CN212111148U - 高效能mRNA标记侦测试剂组结构 - Google Patents
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Abstract
一种高效能mRNA标记侦测试剂组结构，其包括一基因检测器及一与该基因检测器连接的控制器。基因检测器包含一基因芯片感测单元、一基因芯片反应试剂单元、一温控单元、一影像撷取单元及一管理操作单元。本实用新型不需对PCR核酸进行放大，并将RNA反转录反应与生物素标定整合为一个步骤藉此，透过本实用新型提出的高效能mRNA标记侦测试剂组结构，可于临床检验检查时，不需进行放大，透过基因芯片就可以检测检体中的基因表现，具有较高的灵敏度及较佳的方便性，能达到一次满足高灵敏度及便利性的需求。
Description
技术领域
本实用新型有关于一种高效能mRNA标记侦测试剂组结构，尤指涉及一种不包含PCR核酸放大技术，并将RNA反转录反应与生物素标定整合为一个步骤，再透过创新配方与重复反应达到相对应的高效能mRNA标记侦测试剂组结构。
背景技术
对基因过渡表现(Overexpression)的分析已经导致疾病诊断的基本进步与临床进展。而研究基因过渡表现的技术包含有北方墨点法(Northern Blot)、反转录聚合酶链锁反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)及实时定量聚合酶链锁反应(Real-Time PCR)。其中北方墨点法由于操作步骤十分繁琐，所需检体量又过多，因此仅限于研究操作上，无法实际应用于临床诊断。至于反转录聚合酶链锁反应及实时定量聚合酶链锁反应由于操作步骤简便，因此在单一基因检测的应用上，使用相当广泛，例如肝炎病毒的检测及感染症病原菌的鉴定。然而，虽然PCR(聚合酶链锁反应序列)的创作是作为整体最伟大的实验，但多数PCR技术仍保有特定的共同问题，其主要问题包含有：首先为污染，过渡灵敏侦察的伪阳性，例如雾式的 DNA或先前的样品残余；其次，为RT-PCR仅被认为半定量，因为当比较不同的样品时，难以控制序列放大效率；再者，由于所需引子(Primer)间黏合 (Annearling)的干扰，无论RT-PCR或Real-Time PCR都仅广泛应用于单一基因标的检测，当检测标的为基因群时，则PCR相关的技术则有操作耗时、费事及高成本等缺点。
随着近几年来生物科技的快速发展，生物芯片于临床医学诊断或药效评估上的应用逐渐被重视，本发明的先前研究已开发并且评估一尼龙膜芯片(Membrane Array)方法，能使用于癌症诊断，在血液检体(Peripheral Blood)中同时查出一多种mRNA标记引物的表现。其分子标志的表现由RT-PCR 与尼龙膜芯片评估，数据从RT-PCR与尼龙膜芯片取得，且受制于线性回归分析，显示在这两个方法结果之间的高度相互关系(r＝0.979，P<0.0001)。另外，以相关衍生技术的加权化学冷光型基因芯片(Weighted ChemiluminescentMembrane Array,WCHMA)，用于肺癌(Lung Cancer)患者的血液检体分析标的治疗药物(Target Therapeutic Drug)的作用标的K- ras的异常情形，也已被接受刊登于肺癌期刊中。
虽然尼龙膜芯片于分子诊断及药效评估上的应用已有许多报告提出，然而，由于原始尼龙膜芯片所使用判读方法上，对于每一基因在特定疾病的重要性皆等值的概念下，造成检测特异性在达到一定程度之后便不易提升。对此，本发明人研究开发了一基因群检测结构，虽可大量并快速进行生物检体检测分析，但其检测过程需要先行放大，并无法达到直接从血液检测透过基因芯片就能侦测血液里的基因表现，导致在芯片检测灵敏度及方便性等方面的要求仍嫌不足。于是，本发明再研究开发一酵素型基因芯片侦测试剂组结构，虽然不需进行放大，即可达到直接从血液检测透过基因芯片就能侦测血液里的基因表现，但其包含RNA萃取、cDNA合成、探针标志、杂交反应、以及讯号侦测等繁复的操作步骤，且其杂交反应仅一阶段温控，所耗反应时间长(需至少6.4小时以上)；因此，整体而言，该技术造成侦测所需时间冗长及耗费大量溶剂清洗(六阶段清洗步骤)，导致成本增加且降低效率与效能之余，其产出讯号时背景值亦较高，更有讯号易失真等问题。故，一般已用者无法符合使用者于实际使用时的所需。
实用新型内容
本实用新型主要目的在于，克服已知技艺所遭遇的上述问题并提供一种具有较高灵敏度及较佳方便性的高效能mRNA标记侦测试剂组结构。
为达以上目的，本实用新型系一种高效能mRNA标记侦测试剂组结构，其包括：一基因检测器，系包含：一基因芯片感测单元，其设有一待测检体纯化与标定区及一基因芯片反应与显像区，该基因芯片反应与显像区中系设有一基因芯片，该基因芯片系选定一寡核苷酸片段，并以两个作为基因芯片反应质量控管依据的管家基因(Housekeeping Gene)，将此包含多种目标基因的寡核苷酸片段固着于热塑型材质的芯片上，形成在该基因芯片上被覆有标定特定序列者；一基因芯片反应试剂单元，系与该基因芯片感测单元连接，用以提供该基因芯片进行反应时所需的全部试剂，系由RNA萃取组件、生物素标定组件、杂合反应组件及讯号侦测组件所组成；一温控单元，系与该基因芯片感测单元连接；一影像撷取单元，系与该基因芯片感测单元连接；及一管理操作单元，系与该基因芯片感测单元、该基因芯片反应试剂单元、该温控单元、及该影像撷取单元连接，可作为各单元运作时的控制；所述基因芯片感测单元于该待测检体纯化与标定区通过该基因芯片反应试剂单元提供的试剂，以磁珠纯化待测检体中的mRNA，将此mRNA以生物素标定成探针(Probe)后传送至该基因芯片反应与显像区中进行反应，以该基因芯片反应试剂单元提供的试剂，且由该温控单元对该基因芯片反应与显像区作二阶段温控，将该探针与该基因芯片进行杂合(Hybridization)反应，再将该基因芯片上杂合后的探针加上讯号显示剂进行呈色反应(Color Development)，实现基因检测，该管理操作单元通过该影像撷取单元对该基因芯片反应与显像区撷取待测检体与基因芯片所具有的探针进行杂合反应并显像后产生的影像，并根据一操控参数控制基因检测的过程，控制该基因芯片反应试剂单元中各试剂的添加，以及控制该温控单元的输出温度与温控次数；以及一控制器，系与该基因检测器连接，其包含有一处理单元、一与该处理单元连接的输入单元、及一与该处理单元连接的输出单元，通过该输入单元提供用户输入所需操控参数，并由该处理单元将此操控参数传送至该管理操作单元，以控制该基因检测器进行基因检测的过程，同时接收该基因检测器所撷取的影像，并对该影像结果进行自动化分析，最后将分析结果由该输出单元输出，上述基因芯片反应试剂单元中，该RNA萃取组件包含蛋白酶试剂、RNA专用裂解试剂、磁珠保存/结合试剂、RNA清洗试剂及RNA回溶/保存试剂；该生物素标定组件包含生物素标定试剂及生物素免疫结合试剂；该杂合反应组件包含杂合反应试剂；以及该讯号侦测组件包含缓冲清洗试剂、噪声阻隔试剂及讯号显示剂，共十二种试剂参与反应。
于本实用新型上述实施例中，该热塑性材质系为聚丙烯(Polypropylene, PP)或聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl Methacrylate,PMMA)。
于本实用新型上述实施例中，该寡核苷酸片段系为人工合成的寡核苷酸溶液，其浓度介于10uM～200uM，序列长度介于40～60碱基，并与目标基因上所具有的特殊序列呈现互补的关系。
于本实用新型上述实施例中，该蛋白酶试剂系由蛋白酶K(Protease K)、及保存液所组成的群组。
于本实用新型上述实施例中，该RNA专用裂解试剂系由脱氧核酸酶(Deoxyribonuclease,DNase)、裂解配方、及RNA保护配方所组成的群组。
于本实用新型上述实施例中，该磁珠保存/结合试剂系由磁珠、核酸结合配方、及RNA保护配方所组成的群组。
于本实用新型上述实施例中，该RNA清洗试剂系由清洁剂、及RNA保护配方所组成的群组。
于本实用新型上述实施例中，该RNA回溶/保存试剂系为RNA保存液。
于本实用新型上述实施例中，该生物素标定试剂系由生物素标定核酸、核酸原料、核酸聚合酶、引子、及抗冻剂所组成的群组。
于本实用新型上述实施例中，该生物素免疫结合试剂系由生物素免疫抗体、磷酸酶、及抗冻剂所组成的群组。
于本实用新型上述实施例中，该杂合反应试剂系由杂合反应配方、背景抑制配方、清洁剂、及无机盐类所组成的群组。
于本实用新型上述实施例中，该缓冲清洗试剂系由清洁剂、及无机盐类所组成的群组。
于本实用新型上述实施例中，该噪声阻隔试剂系由清洁剂、及背景抑制配方所组成的群组。
于本实用新型上述实施例中，该讯号显示剂系为5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸- 氯化硝基四氮唑兰染色液(BCIP/NBT Solution)。
于本实用新型上述实施例中，该基因芯片系以β-肌动蛋白(β-actin) 与甘油醛3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GADPH)作为管家基因。
于本实用新型上述实施例中，该处理单元内建有分析软件与影像撷取模式及数据传输模式。
于本实用新型上述实施例中，该处理单元系为单芯片或可程序逻辑数组。
于本实用新型上述实施例中，该输入单元系为多数按键。
于本实用新型上述实施例中，该输出单元系为显示屏。
于本实用新型上述实施例中，该待测检体系为血液、体液、细胞培养或组织细胞。
附图说明
图1系本实用新型的基本架构方块示意图。
图2系本实用新型的方块示意图。
图中：
基因检测器1；
基因芯片感测单元11；
待测检体纯化与标定区111；
基因芯片反应与显像区112；
基因芯片反应试剂单元12；
RNA萃取组件121；
生物素标定组件122；
杂合反应组件123；
讯号侦测组件124；
温控单元13；
影像撷取单元14；
管理操作单元15；
控制器2；
处理单元21；
输入单元22；
输出单元23；
基因芯片3。
具体实施方式
请参阅图1及图2所示，分别为本实用新型的基本架构方块示意图及本实用新型的方块示意图。如图所示：本实用新型系一种高效能mRNA标记侦测试剂组结构，其包括一基因检测器1以及一控制器2所构成。
上述所提基因检测器1包含一基因芯片感测单元11、一与该基因芯片感测单元11连接的基因芯片反应试剂单元12、一与该基因芯片感测单元11 连接的温控单元13、一与该基因芯片感测单元11连接的影像撷取单元1 4、及一与该基因芯片感测单元11、该基因芯片反应试剂单元12、该温控单元13、及该影像撷取单元14连接的管理操作单元15，且由该管理操作单元15作为基因芯片感测单元11、该基因芯片反应试剂单元12、该温控单元13、及该影像撷取单元14运作时的控制。该基因芯片感测单元11设有一待测检体纯化与标定区111及一基因芯片反应与显像区112，且该基因芯片反应与显像区112中设有一基因芯片3，该基因芯片3选定一寡核苷酸片段，并以两个作为基因芯片反应质量控管依据的管家基因(Housekeeping Gene)，即β-肌动蛋白(β-actin)与甘油醛3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase,GADPH)，将此包含多种目标基因的寡核苷酸片段固着于芯片上，形成在该基因芯片3上被覆有标定特定序列者，其中该寡核苷酸片段为人工合成的寡核苷酸溶液，其浓度介于10uM～ 200uM，序列长度介于40～60碱基，并与目标基因上所具有的特殊序列呈现互补的关系。而该基因芯片反应试剂单元12提供该基因芯片3进行反应时所需的全部试剂，其由RNA萃取组件121、生物素标定组件122、杂合反应组件123及讯号侦测组件124所组成，其中该RNA萃取组件121包含蛋白酶试剂、RNA专用裂解试剂、磁珠保存/结合试剂、RNA清洗试剂及RNA回溶/ 保存试剂；该生物素标定组件122包含生物素标定试剂及生物素免疫结合试剂；该杂合反应组件123包含杂合反应试剂；以及该讯号侦测组件124包含缓冲清洗试剂、噪声阻隔试剂及讯号显示剂，共十二种试剂参与反应。
该控制器2与该基因检测器1连接，用以作为该基因检测器1运作时的控制、反应影像分析及数据显示，而该控制器2包含有一处理单元21、一与该处理单元21连接的输入单元22、及一与该处理单元21连接的输出单元2 3，其中该处理单元21可为单芯片或可程序逻辑数组，内建有分析软件与影像撷取模式及数据传输模式，该输入单元22可为多数按键，而该输出单元2 3可为显示屏。如是，籍由上述揭露的结构构成一全新的高效能mRNA标记侦测试剂组结构。
上述基因芯片3可为尼龙膜(Nylon membrane)或热塑性材质等可让核苷酸附着于其上的材料，其中该热塑性材质并可为聚丙烯(Polypropylene, PP)或聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl Methacrylate,PMMA)。该基因芯片 3将该寡核苷酸溶液以30标准升(nL)以上的量，分布于芯片基质上，并以现有规划的方式将寡核苷酸片段重复及排列，干燥后以紫外光照射固化而成。
上述RNA萃取组件121的蛋白酶试剂是由蛋白酶K(Protease K)及保存液所组成的群组；RNA专用裂解试剂是由脱氧核酸酶(Deoxyribonuclease, DNase)、裂解配方、及RNA保护配方所组成的群组，利用加入DNase以去除DNA分子的干扰；磁珠保存/结合试剂是由磁珠、核酸结合配方及RNA保护配方所组成的群组，利用加入官能基保护成分，延长试剂开封后效期；RNA清洗试剂是由清洁剂及RNA保护配方所组成的群组，以单一配方节省操作步骤，提升效率并维持效能；以及RNA回溶/保存试剂系为RNA保存液，利用加入RNA保护成分，确保标定效果。本实用新型相较传统具有更佳反应配方及RNA保护效果。
上述生物素标定组件122的生物素标定试剂系由生物素标定核酸、核酸原料、核酸聚合酶、引子、及抗冻剂所组成的群组；以及生物素免疫结合试剂系由生物素免疫抗体、磷酸酶、及抗冻剂所组成的群组。本实用新型以创新配方进行生物素标定，可不进行反转录反应，提升效率并维持效能，相较传统具有更佳标定效率及免疫结合效果。
上述杂合反应组件123的杂合反应试剂系由杂合反应配方、背景抑制配方、清洁剂、及无机盐类所组成的群组。本实用新型以创新配方缩短反应所需时间，提升效率并维持效能，相较传统具有更佳杂合反应效果，产出讯号时背景值更低。
上述讯号侦测组件124的缓冲清洗试剂系由清洁剂及无机盐类所组成的群组，以单一配方节省操作步骤，提升效率；噪声阻隔试剂系由清洁剂及背景抑制配方所组成的群组，以创新配方缩短反应所需时间，提升效率并维持效能；及讯号显示剂系为5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-氯化硝基四氮唑兰染色液 (BCIP/NBT Solution)。本实用新型相较传统具有更短反应时间，产出讯号时背景值更低，讯号不失真。
当运用时，所述基因检测器1以基因芯片感测单元11于该待测检体纯化与标定区111通过该基因芯片反应试剂单元12提供的试剂，以磁珠纯化待测检体中的mRNA，其中，该待测检体可为血液、体液、细胞培养或组织细胞等。再将此mRNA以生物素标定成探针(Probe)后传送至该基因芯片反应与显像区112中进行反应，以该基因芯片反应试剂单元12提供的试剂，且由该温控单元13对该基因芯片反应与显像区112作二阶段温控，将该探针与该基因芯片进行杂合(Hybridization)反应，再将该基因芯片上杂合后的探针加上讯号显示剂进行呈色反应(Color Development)，实现基因检测，该管理操作单元15通过该影像撷取单元14对该基因芯片反应与显像区112撷取待测检体与基因芯片所具有的探针进行杂合反应并显像后产生的影像，并根据该控制器2的操控参数控制基因检测的过程，控制该基因芯片反应试剂单元 12中各试剂的添加，以及控制该温控单元13的输出温度与温控次数。
上述控制器2通过输入单元22提供用户输入所需操控参数，并由处理单元21将此操控参数传送至该基因检测器1的管理操作单元15，以控制该基因检测器1进行基因检测的过程，同时接收该基因检测器1所撷取的影像，并根据完成后的结果可观察管家基因的表现情形以对该影像结果进行自动化分析，辅以电子化处理转换为数据，与灰阶白质呈反比，最后将分析结果由该输出单元23输出。
于一较佳实施例中，以人类全血进行，本实用新型相较传统具有下列优点：
1.RNA萃取：以血液为样本进行，利用加入DNase以降低DNA分子的干扰，可较传统获取纯度更高的RNA，且所萃取出的RNA产量更高，有效提升效能。
2.生物素标定：以RNA为模板进行标定，将传统cDNA反转录与探针标定两步骤改良合并在一步骤完成，免反转录，且为增进效能并重复一次(共进行 2次)，可较传统有效提升效率。
3.杂合反应：以生物素标定的探针与基因芯片反应，利用二阶段温控使杂合反应时间缩短(最快3小时)，具有较佳的结合力且背景值更低，较传统有效提升效率。
4.讯号侦测：将清洗反应步骤减少，仅具有三阶段清洗步骤，使杂合反应后的讯号产生，较传统有效提升效率(改良部分试剂配方更快速)。
由上述可知，本实用新型不包含PCR核酸放大技术，并将RNA反转录反应与生物素标定整合为一个步骤，再透过创新配方与重复反应达到相对应的功效。其中生物素标定试剂配方的创新处，在于包含“反转录”反应的试剂，因此无须分开两个步骤进行。而该重复反应乃指重复进行反转录级生物素标定，可加强杂合反应后的讯号。藉此，透过本实用新型提出的高效能mRNA标记侦测试剂组结构，可于临床检验检查时，不需进行放大，透过基因芯片就可以检测检体中的基因表现，具有较高的灵敏度及较佳的方便性，能达到一次满足高灵敏度及便利性的需求。
综上所述，本实用新型系一种高效能mRNA标记侦测试剂组结构，可有效改善已用的种种缺点，不包含PCR核酸放大技术，并将RNA反转录反应与生物素标定整合为一个步骤，再透过创新配方与重复反应达到可于临床检验检查时，不需进行放大，透过基因芯片就可以检测检体中的基因表现，具有较高的灵敏度及较佳的方便性，能够一次满足高灵敏度及便利性的需求，进而使本实用新型的产生能更进步、更实用、更符合使用者的所须，确已符合新型专利申请的要件，爰依法提出专利申请。
但以上所述，仅为本实用新型的较佳实施例而已，当不能以此限定本实用新型实施范围；故，凡依本实用新型权利要求书及说明书内容所作的简单等效变化与修饰，皆应仍属本实用新型专利涵盖范围内。
Claims (7)
1.一种高效能mRNA标记侦测试剂组结构，包括一基因检测器和一控制器，所述基因检测器包含一管理操作单元，所述控制器包含有一由可程序逻辑数组组成的处理单元、一与该处理单元连接的输入单元、及一与该处理单元连接的输出单元，所述处理单元与所述管理操作单元连接，其特征在于，
所述基因检测器还包含：
一基因芯片感测单元，其设有一待测检体纯化与标定区及一基因芯片反应与显像区，该基因芯片反应与显像区中设有一基因芯片，该基因芯片由热塑性材质制成，且该基因芯片上分布有一与目标基因上的特殊序列呈现互补关系的寡核苷酸片段；
一用于提供所述基因芯片反应时所需试剂的基因芯片反应试剂单元，与该基因芯片感测单元连接，该基因芯片反应试剂单元由RNA萃取组件、生物素标定组件、杂合反应组件及讯号侦测组件所组成；
一用于对所述基因芯片反应与显像区进行二阶段温控的温控单元，与该基因芯片感测单元连接；
一用于所述基因芯片反应与显像区影像的影像撷取单元，与该基因芯片感测单元连接；
所述管理操作单元，与该基因芯片感测单元、该基因芯片反应试剂单元、该温控单元及该影像撷取单元连接；所述控制器的处理单元与该基因检测器的管理操作单元连接，以通过处理单元将操控参数传送至所述管理操作单元，通过管理操作单元控制所述基因检测器的基因检测过程，同时接收基因检测器撷取的影像。
2.根据权利要求1所述的高效能mRNA标记侦测试剂组结构，其特征在于，该热塑性材质为聚丙烯或聚甲基丙烯酸甲酯。
3.根据权利要求1所述的高效能mRNA标记侦测试剂组结构，其特征在于，该寡核苷酸片段为人工合成的寡核苷酸溶液，其浓度介于10uM～200uM，序列长度介于40～60碱基。
4.根据权利要求1所述的高效能mRNA标记侦测试剂组结构，其特征在于，该基因芯片以β-肌动蛋白与甘油醛3-磷酸脱氢酶作为管家基因。
5.根据权利要求1所述的高效能mRNA标记侦测试剂组结构，其特征在于，该输入单元为多数按键。
6.根据权利要求1所述的高效能mRNA标记侦测试剂组结构，其特征在于，该输出单元为显示屏。
7.根据权利要求1所述的高效能mRNA标记侦测试剂组结构，其特征在于，该待测检体为血液、体液、细胞培养或组织细胞。
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