JP5841939B2 - 点変異およびsnpの検出のための高感度迅速等温法、そのプライマーのセットおよびキット - Google Patents
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Description
1)核酸サンプルを提供する工程、
2)適当な反応条件下で、前記核酸サンプルを、オリゴヌクレオチドの混合物とおよびハイブリダイゼーション条件下で鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを含む溶液と接触させる工程であって、前記のオリゴヌクレオチドの混合物が、検出されるべき点変異の核酸位置を含む標的核酸分子の領域のループ媒介性等温増幅に適したプライマーからなり、前記プライマーが、
i.第1の外側プライマーF3および第2の外側プライマーB3と、
ii.第1の内側プライマーFIPおよび第2の内側プライマーBIPと、
iii.ステムループ変異体伸長性プライマーと、
iv.野生型核酸分子を選択的に認識し、ハイブリダイズできる非伸長性部分と
を含み、
FIPが、3’核酸配列F2および5’核酸配列F1cからなり、BIPが、3’核酸配列B2および5’核酸配列B1cからなり、
F2が、F2cと呼ばれる標的核酸分子の領域を認識およびハイブリダイズでき、B2が、B2cと呼ばれる標的核酸分子の領域を認識およびハイブリダイズでき、
F2cおよびB2cが、標的核酸分子の反対側の鎖に位置する異なる領域であり、
B2cが、点変異の下流にあるか、またはF2cが点変異の上流にあるかのいずれかであり、
B2cが点変異の下流にある場合には、前記の点変異は、F2c配列中に位置するか、またはF2c配列の下流であってF1c配列の上流に位置し、またはF2cが点変異の上流にある場合には、前記の点変異は、B2c配列中に位置するか、またはB2c配列の上流であってB1c配列の下流に位置し、
前記ステムループ変異体伸長性プライマーが、
−中央ループ配列が、点変異が存在する場合にのみ、標的核酸分子を認識し、ハイブリダイズできるように、点変異を含む標的核酸分子の領域を選択的に認識し、ハイブリダイズすることができる中央ループ配列と、
−分子内ハイブリダイゼーションの際にステムを形成するように互いに相補的である、5’末端配列および3’末端配列と
を含み、
点変異を含む標的核酸分子の領域に対する中央ループ配列のハイブリダイゼーション親和性が、3’配列に対する5’配列の分子内ハイブリダイゼーション親和性より高く、その結果、点変異が存在する場合に、中央ループ配列が、点変異を含む標的核酸分子の領域とアニールし、増幅する、工程、
3)得られた混合物を一定温度でインキュベートする工程、ならびに
4)点変異を含む標的核酸分子の領域の増幅を示すシグナルを検出する工程
を含む。
−検出されるべき点変異の核酸位置を含む野生型核酸分子の領域を選択的に認識し、ハイブリダイズできる中央ループ配列と、
−5’末端配列および3’末端配列と
を含むステムループ野生型非伸長性プライマーであり、前記5’末端および前記3’末端配列は、ステムを形成するよう互いに相補的であり、その結果、前記中央ループ配列が、核酸分子の野生型配列を含む領域に対して、5’末端配列の、3’末端配列に対するハイブリダイゼーション親和性よりも高いハイブリダイゼーション親和性を有し、その結果、WT配列とのアニーリングおよびWT配列の増幅の阻止をもたらす。当業者ならば、5’末端配列と3’末端配列間のハイブリダイゼーションは、分子内ハイブリダイゼーションであるという事実は、承知している。
F3 5’−GCATCTTTATTATGGCAGAGAG−3’(配列番号3)、
B3 5’−TGCTCTGAGAAAGGCATTA−3’(配列番号4)、
FIP 5’−GCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAATGGACAACAGTCAAACAAC−3’(配列番号5)、
BIP 5’−GCTTTCTCACAAGCATTTGGTTTTAAATTAGCCTGTAGTTTTACTTACTCTC−3’(配列番号6)、
ステムループ変異体伸長性プライマー:5’−GTCTCCACTGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC−3’(配列番号8)。
NH2−GAGTATGTGTCTGTGGA−COOH(配列番号9)(ここで、Gはグアニンであり、Aはアデニンであり、Tはチミンであり、Cはシトシンである)を含む。
試薬
JAK2プラスミドは、供給業者GeneArt(Regensburg、Germany)によって提供され、野生型または変異体JAK2配列を含有していた。詳細には、
−「wtプラスミド」と呼ばれるJAK2プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド93526にG塩基を含む配列番号2の配列93249〜93731に対応する。
−「mutプラスミド」と呼ばれるJAK2プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド93526にT塩基を含む配列番号2の配列93249〜93731に対応する。
プライマー:「プライマー」と呼ばれる、供給業者Eurofins MWG Operon(Ebersberg、Germany)によって合成された。
−GA211(F3) 5’GTCAAACAACAATTCTTTGTACT3’(配列番号10)
−GA212(B3) 5’AGCTGTGATCCTGAAACTG3’(配列番号11)
−GA216(FIP) 5’AATATACTCCATAATTTAAAACCAAATGCTTTCTTTCTTTGAAGCAGCAAGT 3’(配列番号12)
−GA220(BIP) 5’TTTTGTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACATAAACAAAAACAGATGCTCTGA3’(配列番号13)
−GA221(LF) 5’GTGAGAAAGCTTGCTCATCAT3’(配列番号14)
−GA222(LB) 5’AGGCTTTCTAATGCCTTTC3’(配列番号15)
反応バッファー:100mM Tris−HCl pH8.8、50mM KCl、40mM MgSO4、50mM(NH4)2SO4、0.5% Tween、 5%DMSO「バッファー5×」
dNTPミックス25mM(Fermentas)、「dNTP」
Bst大断片ポリメラーゼ8U/μl(New England Biolabs)、「ポリメラーゼ」
滅菌非発熱性水(apyrogen water)(SALF Spa)、「ddw」
サンプル調製
以下のとおりの反応混合物を調製する。0.2μM外側プライマー(F3およびB3)、1.6μM内側プライマー(FIPおよびBIP)、0.8μMループプライマー(LFおよびLB)、1×バッファー溶液、1.4mM dNTPミックス、8U Bstポリメラーゼ。反応混合物の最終容量は、総反応容量の4/5でなくてはならない(すなわち、20μlの反応混合物+5μlサンプル)。試薬は常に氷上で維持する。3種の陰性対照(7e3cps/ulの野生型プラスミド)、12種の陽性対照(3サンプルの7e3cps/ul変異体プラスミド、3サンプルの7e2cps/ul変異体プラスミド、3サンプルの7e1cps/ul変異体プラスミド、3サンプルの7e0cps/ul変異体プラスミド)、1種の標的なし対照を含む少なくとも17サンプルのために混合物を調製する。
反応は、図1および2の方法スキームにしたがう。
分析される各サンプルの閾値時間を見出すために、a.u.(吸光度の任意の単位)を単位として吸光度の変化を分析する。閾値時間は、サンプル吸光度が、ベースラインを差し引いた後に、閾値に相当する任意単位の値(この場合には、0.1a.u.)に達する分である。各サンプルによって到達される閾値時間は、そのDNAコピー/μlの対数と相関する。
「LAMP JAK2ダンベル」戦略は、SNP検出のためのEiken LAMP法に基づいている(EP1231281、20、21、22ならびにhttp://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/snps_anim.htmlに記載されている)。
試薬
JAK2プラスミドは、供給業者GeneArt(Regensburg、Germany)によって、野生型または変異体JAK2配列を含有するように合成された。詳細には、
−「wtプラスミド」と呼ばれるJAK2プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド93526にG塩基を含む配列番号2の配列93249〜93731に対応する。
−「mutプラスミド」と呼ばれるJAK2プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド93526にT塩基を含む配列番号2の配列93249〜93731に対応する。
プライマー:「プライマー」と呼ばれる、Eurofins MWG Operonによって合成された。
下線を引いた塩基は、ミスマッチしたヌクレオチドに相当する。太字の塩基は、JAK2コード配列のATG開始コドンから位置1849の変異ヌクレオチドに相当する。
反応バッファー:100mM Tris−HCl pH8.8、50mM KCl、40mM MgSO4、50mM(NH4)2SO4、0.5% Tween、「バッファー5×」
dNTPミックス25mM(Fermentas)、「dNTP」
Bst大断片ポリメラーゼ8U/μl(New England Biolabs)、「ポリメラーゼ」
滅菌非発熱性水(SALF Spa)、「ddw」
サンプル調製
プライマーをアリコートで保存する。保存溶液を−20℃で保存することが良好であるが、作業中の希釈液は4℃で保存されるべきである。
反応は、図3の方法スキームにしたがう。
分析される各サンプルの閾値時間を見出すために、a.u.を単位として吸光度の変化を分析する。閾値時間は、サンプル吸光度が、ベースラインを差し引いた後に、閾値に相当する任意単位の値(この場合には、0.1a.u.)に達する分である。各サンプルによって到達される閾値時間は、そのDNAコピー/μlの対数と相関する。
本アプローチは、変異体特異的ループプライマーを使用することによる変異体配列の選択的増幅からなる(図3)。本発明者らは、B2とB1cとの間に含まれるループ領域中に推定変異を提示するダンベル構造を得るよう、F3、B3、FIPおよびBIPオリゴヌクレオチドを含むユニバーサル(変異体非感受性)プライマーのセットを設計した。さらに、本発明者らは、JAK2コード配列の位置1849の変異ヌクレオチドTと相補的な3’末端の最後の塩基および3’末端から3番目の塩基においてミスマッチした塩基を提示するループプライマーを設計した。
試薬
JAK2プラスミドは、供給業者GeneArt(Regensburg、Germany)によって、野生型または変異体JAK2配列を含有するように合成された。詳細には、
−「wtプラスミド」と呼ばれるJAK2プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド93526にG塩基を含む配列番号2の配列93249〜93731に対応する。
−「mutプラスミド」と呼ばれるJAK2プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド93526にT塩基を含む配列番号2の配列93249〜93731に対応する。
プライマー:「プライマー」と呼ばれる、Eurofins MWG Operon(Ebersberg、Germany)によって合成された。
−GA231(F3) 5’GCATCTTTATTATGGCAGAGAG3’(配列番号3)
−GA232(B3) 5’TGCTCTGAGAAAGGCATTA3’(配列番号4)
−GA233(FIP) 5’GCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAATGGACAACAGTCAAACAAC3’(配列番号5)
−GA234(BIP) 5’GCTTTCTCACAAGCATTTGGTTTTAAATTAGCCTGTAGTTTTACTTACTCTC3’(配列番号6)
−GA235(LF) 5’GTCTCCACTGGAGTATGTGTCTGTGGAGAddC3’(配列番号7)
下線を引いた塩基は、JAK2コード配列(GeneBank受託番号NM 004972)中のATG開始コドンから位置1849の野生型ヌクレオチドに相当する。
−ddCは、非伸長性ジデオキシシトシンを表す。
−GA236(LB) 5’GTCTCCACTGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC3’(配列番号8)
−下線を引いた塩基は、JAK2コード配列(GeneBank受託番号NM 004972)中のATG開始コドンから位置1849の変異したヌクレオチドに相当する。
反応バッファー:100mM Tris−HCl pH8.8、50mM KCl、40mM MgSO4、50mM(NH4)2SO4、0.5% Tween、「バッファー5×」
dNTPミックス25mM(Fermentas)、「dNTP」
Bst大断片ポリメラーゼ8U/μl(New England Biolabs)、「ポリメラーゼ」
滅菌非発熱性水(SALF Spa)、「ddw」
サンプル調製
プライマーをアリコートで保存する。保存溶液を−20℃で保存することが良好であるが、作業中の希釈液は4℃で保存されるべきである。
反応は、図4の方法スキームにしたがう。
分析される各サンプルの閾値時間を見出すために、a.u.を単位として吸光度の変化を分析する。閾値時間は、サンプル吸光度が、ベースラインを差し引いた後に、閾値に相当する任意単位の値(この場合には、0.1a.u.)に達する分である。各サンプルによって到達される閾値時間は、そのDNAコピー/μlの対数と相関する。
本アプローチは、特定のループプライマーの、変異体配列から形成されるダンベルとの選択的ハイブリダイゼーションをもたらす、このようなループプライマー設計に基づく変異体配列の選択的増幅からなる(図4)。本発明者らは、B1とB2の間に含まれるループ領域中に推定変異を提示するダンベル構造を得るよう、F3、B3、FIPおよびBIPオリゴヌクレオチドを含むユニバーサル(変異体非感受性)プライマーのセットを設計した。B2内またはB2とB1cとの間のループ領域中に推定変異ヌクレオチドを含有する代替配列でこのような実験を実施した際には、大きな相違は検出されなかった。本発明者らは、プライマーセット中に、その自身の3’末端の配列と相補的であるその5’末端に、8塩基の配列領域を提示する特定のループプライマーを含めた。その結果として、この特別のループプライマーは、反応温度(65℃)でそのオープン型と平衡にある分子内ヘアピン構造を形成する。
試薬
JAK2プラスミドは、供給業者GeneArt(Regensburg、Germany)によって、野生型または変異体JAK2配列を含有するように合成された。詳細には、
−「wtプラスミド」と呼ばれるJAK2プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド93526にG塩基を含む配列番号2の配列93249〜93731に対応する。
−「mutプラスミド」と呼ばれるJAK2プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド93526にT塩基を含む配列番号2の配列93249〜93731に対応する。
プライマー:「プライマー」と呼ばれる、Eurofins MWG Operonによって合成された。
−GA231(F3) 5’GCATCTTTATTATGGCAGAGAG3’(配列番号3)
−GA232(B3) 5’TGCTCTGAGAAAGGCATTA3’(配列番号4)
−GA233(FIP) 5’GCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAATGGACAACAGTCAAACAAC3’(配列番号5)
−GA234(BIP) 5’GCTTTCTCACAAGCATTTGGTTTTAAATTAGCCTGTAGTTTTACTTACTCTC3’(配列番号6)
−GA236(LB) 5’GTCTCCACTGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC3’(配列番号8)
下線を引いた塩基は、JAK2コード配列(GeneBank受託番号NM 004972)中のATG開始コドンから位置1849の変異ヌクレオチドに対応する。
PNA:Eurogentecによって合成された、「PNA」と呼ばれる、GM43 NH2GAGTATGTGTCTGTGGACOOH(配列番号9)。
下線を引いた塩基は、JAK2コード配列(GeneBank受託番号NM 004972)中のATG開始コドンから位置1849の野生型ヌクレオチドに対応する。
反応バッファー:100mM Tris−HCl pH8.8、50mM KCl、40mM MgSO4、50mM(NH4)2SO4、0.5% Tween、「バッファー5×」
dNTPミックス25mM(Fermentas)、「dNTP」
Bst大断片ポリメラーゼ8U/μl(New England Biolabs)、「ポリメラーゼ」
滅菌非発熱性水(SALF Spa)、「ddw」
サンプル調製
プライマーをアリコートで保存する。保存溶液を−20℃で保存することが良好であるが、作業中の希釈液は4℃で保存されるべきである。
反応は、図5の方法スキームにしたがう。
分析される各サンプルの閾値時間を見出すために、a.u.を単位として吸光度の変化を分析する。閾値時間は、サンプル吸光度が、ベースラインを差し引いた後に、閾値に相当する任意単位の値(この場合には、0.1a.u.)に達する分である。各サンプルによって到達される閾値時間は、そのDNAコピー/μlの対数と相関する。
このアプローチは、特定のループプライマーの、変異体配列から形成されるダンベルとの選択的ハイブリダイゼーションをもたらす、このようなループプライマー設計に基づいた変異体配列の選択的増幅からなる(図5)。本発明者らは、B1とB2の間に含まれるループ領域中に推定される変異ヌクレオチドを提示するダンベルを得るよう、F3、B3、FIPおよびBIPオリゴヌクレオチドを含むユニバーサル(変異体非感受性)プライマーのセットを設計した。B2内またはB2とB1cとの間のループ領域中に推定変異ヌクレオチドを含有する代替配列でこのような実験を実施した際には、大きな相違は検出されなかった。本発明者らは、プライマーセット中に、その自身の3’末端の配列と相補的であるその5’末端に、8塩基の配列領域を提示する特定のループプライマーを含めた。その結果として、この特別のループプライマーは、反応温度(65℃)でそのオープン型と平衡にある分子内ヘアピン構造を形成する。
合計29サンプルの、Ospedali Riuniti di Bergamoで患者から抽出したDNAを、実施例4に記載される、JAK2 LAMP「PNAを伴うステムループプライマー」戦略を使用して分析した。得られた結果を、ARM技術を使用して病院で得られたデータと比較した。ARMSは、オリゴヌクレオチドプライマーは、PCRの際にこれらのプライマーを伸長するためには、DNAポリメラーゼに対してその3’末端で完全にアニーリングされなければならないという事実を利用する。3’末端で特定のJAK2点変異に合致するオリゴヌクレオチドプライマーを設計することによって、ARMSは、野生型および変異体対立遺伝子を区別できる。
試薬
JAK2プラスミドは、供給業者GeneArt(Regensburg、Germany)によって、野生型または変異体JAK2配列を含有するように合成された。詳細には、
−「wtプラスミド」と呼ばれるJAK2プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド93526にG塩基を含む配列番号2の配列93249〜93731に対応する。
−「mutプラスミド」と呼ばれるJAK2プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド93526にT塩基を含む配列番号2の配列93249〜93731に対応する。
プライマー:「プライマー」と呼ばれる、Eurofins MWG Operonによって合成された。
下線を引いた塩基は、JAK2コード配列(GeneBank受託番号NM 004972)のATG開始コドンから位置1849の変異ヌクレオチドに相当する。5’末端の太字のチミン塩基は、標的配列中に相補的な塩基を有さない。それは、クエンチング効果を有する下流のグアニン塩基からフルオロフォアを分離するために加えられた。
−GA235(LF) 5’−5’GTCTCCACTGGAGTATGTGTCTGTGGAGAddC3’(配列番号7)
下線を引いた塩基は、JAK2コード配列(GeneBank受託番号NM 004972)のATG開始コドンから位置1849における野生型ヌクレオチドに相当し、ddCは、非伸長性ジデオキシシトシンを表す。
反応バッファー:100mM Tris−HCl pH8.8、50mM KCl、40mM MgSO4、50mM(NH4)2SO4、0.5% Tween、「バッファー5×」
dNTPミックス25mM(Fermentas)、「dNTP」
Bst大断片ポリメラーゼ8U/μl(New England Biolabs)、「ポリメラーゼ」
滅菌非発熱性水(SALF Spa)、「ddw」
サンプル調製
プライマーをアリコートで保存する。保存溶液を−20℃で保存することが良好であるが、作業中の希釈液は4℃で保存されるべきである。
反応は、図4の方法スキームにしたがう。
反応物中の蛍光自己アニーリング型ループプライマーは、適切な波長発光によって励起されると蛍光シグナルを生じる。LAMP反応が進行すると、蛍光自己アニーリング型ループプライマーは、相補的標的配列とハイブリダイズし、その結果として、増幅生成物中に組み込まれる。蛍光自己アニーリング型ループプライマーは、5’末端に近接して少なくとも1つのグアニンヌクレオチドを含有する配列に対して相補的であるように設計される。グアニン塩基は、フルオロフォア(本発明者らの場合には、TAMRA)によって発光された波長を吸収でき、蛍光シグナルのクエンチングを引き起こす。この場合には、LAMP反応の際の標的配列増幅の検出は、分析中の各サンプルの閾値時間を見出すために、蛍光シグナルの減少を測定することに基づく。閾値時間は、反応蛍光シグナルが、50%のクエンチングに達する分である。各サンプルについて、閾値時間は、DNAコピー/μlの対数と相関する。
本アプローチは、特定のループプライマーの、変異体配列から形成されるダンベルとの選択的ハイブリダイゼーションをもたらす、このようなループプライマー設計に基づく変異体配列の選択的増幅からなる(図4)。本発明者らは、B1とB2との間に含まれるループ領域中に推定変異を提示するダンベル構造を得るよう、F3、B3、FIPおよびBIPオリゴヌクレオチドを含むユニバーサル(変異体非感受性)プライマーのセットを設計した。B2内またはB2とB1cの間のループ領域中に推定変異ヌクレオチドを含有する代替配列でこのような実験を実施した際には大きな相違は検出されなかった。本発明者らは、該プライマーセット中に、その自身の3’末端の配列と相補的であるその5’末端に、8塩基の配列領域を提示する特定のループプライマーを含めた。その結果として、この特別のループプライマーは、反応温度(65℃)でそのオープン型と平衡にある分子内ヘアピン構造を形成する。
試薬
JAK2プラスミドは、供給業者GeneArt(Regensburg、Germany)によって、野生型または変異体JAK2配列を含有するように合成された。詳細には、
「wtプラスミド」と呼ばれるJAK2プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド93526にG塩基を含む配列番号2の配列93249〜93731に対応する。
−「mutプラスミド」と呼ばれるJAK2プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド93526にT塩基を含む配列番号2の配列93249〜93731に対応する。
プライマー:「プライマー」と呼ばれる、Eurofins MWG Operonによって合成された。
−GA231(F3) 5’GCATCTTTATTATGGCAGAGAG3’(配列番号3)
−GA232(B3) 5’TGCTCTGAGAAAGGCATTA3’(配列番号4)
−GA233(FIP) 5’GCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAATGGACAACAGTCAAACAAC3’(配列番号5)
−GA234(BIP) 5’GCTTTCTCACAAGCATTTGGTTTTAAATTAGCCTGTAGTTTTACTTACTCTC3’(配列番号6)
反応バッファー:100mM Tris−HCl pH8.8、50mM KCl、40mM MgSO4、50mM(NH4)2SO4、0.5% Tween、「バッファー5×」
dNTPミックス25mM(Fermentas)、「dNTP」
Bst大断片ポリメラーゼ 8U/μl(New England Biolabs)、「ポリメラーゼ」
滅菌非発熱性水(SALF Spa)、「ddw」
サンプル調製
プライマーをアリコートで保存する。保存溶液を−20℃で保存することが良好であるが、作業中の希釈液は4℃で保存されるべきである。
反応は、図11の方法スキームにしたがう。
分析される各サンプルの閾値時間を見出すために、a.u.を単位として吸光度の変化を分析する。閾値時間は、サンプル吸光度が、ベースラインを差し引いた後に、閾値に相当する任意単位の値(この場合には、0.1a.u.)に達する分である。各サンプルによって到達される閾値時間は、そのDNAコピー/μlの対数と相関する。
本アプローチは、F3、B3、FIPおよびBIPプライマーを使用することによるJAK2遺伝子配列の変異体−非感受性増幅からなる(図11)。本発明者らは、反応混合物からPNAおよび変異体特異的ステムループプライマーを除いて、「実施例4」において記載される同じプライマーセットを使用した。「LAMP対照アッセイ」における標的配列増幅の検出は、鋳型に対するプライマーの正しい塩基マッチング、効率的な伸長条件および反応溶液中の阻害剤の不在などの種々の品質パラメータを示す。逆に、「LAMP対照アッセイ」における核酸サンプル増幅の不在または遅延は、反応設定(すなわち、バッファー組成、温度、プライマーの品質、..)における問題または反応混合物中の阻害剤の存在を強調する。
試薬
JAK2プラスミドは、供給業者GeneArt(Regensburg、Germany)によって、野生型または変異体JAK2配列を含有するように合成された。詳細には、
−「wtプラスミド」と呼ばれるJAK2プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド93526にG塩基を含む配列番号2の配列93249〜93731に対応する。
−「mutプラスミド」と呼ばれるJAK2プラスミド、このインサートは、ヌクレオチド93526にT塩基を含む配列番号2の配列93249〜93731に対応する。
プライマー:「プライマー」と呼ばれる、Eurofins MWG Operonによって合成された。
−GA231(F3) 5’GCATCTTTATTATGGCAGAGAG3’(配列番号3)
−GA232(B3) 5’TGCTCTGAGAAAGGCATTA3’(配列番号4)
−GA233(FIP) 5’GCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAATGGACAACAGTCAAACAAC3’(配列番号5)
−GA234(BIP)5’GCTTTCTCACAAGCATTTGGTTTTAAATTAGCCTGTAGTTTTACTTACTCTC3’(配列番号6)
−GA236(LB) 5’GTCTCCACTGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC3’(配列番号8)
下線を引いた塩基は、JAK2コード配列(GeneBank受託番号NM 004972)のATG開始コドンから位置1849の変異したヌクレオチドに相当する。
PNA:Eurogentec、「PNA」と呼ばれる、GM43 NH2GAGTATGTGTCTGTGGACOOH(配列番号9)
下線を引いた塩基は、JAK2コード配列(GeneBank受託番号NM 004972)中のATG開始コドンから位置1849の野生型ヌクレオチドに対応する。
反応バッファー:100mM Tris−HCl pH8.8、50mM KCl、40mM MgSO4、50mM(NH4)2SO4、0.5% Tween、「バッファー5×」
dNTPミックス25mM(Fermentas)、「dNTP」
Bst大断片ポリメラーゼ 8U/μl(New England Biolabs)、「ポリメラーゼ」
滅菌非発熱性水(SALF Spa)、「ddw」
サンプル調製
プライマーをアリコートで保存する。保存溶液を−20℃で保存することが良好であるであるが、作業中の希釈液は4℃で保存されるべきである。
反応は、図5の方法スキームにしたがう。
分析される各サンプルの閾値時間を見出すために、a.u.を単位として吸光度の変化を分析する。閾値時間は、サンプル吸光度が、ベースラインを差し引いた後に、閾値に相当する任意単位の値(この場合には、0.1a.u.)に達する分である。各サンプルによって到達される閾値時間は、そのDNAコピー/μlの対数と相関する。
患者のサブセットは、JAK2 V617F対立遺伝子についてホモ接合性である1。ホモ接合性の機序は、有糸分裂組換えおよび後天性片親性ダイソミーとして知られる変異体対立遺伝子の複製に起因する1。JAK2変異体対立遺伝子のヘテロ接合性またはホモ接合性は、予後と相関し、ひいては、サンプル中のJAK2変異体対立遺伝子コピーの量が、50%よりも高いか低いかを決定することの重要性をもたらす。
Claims (27)
- 野生型核酸分子のバックグラウンドにおける標的核酸分子中の点変異の存在を検出する方法であって、
1)核酸サンプルを提供する工程、
2)適当な反応条件下で、前記核酸サンプルを、オリゴヌクレオチドの混合物およびハイブリダイゼーション条件下で鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを含む溶液と接触させる工程であって、前記のオリゴヌクレオチドの混合物が、検出されるべき点変異の核酸位置を含む標的核酸分子の領域のループ媒介性等温増幅に適したプライマーからなり、前記プライマーが、
i.第1の外側プライマーF3および第2の外側プライマーB3、
ii.第1の内側プライマーFIPおよび第2の内側プライマーBIP、
iii.ステムループ変異体伸長性プライマー、
iv.野生型核酸分子を選択的に認識し、ハイブリダイズできる非伸長性部分
を含み、
ここに、FIPが、3’核酸配列F2および5’核酸配列F1cからなり、BIPが、3’核酸配列B2および5’核酸配列B1cからなり、
F2がF2cと呼ばれる標的核酸分子の領域を認識およびハイブリダイズでき、B2が、B2cと呼ばれる標的核酸分子の領域を認識およびハイブリダイズでき、
F2cおよびB2cが、標的核酸分子の反対側の鎖に位置する異なる領域であり、
B2cが点変異の下流にあるか、またはF2cが点変異の上流にあるかのいずれかであり、
B2cが点変異の下流にある場合には、前記点変異は、F2c配列中に位置するか、またはF2c配列の下流であってF1c配列の上流に位置し、
F2cが点変異の上流にある場合には、前記点変異は、B2c配列中に位置するか、またはB2c配列の上流であってB1c配列の下流に位置し、
前記ステムループ変異体伸長性プライマーが、
−中央ループ配列が、点変異が存在する場合にのみ、標的核酸分子を認識し、ハイブリダイズできるように、点変異を含む標的核酸分子の領域を選択的に認識し、ハイブリダイズすることができる中央ループ配列と、
−分子内ハイブリダイゼーションの際にステムを形成するように互いに相補的である、5’末端配列および3’末端配列と
を含み、
点変異を含む標的核酸分子の領域に対する中央ループ配列のハイブリダイゼーション親和性が、3’配列に対する5’配列の分子内ハイブリダイゼーション親和性より高く、その結果、点変異が存在する場合に、中央ループ配列が、点変異を含む標的核酸分子の領域とアニールし、増幅する、工程、
3)得られた混合物を一定温度でインキュベートする工程、
4)点変異を含む標的核酸分子の領域の増幅を示すシグナルを検出する工程
を含む方法。 - 点変異が、F2c配列とF1c配列との間またはB2c配列とB1c配列との間の領域中に位置する、請求項1に記載の方法。
- 点変異が、F2c配列中またはB2c配列中に位置する、請求項1に記載の方法。
- ステムループ変異体伸長性プライマーの5’末端配列および3’末端配列の各々が、少なくとも3ヌクレオチドの長さである、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 非伸長性部分が、ペプチド核酸(PNA)である、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- PNAが、少なくとも10塩基の長さである、請求項5に記載の方法。
- PNA塩基配列は、点変異の不在下における標的核酸分子とのPNAのハイブリダイゼーションに起因する二本鎖構造の融解温度(Tm=X)がインキュベーション温度よりも高く、点変異の存在下における標的核酸分子とのPNAのハイブリダイゼーションに起因する二本鎖構造の融解温度(Tm=Y)がインキュベーション温度よりも低く、さらに、Xが、Yよりも少なくとも5℃高い、請求項5または6に記載の方法。
- 非伸長性部分が、
−検出されるべき点変異の核酸位置を含む野生型核酸分子の領域を選択的に認識し、ハイブリダイズできる中央ループ配列、
−分子内ハイブリダイゼーションの際にステムを形成するよう互いに相補的である5’末端配列および3’末端配列
を含むステムループ野生型非伸長性プライマーであり、
検出されるべき点変異の核酸位置を含む野生型核酸分子の領域に対する、中央ループ配列のハイブリダイゼーション親和性が、3’末端配列に対する5’末端配列の分子内ハイブリダイゼーション親和性より高く、その結果、中央ループ配列が、検出されるべき点変異の核酸位置を含む野生型核酸分子の領域とアニールし、それによって、増幅を阻止する、請求項1から4のいずれかに記載の方法。 - DNAポリメラーゼが、Bst大断片ポリメラーゼ、Bca(exo−)、Vent(商標)、Vent(exo−)、Deep Vent(商標)、Deep Vent(exo−)、Φ29ファージ、MS−2ファージ、Z−Taq(商標)、KOD、クレノウ断片およびその任意の組合せからなる群から選択される、請求項1から8のいずれかに記載の方法。
- 検出されるべき点変異が、配列番号1の位置2343のg→t変異である、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- 第1の外側プライマーF3が、配列番号3からなり、第2の外側プライマーB3が、配列番号4からなり、第1の内側プライマーFIPが、配列番号5からなり、第2の内側プライマーBIPが、配列番号6からなり、ステムループ変異体伸長性プライマーが、配列番号8からなる、請求項10に記載の方法。
- 配列番号2の位置93526を含むJAK2ゲノムDNA(配列番号2)の領域、または配列番号1の位置2343を含むJAK2cDNA(配列番号1)の領域とハイブリダイズできる塩基配列を含む、6〜24塩基の長さのペプチド核酸(PNA)である非伸長性部分をさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 非伸長性部分が以下の塩基配列
NH2−GAGTATGTGTCTGTGGA−COOH(配列番号9)
を有するPNAであり、ここで、Gがグアニンであり、Aがアデニンであり、Tがチミンであり、Cがシトシンである、請求項12に記載の方法。 - サンプルから得られた点変異を含む標的核酸分子の領域の増幅を示すシグナルを、少なくとも1種の標準物質から得られた前記シグナルと定量的に比較することによって、点変異が、ホモ接合型またはヘテロ接合型であるかを評価する工程をさらに含む、請求項1から13のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも1種の標準物質が、野生型核酸分子のバックグラウンドにおける所定のパーセンテージ(%)の変異体標的核酸分子からなり、前記の所定のパーセンテージ(%)が10%である、請求項14に記載の方法。
- ループ媒介性等温増幅によって、野生型核酸分子のバックグラウンドにおける標的核酸分子中の点変異の存在を検出するためのプライマーのセットであって、
i.第1の外側プライマーF3および第2の外側プライマーB3、
ii.第1の内側プライマーFIPおよび第2の内側プライマーBIP、
iii.ステムループ変異体伸長性プライマー
を含み、
ここに、FIPが、3’核酸配列F2および5’核酸配列F1cからなり、BIPが、3’核酸配列B2および5’核酸配列B1cからなり、
F2がF2cと呼ばれる標的核酸分子の領域と相補的であり、B2が、B2cと呼ばれる標的核酸分子の領域と相補的であり、
F2cおよびB2cが、標的核酸分子の反対側の鎖に位置する非重複領域であり、
B2cが点変異の下流にあるか、またはF2cが点変異の上流にあるかのいずれかであり、
B2cが点変異の下流にある場合には、前記点変異は、F2c配列中もしくはF2c配列とF1c配列の間に位置し、または
F2cが点変異の上流にある場合には、前記点変異は、B2c配列中もしくはB2c配列とB1c配列の間に位置し、
前記ステムループ変異体伸長性プライマーが、
−中央ループ配列が、点変異が存在する場合にのみ、標的核酸分子を認識し、ハイブリダイズできるように、点変異を含む標的核酸分子の領域を選択的に認識し、ハイブリダイズすることができる中央ループ配列と、
−分子内ハイブリダイゼーションの際にステムを形成するよう互いに相補的である5’末端配列および3’末端配列
を含み、
点変異を含む標的核酸分子の領域に対する中央ループ配列のハイブリダイゼーション親和性が、5’配列の3’配列に対する分子内ハイブリダイゼーション親和性よりも高い、プライマーのセット。 - ステムループ変異体伸長性プライマーの5’末端配列および3’末端配列の各々が、少なくとも3ヌクレオチドの長さである、請求項16に記載のプライマーのセット。
- 野生型核酸分子とハイブリダイズできる非伸長性部分をさらに含む、請求項16または17に記載のプライマーのセット。
- 非伸長性部分が、ペプチド核酸(PNA)である、請求項18に記載のプライマーのセット。
- PNAが、少なくとも10塩基の長さである、請求項19に記載のプライマーのセット。
- 非伸長性部分が、
−検出されるべき点変異の核酸位置を含む野生型核酸分子の領域と相補的である中央ループ配列、
−分子内ハイブリダイゼーションの際にステムを形成するよう互いに相補的である5’末端配列および3’末端配列
を含むステムループ非伸長性プライマーであり、
検出されるべき点変異の核酸位置を含む野生型核酸分子の領域に対する中央ループ配列のハイブリダイゼーション親和性が、3’末端配列に対する5’末端配列の分子内ハイブリダイゼーション親和性よりも高い、請求項18に記載のプライマーのセット。 - 第1の外側プライマーF3が、配列番号3からなり、第2の外側プライマーB3が、配列番号4からなり、第1の内側プライマーFIPが、配列番号5からなり、第2の内側プライマーBIPが、配列番号6からなり、ステムループ変異体伸長性プライマーが、配列番号8からなる、請求項16から21のいずれかに記載のプライマーのセット。
- 配列番号2の位置93526を含むJAK2ゲノムDNA(配列番号2)の領域、または配列番号1の位置2343を含むJAK2cDNA(配列番号1)の領域とハイブリダイズできる塩基配列を含む、6〜24塩基の長さのペプチド核酸(PNA)である非伸長性部分をさらに含む、請求項22に記載のプライマーのセット。
- 非伸長性部分が以下の塩基配列
NH2−GAGTATGTGTCTGTGGA−COOH(配列番号9)を有するPNAであり、ここで、Gがグアニンであり、Aがアデニンであり、Tがチミンであり、Cがシトシンである、請求項23に記載のプライマーのセット。 - ループ媒介性等温増幅によって、野生型核酸分子のバックグラウンドにおける標的核酸分子中の点変異の存在を検出するためのキットであって、請求項16から24のいずれかに記載のプライマーのセットと、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼとを含む、キット。
- DNAポリメラーゼが、Bst大断片ポリメラーゼ、Bca(exo−)、Vent、Vent(exo−)、Deep Vent、Deep Vent(exo−)、Φ29ファージ、MS−2ファージ、Z−Taq、KOD、クレノウ断片およびその任意の組合せからなる群から選択される、請求項25に記載のキット。
- 1種または複数の標準物質をさらに含む、請求項25または26に記載のキット。
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