CN107257862B - 从多个引物测序以增加数据速率和密度 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及测序方法，其允许增加的测序速率和增加的测序数据密度。该系统可基于如合成测序(SBS)的下一代测序方法，但使用多个在相同核苷酸链的不同位置处结合的多个引物。

Description

从多个引物测序以增加数据速率和密度
本发明涉及允许增加的测序速录和增加的测序数据密度的测序方法。系统可以基于如合成测序(sequencing by synthesis)(SBS)的下一代测序方法，但使用多个在相同核苷酸链的不同位置处结合的多个引物。
破译DNA序列对于生物研究的几乎所有分支都至关重要。随着Sanger测序的出现，科学家获得了从任何给定的生物系统中阐明遗传信息的能力。该技术已经在世界各地的实验室得到广泛应用，但一直受到通量、可扩展性、速度和分辨率的固有限制的阻碍，这些限制通常阻碍了科学家获得所需的基本信息。为了克服这些障碍，开发了下一代测序(NGS)，其引发了许多突破性的发现并引发了基因组学科学中革命的根本不同的测序方法。
下一代测序数据输出最初以超过摩尔定律的速度增长，自其发明以来每年的增长都超过一倍。2007年，单次测序运行最多可产生大约一千兆碱基(Gb)数据。到2011年，这一速率在单次测序运行中几乎达到了terabase(Tb)数据，几乎在4年中增加了1000倍。凭借快速生成大量测序数据的能力，下一代测序使研究人员可以在几小时或几天内从想法快速移动到完整的数据集。研究人员现在可以在单次运行中测序16个人类基因组，大概3日内生成数据，而每个基因组的试剂成本仍在下降。
相比之下，第一个人类基因组使用CE技术进行测序需要大约10年并用额外的3年来完成分析。完成的项目于2003年发布，仅在发明下一代测序的前几年，并且带来的价格标签接近30亿美元。
虽然最新的高通量测序仪器能够进行大量数据输出，下一代测序技术是高度可扩展的。同样的基础化学可用于较低产率的目标研究或较小的基因组。这种可扩展性给出了研究人员设计最适合其特定研究需求的研究的弹性。为了测序小细菌/病毒基因组或目标区域(如外显子)，研究人员可以选择使用较低输出的仪器，并且每次运行处理较少数量的样品，或者可以选择通过在高通量仪器上进行多路复用(multiplexing)来处理大量样品。多路复用可以在单个实验期间同时测序大样本数。
虽然下一代测序显著提高了产率，当例如处理大型基因组时，提高测序数据速率和密度仍是有利的。本发明旨在进一步改善数据速率和数据密度/产率，特别是当适用于下一代测序/合成测试(SBS)方法时。
优选地，术语“碱基调用(base call)”指将碱基(核碱基)分配至测序期间获得的信息的过程，例如通过将核苷酸分配至色谱峰。
如本文所用，并且除非另有说明，以下每个术语的定义应当如下。
●A--腺嘌呤；
●C-胞嘧啶；
●DNA--脱氧核糖核酸；
●G--鸟嘌呤；
●RNA--核糖核酸；
●T--胸腺嘧啶；和
●U--尿嘧啶。
“核酸”将意指任何核酸分子，包括但不限于DNA、RNA和其杂合体。形成核酸分子的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T和U，以及它们的衍生物。这些碱基的衍生物是本领域熟知的，并且示例于PCR系统，试剂和消耗品中(Perkin Elmer Catalogue 1996-1997,RocheMolecular Systems,Inc.,Branchburg,N.J.,USA)。
核苷酸的“类型”指A、G、C、T或U。
“质量标签”将意指预定大小的分子实体，其能够通过可切割键连接到另一实体。
“固体基底”将意指存在于固相的介质，其中抗体或试剂可以附接(affix)至所述固相。
在提供一系列数值的情况下，可以理解，除非上下文另有明确规定，每个干预值，到下限单位的十分之一，在该范围的上限和下限之间，以及在该范围内的任何其他规定或干预值，包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小的范围内，并且也包括在本发明中，在规定的范围内受到任何明确排除的限制。如果所述范围包括一个或两个限制，本发明也包括排除了那些包括的限制中的一个或全部的范围。
本发明的一个方面提供了一种测定核酸序列的方法，其包括
提供与支持物结合的至少一个核酸；
将至少两个引物与核酸的相同链杂交；
在所述至少两个引物中的每个处在所述核酸的相同链上进行引物延伸；
获得对应于每次引物延伸时掺入的至少一个核苷酸碱基的信号数据；
从所述信号数据测定所述核酸碱基的身份并将所述碱基分配至延伸读段。
优选地，所述方法包括在允许杂交的条件下在存在下列各项的情况下将所述核酸与酶接触以给出多个延伸读段，每个延伸读段从所述至少两个引物之一延伸：(i)能够在不同位置处与所述核酸的相同链杂交的至少两个引物，和(ii)四个标记部分(labelledmoieties)，其包含至少一个选自dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、和dATP的核苷酸类似物，所述四个标记部分的每个具有不同于其他三个标记部分的独特标记物的独特标记物。
所述方法可以包括除去未结合的标记部分的步骤。
优选地，多个延伸读段包含基本同时的延伸读段。
在某些实施方案中，四个标记部分各包含选自dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、和dATP的单一可逆终止核苷酸类似物或可逆终止剂类似物或者包含至少一个选自dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、和dATP的核苷酸类似物的寡核苷酸探针。
有利地，可以基本上同时获得对应于所述至少两个引物延伸中每个的所述信号数据。
这提供了优势，即信号数据包含对应于来自相同核酸链的多个信号的数据。
任选地，信号数据包含一个或多个图像。
任选地，信号数据以对应于所述引物延伸上掺入的多个核苷酸类似物的颜色信号检测，并且其中每个颜色信号对应于不同核苷酸类似物或核苷酸类似物的组合。
本发明的一个方面提供了用于测定核酸序列的方法，其包括进行以下步骤：
(a)提供至少一个与支持物结合的核酸；
(b)在允许杂交的条件下在存在下列各项的情况下将所述核酸与酶接触以给出多个延伸读段，每个延伸读段从所述至少两个引物之一延伸：(i)能够在不同位置处与所述核酸的相同链杂交的至少两个引物，和(ii)四个标记部分，其包含至少一个选自dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、和dATP的核苷酸类似物，所述四个标记部分的每个具有不同于其他三个标记部分的独特标记物的独特标记物。
(c)除去未结合的探针；
(d)通过测定对应独特标记物的身份来测定掺入步骤(b)中的核酸类似物的身份，以及
(e)将核苷酸碱基分配至延伸读段。
优选地，所述多个延伸读段包含同时延伸读段。
在某些实施方案中，所述方法包括合成测序和酶包含聚合酶。
四个探针的每个可以包含选自dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、和dATP的单个可逆终止核苷酸衍生物或可逆终止剂类似物。
在某些实施方案中，所述方法包括通过连接测序并且所述酶包含连接酶。
所述四个探针可以包含寡核苷酸。
所述寡核苷酸可以是用于通过连接技术测序的类型。
所述方法可以包括合成测序、通过连接测序、焦磷酸测序或纳米孔测序。
在某些实施方案中，每个独特标记物可检测为不同的颜色。
有利地，因为两个或更多个引物与核酸的相同链在不同位置处杂交，这允许链的测序开始于两个不同的位点，以给出多个延伸读段，潜在地倍增了数据的密度和其获得的速率。当系统使用结合固体支持物的核酸时(例如在下一代测序技术中)，这允许在每个特定位置处制造出多个碱基调用。将每个碱基调用分配至正确延伸读段，这允许测定核酸序列。
在某些实施方案中，该方法提供的优势在于可以实时同时鉴定在相同链上的不同位置处掺入核酸的单个模板链的多个核苷酸碱基。
优选地，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。
优选地，核酸结合至固体基底。
更优选地，固体基底是合成测序或通过连接方法测序中使用的类型。
优选地，固体基底是芯片。
优选地，固体基底是珠。
任选地，独特标记物经由可切割连接子结合至碱基。
任选地，独特标记物经由化学可切割或光可切割连接子结合至碱基。
任选地，独特标记物是染料、荧光团、生色团、组合荧光能量转移标签、质量标签，或电泳团(electrophore)。
优选地，在(a)提供至少一个结合支持物的核酸后；扩增了核酸。
更优选地，通过桥式扩增(bridge amplification)来扩增核酸。
任选地，至少两个能够在不同位置处与核酸的相同链杂交的两个引物具有重叠序列。
任选地，第二引物与末端具有额外的一个碱基的第一引物相同。
也可以使用每一个添加额外碱基的另外的引物。
任选地，封闭的和未封闭的引物用于在化学上区分延伸读段。这确保将正确的碱基调用分配至正确的延伸读段。
这可以通过使用不同水平的用于至少两个使用的引物的每个的封闭和未封闭引物来实现。
任选地，使用生物信息学信息将所述碱基分配至延伸读段。
在某些实施方案中，确定核苷酸类似物身份的步骤包括检测对应于多个扩展读段的信号数据。
可以同时检测对应于多个扩展读段中的每个的信号数据。
确定核苷酸类似物身份的步骤可以包括分析对应于在每个扩展读段处检测到的独特标记物的信号强度概况。
这可以包括同时测量对应于每个扩展读段的信号数据中的信号强度。
任选地，该方法包括通过产生强度数据的直方图来确定信号数据中的强度测量的分布。
信号数据可以被检测为对应于步骤(b)中掺入的多个核苷酸类似物的颜色信号，其中每个颜色信号对应于不同的核苷酸类似物或核苷酸类似物的组合。
该方法可以包括信号处理步骤，其包括信号去卷积，信号改良和信号选择中的一个或多个。
该方法可以包括在每个扩展读段选择最高强度的颜色信号以提供碱基调用。
可以在每个杂交循环进行多个碱基调用。
任选地，将碱基分配给扩展读段的步骤包括确定核苷酸类似物的位置。
任选地，将碱基分配给扩展读段的步骤包括为每个扩展读段提供初步碱基调用和最终碱基调用。
任选地，最终碱基调用是通过将初步碱基调用数据与参考基因组相比较来提供的。
任选地，最终碱基调用是通过将初步碱基调用数据与参考基因组相比较来提供的。
在某些实施方案中，至少两个引物可以是重叠的引物。
在某些实施方案中，至少两个引物可以因单个碱基添加而不同。
有利地，在某些实施方案中，该方法提供检测包含信号数据的信号，所述信号数据对应于相同核酸链或分子上不同位点处的多个基本上同时的引物延伸。
有利地，在该方法中需要不多于对应于dGTP、dCTP、dTTP、dUTP和dATP的单核苷酸单体类似物或者对应于包含dGTP、dCTP、dTTP、dUTP和dATP的类似物的寡核苷酸探针的四个独特标记物。
在用于每个扩展读段的方法中优选使用相同的四个探针组。
根据本发明，在此提供了用于测定核酸序列的方法，其包括对要测序核酸的每个残基进行以下步骤：
(a)提供至少一个结合至支持物的核酸；
(b)在允许聚合酶催化核酸合成条件下在存在下列各项的情况下将所述核酸与核酸聚合酶接触以给出多个延伸读段，每个扩展读段从引物延伸：(i)能够在不同位置处与所述核酸的相同链杂交的至少两个引物，和(ii)四个可逆终止核酸类似物或可逆终止剂，其选自dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、和dATP的核苷酸类似物，所述四个类似物的每个具有不同于其他三个类似物的独特标记物的独特标记物。
(c)除去未结合的核酸类似物；
(d)通过测定对应独特标记物的身份来测定掺入步骤(b)中的核酸类似物的身份，以及
(e)将所述碱基分配至扩展读段。
而本发明的另一方面提供了用于测定核酸序列的系统，所述系统包含具有用于固定至少一个核酸的固体支持物的测序仪器，以及通过将核酸与酶在下列各项存在下相接触来用于测定其序列的装置：(i)能够在不同位置处与所述核酸的相同链杂交的至少两个引物和(ii)包含至少一个选自dGTP、dCTP、dTTP、dUTP和dATP核苷酸类似物的四个探针，
四个探针中的每一个都具有与其他三个探针的独特标记物不同的独特标记物，
在允许杂交的条件下，以给出多个延伸读段，每个扩展读段从至少两个引物中的一个延伸；
除去未结合的探针；
通过测定对应独特标记物的身份来测定掺入的核酸类似物的身份，以及
将核苷酸碱基分配至扩展读段。
本发明的另一方面提供了一种测序方法，包括：
提供至少一个与支持物杂交的核酸；
将至少两个引物杂交到核酸的相同链以提供两个扩展读段；
用可逆终止剂碱基进行每个引物的延伸；
获得针对每个碱基添加的结合的可逆终止剂碱基的图像。
从所述图像测定存在于支持物上位置处的多个碱基，并将所述碱基分配至扩展读段。
而本发明的另一方面提供了用于测定核酸序列的系统，其包含具有用于固定至少一个核酸的固体支持物的测序装置和用于以下的装置：
提供至少一个结合到支持物的核酸；
将至少两个引物与核酸的相同链杂交；
在所述至少两个引物的每个在所述核酸的相同链上进行至少两个引物延伸；
获得对应于至少两个引物延伸中每个掺入时的至少一个核苷酸碱基的信号数据；
从所述信号数据测定所述核酸碱基的身份并将所述碱基分配至延伸读段。
优选地，所述系统包含用于处理所述信号数据的信号处理器。
而本发明的另一方面提供了用于测定核酸序列的试剂盒，其包含用于进行所述方法的测序试剂和说明书。
为了举例说明本发明，使用具有v2PhiX簇的流通池。
图1和以下示出了标准构建体，其包含P5、SBS3，然后是一个T残基之后是基因组插入物，SBS8’然后是A残基和P7。
图1SBS3/SBS8std PE构建体
粗体＝P5,下划线＝SBS3,斜体＝SBS8,斜体和粗体＝P7
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACCACGACGCTCTTCCGATCT‐‐‐insert‐‐‐
TTACTATGCCGCTGGTGGCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGGTGCTGCGAGAAGGCTAGA‐‐‐insert‐‐‐
AGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAGACCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TCTAGCCTTCTCGCCAAGTCGTCCTTACGGCTCTGGCTAGAGCATACGGCAGAAGACGAAC
如下表所示，将SBS3，SBS3+T和SBS8'引物单独和组合杂交。
表1
道(lane) 引物杂交 期望的1<sup>st</sup>循环
1 SBS3 T
2 SBS3+T All 4(作为基因组)
3 SBS8’ A
4 SBS3/SBS8’ T+A
5 SBS3+T/SBS8’ All 4(作为基因组)+A
进行第一个测序循环并且获得了流动池的第一图像。图2显示了针对观察的三个通道的灰阶(grayscale)(绿色，橙色和红色)中的1st循环个别扫描。道1和3在3个通道中的不同2个中具有最强的信号，而由于在该道中的SBS3和SBS8'上掺入了T和A碱基的混合物，因此道4具有所有3个通道中最强的信号。在SBS3上的T掺入显示出与绿色和橙色通道一样强的信号，在红色通道中非常弱。在SBS8’上的A掺入显示出与橙色和红色通道一样强的信号，在绿色通道中弱和强信号的混合。由于在使用的2引物上掺入了T和A，SBS3/SBS8’显示出在绿色、橙色和红色通道中的强信号。
从图3可以看出，强度直方图显示了组合的信号导致获得不同的强度信息，然后可以将该信息分配给碱基信息以允许有效的碱基调用。上方的直方图来自单独的SBS3，说明了T碱基调用，下方的直方图来自单独的SBS8’，说明了A碱基调用，而中心的直方图显示了组合的SBS3/SBS8’直方图，其中制造了A碱基调用和T碱基调用两者，一个来自每个扩展读段。
类似地，图4再一次地显示了强度直方图，这一次上方的直方图来自单独的SBS3+T，其中碱基调用可以是与基因组DNA相关的4个碱基中的任何一个，下方的直方图来自单独的SBS8’，说明了A碱基调用，而中心的直方图显示了组合的SBS3+T/SBS8’直方图，其中碱基调用可以是与来自一个扩展读段加上给出来自A/A簇双强度峰的来自其他扩展读段的A碱基调用的基因组DNA相关的任何4个碱基。
一旦已经获得强度读段和图像，可以为每个带有在用于测序的每个循环的每个位置被制造的多个调用的位置制造碱基调用。然后，需要将在每个位置上的每个调用分配至正确的扩展读段。这可以通过化学方法完成，例如通过通过使用封闭和未封闭引物的混合物使其中一个读段比另一个读段更亮来完成。另一个选择是使用生物信息学信息以确定例如如果我们使用人类插入物或大肠杆菌插入物等则哪个是在统计学上更“正确”碱基调用。
在特定的实施方案中，多个引物可以是重叠引物。例如可以在多个循环将SBS3和SBS3+T用于序列2保守碱基以通过询问每个碱基多次来给出更好的精确性，在这种情况下其中使用由单碱基添加而不同的两个引物每个碱基询问两次。
在一些情况下，使用封闭和未封闭引物来通过化学方法区分扩展读段。例如，其中一个引物将在开始时是完全未封闭的，而另一个引物将是封闭/未封闭的混合物。因此例如引物1将是100％未封闭的并且在测序上给出100％信号。然后“引物2”将是例如25％未封闭和75％封闭的混合物，这意味着在测序上你将从该引物位点得到25％的信号。因此，你将最终得到在2个不同水平(100％和25％)上的2个读段给出数据，这会使区分哪个碱基属于哪个读段变得更为容易。
当使用生物信息学数据将所述碱基分配给扩展读段时，有可能可以从所读取的碱基的混合物中生物信息地搜索最可能的读段，例如如果你的读数是：
A/G,A/G,T/T,C/G,C/C,A/T
则，可以针对可能匹配在进行测序的基因组中搜索，并且可能将2个读段区分为：
R1，人类，AGTCCT
R2，大肠杆菌，GATGCA
这与从上述碱的混合物的任何其他可能的读段相反(例如，在任一基因组中都没有发现AATCCA)。更长的读段对于每个基因组将更有可能是独一无二的。
测序方法
本文描述的方法可以与各种核酸测序技术结合使用。特别适用的技术是其中将核酸附接在阵列中的固定位置，使得它们的相对位置不改变，并且其中阵列被重复成像的那些。在不同颜色通道中获得图像的实施方案，例如，与用于区分一种核苷酸碱基类型与另一种核苷酸碱基类型的不同标记相符是特别适用的。在一些实施方案中，测定靶核酸核苷酸序列的过程可以是自动化过程。优选的实施方案包括合成测序("SBS")技术。
SBS技术通常涉及通过重复添加针对模板链的核苷酸来酶促延伸新生核酸链。在SBS的传统方法中，可以在每个递送中，在聚合酶存在下，向目标核苷酸提供单个核苷酸单体。然而，在本文所述的方法中，在递送中，在聚合酶存在下，可以将多于一种类型的核苷酸单体提供给目标核酸。
SBS可以利用具有终止剂部分或那些缺少任何终止剂部分的核苷酸单体。使用缺乏终止剂的核苷酸单体的方法例如包括，使用γ-磷酸/磷酸盐标记的核苷酸的焦磷酸测序和测序，如下面进一步详细阐述的。在使用缺乏终止剂的核苷酸单体的方法中，每个循环中加入的核苷酸数目通常是可变的，并取决于模板序列和核苷酸递送模式。对于利用具有终止剂部分的核苷酸单体的SBS技术，终止剂可以在测序条件下是有效不可逆转的，如传统的利用双脱氧核苷酸的Sanger测序的情况，或者终止剂可以是可逆的，如Solexa(现在是Illumina,Inc.)开发的测序方法的情况。
SBS技术可以利用具有标记部分或缺乏标记部分的核苷酸单体。因此，可以基于标签的特征来检测掺入事件，如荧光标记；核苷酸单体的特征如分子量或电荷；核苷酸掺入的副产物，如磷酸/盐释放等。在实施方案中，其中测序试剂中存在两个或更多个不同的核苷酸，可以彼此区分不同的核苷酸，或者替代地，在使用的检测技术下，两个或更多个不同的标签可以是不可区分的。例如，测序试剂中存在的不同核苷酸可以具有不同的标记并且可以使用Solexa(现在是Illumina,Inc.)开发的测序方法示例的适当的光学来区分它们。
实施方案包括焦磷酸测序技术。焦磷酸测序检测由于将特定的核苷酸掺入到新生链中而导致的无机焦磷酸盐(PPi)的释放(Ronaghi,M.,Karamohamed,S.,Pettersson,B.,Uhlen,M.and Nyren,P.(1996)“Real-time DNA sequencing using detection ofpyrophosphate release.”Analytical Biochemistry 242(1),84-9；Ronaghi,M.(2001)“Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing.”Genome Res.11(1),3-11；Ronaghi,M.,Uhlen,M.and Nyren,P.(1998)“A sequencing method based on real-timepyrophosphate.”Science 281(5375),363；美国专利号6,210,891；美国专利号6,258,568和美国专利号6,274,320,前述公开通过引用以它们的整体并入本文)。在焦磷酸测序中，释放的PPi可以通过ATP硫酸化酶立即转化为三磷酸腺苷(ATP)来检测，并且通过萤光素酶产生的光子检测产生的ATP水平。可以将要排序的核酸附接到阵列中的特征，并且可以成像以捕捉由于在阵列的特征处掺入核苷酸而产生的化学发光信号。在用特定核苷酸类型处理阵列后可以获得图像(例如A,T,C或G)。在添加每种核苷酸类型后获得的图像将不同于检测阵列中的哪些特征。图像中的这些差异反映了阵列上特征的不同序列内容。然而，每个特征的相对位置在图像中将保持不变。可以使用本文所述的方法来存储，处理和分析图像。例如，以用各种不同核苷酸类型的阵列处理后获得的图像可以以与本文例举的用于基于可逆终止剂的测序方法的不同检测通道获得的图像相同的方式来处理。
在SBS的另一个示例性类型中，循环测序通过逐步添加可逆终止剂核苷酸来完成，所述可逆终止剂核苷酸例如包括以下所述的可切割或者荧光可切割标签：WO 04/018497和美国专利号7,057,026，所述公开以其整体通过引用并入本文。这种方法正在被Solexa(现在是Illumina,Inc.)商业化，并且还描述于WO 91/06678和WO 07/123,744中，每个以其整体通过引用并入本文。荧光标记的终止剂(可以颠倒这两个终止剂)和切割的荧光标签的可用性促进有效的循环可逆终止(CRT)测序。也可以共同设计聚合酶以有效地掺入并从这些修饰的核苷酸延伸出来。
优选地，在基于可逆终端的测序实施方案中，在SBS反应条件下，标记物基本上不能抑制延伸。然而，检测标记物可以是可移除的，例如通过裂解或降解。在将标记物并入阵列的核酸特征之后，可以捕获图像。在具体实施方案中，每个循环涉及将四种不同核苷酸类型同时递送至阵列，并且每种核苷酸类型具有光谱上不同的标记物。然后可以获得四个图像，每个图像使用对四个不同标签之一选择的检测通道。或者，可以顺序添加不同的核苷酸类型，并且可以在每个添加步骤之间获得阵列的图像。在此类实施方案中，每个图像将显示已经掺入特定类型的核苷酸的核酸特征。由于每个特征的不同序列内容，不同的图像将存在或不存在不同的特征。然而，图像中的特征的相对位置将保持不变。可以如本文所述对从此类可逆终止剂-SBS方法获得的图像进行储存，处理和分析。在图像捕获步骤之后，可以去除标记物，并且可以除去可逆终止剂部分以用于随后的核苷酸添加和检测循环。标签在特定循环内和之后的循环中被检测到后，可以提供降低背景信号和循环之间串扰的优点。有用的标签和去除方法的实例如下所述。
在具体实施方案中，一些或全部核苷酸单体可以包括可逆终止剂。在此类实施方案中，可逆终止剂/可裂解荧光剂可以包括经由3'酯键连接至核糖部分的荧光剂(Metzker,Genome Res.15:1767-1776(2005),其通过引用以其整体并入本文)。其他方法将终止剂化学与荧光标记的切割分离(Ruparel et al.,Proc Natl Acad Sci USA 102:5932-7(2005),其通过引用以其整体并入本文)。Ruparel等人描述了开发的使用小的3'烯丙基封闭延伸的可逆终止剂，但是其可以通过用钯催化剂的短暂处理容易地解封。荧光团经由光可裂解接头附接在碱基上，所述接头可以通过暴露于长波长UV光30秒而容易地被切割。因此，可以使用二硫键还原或光切割作为可切割的连接子。可逆终止的另一种方法是使用在dNTP上放置大体积染料之后发生的自然终止。dNTP上带电荷的大体积染料的存在可以通过空间和/或静电阻碍作为有效的终止剂。除非染料被去除，一个掺入事件的存在防止进一步掺入。染料的切割可去除荧光，并有效地反转终止。修饰的核苷酸的实例也描述在美国专利号7,427,673和美国专利号7,057,026中，其通过引用以它们的整体并入本文。
可以与本文描述的方法和系统一起使用的附加的示例性SBS系统和方法描述于以下中：美国专利申请公开号2007/0166705,美国专利申请公开号2006/0188901,美国专利号7,057,026,美国专利申请公开号2006/0240439,美国专利申请公开号2006/0281109,PCT公开号WO 05/065814,美国专利申请公开号2005/0100900,PCT公开号WO 06/064199,PCT公开号WO 07/010,251,美国专利申请公开号2012/0270305以及美国专利申请公开号2013/0260372，每个公开的内容通过引用以其整体并入本文。
一些实施方案可以利用四种不同的标记物来检测四种不同的核苷酸。例如，可以使用描述于美国专利公开号2013/0079232中的方法和系统来执行SBS，该专利以其整体通过引用并入本文。作为第一个实例，可以以相同的波长检测一对核苷酸类型，但是基于一对成员与另一成员的强度差异，或基于一对成员的改变(例如，经由化学修饰，光化学改性或物理改性)，所述改变导致相较于该对的其他成员检测到的信号所出现或消失的明显信号。作为第二个实例，在特定条件下可以检测四种不同核苷酸类型中的三种，而第四核苷酸类型缺少在这些条件下可检测的标记物，或在这些条件下被最小检测(例如，由背景荧光引起的最小检测等)。可以基于它们各自存在的信号来测定前三种核苷酸类型掺入至核酸，并且可以基于任何信号的不存在或最小检测来确定第四种核苷酸类型掺入到核酸中。作为第三个实例，一种核苷酸类型可以包括在两个不同通道中检测到的标记物，而在不超过一个通道中检测到其他核苷酸类型。上述三个示例性配置不被认为是相互排斥的，并且可以以各种组合使用。组合了所有三个实例的示例性实施例为基于荧光的SBS法，其使用在第一通道中检测到的第一种核苷酸类型(例如，当被第一激发波长激发时具有在第一通道中检测到的标签的dATP)，在第二通道中检测到的第二种核苷酸类型(例如，当被第二激发波长激发时具有在第二通道中检测到的标签的dCTP)，在第一和第二通道中检测到的第三种核苷酸类型(例如，当被第一和/或第二激发波长激发时具有至少一个在两个通道中检测到的标记物的dTTP)以及在任一通道中未被检出或被最小检出的缺少标签的第四种核苷酸类型(例如，没有标记的dGTP)。
此外，如并入美国专利申请公开号2013/0079232的材料中所描述的，可以使用单个通道获得测序数据。在所谓的单染料测序方法中，第一种核苷酸类型是标记的，但该标记物在第一种图像生成后被去除，并且仅在产生第一图像之后标记第二种核苷酸类型。第三种核苷酸类型在第一和第二图像中保留其标签，并且第四种核苷酸类型在两个图像中保持未标记。
一些实施方案可以利用连接技术进行测序。此类技术利用DNA连接酶掺入寡核苷酸并鉴定此类寡核苷酸的掺入。寡核苷酸通常具有与寡核苷酸杂交的序列中特定核苷酸的同一性相关的不同标记。与其他SBS方法一样，在用标记的测序试剂处理核酸特征阵列之后可以获得图像。每个图像将显示已经掺入特定类型的标签的核酸特征。由于每个特征的不同序列内容，不同的图像将存在或不存在不同的特征，但是图像中的特征的相对位置将保持不变。从基于连接的测序方法获得的图像可以如本文所述进行存储，处理和分析。可以与本文描述的方法和系统一起使用的示例性SBS系统和方法描述于美国专利号6,969,488，美国专利号6,172,218和美国专利号6,306,597中，所述专利通过引用以其整体并入本文。
通过连接测序是用于测序的众所周知的方法，其需要用光重复或长时间照射二碱基探针。使用合成测序的示例性系统包括Applied Biosystems的SOLiDTM系统(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)。简言之，通过连接测序的方法包括将测序引物与固定在模板珠上的衔接子序列杂交。一组四个荧光标记的二碱基探针竞争连接至测序引物。二碱基探针的特异性通过在每个连接反应中询问每一个和第二个碱基来实现。在一系列连接循环后，除去延伸产物，并用与n-1位置处互补的测序引物复位模板，用于第二轮连接循环。用测定最终读数长度的周期数来进行多个循环的连接，检测和切割。
此外，本文描述的方法和技术方案可以特别适用于从核酸阵列测序，其中由于每个位置处的每个核苷酸可以基于其可识别的标记来鉴定，可以从阵列上的多个位置处同时读取多个序列。示例性的方法描述于US 2009/0088327；US 2010/0028885；和US 2009/0325172。
一些实施方案可以通过利用纳米孔测序(Deamer,D.W.&Akeson,M.“Nanoporesand nucleic acids:prospects for ultrarapid sequencing.”Trends Biotechnol.18,147-151(2000)；Deamer,D.and D.Branton,“Characterization of nucleic acids bynanopore analysis”.Acc.Chem.Res.35:817-825(2002)；Li,J.,M.Gershow,D.Stein,E.Brandin,and J.A.Golovchenko,“DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope”Nat.Mater.2:611-615(2003),上述公开通过引用以其整体并入本文)。在此类实施方案中，目标核酸穿过纳米孔。纳米孔可以是合成的孔或生物膜蛋白，如α-溶血素。当目标核酸通过纳米孔时，可以通过测量孔隙电导的波动来鉴定每个碱基对(U.S.Patent 7,001,792；Soni,G.V.&Meller,“A.Progress toward ultrafast DNAsequencing using solid-state nanopores.”Clin.Chem.53,1996-2001(2007)；Healy,K.“Nanopore-based single-molecule DNA analysis.”Nanomed.2,459-481(2007)；Cockroft,S.L.,Chu,J.,Amorin,M.&Ghadiri,M.R.“A single-molecule nanopore devicedetects DNA polymerase activity with single-nucleotide resolution.”J.Am.Chem.Soc.130,818-820(2008),上述公开通过引用以其整体并入本文)。从纳米孔测序获得的数据可以如本文所述进行存储，处理和分析。特别地，可以根据本文所列的光学图像和其他图像的示例性处理将数据作为图像进行处理。在某些实施方案中，单个孔可用于保持与两个或两个以上引物杂交的DNA链。然后可以执行基于光的合成测序。
一些实施方案可以利用涉及实时监测DNA聚合酶活性的方法。可以通过含荧光团聚合酶和γ-磷酸酯标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用来检测核酸掺入，其例如描述于美国专利号7,329,492和美国专利号7,211,414中(上述公开通过引用以其整体并入本文)，或者可以用零模式波导和使用荧光核苷酸类似物和工程化聚合酶来检测核苷酸掺入。所述零模式波导例如描述于美国专利号7,315,019中(该公开通过引用以其整体并入本文)，所述荧光核苷酸类似物和工程化聚合酶例如描述于美国专利号7,405,281和美国专利申请公开号2008/0108082中(上述公开通过引用以其整体并入本文)。可以将光源(illumination)限制在围绕表面系留聚合酶的zeptoliter-尺度体积使得可以低背景观察荧光标记核苷酸的掺入(Levene,M.J.et al.“Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations.”Science 299,682-686(2003)；Lundquist,P.M.et al.“Parallel confocal detection of single molecules in realtime.”Opt.Lett.33,1026-1028(2008)；Korlach,J.et al.“Selective aluminumpassivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules inzero-mode waveguide nano structures.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,1176-1181(2008),上述公开通过引用以其整体并入本文)。从这些方法获得的图像可以如本文所述进行存储，处理和分析。在某些实施方案中，两个聚合酶可以存在于每个孔的底部，每个生成来自附接于相同模板分子的不同引物的测序数据。
一些SBS实施方案包括在将核苷酸掺入延伸产物中时释放的质子的检测。例如基于检测释放的质子的测序可以使用可从Ion Torrent(Guilford,CT,aLife Technologiessubsidiary)购得的电检测器以及相关的技术或者描述于以下专利中的测序方法和系统：US 2009/0026082 A1；US 2009/0127589 A1；US 2010/0137143 A1；or US 2010/0282617A1,每个通过引用并入本文。更具体地，本文所列的方法可用于生产用于检测质子的扩增子的克隆群。在使用焦磷酸测序法的实施方案中，核酸的每条链使用两个或多个引物可能意味着每单位时间更多的信号要去卷积。在焦磷酸测序法中，被冲洗出的两倍于正常的pH值下降可能意味着引物中的1个具有TT掺入，或者每个引物具有单个T掺入。
上述方法可以有利地以多重形式进行使得多个不同的靶核酸被同时操作。在具体实施方案中，不同的靶核酸可以在常见的反应容器中或在特定的基底的表面上进行处理。这允许以多种方式来方便地递送测序试剂，去除未反应的试剂和检测掺入事件。在使用表面结合靶核酸的实施方案中，靶核酸可以是阵列形式。在阵列形式中，目标核酸通常可以以空间上可区分的方式结合到表面。目标核酸可以通过直接共价附接，附接到珠子或其他颗粒或结合至聚合酶或附接于表面的其它分子结合。该阵列可以包括在每个位点(也称为特征)的目标核酸的单拷贝，或者具有相同序列的多个拷贝可以存在于每个位点或特征。可以通过如下文进一步详述的桥式扩增或乳液PCR的扩增方法生产多个拷贝。
本文所述的方法可以使用具有各种密度的特征的阵列，包括例如，至少约10特征/cm2、100特征/cm2、500特征/cm2、1,000特征/cm2、5,000特征/cm2、10,000特征/cm2、50,000特征/cm2、100,000特征/cm2、1,000,000特征/cm2、5,000,000特征/cm2，或更高。
本文所列方法的优点在于它们以并行的方式为多个目标核酸提供的快速和有效的检测。因此，本公开提供了能够使用本领域已知的技术制备和检测核酸的综合系统，例如上面列举的那些。因此，本公开的集成系统可以包括能够递送扩增试剂的流体组分和/或针对一个或多个固定化的DNA片段的测序试剂，所述系统包含如泵，阀，储存器，流体管线等部件。流动池可以在用于检测靶核酸的集成系统中配置和/或使用。示例性的流动池例如描述于US 2010/0111768 A1和美国系列号13/273,666中，每篇专利通过引用以其整体并入本文。如流动池所示例，集成系统的一个或多个流体组分可用于扩增方法和检测方法。以核酸测序实施方案为例，集成系统的一个或多个流体组分可以用于本文所述的扩增方法和用于在诸如上述例举的测序方法中递送测序试剂。或者，集成系统可以包括单独的流体系统以执行扩增方法和执行检测方法。能够创建扩增核酸并还能够测定核酸序列的集成测序系统的实例包括但不限于MiSeqTM平台(Illumina,Inc.,加利福尼亚州圣地亚哥)和描述于美国系列号13/273,666中的设备，其以其整体通过引用并入本文。
核酸扩增
在一些实施方案中，使用如美国专利号7,985,565和7,115,400的公开内容的簇扩增方法来扩增固定化的DNA片段，每篇专利的内容以其整体通过引用并入本文。美国专利号7,985,565和7,115,400中并入的材料描述了固相核酸扩增方法，其允许扩增产物被固定在固体支持物上，以形成包含固定化的核酸分子的簇或“群落”。每个在此类阵列上的簇或群落由多个相同的固定化的多核苷酸链和多个相同的固定化的互补多核苷酸链形成。本文中如此形成的阵列大体上称为“簇阵列”。美国专利号7,985,565和7,115,400中描述的固相扩增反应的产物是所谓的“桥接”结构，其通过退火固定的多核苷酸链和未固定的互补链的对来形成，所述两个链优选地经由共价附接，在5’末端固定化在固体支持物上。簇扩增方法是方法的例子，其中固定化的核酸模板用于生产固定化的扩增子。也可以使用其它合适的方法从根据本文提供的方法制备的固定化的DNA片段来产生固定化的扩增子。例如，可以通过固相PCR来形成一个或多个簇或群落，其中每个扩增引物对的一个或两个引物是固定化的。
在其他实施方案中，在溶液中扩增固定化的DNA片段。例如，在一些实施方案中，固定化的DNA片段被切割或以其他方式从固体支持物释放出来，并且然后将扩增引物在溶液中与释放的分子杂交。在其他实施方案中，扩增引物在一个或多个起始扩增步骤中与固定化的DNA片段杂交，然后在溶液中进行随后的扩增步骤。因此，在一些实施方案中，固定化的核酸模板可用于生产固相扩增子。
应当理解，本文所述或本领域通常已知的任何扩增方法可用于通用或靶特异性引物以扩增固定化的DNA片段。用于扩增的合适方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)，链置换扩增(SDA)，转录介导扩增(TMA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)，如描述于美国专利号8,003,354中，通过引用该专利以其整体并入本文。可以使用上述扩增方法来扩增一种或多种感兴趣的核酸。例如，包括多重PCR、SDA、TMA、NASBA等的PCR可用于扩增固定化的DNA片段。在一些实施方案中，特异性针对感兴趣的核酸的引物包括在扩增反应中。
用于扩增核酸的其它合适的方法可以包括寡核苷酸延伸和连接、滚环扩增(RCA)(Lizardi et al.,Nat.Genet.19:225-232(1998),其通过引用并入本文)以及寡核苷酸连接测定(OLA)(一般参见美国专利号7,582,420,5,185,243,5,679,524和5,573,907；EP 0320 308 B1；EP 0 336 731 B1；EP 0 439 182 B1；WO 90/01069；WO 89/12696；以及WO 89/09835,所有专利通过引用并入本文)技术。应当理解，可以设计这些扩增方法以扩增固定化的DNA片段。例如，在一些实施方案中，扩增方法可以包括含有专门针对感兴趣的核酸的引物的连接探针扩增或寡核苷酸连接测定(OLA)反应。在一些实施方案中，扩增方法可以包括含有专门针对感兴趣的核酸的引物的引物延伸连接反应。作为可以专门设计以扩增感兴趣的核酸的引物延伸和连接引物的非限制性实例，扩增可以包括用于GoldenGate测定的引物(Illumina,Inc.,加利福尼亚州圣地亚哥)如美国专利号7,582,420和7,611,869所示，每篇专利通过引用以其整体并入本文。
可用于本公开的方法的示例性等温扩增方法包括但不限于，多重置换扩增(MDA)如例如Dean et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:5261-66(2002)所示，或等温链置换核酸扩增如例如美国专利号6,214,587所示，每篇专利通过引用以其整体并入本文。可用于本公开的其它非基于PCR的方法例如包括，例如描述于Walker et al.,Molecular Methodsfor Virus Detection,Academic Press,Inc.,1995；美国专利号5,455,166,和5,130,238,以及Walker et al.,Nucl.Acids Res.20:1691-96(1992)中的链置换扩增(SDA)，或者例如描述于Lage et al.,Genome Research 13:294-307(2003)中的超分支链置换扩增，前述每个通过引用以其整体并入本文。等位扩增方法可以用于链置换Phi 29聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段，5'->3'体外用于基因组DNA的随机引物扩增。这些聚合酶的使用利用其高的持续性和链置换活性。高持续性允许聚合酶产生长度为10-20kb的片段。如上所述，可以在等温条件下使用具有低持续性和链置换活性的聚合酶(如Klenow聚合酶)来产生较小的片段。美国专利号7,670,810的公开中详细描述了扩增反应，条件和组分的其他描述，该专利通过引用以其整体并入本文。
在本公开中有用的另一种核酸扩增方法是使用具有恒定5'区域接着随机3'区域的双域引物群体的标记PCR(Tagged PCR)，其例如描述于Grothues et al.Nucleic AcidsRes.21(5):1321-2(1993)中，通过引用以其整体并入本文。进行第一轮扩增以允许在基于来自随机合成的3'区域的单独杂交的热变性的DNA上多次起始。由于3'区域的性质，起始位点被认为在整个基因组中是随机的。因此，可以除去未结合的引物并且可以使用与恒定5’区域互补的引物发生进一步的复制。
序列表
<110> 伊卢米纳剑桥有限公司
<120> 从多个引物测序以增加数据率和密度
<130> P166912.WO.01
<160> 2
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 120
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac cacgacgctc ttccgatcta 60
gatcggaaga gcggttcagc aggaatgccg agaccgatct cgtatgccgt cttctgcttg 120
<210> 2
<211> 120
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
ttactatgcc gctggtggct ctagatgtga gaaagggatg gtgctgcgag aaggctagat 60
ctagccttct cgccaagtcg tccttacggc tctggctaga gcatacggca gaagacgaac 120

Claims (19)

1.用于测定核酸序列的方法，其包括：
提供与支持物结合的至少一个核酸；
将至少两个引物与核酸的相同链杂交；
在允许杂交的条件下在存在下列各项的情况下将所述核酸与酶接触：(i)能够在不同位置处与所述至少一个核酸的相同链杂交的至少两个引物，和(ii)四个标记的部分，其各自包含至少一个选自dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、和dATP的核苷酸类似物，所述四个标记的部分的每个具有不同于其他三个标记的部分的独特标记物的独特标记物；
在所述至少两个引物中的每个处在所述核酸的相同链上进行引物延伸以给出多个延伸读段，每个延伸读段从所述至少两个引物之一延伸，其中相同组的四个标记的部分用于每个延伸读段；
获得对应于每次引物延伸时掺入的至少一个核苷酸碱基的信号数据；
从所述信号数据测定所述核酸碱基的身份并将所述碱基分配至延伸读段；其中所述至少两个引物包含不同水平的封闭和未封闭的引物，从而通过使读段之一比另一个更亮而化学区分每个延伸读段。
2.权利要求1的方法，其中所述方法包括除去未结合的标记的部分的步骤。
3.权利要求1或2的方法，其中所述多个延伸读段包含同时的延伸读段。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述四个标记的部分各包含选自dGTP、dCTP、dTTP、dUTP、和dATP的可逆终止剂类似物。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述酶包含聚合酶或连接酶。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述支持物包含芯片或珠。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述独特标记物包含染料、荧光团、生色团、组合荧光能量转移标签、质量标签，或电泳团。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中至少两个引物具有重叠序列。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中至少两个引物相差单个碱基添加。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中生物信息学信息用于将碱基分配给所述延伸读段。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中同时获得对应于所述至少两个引物延伸中每个的所述信号数据。
12.权利要求1至10中任一项的方法，其中测定所述核苷酸碱基的身份的步骤包括分析对应于在所述多个延伸读段中每个上检测的独特标记物的信号强度概况。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中所述信号数据包括一个或多个图像。
14.权利要求13的方法，其中所述信号数据以对应于所述引物延伸上掺入的多个核苷酸类似物的颜色信号检测，并且其中每个颜色信号对应于不同核苷酸类似物或核苷酸类似物的组合。
15.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法包括信号处理步骤，所述步骤包括信号去卷积、信号改良，和信号选择的一个或多个。
16.前述权利要求中任一项的方法，其中在每个杂交循环时做出多个碱基调用。
17.前述权利要求中任一项的方法，其中将所述碱基分配至延伸读段的步骤包括测定所述核苷酸碱基的位置。
18.前述权利要求中任一项的方法，其中将所述碱基分配至延伸读段的步骤包括为每个延伸读段提供初步碱基调用和最终碱基调用。
19.权利要求18的方法，其中通过将初步碱基调用数据与参考基因组比较来提供最终碱基调用。
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