CN102140534A

CN102140534A - 一种hbv基因的核苷酸突变位点的检测方法

Info

Publication number: CN102140534A
Application number: CN2010106099169A
Authority: CN
Inventors: 韩颖鑫; 赵艳敏; 易鑫
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2010-12-15
Filing date: 2010-12-15
Publication date: 2011-08-03

Abstract

本发明主要涉及HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法，所述方法包括如下步骤：(1)针对HBV基因序列可能存在的突变位点在序列中的位置设计两对巢式PCR扩增引物，用所述第一对PCR扩增引物对待测样本中的DNA进行第一轮PCR扩增，然后再以第一轮PCR的扩增产物为模板，用所述第二对PCR扩增引物进行第二轮PCR扩增；(2)对在步骤(1)中得到的扩增产物进行测序；(3)对在步骤(2)中得到的测序结果进行数据分析，确定突变位点。本发明还公开了利用上述方法进行检测的检测试剂盒。

Description

一种HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法

技术领域

本发明属于基因组学和分子生物学中有机生物分子领域，具体而言涉及HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法和检测试剂盒。

背景技术

自然界大多数生物体的遗传信息均包含在脱氧核糖核酸(DNA)中，人类全基因组中30亿个碱基，约4万个基因，分布在24对染色体上。每个基因通过转录、翻译，编码特异的蛋白质，调控生物体内特定的生化反应，发挥特异的生物学功能。DNA序列的改变，即基因突变，会导致蛋白质结构、功能的改变或缺失，进而引起相关的遗传疾病。基因突变包括DNA分子中发生碱基对的插入、缺失和改变(点突变)。

研究表明许多疾病的发生，如血友病、地中海贫血、杜氏型肌营养不良、亨廷顿舞蹈症、老年痴呆症、糖尿病、肥胖症、心血管疾病以及自身免疫等3000多个疾病与基因突变密切相关。另外，近年来人们逐渐认识到癌症的发生发展也是基因累积突变的结果。

在人类基因组中，约90％的差异是以单个核苷酸的差异体现出来的，主要由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，这样的差异位点称作单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)。在人群中，这种变异的发生频率至少要大于1％，否则被认为是点突变。SNP位点大多数为双态，即在一个位点上仅有两种表现形式，并且在人类基因组中广泛存在，平均每500-1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。这些差异极有可能是造成个体差异的遗传因素，因此发现这些位点可广泛地应用于遗传标记的研究、评估个体遗传关系、评估物种进化等研究领域。

目前检测SNP和基因突变的方法有许多种，如直接PCR测序、RFLP、基因芯片和荧光定量PCR等。其中，RFLP分析只能检测出在病毒总体中大于5％的突变株，但是对于每个感兴趣的突变，必须特别设计单独的核酸内切酶。针对某些突变的特异性内切酶可能并不存在，因此RFLP分析并不适用于所有的突变。基因芯片技术利用寡核苷酸微点阵，可以检测新发现的突变，但这种方法代价昂贵，没有得到广泛应用。总之，上述这些方法不是费时费力，灵敏度低，准确度低，就是成本高，不适合大规模筛查。

乙型肝炎病毒(HBV)及其基因

全球有超过350万人患有慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染，每年由于感染HBV死亡的人数有50万到120万，而约有75％的乙肝患者在亚洲。我国是HBV感染高发区，因此对乙肝的治疗刻不容缓。

乙肝病毒是一种易高度变异的病毒，在其逆转录复制过程中因RNA聚合酶和逆转录酶缺乏校正功能，可发生一个或多个核苷酸的变异。HBV-DNA可以在慢性持续性感染过程中自然变异，也可以在免疫压力下发生变异，甚至在各种抗病毒治疗药物诱导下变异。近年来，核苷类药物已成为乙型肝炎治疗的主要方法之一，目前最常用的核苷类药物是拉米夫定(LAM)、阿德福韦酯(ADV)、恩替卡韦(ENT)、替比夫定(LdT)、恩曲他滨(FTC)和替诺福韦酯(TDF)。由于HBV病毒复制能力极强，因此也极易产生耐药，而一旦耐药可能会有爆发性肝炎的危险。因此对这六种核苷类药物耐药突变的检测应该有更加重要的临床意义。

HBV基因的核苷酸突变位点的测序检测

目前本领域中已有使用测序分析进行核苷酸突变位点检测的方法，但是在现有的方法中通常对低拷贝数的样品无法进行检测。因此，本领域中亟需新的检测HBV基因的核苷酸突变位点的方法，从而实现对HBV基因的多个核苷酸突变位点和突变型的灵敏、快速、简便并且成本低廉的检测。

发明内容

本发明的第一方面提供一种待测样本中HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法，包括如下步骤：

(1)针对HBV基因序列可能存在的突变位点在序列中的位置设计两对巢式PCR扩增引物，用所述第一对PCR扩增引物对待测样本中的DNA进行第一轮PCR扩增，然后再以第一轮PCR的扩增产物为模板，用所述第二对PCR扩增引物进行第二轮PCR扩增；

(2)对在步骤(1)中得到的扩增产物进行测序；

(3)对在步骤(2)中得到的测序结果进行数据分析，确定突变位点。

在一个优选实施方案中，

所述第一对PCR扩增引物为：

上游：5’-TCCTGCTGGTGGCTCCAGT-3’(SEQ ID NO：1)；

下游：5’-GCAACGGGGTAAAGGTTCA-3’(SEQ ID NO：2)；

所述第二对PCR扩增引物为：

上游：5’-TGGACTTCTCTCAATTTTCT-3’(SEQ ID NO：3)；

下游：5’-TGACAGACTTTCCAATCAAT-3’(SEQ ID NO：4)。

在另一个优选实施方案中，所述待测样本选自血浆、血清、全血、纯病毒培养物和携带此类病毒的媒介生物。

在另一个优选实施方案中，所述测序方法为第一代测序方法；在更优选的实施方案中，所述测序方法为Sanger法；在更加优选的实施方案中，采用3730测序仪(ABI)进行测序。

在另一个优选实施方案中，所述测序方法为第二代测序方法；在更优选的实施方案中，所述测序方法为SOLEXA测序或454测序法。

在另一个优选实施方案中，所述核苷酸突变位点包括rtL80I/V、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181T/V、rtN236T、rtT184G/S/A/I/L/F、rtA194T、rtS202I/G、rtM204V/I和rtM250V/I/L。

在另一个优选实施方案中，在步骤1)和步骤2)之间纯化所述PCR扩增产物；在更优选的实施方案中，在步骤(1)和步骤(2)之间用凝胶电泳切胶纯化法纯化所述PCR扩增产物。

本发明的第二方面提供一种HBV基因的核苷酸突变位点的检测试剂盒，该试剂盒包括两对巢式PCR扩增引物，可按照在本发明第一方面中描述的方法对HBV基因的核苷酸突变位点进行检测。

在一个优选实施方案中，在本发明试剂盒中

所述第一对PCR扩增引物为：

上游：5’-TCCTGCTGGTGGCTCCAGT-3’(SEQ ID NO：1)；

下游：5’-GCAACGGGGTAAAGGTTCA-3’(SEQ ID NO：2)；

所述第二对PCR扩增引物为：

上游：5’-TGGACTTCTCTCAATTTTCT-3’(SEQ ID NO：3)；

下游：5’-TGACAGACTTTCCAATCAAT-3’(SEQ ID NO：4)。

在另一个优选实施方案中，本发明试剂盒还包括PCR试剂、测序试剂、阴性及阳性对照和说明书等。

在另一个优选实施方案中，本发明试剂盒检测的核苷酸突变位点包括rtL80I/V、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181T/V、rtN236T、rtT184G/S/A/I/L/F、rtA194T、rtS202I/G、rtM204V/I和rtM250V/I/L。

在另一个优选实施方案中，本发明试剂盒检测的待测样本选自血浆、血清、全血、纯病毒培养物和携带此类病毒的媒介生物。

本发明的第三方面提供本发明试剂盒用于检测HBV基因的核苷酸突变位点的用途。

本发明的第四方面提供SEQ ID NO：1-4的核苷酸序列。

本发明的第五方面提供SEQ ID NO：1-4的核苷酸序列作为扩增引物用于HBV基因的核苷酸突变位点的检测的用途。

附图说明

在参考HBV S基因不同蛋白功能区分以及目前HIV聚合酶蛋白编号方式的基础上，2001年开始HBV聚合酶编号自每个区域的第一氨基酸开始的标准编号系统，HBV聚合酶可以分成末端蛋白、间隔区、逆转录酶区及核糖核酸酶4个区域，依次缩写为TP、SD、RT、RNase。逆转录酶区从高度保守的EDWGPCDEHG氨基酸序列开始，E(谷氨酸)作为逆转录酶区的第一个氨基酸，可以写为rt E1.例如：rt L80V，其中rt代表逆转录酶区，数字1代表该区第一个氨基酸，1前面的是野生型氨基酸的缩写，后面是突变型氨基酸的缩写。进一步详细说明各位点的附图。附图是对所述各种突变位点的检测结果。

图1中逆转录酶区第80个氨基酸(即80位点)野生型氨基酸为亮氨酸(简写为L)，在HBV病毒基因中对应的密码子为TTA或CTA，测序结果显示该样品的80位点的密码子一个核苷酸突变为G，密码子GTA对应的氨基酸为缬氨酸(简写为V)，故而写成rt L80V.

图2中逆转录酶区第169个氨基酸(即169位点)野生型氨基酸为异亮氨酸(简写为I)，在HBV病毒基因中对应的密码子为ATA或ATT，测序结果显示该样品的169位点的密码子ATT，对应的氨基酸未发生变化，故而写成rt I169I.

图3中逆转录酶区第173个氨基酸(即173位点)野生型氨基酸为缬氨酸(简写为V)，在HBV病毒基因中对应的密码子为GTG，测序结果显示该样品的173位点为TTG，对应的氨基酸为亮氨酸(简写为L)，故而写成rt V173L.

图4中逆转录酶区第180个氨基酸(即180位点)野生型氨基酸为亮氨酸(简写为L)，在HBV病毒基因中对应的密码子为TTG或CTG，测序结果显示该样品的180位点的密码子一个核苷酸为C和A的嵌合峰，说明HBV准种中有少部分病毒的基因在该位点为突变型ATG，大部分为CTG，野生型与突变型同时存在，故而写成rt L180L/M.

图5中逆转录酶区第181个氨基酸(即181位点)野生型氨基酸为丙氨酸(简写为A)，在HBV病毒基因中对应的密码子为GCT，测序结果显示该该样品的181位点为GTT，对应的氨基酸为缬氨酸(简写为V)，故而写成rt A181V.

图6中逆转录酶区第184个氨基酸(即184位点)野生型氨基酸为苏氨酸(简写为T)，在HBV病毒基因中对应的密码子为ACT，测序结果显示该样品的184位点为CTT，对应的氨基酸为亮氨酸(简写为L)，故而写成rt T184L.

图7中逆转录酶区第194个氨基酸(即194位点)野生型氨基酸为丙氨酸(简写为A)，在HBV病毒基因中对应的密码子为GCT，测序结果显示该样品的194位点为GCT，未发生变化，故而写成rt A194A.

图8中逆转录酶区第202个氨基酸(即202位点)野生型氨基酸为丝氨酸(简写为S)，在HBV病毒基因中对应的密码子为AGT，测序结果显示该样品的202位点为AGT，未发生变化，故而写成rt S202S.

图9中逆转录酶区第204个氨基酸(即204位点)野生型氨基酸为甲硫氨酸(简写为M)，在HBV病毒基因中对应的密码子为ATG，测序结果显示该样品的204位点的密码子有四种可能：GTG、ATT、ATG、GTT，说明HBV准种中有少部分病毒的基因在该位点野生型与突变型同时存在，结合该位点常见密码子为ATC、ATG、GTG，故而写成rtM204M/V/I.

图10中逆转录酶区第236个氨基酸(即236位点)野生型氨基酸为天冬氨酸(简写为N)，在HBV病毒基因中对应的密码子为AAC，测序结果显示该样品的236位点为ACC，对应的氨基酸为苏氨酸(简写为T)，故而写成rt A236T.

图11中逆转录酶区第250个氨基酸(即250位点)野生型氨基酸为天冬氨酸(简写为M)，在HBV病毒基因中对应的密码子为ATG，测序结果显示该样品的250位点为GTG，对应的氨基酸为异亮氨酸(简写为V)，故而写成rt M250V.

具体实施方式

在一个具体实施方案中，本发明的HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法包括如下步骤：

(1)针对HBV基因序列可能存在的突变位点在序列中的位置设计两对巢式PCR扩增引物，用所述第一对设计引物对待测样本中的DNA进行第一轮PCR扩增，然后再以所述第一对引物的扩增产物为模板，用所述第二对设计引物进行第二轮PCR扩增；

(2)对在步骤(1)中得到的扩增产物进行测序；

(2.1)以在步骤(1)中得到的扩增产物为模板，用所述第二对设计引物的上游和下游引物分别进行测序扩增反应；

(2.2)对在步骤2.1)中得到的测序扩增产物进行测序；

(2)对在步骤(1)中得到的扩增产物进行测序；

(2.2)对在步骤2.1)中得到的测序扩增产物用3730测序仪直接进行测序；

与现有技术相比，上述技术方案采用3730直接测序方法检测HBV耐药位点，测序过程中使用的试剂耗材相对简单且相对稳定，并在实验过程中采用了巢式PCR的方法，保证低拷贝数样品可以检测出来，提高了检测的灵敏度。此外，该检测方法成本低廉，通量较高，可以对现有的所有主要耐药位点进行检测并且可以及时发现新的耐药位点。适合用于常规的临床耐药检测。

以下实施例以举例的方式对本发明进行解释，但并不意图限制本发明的范围。

实施例

采用3730测序技术对病人血清中HBV样品进行耐药检测，对于该突变位点的测序检测，我们检测的耐药位点包括：rtL80I/V、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181T/V、rtN236T、rtT184G/S/A/I/L/F、rtA194T、rtS202I/G、rtM204V/I、rtM250V/I/L。首先根据NCBI数据库中乙肝病毒基因组的序列(NCBI登录号：NC 003977)综合比对后，选取保守的区域设计了两对巢式PCR引物。

第一轮PCR扩增引物为：

上游：5’-TCCTGCTGGTGGCTCCAGT-3’(SEQ ID NO：1)；

下游：5’-GCAACGGGGTAAAGGTTCA-3’(SEQ ID NO：2)；

第二轮PCR扩增引物为：

上游：5’-TGGACTTCTCTCAATTTTCT-3’(SEQ ID NO：3)；

下游：5’-TGACAGACTTTCCAATCAAT-3’(SEQ ID NO：4)。

检测步骤如下：

1.待测样本中的HBV-DNA的提取

按厂商说明书操作，用TIANamp病毒基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取乙肝血清样本HBV-DNA。

2.PCR扩增反应

对在步骤(1)中提取的HBV-DNA进行巢式PCR扩增反应，PCR扩增反应试剂的配置见下表。PCR试剂均购自takara公司，即宝生物工程有限公司，试剂包括10x PCR缓冲液、dNTP混合物、

(5U/μL)。引物均委托上海英俊生物有限公司合成。

第一轮PCR扩增反应试剂的配置为：

反应条件为94℃，5min；94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸90s，共扩增40个循环，最终72℃延伸5min。

以第一轮PCR产物为模板，进行第二轮PCR反应。第二轮PCR扩增反应试剂的配置为：

反应条件为94℃，5min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸90s，共扩增40个循环，最终72℃延伸5min。

3.在上一步骤中得到的PCR扩增产物的电泳检测和纯化

加5μL的PCR产物，1.5％的琼脂糖凝胶浓度进行电泳检测，电压130伏，电泳25分钟。EB染胶15分钟，采用凝胶成像系统拍照检测。

将全部PCR产物，1.5％的琼脂糖凝胶浓度进行电泳检测，电压100伏，电泳1小时30分。然后在紫外灯下切下目的片段，放入EP管中。根据琼脂糖凝胶DNA/PCR片段回收试剂盒(Biomiga公司)说明书进行回收，最后溶解于水中。电泳鉴定样品回收浓度。

4.对在上一步骤中得到的纯化产物进行测序扩增

对待测样本进行测序扩增反应的试剂配置如下(两个测序扩增反应)：

反应条件为96℃，2min；96℃变性10s，51℃退火10s，60℃延伸190s，共扩增25个循环，最终12℃。

5.纯化在上一步骤中得到的测序扩增产物

PCR循环完并冷却至4℃，取下并离心1min后，加0.125M的EDTA及16ul乙醇振荡，离心，取上层液体加8ul HI-DI变性，变性完后冷却到4℃，离心30s即可。

6.将在上一步骤得到的纯化产物根据制造商说明书用3730测序仪(ABI)上机测序

7.数据分析：根据3730测序导出的峰图进行数据分析，找出我们所需要检测的耐药位点，判断其突变的基因型。将测序结果用seqscanner install软件打开，运用此软件查找功能键，找到单个分析位点密码子的核苷酸组成，从而推导出该位点密码子对应的编码氨基酸，然后与该位点野生型的氨基酸进行比较，判断该位点是否发生突变。野生的氨基酸序列与突变的氨基酸序列是根据文献报道里的事先整理好的。当该位点发现存在有新的，文献里未报道的突变时，确定为发现新的氨基酸突变。如果该新的氨基酸突变与耐药存在相关性，则确定为新的耐药突变位点。

Claims

1.一种待测样本中HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法，包括如下步骤：

(2)对在步骤(1)中得到的扩增产物进行测序；

2.权利要求1的检测方法，其中

所述第一对PCR扩增引物为：

上游：5’-TCCTGCTGGTGGCTCCAGT-3’(SEQ ID NO：1)；

下游：5’-GCAACGGGGTAAAGGTTCA-3’(SEQ ID NO：2)；

所述第二对PCR扩增引物为：

上游：5’-TGGACTTCTCTCAATTTTCT-3’(SEQ ID NO：3)；

下游：5’-TGACAGACTTTCCAATCAAT-3’(SEQ ID NO：4)。

3.权利要求1或2的方法，其中所述测序采用第一代测序方法，优选地采用Sanger法，特别优选地采用3730测序仪(ABI)进行测序。

4.权利要求1或2的方法，其中所述测序采用第二代测序方法，例如采用SOLEXA测序法或454测序法。

5.前述权利要求任一项的方法，其中所述待测样本选自血浆、血清、全血、纯病毒培养物和携带此类病毒的媒介生物。

6.前述权利要求任一项的方法，其中所述核苷酸突变位点包括rtL80I/V、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181T/V、rtN236T、rtT184G/S/A/I/L/F、rtA194T、rtS202I/G、rtM204V/I和rtM250V/I/L。

7.前述权利要求任一项的方法，其中在步骤(1)和步骤(2)之间纯化所述PCR扩增产物，优选采用凝胶电泳后切胶纯化法纯化所述PCR扩增产物。

8.一种待测样本中HBV基因的核苷酸突变位点的检测试剂盒，包括两对巢式PCR扩增引物，其中

所述第一对PCR扩增引物为：

上游：5’-TCCTGCTGGTGGCTCCAGT-3’(SEQ ID NO：1)；

下游：5’-GCAACGGGGTAAAGGTTCA-3’(SEQ ID NO：2)；

所述第二对PCR扩增引物为：

上游：5’-TGGACTTCTCTCAATTTTCT-3’(SEQ ID NO：3)；

下游：5’-TGACAGACTTTCCAATCAAT-3’(SEQ ID NO：4)；

该检测试剂盒优选地还包括PCR试剂、测序试剂、阴性及阳性对照和说明书等；其中所述核苷酸突变位点优选地包括rtL80I/V、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181T/V、rtN236T、rtT184G/S/A/I/L/F、rtA194T、rtS202I/G、rtM204V/I和rtM250V/I/L；所述待测样本优选地选自血浆、血清、全血、纯病毒培养物和携带此类病毒的媒介生物。

9.权利要求8的试剂盒用于检测HBV基因的核苷酸突变位点的用途。

10.SEQ ID NO：1-4的核苷酸序列及其作为引物用于HBV基因的核苷酸突变位点的检测的用途。