CN112980964A - 一种检测人类易晒黑肤质的多重基因检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测人类易晒黑肤质的多重基因检测试剂盒及其使用方法。本发明采用多重PCR结合片段长短/质量分析方法,同步快速定性检测与皮肤是否易晒黑的相关基因ASIP上2个单核苷酸多态性(SNP)位点。检测方法包括采集样本并提取核酸的步骤;以提取的核酸为模板进行多重PCR扩增的步骤;最后毛细管电泳分离样品并进行结果分析判读的步骤,其优势是快速、准确、灵敏度高、特异性强、通量高、成本低。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域,具体涉及一种检测人类易晒黑肤质的多重基因检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
肤质是指人类皮肤的多样化所形成的特殊属性,随着社会生活水平的提高,人们对皮肤的保养也更加重视。目前人们对肤质的了解也仅处在外观以及一些简单的理化检测上,实际影响肤质最根源的乃是遗传因素,通过对基因的检测可以了解自身肤质在基因层面的好坏倾向。
外界坏境对肤质的影响很大,比如紫外线会造成晒黑、色斑问题,但是不同人对外部因素的敏感性不同,相同环境下有的人容易晒黑、产生色斑,有的人则不然。因此,及早的获取我们肌肤的特质信息能够让我们更有效的呵护肌肤。
人类基因组80%以上基因多态性都是单核苷酸多态性(Single Nucleotidepolymorphism,SNP)。SNP指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,包括碱基转换、颠换、缺失和插入。有研究表明ASIP基因与肌肤是否易晒黑有很大相关性,ASIP基因编码Agouti信号蛋白,使毛囊黑色素细胞合成褐黑素,主要表达于皮肤中。一项涉及约9000例个体的GWAS研究显示,该基因的rs1015362和rs4911414的SNP多态性影响皮肤晒黑和色斑的形成。
目前市场上,SNP分型检测技术主要有三种:测序法、荧光定量PCR法、基因芯片法。
荧光定量PCR
荧光定量PCR采用荧光淬灭及双末端标记技术,针对SNP位点设计特异性的探针,具有灵敏度高、准确性高和特异性高等优势。但荧光定量PCR通量低,若要同时检测多个个SNP位点,需要分管检测,操作复杂,样品用量大,难以适应临床需求。此外,荧光定量PCR难以设置内参质控,无法避免假阳性和假阴性。
基因芯片技术:
基因芯片是通过微加工技术,将数以万计的特定序列的DNA片段(基因探针),有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上,构成的一个二维DNA探针阵列,利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交,可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。其优点是通量高、操作简便;缺点是检测成本昂贵、重复性差、灵敏度较低。芯片的种类较多,难以制定一个统一的质量控制标准也限制了基因芯片技术的普及。
测序法:
Sanger测序法是SNP分型金标准,不仅能检测已知SNP,也能发现未知SNP。但Sanger测序法操作复杂,成本较高。当测序位点较多时需要逐个位点测序,耗时长,累计价格相对昂贵。二代测序技术实现了边合成边测序,具有高通量、高效率的优势。然而二代测序平台价格昂贵、普及度低,作为SNP检测技术在临床上的应用还不够成熟。
基于此,本发明提供了一种基于多重PCR和CE分离技术的快速肤质检测组合引物及其应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测人类易晒黑肤质的多重基因检测试剂盒及其使用方法,该试剂盒能对受测者的相关基因进行检测,并给出分析。
具体地,本发明公开了一种检测人类易晒黑肤质的多重基因检测试剂盒及其使用方法,包括如下步骤:
a)采集受测者口腔内脱落细胞保存于采集卡或者对血液样本进行DNA核酸提取;
b)取受测者唾液采集卡样本或提取的DNA样本加入到反应体系中,进行PCR扩增;
c)运行扩增程序;
d)对扩增产物进行电泳分析,并根据峰型图进行判读;
本试剂盒包含以下几个组分:Primer Mix、PCR反应液和 DNA/RNA-free水。
其中的Primer Mix中,包含扩增ASIP基因的2个SNP多态位点的引物组及3个人类基因组DNA内参和反应内参pcDNA的引物组,详见表1。
本试剂盒可对受测样本进行同步多重PCR扩增,通过SNP引物的设计,可以精确测出被检测基因ASIP的基因型:杂合子或纯合子;pcDNA用以检测反应体系,监控反应体系是否有效,扩增是否正常;3个人体基因组DNA内参用以检测人体样本,保证人体样本有效。
其中PCR反应液包含以下组分:2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、氯化钾、氯化镁等。
本试剂盒的PCR扩增反应条件见表2。
表2本发明的PCR扩增反应条件
本试剂盒的扩增产物通过电泳对扩增产物进行分析;优选的电泳为毛细管电泳。
本试剂盒可同时扩增多个位点,实现检测的简易性、高效性和特异性,通过分析扩增图谱判断测试者皮肤肤质,指导测试者进行针对性的皮肤保养,见表3。
表3本发明的检测位点-肤质参考信息
附图说明
图1是本试剂盒阴性对照DNA/RNA-free水扩增图谱。只出现 pcDNA特征峰。
图2是受测者1口腔脱落细胞样本扩增图谱。该测试者ASIP基因 rs4911414位点的基因型为TG;ASIP2基因rs1015362位点的基因型为GA;出现pcDNA峰及人基因组DNA(huDNA)内参-1、人基因组DNA(huDNA)内参-4、人基因组DNA(huDNA)内-7特征峰。
图3是受测者2口腔脱落细胞样本扩增图谱。该测试者ASIP基因 rs4911414的基因型为GG;ASIP2基因rs1015362位点的基因型为 GG;出现pcDNA峰及人基因组DNA(huDNA)内参-1、人基因组DNA(huDNA)内参-4、人基因组DNA(huDNA)内-7特征峰。
图4是受测者2血液提取DNA样本扩增图谱,同图3。
具体实施方法:
为了更好地理解本发明的内容,下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解,这些实施例仅用于对本发明进一步说明,而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明的内容后,该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整,仍属于本发明的保护范围。
检测是否属于易晒黑肤质的试剂盒,包括盒体和盒体内存放的试剂,包括如下步骤:
a)采集受测者口腔内脱落细胞保存于采集卡或者对血液样本进行DNA核酸提取;
b)取受测者唾液采集卡样本或提取的DNA样本加入到反应体系中,进行PCR扩增;
c)运行扩增程序;
d)对扩增产物进行电泳分析,并根据峰型图进行判读;
本试剂盒包含以下几个组分:包含引物组在内的Primer Mix、 PCR反应液和DNA/RNA-free水。
其中的PCR反应体系Primer Mix中,包含扩增2个SNP多态位点、3个人类基因组内参和pcDNA反应内参的引物组,详见表1。
其中PCR反应液包含以下组分:2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、氯化钾、氯化镁等。
在实施案例中,所述的样本为DNA/RNA-free水、受测者1口腔内壁脱落细胞采集卡、受测者2口腔内壁脱落细胞采集卡、受测者2血液DNA提取样本。
在实施案例中,所述的电泳是通过毛细管电泳对扩增产物进行电泳,并结合分析软件给出扩增图谱并给出分析,判断受测者是否属于易晒黑肤质。
实施例一
(1)所选样本:DNA/RNA-free水。
(2)体系配置
根据说明书,将引物Primer Mix、PCR反应液,在冰上按照说明书比例进行反应体系配置,涡旋混匀后,用离心机进行离心,然后用枪头进行混匀和分装。
(3)加入样本
按照说明书,用移液器取对应体积的DNA/RNA-free水,加入到已经分装好的反应体系中。
(4)扩增程序
PCR仪器上的扩增程序为如表2。
(5)扩增产物在3500DX遗传分析仪上检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(Size-500)组成上样混合物{(1μL Size-500+12μL去离子甲酰胺)×(进样数)}。将9μL上样混合物与1μL扩增产物混合,避免产生气泡,尽快电泳。用ABI 3500遗传分析仪(购自美国ABI公司)检测分析,具体分析参数为进样电压:1.2kv,进样时间:15s,电泳时间1210-1500s。检测结果如图1所示。
(6)分析数据
本次实验中所使用的是DNA/RNA-free水,在电泳图谱中应不存在各基因位点的目标峰,只出现pcDNA基因的特征峰,如下: pcDNA位点所对应的出峰情况为:单峰,图谱中显示pcDNA;
如图1所示,DNA/RNA-free水扩增产物电泳分析图谱只出现反应内参pcDNA峰。
本次实验能够有效地验证反应试剂的扩增有效性,无外界污染源。
实施例二
(1)所选样本:受测者1和受测者2的口腔内壁脱落细胞样本。
(2)样本采集
采集类型:口腔内壁脱落细胞。
采集方法:采用唾液采集棒在口腔内壁上来回擦拭4次,用唾液采集棒的反面继续在口腔内壁上来回擦拭4次,取出唾液采集棒,在唾液样本采集卡上反复按压,将唾液内壁细胞转移到唾液样本采集卡上,并将已经采集好的唾液样本采集卡在无污染区域作晾干处理。
有效样本:唾液样本采集卡的粉色区域变成浅粉色或白色的区域为有效唾液样本区域。
选取样本方法:利用达博塑料打孔器(1.0mm)进行手动打孔取样。
(3)体系配置
根据说明书,将引物Primer Mix、PCR反应液,在冰上按照说明书比例进行反应体系配置,涡旋混匀后,用离心机进行离心,然后用枪头进行混匀和分装。
(4)加入样本:用打孔器取唾液卡中的有效样本1~2个,加入到配置好的反应体系中。
(5)扩增程序
PCR仪器上的扩增程序为如表2。
(6)扩增产物在3500DX遗传分析仪上检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(Size-500)组成上样混合物{(1μL Size-500+12μL去离子甲酰胺)×(进样数)}。将9μL上样混合物与1μL扩增产物混合,避免产生气泡,尽快电泳。用ABI 3500遗传分析仪(购自美国ABI公司)检测分析,具体分析参数为进样电压:1.2kv,进样时间:15s,电泳时间1210-1500s。检测结果分别为图2和图3。
(7)分析数据
本次实验中所使用的是受测者样本,根据各目的峰在图谱中出现的位置,确定该受测者的基因型,指导判断受测者试者是否属于易晒黑肤质。
图2为受测者1唾液样本的分析图谱,图3为受测者2唾液样本的分析图谱。
根据图2分析如下:
受测者1扩增产物电泳图谱出现以下特征峰:ASIP基因rs4911414的基因型为TG;ASIP基因rs1015362的基因型为GA; pcDNA峰及人基因组DNA(huDNA)内参-1、人基因组DNA(huDNA)内参-4、人基因组DNA(huDNA)内-7特征峰。
其中ASIP基因rs4911414位点G显示为ASIP_1_G,位点T显示为ASIP_1_T;ASIP基因rs1015362位点G显示为ASIP_2_G,位点A显示为ASIP_2_A;pcDNA位点为单峰;人基因组DNA(huDNA)内参-1为单峰,图谱中显示huDNA-1;人基因组DNA (huDNA)内参-4为单峰,图谱中显示huDNA-4;人基因组DNA (huDNA)内参-7位点为单峰,图谱中显示huDNA-7。
参考表3,1号受测者的ASIP基因rs4911414和rs1015362基因型均为杂合子,表明该受测者皮肤不易晒黑。
图3为受测者2唾液样本的分析图谱。
受测者2扩增产物电泳图谱出现以下特征峰:ASIP基因 rs4911414的基因型为GG;rs1015362的基因型为GG;pcDNA峰及人基因组DNA(huDNA)内参-1、人基因组DNA(huDNA)内参-4、人基因组DNA(huDNA)内-7特征峰。
其中ASIP基因rs4911414位点G显示为ASIP_1_G,位点T显示为ASIP_1_T;ASIP基因rs1015362位点G显示为ASIP_2_G,位点A显示为ASIP_2_A;pcDNA位点为单峰;人基因组DNA(huDNA)内参-1为单峰,图谱中显示huDNA-1;人基因组DNA (huDNA)内参-4为单峰,图谱中显示huDNA-4;人基因组DNA (huDNA)内参-7位点为单峰,图谱中显示huDNA-7。
参考表3,2号受测者的ASIP基因rs4911414和rs1015362基因型均为GG纯合,表明该测试者肤质容易晒黑。
实施例三
(1)所选样本:受测者2的血液样本。
(2)样本类型:血液样本。
(3)提取DNA:利用核酸提取仪对血液样本进行DNA提取。
(4)体系配置
根据说明书,将引物Primer Mix、PCR反应液,在冰上按照说明书比例进行反应体系配置,涡旋混匀后,用离心机进行离心,然后用枪头进行混匀和分装。
(5)加入样本:按照说明书,用移液器取一定量的提取DNA 样本,加入到反应体系中。
(6)扩增程序
PCR仪器上的扩增程序为如表2。
(7)扩增产物在3500DX遗传分析仪上检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(Size-500)组成上样混合物{(1μL Size-500+12μL去离子甲酰胺)×(进样数)}。将9μL上样混合物与1μL扩增产物混合,避免产生气泡,尽快电泳。用ABI 3500遗传分析仪(购自美国ABI公司)检测分析,具体分析参数为进样电压:1.2kv,进样时间:15s,电泳时间1210-1500s。检测结果分别图4所示。
(8)分析数据
图4为受测者2的血液提取DNA样本分析图谱,图谱中的峰与图3一致,说明该检测试剂盒同样适用于血样提取的DNA样本。
Claims (7)
2.权利要求1所述的一种检测人类易晒黑肤质的多重基因检测试剂盒及其使用方法,其特征在于,所述的口腔脱落细胞,为口腔内壁上脱落细胞,保存于细胞采集卡上,可直接用于PCR扩增。
3.权利要求1所述的一种检测人类易晒黑肤质的多重基因检测试剂盒及其使用方法,其特征在于,所述血液样本,为受测者血液样本或采集于血液保存卡上的血样样本,经过提取的DNA,可直接用于PCR扩增。
4.权利要求1所述的一种检测人类易晒黑肤质的多重基因检测试剂盒及其使用方法,其特征在于,所述的反应体系包含引物组在内的Primer Mix、PCR反应液和DNA/RNA-free水。
5.权利要求1所述的一种检测人类易晒黑肤质的多重基因检测试剂盒及其使用方法,其特征在于,反应体系中的PrimerMix包含了检测ASIP上的2个SNP位点所有基因型的引物,包含了pcDNA和3个人体基因组DNA内参引物。
6.权利要求1所述的一种检测人类易晒黑肤质的多重基因检测试剂盒及其使用方法,其特征在于,反应体系中的PCR反应液包含了2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、氯化钾、氯化镁等。
7.权利要求1所述的一种检测人类易晒黑肤质的多重基因检测试剂盒及其使用方法,其特征在于,扩增产物通过电泳对扩增产物进行分析;优选的所述电泳为毛细管电泳。
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