TW201908482A

TW201908482A - 基因突變特異性擴增效率提高的ｄｎａ聚合酶

Info

Publication number: TW201908482A
Application number: TW107124137A
Authority: TW
Inventors: 李炳哲; 朴日鉉; 李輝皓
Original assignee: 南韓商基因凱斯特有限公司
Priority date: 2017-07-12
Filing date: 2018-07-12
Publication date: 2019-03-01
Also published as: CN109251907B; CN109251907A; KR20190007214A; TWI733038B; KR101958659B1

Abstract

本發明係有關一種基因突變特異性擴增效率提高的DNA聚合酶及其用途，具體來說就是特定胺基酸位點上誘發突變，基因變異特異性擴增效率提高的DNA聚合酶，編碼所述聚合酶的核酸序列，包括所述核酸序列的載體並向所述載體提供轉基因的宿主細胞。本發明還提供一種利用基因突變特異性擴增效率提高的DNA聚合酶在一個以上的模板中活體外(in vitro)檢測出一個以上的基因變異或SNP的方法、包含所述DNA聚合酶之用於檢測基因變異或SNP的組合物以及包含所述組合物的PCR試劑盒。

Description

基因突變特異性擴增效率提高的DNA聚合酶

本發明係有關一種基因突變特異性擴增效率提高的DNA聚合酶及其用途，具體來說就是胺基酸位點上誘發突變，基因變異特異性擴增效率提高的DNA聚合酶，編碼所述聚合酶的核酸序列，包括所述核酸序列的載體並向所述載體提供轉基因的宿主細胞。本發明還提供一種利用基因突變特異性擴增效率提高的DNA聚合酶在一個以上的模板中活體外(in vitro)檢測出一個以上的基因變異或SNP的方法、包含所述DNA聚合酶之用於檢測基因變異或SNP的組合物以及包含所述組合物的PCR試劑盒。

自首例人類基因序列被發現以來，研究人員集中於去發現單核苷酸突變(單核苷酸多態性，SNPs)等個體之間的遺傳差異。遺傳體中單核苷酸變異對各種各樣的疾病來說與互不相同的耐藥性和致病因素有關，隨著這一點越來越明確而成為關注的對象。未來醫學有關核苷酸變異的知識可用於個體遺傳供給的療法，可預防無效或導致副作用的藥物治療(Shi,Expert Rev.Mol.Diagn.1.363-365(2001))。在時間和成本上有效率的核苷酸變異鑑定技術的開發將帶來藥物遺傳學的進一步發展。

SNPs在人類基因組中佔據主要的遺傳變異，可以誘發個體間差異的90%以上。(Kwok,Annu.Rev.Genomics Hum,Genet.2,235-258(2001)；Kwok and Chen,Curr.Issues Mol.Biol.5,43-60(2003)；Twyman and Primrose,Pharmacogenomics 4,67-79(2003))。為了檢測這些遺傳變異和突變等其他核酸變異，可以使用各種方法。例如，可以通過在適當的雜交條件下將待分析的核酸樣品與對於序列變體具有特異性的雜交引子雜交來實現對靶核酸的變體的鑑定(Guo et al.,Nat.Biotechnol.15,331-335(1997))。

但是，發現這種雜交方法，尤其在測定時必需的靈敏度方面無法滿足臨床需要。因此，PCR已被廣泛使用於分子生物學、SNP及其他等位基因序列變體等突變檢測的診斷檢測方法中(Saiki等人，Science 239，487-490(1988))，其中，考慮到變體的存在，在雜交前通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增待檢測的靶核酸。用於這種測定的雜交引子，通常使用單股寡核苷酸。所述測定的修改的具體實例包括使用螢光雜交探針(Livak,Genet.73-5 2017-07-12 Anal.14,143-149(1999))。通常，已經試圖將SNP和其他序列變異的測定方法自動化。(Gut,Hum.Mutat.17,475-492(2001))。

相應技術領域中已知的序列變異特異性雜交的方案由所謂的基因變異特異性擴增提供。在這些檢測方法中，在擴增過程中已使用了變異特異性擴增引子，這通常在引子的3’-末端中具有所謂的差異性末端核苷酸殘基，殘基僅對待檢測的目標核酸的一個特異性變異互補。此方法中，核苷酸變異體是根據PCR擴增後DNA產物的存在或缺失進行測定的。基因變異特異性擴增的原理是基於基因變異特異性擴增引子末端中標準(canonical)或非標準引子-模板複合物的形成。一種精確配對的3’引子末端中，DNA聚合酶引起擴增，另一方面，在錯配引子末端的延伸則被抑制。

例如美國專利第5,595,890號公開了一種基因變異特異性擴增的方法及其應用，又如公開的一種用於檢測k-ras腫瘤基因中有關臨床的點突變(point mutation)的應用。此外美國專利第5,521,301號公開了一種等位基因特異性擴增方法，用於ABO血型系統的基因型分析。與此相比，美國專利第5,639,611號則公開了利用等位基因-特異性擴增來檢測導致鐮狀細胞貧血的點突變。然而，基因變異特異性擴增或等位基因-特異性擴增存在選擇性低的問題，因此需要經過更複雜的且時間和成本密集最佳化的步驟。

如上所述用於檢測序列變異、多態性和集中於點突變的方法，特別在所檢測的序列變異與具有相同核酸分段(或相同的基因)的顯性突變相比不充分的時候，需要等位元基因-特異性擴增(或基因變異特異性擴增)。

例如，利用基因變異特異性擴增在血液、血清或血漿等體液中檢測出散發性腫瘤細胞時，這一狀況就會發生(美國專利第5,496,699號)。為此，先將DNA從血液、血清或血漿等體液中分離出來，DNA由缺乏的散發性腫瘤細胞和過量的非增殖性細胞組成。因此，在過量的野生型DNA存在的情況下，在k-ras基因中的腫瘤DNA重要的突變應該從多個複製中被檢測到。

傳統技術所公開之基因變異特異性擴增的所有方法都存在必須使用3'-末端差異寡核苷酸殘基的缺陷。此外，還有一個缺陷是儘管使用了3'-差異核苷酸殘基，並且即使目標核酸與所要檢測的序列變異體不完全一致，在合適的DNA聚合酶存在的條件下，引子延伸發生在較低水準。特別是具體的序列變異體被檢測出包含不同序列變異體的過量的背景核酸時，會產生假陽性結果。這些基於PCR的方法存在缺陷的主要原因是用於充分地區分錯配鹼基的方法中使用的聚合酶的不良合成。因此至今還不能用PCR直接獲取有無突變的明確資訊。迄今為止，對突變的明確診斷還需要更多的時間以及投入成本的提純和分析方法。因此，能夠提高基因變異特異性或對立等位基因-特異性PCR擴增的選擇性的一種新方法將對通過PCR的直接基因變異或SNP分析的可信度和強效性產生重大影響。

本發明的發明者們致力於開發能夠提高基因變異特異性PCR擴增選擇性的一種新型的DNA聚合酶，結果證實對Taq聚合酶特定位點上的胺基酸殘基誘發突變時，基因變異特異性擴增效率顯著提高，從而完成了本發明。

本發明是為了解決上述問題而研製的，提供一種DNA聚合酶，用於檢測含有基因變異或SNP的目標序列中一個或多個基因變異或SNP。

本發明的另一目的是提供本發明涉及的編碼DNA聚合酶的核酸序列、包含所述核酸序列的載體以及轉基因為所述載體的宿主細胞。

本發明的另一目的是提供一種根據本發明製備DNA聚合酶的方法。

本發明的另一目的是提供利用本發明的DNA聚合酶於活體外(in vitro)檢測一個以上的模板中的一個或多個基因變異或SNP的試劑盒。

本發明的另一目的是提供一種包含本發明涉及之DNA聚合酶之用於檢測基因變異或SNP的組合物。

本發明的另一目的是提供一種包含本發明涉及之用於檢測基因變異或SNP的組合物之用於基因變異或SNP檢測的試劑盒。

為了達到上述目的，本發明提供了一種由序列號為1的胺基酸序列(SEQ ID NO：7的鹼基序列)構成之帶有Taq聚合酶的DNA聚合酶，這種DNA聚合酶包括：(a)序列號為1的胺基酸序列中第507個胺基酸殘基的取代；以及(b)序列號為1的胺基酸序列中第536個胺基酸殘基的取代、第660個胺基酸殘基的取代或第536個和第660個兩個胺基酸殘基的取代、或第536個、第587個和第660個三個胺基酸殘基的取代。

根據本發明的一個較佳實施例，所述第507個胺基酸殘基的置換是由賴胺酸(K)取代穀胺酸(E)，所述第536個胺基酸殘基的置換是由賴胺酸(K)取代精胺酸(R)，所述第587個胺基酸殘基的置換是由異亮胺酸(I)取代精胺酸(R)，所述第660個胺基酸殘基的置換是由纈胺酸(V)取代精胺酸(R)。

根據本發明的另一個較佳實施例，所述DNA聚合酶區分匹配的引子和錯配的引子，所述匹配的引子和錯配的引子與目標序列雜交，對於所述錯配引子雜交的目標序列，其3'末端可以包括非典型核苷酸。

根據本發明的另一個較佳實施例，所述DNA聚合酶顯示包含匹配引子的目標序列的擴增比包含錯配引子的目標序列的擴增更低的Ct值(高擴增效率)提高。

本發明還提供編碼本發明涉及的DNA聚合酶的核酸序列、包括所述核酸序列的載體、轉基因為所述載體的宿主細胞。

本發明還提供一種DNA聚合酶的製備方法，包括培養所述宿主細胞的步驟；從培養物及其培養上清液中分離DNA聚合酶的步驟。

本發明還提供一種檢測方法，包括與本發明涉及的DNA聚合酶接觸的：a)一個或多個模板；b)一個以上匹配的引子、一個以上錯配的引子或一個以上匹配的引子和一個以上錯配的引子兩者；以及c)核苷酸三磷酸酯；使所述一個以上匹配的引子和錯配的引子與目標序列雜交，對於和所述錯配的引子雜交的目標序列，從其3’末端開始到第7個鹼基位點上包括非常規 (non-canonical)核苷酸，在一個以上模板中活體外(in vitro)檢測一個以上的基因變異或SNP。

根據本發明的一個較佳實施例，所述方法可以包括採用雙股特異性染料進行熔體溫度(melting point)分析。

根據本發明的另一個較佳實施例，所述方法可以通過即時PCR、標準PCR後瓊脂糖凝膠中的分析、通過即時PCR的基因變異特異性擴增或等位基因-特異性擴增、四引子擴增-受阻突變體系PCR或等溫擴增來完成。

本發明還提供一種包含本發明涉及的DNA聚合酶之用於檢測基因變異或SNP的組合物。

本發明還提供一種包含用於檢測基因變異或SNP的組合物的試劑盒。

根據本發明的一個實施例，所述PCR試劑盒可用於轉染PCR(競爭性等位基因特異性TaqMan PCR)、微滴式數位PCR(Droplet digital PCR)或核酸質譜分析系統(MassARRAY)。

根據本發明的一個較佳實施例，所述PCR試劑盒還包括一個以上的匹配的引子、一個以上的錯配的引子或者一個以上的匹配的引子和一個以上的錯配的引子兩者，所述一個以上匹配的引子和一個以上錯配的引子與目標序列雜交，對於和所述錯配的引子雜交的目標引子，從其3’末端開始到第7個鹼基位點上可包括非常規(non-canonical)核苷酸。

根據本發明的另一個較佳實施例，所述PCR試劑盒還可包括核苷酸硫磷酸脂。

根據本發明的另一個較佳實施例，所述PCR試劑盒還可包括：a)一個或多個緩衝劑；b)一種結合雙股DNA的定量化試劑；c)聚合酶阻斷抗體；d)一個以上對比值或對比序列；以及e)一個或多個模板。

與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：本發明涉及的基因變異特異性擴增效率提高的DNA聚合酶與常規的Taq聚合酶相比，具有較高的錯配的匹配延伸選擇性，無需任何基質變異也能發生可靠的基因變異特異性擴增。此外，本發明涉及的DNA聚合酶可有效地應用於疾病的醫學診斷和重組DNA的研究。

通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特徵、目的和優點將會變得更明顯：圖1是顯示分別包括R536K、R660V和R536K/R660V變異的Taq DNA聚合酶的製備過程，其中，(a)顯示了片段PCR和重疊PCR的示意圖，(b)顯示了用電泳鑑定片段PCR中的擴增產物，(c)顯示了利用重疊PCR擴增全長後，通過電泳確認擴增產物的結果；圖2是為了提取凝膠，用限制性酶EcoRI/XbaI分解後用電泳鑑定處理SAP的pUC 19載體和經提純之圖1(c)重疊PCR產物的結果；圖3是分別包括E507K、E507K/R536K、E507K/R660V和E507K/R536K/R660V變異的Taq DNA聚合酶的製備過程中片段PCR和重疊PCR的示意圖；圖4是為了提取凝膠，用限制性酶EcoRI/XbaI分解後用電泳鑑定SAP處理的pUC 19載體和經提純之圖3中重疊PCR產物的結果；圖5是採集口腔上皮細胞製備PCR模板的過程示意圖；圖6是顯示利用本發明E507K/R536K,E507K/R660V以及E507K/R536K/R660V Taq聚合酶對rs1408799進行AS-qPCR的結果，對比組採用了包含E507K變異的Taq聚合酶；圖7是顯示採用本發明涉及的具備E507K/R536K,E507K/R660V以及E507K/R536K/R660V的Taq聚合酶，對rs1015362進行AS-qPCR檢測的結果，對比組採用了包括E507K變異的Taq聚合酶；圖8是顯示採用本發明涉及的具備E507K/R536K,E507K/R660V以及E507K/R536K/R660V的Taq聚合酶對rs49114進行AS-qPCR的結果，對比組採用的是包括E507K變異的Taq聚合酶；圖9是顯示包括E507K/R536K/R587I/R660V變異的Taq DNA聚合酶的製備過程，(a)是顯示圖示化的片段PCR和重疊PCR，(b)是顯示用電泳鑑定片段PCR中擴增產物的結果；圖10是顯示使用E507K/R536K/R587I/R660V聚合酶，在KRAS基因中對包括Q61H的SNP的模板進行AS-qPCR的結果，(a)和(b)是使用長度為24mer的引子的結果，(c)和(d)是使用長度為18mer的引子的結果，對比組則採用了包含E507K/R536K/R660V變異的Taq聚合酶；圖11是顯示使用E507K/R536K/R587I/R660V聚合酶，在KRAS基因中對包括G13D的SNP的模板進行AS-qPCR的結果，對比組則採用了包含E507K/R536K/R660V變異的Taq聚合酶；圖12是顯示使用E507K/R536K/R587I/R660V聚合酶，在KRAS基因中對包括G12S的SNP的模板進行AS-qPCR的結果，對比組則採用了包含E507K/R536K/R660V變異的Taq聚合酶；圖13是顯示使用E507K/R536K/R587I/R660V聚合酶，在EGFR基因中對包括L585R的SNP的模板進行AS-qPCR的結果，對比組則採用了包含E507K/R536K/R660V變異的Taq聚合酶。

以下將對本發明進行更為詳細的說明。

正如上文所述，為了改善傳統技術所公開的基因變異特異性擴增方法的不足，需要持續開發能提高基因變異特異性擴增率選擇性的方法，這些方法的開發將對基於PCR直接進行SNP分析的可信度和強效性產生重大影響。本發明的發明者們致力於開發一種能提高基因變異特異性PCR擴增選擇性的方法，證實當Taq聚合酶特定位點的胺基酸殘基被誘發突變時，基因變異特異性擴增效率顯著提高，從而完成了本發明。

本發明涉及的基因變異特異性擴增效率提高的DNA聚合酶與常規Taq聚合酶相比，具有較高的錯配的匹配延伸選擇性，無需任何基質變異也能發生可信度高的基因變異特異性擴增。此外，本發明涉及的DNA聚合酶可有效地應用於疾病的醫學診斷和重組DNA的研究。

以下將對本說明書使用的術語進行說明。

“胺基酸”指的是可導入肽、多肽或蛋白質的任何單體單元。正如本文所使用的，術語“胺基酸”包括以下20種天然或經遺傳編碼的α-胺基酸：丙胺酸(Ala或A)、精胺酸(Arg或R)、天冬醯胺(Asn或N)、天冬胺酸(Asp或D)、半胱胺酸(Cys或C)、穀胺醯胺(Gln或Q)、穀胺酸(Glu或E)、甘胺酸(Gly或G)、組胺酸(His或H)、異亮胺酸(Ile或I)、亮胺酸(Leu或L)、賴胺酸(Lys或K)、甲硫胺酸(Met或M)、苯丙胺酸(Phe或F)、脯胺酸(Pro或P)、絲胺酸(Ser或S)、蘇胺酸(Thr或T)、色胺酸(Trp或W)、酪胺酸(Tyr或Y)、以及纈胺酸(Val或V)。

胺基酸是典型的有機酸，包括被取代或未取代的胺基、被取代或未取代的羧基、以及一個以上的側鏈(sidechain)或基團(group)，或者這些集團的任何類似物，示例性的側鏈包括巰基、硒基、磺醯基、烷基、芳基、醯基、酮基、疊氮基、羥基、肼基、氰基、鹵基、醯肼、烯基、炔基、醚基、硼酸酯、硼酸基、二氧磷基、膦磺酸基、膦基、雜環、烯酮、亞胺、醛基、酯基、硫代酸、羥胺或這些基團的任何組合。

其他示範性胺基酸包括但不限於下列各項：含有光活化交聯劑的胺基酸、金屬鍵胺基酸、自旋標記胺基酸、螢光胺基酸、含金屬胺基酸、具有新型官能團的胺基酸、與其他分子共價或非共價相互作用的胺基酸、經光柵化和/或可光致異構化的胺基酸、放射性胺基酸、包括生物素或生物素類似物的胺基酸、糖基化胺基酸，其他經碳酸酯修飾的胺基酸、包括聚乙二醇或聚醚的胺基酸、重原子取代胺基酸、化學可降解性和/或光降解胺基酸、含有碳-連結糖的胺基酸、氧化還原-活性胺基酸、含硫羧酸的胺基酸、含一個以上毒性部分的胺基酸。

在本發明的DNA聚合酶中，術語“突變體”是指相對於天然存在或未修飾的DNA聚合酶包含一個以上胺基酸替換的重組多肽。

術語“熱穩定聚合酶”(是指熱穩定的酶)是指具有熱抵抗性，保持足夠的活性以實現後續的多核苷酸延伸反應，在實現雙股核酸變性所需時間內處理為升溫時不會發生不可逆變性(失活)。正如本發明中所使用的，適合在PCR等反應中的循環溫度下使用。本發明中的不可逆變性是指永久性的酶活性的完全喪失。關於熱穩定聚合酶，酶活性是指以適當的方式催化核苷酸的組合，形成與模板核酸鏈相互補充的多核苷酸延伸產物。源於嗜熱菌的熱穩定性DNA聚合酶例舉如下：海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)、水生棲熱菌(Thermus aquaticus)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)、黃棲熱菌(Thermus flavus)、絲狀棲熱菌(Thermus filiformus)、棲熱菌屬種Sps17、棲熱菌屬種Z05、熱堅棲熱菌(Thermus caldophilus)、石灰性芽孢桿菌(Bacillus caldo tenax)、新阿波羅棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana)、以及源於非洲棲熱腔菌(Thermosipho africanus)的DNA聚合酶。

術語“熱活性”是指在RT-PCR和/或PCR反應中的逆轉錄或黏合/在延伸階段的常用溫度(即45-80℃)下保持催化性能的酶。熱穩定酶是指在核酸改性所要求的高溫處理時不可逆失活或不改性的酶。熱活性酶可以是熱穩定性的也可能不是熱穩定性。一種熱活性DNA聚合酶可以是包括下述依賴於嗜熱物種或嗜溫物種的DNA或RNA，但不僅限於此。

術語“宿主細胞”是指在細胞培養基中培養時，高等植物或動物兩者的單細胞原核生物和真核生物體(例如細菌、酵母和放線菌)以及單細胞。

術語“載體(vector)”是一種DNA分子，可以選殖並可將基因等外源DNA轉移到受體細胞，包括質體、噬菌體、人工染色體等。在本發明中“質體”、“載體”或“質體載體”在使用時具有相同含義。

術語“核苷酸”(nucleotide)”是以單股(single strand)或雙股(double strand)形式存在的去氧基核苷酸(deoxyribonucleic acid；DNA)或核糖核酸(ribonucleic acid；RNA)，除非另有特別提及，否則可以包括天然核苷酸的類似物。

術語“核酸”或“多核苷酸”是指DNA或RNA聚合物、或者是可與其類似物相對應的聚合物。核酸可包括如染色體或染色體的分割、載體(如表達載體)、表達元件、裸露DNA或RNA聚合物、聚合酶鏈反應(PCR)的產物、寡核苷酸、探針和引子。核酸可以是單股、雙股或三股，不限於任何特定長度。除非另有提及，某些核酸序列除了明確規定的任何序列外還包括互補序列或可對其進行編碼。

術語“引子”是指在多核苷酸開始延伸的條件下放置時，可作為模板-方向核酸合成啟動點的多核苷酸。引子也可用於多種其他寡核苷酸介導的合成過程，包括從頭合成(de novo)RNA和作為試管內轉錄相關過程的啟動子。典型的引子是單股寡核苷酸(例如寡去氧核苷酸)。引子的合適長度通常在6至40個核苷酸範圍內，更典型的長度在15到35個核苷酸的範圍內，隨著使用目的的不同而不同。短引子分子通常要求較低的溫度，以與模板形成足夠穩定的雜交配合物。引子不需要反映模板的精確序列，但必須具有足夠的互補性才能與模板雜交，使引子延伸。在具體的實現例中，術語“引子對”是指包括擴增的核酸序列的5'-末端互補雜交的5'-正義鏈引子以及擴增序列的3'-末端雜交的3'-反義鏈引子的一組引子。必要時，可加入用分光鏡的、光化學的、生化的、免疫化學的或化學手段檢測到的標籤對引子進行標記。例如，有用的標記包括以下：³²P、螢光染料、電子密度試劑、酶(通常用於ELISA分析)、生物素或半抗原或者可以利用抗血清或單株抗體的蛋白質。

術語“5'-核酸水解酶(nuclease)探針”是指包括用於進行靶向核酸檢測的5'-核酸水解酶反應的一個或多個發光標記部分的寡核苷酸。在一些實施例中，舉例來說，5'-核酸水解酶探針只包括單一發光部分(例如，螢光染料等等)。某些實施例中，5'-核酸水解酶探針包括自我互補區域，以使探針能在選擇條件下形成髮夾結構。某些實施例中，5'-核酸水解酶探針包括兩個或更多的標記部分，其中一個標記從核苷酸分離或降解後，輻射強度增強而被釋放。某些實施例中，5'-核酸水解酶探針用兩種不同的螢光染料標記，例如5'-末端報導染料和3'-末端淬滅染料或部分標記。某些實施例中，5'-核酸酶探針除了末端外，還在末端位置以外的一個或多個位置標記。一般來說，如果探針是完好的，則在兩種螢光材料之間發生能量轉移，從而使報導染料發出螢光的部分消光。聚合酶鏈反應的延伸階段期間，例如，與模板核酸結合的5'-核酸水解酶探針具有活性，使報導染料的螢光發光不再被淬滅，例如通過Taq聚合酶或其他聚合酶的5'至3'-核酸水解酶活性進行降解。某些實施例中，5'-核酸水解酶探針可以用多種不同的報導染料和3'-末端淬滅染料或部分進行標記。

術語“FRET”或“螢光共振能量轉移”或“福斯特共振能量轉移”是指兩個以上的發色團、供體發色團和受體發色團(稱為淬滅劑)之間的能量轉移。一般來說，當供體通過發射適當波長的光而激發時，會將能量轉移到受體中。受體通常會以不同波長的光的形式轉移的能量重新發射。當受體是“暗”淬滅劑時，那麼它會以光以外的形式轉移的能量發射。某些螢光物質是作為供體還是受體的作用取決於FRET對其他成員的特性。常用的供體-受體對包括FAM-TAMRA對。常用的淬滅劑是DABCYL和TAMRA。常用的暗淬滅劑包括以下：黑洞猝滅劑^TM(BHQ),(Biosearch Technologies,Inc.,Novato,Cal.),Iowa Black^TM(Integrated DNA Tech.,Inc.,Coralville,Iowa)，和BlackBerry^TM Quencher 650(BBQ-650)(Berry & Assoc.,Dexter,Mich.)。

指稱核酸鹼、三磷酸核苷或核苷酸時，術語“常規”或“天然”指的是所描述的多核苷酸中天然發生的(即，對於DNA它們是dATP,dGTP,dCTP和dTTP)。此外，dITP和7-癸氮-dGTP經常代替dGTP被使用，在定序等試管內DNA合成反應中可以用來代替dATP。

指稱核酸鹼基、核苷、或三磷三磷酸核苷時，術語“非常規”或“修飾”包括某些多核苷酸中天然生成的常規鹼基、核苷或核苷酸的修飾、衍生物或類似物。某些非常規核苷酸與常規dNTP相比，在核糖糖的2′位點被修飾。因此即使對RNA自然發生的核苷酸是核糖核苷(即ATP、GTP、CTP、UTP、集合rNTP)，但由於核苷酸在糖的2’位點具有羥基，相對來說dNTP缺失，並且正如本發明中所用的核苷酸一樣，核糖核苷作為DNA聚合酶的底物，是一種非常規的核苷酸。如本文所用，非常規核苷酸包括但不限於用作核酸定序終止子的化合物。示例性終止子化合物包括但不限於具有2',3'-二去氧結構的化合物，被稱為雙去氧核苷三磷酸。雙去氧核苷三磷酸ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP，被統稱為ddNTP。終止子化合物的其他例子包括核糖核苷酸的2'-PO₄類似物。其他非常規核苷酸包括但不限於硫代dNTP([[α]-S]dNTP)、5'-[α]-硼(borano)-dNTP、[α]-甲基-膦酸dNTP、核糖核苷三磷酸(rNTP)。非常規的鹼基可用放射性同位素如³²P、³³P或³⁵S；螢光標記；化學發光標記；生物發光標記；半抗原標籤如生物素；或酶標籤如鏈黴抗生物素蛋白或抗生物素蛋白來標記。螢光標記可以包括帶負電荷的染料如螢光素家族的染料、或帶中性電荷的染料如羅丹明家族的染料、或帶正電荷的染料如花青家族。螢光素家族的染料包括例如FAM、HEX、TET、JOE、NAN及ZOE。羅丹明家族的染料包括Texas Red、ROX、R110、R6G及TAMRA。用FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G、Texas Red和TAMRA標記的各種染料或核苷酸通過Perkin-Elmer(波士頓，麻塞諸塞州)、Applied Biosystems(福斯特市，加州)、Invitrogen/Molecular Probes(尤金，俄勒岡州)市場銷售。花青家族染料包括Cy2、Cy3、Cy5、及Cy7，通過GE Healthcare UK Limited(Amersham Place,Little Chalfont，白金漢郡，英格蘭)市場銷售。

術語“錯配的區分”是指通過在核酸上將一個或多個核苷酸黏附(例如共價地)，以模板依賴性方式延伸核酸(例如引子或其它寡核苷酸)時，用於從錯配-包含序列區分完全互補的序列的生物催化(例如聚合酶、連接酶等酶)的能力。術語“錯配的區分”是指延伸的核酸(如引子或其它寡核苷酸)與核酸雜交的模板相比，從3'末端核酸具有錯配的錯配-包含(約互補)序列區分完全互補的序列的生物催化能力。在一些實施方案中，延伸的核酸對於完全互補序列在3'末端包含錯配。在一些實施方案中，延伸的核酸對於完全互補序列在末端第二個(N-1)3'-位置和/或N-2位置上包含錯配。

除非另有定義，本發明中使用的所有技術和科學術語具有和當事人通常所理解的相同含義。

本發明有關一種DNA聚合酶，作為由序列號為1的胺基酸序列(SEQ ID NO：7的鹼基序列)組成之具有Taq聚合酶的DNA聚合酶，包括：(a)序列號為1的胺基酸序列中第507個胺基酸殘基的取代；以及(b)序列號為1的胺基酸序列中第536個胺基酸殘基的取代、第660個胺基酸殘基的取代或第536個和第660個兩個胺基酸殘基的取代、或第536個、第587個和第660個三個胺基酸殘基的取代。

所述“Taq聚合酶”是一種取自高溫性細菌棲熱水生菌(Thermus aquaticus)的名稱而命名的耐熱性DNA聚合酶，首先從所述細菌中分離出來。棲熱水生菌作為一種棲息在溫泉和熱水噴發孔中的細菌，確認Taq聚合酶能夠承受PCR過程要求的蛋白質改性條件(高溫)。Taq聚合酶的最佳活性溫度為75~80℃，在92.5℃下的半衰期為2小時以上、95℃下的半衰期是40分鐘、97.5℃下的半衰期是9分鐘，72℃以下可以在10秒內選殖1,000個鹼基對DNA。其缺失3'→5'核酸末端水解酶(核酸外切酶exonuclease)的校正活性缺失，測定出9,000個核苷酸中約1個的錯誤率。例如使用耐熱Taq可以在高溫(60℃以上)下運行PCR。Taq聚合酶的序列1中顯示的胺基酸序列作為標準序列。

本發明中，序列號為1的胺基酸序列中第507個胺基酸殘基由賴胺酸(K)取代穀胺酸(E)的Taq聚合酶被命名為“E507K”(序列號2，鹼基序列為SEQ ID NO：8)；序列號1的胺基酸序列中，第507個胺基酸殘基由賴胺酸(K)取代穀胺酸(E)，第536個胺基酸殘基由賴胺酸(K)取代精胺酸(R)的Taq聚合酶被命名為 "E507K/R536K"(序列號3，鹼基序列為SEQ ID NO：9)；序列號為1的胺基酸序列中，第507個胺基酸殘基由賴胺酸(K)取代穀胺酸(E)，第660個胺基酸殘基由纈胺酸(V)取代了精胺酸(R)的Taq聚合酶被命名為"E507K/R 660V"(序列號4，鹼基序列為SEQ ID NO：10)；最後將序列號為1的胺基酸序列中的第507個胺基酸殘基由賴胺酸(K)取代穀胺酸(E)，536個胺基酸殘基由賴胺酸(K)取代精胺酸(R)，第660個胺基酸殘基由纈胺酸(V)取代了精胺酸(R)的Taq聚合酶被命名為“E507 K/R536K/R660V"(序列號5，鹼基序列為SEQ ID NO：11)。最終，將序列號為1的胺基酸序列中第507個胺基酸殘基由賴胺酸(K)取代穀胺酸(E)、第536個胺基酸殘基由賴胺酸(K)取代精胺酸(R)、第587個胺基酸殘基由異亮胺酸(I)取代精胺酸(R)、第660個胺基酸殘基由纈胺酸(V)取代了精胺酸(R)的Taq聚合酶命名為“E507K/R536K/R587I/R660V”(序列號6，鹼基序列為SEQ ID NO：12)。

根據本發明的一個較佳實施例，所述DNA聚合酶區分匹配的引子和錯配的引子，所述匹配的引子和錯配的引子與目標序列雜交，所述錯配的引子，對於雜交的目標序列，在其3'末端包含非典型核苷酸。

所述錯配的引子是寡核苷酸，必須充分互補以與目標引子雜交，但不能反映目標序列的確切序列。

所述“典型核苷酸(canonical nucleotide)”或“互補核苷酸”是指標準的華生克里克鹼基對、A-U、A-T和G-C。

所述“非典型核苷酸(non-canonical nucleotide)”或“非互補核苷酸”是指除華生克里克鹼基對之外的A-C、A-G、G-U、G-T、T-C、T-U、A-A、G-G、T-T、U-U、C-C、C-U。

根據本發明的一個較佳實施例，所述DNA聚合酶顯示的Ct值顯示包含匹配的引子的目標序列的擴增低於包含錯配的引子的目標序列的擴增。

例如，通過將一個或多個核苷酸共價連接至引子，DNA聚合酶可以比以目標序列依賴性方式錯配的引子更高效率地延伸匹配的引子。在這裡，更高的效率可通過以下例子觀察到，如RT-PCR中與錯配的引子相比，匹配的引子的Ct值更低。匹配的引子和錯配的引子之間的Ct值的差異為10或更高，較佳10~20，或者不存在由錯配的引子引起的擴增子合成。

例如，在第一次反應中匹配的正向引子和反向引子，在同一實驗配置下的第二次反應中使用了錯配的正向引子和匹配的反向引子，這意味著由標準PCR形成的產物對第一次反應的影響大於第二次反應。

Ct(閾值交叉循環)值表示定量PCR的DNA定量方法，取決於繪製對數相循環數量上的螢光。基於DNA的螢光檢測的閾值設置為至少比背景稍高。螢光超過閾值的循環數稱為Ct或根據MIQE準則稱為Cq(定量循環，quantification cycle)。給定反應的Ct值定義為螢光發射交叉固定極限值的循環次數。例如，SYBR Green I和螢光探針可用於模板DNA定量的即時PCR。在PCR期間每個循環收集來自樣品的螢光，並對照循環次數繪圖。起始模板濃度與螢光訊號的螢光訊號最初顯示時間成反比。模板濃度越高，訊號越早出現(在較低的循環數出現)。

本發明還涉及編碼上述DNA聚合酶的核酸序列和包含該核酸序列的載體和宿主細胞。使用編碼本發明的DNA聚合酶的核酸可以製備各種載體。可以使用包括來源於可與宿主細胞互換的物種的複製子和控制序列的任何載體。本發明的載體可以是表達載體並且包括與編碼本發明的DNA聚合酶的核酸序列可操作地連接的控制轉錄和翻譯的核酸區域。調控序列是指在特定宿主生物體中表達可操作地連接的編碼序列所需的DNA序列。例如，適用於原核生物的調控序列包括啟動子、任何操作序列和alc核糖體結合位點。另外，載體可以含有“正調節因子(Positive Retroregulatory Element，PRE)”以增強轉錄的mRNA的半衰期。控制轉錄和翻譯核酸區域通常適用於用於表達聚合酶的宿主細胞。本領域已知用於各種宿主細胞之各種類型的合適的表達載體和合適的調控序列。通常，轉錄和翻譯調控序列可以包括例如啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強子或啟動序列。在典型的實施方案中，調控序列包括啟動子和轉錄起始和終止序列。載體通常還包含含有幾個用於插入外源DNA的限制性位點的多位元點轉接子區域。在某些實施方案中，使用“融合標記”來促進純化，並且如果需要，隨後去除標籤/標誌(例如“組胺酸標籤(His-tag)”)。然而，當從使用“加熱步驟”的嗜溫宿主(例如大腸桿菌)純化熱活性和/或熱穩定性蛋白時，這些通常是不必要的。使用標準重組DNA技術製備含有編碼DNA複製序列、調控序列、表型選擇基因的合適載體和關注的突變聚合酶。如本領域已知，分離的質體、病毒載體和DNA片段被分解並剪切，並以特定順序連接在一起以產生期望的載體。

在本發明的一個較佳實施例中，表達載體含有用於選擇轉化宿主細胞的選擇標記基因。選擇基因在本領域中是已知的，並且根據所使用的宿主細胞會有所不同。合適的選擇基因可以包括編碼氨苄青黴素和/或四環素抗性的基因，由此可以在存在這些抗生素的情況下轉化培養這些載體的細胞。

在本發明的一個較佳實施例中，將編碼本發明DNA聚合酶的核酸序列單獨導入細胞或與載體結合使用後導入。導入或其等價表達是指核酸以後續整合、擴增和/或表達等合適的方式進入細胞。導入方法包括CaPO₄沉澱、脂質體融合、脂聯素、電泳、病毒感染等。

原核生物作為宿主細胞用於本發明的早期選殖階段。對於快速製備大量DNA，製造單股DNA模板用於產生定位突變，篩選大量突變體，產生的突變體DNA序列化特別有用。合適的原核細胞的宿主細胞包括E.coli K12菌株94(ATCC No.31,446)、E.coli菌株W3110(ATCC No.27,325)、E.coli K12菌株DG116(ATCC No.53,606)、E.coli X1776(ATCC No.31,537)以及E.coli B；E.coli等眾多不同的菌株，如HB101、JM101、NM522、NM538、NM539，以及其他各種不同的種類，可將包括枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)等芽胞桿菌群、鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)等其他腸道菌群、或馬氏沙雷菌(Serratia marcesans)以及其他各種單假胞菌群(Pseudomonas sp.)的原核生物屬用作主體。一種典型的用於E.coli轉基因的質體包括pBR 322、pUCI 8、pUCI 9、pUCI18、pUC119和Bluescript M13。不過還可以利用許多其他合適的載體。

本發明還提供了一種製備DNA聚合酶的方法，包括培養所述宿主細胞的步驟；以及培養物和其培養上清液中分離DNA聚合酶的步驟。

本發明的DNA聚合酶是在誘導或引起DNA聚合酶表達的適當條件下，通過培養基因轉化為含有編碼DNA聚合酶核酸序列的表達載體的宿主細胞而製備的。在適合蛋白質表達的條件下培養轉基因宿主細胞的方法已在業界公開。一種來自λpL啟動子-含有的質體載體的適合於製備聚合酶的宿主細胞包括E.coli菌株DG116(ATCC No.53606)。根據表達，聚合酶可以收穫和分離。

一旦純化，就可以鑑定本發明的DNA聚合酶的錯配區別。例如，通過比較引子3-末端中具有單一鹼基錯配的目標序列的擴增與完全匹配至引子的目標序列的擴增的測定錯配區別活性。擴增可通過TaqMan^TM的使用等進行即時檢測。可以通過比較兩種反應的Ct來估計聚合酶區分兩種目標序列的能力。

因此，本發明提供一種檢測方法，包括使DNA聚合酶接觸的：a)一個以上的模板；b)核苷酸三磷酸酯；以及c)一個以上匹配的引子、一個以上錯配的引子或者一個以上匹配的引子和一個以上錯配的引子兩者；使所述一個以上匹配的引子和錯配的引子與目標序列雜交，對於和所述錯配的引子雜交的目標序列，從其3’末端開始到第7個鹼基位置上包括非標準(non-canonical)核苷酸，在一個以上的模板中活體外(in vitro)檢測一個以上的基因變異或SNP。

所述“SNP(單核苷酸多態性，Single Nucleotide Polymorphisms)”是指在DNA序列中顯示一個基因序列(A、T、G或C)差異的遺傳性變化或變異。

在本發明的活體外(in vitro)基因變異或SNP檢測方法中，目標序列可存在於檢測樣品中，可包括DNA、cDNA或RNA，其中較佳的是基因組DNA。測試樣品可以是由細菌、細菌培養物或細胞培養物製備而成的一種細胞裂解物。此外，測試樣品可能包含於動物中，較佳地包含於脊椎動物中，而包括在人類受試者中則最佳。一個目標序列可能包含在基因組DNA中，較佳的是包含在個體的基因組DNA中，更佳的是包含於細菌或脊椎動物中，而最佳的是包含於人類受試者的基因組DNA中。

本發明的SNP檢測方法可包括利用SYBR Green I等雙股特異染料進行熔體溫度分析。

熔體溫度曲線分析可以在包括板載軟體(SDS 2.1)的ABI 5700/7000(96孔格式)或ABI 7900(384孔格式)設備等即時PCR設備上進行。又或，熔體溫度曲線分析可作為終點分析進行。

“結合雙股DNA的染料”或“雙股特異染料”，和未與雙股DNA結合時相比，可在與雙股DNA結合時具有更高螢光的情況下使用。這種染料的實例包括SOYTO-9、SOYTO-13、SOYTO-16、SOYTO-60、SOYTO-64、SYTO-82、溴乙烷(EtBr)、SYTOX Orange、TO-PRO-1、SYBR Green I、TO-PRO-3或EvaGreen。除了EtBr和EvaGreen(Quiagen)，這些染料已被用於即時應用測試。

本發明的活體外(in vitro)基因變異或SNP檢測方法可以通過即時PCR、標準PCR後的瓊脂糖凝膠分析、通過即時PCR的基因變異特異擴增或等位基因特異性擴增、四引子擴增受阻突變體系PCR或等溫擴增進行，但並不限制於此。

例如，本發明的SNP檢測方法可利用定序、迷你-定序、等位基因特異性PCR(Allee specific PCR)、動態等位元基因特異性雜交(dynamic allele-specifichybridization；DASH)；PCR擴展分析(例如單鹼基延伸(single base extension；SBE)、PCR-SSCP、PCR-RFLP分析或TaqMan技術、SNPlex平臺(賽默飛世爾公司，Applied Biosystems)、核酸質譜分析系統(例如Sequenom公司的MassARRAY系統)、Bio-Plex系統(伯樂生命醫學，Bio-Rad)等進行。

所述“標準PCR”是普通技術人員所知之用於擴增DNA或cDNA的單拷貝或多拷貝的技術。幾乎所有的PCR都使用Taq聚合酶或Klen Taq等熱穩定DNA聚合酶。DNA聚合酶通過使用單股DNA作為模板並使用寡核苷酸(引子)從核苷酸酶組裝新的DNA鏈。通過PCR產生的擴增子，可以在瓊脂糖凝膠中分析。

所述“即時PCR”是在PCR時可即時監測並監控其過程，因此，是在整個PCR過程中收集資料而不是在PCR結束時收集。在即時PCR中，反應的特徵是在循環中首次檢測到擴增的時間點，而不是固定循環數後積累的目標量。主要採用基於染料的檢測和基於探針的檢測兩種方法進行定量PCR。

所述“等位基因特異性擴增(Allele Specific Amplification,ASA)”是一種擴增技術，其PCR引子被設計為單個核苷酸殘基可以區分其他模板。

所述“等位基因-特異性擴增或基因突變特異性擴增”通過十分高效的方法檢測基因變異。與大多數檢測基因變異或SNP的其他方法不同的是，不需要目標基因物質的預擴增。ASA在區分匹配和錯配引子/目標序列複合物的基礎上，將擴增和檢測結合在一個反應中。在反應過程中擴增的DNA的增加可以通過由於和雙股DNA結合而發光的SYBR Green I等染料所引起的螢光訊號的增加進行即時監控。通過即時PCR的等位基因特異性擴增或基因變異特異性擴增在發生錯配的情況下表現出螢光訊號的延遲或缺失。在基因變異或SNP檢測中，其提供了是否存在基因變異或SNP的有關資訊。

所述“四引子擴增受阻突變體系PCR”在單管PCR反應中與對照片段一同同時擴增野生型和突變等位基因。非等位基因特異性對照擴增子通過突變區側面的兩個常見的(外部)引子擴增。兩個等位基因特異性(內部)引子設計為與普通引子相反的方向，可與普通引子一同同時擴增野生型和突變型擴增子。結果，兩個等位基因-特異性擴增子的突變位置與普通(外部)引子是不對稱的，因此具有不同的長度，易於用標準凝膠電泳分離。所述對照擴增子不僅擴增失敗，而且對假陰性提供內部對比，使兩個等位基因-特異性擴增子中至少一個存在於四引子擴增受阻突變體系PCR中。

所述“等溫放大”是指核酸的擴增無需依賴於熱循環儀，而是可在較低的溫度下完成，理想的狀態是在擴增過程中不需要改變溫度。等溫擴增使用的溫度可以在室溫(22-24℃)到大約65℃之間，或是大約60-65℃、45-50℃、37-42℃或22-24℃的室溫。等溫擴增產物可通過凝膠電泳、ELISA、ELOSA(酶聯寡核苷酸試驗，Enzyme linkedoligosorbent assay)、即時PCR、ECL(改進的化學發光)、分析RNA、DNA和蛋白質或濁度之基於晶片的毛細管電泳裝置生物分析儀(bioanalyzer)檢測。

在本發明的一個實施例中，使用E507K/R536K、E507K/R660V或E507K/R536K/R660V Taq聚合酶，確認對於包含SNP(rs1408799、rs1015362和/或rs4911414)的模板，其延伸錯配引子的能力是否降低。

結果如圖6至圖8所示，與E507K Taq聚合酶相比，可以證實E507K/R536K、E507K/R660V或E507K/R536K/R660V Taq聚合酶之由錯配引子引起的擴增延遲，其效果在E507K/R536K/R660V Taq聚合酶中最為明顯。

由此證實，所述三種DNA聚合酶與常規Taq聚合酶(E507K)相比具有更高的錯配選擇性。因此預計本發明的DNA聚合酶可有效應用於疾病的醫學診斷和重組DNA的研究。

本發明的另一個實施例中，使用E507K/R536K/R/R660V Taq聚合酶，確認了對於KRAS基因中包含Q61H、G13D或G12S的和SNP的模板以及EGFR基因中包括L858R的SNP的模板，其延伸錯配引子的能力是否降低。

其結果如圖10至圖13中顯示，確認了包含E507K/R536K/R587I/R660V變異的Taq DNA聚合酶具有較包含E507K/R536K/R660V變異的Taq聚合酶更優秀的錯配延伸選擇性。由此可見，本發明之含有E507K/R536K/R587I/R660V變異的Taq DNA聚合酶能夠應用於疾病的醫學診斷以及重組DNA的研究中。

本發明還涉及一種含有本發明涉及之DNA聚合酶之用於檢測基因變異或SNP的組合物及包括其的PCR試劑盒。

根據本發明的一個理想實施例，所述PCR試劑盒適用於常規PCR(第1代PCR)、即時PCR(第2代PCR)、數位PCR(第3代PCR)或核酸質譜分析系統(MassARRAY)而使用。

本發明的PCR試劑盒，所述數位PCR可以是競爭性等位基因特異性TaqMan PCR(Competitive allele-specific TaqMan PCR)或微滴式數字PCR(Droplet digital PCR；ddPCR)，更具體地，可以是等位基因特異性轉染PCR或等位基因特異性微滴式數字PCR，但並不限於此。

所述“轉染PCR”作為一種在含有大量正常的野生型gDNA的樣本中檢測並量化稀有突變的方法，將等位基因-特異性TaqMan® qPCR與等位基因-特異性MGB阻斷劑組合後，可產生優於傳統等位基因-特異性PCR的特異性，以抑制來自野生型等位基因的非-特異性擴增。

所述“微滴式數位PCR”作為一種用2萬顆液滴分割並擴增20μl的PCR反應，計算目標DNA數位的系統，根據液滴中目標DNA的擴增與否，如數位訊號般接收並計算陽性液滴(1)和陰性滴液(0)，通過泊松分佈計算目標DNA的拷貝數，最終以每μl樣本的拷貝數確認結果值，還可用於稀有突變檢測、極少量基因擴增，突變類型的檢測等。

所述“MassARRAY”作為一種採用MALDI-TOF質譜法((MALDI-TOF質譜儀)進行基因形質分析(基因型分析，genotyping)等多種遺傳體研究的多工分析法，可用於低成本迅速分析多個樣本和靶標或特定目標的訂製型(customized)分析。

本發明的PCR試劑盒可包括普通技術人員所知的在引子延伸過程中使用的任意試劑或其他要素。

根據本發明的一個較佳實施例，所述PCR試劑盒包括一個以上的匹配引子、一個以上的錯配引子或者同時包含一個以上匹配引子和一個以上錯配引子。所述一個以上匹配的引子和一個以上錯配的引子與目標序列雜交，所述錯配的引子，相對於雜交目標序列，可以包括從其3'末端到第7個鹼基位點上的非標準(non-canonical)核苷酸。

本發明的PCR試劑盒還可包括核苷酸三磷酸酯。

本發明的PCR試劑盒還包括：a)一個以上的緩衝區；b)與雙股DNA結合的定量化試劑；c)聚合酶阻斷抗體；d)一個以上的對比值或對照序列；和e)一個以上的模板。

以下，將通過實施例對本發明進行更詳細的說明。這些實施例僅僅是對本發明的舉例說明，業界具備一般知識的人應該理解，本發明的專利範圍並不侷限於所述實施例。

實施例1 誘發Taq聚合酶突變 1-1.片段PCR

在本實施例中，序列號為1的胺基酸序列中，(按照以下方法製備SEQ ID NO：1的胺基酸序列中的)第536個胺基酸殘基的精胺酸被賴胺酸取代的Taq DNA聚合酶(以下稱為“R536K”)、第660個胺基酸殘基的精胺酸被纈胺酸取代的Taq DNA聚合酶(以下稱為“R660V”)以及第536個胺基酸殘基的精胺酸被賴胺酸取代和第660個胺基酸殘基的精胺酸被纈胺酸取代的Taq DNA聚合酶(以下稱為“R536K/R660V”)，製備方法如下。

首先，利用表1所示的突變特異性引子通過PCR擴增Taq DNA聚合酶片段(F1至F5)，如圖1(a)所示。反應條件如表2所示。

通過電泳確認PCR產物，結果如圖1(b)所示，確認了各片段的條帶，由此確認了目標片段已被擴增。

1-2.重疊(overlap)PCR

將所述1-1中擴增的各片段作為模板，使用兩末端的引子(Eco-F和Xba-R引子)擴增全長。反應條件如表3和表4所示。

其結果，如圖1(c)所示，確認了“R536K”、“R660V”和“R536K/R660V”的Tag聚合酶被擴增。

1-3.連接(ligation)

在表5所示的條件下，用限制性酶EcoRI/XbaI將pUC19在37℃下分解4小時後純化DNA，，將純化的DNA按照表6所示的條件在37℃用SAP處理1小時以製備載體。

對於插入物(insert)，將所述實施例1-2的重疊PCR產物純化，並在表7所示條件下，用限制性酶EcoRI/XbaI在37℃下分解3小時，然後與製備的載體一同進行凝膠提取(圖2)。

在表8所示的條件下，在室溫(RT)下連接2小時後，轉化大腸桿菌E.coli DH5α並在含有氨苄青黴素的培養基上篩選。從獲得的菌落製備的質體進行定序，獲得了引入所期突變的Taq DNA聚合酶突變體(“R536K”、“R660V”和“R536K/R660V”)。

實施例2 引入E507K突變 2-1.片段PCR

對所述實施例1中製備的“R536K”、“R660V”及“R536K/R660V”的Taq聚合酶的活性進行測試，結果確認活性下降(資料未圖示)，分別對“R536K”、“R660V”及“R536K/R660V”引入了E507K變異(序列號1的胺基酸序列中，第507個胺基酸殘基的穀胺酸被賴胺酸取代)，作為對照組，在野生型(WT)Taq DNA聚合酶中也引入了E507K突變。引入了E507K突變的Taq DNA聚合酶的製備方法與實施例1相同。

使用表9所示的突變特異性引子，如圖3所示通過PCR擴增Taq DNA聚合酶各片段(F6至F7)。反應條件如表10所示。

2-2.重疊(overlap)PCR

將所述2-1中擴增的各片段作為模板，使用兩末端的引子(Eco-F和Xba-R引子)擴增全長。反應條件如表11所示。

2-3.連接(ligation)

在表5所示的條件下，用限制性酶EcoRI/XbaI將pUC19在37℃下分解4小時並純化DNA，在表6所示的條件下，將純化的DNA在37℃用SAP處理1小時以製備載體。

對於插入物(insert)，將所述實施例2-2的重疊PCR產物純化，並在表7所示條件下，用限制性酶EcoRI/XbaI在37℃下分解3小時，然後與製備的載體一同進行凝膠提取(圖4)。

在表8所示的條件下，在室溫(RT)下連接2小時後，轉化大腸桿菌E.coli DH5α或DH10β並在含有氨苄青黴素的培養基上篩選。從獲得的菌落製備的質體進行定序，獲得了引入所需突變的Taq DNA聚合酶突變體(“E507K/R536K”、“E507K/R660V”和“E507K/R536K/R660V”)。

實施例3 使用本發明的DNA聚合酶進行qPCR

使用各自含有所述實施例2中獲得的“E507K/R536K”、“E507K/R660V”和“E507K/R536K/R660V”突變的Taq聚合酶，確認對於含有SNP的模板，其延伸錯配的引子的能力是否降低。作為對照組，使用了含有E507K突變的“E507K”Taq聚合酶。

在本實施例中使用的包含SNP的模板為rs1408799、rs1015362和rs4911414，各模板的基因型和各自對應的特異性引子(IDT，美國)的序列資訊如表12和表13所示。

qPCR條件(Applied Biosystems 7500 Fast)如下表14所示。

探針進行雙重標記，如下表15所示。

使用購自Noble Bio的口腔上皮細胞收集試劑盒收集口腔上皮細胞，將其溶解於500μl裂解液(lysis solution)中，並以12,000×g離心3分鐘。將上清液轉移到新管中，每次使用1μl(圖5)。

反應條件如表16所示，反應緩衝液的組成如表17所示。

除了表13所示的特異性引子以外，其他反應液以同樣方式在兩個試管中製備，通過添加各等位基因特異性引子進行qPCR。此時，合併各試管中檢測到的螢光訊號以在AB 7500軟體(v 2.0.6)上計算並分析達到閾值 (threshold))螢光值的循環(Ct)值的差異。判斷由錯配引子引起的擴增中的Ct值延遲的時間越長，基因變異特異性或等位基因特異性就越好。

在rs1408799、rs1015362及rs4911414上進行AS-qPCR的結果，如圖6至8所示，與對照組E507K相比，可以證實包含E507K/R536K、E507K/R660V或E507K/R536K/R660V變異的Taq聚合酶的情況下，錯配引子引起的擴增延遲，其效果在E507K/R536K/R660V突變中最為明顯。

確認了和包含E507K突變的Taq聚合酶相比，本發明的包含E507K/R536K、E507K/R660V或E507K/R536K/R660V突變的Taq DNA聚合酶具有更優秀的錯配延伸選擇性。由此可見，所述3種Taq DNA聚合酶可有效運用於疾病的醫學診斷和重組DNA研究。

實施例4 R587I變異的導入 4-1. 片段PCR

為了在實施例2中製備的“E507K/R536K/R660V”變異的Taq選殖中追加導入R587I變異(序列號1的胺基酸序列中第587個胺基酸殘基由精胺酸置換為異亮胺酸)，利用下表18中記錄的引子將圖9(a)所示的2個片段擴增至PCR。反應條件如表19。

在電泳上確認PCR產物的結果如圖9(b)所示證實，各片段的條帶得到確認，目標片段擴增。

4-2.In-Fusion選殖(In-fusion cloning)

Taq質體載體(E507K/R536K/R660V)在表20所示條件下，在37℃下經4小時分解為限制性酶KpnI/XbaI，經純化(融化：25μl)後製備成分解線性載體。然後在表21的條件下，在37℃下進行In-Fusion選殖反應15分鐘後生物轉化成E.coli DH5α或DH10β，從含氨苄西林的培養基中篩選出來。對所得各選殖準備的質體進行定序得到了導入R 587 I變異的Taq DNA聚合酶突變體(“E507K/R536K/R587I/R660V”)。

實施例5利用"E507K/R536K/R587I/R660V" Taq聚合酶進行qPCR 5-1. KRAS基因的Q61H變異區分

使用實施例4中獲取的包含"E507K/R536K/R587I/R660V"變異的Taq聚合酶，確認了KRAS基因中含有Q61H的SNP的模板延長錯配引子的能力有否降低。對比組使用了包含“E507K/R536K/R660V”變異的Taq聚合酶。

所述包含SNP的模板是從HepG2肝癌細胞株獲取的gDNA(104copies,33ng/rxn)，通過常規的DNA萃取方法獲取。經確認，檢測目標部位均與NCBI參考序列(NG_007524.1)一致，並用作野生型(WT)。

針對所述模板的特異性引子的序列資訊如下表22所示。

qPCR條件(Applied Biosystems 7500 Fast)與所述實施例3的表14相同。

探針如下表23所示進行了標記。

反應條件與所述實施例3的表16相同，反應緩衝液的組成如下表24。

將所述表22的特異性引子之外的其餘反應液以相同的量放入2個試管，各添加等位基因特異性引子後進行qPCR。此時，各試管中測得的螢光訊號合併後用AB7500軟體(v2.0.6)分析了達到計算並匯出的臨界點(threshold)螢光值的循環(Ct)值的差異。錯配引子引起的擴增中的Ct值越延遲，基因變異特異性或等位基因特異性越好。

AS-qPCR結果如圖10(a)和(b)所示，可確認與對比組E507K/R536K/R660V相比，包含E507K/R536K/R587I/R660V變異的Taq聚合酶△Ct增加至5，錯配引子引起的擴增延遲。

另外，本發明的發明者們還將下表25中的引子製成18mer的長度代替所述表22的24mer長的引子使用，再一次反復進行了所述實驗。除了使用下表26的反應緩衝液組成之外，所有條件和使用所述24mer長度的引子所進行的實驗相同。

其結果，如圖10(c)和10(d)所示，可以確認與對比組E507K/R536K/R660V相比，包含E507K/R536K/R587I/R660V變異的Taq聚合酶由錯配引子引起的擴增延遲。尤其是，導入R587I的聚合酶的△Ct明顯增加。

5-2. KRAS基因的G13D變異區分

使用所述實施例4中獲取之包含“E507K/R536K/R587I/R660V”變異的Taq聚合酶，確認了KRAS基因中包含G13D的SNP的模板延伸錯配引子的能力有否降低。對比組則使用了包含“E507K/R536K/R660V”變異的Taq聚合酶。

所述包含SNP的模板是從HepG2肝癌細胞株獲取的gDNA(104 copies,33ng/rxn)，通過常規的DNA萃取方法獲取。經確認，檢測目標部位均與NCBI參考序列(NG_007524.1)一致，並用作野生型(WT)。

針對所述模板的特異性引子的序列資訊如下表27所示。

qPCR條件(Applied Biosystems 7500 Fast)與所述實施例3的表14相同。

探針如下表28所示進行了標記。

反應條件與所述實施例3的表16相同，反應緩衝液的組成和所述實施例5-1的表24相同。

將所述表27的特異性引子之外的其餘反應液以相同的量放入2個試管，各添加等位基因特異性引子後進行qPCR。此時，各試管中測得的螢光訊號合併後用AB7500軟體(v2.0.6)分析了達到計算並匯出的臨界點(threshold)螢光值的循環(Ct)值的差異。錯配引子引起的擴增中的Ct值越延遲，基因變異特異性或等位基因特異性越好。

AS-qPCR結果如圖11所示，可確認與對比組E507K/R536K/R660V相比，包含E507K/R536K/R587I/R660V變異的Taq聚合酶由錯配引子引起的擴增延遲。

5-3. KRAS基因的G12S變異區分

使用所述實施例4中獲取的包含“E507K/R536K/R587I/R660V”變異的Taq聚合酶，確認了KRAS基因中包含G13S的SNP的模板延伸錯配引子的能力有否降低。對比組則使用了包含“E507K/R536K/R660V”變異的Taq聚合酶。

針對所述模板的特異性引子的序列資訊如下表29所示。

qPCR條件(Applied Biosystems 7500 Fast)與所述實施例3的表14相同。

探針如下表30所示進行了標記。

將所述表29的特異性引子之外的其餘反應液以相同的量放入2個試管，各添加等位基因特異性引子後進行qPCR。此時，各試管中測得的螢光訊號合併後用AB7500軟體(v2.0.6)分析了達到計算並匯出的臨界點(threshold)螢光值的循環(Ct)值的差異。錯配引子引起的擴增中的Ct值越延遲，基因變異特異性或等位基因特異性越好。

AS-qPCR結果如圖12所示，可確認與對比組E507K/R536K/R660V相比，包含E507K/R536K/R587I/R660V變異的Taq聚合酶由錯配引子引起的擴增延遲。

5-4. EGFR基因的L858R變異區分

使用所述實施例4中獲取的包含“E507K/R536K/R5871/R660V”變異的Taq聚合酶，確認了EGFR基因中包含L858R的SNP的模板延伸錯配引子的能力有否降低。對比組則使用了包含“E507K/R536K/R660V”變異的Taq聚合酶。

所述包含SNP的模板是從HepG2肝癌細胞株獲取的gDNA(10⁴copies,33ng/rxn)，通過常規的DNA萃取方法獲取。經確認，檢測目標部位均與NCBI參考序列(NG_007726.3)一致，並用作野生型(WT)。

針對所述模板的特異性引子的序列資訊如下表31所示。

qPCR條件(Applied Biosystems 7500 Fast)與所述實施例3的表14相同。

探針如下表32所示進行了雙重標記。

將所述表31的特異性引子之外的其餘反應液以相同的量放入2個試管，各添加等位基因特異性引子後進行qPCR。此時，各試管中測得的螢光訊號合併後用AB7500軟體(v2.0.6)分析了達到計算並匯出的臨界點(threshold) 螢光值的循環(Ct)值的差異。錯配引子引起的擴增中的Ct值越延遲，基因變異特異性或等位基因特異性越好。

AS-qPCR結果如圖13所示，可確認與對比組E507K/R536K/R660V相比，包含E507K/R536K/R587I/R660V變異的Taq聚合酶由錯配引子引起的擴增延遲。

如上所述，確認了包含本發明E507K/R536K/R587I/R660V變異的Taq DNA聚合酶與包含E507K/R536K/R660V變異的Taq聚合酶相比，在某些情況下具有優異的錯配延伸選擇性。由此可見，包含本發明E507K/R536K/R587I/R660V變異的Taq DNA聚合酶可有效運用於疾病的醫學診斷和重組DNA研究。

<110> 基因凱斯特有限公司

<120> 基因突變特異性擴增效率提高的DNA聚合酶

<130> 107E0253

<150> KR 10-2017-0088373

<151> 2017-07-12

<160> 55

<170> PatentIn version 3.5

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> PRT

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Claims

一種由序列號為1的胺基酸序列構成之帶有Taq聚合酶的DNA聚合酶，這種DNA聚合酶包括：(a)序列號為1的胺基酸序列中第507個胺基酸殘基的取代；以及(b)序列號為1的胺基酸序列中第536個胺基酸殘基的取代、第660個胺基酸殘基的取代或第536個和第660個兩個胺基酸殘基的取代、或第536個、第587個和第660個三個胺基酸殘基的取代。
如申請專利範圍第1項所述的DNA聚合酶，其中所述第507個胺基酸殘基的置換是由賴胺酸(K)取代穀胺酸(E)，所述第536個胺基酸殘基的置換是由賴胺酸(K)取代精胺酸(R)，所述第587個胺基酸殘基的置換是由異亮胺酸(I)取代精胺酸(R)，所述第660個胺基酸殘基的置換是由纈胺酸(V)取代精胺酸(R)。
如申請專利範圍第1項所述的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶區分匹配的引子和錯配的引子，所述匹配的引子和錯配的引子與目標序列雜交，對於所述錯配引子雜交的目標序列，其3'末端包括非典型核苷酸。
如申請專利範圍第1項所述的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶包含匹配的引子的目標序列的擴增顯示的Ct值比包含錯配的引子的目標序列的擴增顯示的Ct值低。
一種編碼如申請專利範圍第2項所述的DNA聚合酶的核酸序列。
一種包括如申請專利範圍第5項所述的核酸序列的載體。
一種轉基因如申請專利範圍第6項所述的載體的宿主細胞。
一種檢測方法，包括使申請專利範圍第1項或申請專利範圍第2項所述的DNA聚合酶接觸的：a)一個或多個模板；b)一個以上匹配的引子、一個以上錯配的引子或一個以上匹配的引子和一個以上錯配的引子兩者；以及c)核苷酸三磷酸酯；使所述一個以上匹配的引子和錯配的引子與目標序列雜交，對於和所述錯配的引子雜交的目標序列，從其3’末端開始到第7個鹼基位點上包括非常規核苷酸，在一個以上模板中活體外檢測一個以上的基因變異或SNP。
如申請專利範圍第8項所述的方法，其包括採用雙股特異性染料進行熔體溫度分析。
如申請專利範圍第8項所述的方法，其中通過即時PCR、標準PCR後瓊脂糖凝膠中的分析、通過即時PCR的基因變異特異性擴增或等位基因-特異性擴增、四引子擴增-受阻突變體系PCR或等溫擴增來完成。
一種包含如申請專利範圍第1項或申請專利範圍第2項所述的DNA聚合酶之用於檢測基因變異或SNP的組合物。
一種包含如申請專利範圍第11項所述之組合物的PCR試劑盒。
如申請專利範圍第12項所述的PCR試劑盒，其中所述PCR試劑盒可用於轉染PCR、微滴式數位PCR或核酸質譜分析系統。
如申請專利範圍第12項所述的PCR試劑盒，其包括一個以上的匹配引子、一個以上的錯配引子或者一個以上的匹配引子和一個以上的錯配引子兩者，所述一個以上匹配引子和一個以上錯配引子與目標序列雜交，對於和所述錯配引子雜交的目標引子，從其3’末端開始到第7個鹼基位點上可包括非常規核苷酸。
如申請專利範圍第12項所述的PCR試劑盒，其還可包括核苷酸硫磷酸脂。
如申請專利範圍第12項所述的PCR試劑盒，其還可包括：a)一個或多個緩衝劑；b)一種結合雙股DNA的定量化試劑；c)聚合酶阻斷抗體；d)一個以上對比值或對比序列；以及e)一個或多個模板。