CN103987859A - Jak2的突变分析 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了对JAK2中的突变的测定。所述测定利用使用优先与野生型等位基因杂交的阻断探针进行的突变等位基因的选择性扩增。然后使用相同的探针来检测野生型序列的存在或不存在。不需要预先知晓具体的突变体序列。

Description

JAK2的突变分析
发明领域
本发明涉及用于分析JAK2基因中的遗传突变并且特别是单核苷酸多态性(SNPs)的方法。本发明的各方面还涉及用于分析所述突变的核酸探针和引物。
发明背景
詹纳斯激酶2(Janus kinase2，通常称作JAK2)是一种已经参与II型细胞因子受体家族(例如干扰素受体)、GM-CSF受体家族(IL-3R、IL-5R和GM-CSF-R)、gp130受体家族(例如IL-6R)和单链受体(例如Epo-R、Tpo-R、GH-R、PRL-R)的成员的信号传导的人蛋白。JAK2信号传导在蛋白受体的下游激活。JAK2中的突变已经参与真性红细胞增多症(polycythemia vera)、自发性血小板增多(essential thrombocythemia)和其他骨髓增生病症(myeloproliferative disorders)。这种突变是位置617的缬氨酸变为苯丙氨酸，该突变似乎使得造血细胞对生长因子(诸如促红细胞生成素和血小板生成素)更敏感。
真性红细胞增多症(还称为红细胞增多病(erythremia)或原发性红细胞增多症(primary polycythemia))是一种血液病症，其中骨髓产生过多的红血细胞。其可能还导致过量产生白血细胞和血小板。由于增加的红血细胞，血液变稠，这引起与真性红细胞增多症相关的大部分健康关注。其在老年人中比较常见并且可以是有症状的或无症状的。
提供用于诊断真性红细胞增多症的快速而简单的检测是有益的。
美国专利7,429,456描述了JAK2中缬氨酸到苯丙氨酸(V617F)突变的鉴定，并且描述了用于检测该突变存在的测试。US7,429,456的SEQ IDNO1给出了V617F形式的人JAK2的氨基酸序列，并且US7,429,456的SEQ ID NO2给出了编码所述氨基酸序列的核酸序列(基因序列突变称作G1849T)；还参考该蛋白的野生型形式，其NCBI登记号为NM004972。该专利中所述的诊断测试利用跨越核酸序列的位置1849的突变的T核苷酸的核酸探针。通过侧连位置1849的区域的PCR扩增，然后通过用包含T1849核苷酸的探针杂交而检测突变的存在。如果存在杂交，则存在突变。备选地，所述PCR引物可以针对突变体序列，从而选择性扩增该突变体形式。JAK2的mRNA序列(SEQ ID NO4)在本申请的图1中给出。位置G1849对应于图1的SEQ ID NO4的nt2343。所述测定特异性针对特定的突变。
提供备选的诊断测试将是有用的。
我们同时未决的专利申请GB1100150.0描述了基于突变体序列的优先扩增而检测和分析靶基因中的SNPs的方法。双链DNA的解链温度(Tm)取决于碱基对杂交的程度；当在探针与靶序列之间存在错配时(例如，由于存在SNP)，那么与不存在错配时相比，Tm是不同的。GB1100150.0中所述的方法包括使用针对靶序列的侧连区域的PCR引物与优先与野生型序列或突变体序列杂交的阻断探针的组合。设计该探针，以使其在与要被阻断的序列(例如，野生型序列)结合时具有的Tm低于其在与要被扩增的序列(例如，突变体序列)结合时具有的Tm。扩增在一定温度进行，以使探针与要被阻断的序列结合而不与要被扩增的序列结合，并且因此只有另一种序列被扩增。然后，可以使用相同的探针来检测所扩增的序列的存在，并且检测所扩增的序列与未扩增的序列的相对比例。
本发明应用相关方法来检测JAK2中的突变。
发明概述
按照本发明的第一方面，提供一种检测在具有至少第一突变体和野生型等位基因的JAK2基因的基因座中不存在野生型等位基因的方法，所述方法包括：
a)提供反应混合物，其包含：
i)包含代表JAK2基因的至少一部分的核酸的样品；
ii)寡核苷酸探针，其与突变体等位基因杂交的解链温度(Tm)低于其与野生型等位基因杂交的解链温度；
iii)用于核酸扩增的成对寡核苷酸引物，所述引物与所述样品中的所述核酸在寡核苷酸探针结合位点侧翼的第一和第二位点杂交；其中引物：样品的Tm高于探针：突变体等位基因的Tm；
b)保持所述反应混合物在所述探针：突变体等位基因的Tm与所述探针：野生型等位基因的Tm之间的温度，以使所述探针优先与所述野生型等位基因杂交；
c)对所述反应混合物进行热循环扩增，所述扩增包括解链阶段、退火阶段和延伸阶段，其中所述延伸阶段和退火阶段的温度在所述探针：突变体等位基因的Tm与所述探针：野生型等位基因的Tm之间，以使所述探针在这些阶段与野生型等位基因杂交；由此扩增所述突变体等位基因；和
d)在等于或低于所述探针：突变体等位基因的Tm的温度检测所述探针与所述样品的杂交；在等于或低于所述探针：野生型等位基因的Tm的更高的温度检测所述探针与所述样品的杂交；并且比较二者；由此检测所述野生型等位基因的存在或不存在。
因此，本发明允许第一突变体等位基因较第二野生型等位基因优先得到扩增。在扩增过程中作为阻断探针的相同探针可以用在检测阶段。这显著简化了程序。本发明的重要特征是所用的探针检测野生型等位基因的存在或不存在；即，如果野生型等位基因存在，其被检测到，而如果不存在，则其不被检测到。任何突变体序列都将被优先扩增，因此，即使突变体相对少见(例如，仅存在于样品中的少数细胞中)，也能够减少野生型序列的相对拷贝数。当存在突变体时，与在较低温度的突变体检测相比，野生型检测将减少。该方法不局限于检测任何具体的突变体等位基因，因此，与依赖于使用对一种突变体等位基因特异性的探针的备选方法相比，所述方法更加灵活。
延伸阶段和退火阶段可以合并，原因在于它们可以在相同温度进行。
优选地，在步骤a)i)中由所述样品代表的JAK2基因的部分跨越JAK2基因的nt2343(参照图1中给出的SEQ ID NO4定义的nt2343)。该突变体等位基因优选是在nt2343的突变。在一个优选的实施方案中，突变体形式是T2343，而野生型是G2343。这对应于V617F突变。
然而，本发明不限于使用V617F突变。例如，可以设计探针跨越nt2343和足够的另外的核苷酸，以便关于在氨基酸残基618的突变(例如，少见的C618F突变)具有差异性Tm。这对应于核苷酸置换G2347T。由于本发明依赖于探针与野生型序列结合和与突变体序列结合之间的差异性Tm，因此所述突变体序列的本性不重要。
在优选的实施方案中，探针跨越nt2343。所述探针优选地包含对应野生型残基G2343的核苷酸；针对其的任何错配都将导致较低的Tm。
寡核苷酸探针长度优选为至少15、20、25、26、27、28、29、30个核苷酸。
特别优选的寡核苷酸探针包含序列TTT AAA TTA TGG AGT ATGTGT CTG TGGAGA(SEQ ID NO：1)，或由序列TTTAAATTATGGAGTATG TGT CTG TGG AGA(SEQ ID NO：1)组成。这对应于图1给出的JAK2序列的nt2324至2353(探针结合区用下划线表示)。
引物优选扩增JAK2序列的长度为至少50、60、70、80、90、100个核苷酸的部分。优选的引物包括TCT TTG AAG CAG CAA GTA TGA TGA(SEQ ID NO2；正义引物)和GCA TTA GAA AGC CTG TAG TTT TAC TT(SEQ ID NO3，反义引物)。这些提供长度为112nt的扩增子。
延伸和退火阶段的温度可以是相同的(在这种情形中，可以使用合并的延伸-退火阶段)，但是优选是不同的。解链阶段的温度可以高于引物：样品的Tm和探针：野生型等位基因的Tm的温度。然而，这不是必需的；例如，引物：样品的Tm可能低于探针：野生型等位基因的Tm，在该情形中，解链阶段可以是这两个值之间的温度，以便在整个扩增反应中探针有效地保持与野生型等位基因杂交。
在延伸阶段过程中，寡核苷酸探针保持与野生型等位基因杂交。这防止与该核酸杂交的引物的链延伸，而由于所述探针不与突变体等位基因杂交，因此，与突变体等位基因杂交的引物是游离的能够进行链延伸。以这种方式，突变体等位基因将优先被扩增。如下文所示，在特定的实施方案中，引物中的一个或两个可以与探针结合位点重合，以使所述探针与所述引物竞争结合；这可以防止引物的结合以及由此的链延伸。在其他(优选的)实施方案中，引物和探针不重合，但是引物防止进一步的链延伸。
基因座可以是多等位基因基因座；即，在该基因座上可能存在多于两种等位基因。在这样的情形中，一种等位基因可以指定为野生型等位基因，并且其他的为突变体等位基因。优选这样选择探针，以使探针：野生型等位基因的Tm高于任意探针：突变体等位基因的Tm。该方法可以用来优先扩增存在的突变体等位基因中的任一种。当该方法用于研究体细胞突变时，这是特别有益的，在体细胞突变情形中，在不同的细胞系中可能存在数种不同的突变。在优选的实施方案中，每种可能的探针：等位基因组合的Tm是不同的。优选地，Tm至少差别0.25℃，更优选至少0.5℃，最优选至少0.75℃。这允许在每个等位基因之间进行区分。例如，如果存在四种等位基因，并且仅有两种要被扩增，那么延伸温度可以设定在适当的水平，以使所述探针与所述等位基因中的另外两种杂交。
探针优选地与靶等位基因的一条链基本上互补，并且更优选地与靶等位基因的一条链完全互补。探针可以与野生型等位基因的一条链完全互补。突变体等位基因可以由于一个或多个点突变(单核苷酸多态性，SNPs)不同于第二等位基因的序列。突变体等位基因可能包含多于一种SNP，例如，在不同的密码子。本发明方法的一个优点在于可以优先扩增潜在包含多于一种SNP的突变体等位基因。备选地，突变体等位基因可以由于一个或多个缺失而不同于野生型等位基因的序列。
优选地，探针是DNA。
突变体与野生型等位基因之间在序列上的差异优选在探针结合的区域内部；即，探针与突变体等位基因之间的任何错配都不在探针的末端。
探针可以被标记。例如，探针可以包含荧光或放射性标记，或者可以用第二探针可以结合的配体来标记。优选地，所述探针用荧光标记来标记，并且优选地，取决于所述探针已经与靶标链结合(即，所述探针是双链核酸的一部分)还是未与之结合(所述探针是单链的)，所述标记还产生不同的信号。优选的探针是探针(例如，参见Mol Cell Probes(分子细胞探针).2002年10月；16(5)：319-26，“Ultra-rapid DNA analysisusing HyBeacon probes and direct PCR amplification from saliva(使用HyBeacon探针和对唾液的直接PCR扩增进行的超快速DNA分析)”，French DJ，Archard CL，Andersen MT，McDowell DG)。不同信号的产生允许容易且快速的分析所述探针是否已经与靶标结合。
检测杂交的探针分子的步骤可以进一步包括定量扩增混合物中突变体和野生型等位基因的相对量。在本发明的特定实施方案中，检测步骤可以在扩增步骤之前以及之后进行。在优选的实施方案中，突变体与野生型等位基因的比例可以通过下述测定：将所述反应混合物维持在等于或低于探针：突变体等位基因的Tm的第一温度；检测杂交的探针分子；将所述反应混合物升温至高于所述探针：突变体等位基因的Tm但是等于或低于所述探针：野生型等位基因的Tm的温度；并且检测杂交的探针分子。在第一较低的温度，探针将与突变体和野生型等位基因杂交，而在第二较高的温度，探针将仅与所述野生型等位基因杂交。
当基因座是多等位基因的时，则检测步骤可以进一步包括将反应混合物升温至一个或多个中间温度，并且在每个中间温度检测杂交的探针分子。当每种探针：等位基因组合具有不同的Tm时，这是特别优选的。本发明的这一实施方案允许在单次实验中扩增并且定量多种不同的突变体等位基因。
引物优选地在探针结合的区域之外的区域结合；即，第一引物结合探针靶标的3’-端，而第二引物结合探针靶标的5’-端(记住：引物应该结合在双链体DNA的不同链上)。当引物进行链延伸时，这被结合的探针所阻断，使得该链不能被扩增。在特定的实施方案中，引物可以结合在探针结合的区域的附近，或者甚至可以与探针重合一个、两个、三个或更多个核苷酸，尽管这不是优选的。当然，两个引物可以与探针靶标不同的程度地重合，或者一个引物可以重合，而另一个引物不重合。在探针与引物重合的情形中，则所述探针可以与引物竞争结合，优选在所述引物的3’端，并且以这种方式防止延伸。
在本发明的优选的实施方案中，扩增反应是聚合酶链式反应(PCR)。在特定的实施方案中，引物可以以不同的浓度提供；优选地，一个引物以限速量提供，并且所述扩增反应是不对称PCR。在不对称PCR中，两个靶标DNA链中的一个被优先扩增，由于使用限速引物，因此只有另一个引物可用于起始链延伸。正义链或反义链可以是被靶向用于优先扩增的链；优选地，优先扩增的链是与所述探针互补的链。在特别优选的实施方案中，其中引物是上文引用的SEQ ID NO2和3，不对称PCR使用过量的作为反向引物的引物进行，为12.5pMol/20μl反应物，限制性引物是正向引物，为1.5pMol/20μl反应物，并且探针为3pMol/20μl反应物。
本发明还提供包含SEQ ID NO1的核苷酸序列或由SEQ ID NO1的核苷酸序列组成的寡核苷酸探针。所述探针优选是DNA。所述探针可以进一步包含与所述探针相缔合的一种或多种标记；优选与所述序列的一个或多个核苷酸缔合的荧光标记。所述标记可以被检测到，从而取决于所述探针是与靶序列采用双链的双链体还是单链的而产生差别性的信号。
还提供引物序列，所述引物序列选择用于允许由上文提及的探针SEQ ID NO1识别的靶序列的扩增。引物可以由SEQ ID NO2或SEQ IDNO3的核苷酸序列组成或者包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，本发明提供引物对，所述引物对具有由SEQ ID NO2的核苷酸序列组成或包含SEQ ID NO2的核苷酸序列的第一引物和由SEQ ID NO3的核苷酸序列组成或包含SEQ ID NO3的核苷酸序列的第二引物。
本发明还提供用于检测JAK2基因中的突变的试剂盒，所述试剂盒包括引物对，所述引物对具有由SEQ ID NO2的核苷酸序列组成或包含SEQID NO2的核苷酸序列的第一引物和由SEQ ID NO3的核苷酸序列组成或包含SEQ ID NO3的核苷酸序列的第二引物；和探针，所述探针包含SEQ ID NO1的核苷酸序列或由SEQ ID NO1的核苷酸序列组成。所述试剂盒任选地包括关于使用的使用说明；和/或进行核酸扩增和/或检测所需要的另外的试剂。
附图简述
图1给出野生型JAK2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO4)。
图2给出本发明的引物和探针序列以及扩增子详细信息。
图3显示探针相对于V617F突变体靶标(左侧曲线，具有较低的Tm)和相对于野生型靶标(右侧曲线，具有更高的Tm)的解链曲线。
图4显示在JAK2基因由SEQ ID NO1的探针覆盖的区域中已经鉴定的突变。
图5列出了在相同区域中的多种突变。
图6给出了来自本测定的野生型和混合的野生型-V617F样品的示例性解链曲线。
图7显示用于分析的热循环步骤。
图8显示用于使用LightCycler进行的Genedrive测定分析的热循环步骤。
图9显示用于使用LightCycler进行的Ipsogen JAK2V617FMutaQuant试剂盒分析的热循环步骤。
图10显示具有已知的标准和对照的图9的测定的示例性结果。
发明详述
本发明提供一种方法，由此通过检测野生型序列的存在或不存在可以间接检测JAK2基因中的突变(例如，V617F突变)。本发明使用单一探针，其既作为防止野生型等位基因扩增的阻断剂，又作为报道野生型等位基因存在的报道子。此外，所述探针可以用于由单次实验检测在同一基因座的多种不同的等位基因(例如，备选的SNPs)。所述方法可以用于检测诸如SNPs以及插入或缺失的突变。
本文所述的方法利用探针(其取决于所述探针是单链的还是双链的提供不同的报道信号)和不对称PCR(以优先扩增靶序列的一条链)。所述方法的典型的灵敏性是1-5个拷贝的突变体等位基因，和大于5％的SNP与野生型的比率。使用单引物组和探针的单一测定可以检测在该探针序列内的多种SNPs。
实施例1：JAK2
图1给出野生型JAK2mRNA序列的序列(SEQ ID NO4)。突出显示残基2343。
图2给出正向和反向引物的序列以及用于结合野生型JAK2的探针序列。
JAK2中的V617F突变是由核酸序列中的G2343T突变导致。探针结合跨越该突变的区域；如果存在所述突变(或者实际上在该序列中的任何其他突变)，那么杂交的探针的Tm降低。
明显的，探针序列与相关的野生型靶序列完全互补，并且与每种可能的突变体序列相比，具有一个错配碱基。所述错配是在探针内部，而不是在任一个末端。所述探针是探针，其具有一对荧光团，当所述探针采用双链的双链体时，与单链形式相比，该对荧光团改变其发射。
包含JAK2区的DNA样品在20μl总反应体积中使用12.5pMol过量的(正向)引物、1.5pMol限制性(反向)引物和3pMol探针进行扩增。循环条件为：
95℃5分钟基因组DNA变性
95℃5秒}
53℃5秒}40个循环
72℃5秒}
终点解链曲线分析在45℃至75℃以0.1℃/秒进行。
扩增后，分析反应产物的解链曲线，以确定是否存在野生型序列。
图3显示探针相对于V617F突变体靶标(左侧曲线，具有较低的Tm)和相对于野生型靶标(右侧曲线，具有更高的Tm)的解链曲线。可以明显看出使用单一探针清楚地区分这两种形式。不存在野生型产物时，将获得移动的解链曲线；这种方法允许检测探针区域内的任意突变，并且不仅是V617F突变。
图4显示在JAK2基因由SEQ ID NO1的探针覆盖的区域中已经鉴定的突变。注意该图是指nt1830至1864；这对应于SEQ ID NO4的nt2324至2358。图5列出了在相同区域中的多种突变。我们相信本发明方法能够使用SEQ ID NO1的探针鉴定这些突变中的任一种的存在。
本文所述的扩增方法使用不对称PCR，其优先扩增靶DNA的一条链。如在常规PCR中一样进行标准热循环，但是使用限制量的一种引物(限速引物)。当限制性引物消耗尽时，通过过量引物的延伸复制算术性增加。
典型地，所述探针与非引物限制性的链互补，以使优先扩增的链可以与所述探针杂交。然后，如果杂交发生，-例如，如果序列是野生型的序列而不是突变体的序列，所述探针可以阻断该链的扩增。
技术人员能够设计用于本发明方法的适当的备选引物，以扩增需要的靶序列。
所用的探针在与野生型结合时具有比与突变体结合时显著更高的解链温度(Tm)。这允许使用该探针既作为防止扩增的阻断剂又作为报道野生型或突变体序列存在的报道子的应用。
使用设定高于所述探针：野生型双链体的Tm的保持/延伸温度，可以优先使所述探针与野生型结合，与突变体序列没有显著的杂交。扩增引物的退火也选择高于所述探针：突变体双链体的Tm。扩增引物结合野生型和突变体等位基因二者，但是由于所述阻断探针，野生型的扩增显著减少。这优先在后续的扩增轮数中增加突变体群体。
例如，第一退火步骤是在高温进行(例如，66.5℃)。在该阻断步骤中，探针与野生型结合并且阻断正向引物杂交。由于Tm过高，没有探针与突变体的结合。在第二退火步骤中，在较低的温度(例如，57℃)，正向引物竞争结合突变体。由于Tm过高，存在很少的探针与突变体的结合。
在扩增反应中，解链阶段可以在95℃发生，那么对于阻断退火阶段，温度降至66.5℃。然后在循环回至95℃之前，对于引物退火和延伸阶段进一步降至63℃。因此，突变体序列得到扩增，而野生型被阻断。可能仍然有一些野生型序列的扩增，但是突变体序列优先被扩增，因此增加了在样品中的相对丰度。
一旦样品被扩增，通过进行所述的解链曲线分析可以确定不存在野生型序列。使用探针或类似探针的益处在于同一个单一探针阻断野生型的扩增从而富集突变体序列的扩增，并且在测定结束时报道野生型：突变体的比率。所述方法允许在探针区域内的任一种突变体序列的扩增，并且完全不依赖于任何SNP知识；即，可以报道在探针序列内的未知的SNPs。单一探针可以富集在所述单一探针内和或沿着一列的多个探针内的多个密码子上的突变SNPs。该技术还可以用来检测插入/缺失，并且与不对称扩增相容。
实施例2-与其他测试比较
我们进行本文所述的方法与其他测定的比较从而确定可靠性、准确性和灵敏性。获得用于测试的二十种盲的DNA样品，并且使用三种不同的方法测定：1.Genedrive测定(如本文所述，使用来自Epistem的Genedrive热循环系统)；2.使用罗氏(Roche)LightCycler480II的Genedrive测定；3.在罗氏LightCycler480II上的JAK2V617F MutaQuant试剂盒(Ipsogen)。
1.Genedrive测定
测定是基于WT和突变体峰高度的扩增子解链曲线分析。盲测试样品在GenedriveTM上分析，在三个不同的GenedriveTM部件上三次独立的分析运行以单数进行。V617F峰值解链温度(Tm)＝56-58℃。JAK2Wt峰值Tm＝61-65℃。
图6显示来自野生型样品和混合的野生型-V617F突变体样品的示例性解链曲线。
图7显示用于分析的热循环步骤。样品以每次反应10ng、每份样品20μl反应物和40个PCR循环运行。每次样品运行的解链曲线显示在图8中。肉眼进行峰值鉴定。结果总结在下表中。
“读出(Call)”是关于样品是野生型还是突变体的实验确定。
“BWH读出”是来自非盲样品的野生型或突变体的确定。
15/20样品读出与BWH读出一致。5/20样品读出与BWH读出不一致(G7，K11，Q17，R18，T20)。具有差异性读出的样品含有～5％或更少的V617F突变负荷，这表明这是本测定的目前的灵敏性界限。结果显示为3次分析运行的可重现性。
2.Genedrive测定/LightCycler数据
同样，样品以每次反应10ng、每份样品20μl反应物和40个PCR循环运行。循环模式显示在图8中。分析方法是解链曲线基因分型和Tm读出；同样，肉眼确定读出，以确定峰值的存在。此处没有显示原始数据，但是结果总结给出如下：
16/20样品读出与BWH读出一致(15/20样品与GenedriveTM数据一致)。较5/20读出与GenedriveTM数据不一致(G7，K11，Q17，R18，T20)，4/20样品读出与BWH读出不一致(G7，Q17，R18，T20)。具有差异性读出的样品含有～5％或更少的V617F突变负荷，这表明这是本测定的目前的灵敏性界限。检测的样品K11(0.4％V617F突变)表明<5％的V617F突变的检测可以是可行的。
3.Ipsogen JAK2V617F MutaQuant试剂盒
使用JAK2V617F MutaQuant试剂盒(Ipsogen，cat#MQPP-02-CE，lot#12-03-05)，以及TaqMan2X PCR主混合物(Applied Biosystems，cat#4304437，lot#P07408)。标准物、对照和主混合物按照供应商的使用说明制备。样品以每份样品25μl反应物、每次反应25ng模板DNA和50个循环运行。循环模式显示在图9中。
运行17/20BWH样品以允许测定在单个96孔平板上进行筛选(忽略样品B2、D4和E5)。使用480软件版本1.5.0(RocheDiagnostics，GmbH)分析数据。分析方法：Abs Quant/Fit点。从由标准样品产生的标准曲线计算拷贝数。
来自已知的标准物和对照的示例性结果显示在图10中。总结的结果显示如下：
对于筛选的所有样品，Ipsogen MutaQuant筛选的结果与BWH结果一致。尽管这表面上是个较好的结果，但是Genedrive测定使用40个循环的PCR程序，而不是如Ipsogen测定的情形那样使用50个循环，和较低的模板起始量(10ng相对于25ng)。可能的是增加起始模板和循环数将提高Genedrive测定的灵敏性。然而，清楚的是，本文所述的Genedrive方法具有与已有方法相当的灵敏性和准确性，并且提供一种用于JAK2突变的备选测定。此外，所述方法具有不必预先知晓可能存在的特定的突变的优点，并且可以用较少的样品量和较少的扩增循环进行操作。

Claims (17)

1.检测在具有至少第一突变体和野生型等位基因的JAK2基因中的基因座不存在野生型等位基因的方法，所述方法包括：
a)提供反应混合物，其包含：
i)样品，所述样品包含代表JAK2基因的至少一部分的核酸；
ii)寡核苷酸探针，其与突变体等位基因杂交的解链温度(Tm)低于其与野生型等位基因杂交的解链温度；
iii)用于核酸扩增的成对寡核苷酸引物，所述引物与所述样品中的所述核酸在寡核苷酸探针结合位点侧翼的第一和第二位点杂交；其中引物：样品的Tm高于探针：突变体等位基因的Tm；
b)保持所述反应混合物在所述探针：突变体等位基因的Tm与所述探针：野生型等位基因的Tm之间的温度，以使所述探针优先与所述野生型等位基因杂交；
c)对所述反应混合物进行热循环扩增，所述扩增包括解链阶段、退火阶段和延伸阶段，其中所述延伸阶段和退火阶段的温度在所述探针：突变体等位基因的Tm与所述探针：野生型等位基因的Tm之间，以使所述探针在这些阶段与所述野生型等位基因杂交；由此扩增所述突变体等位基因；和
d)在等于或低于所述探针：突变体等位基因的Tm的温度检测所述探针与所述样品的杂交；在等于或低于所述探针：野生型等位基因的Tm的更高的温度检测所述探针与所述样品的杂交；并且比较二者；由此检测所述野生型等位基因的存在或不存在。
2.权利要求1的方法，其中在步骤a)i)中由所述样品代表的JAK2基因的部分跨越SEQ ID NO4所示的JAK2基因的nt2343。
3.权利要求2的方法，其中所述突变体等位基因是在nt2343的突变。
4.权利要求3的方法，其中所述突变体形式是T2343，而所述野生型是G2343。
5.权利要求2-4中任一项的方法，其中所述探针被设计为跨越nt2343和足够的另外的核苷酸，以能够检测在氨基酸残基618的突变。
6.权利要求2-5中任一项的方法，其中所述探针跨越nt2343。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述寡核苷酸探针长度优选为至少15、20、25、26、27、28、29、30个核苷酸。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述寡核苷酸探针包含序列TTTAAATTATGGAGTATG TGT CTG TGGAGA(SEQ ID NO：1)，或由序列TTT AAA TTA TGG AGT ATG TGT CTG TGG AGA(SEQ ID NO：1)组成。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述引物扩增JAK2序列的一部分，其长度为至少50、60、70、80、90、100个核苷酸。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中至少一个所述引物包含核苷酸序列TCT TTGAAG CAG CAAGTATGATGA(SEQ ID NO2；正义引物)或GCA TTA GAA AGC CTG TAG TTT TAC TT(SEQ ID NO3，反义引物)，或由核苷酸序列TCT TTG AAG CAG CAA GTA TGA TGA(SEQID NO2；正义引物)或GCATTA GAAAGC CTG TAG TTT TAC TT(SEQID NO3，反义引物)组成。
11.权利要求10的方法，其中所述引物由核苷酸序列TCT TTG AAGCAG CAA GTA TGA TGA(SEQ ID NO2；正义引物)和GCA TTA GAAAGC CTG TAG TTT TAC TT(SEQ ID NO3，反义引物)组成。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述探针是被标记的。
13.权利要求12的方法，其中所述标记根据所述探针已经与靶标链杂交(即，所述探针是双链核酸的一部分)还是未与之杂交(所述探针是单链的)产生不同的信号。
14.寡核苷酸探针，其包含SEQ ID NO1的核苷酸序列或由SEQ IDNO1的核苷酸序列组成。
15.引物序列，其由SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的核苷酸序列组成或包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的核苷酸序列。
16.引物对，其具有第一引物和第二引物，所述第一引物由SEQ IDNO2的核苷酸序列组成或包含SEQ ID NO2的核苷酸序列，所述第二引物由SEQ ID NO3的核苷酸序列组成或包含SEQ ID NO3的核苷酸序列。
17.用于检测JAK2基因中的突变的试剂盒，所述试剂盒包含引物对和探针，所述引物对具有第一引物和第二引物，所述第一引物由SEQ IDNO2的核苷酸序列组成或包含SEQ ID NO2的核苷酸序列，所述第二引物由SEQ ID NO3的核苷酸序列组成或包含SEQ ID NO3的核苷酸序列；所述探针包含SEQ ID NO1的核苷酸序列或由SEQ ID NO1的核苷酸序列组成。
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