JP7241634B2

JP7241634B2 - ヒトｂｒａｆのｖ６００変異検出用プローブ及びヒトｂｒａｆのｖ６００変異の検出方法

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Description

本開示は、ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブ及びヒトＢＲＡＦのＶ６００変異の検出方法に関する。

ＢＲＡＦ（ｖ－ｒａｆｍｕｒｉｎｅｓａｒｃｏｍａｖｉｒａｌｏｎｃｏｇｅｎｅｈｏｍｏｌｏｇＢ１）遺伝子は、肺癌の重要なドライバー遺伝子である。このＢＲＡＦ遺伝子変異は肺癌のみならず悪性黒色腫や大腸癌など様々な悪性腫瘍で起こることが知られている。これらの悪性腫瘍においては、ＢＲＡＦ遺伝子に様々な変異が生じることが知られており、主なものとして、たとえば、コドン６００のバリンに生ずる変異（Ｖ６００変異）が挙げられる。Ｖ６００変異には、バリンが、グルタミン酸に置換されるＶ６００Ｅ変異、リジンに置換されるＶ６００Ｋ変異、アルギニンに置換されるＶ６００Ｒ変異、アスパラギン酸に置換されるＶ６００Ｄ変異などがある。

特に、Ｖ６００変異が生じている悪性黒色腫や肺癌には治療効果の高い分子標的薬がある。したがって、このような分子標的薬の適用の可否を判断するためにも、ＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００変異を検出する必要があり、様々な測定技術が実用化されている。たとえば、下記非特許文献１に挙げられているように、ダイレクトシークエンス法、アリル特異的ＰＣＲ法及び次世代シークエンス（ＮＧＳ）法がＶ６００変異検出に利用されている。

ダイレクトシークエンス法は測定対象の塩基配列を決定することが可能な方法で、Ｖ６００Ｅ変異以外のＶ６００変異を検出することができるが、検出感度が低いことが問題である。

アリル特異的ＰＣＲ法は検出したい変異型アリルに特異的なプライマーを利用して変異配列の増幅の有無を確認する方法であり、検出感度は高いが検出可能な変異の種類が少ないことが問題である。たとえば、下記特許文献１及び２ではＰＣＲ法にてＶ６００Ｅ変異の検出が試みられている。

次世代シーケンス法はダイレクトシーケンス法と同様に測定対象の塩基配列を決定することが可能な方法で、Ｖ６００Ｅ変異以外のＶ６００変異も検出でき検出感度も高いが、高価な装置が必要で操作も非常に煩雑であることが問題である。

ＣＮ１０８２７７２６３ＡＣＮ１０４６１１４０６Ａ

日本肺癌学会バイオマーカー委員会「肺癌患者におけるＢＲＡＦ遺伝子変異検査の手引き」第１．０版、https://www.haigan.gr.jp/uploads/files/photos/1620.pdf、２０１８年４月５日

Ｖ６００Ｅ変異以外のＶ６００変異を感度よく簡便に検出可能な技術として融解曲線解析法が挙げられる。融解曲線解析法は二本鎖ＤＮＡの解離温度の違いを利用して変異を検出する方法である。融解曲線解析法は検出感度が良好で操作も簡便であり、変異検出に利用する核酸プローブの配列を野生型配列と完全一致するように設計することでＶ６００Ｅ変異だけでなくＶ６００Ｅ変異以外のＶ６００変異も検出可能となる。

しかしながら、核酸プローブの配列を野生型配列と完全一致するように設計すると、測定対象にＶ６００変異以外の変異が存在した場合、交差反応による偽陽性を示すおそれがある。特に、肺癌を対象としたＢＲＡＦ遺伝子変異検出の場合、Ｖ６００変異以外の変異でＶ６００の近傍に位置するＫ６０１Ｅ変異（コドン６０１のリジンがグルタミン酸に置換）は頻度も高く、Ｖ６００変異との交差反応が問題となる。

そこで本発明の実施態様は、融解曲線解析法において、Ｖ６００Ｅ変異を含むＶ６００変異を検出可能としつつ、Ｋ６０１Ｅ変異との交差反応を示さないＢＲＡＦ遺伝子変異検出用プローブの提供を課題とする。

本開示の実施態様のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブは、配列番号１に示す塩基配列において、５’末端から数えて１９番目に位置するアデニンが、シトシンともチミンとも相補的でない塩基に置換されているとともに、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドである。好ましくは、配列番号２又は配列番号３に示す塩基配列を有する。

本発明の実施態様のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブは、融解曲線解析法において、Ｖ６００Ｅ変異を含むＶ６００変異を検出可能としつつ、Ｋ６０１Ｅ変異との交差反応は示さない。

プローブＰ１と各相補鎖との間の乖離曲線である。プローブＰ１と各相補鎖との間の塩基対の対応を示す。プローブＰ３と各相補鎖との間の乖離曲線である。プローブＰ３と各相補鎖との間の塩基対の対応を示す。プローブＰ４と各相補鎖との間の乖離曲線である。プローブＰ４と各相補鎖との間の塩基対の対応を示す。プローブＰ１と各種Ｖ６００変異ＢＲＡＦ遺伝子の相補鎖との間の乖離曲線である。

以下、本開示を実施するための形態について説明する。ただし、本開示は以下の実施形態に限定されるものではない。

本開示において、検出対象となる試料中の試料核酸、本開示のプローブ及びプライマーを含む本明細書に記載される全ての核酸配列又はヌクレオチド配列への言及は、特に断らない限り、それらの相補配列、及び当該核酸配列又はヌクレオチド配列とその相補配列とから形成される二本鎖についても言及できるものとする。

本開示において、「核酸」とは、全ての種類のＤＮＡ及びＲＮＡを意味する。本開示において、「核酸」と「ヌクレオチド」とは、互換的に使用する場合がある。

本開示において「Ｔｍ」又は「Ｔｍ値」とは、二本鎖ＤＮＡの５０％が解離して一本鎖ＤＮＡになる温度をいい、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が吸光度全上昇分の５０％に達した時点の温度と定義される。二本鎖核酸、例えば二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度が加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって解離が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。

本開示において、Ｔｍ値は、以下に詳細を説明する蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いて測定することができる。

本明細書においてＴｍ値を算出する場合、得られたＴｍ値は、特に断らない限り、ソフトウェア「Ｍｅｌｔｃａｌｃ９９ｆｒｅｅ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）を用い、設定条件：Ｏｌｉｇｏｃｏｎｃ［μＭ］０．２、Ｎａｅｑ．［ｍＭ］５０の条件で算出した値とする。このソフトウェアは、当業界で公知のものであり、ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＶｏｌ.５４, Ｎｏ.６, ｐｐ.９９０-９９９（２００８）等でもプローブの設計に使用されている。

本開示において、「５’末端から数えてＮ番目（ただし、Ｎは自然数）」という場合、ヌクレオチド配列の５’末端にある塩基を１番目として数える。

また、本開示において、たとえば「ヒトＢＲＡＦ遺伝子のコード領域のＮ番目の塩基（ただし、Ｎは自然数）」とは、ヒトＢＲＡＦのタンパク質をコードする１番目の塩基から数えてＮ番目の塩基を意味する。これは、コード領域（すなわち、エキソン）がイントロンによって分断されていても同様に適用される。すなわち、イントロンが存在していたとしても、ヒトＢＲＡＦタンパク質をコードする塩基配列のみを数え上げてＮ番目に位置すれば足りることを意味する。それゆえ、たとえば「ヒトＢＲＡＦ遺伝子のコード領域のＮ番目の塩基」は、ｃＤＮＡ配列又はｍＲＮＡ配列のみならず、スプライシング前の塩基配列や、ゲノム配列おいても同様に適用され、ヒトＢＲＡＦタンパク質をコードする配列のみを数え上げてＮ番目に位置することを意味する。

なお、本明細書において、塩基配列の文脈で使用される「コード領域」とは、タンパク質に翻訳される塩基配列の領域をいう。

本開示において、「オリゴヌクレオチド」の構成単位としては、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、人工核酸等が挙げられる。前記人工核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡアナログであるＬＮＡ（ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ）；ペプチド核酸であるＰＮＡ（ＰｅｐｔｉｄｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ）；架橋化核酸であるＢＮＡ（ＢｒｉｄｇｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ）等が挙げられる。

前記オリゴヌクレオチドは、前記構成単位のうち、一種類の構成単位から構成されてもよいし、複数種類の構成単位から構成されてもよい。

本開示においてハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ３ｒｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法等に従って行うことができる。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。

本明細書において、「変異」とは、野生型の塩基配列の一部の塩基が置換、欠失、重複又は挿入されることによって生じる新たな塩基配列を意味する。

本開示において、「ヒトＢＲＡＦ」とは、ヒト由来のＢＲＡＦを意味し、ヒト由来のＢＲＡＦのゲノム配列、ｍＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、及びタンパク質の全てを包含する概念である。より具体的には、ヒトＢＲＡＦのゲノム配列は、アクセッションナンバー：ＮＧ＿００７８７３．３（ＲＥＧＩＯＮ: ５００１．．１９５７５３）で表され、ヒトＢＲＡＦ遺伝子のｍＲＮＡ配列は、アクセッションナンバー：ＮＭ＿００４３３３．６で表され、ヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列は、アクセッションナンバー：ＣＣＤＳ５８６３．１で表され、ヒトＢＲＡＦのタンパク質のアミノ酸配列は、アクセッションナンバー：００４３２４．２で表される。

本開示において、「ヒトＢＲＡＦのＶ６００Ｅ変異」とは、野生型のヒトＢＲＡＦのアミノ酸配列の６００番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換された変異をいう。この変異は、野生型のヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１７９９番目の塩基であるチミン（Ｔ）がアデニン（Ａ）に置換された変異（Ｔ１７９９Ａ変異）に起因するものである。

本開示において、「ヒトＢＲＡＦのＫ６０１Ｅ変異」とは、野生型のヒトＢＲＡＦのアミノ酸配列の６０１番目のアミノ酸であるリジン（Ｋ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換された変異をいう。この変異は、野生型のヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１８０１番目の塩基であるアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に置換された変異（Ａ１８０１Ｇ変異に起因するものである。

本開示において、「ヒトＢＲＡＦのＶ６００Ｅ２変異」とは、野生型のヒトＢＲＡＦのアミノ酸配列の６００番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換された変異をいう。この変異は、野生型のヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１７９９番目の塩基であるチミン（Ｔ）及び１８００番目の塩基であるグアニン（Ｇ）がいずれもアデニン（Ａ）に置換された変異（ＴＧ１７９９＿１８００ＡＡ変異）に起因するものである。

本開示において、「ヒトＢＲＡＦのＶ６００Ｋ変異」とは、野生型のヒトＢＲＡＦのアミノ酸配列の６００番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）がリジン（Ｋ）に置換された変異をいう。この変異は、野生型のヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１７９８番目の塩基であるグアニン（Ｇ）及び１７９９番目の塩基であるチミン（Ｔ）がいずれもアデニン（Ａ）に置換された変異（ＧＴ１７９８＿１７９９ＡＡ変異）に起因するものである。

本開示において、「ヒトＢＲＡＦのＶ６００Ｒ変異」とは、野生型のヒトＢＲＡＦのアミノ酸配列の６００番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）がアルギニン（Ｒ）に置換された変異をいう。この変異は、野生型のヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１７９８番目の塩基であるグアニン（Ｇ）及び１７９９番目の塩基であるチミン（Ｔ）がそれぞれアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）に置換された変異（ＧＴ１７９８＿１７９９ＡＧ変異）に起因するものである。

本開示において、「ヒトＢＲＡＦのＶ６００Ｄ変異」とは、野生型のヒトＢＲＡＦのアミノ酸配列の６００番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換された変異をいう。この変異は、野生型のヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１７９９番目の塩基であるチミン（Ｔ）及び１８００番目の塩基であるグアニン（Ｇ）がそれぞれアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）に置換された変異（ＴＧ１７９９＿１８００ＡＴ変異）に起因するものである。

なお、本開示において、「Ｖ６００変異」とは、上記したＶ６００Ｅ変異、Ｖ６００Ｅ２変異、Ｖ６００Ｋ変異、Ｖ６００Ｒ変異及びＶ６００Ｄ変異の総称である。

本開示において、「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡの相補ＤＮＡ鎖（一本鎖）、ｍＲＮＡの相補ＤＮＡ鎖の相補ＤＮＡ鎖（一本鎖）、及びｍＲＮＡの相補ＤＮＡ鎖とｍＲＮＡの相補ＤＮＡ鎖の相補ＤＮＡ鎖とにより形成される二本鎖、のいずれを指称することもできる。ｃＤＮＡは、公知の方法で、ｍＲＮＡから逆転写することにより得ることができる。

典型的には、「コード領域」を含む文脈において使用される「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡの相補ＤＮＡ鎖の相補ＤＮＡ鎖（一本鎖）を意味する。

＜ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブ＞
本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブは、配列番号１に示す塩基配列において、５’末端から数えて１９番目に位置するアデニンが、シトシンともチミンとも相補的でない塩基に置換されているとともに、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドである。このヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブは、好ましくは配列番号２又は配列番号３に示す塩基配列を有する。

本開示において、配列番号１に示す塩基配列は「tttggtctagctacagTgAaatc」である。

配列番号１に示す塩基配列は、野生形ヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１７８３番目～１８０５番目の２３塩基である。この塩基配列の５’末端から数えて１７番目に大文字で示すチミン（Ｔ）は野生形ヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１７９９番目の塩基である。また、この塩基配列の５’末端から数えて１９番目に大文字で示すアデニン(Ａ）は野生形ヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１８０１番目の塩基である。本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブにおいては、このアデニン（Ａ）がシトシンともチミンとも相補的でない塩基、たとえばシトシン（Ｃ）若しくはチミン（Ｔ）、若しくはシトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）の混合塩基、又はその他シトシン及びチミンと水素結合を形成し得ない塩基（たとえば、シトシン若しくはチミンの修飾塩基又はイノシン）に置換されている。このような、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブの塩基配列を以下、「置換配列」と総称する。

本開示において、配列番号２に示す塩基配列は「tttggtctagctacagTgCaatc」である。

本開示において、配列番号３に示す塩基配列は「tttggtctagctacagTgTaatc」である。

配列番号２及び配列番号３に示す塩基配列はいずれも、上記した置換配列の例であり、ヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１７８３番目～１８０５番目の２３塩基（すなわち、配列番号１の塩基配列）を基にしているが、１８０１番目が本来アデニン（Ａ）であるところ、配列番号２では大文字で示すシトシン（Ｃ）に置換され、また、配列番号３では３’末端側の大文字で示すチミン（Ｔ）に置換されている。なお、配列番号２及び配列番号３において、各々の塩基配列の５’末端から数えて１７番目に大文字で示すチミン（Ｔ）は、配列番号１と同様、いずれも野生型ヒトＢＲＡＦのｃＤＮＡ配列のコード領域における１７９９番目の塩基である。

ここで、野生型ヒトＢＲＡＦでは、上記したように、ｃＤＮＡ配列のコード領域の１７９９番目の塩基はチミン（Ｔ）であり、１８０１番目の塩基はアデニン（Ａ）である。よって、上記した置換配列、たとえば、配列番号２及び配列番号３の塩基配列を有するプローブはいずれも、野生型のヒトＢＲＡＦとは１８０１番目の１塩基のみがミスマッチである。

また、ヒトＢＲＡＦのＶ６００Ｅ変異では、上記したように、ｃＤＮＡ配列のコード領域の１７９９番目の塩基はアデニン（Ａ）に置換されているが、１８０１番目の塩基はアデニン（Ａ）のままである。よって、上記した置換配列、たとえば、配列番号２及び配列番号３の塩基配列を有するプローブはいずれも、Ｖ６００Ｅ変異のヒトＢＲＡＦとは１７９９番目及び１８０１番目の２塩基がミスマッチである。

そして、ヒトＢＲＡＦのＫ６０１Ｅ変異では、上記したように、ｃＤＮＡ配列のコード領域の１７９９番目の塩基はチミン（Ｔ）のままであるが、１８０１番目の塩基はグアニン（Ｇ）に置換されている。よって、上記した置換配列、たとえば、配列番号２及び配列番号３の塩基配列を有するプローブは、野生型のヒトＢＲＡＦとは１８０１番目の１塩基のみがミスマッチである。

つまり、上記した置換配列、たとえば、配列番号２及び配列番号３の塩基配列を有するプローブはいずれも、野生型ヒトＢＲＡＦ及びＫ６０１Ｅ変異ＢＲＡＦとは１塩基ミスマッチであるが、Ｖ６００Ｅ変異ＢＲＡＦとは２塩基ミスマッチとなる。

すなわち、上記した置換配列、たとえば、配列番号２及び配列番号３の塩基配列を有するプローブは、Ｖ６００Ｅ変異ＢＲＡＦよりも、野生型ヒトＢＲＡＦ及びＫ６０１Ｅ変異ＢＲＡＦに対してよりパーフェクトマッチに近い。これにより、上記した置換配列、たとえば、配列番号２及び配列番号３の塩基配列を有するプローブは、野生型ヒトＢＲＡＦ及びＫ６０１Ｅ変異ＢＲＡＦとの間ではより結合力が強くＴｍ値がより高くなるのに対し、Ｖ６００Ｅ変異ＢＲＡＦとの間ではより結合力が弱くＴｍ値がより低くなる。本開示は、このＴｍ値の差異に基づき、操作が簡便で、高価な装置を必要とせず、かつ高感度でＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００Ｅ変異を、野生型及びＫ６０１Ｅ変異と峻別することを可能としている。

なお、上記した置換配列の例として、配列番号２及び配列番号３の塩基配列を有するプローブを任意の比率で混合したものも本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブとして使用可能である。

ここで、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブの合成は、例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３８０Ｂを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ（１９８１），２２，１８５９参照）、常法に従って合成することができ、あるいは、プライマー合成を受託する企業（例えば、株式会社日本遺伝子研究所など）に合成を依頼することもできる。

オリゴヌクレオチドの３’末端を蛍光色素で標識する方法は、例えば、過剰量の蛍光標識したヌクレオチドを基質としてＰＣＲのポリメラ－ゼ反応溶液に含有させる方法などが挙げられる。あるいは、蛍光標識オリゴヌクレオチドは、蛍光標識オリゴヌクレオチド合成を受託する企業（例えば、Ｊ－Ｂｉｏ２１センター（日鉄住金環境株式会社）など）に合成を依頼することもできる。

本開示の蛍光色素は、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン及びその誘導体、並びにポリメチン色素誘導体からなる群から選択される蛍光色素が挙げられる。市販の蛍光色素としては、例えば、ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＴＡＭＲＡ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＢＯＤＩＰＹＦＬ（登録商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｃｙ３及びＣｙ５（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（登録商標、ＡＢＩ社製）等が挙げられる。

上記したローダミンの誘導体は、５－カルボキシテトラメチルローダミンであることが望ましい。この５－カルボキシテトラメチルローダミンとは、上記したＴＡＭＲＡの一般名称である。上記したＴＡＭＲＡのような蛍光標識オリゴヌクレオチドは、相補配列にハイブリダイズしていない場合には蛍光を発し、相補配列にハイブリダイズしてハイブリッドを形成した場合には蛍光が減少（例えば、消光）する。

このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブは、一般に蛍光消光プローブと称される。蛍光消光プローブは、オリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端の塩基が蛍光色素で標識化され、標識化される塩基は、シトシン（Ｃ）である。この場合、蛍光消光プローブがハイブリダイズする検出目的配列において、蛍光消光プローブの末端塩基Ｃと対をなす塩基又は当該対をなす塩基から１～３塩基離れた塩基がグアニン（Ｇ）となるように、蛍光消光プローブの塩基配列を設計することが好ましい。このような蛍光消光プローブは、一般にグアニン消光プローブと称され、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）としても知られている。

このようなグアニン消光プローブが検出目的配列にハイブリダイズすると、蛍光色素で標識化された末端のシトシン（Ｃ）が検出目的配列におけるグアニン（Ｇ）に近づくことによって、蛍光色素の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。このようなグアニン消光プローブを使用すれば、シグナルの変動に基づき、グアニン消光プローブが標的配列とハイブリダイズしているか解離しているかを容易に確認することができる。蛍光色素は、通常、ヌクレオチドのリン酸基に結合することができる。

従って、蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いて形成されたハイブリッドの蛍光のシグナル（例えば、蛍光強度）を解析することにより、二本鎖であるハイブリッドが一本鎖へ解離した割合、及びＴｍ値などを測定することができる。

蛍光色素は、特定の波長で発光するため、そのような波長を蛍光強度の検出に利用することができる。例えば、下記の蛍光色素において好ましい検出波長は、以下の通りである。ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ（検出波長：４５０ｎｍ～４８０ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ（検出波長：５８５ｎｍ～７００ｎｍ）、及びＢＯＤＩＰＹＦＬ（検出波長：５１５ｎｍ～５５５ｎｍ）。

なお、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブは、このＶ６００変異が生ずる部位を含んだ塩基配列をＰＣＲ反応によって増幅することが可能なフォワードプライマー及びリバースプライマーと組み合わせたキットとして提供することもできる。

＜ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異の検出方法＞
本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異の検出方法は、上記したヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブを試料中の一本鎖核酸と接触させて、前記ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブと前記一本鎖核酸とのハイブリッドを形成させる工程、前記ハイブリッドを含む試料溶液の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定する工程、前記シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッドのＴｍ値を決定する工程、及び、前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ヒトＢＲＡＦ遺伝子の変異の存在を検出する工程、を含む。

前記試料としては、たとえば、生体から採取した固形組織、血液、喀痰、気管支洗浄液又は胸水である。生体から採取した固形組織としては、たとえば、患者より切除した患部又は生検した固形組織が挙げられる。このような試料から核酸を単離して、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異の検出方法に供される。試料からの核酸の単離は定法に従って行うことができる。

また、生体試料に含まれるＤＮＡを遺伝子増幅法により増幅させた増幅産物を試料として用いてもよい。あるいは、生体試料に含まれるＲＮＡから逆転写ＰＣＲ反応によりｃＤＮＡを生成し、このｃＤＮＡを遺伝子増幅法により増幅させた増幅産物を試料として用いてもよい。

核酸増幅法は、特に制限されない。核酸増幅法としては、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-Mediated Amplification）法、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法等が挙げられ、中でもＰＣＲ法が好ましい。

核酸の増幅において、増幅反応液における試料の添加割合は特に制限されない。具体例として、上記試料が生体試料（例えば、全血試料）の場合、添加割合の下限は、０．０１体積％以上であることが好ましく、０．０５体積％以上であることがより好ましく、０．１体積％以上であることがさらに好ましい。また、上記試料が生体試料（例えば、全血試料）の場合、添加割合の上限は、２体積％以下であることが好ましく、１体積％以下であることがより好ましく、０．５体積％以下であることがさらに好ましい。

また、ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブを用いた光学的検出を行う場合、上記反応液における生体試料の添加割合は、例えば、０．１体積％～０．５体積％に設定することが好ましい。この範囲であれば、例えば、変性による沈殿物等の発生による影響を十分に防止でき、光学的手法による測定精度を向上できる。また、生体試料中の夾雑物によるＰＣＲの阻害も十分に抑制されるため、増幅効率をより一層向上できることも期待される。

また、核酸増幅反応の開始前に、上記反応液にさらにアルブミンを添加することが好ましい。このようなアルブミンの添加によって、例えば、沈殿物又は濁りの発生による影響をより一層低減でき、かつ、増幅効率もさらに向上する。

上記反応液におけるアルブミンの添加割合は、例えば、０．０１質量％～２質量％であり、好ましくは０．１質量％～１質量％であり、より好ましくは０．２質量％～０．８質量％である。アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、ラット血清アルブミン、ウマ血清アルブミン等が挙げられ、特に制限されない。これらのアルブミンはいずれか１種類を使用してもよく、２種類以上を併用してもよい。

核酸増幅法としてのＰＣＲ法については、このＶ６００変異が生ずる部位を含んだ塩基配列をＰＣＲ反応によって増幅することが可能なフォワードプライマー及びリバースプライマーを適宜設計した上で合成し、定法に従って行うことができる。

以下、増幅についてＰＣＲ法を例に挙げて説明するが、本開示は、この例に制限されない。

まず、鋳型（テンプレート）核酸、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異が生ずる部位を含んだ塩基配列を増幅可能なフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むＰＣＲ反応液を調製する。

ＰＣＲ反応液における各種プライマーの添加割合は、特に制限されない。フォワードプライマー及びリバースプライマーの合計の添加割合は、０．０１μｍｏｌ／Ｌ～５０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５μｍｏｌ／Ｌ～５μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。

また、フォワードプライマー及びリバースプライマー添加割合は、いずれも０．０５μｍｏｌ／Ｌ～５０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５μｍｏｌ／Ｌ～５μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。

ＰＣＲ反応液におけるフォワードプライマーセット及びリバースプライマーの含有比率は特に限定されない。増幅効率及び野生型又は変異型への特異性を高くする観点から、フォワードプライマー及びリバースプライマーの合計モル量に対する比は、１：１～１：１０であることが好ましく、１：２～１：５であることがより好ましく、１：３～１：４．５であることがさらに好ましい。

ＰＣＲ反応液におけるその他の組成成分は、特に制限されず、従来公知の成分が挙げられ、その割合も特に制限されない。他の組成成分としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）等のヌクレオチド、溶媒等が挙げられる。ＰＣＲ反応液において、各組成成分の添加順序は何ら制限されない。

ＤＮＡポリメラーゼは特に制限されない。例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４８８９８１８号明細書及び米国特許第５０７９３５２号明細書を参照）（Ｔａｑポリメラーゼ（商品名））、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９１／０９９５０号を参照）（rTth DNA polymerase）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（国際公開第９２／９６８９号を参照）（Pfu DNA polymerase；Strategene社製）、テルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来ＤＮＡポリメラーゼ（欧州特許第０４５５４３０号明細書を参照）（Ｖｅｎｔ（商標）；New England Biolabs社製）等が商業的に入手可能である。中でも、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。

ＰＣＲ反応液中のＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、目的核酸を増幅する目的で当業界において通常用いられる割合であればよい。

ヌクレオシド三リン酸としては、通常、ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ等）が挙げられる。ＰＣＲ反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、目的核酸を増幅する目的で当業界において通常用いられる割合であればよい。

溶媒としては、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ（2-morpholinoethanesulfonic acid）、ＭＯＰＳ（3-morpholinopropanesulfonic acid）、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、ＣＡＰＳ（N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid）等の緩衝液が挙げられ、典型的な実施態様においては、市販のＰＣＲ用緩衝液やＰＣＲキットに付属の緩衝液等をそのまま使用すればよい。

また、ＰＣＲ反応液には、グリセロール、ヘパリン、ベタイン、ＮａＮ３、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４等が含まれていてもよい。

ＰＣＲは、通常、二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離（解離工程）、プライマーの鋳型核酸へのアニーリング（アニーリング工程）、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーからの核酸配列の伸長（伸長工程）の３工程を含む。各工程の条件は特に制限されない。解離工程の条件は、例えば、９０℃～９９℃、１秒間～１２０秒間が好ましく、９２℃～９５℃、１秒間～６０秒間がより好ましい。アニーリング工程の条件は、例えば、４０℃～７０℃、１秒間～３００秒間が好ましく、５０℃～７０℃、５秒間～６０秒間がより好ましい。また、伸長工程の条件は、例えば、５０℃～８０℃、１秒間～３００秒間が好ましく、５０℃～８０℃、５秒間～６０秒間がより好ましい。サイクル数も特に制限されない。３工程を１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。上限は特に制限されない。

例えば、合計１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、より好ましくは５０サイクル以下である。各工程の温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。なお、アニーリング工程と伸長工程とを同じ温度条件とし、２工程でＰＣＲを行ってもよい。

以上のようにして、ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異が生ずる部位を含んだ塩基配列についての増幅産物を得ることができる。

このようにして得られた増幅産物は、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブとハイブリダイズさせて、ハイブリッドを形成させることができる。

ハイブリッド形成工程では、上記増幅工程で得られた増幅産物の一本鎖増幅核酸と、ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異が生ずる部位を含んだ塩基配列にハイブリダイズ可能な本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブとのハイブリッドを形成させる。上記一本鎖増幅核酸は、例えば、反応液を加熱し、上記増幅工程で得られた増幅産物である二本鎖増幅核酸を解離することで調製することができる。

本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブを反応液に添加するタイミングは特に制限されない。例えば、増幅工程前、増幅工程の開始時、増幅工程の途中、及び増幅工程後のいずれであってもよい。中でも、増幅工程前又は増幅工程の開始時に添加することが、増幅反応とハイブリダイゼーションとを連続的に行うことができるため好ましい。すなわち、上記増幅工程と上記ハイブリッド形成工程とが同時に進行することが、処理効率の観点から好ましい。

上記反応液におけるヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブの添加割合は特に制限されない。例えば、ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブを１０ｎｍｏｌ／Ｌ～４００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、２０ｎｍｏｌ／Ｌ～２００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することがより好ましい。

上記一本鎖増幅核酸とヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブとのハイブリダイゼーションの手法及び条件には、特に制限はない。二本鎖増幅核酸を解離して一本鎖増幅核酸にすること、一本鎖核酸同士をハイブリダイズすることを目的として当業界で既知の条件をそのまま適用すればよい。

例えば、解離における加熱温度は、上記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５℃～９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒間～１０分間であり、好ましくは１秒間～５分間である。また、解離した一本鎖増幅核酸と本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブとのハイブリダイズは、例えば、解離後、解離における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件は、例えば４０℃～５０℃である。

ここで、上記増幅工程において、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブと、上記したフォワードプライマー及びリバースプライマーとを共存させる場合であっても、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブの３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されているため、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブ自体がＤＮＡポリメラーゼの反応対象となって伸長することはない。

また、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブと同じ配列を有するが蛍光標識されていないプローブを併用してもよい。これにより、例えば、検出する蛍光強度を調節することができる等の利点が得られる。このような未標識プローブは、その３’末端にリン酸基が付加されていてもよい。

次に、ハイブリッドを含む試料溶液の温度を変化させることにより、ハイブリッドを解離させ、ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定する。

ハイブリッドの解離状態を示すシグナルの測定は、２６０ｎｍの吸光度測定でもよいが、標識した蛍光色素の波長に応じて適宜設定することが好ましい。標識した蛍光色素に応じた波長とすることで、検出感度を高めることができる。例えば、蛍光色素として、ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅを用いる場合には、検出波長が４５０ｎｍ～４８０ｎｍであることが好ましく、ＴＡＭＲＡを用いる場合には、検出波長が５８５ｎｍ～７００ｎｍであることが好ましく、ＢＯＤＩＰＹＦＬ用いる場合には、検出波長が５１５ｎｍ～５５５ｎｍであることが好ましい。

上記ハイブリッドの解離状態に基づくシグナルの変動は、反応液の温度を変化させて行う。例えば、一本鎖増幅核酸と本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブとのハイブリッドを含む上記反応液を加熱し、温度上昇に伴うシグナルの変動を測定する。前述のように、例えば、末端のＣ塩基が標識化された標識化プローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖増幅核酸とハイブリダイズした状態では蛍光が減少（又は消光）し、解離した状態では蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（又は消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定することにより、解離に基づくシグナルの変動を測定することができる。

シグナルの変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温～８５℃、好ましくは２５℃～７０℃であってよく、終了温度が４０℃～１０５℃であってよい。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば０．１℃／秒～２０℃／秒であってよく、好ましくは０．３℃／秒～５℃／秒である。

なお、以上の説明では、上記蛍光強度測定工程においてハイブリッドを加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度変動を測定するものとしたが、ハイブリッド形成時における蛍光強度の変動を測定するようにしてもよい。つまり、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッドを形成する際に、温度降下に伴う蛍光強度の変動を測定してもよい。

具体例として、単独で蛍光強度を示し、かつハイブリッド形成により蛍光強度を示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖増幅核酸と標識化プローブとが解離している状態では蛍光を発するが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光が減少（又は消光）する。したがって、例えば、反応液の温度を徐々に降下させて、温度降下に伴う蛍光強度の減少を測定することで、ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定することができる。

次に、このシグナルの変動に基づいて、ハイブリッドのＴｍ値を決定する。

Ｔｍ値の決定は、例えば、以下のようにして行うことができる。例えば、末端のＣ塩基が標識化された標識化プローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、得られた蛍光強度の変動から、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量を算出する。変化量を（－ｄ（蛍光強度増加量）／ｄｔ）とする場合は、例えば、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定することができる。また、変化量を（ｄ（蛍光強度増加量）／ｄｔ）とする場合は、例えば、最も高い値を示す温度をＴｍ値として決定することができる。

そして、このＴｍ値に基づいて、試料中の一本鎖核酸における、ヒトＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００変異の存在を検出する。例えば、ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブの、試料中の一本鎖核酸とのハイブリッドにおけるＴｍ値が、対照としての野生型ヒトＢＲＡＦの塩基配列とのハイブリッドにおけるＴｍ値よりも３℃以上、望ましくは５℃以上低ければ、試料中の一本鎖核酸における検出目的配列は、Ｖ６００変異を被っていると判断される。

ここで、典型的な実施態様において、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブを用いた場合、数あるヒトＢＲＡＦのＶ６００変異のうち、Ｖ６００Ｅ変異を始め、少なくともＶ６００Ｅ２変異、Ｖ６００Ｋ変異、Ｖ６００Ｒ変異及びＶ６００Ｄ変異においては、野生型ＢＲＡＦと比較して上記したＴｍ値は３℃以上低い。一方、Ｋ６０１Ｅ変異においては、野生型ＢＲＡＦとのＴｍ値の差異は３℃に満たず、ほぼ同一である。よって、本開示のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブは、少なくとも上記したＶ６００変異を、野生型はもちろん、Ｋ６０１Ｅ変異からも峻別することが可能となっている。

以下、本開示を実施例により更に具体的に説明するが、本開示はその主旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「部」は質量基準である。

＜プローブの検証＞
［プローブ］
それぞれ配列番号２、４及び５に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素５－ＴＡＭＲＡで標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブＰ１、Ｐ３及びＰ４を日鉄住金環境株式会社に製造委託して人工的に合成したものを得た。これらプローブの塩基配列を下記表１に示す。

ここで、プローブＰ１の塩基配列は、野生型ヒトＢＲＡＦの対応塩基配列に対し、１８０１番目の塩基であるアデニン（Ａ）を、上記表１中にて大文字で示すシトシン（Ｃ）に置換した以外は完全一致である。

また、プローブＰ３の塩基配列は、前記特許文献１に「ＳＥＱＩＤＮＯ．２」（同文献の配列番号２）として開示されている塩基配列（配列番号６）の塩基配列の３’末端を１塩基伸長して得た３’末端のシトシン（Ｃ）を蛍光色素５－ＴＡＭＲＡで標識したものであり、野生型ヒトＢＲＡＦの対応塩基配列と完全一致である。

さらに、プローブＰ４の塩基配列は、前記特許文献２に「Ｇｅｎｅｒａｌｐｒｏｂｅ」（同文献の配列番号３）として開示されている塩基配列（配列番号７）の塩基配列の３’末端を３塩基伸長して得た３’末端のシトシン（Ｃ）を蛍光色素５－ＴＡＭＲＡで標識したものであり、野生型ヒトＢＲＡＦの対応塩基配列と完全一致である。

なお、上記表１中の各プローブの塩基配列において大文字で示しているチミン（Ｔ）はＶ６００Ｅ変異において塩基置換を被る１７９９番目の塩基に対応する塩基である。

以上、上記表１に示すように、上記各プローブは、５’末端のチミン（Ｔ）塩基の数が相違している点、及び、プローブＰ１において１８０１番目の塩基が大文字で示すようにシトシン（Ｃ）で置換されている点を除き、同一の塩基配列を有している。

［相補鎖］

上記各プローブの相補鎖として、それぞれ配列番号８、９及び１０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＣ１、Ｃ２及びＣ３を日鉄住金環境株式会社に製造委託して人工的に合成したものを得た。これら相補鎖の塩基配列を下記表２に示す。

ここで、上記相補鎖Ｃ１、Ｃ２及びＣ３はそれぞれ、野生型ヒトＢＲＡＦ、Ｖ６００Ｅ変異ＢＲＡＦ及びＫ６０１Ｅ変異ＢＲＡＦの各コード領域の１７７４～１８２３番目の塩基配列に対する相補鎖である。ここで、Ｖ６００Ｅ変異ＢＲＡＦにおいては、１７９９番目の塩基がチミン（Ｔ）からアデニン（Ａ）に置換されているので、これに相補的な上記相補鎖Ｃ２においてはこの置換されたアデニン（Ａ）に対応して上記表２にて大文字で示すチミン（Ｔ）となっている。また、Ｋ６０１Ｅ変異ＢＲＡＦにおいては、１８０１番目の塩基がアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）に置換されているので、これに相補的な上記相補鎖Ｃ３においてはこの置換されたグアニン（Ｇ）に対応して上記表２にて大文字で示すシトシン（Ｃ）となっている。

そして、下記表３に示す組成で反応液を調製し、下記表４に示す温度条件でＴｍ値の測定を行った。すなわち、反応液を９５℃で１秒間加熱してプローブと相補鎖と一旦乖離させた後、４０℃６０秒間で再びプローブと相補鎖とをハイブリダイズさせ、そして、３秒間に１℃の割合で反応液を７５℃まで加熱し、プローブと相補鎖とを乖離させた。なお、Ｔｍ値の測定は、自動遺伝子解析装置（商品名ｉ－ｄｅｎｓｙ、アークレイ社製）を用いて行った。

Ｔｍ値の測定結果を図１、図３及び図５に示す。図１は、プローブＰ１と各相補鎖との間の乖離曲線である。図３は、プローブＰ３と各相補鎖との間の乖離曲線である。図５は、プローブＰ４と各相補鎖との間の乖離曲線である。図１、図３及び図５においてはそれぞれ、プローブと野生型ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ１）との乖離曲線は実線（ＷＴ）で、プローブとＶ６００Ｅ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ２）との乖離曲線は破線（Ｖ６００Ｅ）で、及びプローブとＫ６０１Ｅ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ３）との乖離曲線は一点鎖線（Ｋ６０１Ｅ）にて示している。各乖離曲線のピークは、プローブと相補鎖との乖離が最も多く発生している温度に相当し、この温度がＴｍ値である。

［プローブＰ１］
まず、図１に示すように、プローブＰ１は、野生型ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ１）とのＴｍ値が５９℃、及び、Ｋ６０１Ｅ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ３）とのＴｍ値が５８℃とほぼ同じであった。これに対し、プローブＰ１とＶ６００Ｅ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ２）とのＴｍ値は５３℃であり、Ｃ１及びＣ３とのＴｍ値より５℃以上低い値となっていた。

ここで、図２は、プローブＰ１と、各相補鎖との間で、相補的な塩基対を対応させて示したものである。本図に示すように、プローブＰ１と相補鎖Ｃ１との間では、Ｐ１において大文字で示すシトシン（Ｃ）の位置で、相補鎖の対応する位置のチミン（Ｔ）とミスマッチが生じている。また、プローブＰ１と相補鎖Ｃ３との間では、同じくＰ１において大文字で示すシトシン（Ｃ）の位置で、Ａ１８０１Ｇ変異に伴う相補的なシトシン（Ｃ）とミスマッチが生じている。これらに対し、プローブＰ１と相補鎖Ｃ２との間では、同じくＰ１において大文字で示すシトシン（Ｃ）の位置に加え、大文字で示すチミン（Ｔ）の位置において、Ｔ１７９９Ａ変異に伴う相補的なチミン（Ｔ）とミスマッチが生じている。

つまり、プローブＰ１と相補鎖Ｃ１との間、及び、プローブＰ１と相補鎖Ｃ３との間ではいずれも１塩基でミスマッチが生じているのに対し、プローブＰ１と相補鎖Ｃ２との間では２塩基でミスマッチが生じている。これに伴い、プローブＰ１と相補鎖Ｃ２との間のＴｍ値が、プローブＰ１と相補鎖Ｃ１との間のＴｍ値及びプローブＰ１と相補鎖Ｃ３との間のＴｍ値より低くなっているものと推察される。

以上によって、プローブＰ１は、Ｔｍ値の差異によって、Ｖ６００Ｅ変異を、野生型及びＫ６０１Ｅ変異と峻別することが可能なプローブであることが判明した。

［プローブＰ３］
次に、図３に示すように、プローブＰ３は、野生型ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ１）とのＴｍ値が６５℃であったのに対し、Ｖ６００Ｅ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ２）とのＴｍ値が５９℃、また、Ｋ６０１Ｅ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ３）とのＴｍ値が５８℃と、いずれもＣ１とのＴｍ値より６℃以上低く、Ｃ２とのＴｍ値とＣ３とのＴｍ値とはほぼ同じであった。

これは、図４に示すように、プローブＰ３と相補鎖Ｃ１との間ではミスマッチは生じていないのに対し、プローブＰ３と相補鎖Ｃ２との間、及び、プローブＰ３１と相補鎖Ｃ３との間ではいずれも１塩基のミスマッチが生じているためであると推察される。

以上によってプローブＰ３は、野生型とのＴｍ値の差異は判別できるものの、Ｖ６００Ｅ変異とＫ６０１Ｅ変異との峻別が不可能なプローブであることが判明した。

［プローブＰ４］

そして、図５に示すように、プローブＰ４は、野生型ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ１）とのＴｍ値が６６℃であったのに対し、Ｖ６００Ｅ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ２）とのＴｍ値が６０℃、また、Ｋ６０１Ｅ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ３）とのＴｍ値も６０℃と、いずれもＣ１とのＴｍ値より６℃低く、Ｃ２とのＴｍ値とＣ３とのＴｍ値とはほぼ同じであった。

これもまた、図６に示すように、プローブＰ４と相補鎖Ｃ１との間ではミスマッチは生じていないのに対し、プローブＰ４と相補鎖Ｃ２との間、及び、プローブＰ４と相補鎖Ｃ３との間ではいずれも１塩基のミスマッチが生じているためであると推察される。

以上によってプローブＰ４も、野生型とのＴｍ値の差異は判別できるものの、Ｖ６００Ｅ変異とＫ６０１Ｅ変異との峻別が不可能なプローブであることが判明した。

［プローブについて小括］
以上のまとめとして、各プローブと各相補鎖との間のＴｍ値を下記表５に示す。

以上より、プローブＰ３及びプローブＰ４はいずれも、Ｖ６００Ｅ変異をＫ６０１Ｅ変異と区別することが不可能であるが、プローブＰ１は、Ｖ６００Ｅ変異を、野生型のみならずＫ６０１Ｅ変異とも峻別することが可能であることが分かった。このプローブＰ１の塩基配列は、野生型のｃＤＮＡ配列に準拠し、この配列の１８０１番目の塩基に相当するアデニン（Ａ）がシトシン（Ｃ）に置換されている。このシトシン（Ｃ）は、野生型の相補鎖におけるチミン（Ｔ）、Ｖ６００Ｅ変異の相補鎖におけるチミン（Ｔ）、及びＫ６０１Ｅ変異の相補鎖におけるシトシン（Ｃ）のいずれとも相補的でない塩基が選ばれている。この置換は、１８０１番目の塩基において野生型、Ｖ６００Ｅ変異及びＫ６０１Ｅ変異のいずれともミスマッチを起こさせることで、結果としてＡ１８０１Ｇ変異を無効化することに成功している。また、プローブＰ１において１７９９番目の塩基であるチミン（Ｔ）は、野生型の相補鎖及びＫ６０１Ｅ変異の相補鎖におけるアデニン（Ａ）とは相補的であるが、Ｖ６００Ｅ変異の相補鎖のチミン（Ｔ）とは相補的でないため、Ｖ６００Ｅ変異を野生型からもＫ６０１Ｅ変異からも峻別することが可能となっている。

＜他のＶ６００変異＞
次に、上記プローブＰ１を用いて、Ｖ６００Ｅ変異以外の他の変異の検出を試みた。

［相補鎖］
プローブＰ１の相補鎖として、上記で使用した配列番号８の相補鎖Ｃ１（野生型）及び配列番号９の相補鎖Ｃ１（Ｖ６００Ｅ変異）に加えて、それぞれ配列番号１１～配列番号１４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＣ４～Ｃ７を日鉄住金環境株式会社に製造委託して人工的に合成したものを得た。これら相補鎖の塩基配列を下記表６に示す。

ここで、上記相補鎖Ｃ１及びＣ２はそれぞれ、前記表２の説明で言及したとおりである。上記相補鎖Ｃ４はＶ６００Ｅ２変異ＢＲＡＦ遺伝子に由来し、この相補鎖においては、ＴＧ１７９９＿１８００ＡＡ変異によって、これに相補的なチミン（Ｔ）２個で上記大文字のように置換されている。上記相補鎖Ｃ５はＶ６００Ｋ変異ＢＲＡＦ遺伝子に由来し、この相補鎖においては、ＧＴ１７９８＿１７９９ＡＡ変異によって、これに相補的なチミン（Ｔ）２個で上記大文字のように置換されている。上記相補鎖Ｃ６はＶ６００Ｒ変異ＢＲＡＦ遺伝子に由来し、この相補鎖においては、ＧＴ１７９８＿１７９９ＡＧ変異によって、これに相補的なチミン（Ｔ）及びシトシン（Ｃ）で上記大文字のように置換されている。上記相補鎖Ｃ７はＶ６００Ｄ変異ＢＲＡＦ遺伝子に由来し、この相補鎖においては、ＴＧ１７９９＿１８００ＡＴ変異によって、これに相補的なチミン（Ｔ）及びアデニン（Ａ）で上記大文字のように置換されている。

そして、下記表７に示す組成で反応液を調製し、ＰＣＲによって増幅を行いつつ、プローブＰ１を各相補鎖とハイブリダイズさせた。

その後、前記表４に示す温度条件でＴｍ値の測定を行った。すなわち、反応液を９５℃で１秒間加熱してプローブと相補鎖と一旦乖離させた後、４０℃６０秒間で再びプローブと相補鎖とをハイブリダイズさせ、そして、３秒間に１℃の割合で反応液を７５℃まで加熱し、プローブと相補鎖とを乖離させた。なお、Ｔｍ値の測定は、自動遺伝子解析装置（商品名ｉ－ｄｅｎｓｙ、アークレイ社製）を用いて行った。

Ｔｍ値の測定結果を図７に示す。図７は、プローブＰ１と各相補鎖との間の乖離曲線である。図７においては、プローブＰ１と野生型ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ１）との乖離曲線は実線（ＷＴ）で、プローブＰ１とＶ６００Ｅ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ２）との乖離曲線は太い破線（Ｖ６００Ｅ）で、プローブＰ１とＶ６００Ｅ２変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ４）との乖離曲線は細い破線（Ｖ６００Ｅ２）で、プローブＰ１とＶ６００Ｋ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ５）との乖離曲線は太い一点鎖線（Ｖ６００Ｋ）で、プローブＰ１とＶ６００Ｒ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ６）との乖離曲線は細い一点鎖線（Ｖ６００Ｋ）で、プローブＰ１とＶ６００Ｄ変異ＢＲＡＦ相補鎖（Ｃ７）との乖離曲線は太い点線（Ｖ６００Ｄ）で、及び相補鎖の代わりに蒸留水を用いた陰性対照における曲線は細い点線（ＤＷ）で、それぞれ示している。各乖離曲線のピークは、プローブと相補鎖との乖離が最も多く発生している温度に相当し、この温度がＴｍ値である。プローブＰ１と各相補鎖との間のＴｍ値及び野生型（ＷＴ）とのＴｍ値の差（ΔＴｍ）を下記表８に示す。

以上より、Ｖ６００Ｅ変異、Ｖ６００Ｅ２変異、Ｖ６００Ｋ変異、Ｖ６００Ｒ変異及びＶ６００Ｄ変異のいずれも、野生型よりＴｍ値が低かった。そして、Ｖ６００Ｅ２変異、Ｖ６００Ｋ変異、Ｖ６００Ｒ変異及びＶ６００Ｄ変異におけるΔＴｍはＶ６００Ｅ変異より大きかった。以上より、少なくとも上記Ｖ６００変異はプローブＰ１により、野生型及びＫ６０１Ｅ変異から峻別することが可能であることが分かった。

＜プローブＰ２＞
前記プローブＰ１の他に、配列番号３に示す塩基配列を有し、３’末端のシトシンが蛍光色素５－ＴＡＭＲＡで標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブＰ２を日鉄住金環境株式会社に製造委託して人工的に合成したものを得た。このプローブの塩基配列は下記のとおりである。

Ｐ２：tttggtctagctacagTgTaatc-(TAMRA)（配列番号３）

ここで、プローブＰ２の塩基配列は、野生型ヒトＢＲＡＦの対応塩基配列に対し、１８０１番目の塩基であるアデニン（Ａ）を、上記にて３’末端側で大文字で示すチミン（Ｔ）に置換した以外は完全一致である。この置換されたチミン（Ｔ）は、前記プローブＰ１において対応する位置にあるシトシン（Ｃ）と同様、野生型の相補鎖におけるチミン（Ｔ）、Ｖ６００Ｅ変異の相補鎖におけるチミン（Ｔ）、及びＫ６０１Ｅ変異の相補鎖におけるシトシン（Ｃ）のいずれとも相補的でない塩基としての意義を有する。よって、この置換は、プローブＰ１の場合と同様、１８０１番目の塩基において野生型、Ｖ６００Ｅ変異及びＫ６０１Ｅ変異のいずれともミスマッチを起こさせることで、結果としてＡ１８０１Ｇ変異を無効化しつつ、１７９９番目の塩基であるチミン（Ｔ）が、プローブＰ１と同様に、野生型の相補鎖及びＫ６０１Ｅ変異の相補鎖におけるアデニン（Ａ）とは相補的であるが、Ｖ６００Ｅ変異の相補鎖のチミン（Ｔ）とは相補的でないことで、Ｖ６００Ｅ変異を野生型からもＫ６０１Ｅ変異からも峻別することを可能とすることが強く推認される。

このことを検証するため、前記した、ソフトウェア「Ｍｅｌｔｃａｌｃ９９ｆｒｅｅ」にて、プローブＰ２の塩基配列と、前記表６に示した各Ｖ６００変異の相補鎖Ｃ１、Ｃ２及びＣ４～Ｃ７の配列、並びに前記表２に示したＫ６０１Ｅ変異の相補鎖Ｃ３とのＴｍ値を計算した。その結果を下記表９に示す。

上記表９から、プローブＰ２と各Ｖ６００変異の相補鎖とのＴｍ値は、野生型のＴｍ値よりも６℃以上低くなった。一方、プローブＰ２とＫ６０１Ｅ変異とのＴｍ値は、野生型のＴｍ値よりも１．５℃しか低くなっていなかった。よって、プローブＰ２は、ＢＲＡＦ遺伝子における各Ｖ６００変異を、野生型及びＫ６０１Ｅ変異に対して十分峻別可能であることが強く示唆された。

本発明は、ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出によって、様々な悪性腫瘍における分子標的薬の適用の可否の判断に利用可能である。

Claims

配列番号１に示す塩基配列において、５’末端から数えて１９番目に位置するアデニンが、シトシンともチミンとも相補的でない塩基に置換されていて、５’末端から数えて１番目から１８番目まで及び２０番目から２３番目までの塩基が配列番号１に示す塩基配列のとおりであるとともに、３’末端のシトシンが蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドである、ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブ。
配列番号２又は配列番号３に示す塩基配列を有する、請求項１に記載のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブ。
前記蛍光色素が、フルオレセイン、リン光体、ローダミン及びその誘導体、並びにポリメチン色素誘導体からなる群から選択される、請求項１又は２に記載のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブ。
前記ローダミンの誘導体は、５－カルボキシテトラメチルローダミンである、請求項３に記載のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブ。
請求項１から請求項４までのいずれか１項に記載のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブを試料中の一本鎖核酸と接触させて、前記ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異検出用プローブと前記一本鎖核酸とのハイブリッドを形成させる工程、
前記ハイブリッドを含む試料溶液の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づくシグナルの変動を測定する工程、
前記シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッドのＴｍ値を決定する工程、及び、
前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ヒトＢＲＡＦ遺伝子の変異の存在を検出する工程、
を含む、ヒトＢＲＡＦのＶ６００変異の検出方法。
前記試料が、生体から採取した固形組織、血液、喀痰、気管支洗浄液又は胸水である、請求項５に記載のヒトＢＲＡＦのＶ６００変異の検出方法。