TWI732827B - 高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法 - Google Patents

高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法 Download PDF

Info

Publication number
TWI732827B
TWI732827B TW106106454A TW106106454A TWI732827B TW I732827 B TWI732827 B TW I732827B TW 106106454 A TW106106454 A TW 106106454A TW 106106454 A TW106106454 A TW 106106454A TW I732827 B TWI732827 B TW I732827B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
reaction
reagent
gene chip
rna
solution
Prior art date
Application number
TW106106454A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201831693A (zh
Inventor
林綉茹
楊智凱
吳昌翰
林維純
Original Assignee
大陸商蘇州翊準基因科技有限公司
康雋國際生物科技股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大陸商蘇州翊準基因科技有限公司, 康雋國際生物科技股份有限公司 filed Critical 大陸商蘇州翊準基因科技有限公司
Priority to TW106106454A priority Critical patent/TWI732827B/zh
Priority to CN201810144169.2A priority patent/CN108562575A/zh
Publication of TW201831693A publication Critical patent/TW201831693A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI732827B publication Critical patent/TWI732827B/zh

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)

Abstract

一種高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法，係以十二種試劑參與基因晶片反應流程，其至少包括RNA萃取、生物素標定、雜合反應、以及訊號偵測等步驟。本發明不包含PCR核酸放大技術，並將RNA反轉錄反應與生物素標定整合為一個步驟，再透過創新配方與重複反應達到相對應之功效。其中生物素標定試劑配方的創新處，在於合併「反轉錄」與「生物素標定」兩反應為一的試劑，因此無須分開兩個步驟進行。而該重複反應乃指重複進行反轉錄級生物素標定，可加強雜合反應後之訊號。藉此，透過本發明提出之高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法，可於臨床檢驗檢查時，不需進行放大，透過基因晶片就可以檢測檢體中所之基因表現，具有較高之靈敏度及較佳之方便性，能達到一次滿足高靈敏度及便利性之需求。

Description

高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法
本發明係有關於一種高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法，尤指涉及一種不包含PCR核酸放大技術，並將RNA反轉錄反應與生物素標定整合為一個步驟，特別係指再透過創新配方與重複反應達到相對應之功效者。
對基因過渡表現(Overexpression)之分析已經導致疾病診斷之基本進步與臨床進展。而研究基因過渡表現之技術係包含有北方墨點法(Northern Blot)、反轉錄聚合酶鏈鎖反應(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)及即時定量聚合酶鏈鎖反應(Real-Time PCR)。其中Northern Blot由於操作步驟十分繁瑣，所需檢體量又過多，因此僅限於研究操作上，無法實際應用於臨床診斷。至於RT-PCR及Real-Time PCR由於操作步驟簡便，因此在單一基因檢測之應用上，使用相當廣泛，例如肝炎病毒之檢測及感染症病原菌之鑑定。然而，雖然PCR序列之創作係作為整體最偉大之實驗，但多數PCR技術仍保有特定之共同問題，其主要問題包含有：首先為汙染，過渡靈敏偵察之偽陽性，例如霧式之DNA或先前之樣品殘餘；其次，為RT-PCR僅被認為半定量，因為當比較不同之樣品時，難以控制序列放大之效率；再者，係由於所需引子(Primer)間黏合(Annearling)之干擾，無論RT-PCR或Real-Time PCR都僅廣泛應用於單一基因標的之檢測，當檢測標的為基因群時，則PCR相關之技術則有操作耗時、 費事及高成本等缺點。
隨著近幾年來生物科技之快速發展，生物晶片於臨床醫學診斷或藥效評估上之應用逐漸被重視，本發明之先前研究已開發並且評估一尼龍膜晶片(Membrane Array)方法，能使用於癌症診斷，在血液檢體(Peripheral Blood)中同時查出一多種mRNA標記引物之表現。其分子標誌之表現由RT-PCR與尼龍膜晶片評估，數據從RT-PCR與尼龍膜晶片取得，且受制於線性迴歸分析，顯示在這兩個方法結果之間的高度相互關係(r=0.979，P<0.0001)。另外，以相關衍生技術之加權化學冷光型基因晶片(Weighted Chemiluminescent Membrane Array,WCHMA)，用於肺癌(Lung Cancer)患者之血液檢體分析標的治療藥物(Target Therapeutic Drug)之作用標的K-ras之異常情形，也已被接受刊登於肺癌期刊中。
雖然尼龍膜晶片於分子診斷及藥效評估上之應用已有許多報告提出，然而，由於原始尼龍膜晶片所使用判讀方法上，對於每一基因在特定疾病之重要性皆等值之概念下，造成檢測特異性在達到一定程度之後便不易提升。對此，本發明另外研究開發一基因群檢測結構，雖可大量並快速進行生物檢體檢測分析，惟其檢測過程需要先行放大，並無法達到直接從血液檢測透過基因晶片就能偵測血液裡之基因表現，導致在晶片檢測靈敏度及方便性等方面之要求仍嫌不足。於是，本發明申請人再研究開發一酵素型基因晶片偵測試劑組結構，雖然不需進行放大，即可達到直接從血液檢測透過基因晶片就能偵測血液裡之基因表現，惟此先前技術包含RNA萃取、cDNA合成、探針標誌、雜交反應、以及訊號偵測等繁複的操作步驟，且其雜交反應僅一階段溫控，所耗反應時間長(需至少6.4小時以上)；因此，整體而言，該先前 技術造成偵測所需時間冗長及耗費大量溶劑清洗(六階段清洗步驟)，導致成本增加且降低效率與效能之餘，其產出訊號時背景值亦較高，更有訊號易失真等問題。故，一般習用者係無法符合使用者於實際使用時之所需。
本發明之主要目的係在於，克服習知技藝所遭遇之上述問題並提供一種不包含PCR核酸放大技術，並將RNA反轉錄反應與生物素標定整合為一個步驟，再透過創新配方與重複反應達到可於臨床檢驗檢查時，不需進行放大，透過基因晶片就可以檢測檢體中所之基因表現，具有較高之靈敏度及較佳之方便性，能夠一次滿足高靈敏度及便利性等需求之高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法。
為達以上之目的，本發明係一種高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法，係以十二種試劑參與基因晶片反應流程，其至少包括下列步驟：RNA萃取步驟：於一基因晶片感測單元之待測檢體純化與標定區中，利用一基因晶片反應試劑單元中RNA萃取元件所包含蛋白酶試劑、RNA專用裂解試劑、磁珠保存/結合試劑、RNA清洗試劑及RNA回溶/保存試劑，對一待測檢體進行RNA萃取反應，將該待測檢體與由蛋白酶K(Protease K)、及保存液所組成之蛋白酶試劑及由去氧核酸酶(Deoxyribonuclease,DNase)、裂解配方、及RNA保護配方所組成之RNA專用裂解試劑均勻地混合反應後，加入由磁珠、核酸結合配方、及RNA保護配方所組成之磁珠保存/結合試劑均勻地混合反應後，以磁鐵固定磁珠去除反應溶液，加入由清潔劑、及RNA保護配方所組成之RNA清洗試劑混合均勻，再以磁鐵固定磁珠去除反應溶液，並加入作為RNA回溶/保存試劑之RNA保存液均勻地混合反應後，以磁鐵固 定磁珠，收集所得之mRNA溶液；生物素標定步驟：利用該基因晶片反應試劑單元中生物素標定元件所包含生物素標定試劑及生物素免疫結合試劑，對上述mRNA溶液進行生物素標定，將該mRNA溶液加入由生物素標定核酸、核酸原料、核酸聚合酶、引子、及抗凍劑所組成之生物素標定試劑均勻地混合反應後，再加入由生物素免疫抗體、磷酸酶、及抗凍劑所組成之生物素免疫結合試劑均勻地混合反應後，取得以生物素標定之探針(Probe)；雜合反應步驟：將一基因晶片置入該基因晶片感測單元之基因晶片反應與顯像區中，利用該基因晶片反應試劑單元中雜合反應元件所包含雜合反應試劑，偕同上述探針對該基因晶片進行雜合反應，將該基因晶片加入由雜合反應配方、背景抑制配方、清潔劑、及無機鹽類所組成之雜合反應試劑均勻地混合反應後，再加入該探針反應3~4小時，經過一溫控單元對該基因晶片作二階段溫控，將該探針與該基因晶片進行雜合(Hybridization)反應，取得雜合溶液，其中，該基因晶片係選定一寡核苷酸片段，並以兩個作為基因晶片反應品質控管依據之管家基因(Housekeeping Gene)，將此包含多種目標基因之寡核苷酸片段固著於熱塑性材質的晶片上，形成在該基因晶片上被覆有標定特定序列者，而該寡核苷酸片段係為人工合成之寡核苷酸溶液，其濃度介於10μM~200μM，序列長度介於40~60鹼基，並與目標基因上所具有之特殊序列呈現互補之關係，該基因晶片係將該寡核苷酸溶液以30標準升(nL)以上之量，分布於晶片基質上，將寡核苷酸片段重複及排列，乾燥後以紫外光照射固化而成；以及訊號偵測步驟：將上述雜合溶液移除，留下該基因晶片於該基因晶片反應與顯像區中，利用該基因晶片反應試劑單元中訊號偵測元件所包含緩衝清洗試劑、雜訊阻隔試劑及訊號顯示劑，對 上述移除雜合溶液之基因晶片進行呈色反應(Color Development)，將該基因晶片上雜合後之探針加入由清潔劑、及無機鹽類所組成之緩衝清洗試劑，於反應後移除，加入由清潔劑、及背景抑制配方所組成之雜訊阻隔試劑，於反應後移除，再加入該訊號顯示劑，反應直到訊號產生，之後加入水清洗，直到訊號停止繼續產生，於烘乾後即得到偵測結果。
於本發明上述實施例中，該熱塑性材質係為聚丙烯(Polypropylene,PP)或聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl Methacrylate,PMMA)。
於本發明上述實施例中，該訊號顯示劑係為5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-氯化硝基四氮唑蘭染色液(BCIP/NBT Solution)。
於本發明上述實施例中，該基因晶片係以β-肌動蛋白(β-actin)與甘油醛3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GADPH)作為管家基因
於本發明上述實施例中，該待測檢體係為血液、體液、細胞培養或組織細胞。
1:基因檢測器
11:基因晶片感測單元
111:待測檢體純化與標定區
112:基因晶片反應與顯像區
12:基因晶片反應試劑單元
121:RNA萃取元件
122:生物素標定元件
123:雜合反應元件
124:訊號偵測元件
13:溫控單元
14:影像擷取單元
15:管理操作單元
2:控制器
21:處理單元
22:輸入單元
23:輸出單元
3:基因晶片
s11~s14:步驟
第1圖，係本發明之偵測流程示意圖。
第2圖，係本發明之基本架構方塊示意圖。
第3圖，係本發明之方塊示意圖。
請參閱『第1圖~第3圖』所示，係分別為本發明之偵測流程示意圖、本發明之基本架構方塊示意圖、及本發明之方塊示意圖。如圖所示：本發明係一種高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法，所提偵測方 法適用於一高效能mRNA標記偵測試劑組結構，其包括一基因檢測器1以及一控制器2所構成。
上述所提基因檢測器1係包含一基因晶片感測單元11、一與該基因晶片感測單元11連接之基因晶片反應試劑單元12、一與該基因晶片感測單元11連接之溫控單元13、一與該基因晶片感測單元11連接之影像擷取單元14、及一與該基因晶片感測單元11、該基因晶片反應試劑單元12、該溫控單元13、及該影像擷取單元14連接之管理操作單元15，且由該管理操作單元15作為各單元11~14運作時之控制。該基因晶片感測單元11係設有一待測檢體純化與標定區111及一基因晶片反應與顯像區112，而該基因晶片反應試劑單元12係提供進行反應時所需之全部試劑，其係由RNA萃取元件121、生物素標定元件122、雜合反應元件123及訊號偵測元件124所組成，其中該RNA萃取元件121包含蛋白酶試劑、RNA專用裂解試劑、磁珠保存/結合試劑、RNA清洗試劑及RNA回溶/保存試劑；該生物素標定元件122包含生物素標定試劑及生物素免疫結合試劑；該雜合反應元件123包含雜合反應試劑；以及該訊號偵測元件124包含緩衝清洗試劑、雜訊阻隔試劑及訊號顯示劑，共十二種試劑參與反應。
該控制器2係與該基因檢測器1連接，用以作為該基因檢測器1運作時之控制、反應影像分析及數據顯示，而該控制器2係包含有一處理單元21、一與該處理單元21連接之輸入單元22、及一與該處理單元21連接之輸出單元23，其中該處理單元21係可為單晶片或可程式邏輯陣列，內建有分析軟體與影像擷取模式及資料傳輸模式，該輸入單元22係可為多數按鍵，而該輸出單元23係可為顯示幕。 上述RNA萃取元件121之蛋白酶試劑係由蛋白酶K(Protease K)、及保存液所組成之群組；RNA專用裂解試劑係由去氧核酸酶(Deoxyribonuclease,DNase)、裂解配方、及RNA保護配方所組成之群組，利用加入DNase以去除DNA分子之干擾；磁珠保存/結合試劑係由磁珠、核酸結合配方、及RNA保護配方所組成之群組，利用加入官能基保護成份，延長試劑開封後效期；RNA清洗試劑係由清潔劑、及RNA保護配方所組成之群組，以單一配方節省操作步驟，提升效率並維持效能；以及RNA回溶/保存試劑係為RNA保存液，利用加入RNA保護成份，確保標定效果。本發明相較傳統具有更佳反應配方及RNA保護效果。
上述生物素標定元件122之生物素標定試劑係由生物素標定核酸、核酸原料、核酸聚合酶、引子、及抗凍劑所組成之群組；以及生物素免疫結合試劑係由生物素免疫抗體、磷酸酶、及抗凍劑所組成之群組。本發明以創新配方進行生物素標定，可不進行反轉錄反應，提升效率並維持效能，相較傳統具有更佳標定效率及免疫結合效果。
上述雜合反應元件123之雜合反應試劑係由雜合反應配方、背景抑制配方、清潔劑、及無機鹽類所組成之群組。本發明以創新配方縮短反應所需時間，提升效率並維持效能，相較傳統具有更佳雜合反應效果，產出訊號時背景值更低。
上述訊號偵測元件124之緩衝清洗試劑係由清潔劑、及無機鹽類所組成之群組，以單一配方節省操作步驟，提升效率；雜訊阻隔試劑係由清潔劑、及背景抑制配方所組成之群組，以創新配方縮短反應所需時間，提升效率並維持效能；及訊號顯示劑係為5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-氯化硝基四氮唑蘭染色液(BCIP/NBT Solution)。本發明相較傳統 具有更短反應時間，產出訊號時背景值更低，訊號不失真。
本發明以上述結構進行高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法，其至少包含下列步驟：
RNA萃取步驟s11：於上述基因晶片感測單元11之待測檢體純化與標定區111中，利用上述基因晶片反應試劑單元12中RNA萃取元件121對一待測檢體進行RNA萃取反應，將該待測檢體與由蛋白酶K(Protease K)、及保存液所組成之蛋白酶試劑及由去氧核酸酶(Deoxyribonuclease,DNase)、裂解配方、及RNA保護配方所組成之RNA專用裂解試劑均勻地混合反應後，加入由磁珠、核酸結合配方、及RNA保護配方所組成之磁珠保存/結合試劑均勻地混合反應後，以磁鐵固定磁珠去除反應溶液，加入由清潔劑、及RNA保護配方所組成之RNA清洗試劑混合均勻，再以磁鐵固定磁珠去除反應溶液，並加入作為RNA回溶/保存試劑之RNA保存液均勻地混合反應後，以磁鐵固定磁珠，收集所得之mRNA溶液。
生物素標定步驟s12：利用該基因晶片反應試劑單元12中生物素標定元件122對上述mRNA溶液進行生物素標定，將該mRNA溶液加入由生物素標定核酸、核酸原料、核酸聚合酶、引子、及抗凍劑所組成之生物素標定試劑均勻地混合反應後，再加入由生物素免疫抗體、磷酸酶、及抗凍劑所組成之生物素免疫結合試劑均勻地混合反應後，取得以生物素標定之探針(Probe)。
雜合反應步驟s13：將一基因晶片3置入上述基因晶片感測單元11之基因晶片反應與顯像區112中，利用該基因晶片反應試劑單元12中雜合反應元件123與上述探針對該基因晶片3進行雜合反應，將該基因晶片3加入由雜合反應配方、背景抑制配方、清潔劑、 及無機鹽類所組成之雜合反應試劑均勻地混合反應後，再加入該探針反應3~4小時，經過一溫控單元對該基因晶片作二階段溫控，將該探針與該基因晶片進行雜合(Hybridization)反應，取得雜合溶液，其中，該基因晶片係選定一寡核苷酸片段，並以兩個作為基因晶片反應品質控管依據之管家基因(Housekeeping Gene)，即β-肌動蛋白(β-actin)與甘油醛3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GADPH)，將此包含多種目標基因之寡核苷酸片段固著於熱塑性材質的晶片上，形成在該基因晶片3上被覆有標定特定序列者，而該寡核苷酸片段係為人工合成之寡核苷酸溶液，其濃度介於10μM~200μM，序列長度介於40~60鹼基，並與目標基因上所具有之特殊序列呈現互補之關係。該基因晶片3係可為尼龍膜(Nylon membrane)或熱塑性材質等可讓核苷酸附著於其上之材料，且該熱塑性材質並可為聚丙烯(Polypropylene,PP)或聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl Methacrylate,PMMA)。該基因晶片3係將該寡核苷酸溶液以30標準升(nL)以上之量，分布於晶片基質上，將寡核苷酸片段重複及排列，乾燥後以紫外光照射固化而成。
訊號偵測步驟s14：將上述雜合溶液移除，留下該基因晶片3於該基因晶片反應與顯像區112中，利用該基因晶片反應試劑單元12中訊號偵測元件124對上述移除雜合溶液之基因晶片3進行呈色反應(Color Development)，將該基因晶片3上雜合後之探針加入由清潔劑、及無機鹽類所組成之緩衝清洗試劑，於反應後移除，加入由清潔劑、及背景抑制配方所組成之雜訊阻隔試劑，於反應後移除，再加入該訊號顯示劑，反應直到訊號產生，之後加入水清洗，直到訊號停止繼續產生，於烘乾後即得到偵測結果。如是，藉由上述揭露之 流程構成一全新之高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法。
當運用時，所述基因檢測器1以基因晶片感測單元11於該待測檢體純化與標定區111通過該基因晶片反應試劑單元12提供之試劑，以磁珠純化待測檢體中之mRNA，其中，該待測檢體係可為血液、體液、細胞培養或組織細胞等。再將此mRNA以生物素標定成探針後傳送至該基因晶片反應與顯像區112中進行反應，以該基因晶片反應試劑單元12提供之試劑，且由該溫控單元13對該基因晶片反應與顯像區112作二階段溫控，將該探針與該基因晶片進行雜合(Hybridization)反應，再將該基因晶片上雜合後之探針加上訊號顯示劑進行呈色反應(Color Development)，實現基因檢測，該管理操作單元15通過該影像擷取單元14對該基因晶片反應與顯像區112擷取待測檢體與基因晶片所具有之探針進行雜合反應並顯像後產生之影像，並根據該控制器2之操控參數控制基因檢測之過程，控制該基因晶片反應試劑單元12中各試劑之添加，以及控制該溫控單元13之輸出溫度與溫控次數。
上述控制器2通過輸入單元22提供使用者輸入所需操控參數，並由處理單元21將此操控參數傳送至該基因檢測器1之管理操作單元15，以控制該基因檢測器1進行基因檢測之過程，同時接收該基因檢測器1所擷取之影像，並根據完成後之結果可觀察管家基因之表現情形以對該影像結果進行自動化分析，輔以電子化處理轉換為數據，與灰階白質呈反比，最後將分析結果由該輸出單元23輸出。
於一較佳實施例中，以人類全血進行本發明相較傳統具有下列優點：
1.RNA萃取：以血液為樣本進行，利用加入DNase以降低DNA分子的干擾，可較傳統獲取純度更高之RNA，且所萃取出之RNA產量更高， 有效提升效能。
2.生物素標定：以RNA為模板進行標定，將傳統cDNA反轉錄與探針標定兩步驟改良合併在一步驟完成，免反轉錄，且為增進效能並重複一次(共進行2次)，可較傳統有效提升效率。
3.雜合反應：以生物素標定之探針與基因晶片反應，利用二階段溫控使雜合反應時間縮短(最快3小時)，具有較佳之結合力且背景值更低，較傳統有效提升效率。
4.訊號偵測：將清洗反應步驟減少，僅具有三階段清洗步驟，使雜合反應後之訊號產生，較傳統有效提升效率(改良部分試劑配方更快速)。
由上述可知，本發明不包含PCR核酸放大技術，並將RNA反轉錄反應與生物素標定整合為一個步驟，再透過創新配方與重複反應達到相對應之功效。其中生物素標定試劑配方的創新處，在於合併「反轉錄」與「生物素標定」兩反應為一的試劑，因此無須分開兩個步驟進行。而該重複反應乃指重複進行反轉錄級生物素標定，可加強雜合反應後之訊號。藉此，透過本發明提出之高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法，可於臨床檢驗檢查時，不需進行放大，透過基因晶片就可以檢測檢體中所之基因表現，具有較高之靈敏度及較佳之方便性，能達到一次滿足高靈敏度及便利性之需求。
綜上所述，本發明係一種高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法，可有效改善習用之種種缺點，不包含PCR核酸放大技術，並將RNA反轉錄反應與生物素標定整合為一個步驟，再透過創新配方與重複反應達到可於臨床檢驗檢查時，不需進行放大，透過基因晶片就可以檢測檢體中所之基因表現，具有較高之靈敏度及較佳之方便性，能夠一次 滿足高靈敏度及便利性之需求，進而使本發明之產生能更進步、更實用、更符合使用者之所須，確已符合發明專利申請之要件，爰依法提出專利申請。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
s11~s14:步驟

Claims (5)

  1. 一種高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法，係以十二種試劑參與基因晶片反應流程，其至少包括下列步驟：RNA萃取步驟：於一基因晶片感測單元之待測檢體純化與標定區中，利用一基因晶片反應試劑單元中RNA萃取元件所包含蛋白酶試劑、RNA專用裂解試劑、磁珠保存/結合試劑、RNA清洗試劑及RNA回溶/保存試劑，對一待測檢體進行RNA萃取反應，將該待測檢體與由蛋白酶K(Protease K)、及保存液所組成之蛋白酶試劑及由去氧核酸酶(Deoxyribonuclease,DNase)、裂解配方、及RNA保護配方所組成之RNA專用裂解試劑均勻地混合反應後，加入由磁珠、核酸結合配方、及RNA保護配方所組成之磁珠保存/結合試劑均勻地混合反應後，以磁鐵固定磁珠去除反應溶液，加入由清潔劑、及RNA保護配方所組成之RNA清洗試劑混合均勻，再以磁鐵固定磁珠去除反應溶液，並加入作為RNA回溶/保存試劑之RNA保存液均勻地混合反應後，以磁鐵固定磁珠，收集所得之mRNA溶液；生物素標定步驟：利用該基因晶片反應試劑單元中生物素標定元件所包含生物素標定試劑及生物素免疫結合試劑，對上述mRNA溶液進行生物素標定，將該mRNA溶液加入由生物素標定核酸、核酸原料、核酸聚合酶、引子、及抗凍劑所組成之生物素標定試劑均勻地混合反應後，再加入由生物素免疫抗體、磷酸酶、及抗凍劑所組成之生物素免疫結合試劑均勻地混合反應後，取得以生物素標定之探針(Probe)；雜合反應步驟：將一基因晶片置入該基因晶片感測單元之基 因晶片反應與顯像區中，利用該基因晶片反應試劑單元中雜合反應元件所包含雜合反應試劑，偕同上述探針對該基因晶片進行雜合反應，將該基因晶片加入由雜合反應配方、背景抑制配方、清潔劑、及無機鹽類所組成之雜合反應試劑均勻地混合反應後，再加入該探針反應3~4小時，經過一溫控單元對該基因晶片作二階段溫控，將該探針與該基因晶片進行雜合(Hybridization)反應，取得雜合溶液，其中，該基因晶片係選定一寡核苷酸片段，並以兩個作為基因晶片反應品質控管依據之管家基因(Housekeeping Gene)，將此包含多種目標基因之寡核苷酸片段固著於熱塑性材質的晶片上，形成在該基因晶片上被覆有標定特定序列者，而該寡核苷酸片段係為人工合成之寡核苷酸溶液，其濃度介於10μM~200μM，序列長度介於40~60鹼基，並與目標基因上所具有之特殊序列呈現互補之關係，該基因晶片係將該寡核苷酸溶液以30標準升(nL)以上之量，分布於晶片基質上，將寡核苷酸片段重複及排列，乾燥後以紫外光照射固化而成；以及訊號偵測步驟：將上述雜合溶液移除，留下該基因晶片於該基因晶片反應與顯像區中，利用該基因晶片反應試劑單元中訊號偵測元件所包含緩衝清洗試劑、雜訊阻隔試劑及訊號顯示劑，對上述移除雜合溶液之基因晶片進行呈色反應(Color Development)，將該基因晶片上雜合後之探針加入由清潔劑、及無機鹽類所組成之緩衝清洗試劑，於反應後移除，加入由清潔劑、及背景抑制配方所組成之雜訊阻隔試劑，於反應後移除，再加入該訊號顯示劑，反應直到訊號產生，之後加入水清洗，直到訊號停止繼續產生，於烘乾後即得到偵測結果。
  2. 依申請專利範圍第1項所述之高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法，其中，該熱塑性材質係為聚丙烯(Polypropylene,PP)或聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl Methacrylate,PMMA)。
  3. 依申請專利範圍第1項所述之高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法，其中，該訊號顯示劑係為5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-氯化硝基四氮唑蘭染色液(BCIP/NBT Solution)。
  4. 依申請專利範圍第1項所述之高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法，其中，該基因晶片係以β-肌動蛋白(β-actin)與甘油醛3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GADPH)作為管家基因。
  5. 依申請專利範圍第1項所述之高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法，其中，該待測檢體係為血液、體液、細胞培養或組織細胞。
TW106106454A 2017-02-24 2017-02-24 高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法 TWI732827B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW106106454A TWI732827B (zh) 2017-02-24 2017-02-24 高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法
CN201810144169.2A CN108562575A (zh) 2017-02-24 2018-02-12 高效能mRNA标记侦测试剂组的侦测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW106106454A TWI732827B (zh) 2017-02-24 2017-02-24 高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201831693A TW201831693A (zh) 2018-09-01
TWI732827B true TWI732827B (zh) 2021-07-11

Family

ID=63532405

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW106106454A TWI732827B (zh) 2017-02-24 2017-02-24 高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN108562575A (zh)
TW (1) TWI732827B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11555871B2 (en) 2019-12-31 2023-01-17 Industrial Technology Research Institute Method of detecting biological sample
CN112608980A (zh) * 2020-12-31 2021-04-06 许嘉欣 一种检测食品中冠状病毒的基因芯片制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI402502B (zh) * 2010-05-13 2013-07-21 Fooyin University Hospital Genome detection system
TWI509074B (zh) * 2012-11-28 2015-11-21 Fooyin University Hospital Enzyme Gene Chip Detection Reagent and Its Detection

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI402502B (zh) * 2010-05-13 2013-07-21 Fooyin University Hospital Genome detection system
TWI509074B (zh) * 2012-11-28 2015-11-21 Fooyin University Hospital Enzyme Gene Chip Detection Reagent and Its Detection

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Hsiung SK et al,"A Novel Technique for Detecting the Therapeutic Target, KRAS Mutant, From Peripheral Blood Using the Automatic Chipball Device With Weighted Enzymatic Chip Array", Fooyin Journal of Health Sciences, Vol.1, No.2, Pages 72-80, 2009/11
Hsiung SK et al,"Clinical application of automatic gene chip analyzer (WEnCA-Chipball) for mutant KRAS detection in peripheral circulating tumor cells of cancer patients", Biomedical Engineering Trends, Research and Technologies, p.151-168, 2011
Hsiung SK et al,"Clinical application of automatic gene chip analyzer (WEnCA-Chipball) for mutant KRAS detection in peripheral circulating tumor cells of cancer patients", Biomedical Engineering Trends, Research and Technologies, p.151-168, 2011 Hsiung SK et al,"A Novel Technique for Detecting the Therapeutic Target, KRAS Mutant, From Peripheral Blood Using the Automatic Chipball Device With Weighted Enzymatic Chip Array", Fooyin Journal of Health Sciences, Vol.1, No.2, Pages 72-80, 2009/11 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108562575A (zh) 2018-09-21
TW201831693A (zh) 2018-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9315858B2 (en) Apparatus for point-of-care detection of nucleic acid in a sample
Boonham et al. Exploiting generic platform technologies for the detection and identification of plant pathogens
CN102344961B (zh) 一种经济的应用大规模平行测序技术检验多目标多基因的方法
CN107849607A (zh) 血浆dna的单分子测序
JP4435259B2 (ja) 微量胃癌細胞の検出法
CN104254617A (zh) 通过单分子杂交和操作进行的dna检测和定量的方法
TW201420767A (zh) 酵素型基因晶片偵測試劑組及其偵測法
CN101497928B (zh) 鉴定ggⅰ组诺如病毒和ggⅱ组诺如病毒的方法及专用试剂盒
TWI732827B (zh) 高效能mRNA標記偵測試劑組之偵測方法
TWI495727B (zh) 微型電化學多重即時定量聚合酶連鎖反應(ｐｃｒ)系統
CN103276099A (zh) 用于荧光定量pcr检测幽门螺杆菌的引物和试剂盒
JP2006223303A (ja) 微量胃癌細胞の検出法
CN212111148U (zh) 高效能mRNA标记侦测试剂组结构
US8178343B2 (en) Gene cluster diagnosis apparatus
CN106414775A (zh) 用于宏基因组生物标志检测的组合物和方法
Paul et al. Rapid extraction of plant nucleic acids by microneedle patch for in-field detection of plant pathogens
WO2021039777A1 (ja) 関節リウマチを検査する方法
KR20180081445A (ko) 핵산의 신속 검출법 및 이를 이용한 질병의 신속 진단 방법
EP4271811A1 (en) High-spatial-resolution epigenomic profiling
CN111321220A (zh) 用于检测直肠癌放化疗敏感性的组合物、微阵列和计算机系统
Kaoud Hussein Advanced technology for the diagnosis of fish diseases
CN114836581B (zh) 用于检测消化道感染性疾病病原体的引物组合
Pei et al. Chromatin Immunoprecipitation Sequencing (ChIP-seq) Protocol for Small Amounts of Frozen Biobanked Cardiac Tissue
Lan et al. Strategic research on the molecular diagnostics industry in China
JP2023020631A (ja) 全身性エリテマトーデスを検査する方法