ES2889875T3 - Secuenciación a partir de cebadores múltiples para incrementar la velocidad y la densidad de los datos - Google Patents

Abstract

Un método para determinar la secuencia de un ácido nucleico que comprende: ­ proporcionar al menos un ácido nucleico unido a un soporte; ­ poner en contacto el ácido nucleico con una enzima en presencia de (i) al menos dos cebadores capaces de hibridar a la misma hebra de dicho al menos un ácido nucleico en diferentes posiciones y (ii) cuatro restos marcados que comprenden cada uno un análogo de nucleótido diferente seleccionado de dGTP, dCTP, dTTP, dUTP y dATP, teniendo cada uno de los cuatro restos marcados una etiqueta única que es diferente de las etiquetas únicas de los otros tres restos marcados, en condiciones que permiten la hibridación; ­ hibridar los al menos dos cebadores a la misma cadena del ácido nucleico; ­ realizar extensiones de cebador en dicha misma cadena del ácido nucleico en cada uno de los al menos dos cebadores para dar una pluralidad de lecturas de extensión, extendiendo cada lectura de extensión desde uno de los al menos dos cebadores, en donde el mismo conjunto de cuatro restos marcados se utiliza para cada lectura de extensión; ­ obtener datos de señales que corresponden a al menos una base de nucleótidos incorporada en cada una de las extensiones del cebador; y ­ determinar a partir de dichos datos de señal la identidad de las bases de nucleótidos y asignar dichas bases a una lectura de extensión; en donde los al menos dos cebadores comprenden cebadores bloqueados y no bloqueados para diferenciar químicamente entre cada lectura de extensión; en donde los al menos dos cebadores comprenden niveles diferentes de cebadores bloqueados y no bloqueados de manera que la pluralidad de lecturas de extensión se diferencian químicamente haciendo que una de las lecturas sea más brillante que la otra.

Description

DESCRIPCIÓN

Secuenciación a partir de cebadores múltiples para incrementar la velocidad y la densidad de los datos

La presente invención se refiere a un método de secuenciación que permite mayores velocidades de secuenciación y un aumento en la densidad de los datos de secuenciación. El sistema puede basarse en métodos de secuenciación de nueva generación, tal como la secuenciación por síntesis (SBS), pero utiliza múltiples cebadores unidos en diferentes posiciones en la misma cadena de ácido nucleico.

Descifrar las secuencias de DNA es fundamental para prácticamente todas las ramas de la investigación biológica. Con la llegada de la secuenciación de Sanger, los científicos obtuvieron la capacidad de dilucidar la información genética de cualquier sistema biológico dado. Esta tecnología se ha adoptado ampliamente en laboratorios de todo el mundo, pero siempre se ha visto obstaculizada por limitaciones inherentes en el rendimiento, la escalabilidad, la velocidad y la resolución que a menudo impiden a los científicos obtener la información esencial que necesitan. Para superar estas barreras, se desarrolló la secuenciación de nueva generación (NGS), un enfoque fundamentalmente diferente de la secuenciación que desencadenó numerosos descubrimientos innovadores y encendió una revolución en la ciencia genómica.

La producción de datos de secuenciación de nueva generación aumentó inicialmente a una velocidad que supera la ley de Moore, más del doble cada año desde que se inventó. En 2007, una sola ejecución de secuenciación podría producir un máximo de alrededor de un gigabase (Gb) de datos. Para 2011, esa tasa casi ha alcanzado una terabase (Tb) de datos en una sola ejecución de secuenciación, casi un aumento de 1000 veces en cuatro años. Con la capacidad de generar rápidamente grandes volúmenes de datos de secuenciación, la secuenciación de nueva generación permite a los investigadores pasar rápidamente de una idea a conjuntos de datos completos en cuestión de horas o días. Los investigadores ahora pueden secuenciar 16 genomas humanos en una sola ejecución, produciendo datos en aproximadamente 3 días, por un costo de reactivo por genoma que aún está disminuyendo.

En comparación, el primer genoma humano requirió aproximadamente 10 años para secuenciar usando tecnología CE y tres años adicionales para finalizar el análisis. El proyecto completo se publicó en 2003, solo unos pocos años antes de que se inventara la secuenciación de nueva generación, y tuvo un precio cercano a los 3 billones de dólares.

Si bien los últimos instrumentos de secuenciación de alto rendimiento son capaces de producir una salida de datos masiva, la tecnología de secuenciación de nueva generación es altamente escalable. La misma química subyacente se puede utilizar para volúmenes de salida más bajos para estudios específicos o genomas más pequeños. Esta escalabilidad brinda a los investigadores la flexibilidad para diseñar los estudios que mejor se adapten a las necesidades de su investigación particular. Para secuenciar pequeños genomas bacterianos/virales o regiones específicas como exomas, un investigador puede optar por utilizar un instrumento de menor rendimiento y procesar una menor cantidad de muestras por ejecución, o puede optar por procesar una gran cantidad de muestras multiplexando en un instrumento de alto rendimiento. La multiplexación permite secuenciar simultáneamente grandes cantidades de muestras durante un solo experimento.

Aunque la secuenciación de nueva generación ha aumentado el rendimiento de manera significativa, todavía es beneficioso aumentar la velocidad de datos y la densidad de secuenciación, particularmente cuando se trabaja con genomas grandes, por ejemplo. La presente invención tiene como objetivo mejorar aún más la velocidad de datos y la densidad/rendimiento de datos, particularmente cuando se aplica a la metodología de secuenciación de nueva generación/secuenciación por síntesis (SBS).

Preferiblemente, el término "llamada de base", llamadas de base o llamada de base se refiere al proceso de asignar bases (nucleobases) a la información obtenida durante la secuenciación, por ejemplo, asignando nucleótidos a los picos del cromatograma.

Como se usa en la presente memoria, y a menos que se indique lo contrario, cada uno de los siguientes términos tendrá la definición que se establece a continuación.

• A-Adenina;

• C-Citosina;

• DNA-Ácido desoxirribonucleico;

• G-Guanina;

• RNA-Ácido ribonucleico;

• T-Timina; y

• U-Uracilo.

"Ácido nucleico" significará cualquier molécula de ácido nucleico, incluyendo, sin limitación, DNA, RNA e híbridos de los mismos. Las bases de ácido nucleico que forman moléculas de ácido nucleico pueden ser las bases A, C, G, T y U, así como derivados de las mismas. Los derivados de estas bases son bien conocidos en la técnica y se ejemplifican en sistemas de PCR, reactivos y consumibles (Catálogo Perkin Elmer 1996-1997, Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, N.J., EE.UU.).

"Tipo" de nucleótido se refiere a, G, C, T o U.

"Etiqueta de masa" significará una entidad molecular de un tamaño predeterminado que es capaz de unirse mediante un enlace escindible a otra entidad.

"Sustrato sólido" significará cualquier medio adecuado presente en la fase sólida al que se pueda fijar un anticuerpo o un agente.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo, y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido, se incluye dentro de la divulgación. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños, y también se incluyen dentro de la divulgación, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos límites incluidos también se incluyen en la divulgación.

La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.

Un aspecto de la divulgación proporciona un método para determinar la secuencia de un ácido nucleico que comprende proporcionar al menos un ácido nucleico unido a un soporte;

hibridar al menos dos cebadores a la misma cadena de ácido nucleico;

realizar extensiones de cebadores en dicha misma cadena de ácido nucleico en cada uno de los al menos dos cebadores;

obtener datos de señales que correspondan a al menos una base de nucleótidos incorporada en cada una de las extensiones del cebador;

determinar a partir de dichos datos de señal la identidad de las bases de nucleótidos y asignar dichas bases a una lectura de extensión.

Preferiblemente, el método comprende poner en contacto el ácido nucleico con una enzima en presencia de (i) los al menos dos cebadores capaces de hibridar a la misma cadena de dicho ácido nucleico en diferentes posiciones y (ii) cuatro restos marcados que comprenden al menos un nucleótido análogo seleccionado de dGTP, dCTP, dTTP, dUTP y dATP, teniendo cada uno de los cuatro restos marcados una etiqueta única que es diferente de las etiquetas únicas de los otros tres restos marcados, en condiciones que permiten la hibridación para dar una pluralidad de lecturas de extensiones, extendiendo cada lectura de extensión desde uno de los al menos dos cebadores.

El método puede comprender la etapa de eliminar restos marcados no unidos.

Preferiblemente, la pluralidad de lecturas de extensión comprende lecturas de extensión sustancialmente simultáneas. En determinadas realizaciones, los cuatro restos marcados comprenden cada uno un único análogo de nucleótido de terminación reversible o un análogo de terminador reversible seleccionado de dGTP, dCTP, dTTP, dUTP y dATP o una sonda de oligonucleótido que comprende al menos un análogo de nucleótido seleccionado entre dGTP, dCTP, dTTP, dUTP y dATP.

De manera ventajosa, los datos de señal correspondientes a cada una de las al menos dos extensiones de cebadores pueden obtenerse de forma sustancialmente simultánea.

Esto proporciona la ventaja de que los datos de la señal comprenden datos que corresponden a múltiples señales de la misma cadena de ácido nucleico.

Opcionalmente, los datos de la señal comprenden una o más imágenes.

Opcionalmente, los datos de la señal se detectan como señales de color que corresponden a una pluralidad de análogos de nucleótidos incorporados en las extensiones del cebador y en el que cada señal de color corresponde a un análogo de nucleótidos diferente o una combinación de análogos de nucleótidos.

Un aspecto de la presente divulgación proporciona un método para determinar la secuencia de un ácido nucleico que comprende realizar las siguientes etapas:

(a) proporcionar al menos un ácido nucleico unido a un soporte;

(b) poner en contacto el ácido nucleico con una enzima en presencia de (i) al menos dos cebadores capaces de hibridar a la misma cadena de dicho ácido nucleico en diferentes posiciones y (ii) cuatro sondas que comprenden al menos un análogo de nucleótido seleccionado de dGTP , dCTP, dTTP, dUTP y dATP, teniendo cada una de las cuatro sondas una etiqueta única que es diferente de las etiquetas únicas de las otras tres sondas, en condiciones que permitan la hibridación para dar una pluralidad de lecturas de extensiones, extendiendo cada lectura de extensión desde uno de los al menos dos cebadores,

(c) retirar las sondas no unidas;

(d) determinar la identidad de los análogos de nucleótidos incorporados en la etapa (b) mediante la determinación de la identidad de las correspondientes etiquetas únicas, y

(e) asignar las bases de nucleótidos a una lectura de extensión.

Preferiblemente, la pluralidad de lecturas de extensión comprende lecturas de extensión simultáneas.

En determinadas realizaciones, el método comprende la secuenciación por síntesis y la enzima comprende una polimerasa.

Cada una de las cuatro sondas puede comprender un análogo de nucleótido de terminación reversible o un análogo de terminador reversible seleccionado de dGTP, dCTP, dTTP, dUTP y dATP.

En determinadas realizaciones, el método comprende secuenciar por ligación y la enzima comprende una ligasa. Las cuatro sondas pueden comprender oligonucleótidos.

Los oligonucleótidos pueden ser del tipo utilizado en la secuenciación mediante técnicas de ligación.

El método puede comprender secuenciación por síntesis, secuenciación por ligación, pirosecuenciación o secuenciación por nanoporos.

En determinadas realizaciones, cada etiqueta única es detectable con un color diferente.

De manera ventajosa, ya que dos o más cebadores se hibridan a la misma cadena de ácido nucleico, pero en diferentes posiciones, esto permite que la secuenciación de la cadena comience en dos puntos separados, para dar múltiples lecturas de extensión, multiplicando potencialmente la densidad de datos y la velocidad a la que son obtenidos. Cuando el sistema usa ácidos nucleicos unidos a un soporte sólido, por ejemplo, en técnicas de secuenciación de nueva generación, esto permite que se realicen múltiples llamadas de bases en cada localización particular. Cada llamada de base se asigna a la lectura de extensión correcta que permite determinar la secuencia del ácido nucleico.

En determinadas realizaciones, el método proporciona la ventaja de que una pluralidad de bases de nucleótidos incorporadas en una única cadena plantilla de un ácido nucleico en diferentes posiciones de la misma cadena puedan identificarse simultáneamente en tiempo real.

Preferiblemente, el ácido nucleico es ácido desoxirribonucleico (DNA).

Preferiblemente, el ácido nucleico está unido a un sustrato sólido.

Lo más preferiblemente, el sustrato sólido es del tipo utilizado en las metodologías de secuenciación por síntesis o secuenciación por ligación.

Preferiblemente, el sustrato sólido es un chip.

Alternativamente, el sustrato sólido es una perla.

Opcionalmente, la etiqueta única está unida a una base a través de un enlazador escindible.

Opcionalmente, la etiqueta única se une a la base mediante un enlazador químicamente escindible o fotoescindible. Opcionalmente, la etiqueta única es un colorante, un fluoróforo, un cromóforo, una etiqueta de transferencia de energía de fluorescencia combinatoria, una etiqueta de masa o un electróforo.

Preferiblemente, después de (a) proporcionar al menos un ácido nucleico unido a un soporte; el ácido nucleico se amplifica.

Lo más preferiblemente, el ácido nucleico se amplifica mediante amplificación en puente.

Opcionalmente, los al menos dos cebadores capaces de hibridar a la misma cadena de dicho ácido nucleico en diferentes posiciones tienen secuencias superpuestas.

Opcionalmente, un segundo cebador es el mismo que un primer cebador con una base adicional al final. También se pueden usar cebadores adicionales, añadiendo cada uno una base adicional.

Opcionalmente, se utilizan cebadores bloqueados y no bloqueados para diferenciar químicamente entre lecturas de extensión. Esto asegura que las llamadas de base correctas se asignen a la lectura de extensión correcta.

Esto se puede lograr usando diferentes niveles de cebadores bloqueados y no bloqueados para cada uno de los al menos dos cebadores usados.

Opcionalmente, se utiliza información bioinformática para asignar dichas bases a una lectura de extensión.

En determinadas realizaciones, la etapa de determinar la identidad de los análogos de nucleótidos comprende detectar los datos de señal que corresponden a la pluralidad de lecturas de extensión.

Los datos de señal que corresponden a cada una de la pluralidad de lecturas de extensión pueden detectarse simultáneamente.

La etapa de determinar la identidad de los análogos de nucleótidos puede comprender analizar un perfil de intensidad de señal que corresponde a las etiquetas únicas detectadas en cada una de las lecturas de extensión.

Esto puede incluir medir las intensidades de la señal en los datos de la señal que corresponde a cada lectura de extensión simultáneamente.

Opcionalmente, el método incluye determinar la distribución de medidas de intensidad en los datos de la señal generando un histograma de datos de intensidad.

Los datos de la señal pueden detectarse como señales de color que corresponden a una pluralidad de análogos de nucleótidos incorporados en la etapa (b), en el que cada señal de color corresponde a un análogo de nucleótidos diferente o una combinación de análogos de nucleótidos.

El método puede incluir la etapa de procesamiento de la señal que comprende una o más deconvolución de la señal, refinamiento de la señal y selección de la señal.

El método puede incluir la selección de señales de color de mayor intensidad en cada lectura de extensión para proporcionar una llamada de base.

Pueden realizarse múltiples llamadas de base en cada ciclo de hibridación.

Opcionalmente, la etapa de asignar bases a una lectura de extensión comprende determinar la posición de los análogos de nucleótidos.

Opcionalmente, la etapa de asignar bases a una lectura de extensión comprende proporcionar una llamada de base preliminar y una llamada de base final para cada lectura de extensión.

Opcionalmente, la llamada de base final se proporciona mediante la comparación de los datos de la llamada de base preliminares con un genoma de referencia.

Opcionalmente, la llamada de base final se proporciona mediante la comparación de los datos de llamada de base preliminares con un genoma de referencia.

En determinadas realizaciones, los al menos dos cebadores pueden ser cebadores superpuestos.

En ciertas realizaciones, los al menos dos cebadores pueden diferir por una sola adición de base.

De manera ventajosa, en determinadas realizaciones, el método proporciona la detección de una señal que comprende datos de señal que corresponden a una pluralidad de extensiones de cebador sustancialmente simultáneas en distintos sitios de la misma cadena o molécula de ácido nucleico.

De manera ventajosa, no se pueden requerir en el método más de cuatro etiquetas únicas que corresponden a análogos de monómero de un solo nucleótido de dGTP, dCTP, dTTP, dUTP y dATP o a sondas de oligonucleótidos que comprenden análogos de dGTP, dCTP, dTTP, dUTP y dATP.

El mismo conjunto de cuatro sondas se usa preferiblemente en el método para cada lectura de extensión.

Según la presente divulgación, se proporciona un método para determinar la secuencia de un ácido nucleico que comprende realizar las siguientes etapas para cada residuo del ácido nucleico que se va a secuenciar:

(a) proporcionar al menos un ácido nucleico unido a un soporte;

(b) poner en contacto el ácido nucleico con una polimerasa de ácido nucleico en presencia de (i) al menos dos cebadores capaces de hibridar a la misma cadena de dicho ácido nucleico en diferentes posiciones y (ii) cuatro análogos de nucleótidos de terminación reversible o terminadores reversibles seleccionados de análogos de dGTP, dCTP, dTTP, dUTP y dATP, teniendo cada uno de los cuatro análogos una etiqueta única que es diferente de las etiquetas únicas de los otros tres análogos,

en condiciones que permitan a la polimerasa catalizar la síntesis de ácidos nucleicos para dar una pluralidad de lecturas de extensiones, extendiendo cada lectura de extensión desde un cebador,

(c) eliminar los análogos de nucleótidos no unidos;

(d) determinar la identidad de los análogos de nucleótidos incorporados en la etapa (b) mediante la determinación de la identidad de las correspondientes etiquetas únicas, y

(e) asignar dichas bases a una lectura de extensión.

Otro aspecto más de la presente divulgación proporciona un sistema para determinar la secuencia de un ácido nucleico que comprende un aparato de secuenciación que tiene un soporte sólido para inmovilizar al menos un ácido nucleico y medios para determinar su secuencia poniendo en contacto el ácido nucleico con una enzima en presencia de (i) al menos dos cebadores capaces de hibridar a la misma cadena de dicho ácido nucleico en diferentes posiciones y (ii) cuatro sondas que comprenden al menos un análogo de nucleótido seleccionado de dGTP, dCTP, dTTP, dUTP y dATP, teniendo cada una de las cuatro sondas una etiqueta única que es diferente de las etiquetas únicas de las otras tres sondas,

en condiciones que permitan la hibridación para dar una pluralidad de lecturas de extensión, extendiendo cada lectura de extensión desde uno de los al menos dos cebadores;

eliminar las sondas no unidas;

determinar la identidad de los análogos de nucleótidos incorporados mediante la determinación de la identidad de las etiquetas únicas correspondientes, y

asignar las bases de nucleótidos a una lectura de extensión.

Otro aspecto de la presente divulgación proporciona un método de secuenciación que comprende proporcionar al menos un ácido nucleico hibridado a un soporte;

hibridar al menos dos cebadores a la misma cadena de ácido nucleico para proporcionar dos lecturas de extensión; realizar una extensión de cada uno de los cebadores con bases de terminador reversibles;

obtener una imagen de las bases de terminador reversibles unidas para cada adición de base;

determinar a partir de dichas imágenes la pluralidad de bases presentes en una localización en el soporte y asignar dichas bases a una lectura de extensión.

Otro aspecto más de la presente divulgación proporciona un sistema para determinar la secuencia de un ácido nucleico que comprende un aparato de secuenciación que tiene un soporte sólido para inmovilizar al menos un ácido nucleico y medios para proporcionar al menos un ácido nucleico unido a un soporte;

hibridar al menos dos cebadores a la misma cadena de ácido nucleico;

realizar al menos dos extensiones de cebadores en dicha misma cadena de ácido nucleico en cada uno de los al menos dos cebadores;

obtener datos de señales que corresponden a al menos una base de nucleótidos incorporada en cada una de las al menos dos extensiones de cebador;

determinar a partir de dichos datos de señal la identidad de las bases de nucleótidos y asignar dichas bases a una lectura de extensión.

Preferiblemente, el sistema comprende un procesador de señales para procesar los datos de las señales.

Otro aspecto más de la presente divulgación proporciona un kit para determinar la secuencia de un ácido nucleico que comprende reactivos e instrucciones de secuenciación para realizar el método.

Para ejemplificar la invención se utilizó una celda de flujo con agrupaciones v2 PhiX. Un constructo estándar que comprende P5, SBS3, seguido de un residuo de T y luego un inserto genómico, SBS8' seguido de un residuo de A y P7 como se muestra en la Figura 1 y a continuación;

Figura 1

Constructo de PE estándar SBS3/SBS8

Negrita = P5, subrayado = SBS3, cursiva = SBS8, cursiva y negrita = P7

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACCACGACGCTCTTCCGATCT-insert-

TTACTATGCCGCTGGTGGCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGGTGCTGCGAGAAGGCTAGA— insert—

AGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAGACCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG TCTAGCCTTCTCGCCAAGTCGTCCTTACGGCTCTCGCYAGAGCATACGGCAGAAGACGAAC

Los cebadores SBS3, SBS3+T y SBS8 'se hibridaron tanto solos como en combinaciones como se muestra en la tabla 1 a continuación.

Tabla 1

Se realiza un primer ciclo de secuenciación y se obtienen las primeras imágenes de la celda de flujo. La Figura 2 muestra el 1er ciclo de escaneos individuales en escala de grises para los 3 canales analizados (verde, naranja y rojo). Los carriles 1 y 3 tienen señales más fuertes en 2 diferentes de los 3 canales, mientras que el carril 4 tiene señales fuertes para los 3 canales debido a la mezcla de bases T y A incorporadas en SBS3 y SBS8' en ese carril. La incorporación de T en SBS3 se muestra como una señal fuerte en los canales verde y naranja, muy débil en el rojo. La incorporación de A en SBS8' se muestra como fuerte en los canales naranja y rojo, una mezcla de señal débil y fuerte en el canal verde. El carril SBS3/SBS8' muestra una señal fuerte en los canales verde, naranja y rojo debido a la incorporación de T y A en los 2 cebadores usados.

Como puede verse en la Figura 3, los histogramas de intensidad muestran que las señales combinadas dan como resultado la obtención de información de intensidad diferente que luego puede asignarse a la información de la base para permitir una llamada de base eficaz. El histograma superior es solo de SBS3, indicativo de una llamada de base de T, el histograma inferior es de SBS8' solo, indicativo de una llamada de base de A, mientras que el histograma central muestra el histograma combinado de SBS3/SBS8' donde se está realizando tanto una llamada de base de A como una llamada de base de T, una de cada una de las lecturas de extensiones.

De manera similar, la Figura 4 nuevamente muestra histogramas de intensidad, esta vez el histograma superior es de SBS3 T solo, donde la llamada de base puede ser una cualquiera de las 4 bases ya que se relaciona con el DNA genómico, el histograma inferior es solo de SBS8', indicativo de una llamada de base de A, mientras que el histograma central muestra el histograma combinado de SBS3 T/SBS8' donde la llamada de base puede ser una cualquiera de las 4 bases relacionadas con el DNA genómico de una lectura de extensión, más una llamada de base de A de la otra lectura de extensión que da un pico de intensidad doble de los grupos A/A.

Una vez que se han obtenido las lecturas de intensidad y las imágenes, se pueden realizar llamadas de base para cada ubicación con múltiples llamadas en cada posición para cada ciclo de secuenciación. Cada llamada en cada posición deberá asignarse después a la lectura de extensión correcta. Esto se puede hacer químicamente, por ejemplo, haciendo que una de las lecturas sea más brillante que la otra usando una mezcla de cebador bloqueado y desbloqueado. Otra opción es usar información bioinformática para determinar cuál es la llamada de base más "correcta" estadísticamente si estamos usando, por ejemplo, insertos humanos, o insertos de E. coli, etc.

En una realización particular, los múltiples cebadores pueden ser cebadores superpuestos. Por ejemplo, SBS3 y SBS3 T podrían usarse para secuenciar 2 bases consecutivas en cada ciclo para dar una mejor precisión al interrogar cada base varias veces, en este caso donde se usan dos cebadores que difieren por una sola adición de base, cada base se interroga dos veces.

En algunos casos, se utilizan cebadores bloqueados y no bloqueados para diferenciar químicamente entre lecturas de extensión. Por ejemplo, uno de los cebadores estaría completamente desbloqueado al principio, mientras que el otro cebador sería una mezcla de cebadores bloqueados/no bloqueados. Así, por ejemplo, el cebador 1 estaría desbloqueado al 100% y daría una señal del 100% en la secuenciación. Después, el "cebador 2" sería una mezcla de, digamos, 25% desbloqueado y 75% bloqueado, lo que significa que en la secuenciación obtendría una señal del 25% de este sitio del cebador. Por lo tanto, terminaría con las 2 lecturas dando datos en 2 niveles diferentes (100% y 25%), lo que debería facilitar la diferenciación de qué base pertenece a qué lectura).

Cuando se utiliza información bioinformática para asignar dichas bases a una lectura de extensión, es posible buscar bioinformáticamente las lecturas más probables posibles a partir de la mezcla de bases que se están leyendo, por ejemplo, si sus lecturas son:

A/G, A/G, T/T, C/G, C/C, A/T

Después, podría llevarse a cabo una búsqueda en los genomas que se están secuenciando en busca de coincidencias probables, y podría ser posible distinguir las 2 lecturas como:

R1, humano, AGTCCT

R2, E. coli, GATGCA

a diferencia de cualquier otra lectura posible de la mezcla de bases anterior (por ejemplo, AATCCA no se encuentra en ninguno de los genomas). Es más probable que las lecturas más largas sean únicas para cada genoma.

Métodos de secuenciación

Los métodos descritos en la presente memoria se pueden usar junto con una variedad de técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos. Las técnicas particularmente aplicables son aquellas en las que los ácidos nucleicos se unen en localizaciones fijas en una matriz de modo que sus posiciones relativas no cambien y en las que la matriz se forma repetidamente en imágenes. Son particularmente aplicables las realizaciones en las que se obtienen imágenes en diferentes canales de color, por ejemplo, coincidiendo con diferentes etiquetas utilizadas para distinguir un tipo de base de nucleótidos de otro. En algunas realizaciones, el proceso para determinar la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana puede ser un proceso automatizado. Las realizaciones preferidas incluyen técnicas de secuenciación por síntesis ("SBS").

Las técnicas de SBS generalmente implican la extensión enzimática de una cadena de ácido nucleico naciente mediante la adición iterativa de nucleótidos frente a una cadena plantilla. En los métodos tradicionales de SBS, se puede proporcionar un monómero de un solo nucleótido a un nucleótido diana en presencia de una polimerasa en cada suministro. Sin embargo, en los métodos descritos en la presente memoria, se puede proporcionar más de un tipo de monómero nucleotídico a un ácido nucleico diana en presencia de una polimerasa en un suministro.

La técnica de SBS puede utilizar monómeros de nucleótidos que tienen un resto terminador o aquellos que carecen de restos terminadores. Los métodos que utilizan monómeros de nucleótidos que carecen de terminadores incluyen, por ejemplo, pirosecuenciación y secuenciación utilizando nucleótidos marcados con Y-fosfato, como se expone con más detalle a continuación. En los métodos que utilizan monómeros de nucleótidos que carecen de terminadores, el número de nucleótidos añadidos en cada ciclo es generalmente variable y depende de la secuencia plantilla y del modo de suministro de nucleótidos. Para las técnicas de SBS que utilizan monómeros de nucleótidos que tienen un resto terminador, el terminador puede ser efectivamente irreversible en las condiciones de secuenciación utilizadas como es el caso de la secuenciación tradicional de Sanger que utiliza didesoxinucleótidos, o el terminador puede ser reversible como es el caso de los métodos de secuenciación desarrollados por Solexa (ahora Illumina, Inc.).

Las técnicas de SBS pueden utilizar monómeros de nucleótidos que tienen un resto marcador o aquellos que carecen de un resto marcador. Por consiguiente, los sucesos de incorporación pueden detectarse basándose en una característica de la etiqueta, tal como la fluorescencia de la etiqueta; una característica del monómero de nucleótido, tal como el peso molecular o la carga; un subproducto de la incorporación del nucleótido, tal como la liberación de pirofosfato; o similar. En realizaciones, donde dos o más nucleótidos diferentes están presentes en un reactivo de secuenciación, los diferentes nucleótidos se pueden distinguir unos de otros, o alternativamente, los dos o más marcadores diferentes pueden ser indistinguibles bajo las técnicas de detección que se utilizan. Por ejemplo, los diferentes nucleótidos presentes en un reactivo de secuenciación pueden tener diferentes etiquetas y pueden distinguirse usando ópticas apropiadas como se ejemplifica mediante los métodos de secuenciación desarrollados por Solexa (ahora Illumina, Inc.).

Las realizaciones incluyen técnicas de pirosecuenciación. La pirosecuenciación detecta la liberación de pirofosfato inorgánico (PPi) a medida que se incorporan nucleótidos particulares en la cadena naciente (Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M. and Nyren, P. (1996) "Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release". Analytical Biochemistry 242 (1), 84-9; Ronaghi, M. (2001) "Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing". Genome Res. 11 (1), 3-11; Ronaghi, M., Uhlen, M. y Nyren, P. (1998) "A sequencing method based on real-time pyrophosphate". Sciencie 281 (5375), 363; los documentos de Patente U.S. Pat No. 6,210,891; U.S. Pat. No. 6,258,568 y U.S. Pat. No. 6,274,320).

En la pirosecuenciación, el PPi liberado puede detectarse convirtiéndolo inmediatamente en trifosfato de adenosina (ATP) mediante la ATP sulfurilasa, y el nivel de ATP generado se detecta mediante fotones producidos por luciferasa. Los ácidos nucleicos que se van a secuenciar se pueden unir a características en una matriz y la matriz puede formarse imágenes para capturar las señales quimioluminiscentes que se producen debido a la incorporación de nucleótidos en las características de la matriz. Se puede obtener una imagen después de que la matriz se trate con un tipo de nucleótido particular (por ejemplo, A, T, C o G). Las imágenes obtenidas después de la adición de cada tipo de nucleótido diferirán con respecto a las características en la matriz que se detecten. Estas diferencias en la imagen reflejan el contenido de secuencia diferente de las características en la matriz. Sin embargo, las localizaciones relativas de cada característica permanecerán sin cambios en las imágenes. Las imágenes pueden almacenarse, procesarse y analizarse utilizando los métodos establecidos en la presente memoria. Por ejemplo, las imágenes obtenidas después del tratamiento de la matriz con cada tipo de nucleótido diferente se pueden manejar de la misma manera que se ejemplifica en la presente memoria para las imágenes obtenidas de diferentes canales de detección para métodos de secuenciación basados en terminadores reversibles.

En otro tipo ejemplar de SBS, la secuenciación del ciclo se logra mediante la adición escalonada de nucleótidos terminadores reversibles que contienen, por ejemplo, una etiqueta de colorante escindible o fotoblanqueable como se describe, por ejemplo, en los documentos de Patente WO 04/018497 y U.S. Pat. No. 7,057,026.

Este enfoque está siendo comercializado por Solexa (ahora Illumina Inc.), y también se describe en los documentos de Patente WO 91/06678 y WO 07/123,744, la disponibilidad de terminadores marcados con fluorescencia en los que tanto la terminación puede invertirse como la etiqueta fluorescente escindida facilita la secuenciación eficaz de terminación cíclica reversible (CRT). Las polimerasas también pueden diseñarse conjuntamente para incorporar y extenderse eficazmente a partir de estos nucleótidos modificados.

Preferiblemente, en realizaciones de secuenciación basadas en terminadores reversibles, las etiquetas no inhiben sustancialmente la extensión en las condiciones de reacción de SBS. Sin embargo, las etiquetas de detección pueden eliminarse, por ejemplo, mediante escisión o degradación. Las imágenes pueden capturarse tras la incorporación de etiquetas en características de ácidos nucleicos en matriz. En realizaciones particulares, cada ciclo implica el suministro simultáneo de cuatro tipos de nucleótidos diferentes a la matriz y cada tipo de nucleótido tiene una etiqueta espectralmente distinta. A continuación, se pueden obtener cuatro imágenes, cada una de las cuales utiliza un canal de detección que es selectivo para una de las cuatro etiquetas diferentes. Alternativamente, se pueden añadir secuencialmente diferentes tipos de nucleótidos y se puede obtener una imagen de la matriz entre cada etapa de adición. En dichas realizaciones, cada imagen mostrará características de ácido nucleico que han incorporado nucleótidos de un tipo particular. Diferentes características estarán presentes o ausentes en las diferentes imágenes debido al diferente contenido de secuencia de cada característica. Sin embargo, la posición relativa de las características permanecerá sin cambios en las imágenes. Las imágenes obtenidas a partir de dichos métodos de terminador reversible-SBS pueden almacenarse, procesarse y analizarse como se establece en la presente memoria. Después de la etapa de captura de imágenes, las etiquetas se pueden eliminar y los restos terminadores reversibles se pueden eliminar para los ciclos posteriores de adición y detección de nucleótidos. La eliminación de las etiquetas después de que se hayan detectado en un ciclo particular y antes de un ciclo posterior puede proporcionar la ventaja de reducir la señal de fondo y la diafonía entre ciclos. A continuación, se exponen ejemplos de etiquetas útiles y métodos de eliminación.

En realizaciones particulares, algunos o todos los monómeros de nucleótidos pueden incluir terminadores reversibles. En dichas realizaciones, los terminadores reversibles/flúores escindibles pueden incluir flúor unido al resto de ribosa a través de un enlace éster en 3' (Metzker, Genome Res. 15: 1767-1776 (2005)).

Otros enfoques han separado la química del terminador de la escisión de la etiqueta de fluorescencia (Ruparel et al., Proc Natl Acad Sci USA 102: 5932-7 (2005)). Ruparel et al describieron el desarrollo de terminadores reversibles que usaban un pequeño grupo alilo en 3' para bloquear la extensión, pero que podían desbloquearse fácilmente mediante un tratamiento corto con un catalizador de paladio. El fluoróforo se unió a la base mediante un enlazador fotoescindible que podría escindirse fácilmente mediante una exposición de 30 segundos a luz UV de longitud de onda larga. Por tanto, se puede utilizar la reducción con disulfuro o la fotoescisión como enlazador escindible. Otro enfoque para la terminación reversible es el uso de la terminación natural que se produce después de la colocación de un colorante voluminoso en un dNTP. La presencia de un colorante voluminoso cargado en el dNTP puede actuar como un terminador eficaz a través de un impedimento estérico y/o electrostático. La presencia de un suceso de incorporación evita otras incorporaciones a menos que se elimine el colorante. La escisión del colorante elimina el flúor e invierte eficazmente la terminación. También se describen ejemplos de nucleótidos modificados en los documentos de Patente U.S. Pat. No. 7,427,673, y U.S. Pat. No. 7,057,026.

Los sistemas y métodos de SBS ejemplares adicionales que se pueden utilizar con los métodos y sistemas descritos en la presente memoria se describen en las solicitudes de Patente U.S. Patent Application Publication No.

2007/0166705, U.S. Patent Application Publication No. 2006/0188901, U.S. Pat. No. 7,057,026, U.S. Patent Application Publication No. 2006/0240439, U.S. Patent Application Publication No. 2006/0281109, PCT Publication No. WO 05/065814, U.S. Patent Application Publication No. 2005/0100900, PCT Publication No. WO 06/064199, PCT Publication No. w O 07/010,251, U.S. Patent Application Publication No. 2012/0270305 y U.S. Patent Application Publication No. 2013/0260372.

Algunas realizaciones pueden utilizar la detección de cuatro nucleótidos diferentes usando menos de cuatro etiquetas diferentes. Por ejemplo, la técnica de SBS se puede realizar utilizando métodos y sistemas descritos en los materiales incorporados de la solicitud de Patente U.S. Patent Application Publication No. 2013/0079232. Como primer ejemplo, se puede detectar un par de tipos de nucleótidos en la misma longitud de onda, pero distinguir en función de la diferencia de intensidad de un miembro del par en comparación con el otro, o en función de un cambio en un miembro del par (por ejemplo, mediante modificación química, modificación fotoquímica o modificación física) que hace que la señal aparente aparezca o desaparezca en comparación con la señal detectada para el otro miembro del par. Como segundo ejemplo, se pueden detectar tres de los cuatro tipos de nucleótidos diferentes en condiciones particulares, mientras que un cuarto tipo de nucleótidos carece de una etiqueta que sea detectable en esas condiciones, o se detecta mínimamente en esas condiciones (por ejemplo, detección mínima debido a la fluorescencia de fondo, etc.). La incorporación de los primeros tres tipos de nucleótidos en un ácido nucleico se puede determinar basándose en la presencia de sus respectivas señales y la incorporación del cuarto tipo de nucleótidos en el ácido nucleico se puede determinar basándose en la ausencia o detección mínima de cualquier señal. Como tercer ejemplo, un tipo de nucleótidos puede incluir etiqueta (s) que se detectan en dos canales diferentes, mientras que otros tipos de nucleótidos se detectan en no más de uno de los canales. Las tres configuraciones ejemplares mencionadas anteriormente no se consideran mutuamente excluyentes y pueden usarse en varias combinaciones. Una realización ejemplar que combina los tres ejemplos es un método de SBS basado en fluorescentes que utiliza un primer tipo de nucleótido que se detecta en un primer canal (por ejemplo, dATP que tiene una etiqueta que se detecta en el primer canal cuando se excita mediante una primera longitud de onda de excitación), un segundo tipo de nucleótido que se detecta en un segundo canal (por ejemplo, dCTP que tiene una etiqueta que se detecta en el segundo canal cuando se excita mediante una segunda longitud de onda de excitación), un tercer tipo de nucleótido que se detecta tanto en el primer como en el segundo canal ( por ejemplo, dTTP que tiene al menos una etiqueta que se detecta en ambos canales cuando se excita con la primera y/o segunda longitud de onda de excitación) y un cuarto tipo de nucleótido que carece de una etiqueta que no se detecta, o mínimamente, en ninguno de los canales (por ejemplo, dGTP que no tiene etiqueta).

Además, como se describe en la solicitud de Patente U.S. Patent Application Publication No. 2013/0079232, los datos de secuenciación se pueden obtener utilizando un solo canal. En los llamados enfoques de secuenciación de un colorante, el primer tipo de nucleótido se marca, pero la etiqueta se elimina después de que se genera la primera imagen, y el segundo tipo de nucleótido se etiqueta solo después de que se genera una primera imagen. El tercer tipo de nucleótido conserva su etiqueta tanto en la primera como en la segunda imagen, y el cuarto tipo de nucleótido permanece sin etiquetar en ambas imágenes.

Algunas realizaciones pueden utilizar secuenciación mediante técnicas de ligación. Dichas técnicas utilizan DNA ligasa para incorporar oligonucleótidos e identificar la incorporación de dichos oligonucleótidos. Los oligonucleótidos tienen típicamente diferentes etiquetas que se correlacionan con la identidad de un nucleótido particular en una secuencia a la que se hibridan los oligonucleótidos. Al igual que con otros métodos de SBS, se pueden obtener imágenes tras el tratamiento de una matriz de características de ácidos nucleicos con los reactivos de secuenciación marcados. Cada imagen mostrará características de ácidos nucleicos que han incorporado etiquetas de un tipo particular. Diferentes características estarán presentes o ausentes en las diferentes imágenes debido al diferente contenido de secuencia de cada característica, pero la posición relativa de las características permanecerá sin cambios en las imágenes. Las imágenes obtenidas a partir de métodos de secuenciación basados en ligación pueden almacenarse, procesarse y analizarse como se establece en la presente memoria. Los sistemas y métodos de SBS ejemplares que se pueden utilizar con los métodos y sistemas descritos en la presente memoria se describen en los documentos de Patente U.S. Pat. No. 6,969,488, U.S. Pat. No. 6,172,218, y U.S. Pat. No. 6,306,597.

La secuenciación por ligación es un método bien conocido para la secuenciación que requiere la irradiación repetida o prolongada de sondas di-base con luz. Los sistemas ejemplares que utilizan secuenciación por síntesis incluyen el sistema SOLiD ™ de Applied Biosystems (Life Technologies, Carlsbad, CA). Brevemente, los métodos para secuenciar por ligación incluyen la hibridación de cebadores de secuenciación a secuencias adaptadoras inmovilizadas en perlas plantilla. Un conjunto de cuatro sondas di-base marcadas con fluorescencia compiten por la ligación al cebador de secuenciación. La especificidad de la sonda di-base se logra interrogando cada 1a y 2a base en cada reacción de ligación. Después de una serie de ciclos de ligación, se elimina el producto de extensión y la plantilla se restablece con un cebador de secuenciación complementario a la posición n-1 para una segunda ronda de ciclos de ligación. Se realizan múltiples ciclos de ligación, detección y escisión, determinando el número de ciclos la longitud de lectura eventual.

Además, los métodos y soluciones descritos en la presente memoria pueden ser particularmente útiles para secuenciar a partir de una matriz de ácidos nucleicos, donde se pueden leer múltiples secuencias simultáneamente desde múltiples posiciones en la matriz, ya que cada nucleótido en cada posición puede identificarse basándose en su etiqueta identificable. Los métodos ejemplares se describen en los documentos de Patente US 2009/0088327; US 2010/0028885; y US 2009/0325172

Algunas realizaciones pueden utilizar secuenciación por nanoporos (Deamer, D. W. & Akeson, M. "Nanopores and nucleic acids: prospects for ultrarapid sequencing". Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000); Deamer, D. and D. Branton, "Characterization of nucleic acids by nanopore analysis". Acc. Chem. Res. 35: 817-825 (2002)); Li, J., M. Gershow, D. Stein, E. Brandin and J. A. Golovchenko, "DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope" Nat. Mater. 2: 611-615 (2003)).

En dichas realizaciones, el ácido nucleico diana pasa a través de un nanoporo. El nanoporo puede ser un poro sintético o una proteína de membrana biológica, tal como la a -hemolisina. A medida que el ácido nucleico diana pasa a través del nanoporo, cada par de bases se puede identificar midiendo las fluctuaciones en la conductancia eléctrica del poro. (documento de Patente U.S. Pat. No. 7,001,792; Soni, G.V. & Meller, "A. Progress toward ultrafast DNA sequencing using solid-state nanopores". Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007); Healy, K. "Nanopore-based single-molecule DNA analysis". Nanomed. 2, 459-481 (2007); Cockroft, S. L., Chu, J., Amorin, M. & Ghadiri, M. R. "A single-molecule nanopore device detects DNA polymerase activity with single-nucleotide resolution". J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008)).

Los datos obtenidos de la secuenciación por nanoporos se pueden almacenar, procesar y analizar cómo se establece en la presente memoria. En particular, los datos se pueden tratar como una imagen según el tratamiento ejemplar de imágenes ópticas y otras imágenes que se exponen en la presente memoria. En determinadas realizaciones, se puede utilizar un solo poro para contener la cadena de DNA, dos de los cuales dos o más cebadores se hibridan. Después se puede realizar una secuenciación basada en óptica por síntesis.

Algunas realizaciones pueden utilizar métodos que implican la monitorización en tiempo real de la actividad de la DNA polimerasa. Las incorporaciones de nucleótidos se pueden detectar a través de interacciones de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre una polimerasa que lleva fluoróforo y nucleótidos marcados con Y-fosfato como se describe, por ejemplo, en los documentos de Patente U.S. Pat. No. 7,329,492 y U.S. Pat. No.

7,211,414 o las incorporaciones de nucleótidos se pueden detectar con guías de onda de modo cero como se describe, por ejemplo, en el documento de Patente U.S. Pat No. 7,315,019 y usando análogos de nucleótidos fluorescentes y polimerasas modificadas como se describe, por ejemplo, en el documento de Patente U.S. Pat. No. 7,405,281 y en la solicitud de Patente U.S. Patent Application Publication No. 2008/0108082.

La iluminación se puede restringir a un volumen de escala de zeptolitros alrededor de una polimerasa unida a la superficie de modo que se pueda observar la incorporación de nucleótidos marcados con fluorescencia con un fondo bajo (Levene, M. J. et al. "Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations". Science 299, 682-686 (2003); Lundquist, P. M. et al. "Parallel confocal detection of single molecules in real time". Opt. Lett 33, 1026­ 1028 (2008); Korlach, J. et al. "Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nano structures". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008)): Las imágenes obtenidas de dichos métodos se pueden almacenar, procesar y analizar cómo se establece en la presente memoria. En ciertas realizaciones, pueden estar presentes dos polimerasas en el fondo de cada pocillo, generando cada una de las cuales datos de secuencia a partir de un cebador diferente unido a la misma molécula plantilla.

Algunas realizaciones de SBS incluyen la detección de un protón liberado tras la incorporación de un nucleótido en un producto de extensión. Por ejemplo, la secuenciación basada en la detección de protones liberados puede usar un detector eléctrico y técnicas asociadas que están disponibles comercialmente en Ion Torrent (Guilford, CT, una subsidiaria de Life Technologies) o métodos y sistemas de secuenciación descritos en los documentos de Patente US 2009/0026082 A1; US 2009/0127589 A1; US 2010/0137143 A1; o US 2010/0282617 A1. Más específicamente, los métodos establecidos en la presente memoria pueden usarse para producir poblaciones clonales de amplicones que se usan para detectar protones. En una realización que usa un método de pirosecuenciación, que usa dos o más cebadores por cadena de ácido nucleico puede significar más señal por unidad de tiempo para deconvolucionar. En el método de pirosecuenciación, el doble de la caída normal en el pH cuando se nivela T puede significar que 1 de los cebadores tuvo una incorporación de TT, o que cada cebador tuvo una única incorporación de T.

Los métodos anteriores se pueden llevar a cabo de manera ventajosa en formatos multiplex de modo que se manipulen simultáneamente múltiples ácidos nucleicos diana diferentes. En realizaciones particulares, se pueden tratar diferentes ácidos nucleicos diana en un recipiente de reacción común o en una superficie de un sustrato particular. Esto permite el suministro conveniente de reactivos de secuenciación, la eliminación de reactivos que no han reaccionado y la detección de sucesos de incorporación de una manera multiplex. En realizaciones que usan ácidos nucleicos diana unidos a la superficie, los ácidos nucleicos diana pueden estar en un formato de matriz. En un formato de matriz, los ácidos nucleicos diana pueden unirse típicamente a una superficie de una manera espacialmente distinguible. Los ácidos nucleicos diana pueden unirse mediante unión covalente directa, unión a una perla u otra partícula o unión a una polimerasa u otra molécula que esté unida a la superficie. La matriz puede incluir una única copia de un ácido nucleico diana en cada sitio (también denominado como una característica) o pueden estar presentes múltiples copias que tienen la misma secuencia en cada sitio o característica. Pueden producirse múltiples copias mediante métodos de amplificación tales como amplificación en puente o PCR de emulsión como se describe con más detalle a continuación.

Los métodos establecidos en la presente memoria pueden usar matrices que tengan características en cualquiera de una variedad de densidades que incluyen, por ejemplo, al menos aproximadamente 10 características/cm2, 100 características/cm2, 500 características/cm2, 1000 características/cm2, 5000 características/cm2, 10000 características/cm2, 50000 características/cm2, 100000 características/cm2, 1000000 características/cm2, 5000000 características/cm2, o más alto.

Una ventaja de los métodos expuestos en la presente memoria es que proporcionan una detección rápida y eficaz de una pluralidad de ácidos nucleicos diana en paralelo. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona sistemas integrados capaces de preparar y detectar ácidos nucleicos usando técnicas conocidas en la técnica tales como las ejemplificadas anteriormente. Por tanto, un sistema integrado de la presente divulgación puede incluir componentes fluídicos capaces de suministrar reactivos de amplificación y/o reactivos de secuenciación a uno o más fragmentos de DNA inmovilizados, comprendiendo el sistema componentes tales como bombas, válvulas, depósitos, líneas fluídicas y similares. Una celda de flujo puede configurarse y/o usarse en un sistema integrado para la detección de ácidos nucleicos diana. Se describen celdas de flujo ejemplares, por ejemplo, en los documentos de Patente US 2010/0111768 A1 y US 2012/0270305.

Como se ejemplifica para las celdas de flujo, uno o más de los componentes fluídicos de un sistema integrado pueden usarse para un método de amplificación y para un método de detección. Tomando una realización de secuenciación de ácidos nucleicos como ejemplo, se pueden usar uno o más de los componentes fluídicos de un sistema integrado para un método de amplificación establecido en la presente memoria y para el suministro de reactivos de secuenciación en un método de secuenciación tal como los ejemplificados anteriormente. Alternativamente, un sistema integrado puede incluir sistemas fluídicos separados para llevar a cabo métodos de amplificación y para llevar a cabo métodos de detección. Los ejemplos de sistemas de secuenciación integrados que son capaces de crear ácidos nucleicos amplificados y también de determinar la secuencia de los ácidos nucleicos incluyen, sin limitación, la plataforma MiSeq™ (Illumina, Inc., San Diego, CA) y los dispositivos descritos en el documento de Patente US 2012/0270305.

Amplificación de ácidos nucleicos

En algunas realizaciones, los fragmentos de DNA inmovilizados se amplifican usando metodologías de amplificación de agrupaciones como se ejemplifica en las descripciones de los documentos de Patente US Patent Nos.

7.985.565 y 7,1 15,400. Los documentos de Patente US Patent Nos. 7,985,565 y 7,115,400 describen métodos de amplificación de ácido nucleico en fase sólida que permiten inmovilizar productos de amplificación sobre un soporte sólido para formar matrices compuestas por agrupaciones o "colonias" de moléculas de ácido nucleico inmovilizadas. Cada agrupación o colonia en dicha matriz se forma a partir de una pluralidad de cadenas polinucleotídicas inmovilizadas idénticas y una pluralidad de cadenas polinucleotídicas complementarias inmovilizadas idénticas. Las matrices así formadas se denominan generalmente en la presente memoria como "matrices agrupadas". Los productos de reacciones de amplificación en fase sólida como las descritas en los documentos de Patente US Patent Nos.

7.985.565 y 7,115,400 son las denominadas estructuras "puenteadas" formadas por hibridación de pares de cadenas polinucleotídicas inmovilizadas y cadenas complementarias inmovilizadas, estando ambas cadenas inmovilizadas sobre el soporte sólido en el extremo 5', preferiblemente mediante una unión covalente. Las metodologías de amplificación de agrupaciones son ejemplos de métodos en los que se usa una plantilla de ácido nucleico inmovilizado para producir amplicones inmovilizados. También pueden usarse otras metodologías adecuadas para producir amplicones inmovilizados a partir de fragmentos de DNA inmovilizados producidos según los métodos proporcionados en la presente memoria. Por ejemplo, se pueden formar una o más agrupaciones o colonias mediante PCR en fase sólida, si uno o ambos cebadores de cada par de cebadores de amplificación estén inmovilizados.

En otras realizaciones, los fragmentos de DNA inmovilizados se amplifican en solución. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los fragmentos de DNA inmovilizados se escinden o se liberan de otro modo del soporte sólido y los cebadores de amplificación se hibridan después en solución a las moléculas liberadas. En otras realizaciones, los cebadores de amplificación se hibridan a los fragmentos de DNA inmovilizados para una o más etapas de amplificación iniciales, seguidas de las etapas de amplificación posteriores en solución. Por tanto, en algunas realizaciones se puede usar una plantilla de ácido nucleico inmovilizado para producir amplicones en fase de solución.

Se apreciará que cualquiera de las metodologías de amplificación descritas en la presente memoria o generalmente conocidas en la técnica se puede utilizar con cebadores universales o específicos de la diana para amplificar fragmentos de DNA inmovilizados. Los métodos adecuados para la amplificación incluyen, pero no se limitan a, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), la amplificación mediada por transcripción (TMA) y la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA), como se describe en el documento de Patente U.S. Patent No. 8,003,354.

Los métodos de amplificación anteriores se pueden emplear para amplificar uno o más ácidos nucleicos de interés. Por ejemplo, se puede utilizar PCR, que incluye PCR multiplex, SDA, TMA, NASBA y similares para amplificar fragmentos de DNA inmovilizados. En algunas realizaciones, los cebadores dirigidos específicamente al ácido nucleico de interés se incluyen en la reacción de amplificación.

Otros métodos adecuados para la amplificación de ácidos nucleicos pueden incluir extensión y ligación de oligonucleótidos, amplificación por círculo rodante [RCA] (Lizardi et al., Nat Genet. 19: 225-232 (1998)) y las tecnologías de ensayo de ligación de oligonucleótidos (OLA) (véase, en general, los documentos de Patente U.S. Pat. Nos. 7,582,420, 5,185,243, 5,679,524 y 5,573,907; EP 0 320 308 B1; EP 0 336 731 B1; EP 0 439 182 B1; WO 90/01069; WO 89/12696; y WO 89/09835). Se apreciará que estas metodologías de amplificación pueden diseñarse para amplificar fragmentos de DNA inmovilizados. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el método de amplificación puede incluir reacciones de amplificación con sonda de ligación o ensayo de ligación de oligonucleótidos (OLA) que contienen cebadores dirigidos específicamente al ácido nucleico de interés. En algunas realizaciones, el método de

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar la secuencia de un ácido nucleico que comprende:

- proporcionar al menos un ácido nucleico unido a un soporte;

- poner en contacto el ácido nucleico con una enzima en presencia de (i) al menos dos cebadores capaces de hibridar a la misma hebra de dicho al menos un ácido nucleico en diferentes posiciones y (ii) cuatro restos marcados que comprenden cada uno un análogo de nucleótido diferente seleccionado de dGTP, dCTP, dTTP, dUTP y dATP, teniendo cada uno de los cuatro restos marcados una etiqueta única que es diferente de las etiquetas únicas de los otros tres restos marcados, en condiciones que permiten la hibridación;

- hibridar los al menos dos cebadores a la misma cadena del ácido nucleico;

- realizar extensiones de cebador en dicha misma cadena del ácido nucleico en cada uno de los al menos dos cebadores para dar una pluralidad de lecturas de extensión, extendiendo cada lectura de extensión desde uno de los al menos dos cebadores, en donde el mismo conjunto de cuatro restos marcados se utiliza para cada lectura de extensión;

- obtener datos de señales que corresponden a al menos una base de nucleótidos incorporada en cada una de las extensiones del cebador; y

- determinar a partir de dichos datos de señal la identidad de las bases de nucleótidos y asignar dichas bases a una lectura de extensión;

en donde los al menos dos cebadores comprenden cebadores bloqueados y no bloqueados para diferenciar químicamente entre cada lectura de extensión; en donde los al menos dos cebadores comprenden niveles diferentes de cebadores bloqueados y no bloqueados de manera que la pluralidad de lecturas de extensión se diferencian químicamente haciendo que una de las lecturas sea más brillante que la otra.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el método comprende una etapa de eliminar restos marcados no unidos.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la pluralidad de lecturas de extensión comprende lecturas de extensión simultáneas.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los cuatro restos marcados comprenden cada uno un único análogo de nucleótido de terminación reversible o un análogo de terminador reversible seleccionado de dGTP, dCTP, dTTP, dUTP y dATP.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la enzima comprende una polimerasa o ligasa.

6. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que el soporte comprende un chip o perla.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la etiqueta única comprende un colorante, un fluoróforo, un cromóforo, una etiqueta de transferencia de energía de fluorescencia combinatoria, una etiqueta de masa o un electróforo.

8. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que los al menos dos cebadores tienen secuencias superpuestas y/o se diferencian por la adición de una sola base.

9. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que se usa información bioinformática para asignar las bases a la lectura de extensión.

10. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que los datos de señal que corresponden a cada una de las al menos dos extensiones de cebador se obtienen simultáneamente.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la etapa de determinar la identidad de las bases de nucleótidos comprende analizar un perfil de intensidad de señal que corresponde a las etiquetas únicas detectadas en cada una de la pluralidad de lecturas de extensión.

12. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que los datos de la señal comprenden una o más imágenes, en el que opcionalmente los datos de la señal se detectan como señales de color que corresponden a una pluralidad de análogos de nucleótidos incorporados en las extensiones del cebador y en el que cada señal de color corresponde a un análogo de nucleótidos diferente o combinación de análogos de nucleótidos.

13. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que el método comprende una etapa de procesamiento de señales que comprende una o más deconvolución de señales, refinamiento de señales y selección de señales.

14. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que se realizan múltiples llamadas de bases en cada ciclo de hibridación.

15. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que la etapa de asignar las bases a una lectura de extensión comprende determinar la posición de las bases de nucleótidos y/o proporcionar una llamada de base preliminar y una llamada de base final para cada lectura de extensión, en donde opcionalmente la llamada de base final se proporciona mediante la comparación de los datos de la llamada base preliminar con un genoma de referencia.