TW201420767A - 酵素型基因晶片偵測試劑組及其偵測法 - Google Patents
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Abstract
一種酵素型基因晶片偵測試劑組及其偵測法，該酵素型基因晶片偵測試劑組包含一基因晶片，其上含有兩個管家基因，可作為基因晶片反應品質控管之依據，以及一組基因晶片反應試劑，其係提供基因晶片反應流程所需之全部試劑。該基因晶片反應流程分為RNA萃取、cDNA合成、探針標誌、雜交反應及訊號偵測等五個步驟，而該基因晶片反應試劑共需十七種試劑參與反應，並根據完成後之結果可觀察管家基因之表現情形。藉此，透過本發明提出之酵素型基因晶片偵測試劑組及其偵測法，可於臨床檢驗檢查時，不需進行放大，直接從血液檢測，透過基因晶片就可以檢測血液裡之基因表現，具有較高之靈敏度及較佳之方便性，能達到一次滿足高靈敏度及便利性之需求。
Description
本發明係有關於一種酵素型基因晶片偵測試劑組及其偵測法，尤指涉及一種以十七種試劑參與基因晶片反應流程，特別係指可於臨床檢驗檢查時，不需進行放大，直接從血液檢測，透過基因晶片就可以檢測血液裡之基因表現之酵素型基因晶片偵測試劑組及其偵測法。
對基因過渡表現（Overexpression）之分析已經導致疾病診斷之基本進步與臨床進展。而研究基因過渡表現之技術係包含有北方墨點法（Northern Blot）、反轉錄聚合酶鏈鎖反應（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）及即時定量聚合酶鏈鎖反應（Real-Time PCR）。其中Northern Blot由於操作步驟十分敏瑣，所需檢體量又過多，因此僅限於研究操作上，無法實際應用於臨床診斷。至於RT-PCR及Real-Time PCR由於操作步驟簡便，因此在單一基因檢測之應用上，使用相當廣泛，例如肝炎病毒之檢測及感染症病原菌之鑑定。然而，雖然PCR序列之創作係作為整體最偉大之實驗，但多數PCR技術仍保有特定之共同問題，其主要問題包含有：其一係汙染，過渡靈敏偵察之偽陽性，例如霧式之DNA或先前之樣品殘餘；其二係RT-PCR僅被認為半定量，因為當比較不同之樣品時，難以控制序列放大之效率；以及其三係由於所需引子（Primer）間黏合（Annearling）之干擾，無論RT-PCR或Real-Time PCR都僅廣泛應用於單一基因標的之檢測，當檢測標的為基因群時，則PCR相關之技術則有操作耗時、費事及高成本等缺點。
隨著近幾年來生物科技之快速發展，生物晶片於臨床醫學診斷或藥效評估上之應用逐漸被重視，本發明之先前研究已開發並且評估一尼龍膜晶片（Membrane Array）方法，能使用於癌症診斷，在血液檢體（Peripheral Blood）中同時查出一多種mRNA標記引物之表達水準。其分子標誌之表達水準由RT-PCR與尼龍膜晶片評估，數據從RT-PCR與尼龍膜晶片取得，且受制於線性迴歸分析，顯示在這兩個方法結果之間之高度相互關係（r=0.979，P<0.0001）。另外，以相關衍生技術之加權化學冷光型基因晶片（Weighted Chemiluminescent Membrane Array, WCHMA）用於肺癌（Lung Cancer）患者之血液檢體分析標的治療藥物（Target Therapeutic Drug）之作用標的K-ras之異常情形，也已被接受刊登於肺癌期刊中。
雖然尼龍膜晶片於分子診斷及藥效評估上之應用已有許多報告提出，然而，由於原始尼龍膜晶片所使用判讀方法上，對於每一基因在特定疾病之重要性皆等值之概念下，造成檢測特異性在達到一定程度之後便不易提升。對此，本發明另外研究開發一基因群檢測結構，雖可大量並快速進行生物檢體檢測分析，惟其檢測過程需先行放大，並無法達到直接從血液檢測透過基因晶片就能偵測血液裡之基因表現，導致在晶片檢測靈敏度及方便性等方面之要求仍嫌不足；故，ㄧ般習用者係無法符合使用者於實際使用時之所需。
隨著近幾年來生物科技之快速發展，生物晶片於臨床醫學診斷或藥效評估上之應用逐漸被重視，本發明之先前研究已開發並且評估一尼龍膜晶片（Membrane Array）方法，能使用於癌症診斷，在血液檢體（Peripheral Blood）中同時查出一多種mRNA標記引物之表達水準。其分子標誌之表達水準由RT-PCR與尼龍膜晶片評估，數據從RT-PCR與尼龍膜晶片取得，且受制於線性迴歸分析，顯示在這兩個方法結果之間之高度相互關係（r=0.979，P<0.0001）。另外，以相關衍生技術之加權化學冷光型基因晶片（Weighted Chemiluminescent Membrane Array, WCHMA）用於肺癌（Lung Cancer）患者之血液檢體分析標的治療藥物（Target Therapeutic Drug）之作用標的K-ras之異常情形，也已被接受刊登於肺癌期刊中。
雖然尼龍膜晶片於分子診斷及藥效評估上之應用已有許多報告提出，然而，由於原始尼龍膜晶片所使用判讀方法上，對於每一基因在特定疾病之重要性皆等值之概念下，造成檢測特異性在達到一定程度之後便不易提升。對此，本發明另外研究開發一基因群檢測結構，雖可大量並快速進行生物檢體檢測分析，惟其檢測過程需先行放大，並無法達到直接從血液檢測透過基因晶片就能偵測血液裡之基因表現，導致在晶片檢測靈敏度及方便性等方面之要求仍嫌不足；故，ㄧ般習用者係無法符合使用者於實際使用時之所需。
本發明之主要目的係在於，克服習知技藝所遭遇之上述問題並提供一種可於臨床檢驗檢查時，不需進行放大，直接從血液檢測，透過基因晶片就可以檢測血液裡之基因表現，具有較高之靈敏度及較佳之方便性，能達到一次滿足高靈敏度及便利性需求之酵素型基因晶片偵測試劑組及其偵測法。
為達以上之目的，本發明係一種酵素型基因晶片偵測試劑組及其偵測法，係以十七種試劑參與基因晶片反應流程，其至少包括下列步驗：
（Ａ）RNA萃取步驟：將欲處理之檢體與一蛋白酶溶液及一裂解溶液混合均勻，置於45～67°C反應8～12分鐘後，加入一磁珠溶液與一結合溶液混合均勻，置於20～30°C反應8～12分鐘後，以磁鐵固定磁珠去除反應溶液，加入一清洗溶液混合均勻，再以磁鐵固定磁珠去除反應溶液，並加入一溶解溶液混合均勻，接著再置於56～84°C反應8～12分鐘後，以磁鐵固定磁珠，收集所得之RNA溶液；
（Ｂ）cDNA合成步驟：將上述RNA溶液置於56～84°C反應8～12分鐘後，加入一引子溶液混合均勻，並置於-0.5～0.5°C反應1.5～2.5分鐘，接著加入一反轉錄溶液與一反轉錄酵素溶液混合均勻，置於34～50°C反應96～144分鐘後，取得cDNA溶液；
（Ｃ）探針標誌步驟：將上述cDNA溶液置於76～114°C反應4～6分鐘後，降溫至-0.5～0.5°C反應1.5～2.5分鐘，再加入一標誌溶液混合均勻，置於34～50°C反應192～288分鐘後，取得探針溶液；
（Ｄ）雜交反應步驟：將一基因晶片置入一反應盒，加入一雜交溶液混合均勻，置於34～50°C反應8～12分鐘，另將上述探針溶液置於76～114°C反應4～6分鐘後，降溫至-0.5～0.5°C反應1.5～2.5分鐘，再將此探針溶液加入該反應盒中，置於34～50°C反應384～576分鐘後，取得雜交溶液，其中，該基因晶片係選定一寡核苷酸片段，並以兩個作為基因晶片反應品質控管依據之管家基因（Housekeeping Gene），將此包含多種目標基因之寡核苷酸片段固著於晶片上，形成在該基因晶片上被覆有標定特定序列者；以及
（Ｅ）訊號偵測步驟：將上述雜交溶液移除，留下基因晶片於反應盒中，加入一第一清洗溶液，於反應4～6分鐘後移除，重複兩次，加入一第二清洗溶液，置於34～50°C反應4～6分鐘後移除，重複兩次，加入一填補溶液，反應24～36分鐘後移除，加入一抗體溶液，反應72～108分鐘後移除，加入一第三清洗溶液，反應4～6分鐘後移除，重複兩次，加入一呈色溶液，置於34～50°C反應直到訊號產生，之後加入水清洗，直到訊號停止繼續產生，於烘乾後即得到偵測結果。
於一較佳實施例中，上述所提之基因晶片係可為尼龍膜（Nylon membrane）或熱塑性複合材料，該熱塑性複合材料並可為聚丙烯（Polypropylene, PP）或聚甲基丙烯酸甲酯（Polymethyl Methacrylate, PMMA）。
於一較佳實施例中，上述所提之寡核苷酸片段係為人工合成之寡核苷酸溶液，其濃度介於10mM～200mM，序列長度介於40～60鹼基，並與目標基因上所具有之特殊序列呈現互補之關係，該基因晶片係將該寡核苷酸溶液以30標準升（nL）以上之量，分布於晶片上，將寡核苷酸片段重複及排列，乾燥後以紫外光照射固化所成。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ａ）所提之蛋白酶溶液係為蛋白酶K（Protease K）。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ａ）所提之裂解溶液係由4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、氯化鈉（Sodium Chloride）及聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ａ）所提之磁珠溶液係為氧化矽基羥基磁珠。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ａ）所提之結合溶液係由聚乙二醇（Polyethylene Glycol, PEG）及氯化鈉所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ａ）所提之清洗溶液係由乙醇（Ethanol）、丙三醇（Glycerin）及醋酸銨（Ammonium Acetate）所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ａ）所提之溶解溶液係由三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-Hydrogen Chloride, Tris-HCl）及乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic Acid, EDTA）所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｂ）所提之引子溶液係由寡核苷酸引子（dT primer）及隨機引子（Random primer）所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｂ）所提之反轉錄溶液係由三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀（Potassium Chloride, KCl）、氯化鎂（Magnesium Chloride, MgCl）及二硫代蘇糖醇（Dithiothreitol, DTT）所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｂ）所提之反轉錄酵素溶液係由反轉錄酵素（Reverse Transcriptase MMLV）及核糖核酸酶抑制劑（Ribonuclease Inhibitor）所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｃ）所提之標誌溶液係由隨機引子、Klen Taq聚合酶（Klen Taq Polymerase）、去氧腺苷三磷酸（Deoxyadenosine Triphosphate, dATP）、去氧胞苷三磷酸（Deoxycytidine Triphosphate, dCTP）、去氧鳥苷三磷酸（Deoxyguanosine Triphosphate, dGTP）、去氧胸苷三磷酸（Deoxythymidine Triphosphate, dTTP）、生物素化去氧三磷酸尿苷（Biotin-dUTP）、Klen Taq緩衝液（Klen Taq Buffer）及丙三醇所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｄ）所提之雜交溶液係由聚乙二醇（Polyethylene Glycol）、十二基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate, SDS）及氯化鈉所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｅ）所提之第一清洗溶液係由十二基硫酸鈉及檸檬酸鈉（Saline Sodium Citrate, SSC）所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｅ）所提之第二清洗溶液係為檸檬酸鈉。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｅ）所提之第三清洗溶液係由十二基硫酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚、及丙三醇所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｅ）所提之填補溶液係為阻斷緩衝劑（Blocking Reagent）。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｅ）所提之抗體溶液係為鹼性磷酸酵素連結抗生物素免疫球蛋白G （Alkaline Phosphatase-conjugated IgG Anti-Biotin）。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｅ）所提之呈色溶液係為5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-氯化硝基四氮唑蘭染色液（BCIP/NBT Solution）。
為達以上之目的，本發明係一種酵素型基因晶片偵測試劑組及其偵測法，係以十七種試劑參與基因晶片反應流程，其至少包括下列步驗：
（Ａ）RNA萃取步驟：將欲處理之檢體與一蛋白酶溶液及一裂解溶液混合均勻，置於45～67°C反應8～12分鐘後，加入一磁珠溶液與一結合溶液混合均勻，置於20～30°C反應8～12分鐘後，以磁鐵固定磁珠去除反應溶液，加入一清洗溶液混合均勻，再以磁鐵固定磁珠去除反應溶液，並加入一溶解溶液混合均勻，接著再置於56～84°C反應8～12分鐘後，以磁鐵固定磁珠，收集所得之RNA溶液；
（Ｂ）cDNA合成步驟：將上述RNA溶液置於56～84°C反應8～12分鐘後，加入一引子溶液混合均勻，並置於-0.5～0.5°C反應1.5～2.5分鐘，接著加入一反轉錄溶液與一反轉錄酵素溶液混合均勻，置於34～50°C反應96～144分鐘後，取得cDNA溶液；
（Ｃ）探針標誌步驟：將上述cDNA溶液置於76～114°C反應4～6分鐘後，降溫至-0.5～0.5°C反應1.5～2.5分鐘，再加入一標誌溶液混合均勻，置於34～50°C反應192～288分鐘後，取得探針溶液；
（Ｄ）雜交反應步驟：將一基因晶片置入一反應盒，加入一雜交溶液混合均勻，置於34～50°C反應8～12分鐘，另將上述探針溶液置於76～114°C反應4～6分鐘後，降溫至-0.5～0.5°C反應1.5～2.5分鐘，再將此探針溶液加入該反應盒中，置於34～50°C反應384～576分鐘後，取得雜交溶液，其中，該基因晶片係選定一寡核苷酸片段，並以兩個作為基因晶片反應品質控管依據之管家基因（Housekeeping Gene），將此包含多種目標基因之寡核苷酸片段固著於晶片上，形成在該基因晶片上被覆有標定特定序列者；以及
（Ｅ）訊號偵測步驟：將上述雜交溶液移除，留下基因晶片於反應盒中，加入一第一清洗溶液，於反應4～6分鐘後移除，重複兩次，加入一第二清洗溶液，置於34～50°C反應4～6分鐘後移除，重複兩次，加入一填補溶液，反應24～36分鐘後移除，加入一抗體溶液，反應72～108分鐘後移除，加入一第三清洗溶液，反應4～6分鐘後移除，重複兩次，加入一呈色溶液，置於34～50°C反應直到訊號產生，之後加入水清洗，直到訊號停止繼續產生，於烘乾後即得到偵測結果。
於一較佳實施例中，上述所提之基因晶片係可為尼龍膜（Nylon membrane）或熱塑性複合材料，該熱塑性複合材料並可為聚丙烯（Polypropylene, PP）或聚甲基丙烯酸甲酯（Polymethyl Methacrylate, PMMA）。
於一較佳實施例中，上述所提之寡核苷酸片段係為人工合成之寡核苷酸溶液，其濃度介於10mM～200mM，序列長度介於40～60鹼基，並與目標基因上所具有之特殊序列呈現互補之關係，該基因晶片係將該寡核苷酸溶液以30標準升（nL）以上之量，分布於晶片上，將寡核苷酸片段重複及排列，乾燥後以紫外光照射固化所成。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ａ）所提之蛋白酶溶液係為蛋白酶K（Protease K）。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ａ）所提之裂解溶液係由4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、氯化鈉（Sodium Chloride）及聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ａ）所提之磁珠溶液係為氧化矽基羥基磁珠。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ａ）所提之結合溶液係由聚乙二醇（Polyethylene Glycol, PEG）及氯化鈉所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ａ）所提之清洗溶液係由乙醇（Ethanol）、丙三醇（Glycerin）及醋酸銨（Ammonium Acetate）所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ａ）所提之溶解溶液係由三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-Hydrogen Chloride, Tris-HCl）及乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic Acid, EDTA）所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｂ）所提之引子溶液係由寡核苷酸引子（dT primer）及隨機引子（Random primer）所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｂ）所提之反轉錄溶液係由三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀（Potassium Chloride, KCl）、氯化鎂（Magnesium Chloride, MgCl）及二硫代蘇糖醇（Dithiothreitol, DTT）所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｂ）所提之反轉錄酵素溶液係由反轉錄酵素（Reverse Transcriptase MMLV）及核糖核酸酶抑制劑（Ribonuclease Inhibitor）所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｃ）所提之標誌溶液係由隨機引子、Klen Taq聚合酶（Klen Taq Polymerase）、去氧腺苷三磷酸（Deoxyadenosine Triphosphate, dATP）、去氧胞苷三磷酸（Deoxycytidine Triphosphate, dCTP）、去氧鳥苷三磷酸（Deoxyguanosine Triphosphate, dGTP）、去氧胸苷三磷酸（Deoxythymidine Triphosphate, dTTP）、生物素化去氧三磷酸尿苷（Biotin-dUTP）、Klen Taq緩衝液（Klen Taq Buffer）及丙三醇所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｄ）所提之雜交溶液係由聚乙二醇（Polyethylene Glycol）、十二基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate, SDS）及氯化鈉所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｅ）所提之第一清洗溶液係由十二基硫酸鈉及檸檬酸鈉（Saline Sodium Citrate, SSC）所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｅ）所提之第二清洗溶液係為檸檬酸鈉。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｅ）所提之第三清洗溶液係由十二基硫酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚、及丙三醇所組成之群組。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｅ）所提之填補溶液係為阻斷緩衝劑（Blocking Reagent）。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｅ）所提之抗體溶液係為鹼性磷酸酵素連結抗生物素免疫球蛋白G （Alkaline Phosphatase-conjugated IgG Anti-Biotin）。
於一較佳實施例中，上述步驟（Ｅ）所提之呈色溶液係為5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-氯化硝基四氮唑蘭染色液（BCIP/NBT Solution）。
請參閱『第１圖』所示，係本發明之偵測流程示意圖。如圖所示：本發明係一種酵素型基因晶片偵測試劑組及其偵測法，該酵素型基因晶片偵測試劑組包含一基因晶片，其上含有兩個管家基因，可作為基因晶片反應品質控管之依據，以及一組基因晶片反應試劑，其係提供基因晶片反應流程所需之全部試劑。該基因晶片反應流程分為RNA萃取、cDNA合成、探針標誌、雜交反應及訊號偵測等五個步驟，而該基因晶片反應試劑共需十七種試劑參與反應，並根據完成後之結果可觀察管家基因之表現情形。於一較佳實施例中，該基因晶片反應流程係至少包括下列步驗：
（Ａ）RNA萃取步驟１１：先將欲處理之檢體與一6 mAU之蛋白酶K（Protease K）溶液混合均勻，再與一由200 mM之4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、400 mM之氯化鈉（Sodium Chloride）及1 %之聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）組成之裂解溶液混合均勻，置於56°C反應10分鐘後，加入一磁珠溶液，即25 mg/ml之氧化矽基羥基磁珠混合均勻，再與一由12.5 %之聚乙二醇（Polyethylene Glycol, PEG）及2 M之氯化鈉組成之結合溶液混合均勻，置於25°C反應10分鐘後，以磁鐵固定磁珠去除反應溶液，加入一由70 %之乙醇（Ethanol）、1 %之丙三醇（Glycerin）及100 mM之醋酸銨（Ammonium Acetate）組成之清洗溶液混合均勻，再以磁鐵固定磁珠去除反應溶液，並加入一由20 mM之三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-Hydrogen Chloride, Tris-HCl）及1 mM之乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic Acid, EDTA）組成之溶解溶液混合均勻，接著再置於70°C反應10分鐘後，以磁鐵固定磁珠，收集所得之RNA溶液；
（Ｂ）cDNA合成步驟１２：將上述RNA溶液置於70°C反應10分鐘後，加入一由300 ng/ul之寡核苷酸引子（dT primer）及100 ng/ul之隨機引子（Random primer）組成之引子溶液混合均勻，並置於0°C反應2分鐘，接著加入一由250 mM之三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、375 mM之氯化鉀（Potassium Chloride, KCl）、15 mM之氯化鎂（Magnesium Chloride, MgCl）及100 mM之之二硫代蘇糖醇（Dithiothreitol, DTT）組成之反轉錄溶液混合均勻，再與一由200 unit之反轉錄酵素（Reverse Transcriptase MMLV）及25 unit之核糖核酸酶抑制劑（Ribonuclease Inhibitor）組成之反轉錄酵素溶液混合均勻，置於42°C反應120分鐘後，取得cDNA溶液；
（Ｃ）探針標誌步驟１３：將上述cDNA溶液置於95°C反應5分鐘後，再置於0°C反應2分鐘，之後加入一由80 ng/ml之隨機引子、2 U/ul之Klen Taq聚合酶（Klen Taq Polymerase）、1 mM之去氧腺苷三磷酸（Deoxyadenosine Triphosphate, dATP）、1 mM之去氧胞苷三磷酸（Deoxycytidine Triphosphate, dCTP）、1 mM之去氧鳥苷三磷酸（Deoxyguanosine Triphosphate, dGTP）、0.6 mM之去氧胸苷三磷酸（Deoxythymidine Triphosphate, dTTP）、0.4 mM之生物素化去氧三磷酸尿苷（Biotin-dUTP）、20 %之Klen Taq緩衝液（Klen Taq Buffer）及20 %之丙三醇組成之標誌溶液混合均勻，置於42°C反應240分鐘後，取得探針溶液；
（Ｄ）雜交反應步驟１４：將一基因晶片置入一反應盒，加入一由10 %之聚乙二醇（Polyethylene Glycol）、10 %之十二基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate, SDS）及2 M之氯化鈉組成之雜交溶液混合均勻，置於42°C反應10分鐘，另將上述探針溶液置於95°C反應5分鐘後，再置於0°C反應2分鐘，之後將此探針溶液加入該反應盒中，置於42°C反應480分鐘後，取得雜交溶液；以及
（Ｅ）訊號偵測步驟１５：將上述雜交溶液移除，留下基因晶片於反應盒中，加入一由0.5 %之十二基硫酸鈉及0.05 X之檸檬酸鈉（Saline Sodium Citrate, SSC）組成之第一清洗溶液，於反應5分鐘後移除，重複兩次。繼之，加入一2 X之檸檬酸鈉作為第二清洗溶液，置於42°C反應5分鐘後移除，重複兩次。接著，加入一1.5 %之阻斷緩衝劑（Blocking Reagent）作為填補溶液，反應30分鐘後移除，再加入一0.7 ug/ml之鹼性磷酸酵素連結抗生物素免疫球蛋白G （Alkaline Phosphatase-conjugated IgG Anti-Biotin）作為抗體溶液，反應90分鐘後移除，之後加入一由1 %之十二基硫酸鈉、1 %之聚乙二醇辛基苯基醚、及1 %之丙三醇組成之第三清洗溶液，反應5分鐘後移除，重複兩次。最後加入一1 X 之5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-氯化硝基四氮唑蘭染色液（BCIP/NBT Solution）作為呈色溶液，置於42°C反應直到訊號產生，之後加入水清洗，直到訊號停止繼續產生，於烘乾後即得到偵測結果。
上述步驟（Ｄ）所提之基因晶片係可為尼龍膜（Nylon membrane）或熱塑性複合材料等可讓核苷酸附著於其上之材料，其中該熱塑性複合材料並可為聚丙烯（Polypropylene, PP）或聚甲基丙烯酸甲酯（Polymethyl Methacrylate, PMMA）。該基因晶片係選定一寡核苷酸片段，並以兩個作為基因晶片反應品質控管依據之管家基因（Housekeeping Gene），將此包含多種目標基因之寡核苷酸片段固著於晶片上，形成在該基因晶片上被覆有標定特定序列者。其中，該寡核苷酸片段係為人工合成之寡核苷酸溶液，其濃度介於10mM～200mM，序列長度介於40～60鹼基，並與目標基因上所具有之特殊序列呈現互補之關係。該基因晶片係將該寡核苷酸溶液以30標準升（nL）以上之量，分布於晶片基質上，並以現有規劃之方式將寡核苷酸片段重複及排列，乾燥後以紫外光照射固化，結束後即完成基因晶片之製作。
藉此，透過本發明提出之酵素型基因晶片偵測試劑組及其偵測法，可於臨床檢驗檢查時，不需進行放大，直接從血液檢測，透過基因晶片就可以檢測血液裡之基因表現，相較傳統技術，具有較高之靈敏度及較佳之方便性，達到一次滿足高靈敏度及便利性之需求。
綜上所述，本發明係一種酵素型基因晶片偵測試劑組及其偵測法，可有效改善習用之種種缺點，可於臨床檢驗檢查時，不需進行放大，直接從血液檢測，透過基因晶片就可以檢測血液裡之基因表現，相較傳統技術，具有較高之靈敏度及較佳之方便性，能達到一次滿足高靈敏度及便利性之需求，進而使本發明之産生能更進步、更實用、更符合使用者之所須，確已符合發明專利申請之要件，爰依法提出專利申請。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
（Ａ）RNA萃取步驟１１：先將欲處理之檢體與一6 mAU之蛋白酶K（Protease K）溶液混合均勻，再與一由200 mM之4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、400 mM之氯化鈉（Sodium Chloride）及1 %之聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）組成之裂解溶液混合均勻，置於56°C反應10分鐘後，加入一磁珠溶液，即25 mg/ml之氧化矽基羥基磁珠混合均勻，再與一由12.5 %之聚乙二醇（Polyethylene Glycol, PEG）及2 M之氯化鈉組成之結合溶液混合均勻，置於25°C反應10分鐘後，以磁鐵固定磁珠去除反應溶液，加入一由70 %之乙醇（Ethanol）、1 %之丙三醇（Glycerin）及100 mM之醋酸銨（Ammonium Acetate）組成之清洗溶液混合均勻，再以磁鐵固定磁珠去除反應溶液，並加入一由20 mM之三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-Hydrogen Chloride, Tris-HCl）及1 mM之乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic Acid, EDTA）組成之溶解溶液混合均勻，接著再置於70°C反應10分鐘後，以磁鐵固定磁珠，收集所得之RNA溶液；
（Ｂ）cDNA合成步驟１２：將上述RNA溶液置於70°C反應10分鐘後，加入一由300 ng/ul之寡核苷酸引子（dT primer）及100 ng/ul之隨機引子（Random primer）組成之引子溶液混合均勻，並置於0°C反應2分鐘，接著加入一由250 mM之三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、375 mM之氯化鉀（Potassium Chloride, KCl）、15 mM之氯化鎂（Magnesium Chloride, MgCl）及100 mM之之二硫代蘇糖醇（Dithiothreitol, DTT）組成之反轉錄溶液混合均勻，再與一由200 unit之反轉錄酵素（Reverse Transcriptase MMLV）及25 unit之核糖核酸酶抑制劑（Ribonuclease Inhibitor）組成之反轉錄酵素溶液混合均勻，置於42°C反應120分鐘後，取得cDNA溶液；
（Ｃ）探針標誌步驟１３：將上述cDNA溶液置於95°C反應5分鐘後，再置於0°C反應2分鐘，之後加入一由80 ng/ml之隨機引子、2 U/ul之Klen Taq聚合酶（Klen Taq Polymerase）、1 mM之去氧腺苷三磷酸（Deoxyadenosine Triphosphate, dATP）、1 mM之去氧胞苷三磷酸（Deoxycytidine Triphosphate, dCTP）、1 mM之去氧鳥苷三磷酸（Deoxyguanosine Triphosphate, dGTP）、0.6 mM之去氧胸苷三磷酸（Deoxythymidine Triphosphate, dTTP）、0.4 mM之生物素化去氧三磷酸尿苷（Biotin-dUTP）、20 %之Klen Taq緩衝液（Klen Taq Buffer）及20 %之丙三醇組成之標誌溶液混合均勻，置於42°C反應240分鐘後，取得探針溶液；
（Ｄ）雜交反應步驟１４：將一基因晶片置入一反應盒，加入一由10 %之聚乙二醇（Polyethylene Glycol）、10 %之十二基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate, SDS）及2 M之氯化鈉組成之雜交溶液混合均勻，置於42°C反應10分鐘，另將上述探針溶液置於95°C反應5分鐘後，再置於0°C反應2分鐘，之後將此探針溶液加入該反應盒中，置於42°C反應480分鐘後，取得雜交溶液；以及
（Ｅ）訊號偵測步驟１５：將上述雜交溶液移除，留下基因晶片於反應盒中，加入一由0.5 %之十二基硫酸鈉及0.05 X之檸檬酸鈉（Saline Sodium Citrate, SSC）組成之第一清洗溶液，於反應5分鐘後移除，重複兩次。繼之，加入一2 X之檸檬酸鈉作為第二清洗溶液，置於42°C反應5分鐘後移除，重複兩次。接著，加入一1.5 %之阻斷緩衝劑（Blocking Reagent）作為填補溶液，反應30分鐘後移除，再加入一0.7 ug/ml之鹼性磷酸酵素連結抗生物素免疫球蛋白G （Alkaline Phosphatase-conjugated IgG Anti-Biotin）作為抗體溶液，反應90分鐘後移除，之後加入一由1 %之十二基硫酸鈉、1 %之聚乙二醇辛基苯基醚、及1 %之丙三醇組成之第三清洗溶液，反應5分鐘後移除，重複兩次。最後加入一1 X 之5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-氯化硝基四氮唑蘭染色液（BCIP/NBT Solution）作為呈色溶液，置於42°C反應直到訊號產生，之後加入水清洗，直到訊號停止繼續產生，於烘乾後即得到偵測結果。
上述步驟（Ｄ）所提之基因晶片係可為尼龍膜（Nylon membrane）或熱塑性複合材料等可讓核苷酸附著於其上之材料，其中該熱塑性複合材料並可為聚丙烯（Polypropylene, PP）或聚甲基丙烯酸甲酯（Polymethyl Methacrylate, PMMA）。該基因晶片係選定一寡核苷酸片段，並以兩個作為基因晶片反應品質控管依據之管家基因（Housekeeping Gene），將此包含多種目標基因之寡核苷酸片段固著於晶片上，形成在該基因晶片上被覆有標定特定序列者。其中，該寡核苷酸片段係為人工合成之寡核苷酸溶液，其濃度介於10mM～200mM，序列長度介於40～60鹼基，並與目標基因上所具有之特殊序列呈現互補之關係。該基因晶片係將該寡核苷酸溶液以30標準升（nL）以上之量，分布於晶片基質上，並以現有規劃之方式將寡核苷酸片段重複及排列，乾燥後以紫外光照射固化，結束後即完成基因晶片之製作。
藉此，透過本發明提出之酵素型基因晶片偵測試劑組及其偵測法，可於臨床檢驗檢查時，不需進行放大，直接從血液檢測，透過基因晶片就可以檢測血液裡之基因表現，相較傳統技術，具有較高之靈敏度及較佳之方便性，達到一次滿足高靈敏度及便利性之需求。
綜上所述，本發明係一種酵素型基因晶片偵測試劑組及其偵測法，可有效改善習用之種種缺點，可於臨床檢驗檢查時，不需進行放大，直接從血液檢測，透過基因晶片就可以檢測血液裡之基因表現，相較傳統技術，具有較高之靈敏度及較佳之方便性，能達到一次滿足高靈敏度及便利性之需求，進而使本發明之産生能更進步、更實用、更符合使用者之所須，確已符合發明專利申請之要件，爰依法提出專利申請。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
11．．．步驟(A)RNA萃取
12．．．步驟(B)cDNA合成
13．．．步驟(C)探針標誌
14．．．步驟(D)雜交反應
15．．．步驟(E)訊號偵測
第１圖，係本發明之偵測流程示意圖。
11．．．步驟(A)RNA萃取
12．．．步驟(B)cDNA合成
13．．．步驟(C)探針標誌
14．．．步驟(D)雜交反應
15．．．步驟(E)訊號偵測
Claims (20)
- 一種酵素型基因晶片偵測試劑組之偵測方法，係以十七種試劑參與基因晶片反應流程，其至少包括下列步驗：
（Ａ）RNA萃取步驟：將欲處理之檢體與一蛋白酶溶液及一裂解溶液混合均勻，置於45～67°C反應8～12分鐘後，加入一磁珠溶液與一結合溶液混合均勻，置於20～30°C反應8～12分鐘後，以磁鐵固定磁珠去除反應溶液，加入一清洗溶液混合均勻，再以磁鐵固定磁珠去除反應溶液，並加入一溶解溶液混合均勻，接著再置於56～84°C反應8～12分鐘後，以磁鐵固定磁珠，收集所得之RNA溶液；
（Ｂ）cDNA合成步驟：將上述RNA溶液置於56～84°C反應8～12分鐘後，加入一引子溶液混合均勻，並置於-0.5～0.5°C反應1.5～2.5分鐘，接著加入一反轉錄溶液與一反轉錄酵素溶液混合均勻，置於34～50°C反應96～144分鐘後，取得cDNA溶液；
（Ｃ）探針標誌步驟：將上述cDNA溶液置於76～114°C反應4～6分鐘後，降溫至-0.5～0.5°C反應1.5～2.5分鐘，再加入一標誌溶液混合均勻，置於34～50°C反應192～288分鐘後，取得探針溶液；
（Ｄ）雜交反應步驟：將一基因晶片置入一反應盒，加入一雜交溶液混合均勻，置於34～50°C反應8～12分鐘，另將上述探針溶液置於76～114°C反應4～6分鐘後，降溫至-0.5～0.5°C反應1.5～2.5分鐘，再將此探針溶液加入該反應盒中，置於34～50°C反應384～576分鐘後，取得雜交溶液，其中，該基因晶片係選定一寡核苷酸片段，並以兩個作為基因晶片反應品質控管依據之管家基因（Housekeeping Gene），將此包含多種目標基因之寡核苷酸片段固著於晶片上，形成在該基因晶片上被覆有標定特定序列者；以及
（Ｅ）訊號偵測步驟：將上述雜交溶液移除，留下基因晶片於反應盒中，加入一第一清洗溶液，於反應4～6分鐘後移除，重複兩次，加入一第二清洗溶液，置於34～50°C反應4～6分鐘後移除，重複兩次，加入一填補溶液，反應24～36分鐘後移除，加入一抗體溶液，反應72～108分鐘後移除，加入一第三清洗溶液，反應4～6分鐘後移除，重複兩次，加入一呈色溶液，置於34～50°C反應直到訊號產生，之後加入水清洗，直到訊號停止繼續產生，於烘乾後即得到偵測結果。 - 依申請專利範圍第１項所述之酵素型基因晶片偵測試劑組之偵測方法，其中，該基因晶片係可為尼龍膜（Nylon membrane）或熱塑性複合材料，該熱塑性複合材料並可為聚丙烯（Polypropylene, PP）或聚甲基丙烯酸甲酯（Polymethyl Methacrylate, PMMA）。
- 依申請專利範圍第１項所述之酵素型基因晶片偵測試劑組之偵測方法，其中，該寡核苷酸片段係為人工合成之寡核苷酸溶液，其濃度介於10mM～200mM，序列長度介於40～60鹼基，並與目標基因上所具有之特殊序列呈現互補之關係，該基因晶片係將該寡核苷酸溶液以30標準升（nL）以上之量，分布於晶片上，將寡核苷酸片段重複及排列，乾燥後以紫外光照射固化所成。
- 依申請專利範圍第１項所述之酵素型基因晶片偵測試劑組之偵測方法，其中，該步驟（Ａ）蛋白酶溶液係為蛋白酶K（Protease K）。
- 依申請專利範圍第１項所述之酵素型基因晶片偵測試劑組之偵測方法，其中，該步驟（Ａ）裂解溶液係由4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、氯化鈉（Sodium Chloride）及聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）所組成之群組。
- 依申請專利範圍第１項所述之酵素型基因晶片偵測試劑組之偵測方法，其中，該步驟（Ａ）磁珠溶液係為氧化矽基羥基磁珠。
- 依申請專利範圍第１項所述之酵素型基因晶片偵測試劑組之偵測方法，其中，該步驟（Ａ）結合溶液係由聚乙二醇（Polyethylene Glycol, PEG）及氯化鈉所組成之群組。
- 依申請專利範圍第１項所述之酵素型基因晶片偵測試劑組之偵測方法，其中，該步驟（Ａ）清洗溶液係由乙醇（Ethanol）、丙三醇（Glycerin）及醋酸銨（Ammonium Acetate）所組成之群組。
- 依申請專利範圍第１項所述之酵素型基因晶片偵測試劑組之偵測方法，其中，該步驟（Ａ）溶解溶液係由三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-Hydrogen Chloride, Tris-HCl）及乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic Acid, EDTA）所組成之群組。
- 依申請專利範圍第１項所述之酵素型基因晶片偵測試劑組之偵測方法，其中，該步驟（Ｂ）引子溶液係由寡核苷酸引子（dT primer）及隨機引子（Random primer）所組成之群組。
- 依申請專利範圍第１項所述之酵素型基因晶片偵測試劑組之偵測方法，其中，該步驟（Ｂ）反轉錄溶液係由三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀（Potassium Chloride, KCl）、氯化鎂（Magnesium Chloride, MgCl）及二硫代蘇糖醇（Dithiothreitol, DTT）所組成之群組。
- 依申請專利範圍第１項所述之酵素型基因晶片偵測試劑組之偵測方法，其中，該步驟（Ｂ）反轉錄酵素溶液係由反轉錄酵素（Reverse Transcriptase MMLV）及核糖核酸酶抑制劑（Ribonuclease Inhibitor）所組成之群組。
- 依申請專利範圍第１項所述之酵素型基因晶片偵測試劑組之偵測方法，其中，該步驟（Ｃ）標誌溶液係由隨機引子、Klen Taq聚合酶（Klen Taq Polymerase）、去氧腺苷三磷酸（Deoxyadenosine Triphosphate, dATP）、去氧胞苷三磷酸（Deoxycytidine Triphosphate, dCTP）、去氧鳥苷三磷酸（Deoxyguanosine Triphosphate, dGTP）、去氧胸苷三磷酸（Deoxythymidine Triphosphate, dTTP）、生物素化去氧三磷酸尿苷（Biotin-dUTP）、Klen Taq緩衝液（Klen Taq Buffer）及丙三醇所組成之群組。
- 依申請專利範圍第１項所述之酵素型基因晶片偵測試劑組之偵測方法，其中，該步驟（Ｄ）雜交溶液係由聚乙二醇（Polyethylene Glycol）、十二基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate, SDS）及氯化鈉所組成之群組。
- 依申請專利範圍第１項所述之酵素型基因晶片偵測試劑組之偵測方法，其中，該步驟（Ｅ）第一清洗溶液係由十二基硫酸鈉及檸檬酸鈉（Saline Sodium Citrate, SSC）所組成之群組。
- 依申請專利範圍第１項所述之酵素型基因晶片偵測試劑組之偵測方法，其中，該步驟（Ｅ）第二清洗溶液係為檸檬酸鈉。
- 依申請專利範圍第１項所述之酵素型基因晶片偵測試劑組之偵測方法，其中，該步驟（Ｅ）第三清洗溶液係由十二基硫酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚、及丙三醇所組成之群組
- 依申請專利範圍第１項所述之酵素型基因晶片偵測試劑組之偵測方法，其中，該步驟（Ｅ）填補溶液係為阻斷緩衝劑（Blocking Reagent）。
- 依申請專利範圍第１項所述之酵素型基因晶片偵測試劑組之偵測方法，其中，該步驟（Ｅ）抗體溶液係為鹼性磷酸酵素連結抗生物素免疫球蛋白G （Alkaline Phosphatase-conjugated IgG Anti-Biotin）。
- 依申請專利範圍第１項所述之酵素型基因晶片偵測試劑組之偵測方法，其中，該步驟（Ｅ）呈色溶液係為5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-氯化硝基四氮唑蘭染色液（BCIP/NBT Solution）。
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