid)，以及肽核酸(peptide nucleic acid)中的任一者]来将扩增限制为突变株-特异性(mutant-specific)，以及限制性片段巢式AS-PCR(restriction fragment nested AS-PCR)。不幸地，一项多中心研究报导：当盲样(blinded samples)通过某些最专业的健康机构而被检测时，JAK2 V617F突变型等位基因负担的定量结果中存在显著的差异，其描述了使用明确、准确的标准来改善JAK2定量分析的重要性。虽然来自于JAK2-突变的UKE-1与HEL细胞的DNA在JAK2 V617F突变的量化中常被用于标准曲线的建立，两种细胞都不被认为是理想的，因为HEL细胞带有多个JAK2复本，以及UKE-1细胞会在活体外培养期间随着JAK2复本的增加而经历株落进化(clonal evolution)，其可能导致对JAK2 V617F突变型等位基因负担的低估。

因此，对于低JAK2 V617F突变型等位基因负担的精准的量化以及提升检测的灵敏度仍然存在有一增加的需求。

【发明内容】

于是，在第一个方面，本发明提供一种量化在体内的靶基因的突变型等位基因负担(mutant allele burden)的试剂盒，其包含有下列核酸试剂：反应混合物(reactionmixture)，其含有(i)用于检测位于该靶基因的第一区域的突变型等位基因序列的突变型等位基因-特异性引物对(mutant allele-specific primer pair)与第一可检测的探针(first detectable probe)，以及(ii)用于检测位于该靶基因的第二区域的内部对照序列(internal control sequence)的内部对照序列-特异性引物对(internal controlsequence-specific primer pair)与第二可检测的探针(second detectable probe)，该第二区域是不同于该第一区域，该反应混合物用来对得自于该个体的基因组DNA进行第一定量聚合酶链式反应，以测量该靶基因的突变型等位基因表达水平，以及多个标准稀释液(standard diluents)，其是通过对第一质粒进行使用第二质粒的连续稀释所形成，所述标准稀释液用来进行使用该反应混合物的第二定量聚合酶链式反应，以建立该靶基因的突变型等位基因负担的标准曲线，该标准曲线用来与所测得的靶基因的突变型等位基因表达水平进行比对，以推定在该个体内的靶基因的突变型等位基因负担，其中，该第一质粒包括该位于第一区域的突变型等位基因序列以及该位于第二区域的内部对照序列，该第二质粒包括位于该第一区域的野生型等位基因序列(wild-type allele sequence)以及该位于第二区域的内部对照序列。

在第二个方面，本发明提供核酸试剂供应用于制备用来量化在体内的靶基因的突变型等位基因负担(mutant allele burden)的试剂盒的用途，其特征在于：该核酸试剂包括：第一质粒，其包括位于该靶基因的第一区域的突变型等位基因序列(mutant allelesequence)以及位于该靶基因的第二区域的内部对照序列(internal control sequence)，该第二区域是不同于该第一区域；第二质粒，其包括位于该靶基因的第一区域的野生型等位基因序列(wild-type allele sequence)以及该内部对照序列；反应混合物(reactionmixture)，其含有(i)用于检测该突变型等位基因序列的突变型等位基因-特异性引物对(mutant allele-specific primer pair)与第一可检测的探针(first detectableprobe)，以及(ii)用于检测该内部对照序列的内部对照序列-特异性引物对(internalcontrol sequence-specific primer pair)与第二可检测的探针(second detectableprobe)；其中，使用该试剂盒来量化该靶基因的突变型等位基因负担的步骤包括：使得自于该个体的基因组DNA进行使用该反应混合物的第一定量聚合酶链式反应，以测量该靶基因的突变型等位基因表达水平；使通过使用该第二质粒来连续稀释所形成的第一质粒的多个标准稀释液(standard diluents)进行使用该反应混合物的第二定量聚合酶链式反应，以建立该靶基因的突变型等位基因负担的标准曲线；以及使所测得的靶基因的突变型等位基因表达水平与该标准曲线进行比对，以推定在该个体内的靶基因的突变型等位基因负担。

本发明所述量化在体内的靶基因的突变型等位基因负担的试剂盒或其用途，该突变型等位基因序列具有实质上相同于该野生型等位基因序列的核苷酸长度，以及该第一质粒具有实质上相同于该第二质粒的核苷酸长度。

本发明所述量化在体内的靶基因的突变型等位基因负担的试剂盒或其用途，用于该第一与第二定量聚合酶链式反应各者中的反应混合物进一步包括阻断剂(blockingagent)，其杂交至该靶基因的野生型等位基因序列并且抑制该突变型等位基因-特异性引物对中的至少一个引物结合至该靶基因的野生型等位基因序列。

本发明所述量化在体内的靶基因的突变型等位基因负担的试剂盒或其用途，该阻断剂是在3’-端具有非-可延伸的部分(non-extendable moiety)的寡核苷酸，该非-可延伸的部分选自由下列所构成的群组：肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)、锁核酸(lockednucleic acid,LNA)、拉链核酸(zip nucleic acid,ZNA)、桥核酸(bridged nucleic acid,BNA)、苏糖核酸(threose nucleic acid,TNA)、三唑核酸(triazole nucleic acid)、氨基-C7(amino-C7)、非-可延伸的核苷酸(non-extendable nucleotide)、小沟结合子(minorgroove binder,MGB)，以及它们的组合。

本发明所述量化在体内的靶基因的突变型等位基因负担的试剂盒或其用途，该阻断剂是在其3’-端具有二-去氧核苷酸三磷酸(di-deoxynucleotide triphosphates,ddNTP)的寡核苷酸。

本发明所述量化在体内的靶基因的突变型等位基因负担的试剂盒或其用途，该靶基因是疾病-关联性基因(disease-associated gene)。

本发明所述量化在体内的靶基因的突变型等位基因负担的试剂盒或其用途，该疾病-关联性基因选自由下列所构成的群组：癌症-关联性基因(cancer-associated genes)、与遗传性疾病(hereditary disease)有关联的基因，以及它们的组合。

本发明所述量化在体内的靶基因的突变型等位基因负担的试剂盒或其用途，该靶基因选自由下列所构成的群组：JAK2、K-Ras、B-Raf、EGFR，以及它们的组合。

本发明所述量化在体内的靶基因的突变型等位基因负担的试剂盒或其用途，该靶基因是JAK2。

本发明所述量化在体内的靶基因的突变型等位基因负担的试剂盒或其用途，该突变型等位基因序列是JAK2 V617F。

【附图说明】

下面结合附图及实施例来对本发明进行详细说明，所以本发明在上述以及其他目的与特征，可通过参照下文的描述、随文检附的权利要求书和伴随的图式而变得更为明显，附图中：

图1显示重组型质粒JAK2_WT_Ctrl_yT&A以及JAK2_V617F_Ctrl_yT&A的架构图，其中AmpR代表氨苄青霉素抗性基因(ampicillin resistance gene)，JAK2Ref.代表作为内部对照组的部分的JAK2外显子21，JAK2 WT/V617F代表野生型或突变型JAK2外显子14，以及JAK2 c.1849G>T代表JAK2 V617F突变位置；

图2显示由Qiagen RGQ PCR试剂盒以及Bio-Rad QX200 ddPCR试剂盒来测量的重组型质粒混合物的JAK2 V617F突变型等位基因负担(allele burdens,AB)的观测值与期望值之间的相关图；

图3显示在有或没有(无)寡核苷酸阻断剂(oligonucleotide blocker)的情况下，具有不同的JAK2 V617F突变型等位基因负担的重组型质粒混合物(recombinant plasmidmistures)的扩增曲线(amplification cureves)，其中JAK2 V617F突变以及JAK2外显子21分别由荧光素-放射探针[fluorescein(FAM)-emitting probe]以及六氯-荧光素-放射探针[hexachloro-fluorescein(HEX)-emitting probe]所检测；

图4显示用于量化JAK2 V617F突变型等位基因负担的在有或没有(无)寡核苷酸阻断剂的情况下所建立的以质粒为基础的标准曲线(plasmid-based standard curves)；

图5显示使用两个不同的批次的细胞作为标准制剂(standard preparation)的用于量化JAK2 V617F突变型等位基因负担的以细胞为基础的标准曲线(cell-basedstandard curves)，其中HEL-HCK表示通过使用HEL细胞作为标准品并且以HCK基因作为内部对照而被建立的标准曲线，以及UKE-1-HCK表示通过使用UKE-1细胞作为标准品并且以HCK基因作为内部对照而被建立的标准曲线；

图6显示依据以质粒为基础的标准曲线所测得的32位MPN病患中的JAK2V617F突变型等位基因负担以及依据以细胞为基础的标准曲线HEL-HCK与UKE-1-HCK所测得者之间的相关图(correlation plots)；

图7显示由依据以质粒为基础的标准曲线的qCAST-双重PCR分析(qCAST-DuplexPCR)以及由Qiagen RGQ PCR试剂盒所测得的JAK2 V617F突变型等位基因负担与其期望值的比较；以及

图8显示由依据以质粒为基础的标准曲线的qCAST-双重PCR分析所测得的MPN病患以及健康成年个体中JAK2 V617F突变型等位基因负担以及由多重PCR扩增子测序法、ABICAST PCR试剂盒、Qiagen RGQ PCR试剂盒与Bio-Rad QX200 ddPCR试剂盒中任一者所测得者之间的相关图。

【具体实施方式】

为了这本说明书的目的，将被清楚地了解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限于”，以及文字“包括(comprises)”具有对应的意义。

除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人员所共同了解的意义。熟悉本技艺者会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。为表清楚，下面的界定被使用于本文中。

如此处所使用的，“核酸(nucleic acid)”、“核酸序列(nucleic acid sequence)”以及“核酸片段(nucleic acid fragment)”等术语意指呈单链或双链形式的去氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列，且包含已知的天然存在的核苷酸(naturally occurringnucleotides)或人造化学仿效物(aritificial chemical mimics)。如本文中所用的，“核酸”此术语可与“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸(oligo-nucleotide)”和“聚核苷酸(polynucleotide)”交换使用。

除非另有指明，核酸序列除了于本文中所揭示的特测序列外，亦涵盖其互补序列(complementary sequences)，以及它们的守恒性类似物(conservative analogs)、相关的天然存在的结构变异体和/或合成的非天然存在的类似物。例如具有简并性密码子取代(degenerative codon substitution)以及守恒性删除(deletion)、插入(insertion)、取代(substitution)或加入(addition)的同源性序列(homologous sequences)。特别地，简并性密码子取代可以经由，例如，在核酸序列中的一或多个被选定的密码子的第3位置处替换以其他的核苷酸残基而被产生。

如此处所使用的，术语“等位基因(allele)”通常意指在DNA节段[例如，在同源染色体(homologous chromosomes)上]中的相同的实体基因座(physical locus)上的多种的DNA序列(alternative DNA sequences)。等位基因可以意指在单一细胞(single cell)或生物体(organism)中的同源染色体上所发现的在相同实体基因座之间有所差异的DNA序列，或者在多个细胞或生物体中的相同实体基因座上有所差异的DNA序列[“等位基因变异体(allelic variant)”]。在某些具体例中，等位基因可以对应于在特定物理基因座上的单个核苷酸差异。在其他具体例中，等位基因可以对应于核苷酸(单个或多个)的插入或删除。

如此处所使用的，术语“野生型(wild-type)”意指基因或等位基因具有当分离自天然存在的来源时的基因或等位基因的特性。野生型基因或野生型等位基因是在族群中最常被观察到的，并且被任意地指定为该基因或等位基因的“正常(normal)”或“野生型(wild-type)”形式。

如此处所使用的，术语“突变体(mutant)”或“突变(mutated)”意指当相较于野生型基因或等位基因时，在序列上显示修饰的基因或等位基因。术语“突变(mutation)”意指正常守恒的核酸序列(normally conserved nucleic acid sequence)在核苷酸序列上的变化，其导致有别于正常(未改变的)或野生型序列的突变的形成。突变通常可被区分成两种常见的类型，即，碱基对取代(base-pair substitutions)[例如，单核苷酸取代(singlenucleotide substitutions)]以及框移突变(frame-shift mutations)。后者需要一至数个核苷酸对(nucleotide pairs)的插入或删除。

如此处所使用的，术语“等位基因负担(allele burden)”或“突变型等位基因负担(mutant allele burden)”意指突变等位基因相对于在，例如造血细胞(hematopoieticcells)中的总等位基因(亦即突变型与野生型等位基因的组合)的比率。

如此处所使用的，术语“引物(primer)”意指单链-寡核苷酸(single-strandedoligonucleotide)，其能够在适当的条件下、在适当的缓冲液中以及在合适的温度下作为模板-指引的DNA合成(template-directed DNA synthesis)的起始点。引物的合适长度取决于该引物的预期用途，但通常落在15至30个核苷酸的范围内。引物序列不需要与模板完全互补，但必须足以与模板互补以进行杂交。

如此处所使用的，术语“引物对(primer pair)”意指一组引物，其包括能够杂交至DNA序列的5’端来进行扩增的5’上游引物，以及能够杂交至该序列的3’端的互补序列来进行扩增的3’下游引物。

如此处所使用的，术语“等位基因-特异性引物(allele-specific primer)”意指能够杂交至靶序列的一种以上的变异体的引物，但由于仅在其中一种变异体的存在下，该引物能在合适的条件下通过核酸聚合酶(nucleic acid polymerase)来有效地延伸。而在其他变异体的存在下，延伸反应是效率较低的、无效率的(inefficient)或无法检测的(undetectable)，而能够区别靶序列的不同变异体。

如此处所使用的，术语“探针(probe)”意指可与靶核酸中的序列杂交并且通常被可检测地标记的寡核苷酸。探针可以具有修饰，诸如，一种使探针无法通过核酸聚合酶延伸的3’端修饰，以及一或多种发色团(chromophores)。具有相同序列的寡核苷酸可以在一次分析中作为引物，以及在不同分析中作为探针。

如此处所使用的，术语“靶基因(target gene)”、“靶序列(target sequence)”、“靶核酸(target nucleic acid)”或“靶DNA(target DNA)”意指核酸序列的一部分，其可被扩增(amplified)、被检测(detected)或这两者。

“病患(patient)”、“个体(subject)”和“个体(individual)”等术语在本文中可被相互交换使用，并且意指待处理的哺乳动物(例如，人)和/或从中获得的生物样品(biological sample)。

如此处所使用的，术语“样品(sample)”或“临床样品(clinical sample)”意指含有或推定含有核酸的任何组成物。这包括从个体分离出的组织或液体样品，例如，皮肤(skin)、血浆(plasma)、血清(serum)、脊髓液(spinal fluid)、淋巴液(lymph fluid)、滑液(synovial fluid)、尿液(urine)、泪液(tears)、血球(blood cells)、器官(organs)与肿瘤(tumors)，以及从取自于个体的细胞所建立的体外培养(in vitro cultures)的样品，包括福尔马林-固定的石蜡包埋组织(formalin-fixed paraffin embedded tissue,FFPET)以及从中分离出的核酸。

如此处所使用的，术语“定量PCR(quantitative PCR)”或简称“q-PCR”是基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)所给定的实验室技术的定义，其被用来扩增并同时地检测或定量靶核酸分子(例如，DNA分子)。相较于反应产物(reaction product)在扩增反应结束后被检测的标准PCR，q-PCR的关键特征是：扩增反应期间的核酸分子(例如，DNA分子或DNA片段)在反应进行中“即时(real-time)”地被检测，因此，q-PCR的替代名称为“即时聚合酶链式反应(real-time PCR)”。被扩增出的DNA分子通过非-特异性荧光染料嵌入(intercalation)任一双链DNA或者具有被标记以荧光报道子[例如，以荧光素-为基础的染料(fluorescein-based dyes)，诸如FAM、HEX、2’-氯-7’-苯基-1,4-二氯-6-羧基-荧光素(2’-chloro-7’phenyl-1,4-dichloro-6-carboxy-fluorescein,VIC)、四氯荧光素(tetrachlorofluorescein,TET)以及6-羧基-4’,5’-二氯2’,7’-二甲氧基荧光素(6-carboxy-4’,5’-dichloro-2’,7’-dimethoxyfluorescein,JOE)，以及以玫瑰红-为基础的染料(rhodamine-based dyes)，诸如6-羧基-X-玫瑰红(6-carboxy-X-rhodamine,ROX)、四甲基玫瑰红(tetramethylrhodamine,TAMRA)以及磺酰罗丹明101磺酰氯/德州红(sulforhodamine 101acid chloride/Texas Red)]的寡核苷酸的序列-特异性DNA探针(仅在该探针与其互补的靶序列杂交后才可进行检测)而被即时检测。已知的是：当用于检测不同的DNA分子的两种DNA探针被同时地使用在q-PCR分析中，标记在所述DNA探针上的荧光报道子应彼此不同。在扩增反应期间所产生的荧光信号通过适当的光学检测系统而被检测，并且自该信号通过背景阈值(background threshold)的时刻被追踪直到该反应达致平稳期(plateau)。该靶序列的拷贝数可以使用相对或绝对定量法来估算，通常通过分析所得到的扩增曲线(亦被知晓为标准曲线)的形状，或通过当该荧光信号上升至超过循环阈值(cycle threshold value)(通常称为C_t值)时来测定。在相对定量法中，在给定的样品中所估算的靶核酸水平是使用C_t或标准曲线分析而被表示为相对于在另一参考样品中的相同靶所得到的数值，举例来说，未经处理的对照样品。相对地，在绝对定量法中，使用标准曲线来呈现q-PCR信号与加载的拷贝数的关联性，或可以依据数字PCR方法而被计算。这些以及其他的q-PCR定量法是本领域普通技术人员所熟知的且它们的计算方式可以依据给定的用途以及q-PCR系统而有所不同。

如此处所使用的，术语“C_t”或“C_t值”意指循环阈值(cycle threshold)并且表示q-PCR扩增反应分析的循环数，其中来自报道子或探针的荧光信号表示扩增产物(amplicon)生成首次超过背景值(background level)而成为可检测的。在某些具体例中，该C_t是q-PCR扩增反应中变成指数期(exponential phase)的循环数。在某些具体例中，在起始材料(starting material)中的靶DNA的量越多，荧光信号的显著增加则越快出现，并产生较低的C_t。

如此处所使用的，术语“ΔC_t”、“delta C_t”或“dC_t”意指在两种不同的样品或反应之间，PCR的信号通过固定阈值时数值循环数(numerical cycle number)的差异。在某些具体例中，ΔC_t是在两种不同的样品或反应之间，PCR的指数性扩增(exponentialamplification)被达致时数值循环数的差异。

本发明提供一种量化在体内的靶基因的突变型等位基因负担(mutant alleleburden)的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含有下列核酸试剂：

反应混合物(reaction mixture)，其含有(i)用于检测位于该靶基因的第一区域的突变型等位基因序列(mutant allele sequence)的突变型等位基因-特异性引物对(mutant allele-specific primer pair)与第一可检测的探针(first detectableprobe)，以及(ii)用于检测位于该靶基因的第二区域的内部对照序列(internal controlsequence)的内部对照序列-特异性引物对(internal control sequence-specificprimer pair)与第二可检测的探针(second detectable probe)，该第二区域不同于该第一区域，该反应混合物用来对得自于该个体的基因组DNA进行第一定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction,q-PCR)，以测量该靶基因的突变型等位基因表达水平，以及

多个标准稀释液(standard diluents)，其通过对第一质粒进行使用第二质粒的连续稀释所形成，所述标准稀释液用来进行使用该反应混合物的第二定量聚合酶链式反应，以建立该靶基因的突变型等位基因负担的标准曲线，该标准曲线用来与所测得的靶基因的突变型等位基因表达水平进行比对，以推定在该个体内的靶基因的突变型等位基因负担，

其中，该第一质粒包括该位于第一区域的突变型等位基因序列以及该位于第二区域的内部对照序列，该第二质粒包括位于该第一区域的野生型等位基因序列(wild-typeallele sequence)以及该位于第二区域的内部对照序列。

本发明又提供核酸试剂供应用于制备用来量化在体内的靶基因的突变型等位基因负担的试剂盒的用途，其特征在于：该核酸试剂包括：

第一质粒，其包括位于该靶基因的第一区域的突变型等位基因序列以及位于该靶基因的第二区域的内部对照序列，该第二区域不同于该第一区域；

第二质粒，其包括位于该靶基因的第一区域的野生型等位基因序列以及该内部对照序列；

反应混合物，其含有(i)用于检测该突变型等位基因序列的突变型等位基因-特异性引物对与第一可检测的探针，以及(ii)用于检测该内部对照序列的内部对照序列-特异性引物对与第二可检测的探针；

其中，使用该试剂盒来量化该靶基因的突变型等位基因负担的步骤包括：

使得自于该个体的基因组DNA进行使用该反应混合物的第一定量聚合酶链式反应，以测量该靶基因的突变型等位基因表达水平；

使通过使用该第二质粒来连续稀释所形成的第一质粒的多个标准稀释液进行使用该反应混合物的第二定量聚合酶链式反应，以建立该靶基因的突变型等位基因负担的标准曲线；以及

使所测得的靶基因的突变型等位基因表达水平与该标准曲线进行比对，以推定在该个体内的靶基因的突变型等位基因负担。

本发明另外又提供一种量化在体内的靶基因的突变型等位基因负担的方法，其包含有：

提供第一质粒，其包括位于该靶基因的第一区域的突变型等位基因序列以及位于该靶基因的第二区域的内部对照序列，该第二区域不同于该第一区域；

提供第二质粒，其包括位于该靶基因的第一区域的野生型等位基因序列以及该内部对照序列；

使得自于该个体的基因组DNA进行使用反应混合物的第一定量聚合酶链式反应，以测量该靶基因的突变型等位基因表达水平，该反应混合物含有(i)用于检测该突变型等位基因序列的突变型等位基因-特异性引物对与第一可检测的探针，以及(ii)用于检测该内部对照序列的内部对照序列-特异性引物对与第二可检测的探针；

使通过使用该第二质粒来连续稀释所形成的第一质粒的标准稀释液进行使用该反应混合物的第二定量聚合酶链式反应，以建立该靶基因的突变型等位基因负担的标准曲线；以及

在某些具体例中，该突变型等位基因序列具有实质上相同于该野生型等位基因序列的核苷酸长度，以及该第一质粒具有实质上相同于该第二质粒的核苷酸长度。

依据本发明，用于该第一与第二定量聚合酶链式反应各者中的反应混合物可以进一步包括阻断剂(blocking agent)，其杂交至该靶基因的野生型等位基因序列并且抑制该突变型等位基因-特异性引物对中的至少一个引物结合至该靶基因的野生型等位基因序列。

如此处所使用的，术语“阻断剂(blocking agent)”以及“寡核苷酸阻断剂(oligonucleotide blocker)”可以被交换地使用，并且可以被设计成退火(anneal)至与等位基因-特异性引物对所退火者相同或相反的链(strand)，并且可以在寡核苷酸阻断剂的3’端、5’端和/或靠近3’端的内部位置修饰有阻断基团(blocking group)[例如，“非-可延伸的部分(non-extendable moiety)”]。因此，举例来说，为了抑制野生型等位基因[例如，大量的等位基因变异体(allelic variant)]的扩增反应同时允许扩增反应通过该等位基因-特异性引物对的延伸发生在包含有突变型等位基因(例如，稀少的等位基因变异体)的相同的或相反的链上时，寡核苷酸阻断剂可以被设计成紧密地结合至该野生型等位基因。亦即，该非-可延伸部分可以提升匹配的(matched)与不匹配的(mismatched)靶序列之间在Tm上的差异性和/或降低不匹配的结合效率(priming efficiency)，借此改善分析的特异性(specificity)和/或选择性(selectivity)。

在某些具体例中，该阻断剂是在3’-端具有非-可延伸的部分的寡核苷酸。该非-可延伸的部分的实例包括，但不限于，肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)、锁核酸(lockednucleic acid,LNA)、拉链核酸(zip nucleic acid,ZNA)、桥核酸(bridged nucleic acid,BNA)、苏糖核酸(threose nucleic acid,TNA)、三唑核酸(triazole nucleic acid)、氨基-C7(amino-C7)、非-可延伸的核苷酸(non-extendable nucleotide)、小沟结合子(minorgroove binder,MGB)，以及它们的组合。

如此处所使用的，术语“非-可延伸的核苷酸(non-extendable nucleotide)”意指阻断核酸聚合的核苷酸[例如，阻断聚合酶通读(read-through)]。在某些具体例中，该非-可延伸的核苷酸是非-天然地存在的核苷酸(non-naturally occurring nucleotide)或二-去氧核苷酸(dideoxynucleotides)[例如，2’,3’-二-去氧核苷酸(亦即，二-去氧核苷酸三磷酸(di-deoxynucleotide triphosphates,ddNTP)，其可以包括ddGTP、ddATP、ddTTP以及ddCTP)]。在某些具体例中，该非-天然地存在的核苷酸是isoC、isoG、去氧尿苷(deoxyuridine)、3’-去氧腺苷(3’-deoxyadenosine)、3’-去氧胸苷(3’-deoxythymidine)、3’-去氧鸟苷(3’-deoxyguanosine)、3’-去氧胞苷(3’-deoxycytidine)、反向的dT(inverted dT)、5’-甲基-去氧胞苷(5’-methyl-deoxycytidine)、2’-氟基(2’-fluoro)、8-氮杂-7-去氮-dA(8-aza-7-deaza-dA,ppA)、8-氮杂-7-去氮-dG(8-aza-7-deaza-dG,ppG)、2’-去氧假异胞苷(2’-deoxypseudoisocytidine,iso dC)、5-氟-2’-去氧尿苷(5-fluoro-2’-deoxyuridine,fdU)，和/或呈相反方向插入的其它天然-存在的核苷酸。

在示范性具体例中，该阻断剂是在其3’-端具有二-去氧核苷酸三磷酸的寡核苷酸。

依据本发明，该靶基因在基因中可能具有一或多个单核苷酸多型性(single-nucleotide polymorphisms)。在某些具体例中，该靶基因是疾病-关联性基因(disease-associated gene)，诸如癌症-关联性基因(cancer-associated genes)以及与遗传性疾病(hereditary disease)有关联的基因。

该靶基因的实例可以包括，但不限于，JAK2、K-Ras、B-Raf以及EGFR。在示范性具体例中，该靶基因为JAK2且该突变型等位基因序列为JAK2 V617F。

本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，所述实施例只是供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。

<实施例>

一般实验材料：

1.在下面的实施例中所使用的引物与探针由Integrated DNA Technologies,Inc.(IDT)(Iowa，USA)所合成。

2.细胞培养(cell cultures)：

人类红血球性白血病(HEL)细胞系[Human erythroleukemia(HEL)cell line](ATCC TIB-180^TM)以及原发性血小板减少症(essential thrombocytopenia,ET)转化的急性骨髓性白血病(AML)细胞系[acute myeloid leukemia(AML)cell line]UKE-1(GM23245)分别购自于美国类型培养物收集中心(American Type Culture Collection)(VA,USA)以及Coriell Cell Repositories,Coriell Institute for Medical Research(NJ,USA)。各别种类的细胞被培育在含有RPMI-1640(Gibco)[补充有15％ FBS以及2mM L-麸酰胺酸(L-glutamine)]的培养皿中，继而在培养条件设定为37℃以及5％ CO₂的培养箱中进行培育。培养基的更换每2天被进行。当所培养的细胞达到70％汇聚(confluence)时，细胞继代被进行。

3.研究对象、血液样品收集以及DNA萃取：

下面的实验经由中国台湾嘉义长庚纪念医院的人体试验伦理委员会所核准。带有骨髓增生性肿瘤(myeloproliferative neoplasms,MPN)的患者(其在中国台湾嘉义长庚纪念医院进行追踪与治疗)以及作为对照组的成年健康个体被招募来作为研究族群。针对血液样品收集，本研究的各个参与者依据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)而被提供书面的告知同意书(informed consent)。

收集自各个MPN病患以及健康个体的周边静脉血液(peripheral venous blood)被置于含有EDTA的血液收集管中。周边血液的颗粒细胞使用Ficoll-Hypaque密度梯度离心(Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation)来收取并被冷冻保存于RNAlater^TM稳定溶液中(RNAlater^TM Stabilization Solution)(Cat.No.:AM 7020,Thermo FisherScientific)。颗粒细胞的DNA被萃取出，并使用TRI(Cat.No.:T9424,Sigma-Aldrich)来进行纯化，继而以焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)-处理的d₂H₂O予以稀释，以制备具有最终浓度为100ng/μL的DNA试验样品以用于进一步的分析。

一般实验方法：

1.关于在本发明中所采用的实验方法以及用于DNA选殖的相关技术，诸如，通过限制酶的DNA切割、使用T4 DNA连接酶的DNA连接、琼脂糖凝胶电泳、质粒转染等等，可参照下列在本技艺中所熟知的教科书：Sambrook J.andRussell D.W.(2001),MolecularCloning:a Laboratory Manual,3rd ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,NewYork。前述的技术能够由本领域技术人员根据他们的专业知识与经验而被轻易地进行。

2.统计学分析(Statistical analysis)：

组内与组间的q-PCR分析变异(intra-and inter-q-PCR assay variation)通过使用线性回归(linear regression)和/或皮尔森相关分析(Pearson’s correlationanalysis)来计算在等位基因负担值上的变异系数而得到。各个统计学分析使用社会科学统计套装(Statistical Package for the Social Sciences,SPSS)软体版本17.0来进行(购自于SPSS Inc.，芝加哥，USA)。针对各个统计学分析的显著水准(level ofsignificance)被设定为0.05。

实施例1.作为用于量化JAK2 V617F突变型等位基因负担(mutant alleleburden)的标准的重组型质粒的构筑

为了最小化拷贝数变异(copy number variation)以及标准化JAK2 V617F等位基因负担的量化，本发明的对重组型质粒被构筑如下。

由于较少体细胞突变存在于JAK2基因的外显子21，因此申请人选择这个区域作为内部对照组。使用以TRI自HEL细胞所萃取出的基因体DNA作为模板并且使用如表1中所示的正向引物H_JAK2_clon_exon21_F以及反向引物H_JAK2_clon_exon21_R来进行PCR，具有JAK2外显子21部分DNA序列的对照PCR产物(264bp)被得到。所形成的对照PCR产物被纯化，接着依据制造商的操作指南使用yT&A选殖试剂盒(Yeastern Biotech，台北，中国台湾)而被接合至选殖载体中，以得到质粒JAK2_Ctrl_yT&A。依据桑格氏测序法(Sangersequencing)(制造商：ABI；型号：3730)所进行的测序分析，具有如序列辨识编号：3所示的核苷酸序列的部分的JAK2外显子21被包括在质粒JAK2_Ctrl_yT&A中。

为了检测JAK2 V617的突变，JAK2的外显子14被选作为靶区域。使用如表1中所示的正向引物SalI-hJAK2_WT/V617F_F以及反向引物BamHI-hJAK2_WT/V617F_R，具有JAK2外显子14的突变型DNA序列的突变型PCR产物(323bps)以及具有JAK2外显子14的野生型DNA序列的野生型PCR产物(323bps)分别使用下列模板来进行PCR而被获得：萃取自HEL细胞的基因体DNA作为突变型DNA模板，以及萃取自健康成年个体的周边血液颗粒细胞的DNA作为野生型DNA模板。所得到的突变型以及野生型PCR产物各别被插入至JAK2_Ctrl_yT&A质粒的SalI以及BamHI位点内，以生成对应的野生型目标重组型质粒JAK2_WT_Ctrl_yT&A(3306bps)以及具有JAK2 V617F突变的突变型目标重组型质粒JAK2_V617F_Ctrl_yT&A(3306bps)，如图1所示，其中，JAK2 V617F突变位置(cDNA 1849G>T)以星号来标示。该野生型以及突变型目标重组型质粒分别由桑格氏测序法来确认包括部分的野生型JAK2外显子14(序列辨识编号：6)以及部分的突变型JAK2外显子14(序列辨识编号：7)。

表1

注：底线所标示的核苷酸各别表示如上方所示的限制酶的辨识位点

实施例2.验证本发明作为用于量化JAK2 V617F突变型等位基因负担的标准的重组型质粒的准确性

实验方法：

得自于实施例1的野生型以及突变型目标重组型质粒JAK2_WT_Ctrl_yT&A以及JAK2_V617F_Ctrl_yT&A(其分别代表0％以及100％JAK2 V617F突变型等位基因负担)以如下面的表2中所示的各种不同比例来被混合，以得到各自具有不同的JAK2 V617F突变型等位基因负担的六种重组型质粒混合物(亦即，100％、50％、10％、1％、0.1％以及0.01％)，其供作为用于JAK2 V617F突变型等位基因的标准稀释液。

表2

JAK2 V617F突变型等位基因负担(％)	100	50	10	1	0.1	0.01
							JAK2_WT_Ctrl_yT&A(μL)	0	50	90	99	99.9	99.99
JAK2_V617F_Ctrl_yT&A(μL)	100	50	10	1	0.1	0.01

在上述的重组型质粒混合物中的JAK2 V617F突变依据制造商的操作指南使用两种市售的试剂盒[亦即，在RGQ PCR系统上所执行的RGQ PCR试剂盒(Qiagen，德国)，以及在QX200^TM ddPCR系统上(Bio-Rad,CA,USA)所执行的PrimePCR^TM微滴式数字PCR突变检测分析(ddPCR)(PrimePCR^TM droplet digital^TM PCR Mutation Detection Assay)试剂盒]而被检测以及测定。将Qiagen RGQ PCR试剂盒以及Bio-Rad QX200 ddPCR试剂盒所测定的所有重组型质粒混合物中所计算出的JAK2 V617F突变型等位基因负担相互比较，接着使用线性回归(linear regression)来与期望值进行比对。

结果：

图2显示该重组型质粒混合物的所期望的JAK2 V617F突变型等位基因负担与由Qiagen RGQ PCR试剂盒以及Bio-Rad QX200 ddPCR试剂盒所测得的观测值之间的相关图。如图2所示，在所期望的JAK2 V617F突变型等位基因负担与使用Qiagen RGQ PCR试剂盒所测得的观测值之间具有优异的相关性，且经计算的R²值为0.9977。相似地，近乎完美匹配亦被发现在期望的JAK2 V617F突变型等位基因负担以及使用Bio-Rad QX200 ddPCR试剂盒所测得的观测值之间，且经计算的R²值为0.9965。

综上所述，这些结果显示本发明的野生型以及突变型目标重组型质粒在生成用于量化JAK2 V617F突变型等位基因负担的突变型等位基因的标准稀释液上的可靠性。

实施例3.通过定量双重PCR分析(quantitative duplex PCR assay)来量化重组型质粒混合物以及临床样品中的JAK2 V617F突变型等位基因负担

A.JAK2 V617F突变型等位基因负担的标准曲线的建立

1.以质粒为基础的标准曲线(plasmid-based standard curve)：

7个重组型质粒混合物(分别具有为100％、10％、1％、0.1％、0.01％、0.001％以及0％的JAK2 V617F突变型等位基因负担)依据实施例2中所述的方法而被制备。使这些重组型质粒混合物各别作为DNA模板(template)来进行定量双重PCR分析，其使用表3中所示的PCR反应混合物(PCR reaction mixture)与反应条件而在Rotor-Gene Q(RGQ)5plex HRM平台(Rotor-Gene Q 5plex HRM platform)(CatNo.:9001580，Qiagen，德国)上被执行。如表4中所列的JAK2_exon 14突变型等位基因-特异性引物对与探针以及JAK2_exon 21-特异性引物对与探针分别地被设计来通过JAK2 V617F的循环阈值(cycle threshold value)(亦即，C_t.FAM)来量化JAK2V617F突变型等位基因的含量，以及通过JAK2_exon 21的循环阈值(C_t.HEX)来量化JAK2_exon 21的含量。拷贝数标准化(copy number normalization)以所得到的ΔC_t值为基础而使用下列公式来进行：

ΔC_t＝C_t.FAM–C_t.HEX

表3

表4

注：FAM、HEX以及IABkFQ分别代表荧光素(fluorescein)、六氯-荧光素(hexachloro-fluorescein)以及IowaFQ。

为了提升JAK2 V617F检测的特异性以及JAK2 V617F突变型等位基因负担的量化准确，改良的定量双重PCR分析{亦即，定量竞争型等位基因-特异性Taqman双重PCR(qCAST-Duplex PCR)分析[quantitative competitive allele-specific TaqMan duplex PCR(qCAST-Duplex PCR)assay]通过进一步添加2μL的寡核苷酸阻断剂(oligonucleotideblocker)(序列辨识编号：14)至如表3中所示的q-PCR反应混合物中而被执行，该寡核甘酸阻断剂是JAK2野生型等位基因-特异性阻断剂，它被设计成在其3’端(3’-ddCTP)带有二-去氧胞核苷(di-deoxycytidine)，以抑制JAK2外显子14突变型等位基因-特异性引物对结合至JAK2野生型等位基因序列。

之后，由此所得到的在寡核苷酸阻断剂的存在与不存在下的重组型质粒混合物的ΔC_t值分别被用来建立JAK2 V617F突变型等位基因负担的标准曲线(亦即，以质粒为基础的标准曲线)。

2.以细胞为基础的标准曲线(cell-based standard curve)：

相较于如上所述的在寡核苷酸阻断剂的存在下通过重组型质粒混合物所建立的标准曲线，两种细胞系(亦即，HEL细胞以及UKE-1细胞)被用来建立量化JAK2 V617F突变型的标准曲线(亦即，以细胞为基础的标准曲线)，并使用HCK基因或JAK2基因作为内部对照。“细胞-基因”的命名用来代表由此得到的四个以细胞系为基础的标准曲线的DNA的细胞来源(cellular origin)(亦即，HEL细胞或UKE-1细胞)以及内部对照基因(亦即，HCK基因或JAK2基因)，亦即，HEL-JAK2、HEL-HCK、UKE-1-JAK以及UKE-1-HCK。

具体而言，HEL与UKE-1细胞的基因组DNA使用TRI而被萃取并纯化(Cat.No.:T9424,Sigma-Aldrich)。该经纯化的各个细胞类型的基因组DNA被混合以适量的来自于健康成年个体的DNA，以获得5个DNA标准稀释液，其具有对应的JAK2 V617F突变型等位基因负担(亦即，100％、50％、10％、1％，以及0.1％)。使各个标准稀释液作为DNA模板并使用如表3中所示的PCR反应混合物以及反应条件来进行上述的qCAST-双重PCR分析，其中JAK2基因被用来作为内部对照。当HCK基因作为内部对照时，表3中的JAK2_exon 21-特异性引物对与探针被取代以如表5中所示的被设计来量化HCK扩增子(C_t.HEX)的HCK-特异性引物对与探针。

表5

结果：

图3显示在寡核苷酸阻断剂的存在与不存在下所得到的具有不同的JAK2V617F突变型等位基因负担的重组型质粒混合物中JAK2 V617F突变[由FAM-放射探针(FAM-emitting probe)所量化]以及JAK2外显子21[由HEX-放射探针(HEX-emitting probe)所量化]的扩增曲线。图4显示通过以图3的扩增曲线为基础来计算ΔC_t值所得到的以质粒为基础的标准曲线。

如图3所示，在含有范围落在100％至0.01％的JAK2 V617F突变型等位基因负担的重组型质粒混合物中的JAK2 V617F突变型等位基因负担的量化之间没有差异，其中在寡核苷酸阻断剂的存在与不存在下所分别测得的具有0.01％ JAK2V617F突变型等位基因负担的重组型质粒混合物的C_t.FAM值皆为36个循环。然而，在寡核苷酸阻断剂的不存在下，含有0.01％、0.001％以及0％ JAK2 V617F突变型等位基因负担的重组型质粒混合物的扩增曲线大多彼此重叠，并且特别地，含有0.001％ JAK2 V617F突变型等位基因负担的重组型质粒混合物的C_t.FAM值在36与37之间波动，其由非-特异性扩增所自造成，导致难以区别含有0.001％与0.01％的JAK2 V617F突变型等位基因负担的重组型质粒混合物。换句话说，通过添加寡核苷酸阻断剂，含有0.01％、0.001％以及0％ JAK2 V617F突变型等位基因负担的重组型质粒混合物的扩增曲线被清楚地分隔开而改善它们之间的判别。此外，如以JAK2外显子21作为内部对照所示的，相当大程度地重叠的扩增曲线表示：伴随着起始于几乎相同的定量PCR反应的循环数的JAK2外显子21的加速扩增(没有受到寡核苷酸阻断剂的存在所影响)，结果产生了明确的q-PCR。

如图4所示，分别在寡核苷酸阻断剂的存在与不存在下以JAK2 V617F突变与JAK2外显子21的扩增曲线为基础所建立的这些重组型质粒混合物的标准曲线与期望线(expected line)(细虚线)达到了优异的相关性。特别地，相较于在未使用寡核苷酸阻断剂下所建立的标准曲线，在寡核苷酸阻断剂的存在下所建立的标准曲线更紧密地与期望线(细虚线)重叠，特别是具有低JAK2 V617F突变型等位基因负担的样品。

上面的结果确认了在量化JAK2 V617F突变型等位基因负担上使用质粒混合物来建立标准曲线的明确的准确性。此外，通过添加寡核苷酸阻断剂(其阻碍了JAK2 V617F突变型等位基因-特异性引物对结合至野生型DNA模板来减少非-特异性扩增)，qCAST-双重PCR分析的灵敏度可大幅地改善。

图5显示用于量化JAK2 V617F突变型等位基因负担的以细胞为基础的标准曲线，其通过使用来自两个不同批次的HEL或UKE-1细胞的多种DNA稀释液作为在qCAST-双重PCR分析中的标准品并且以HCK基因作为内部对照而被建立。如图5所示，得自于两个不同批次的HEL细胞的两个HEL-HCK标准曲线之间有明显的位移，并且在两个UKE-1-HCK标准曲线中也发现了相似的结果。结果指出在量化JAK2 V617F突变型等位基因负担中使用萃取自HEL与UKE-1细胞的基因组DNA作为标准品存在有显著的不一致性。

B.在MPN病患中使用以质粒为基础或以细胞为基础的标准曲线来量化JAK2V617F突变型等位基因负担

为了评估在本实施例第A项中所得到的标准曲线的准确性，5位MPN患者，其中包括4位JAK2 V617F-阳性病患(亦即，MPN 3、MPN 4、MPN11以及MPN 15)以及1位JAK2 V617F-阴性病患(亦即，MPN34)，他们被招募来进行初步分析。使每一位MPN病患的DNA测试样品(其依据前面一般实验材料中标题为「3.研究对象、血液样品收集以及DNA萃取」的部分中所述的方法而被制备)进行如本实施例中第A项所述的qCAST-双重PCR分析，其被进行三重复。各个病患中的JAK2V617F突变型等位基因负担通过将所得到的ΔC_t值拿来与在本实施例的第A项中所建立的以质粒为基础的标准曲线(在寡核苷酸阻断剂的存在下所建立)以及四个以细胞为基础的标准曲线中的一者相比较而被测定。

为供比较，5位MPN病患中的JAK2 V617F突变型等位基因负担亦如实施例2中所提及的，使用Bio-Rad QX200 ddPCR试剂盒而被测定。

此外，使来自于进一步招募的32位MPN病患(25位带有JAK2突变)的DNA测试样品被进行与如上所述相同的qCAST-双重PCR分析。计算依据以质粒为基础的标准曲线以及以细胞为基础的标准曲线(包括HEL-HCK以及UKE-1-HCK)所分别测得的各个样品的JAK2 V617F突变型等位基因负担，接着使用线性回归以及皮尔森氏相关性分析来测定它们之间的相关性。

结果：

表6显示通过使用以质粒为基础与以细胞为基础的标准曲线的qCAST-双重PCR分析以及通过Bio-Rad QX200 ddPCR试剂盒所测得的5位MPN病患中的JAK2 V617F突变型等位基因负担。

如表6所示，当以质粒为基础的标准曲线以及qCAST-双重PCR被用来量化JAK2V617F突变型等位基因负担时，由此所测得的各个样品的数值是相似于使用Bio-Rad QX200ddPCR试剂盒所测得者，而且皆是高度一致而具有极小的偏差。再者，在被认为是JAK2-阴性的MPN病患(亦即，MPN 34)中，由此所测得的突变型等位基因负担明显低于0.01％，表示使用qCAST-双重PCR分析以及以质粒为基础的标准曲线对于JAK2 V617F突变型等位基因负担能够达到相对地较低的检测极限。相反地，当以细胞为基础的标准曲线与qCAST-双重PCR分析一同被用来量化JAK2 V617F突变型等位基因负担时，可观察到具有显著偏差的高估的JAK2 V617F突变型等位基因负担，这显示：使用HEL或UKE-1细胞作为标准品可能导致不一致的数据收集，并且可能导致伪阳性(false-positive)的结果。

图6显示使用依据以质粒为基础的标准曲线与以细胞为基础的标准曲线(亦即，HEL-HCK以及UKE-1-HCK)的qCAST-双重PCR所测得的在32位MPN病患中的JAK2 V617F突变型等位基因负担的相关图。如图6所示，当HEL-HCK被用来当作标准品时，对于JAK2 V617F突变型等位基因负担有明显的高估，而且在从HEL-HCK标准曲线与以质粒为基础的标准曲线所得到的结果之间绘制的曲线证实了相对差的相关性。另一方面，从UKE-1-HCK以及以质粒为基础的标准曲线所得到的结果证实了些微较佳的相关性，但仍有不少的离群值。

综上所述，这些数据表示由于HEL与UKE-1细胞这两者对于量化JAK2V617F突变型等位基因负担不是实用的基因组DNA标准，而属不可靠的来源。相反地，在量化JAK2 V617F突变型等位基因负担上，可借助本发明依据以重组型质粒所建立的标准曲线的qCast-双重PCR分析而获得可再现的且肯定的结果。

实施例4.验证用于量化MPN病患中的JAK2 V617F突变型等位基因负担的依据以质粒为基础的标准曲线的qCAST-双重PCR分析的准确性实验方法：

为了评估使用在实施例3的第A项中所建立的以质粒为基础的标准曲线的qCAST-双重PCR分析的灵敏度(sensitivity)(检测极限)，来自于JAK2-突变的MPN病患的DNA混合物的随机集(random set)使用健康成年个体的DNA而被序列地稀释，以获得8个DNA测试样品(亦即，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7以及S8)，它们分别地具有低JAK2 V617F突变型等位基因负担(亦即，2％、1％、0.2％、0.1％、0.02％、0.01％、0.002％以及0.001％)。8个DNA测试样品中的各者皆以三重复来进行qCAST-双重PCR分析，以及以二重复来使用Qiagen RGQ PCR试剂盒。

此外，为供综合分析，70位MPN病患(包括55位JAK2 V617-阳性以及15位JAK2V617-阴性的MPN病患)以及30位健康成年个体被招募。使来自于那些受试者的DNA测试样品进行4个常用的灵敏性分析，包括Qiagen RGQ PCR试剂盒、Bio-Rad QX200 ddPCR试剂盒、竞争型等位基因-特异性TaqMan(CAST)PCR试剂盒[Applied Biosystems(ABI),MA,USA]以及多重PCR扩增子测序法(multiplex PCR amplicon sequencing)(详细的方法被描述如下)，亦进行如实施例3的第B项当中所述的使用以质粒为基础的标准曲线的qCAST-双重PCR分析，以测定其JAK2 V617F突变型等位基因负担。通过使用以质粒为基础的标准曲线的qCAST-双重PCR分析所得到的结果以及通过常用的灵敏性分析所得到者被进行比较，并且使用线性回归以及皮尔森氏相关性分析予以分析，以评估它们之间的相关性。

针对多重PCR扩增子测序法，基因组参考序列协会人类构筑37(Genome ReferenceConsortium Human Build 37)(GRCh37/hg19)的35个靶基因(包括JAK2)的外显子序列从加州大学圣塔克鲁兹分校(University of California Santa Cruz,UCSC)的基因组浏览器(Genome Browser)被下载。针对该靶基因所设计的各个引物对包含一个对应的转接子(adaptor)，而期望的最大PCR产物大小被设定在小于300bps。使用Access Array^TM系统(Access Array^TM system)(Fluidigm,CA,USA)的以微流体为基础的方法(micro-fluid-based method)被用来建构用于各个DNA样品的序列库(sequence library)，以及双端150bps循环高通量测序法(paired-end 150bps cycle high-throughput sequencing)使用HiSeq 2500系统(Hiseq 2500system)(Illumina,CA,USA)而被执行。在数据处理后，定位(mapping)与变异辨识(variant calling)使用CLC Genomics Workbench(Qiagen,Germany)而被执行。JAK2V617F突变的辨识依据大于50的覆盖率(coverage)以及大于1％的等位基因频率(allelic frequency)的准则。

结果：

图7显示DNA测试样品S1至S8的JAK2 V617F突变型等位基因负担，其通过使用以质粒为基础的标准曲线的qCAST-双重PCR分析以及通过Qiagen RGQ PCR试剂盒所测得。如图7所示，通过该qCAST-双重PCR分析所量化的测试样品S1至S8中的JAK2 V617F突变型等位基因负担与期望值(expected values)具有较高的相似性以及优异的相关性，即使是在具有极低突变型等位基因负担(≤0.01％)的DNA测试样本中。相反地，当使用Qiagen RGQ PCR试剂盒时，在期望的突变型等位基因负担低于0.01％的DNA测试样本中可观察到JAK2 V617F突变型等位基因负担的高估。这个结果表示：本发明依据以质粒为基础的标准曲线的qCAST-双重PCR分析在JAK2 V617F突变型等位基因负担的量化上可得到高度准确且可再现的结果，即使是低于0.01％的数值。

表7显示由本发明qCAST-双重PCR分析以及4个常用的灵敏性分析所测得的MPN病患与健康成年个体中的JAK2 V617F突变型等位基因负担。

图8显示由依据以质粒为基础的标准曲线的qCAST-双重PCR分析所测得的JAK2V617F突变型等位基因负担以及由其他分析所测得者之间的相关图。

表7

注：1)括号中的数字表示所检测的案例数量/期望的案例数量。由于一些分析中的可获得性受限，这些分析所分析的DNA样品数量之间有差异。

2)“n.d.”代表没有检测。

如表7与图8所示，由本发明依据以质粒为基础的标准曲线的qCAST-双重PCR分析所量测到的JAK2 V617F突变型等位基因负担的量化结果显示出良好的相关性，以及与由4个常用的灵敏性分析中的任一者所得到的结果是一致的，并且在任一个评估中没有任何健康成年个体被检测为JAK2V617F-阳性，这显示：本发明的方法的效能(performance)是可相比拟的并且准确的，而具有低伪阳性率(false positive rate)。特别地，使用以质粒为基础的标准曲线的qCAST-双重PCR分析以及Bio-Rad QX200 ddPCR分析的量测之间的结果特别一致，而Bio-Rad QX200 ddPCR分析普遍被认为是在量化JAK2变异型等位基因负担上最可靠的分析之一，但在临床环境下可能不容易负担的起。因此，本发明使用qCAST-双重PCR分析以及以重组型质粒作为标准品的量化方法具有更符成本效益(cost-effective)的优点。

总而言之，对于JAK2变异型等位基因负担的量化，通过使用qCAST-双重PCR分析以及使用重组型质粒作为标准品，本发明的方法能够得到可再现且肯定的结果，借此改善了MPN分子诊断学上的准确性。

于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本案作为参考资料。若有所冲突时，本案详细说明(包含界定在内)将占上风。

虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明只受如随文检附的权利要求书所示者的限制。

序列表

<110> 长庚医疗财团法人嘉义长庚纪念医院

<120> 量化靶基因的突变型等位基因负担的方法

<130>

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物 H_JAK2_clon_exon21_F

<400> 1

cagtataata tggcagagta aaacaata 28

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物 H_JAK2_clon_exon21_R

<400> 2

cctttattat ctatgaaaac gtctagatga 30

<210> 3

<211> 264

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

ggtatgaccc tctacaggac aacactgggg aggtggtcgc tgtaaaaaag cttcagcata 60

gtactgaaga gcacctaaga gactttgaaa gggaaattga aatcctgaaa tccctacagc 120

atgacaacat tgtaaagtac aagggagtgt gctacagtgc tggtaagctg cccattgaaa 180

cctattttaa attcaaggta tgtgtttggc atcctgtgta atataaatgt acaatgtctt 240

aacgatctgg acttatgcca atgc 264

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物 BamHI-hJAK2_WT/V617F_F

<400> 4

gatatggatc cggaccaaag cacattgtat cctcat 36

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物 SalI-hJAK2_WT/V617F_R

<400> 5

atatagtcga cgtcgacctg acacctagct gtga 34

<210> 6

<211> 323

<212> DNA

<213> 智人

<400> 6

ggaccaaagc acattgtatc ctcatctata gtcatgctga aagtaggaga aagtgcatct 60

ttattatggc agagagaatt ttctgaacta tttatggaca acagtcaaac aacaattctt 120

tgtacttttt tttttcctta gtctttcttt gaagcagcaa gtatgatgag caagctttct 180

cacaagcatt tggttttaaa ttatggagta tgtgtctgtg gagacgagag taagtaaaac 240

tacaggcttt ctaatgcctt tctcagagca tctgtttttg tttatataga aaattcagtt 300

tcaggatcac agctaggtgt cag 323

<210> 7

<211> 323

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

ggaccaaagc acattgtatc ctcatctata gtcatgctga aagtaggaga aagtgcatct 60

ttattatggc agagagaatt ttctgaacta tttatggaca acagtcaaac aacaattctt 120

tgtacttttt tttttcctta gtctttcttt gaagcagcaa gtatgatgag caagctttct 180

cacaagcatt tggttttaaa ttatggagta tgtttctgtg gagacgagag taagtaaaac 240

tacaggcttt ctaatgcctt tctcagagca tctgtttttg tttatataga aaattcagtt 300

tcaggatcac agctaggtgt cag 323

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物 H_JAK2_V617_F

<400> 8

ttatggacaa cagtcaaaca acaattc 27

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物 H_JAK2_V617_R

<400> 9

cttactctcg tctccacaaa a 21

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针H_JAK2_probe_FAM

<220>

<221> misc_特征

<223> 在5'-端标记有荧光素

<220>

<221> misc_特征

<223> 在3'-端标记有Iowa Black FQ (IABkFQ)

<400> 10

ttgtactttt ttttttcctt agtctttctt tgaagcagca 40

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物 H_JAK2_ref_ex21_F

<400> 11

ggaatattta ccatatggaa gtttacgaga ct 32

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物 H_JAK2_ref_ex21_R

<400> 12

caacacggtt gcttcatcta cagca 25

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针H_JAK2_ref_probe_HEX

<220>

<221> misc_特征

<223> 在5'-端标记有六氯-荧光素

<220>

<221> misc_特征

<223> 在3'-端标记有Iowa Black FQ (IABkFQ)

<400> 13

acggatagat cacataaaac ttctgcagta caca 34

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸阻断剂H_JAK2_WT_blocker

<220>

<221> misc_特征

<223> 在5'-端标记有二-去氧胞核苷

<400> 14

tacttactct cgtctccaca aa 22

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物 H_HCK_F

<400> 15

tattagcacc atccatagga ggctt 25

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物 H_HCK_R

<400> 16

gttagggaaa gtggagcgga ag 22

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针H_HCK_probe_HEX

<220>

<221> misc_特征

<223> 在5'-端标记有六氯-荧光素

<220>

<221> misc_特征

<223> 在3'-端标记有Iowa Black FQ (IABkFQ)

<400> 17

taacgcgtcc accaaggatg cgaa 24

Claims

1.一种量化在体内的非-融合的靶基因的突变型等位基因负担的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含有下列核酸试剂：

反应混合物，其含有(i)用于检测位于该靶基因的第一外显子的突变型等位基因序列的突变型等位基因-特异性引物对与第一可检测的探针，以及(ii)用于检测位于该靶基因的第二外显子的内部对照序列的内部对照序列-特异性引物对与第二可检测的探针，该第二外显子不同于该第一外显子，该反应混合物用来对得自于该个体的基因组DNA进行第一定量聚合酶链式反应，以测量该靶基因的突变型等位基因表达水平，以及

多个标准稀释液，其通过对第一质粒进行使用第二质粒的连续稀释所形成，所述标准稀释液用来进行使用该反应混合物的第二定量聚合酶链式反应，以建立该靶基因的突变型等位基因负担的标准曲线，该标准曲线用来与所测得的靶基因的突变型等位基因表达水平进行比对，以推定在该个体内的靶基因的突变型等位基因负担，

其中，该第一质粒包括该位于第一外显子的突变型等位基因序列以及该位于第二外显子的内部对照序列，该第二质粒包括位于该第一外显子的野生型等位基因序列以及该位于第二外显子的内部对照序列。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：该突变型等位基因序列具有实质上相同于该野生型等位基因序列的核苷酸长度，以及该第一质粒具有实质上相同于该第二质粒的核苷酸长度。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：用于该第一与第二定量聚合酶链式反应各者中的反应混合物进一步包括阻断剂，其杂交至该靶基因的野生型等位基因序列并且抑制该突变型等位基因-特异性引物对中的至少一个引物结合至该靶基因的野生型等位基因序列。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：该阻断剂是在3’-端具有非-可延伸的部分的寡核苷酸，该非-可延伸的部分选自由下列所构成的群组：肽核酸、锁核酸、拉链核酸、桥核酸、苏糖核酸、三唑核酸、氨基-C7、非-可延伸的核苷酸、小沟结合子，以及它们的组合。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：该阻断剂是在其3’-端具有二-去氧核苷酸三磷酸的寡核苷酸。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：该非-融合的靶基因是疾病-关联性基因。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：该疾病-关联性基因选自由下列所构成的群组：癌症-关联性基因、与遗传性疾病有关联的基因，以及它们的组合。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：该非-融合的靶基因选自由下列所构成的群组：JAK2、K-Ras、B-Raf、EGFR，以及它们的组合。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：该非-融合的靶基因是JAK2。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：该突变型等位基因序列是JAK2 V617F。

11.核酸试剂供应用于制备用来量化在体内的非-融合的靶基因的突变型等位基因负担的试剂盒的用途，其特征在于：该核酸试剂包括：

第一质粒，其包括位于该靶基因的第一外显子的突变型等位基因序列以及位于该靶基因的第二外显子的内部对照序列，该第二外显子是不同于该第一外显子；

第二质粒，其包括位于该靶基因的第一外显子的野生型等位基因序列以及该内部对照序列；

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于：该突变型等位基因序列具有实质上相同于该野生型等位基因序列的核苷酸长度，以及该第一质粒具有实质上相同于该第二质粒的核苷酸长度。

13.根据权利要求11所述的用途，其特征在于：用于该第一与第二定量聚合酶链式反应各者中的反应混合物进一步包括阻断剂，其杂交至该靶基因的野生型等位基因序列并且抑制该突变型等位基因-特异性引物对中的至少一个引物结合至该靶基因的野生型等位基因序列。

14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于：该阻断剂是在3’-端具有非-可延伸的部分的寡核苷酸，该非-可延伸的部分选自由下列所构成的群组：肽核酸、锁核酸、拉链核酸、桥核酸、苏糖核酸、三唑核酸、氨基-C7、非-可延伸的核苷酸、小沟结合子，以及它们的组合。

15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于：该阻断剂是在其3’-端具有二-去氧核苷酸三磷酸的寡核苷酸。

16.根据权利要求11所述的用途，其特征在于：该非-融合的靶基因是疾病-关联性基因。

17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于：该疾病-关联性基因选自由下列所构成的群组：癌症-关联性基因、与遗传性疾病有关联的基因，以及它们的组合。

18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于：该非-融合的靶基因选自由下列所构成的群组：JAK2、K-Ras、B-Raf、EGFR，以及它们的组合。

19.根据权利要求18所述的用途，其特征在于：该非-融合的靶基因是JAK2。

20.根据权利要求19所述的用途，其特征在于：该突变型等位基因序列是JAK2 V617F。