JP6158189B2 - Jak2の突然変異解析 - Google Patents
Jak2の突然変異解析 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6158189B2 JP6158189B2 JP2014532472A JP2014532472A JP6158189B2 JP 6158189 B2 JP6158189 B2 JP 6158189B2 JP 2014532472 A JP2014532472 A JP 2014532472A JP 2014532472 A JP2014532472 A JP 2014532472A JP 6158189 B2 JP6158189 B2 JP 6158189B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- probe
- primer
- allele
- wild type
- mutant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
a) 以下のものを含む反応混合物を提供する工程:
i) JAK2遺伝子の少なくとも一部分を提供する核酸を含む試料;
ii) 前記野生型アリルにハイブリダイズする融解温度(Tm)よりも低いTmにおいて前記突然変異型アリルにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ;
iii) 核酸増幅のための一対のオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記オリゴヌクレオチドプローブの結合部位の両側にある第1の部位および第2の部位において前記試料中の核酸にハイブリダイズし、ここで、プライマー対試料のTmはプローブ対突然変異型アリルのTmよりも高い、プライマー;
b) 前記プローブが、前記野生型アリルに優先的にハイブリダイズするように、前記反応混合物を、プローブ対突然変異型アリルのTmとプローブ対野生型アリルのTmとの間の温度に維持する工程、
c) 前記反応混合物について、融解段階、アニーリング段階、および伸長段階を含む熱サイクリング増幅を実行し、ここで、前記伸長段階およびアニーリング段階の温度は、これらの段階の際に前記プローブが前記野生型アリルにハイブリダイズするように、プローブ対突然変異型アリルのTmとプローブ対野生型アリルのTmとの間とされ、それによって前記突然変異型アリルを増幅する工程;ならびに
d) プローブ対突然変異型アリルのTm以下の温度にて、前記試料に対する前記プローブのハイブリダイゼーションを検出し、プローブ対野生型アリルのTm以下の温度における、より高い温度にて、前記試料に対する前記プローブのハイブリダイゼーションを検出し、これら2つを比較し、それによって前記野生型アリルの存在または欠如を検出する工程
を含む。
野生型JAK2のmRNA配列(配列番号4)の配列を図1に示す。第2343残基はハイライト表示している。
95℃ 5分間 ゲノムDNA変性
95℃ 5秒間 }
53℃ 5秒間 } 40xサイクル
72℃ 5秒間 }
0.1℃/秒、45℃〜75℃におけるエンドポイント融解曲線解析
信頼性、正確性、および感度を決定するために、本明細書に記述される方法と他のアッセイとの比較を行った。試験用に20個の盲検DNA試料を得て、次の3つの異なる方法を使用してアッセイした:1.ジーンドライブアッセイ(本明細書に記述したように、エピステム社のジーンドライブ熱サイクリングシステムを使用する);2.ロシュ社のライトサイクラー480 IIを使用するジーンドライブアッセイ;3.ロシュ社のライトサイクラー480 IIにおけるJAK2 V617Fミュータクォントキット(イプソジェン)。
WTおよび突然変異のピーク高の増幅産物融解曲線解析に基づくアッセイ。盲検試料をジーンドライブ(商標)にて分析した。単独の試料を、3つの異なるジーンドライブ(商標)ユニットにおける3回の独立した分析試行で分析した。V617Fピークの融解温度(Tm)=56〜58℃。JAK2 WtピークのTm=61〜65℃。
ここでも、試料は、反応あたり10ng、試料あたり20μlの反応、40x PCRサイクルにて試験された。サイクルプロファイルを図8に示す。分析法は、融解曲線ジェノタイピングおよびTm判定である。ここでもやはり、判定は目で行ってピークの存在を決定した。生のデータはここでは示さないが、結果の要約を下記に示す。
JAK2 V617Fミュータクォントキット(イプソジェン社、カタログ番号MQPP-02-CE、ロット番号12-03-05)と共に、タックマン(TaqMan) 2X PCRマスターミックス(アプライドバイオシステムズ社、カタログ番号4304437、ロット番号P07408)を使用した。標準、対照、およびマスターミックスは、製造会社の説明書に従って調製した。試料は、試料あたり25μlの反応、反応あたり25ngの鋳型DNA、50Xサイクルにて試験した。サイクリングプロファイルを図9に示す。
Claims (13)
- 少なくとも第1の突然変異型アリルと野生型アリルとを有するJAK2遺伝子中の座位について、野生型アリルの欠如を検出する方法であって、
a) 以下のものを含む反応混合物を提供する工程:
i) JAK2遺伝子の少なくとも一部分を提供する核酸を含む試料;
ii) 前記野生型アリルにハイブリダイズする融解温度(Tm)よりも低いTmにおいて前記突然変異型アリルにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ;
iii) 核酸増幅のための一対のオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記オリゴヌクレオチドプローブの結合部位の両側にある第1の部位および第2の部位において前記試料中の核酸にハイブリダイズし、ここで、プライマー対試料のTmはプローブ対突然変異型アリルのTmよりも高い、プライマー;
b) 前記プローブが、前記野生型アリルに優先的にハイブリダイズするように、前記反応混合物を、プローブ対突然変異型アリルのTmとプローブ対野生型アリルのTmとの間の温度に維持する工程、
c) 前記反応混合物について、融解段階、アニーリング段階、および伸長段階を含む熱サイクリング増幅を実行し、ここで、前記伸長段階およびアニーリング段階の温度は、これらの段階の際に前記プローブが前記野生型アリルにハイブリダイズするように、プローブ対突然変異型アリルのTmとプローブ対野生型アリルのTmとの間とされ、それによって前記突然変異型アリルを増幅する工程;ならびに
d) プローブ対突然変異型アリルのTm以下の温度にて、前記試料に対する前記プローブのハイブリダイゼーションを検出し、プローブ対野生型アリルのTm以下の温度における、より高い温度にて、前記試料に対する前記プローブのハイブリダイゼーションを検出し、これら2つを比較し、それによって前記野生型アリルの存在または欠如を検出する工程
を含み、
プローブが結合に関してプライマーと競合してプライマーの結合を妨げ鎖伸長を妨げるように、前記プライマーの片方または両方は前記プローブの結合部位とオーバーラップしている、
方法。 - 工程a)のi)において試料により提供されるJAK2遺伝子の前記一部分は、配列番号4により示されるJAK2遺伝子の第2343ヌクレオチドを包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記突然変異型アリルは、第2343ヌクレオチドにおける突然変異である、請求項2に記載の方法。
- 前記野生型がG2343であるのに対し、前記突然変異型はT2343である、請求項3に記載の方法。
- 前記プローブは、第2343ヌクレオチドと、第618アミノ酸残基における突然変異を検出することができるために十分な追加的ヌクレオチドとを包含するように設計される、請求項2〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記プローブは、第2343ヌクレオチドを包含する、請求項2〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも15ヌクレオチドの長さである、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブは、TTT AAA TTA TGG AGT ATG TGT CTG TGG AGA(配列番号1)なる配列からなる、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記プライマーは、少なくとも50ヌクレオチドの長さである、JAK2配列の一部分を増幅する、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記プライマーの少なくとも1つが、TCT TTG AAG CAG CAA GTA TGA TGA(配列番号2;センスプライマー)もしくはGCA TTA GAA AGC CTG TAG TTT TAC TT(配列番号3;アンチセンスプライマー)なるヌクレオチド配列からなる、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記プライマーが、TCT TTG AAG CAG CAA GTA TGA TGA(配列番号2;センスプライマー)およびGCA TTA GAA AGC CTG TAG TTT TAC TT(配列番号3;アンチセンスプライマー)なるヌクレオチド配列からなる、請求項10に記載の方法。
- 前記プローブが標識される、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 前記標識は、前記プローブが標的鎖にハイブリダイズしている(すなわち、プローブが二重鎖核酸の一部となっている)か、あるいはハイブリダイズしていない(プローブが一本鎖である)かに依存して差次的なシグナルを生じる、請求項12に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB1116876.2 | 2011-09-30 | ||
GBGB1116876.2A GB201116876D0 (en) | 2011-09-30 | 2011-09-30 | Mutational analysis of JAK2 |
PCT/GB2012/052366 WO2013045908A1 (en) | 2011-09-30 | 2012-09-25 | Mutational analysis of jak2 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014528721A JP2014528721A (ja) | 2014-10-30 |
JP6158189B2 true JP6158189B2 (ja) | 2017-07-05 |
Family
ID=45034941
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014532472A Expired - Fee Related JP6158189B2 (ja) | 2011-09-30 | 2012-09-25 | Jak2の突然変異解析 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9506115B2 (ja) |
EP (1) | EP2761021B1 (ja) |
JP (1) | JP6158189B2 (ja) |
KR (1) | KR20140066776A (ja) |
CN (1) | CN103987859A (ja) |
CA (1) | CA2850121A1 (ja) |
GB (1) | GB201116876D0 (ja) |
WO (1) | WO2013045908A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5813263B1 (ja) * | 2015-03-31 | 2015-11-17 | 日鉄住金環境株式会社 | 遺伝子変異の検出方法及びそれに用いる蛍光標識オリゴヌクレオチド |
AU2017351263B2 (en) * | 2016-10-26 | 2023-12-21 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Method for detecting target base sequence, method for designing and producing probe, and kit |
US11414698B2 (en) * | 2018-03-22 | 2022-08-16 | Chang Gung Medical Foundation Chang Gung Memorial Hospital At Chiayi | Method of quantifying mutant allele burden of target gene |
WO2020145762A1 (ko) * | 2019-01-11 | 2020-07-16 | 주식회사 진캐스트 | Jak2 돌연변이 검출을 위한 dna 중합효소 및 이를 포함하는 키트 |
CN114350767A (zh) * | 2022-01-17 | 2022-04-15 | 武汉海希生物科技有限公司 | 检测jak2基因v617f突变的引物和探针及其应用和试剂盒 |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1100150A (en) | 1966-08-12 | 1968-01-24 | Rolls Royce | Apparatus for testing the profiles of gear teeth |
FR2877013A1 (fr) | 2004-10-27 | 2006-04-28 | Assist Publ Hopitaux De Paris | Indentification d'une mutation de jak2 impliquee dans la polyglobulie de vaquez |
US20070224598A1 (en) | 2006-03-15 | 2007-09-27 | The Methodist Hospital Research Institute | System and method for detection of mutations in JAK2 polynucleotides |
US8354523B2 (en) * | 2006-07-19 | 2013-01-15 | Allelogic Biosciences Corporation | Oligonucleotide probes and uses thereof |
US7803543B2 (en) | 2007-01-19 | 2010-09-28 | Chang Gung University | Methods and kits for the detection of nucleotide mutations using peptide nucleic acid as both PCR clamp and sensor probe |
EP2119796B1 (en) | 2007-07-13 | 2014-01-15 | ARKRAY, Inc. | Probe for detecting mutation in jak2 gene and use thereof |
US20090123920A1 (en) | 2007-11-08 | 2009-05-14 | Maher Albitar | Jak2 mutations |
WO2010001969A1 (ja) * | 2008-07-02 | 2010-01-07 | アークレイ株式会社 | 標的核酸配列の増幅方法、それを用いた変異の検出方法、および、それに用いる試薬 |
US9422597B2 (en) | 2008-11-07 | 2016-08-23 | Biofire Diagnostics, Inc. | Allele amplification bias |
US8206929B2 (en) | 2009-01-07 | 2012-06-26 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid amplification with allele-specific suppression of sequence variants |
WO2011067373A1 (fr) * | 2009-12-04 | 2011-06-09 | Assistance Publique - Hopitaux De Paris | Methode de detection d'une polyglobulie chez un chien |
GB201100150D0 (en) * | 2011-01-06 | 2011-02-23 | Epistem Ltd | Mutational analysis |
-
2011
- 2011-09-30 GB GBGB1116876.2A patent/GB201116876D0/en not_active Ceased
-
2012
- 2012-09-25 US US14/348,508 patent/US9506115B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2012-09-25 JP JP2014532472A patent/JP6158189B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2012-09-25 CA CA2850121A patent/CA2850121A1/en not_active Abandoned
- 2012-09-25 KR KR1020147010952A patent/KR20140066776A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-09-25 CN CN201280058783.8A patent/CN103987859A/zh active Pending
- 2012-09-25 EP EP12766713.7A patent/EP2761021B1/en not_active Not-in-force
- 2012-09-25 WO PCT/GB2012/052366 patent/WO2013045908A1/en active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB201116876D0 (en) | 2011-11-16 |
CN103987859A (zh) | 2014-08-13 |
JP2014528721A (ja) | 2014-10-30 |
WO2013045908A1 (en) | 2013-04-04 |
US20140255937A1 (en) | 2014-09-11 |
EP2761021A1 (en) | 2014-08-06 |
EP2761021B1 (en) | 2018-02-21 |
KR20140066776A (ko) | 2014-06-02 |
CA2850121A1 (en) | 2013-04-04 |
US9506115B2 (en) | 2016-11-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10968487B2 (en) | Oligonucleotides and methods for detecting KRAS and PIK3CA mutations | |
EP1866438B1 (en) | Polynucleotide primers | |
US20140170657A1 (en) | Probe for Detection of Polymorphism in EGFR Gene, Amplification Primer, and Use Thereof | |
JP5841939B2 (ja) | 点変異およびsnpの検出のための高感度迅速等温法、そのプライマーのセットおよびキット | |
Didone et al. | Comparative study of different methodologies to detect the JAK2 V617F mutation in chronic BCR-ABL1 negative myeloproliferative neoplasms | |
JP6158189B2 (ja) | Jak2の突然変異解析 | |
JP5830268B2 (ja) | 標的ポリヌクレオチドの増幅効率の調節方法 | |
WO2011052755A1 (ja) | Mpl遺伝子多型検出用プローブおよびその用途 | |
KR101051385B1 (ko) | 비만 유전자 증폭용 프라이머 세트, 그것을 포함하는 비만 유전자 증폭용 시약 및 그 용도 | |
JP6153758B2 (ja) | 多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用キット | |
US9315871B2 (en) | Mutation detection probe, mutation detection method, method of evaluating drug efficacy, and mutation detection kit | |
JPWO2011077990A1 (ja) | c−kit遺伝子の多型検出用プローブおよびその用途 | |
JP5860667B2 (ja) | Egfrエクソン21l858r遺伝子多型検出用プライマーセット及びその用途 | |
CN112980932B (zh) | 一种检测基因突变的核苷酸及其组合物和方法 | |
US9085803B2 (en) | Probe for detection of polymorphism in ABL gene, and use thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150907 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160628 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160928 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20161101 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170123 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170509 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170607 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6158189 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |