JP6789935B2 - データの速度および密度を増大させるための多数のプライマーからのシーケンシング - Google Patents
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Description
・A−アデニン
・C−シトシン
・DNA−デオキシリボ核酸
・G−グアニン
・RNA−リボ核酸
・T−チミン
・U−ウラシル
支持体に結合した核酸を少なくとも1つ提供するステップと、
少なくとも2つのプライマーを核酸の同一鎖にハイブリダイズするステップと、
前記核酸の同一鎖において、前記少なくとも2つのプライマーのそれぞれでプライマー伸長を行うステップと、
前記プライマー伸長のそれぞれで取り込まれた少なくとも1つのヌクレオチド塩基に対応するシグナルデータを得るステップと、
前記シグナルデータから、前記ヌクレオチド塩基の正体を判定し、前記塩基を伸長リードに割り当てるステップとを含む。
(a)支持体に結合した核酸を少なくとも1つ提供するステップと、
(b)(i)前記核酸の同一鎖の異なる位置にハイブリダイズすることが可能な少なくとも2つのプライマーと、(ii)dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、およびdATPから選択されるヌクレオチドアナログを少なくとも1つ含む4つのプローブの存在下で、伸長リードを複数提供するハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、前記核酸を酵素と接触させるステップであって、前記4つのプローブはそれぞれ、その他の3つのプローブの固有の標識とは異なる固有の標識を有し、前記伸長リードはそれぞれ前記少なくとも2つのプライマーの一方から伸長する、ステップと、
(c)未結合のプローブを除去するステップと、
(d)前記対応する固有標識の正体を判定することにより、ステップ(b)で取り込まれた前記ヌクレオチドアナログの正体を判定するステップと、
(e)ヌクレオチド塩基を伸長リードに割り当てるステップ。
(a)支持体に結合した核酸を少なくとも1つ提供するステップと、
(b)(i)前記核酸の同一鎖の異なる位置にハイブリダイズすることが可能な少なくとも2つのプライマーと、(ii)4つの可逆的に終結させるヌクレオチドアナログ、または、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、およびdATPのアナログから選択される可逆的ターミネータの存在下で、ポリメラーゼが核酸合成に触媒作用を及ぼして複数の伸長リードを提供することを可能にする条件下で、前記核酸を核酸ポリメラーゼと接触させるステップであって、前記4つのアナログはそれぞれ、その他の3つのアナログの固有標識とは異なる固有標識を有し、前記伸長リードはそれぞれプライマーから伸長する、ステップと、
(c)未結合のヌクレオチドアナログを除去するステップと、
(d)前記対応する固有標識の正体を判定することにより、ステップ(b)で取り込まれた前記ヌクレオチドアナログの正体を判定するステップと、
(e)前記塩基を伸長リードに割り当てるステップ。
(i)前記核酸の同一鎖の異なる位置にハイブリダイズすることが可能な少なくとも2つのプライマーと、(ii)dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、およびdATPから選択されるヌクレオチドアナログを少なくとも1つ含む4つのプローブの存在下で、複数の伸長リードを提供するハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、前記核酸を酵素と接触させるステップであって、前記4つのプローブはそれぞれ、その他の3つのプローブの固有標識とは異なる固有標識を有し、前記伸長リードはそれぞれ前記少なくとも2つのプライマーの一方から伸長する、ステップと、
未結合のプローブを除去するステップと、
前記対応する固有標識の正体を判定することにより、取り込まれた前記ヌクレオチドアナログの正体を判定するステップと、
ヌクレオチド塩基を伸長リードに割り当てるステップとにより核酸配列を決定する手段を含む、核酸配列を決定するためのシステムを提供する。
支持体にハイブリダイズした核酸を少なくとも1つ提供するステップと、
少なくとも2つのプライマーを核酸の同一鎖にハイブリダイズして2つの伸長リードを提供するステップと、
可逆的ターミネータ塩基を用いて前記プライマーそれぞれの伸長を実行するステップと、
塩基の追加それぞれにつき前記の結合した可逆的ターミネータ塩基の画像を得るステップと、
前記画像から、前記支持体上のある位置に存在する前記複数の塩基を決定するステップと、
前記塩基を伸長リードに割り当てるステップとを含む、シーケンシング法を提供する。
支持体に結合した核酸を少なくとも1つ提供し、
少なくとも2つのプライマーを核酸の同一鎖にハイブリダイズし、
前記核酸の同一鎖上の前記少なくとも2つのプライマーそれぞれにおいて、少なくとも2つのプライマー伸長を実行し、
前記少なくとも2つのプライマー伸長のそれぞれで取り込まれた少なくとも1つのヌクレオチド塩基に対応するシグナルデータを得て、
前記シグナルデータから前記ヌクレオチド塩基の正体を判定し、前記塩基を伸長リードに割り当てるための手段とを含む、核酸配列を決定するためのシステムを提供する。
SBS3/SBS8 std PE構造
太字=P5、下線= SBS3、イタリック体 = SBS8、イタリック体および太字= P7
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACCACGACGCTCTTCCGATCT---挿入---
TTACTATGCCGCTGGTGGCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGGTGCTGCGAGAAGGCTAGA---挿入---
AGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAGACCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TCTAGCCTTCTCGCCAAGTCGTCCTTACGGCTCTGGCTAGAGCATACGGCAGAAGACGAAC
R1、ヒト、AGTCCT
R2、E.coli、GATGCA
より長いリードは各ゲノムに固有である可能性が高いことになる。
本明細書に記載する方法は、種々の核酸シーケンシング技法と共に用いることが可能である。特に適用可能な技法は、核酸がアレイの一定の位置に付着し、その結果、その相対的位置が変わらず、アレイが繰り返しイメージングされるものである。画像が、例えば、あるヌクレオチド塩基種を別のものと識別するのに用いられる種々の標識と一致して、異なる色チャネルで得られる実施形態が、特定に適用可能である。一部の実施形態において、標的核酸のヌクレオチド配列を決定するプロセスは、自動化プロセスであり得る。好適な実施形態には、シーケンシング・バイ・シンセシス(「SBS」)技法が含まれる。
一部の実施形態では、固定DNA断片を、米国特許第7985565号明細書および同第7115400号明細書(これらの各内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)の開示により例示されるように、クラスタ増幅技法を用いて増幅する。米国特許第7985565号明細書および同第7115400号明細書に組み込まれた材料は、固定核酸分子のクラスタまたは「コロニー」からなるアレイを形成するために増幅産物を固体支持体に固定することを可能にする、固相核酸増幅法を記載する。このようなアレイ上の各クラスタまたはコロニーは、複数の同一の固定ポリヌクレオチド鎖および複数の同一の固定ポリヌクレオチド相補鎖から形成される。このように形成されたアレイは、概して、本明細書では「クラスタ化アレイ」という。米国特許第7985565号明細書および同第7115400号明細書に記載されるような固相増幅反応産物は、固定ポリヌクレオチド鎖と固定相補鎖の対をアニールすることにより形成される、いわゆる「ブリッジ状」構造であり、両鎖は5’末端で好適には共有結合を介して固体支持体に固定される。クラスタ増幅技法は、固定核酸鋳型を用いて固定アンプリコンを生成する方法の例である。他の適切な手法を用いて、本明細書で提供する方法に従い生成された固定DNA断片から固定アンプリコンを生成することも可能である。例えば、1つまたは複数のクラスタもしくはコロニーは、各増幅プライマー対の一方のプライマーが固定されていても、両方のプライマーが固定されていても、固相PCRを介して形成され得る。
Claims (15)
- 核酸配列を決定する方法であって、
支持体に結合した核酸を少なくとも1つ提供するステップと、
(i)少なくとも1つの核酸の同一鎖に異なる位置でハイブリダイズすることが可能な少なくとも2つのプライマーと、(ii)dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、およびdATPから選択される少なくとも1つのヌクレオチドをそれぞれ含む4つの標識部分の存在下で、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、前記核酸を酵素と接触させるステップを含み、前記4つの標識部分はそれぞれ、その他の3つの標識部分の固有の標識とは異なる固有の標識を有する、ステップと、
前記少なくとも2つのプライマーを前記核酸の同一鎖にハイブリダイズするステップと、
前記核酸の同一鎖上で前記少なくとも2つのプライマーそれぞれにおいて、プライマー伸長を行い、複数の伸長リードを提供する、ここで前記伸長リードはそれぞれ前記少なくとも2つのプライマーの一方から伸長し、前記4つの標識部分と同じセットが各伸長に用いられる、ステップと、
前記プライマー伸長のそれぞれで取り込まれた少なくとも1つのヌクレオチド塩基に対応するシグナルデータを得るステップと、
前記シグナルデータから、前記ヌクレオチド塩基の正体を判定し、前記塩基を伸長リードに割り当てるステップとを含み、
前記少なくとも2つのプライマーは、前記複数の伸長リードがリードの一つが他のリードよりも明るくされることで化学的に区別されるように、異なるレベルのブロックプライマーおよび非ブロックプライマーを含む、方法。 - 未結合の標識部分を除去するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の伸長リードは同時に起きる伸長リードを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記4つの標識部分はそれぞれ、単一の可逆的に終結させるヌクレオチドアナログ、または、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、およびdATPから選択される可逆的ターミネータアナログを含む、請求項1〜3の何れかに記載の方法。
- 前記酵素にはポリメラーゼまたはリガーゼが含まれる、請求項1〜4の何れかに記載の方法。
- 前記支持体はチップまたはビーズを含む、請求項1〜5の何れかに記載の方法。
- 前記固有の標識には色素、フルオロフォア、クロモフォア、コンビナトリアル蛍光エネルギー移動タグ、質量タグ、またはエレクトロホアが含まれる、請求項1〜6の何れかに記載の方法。
- 前記少なくとも2つのプライマーは、重複配列を有する、及び/又は単一塩基の追加により異なる、請求項1〜7の何れかに記載の方法。
- バイオインフォマティクス情報を用いて前記塩基を前記伸長リードに割り当てる、請求項1〜8の何れかに記載の方法。
- 前記少なくとも2つのプライマー伸長のそれぞれに対応するシグナルデータは、同時に得られる、請求項1〜9の何れかに記載の方法。
- 前記ヌクレオチド塩基の正体を判定するステップは、前記複数の伸長リードのそれぞれで検出される前記固有の標識に対応するシグナル強度プロファイルを解析するステップを含む、請求項1〜10の何れかに記載の方法。
- 前記シグナルデータは1つまたは複数の画像を含み、任意で前記シグナルデータは、前記プライマー伸長において取り込まれた複数のヌクレオチドアナログに対応する色シグナルとして検出され、各色シグナルは、異なるヌクレオチドアナログまたはヌクレオチドアナログの組み合わせに対応する、1〜11の何れかに記載の方法。
- 1つまたは複数のシグナルデコンボリューション、シグナル改良、およびシグナル選択を含むシグナル処理のステップを含む、請求項1〜12の何れかに記載の方法。
- 多数のベースコールが各ハイブリダイゼーションサイクルで作成される、請求項1〜13の何れかに記載の方法。
- 前記塩基を伸長リードに割り当てるステップは、前記ヌクレオチド塩基の位置を決定するステップを含む、及び/又は前記塩基を伸長リードに割り当てるステップは、各伸長リードに対し暫定ベースコールと最終ベースコールを提供するステップを含み、
ここで、任意に、前記最終ベースコールは、前記暫定ベースコールデータと参照ゲノムとの比較により提供される、請求項1〜14の何れかに記載の方法。
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