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Stand der Technik
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Mit bekannten mikrofludischen Vorrichtungen, auch Lab-on-a-Chips genannt, können DNA-haltige Substanzen, beispielsweise Pathogene, über eindeutige Gensignaturen nachgewiesen werden, beispielsweise über sogenannte sequencing-by-synthesis-Verfahren (u.a. Bentley et al. (6 November 2008). „Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry". Nature. 456 (7218): 53-59 und Ju et al. (26 Oktober 2006) „Fourcolor DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators", PNAS 2006 103 (52) 19635-19640; doi:10.1073/pnas.0609513103). Den Nachweisreaktionen ist dabei gemeinsam, dass Nukleotidsequenzen dieser Substanzen im Rahmen des sogenannten Genotypings mittels komplementärer fluoreszenzgelabelter DNA-Sonden abgefragt werden. Im Gegensatz dazu können mittels Genotyping nur die Gensequenzen nachgewiesen werden, für die die Vorrichtung auch eine entsprechende Sonde aufweist. Pathogene verändern sich jedoch im Verlaufe der Zeit genetisch, oft im Zuge der Ausbildung von Resistenzen. Daher müssen die in der Vorrichtung vorgehaltenen Sonden immer wieder angepasst werden, um diese Veränderungen sowie auch neu entdeckte Pathogene abzudecken.
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Offenbarung der Erfindung
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Vorteile der Erfindung
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Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung einen Reaktionsträger für eine mikrofluidische Vorrichtung zur Bestimmung einer Nukleotidsequenz. Der Reaktionsträger umfasst mindestens eine erste Ausnehmung und eine zweite Ausnehmung, wobei in der ersten Ausnehmung erste Fängerprimer und in der zweiten Ausnehmung zweite Fängerprimer an einer Festphase immobilisiert sind. Die ersten Fängerprimer sind dabei von den zweiten Fängerprimern verschieden.
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Der Reaktionsträger kann insbesondere ein Substrat, beispielsweise ein Kunststoffsubstrat umfassen. Unter einer Ausnehmung kann dabei insbesondere eine Vertiefung in einer Oberfläche des Reaktionsträgers verstanden werden. Bei der Nukleotidsequenz handelt es sich insbesondere um eine Abfolge von Nukleotiden eines Nukleotidstrangs oder Nukleinsäurefragments einer Desoxyribonukleinsäure oder Ribonukleinsäure, beispielsweise eines Nukleotidstrangs eines Pathogens oder einer menschlichen oder tierischen Zelle. Unter einem Pathogen ist dabei ein Krankheitserreger zu verstehen, insbesondere ein Virus, ein Bakterium oder ein Einzeller. Unter einer Bestimmung einer Nukleotidsequenz kann insbesondere ein Sequenzierungsverfahren wie beispielsweise oben beschrieben verstanden werden, insbesondere ein sequencing-by-synthesis-Verfahren. Bei den Fängerprimern handelt es sich insbesondere um Nukleotidstränge, welche ausgebildet sind, die zu sequenzierenden Nukleotidstränge zu binden. Vorzugsweise sind die Fängerprimer ferner für eine Vervielfältigung der zu sequenzierenden Nukleotidstränge ausgebildet, insbesondere für eine Vervielfältigung über eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
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Der Reaktionsträger ermöglicht vorteilhafterweise die Vervielfältigung der zu sequenzierenden Nukleotidstränge, insbesondere über die Durchführung einer PCR, auf dem Reaktionsträger, also direkt an einer Festphase, woran unmittelbar anschließend eine Sequenzierung an der Festphase durchgeführt werden kann. Bei einer solchen Festphasen-PCR wird das entstehende PCR-Produkt an die immobilisierten Fängerprimer angebunden. Die zu sequenzierenden Nukleotidstränge werden während der PCR durch die Bindung an die Fängerprimer immobilisiert und somit vorteilhafterweise an einem vorgegebenen Ort, nämlich am Ort der Festphase, für eine nachfolgende Sequenzierung bereitgestellt. Die unmittelbare Immobilisierung der Nukleotidstränge erlaubt auch eine einfache Entfernung von nicht mehr benötigten Reaktionskomponenten, insbesondere durch eine Spülung der Festphase. Ferner ist von besonderem Vorteil, dass keine spezifischen Sonden zum Nachweis der Nukleotidstränge vorgesehen werden müssen, sondern eine Identifizierung über die Sequenzierung der an die Fängerprimer gebundenen Nukleotidstränge möglich ist. Insbesondere können dadurch vorteilhafterweise bekannte DNA-Signaturen und auch Punktmutationen in solchen Signaturen erkannt werden. Durch die immobilisierten und unterschiedlichen Fängerprimer ist ferner vorteilhafterweise eine parallele und ortsaufgelöste Sequenzierung und Identifizierung verschiedener Nukleotidstränge möglich.
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Der Reaktionsträger kann vorzugsweise weitere Ausnehmungen mit weiteren immobilisierten Fängerprimern umfassen, wobei die weiteren Fängerprimer teilweise identisch und teilweise verschiedenen voneinander sein können. Dies erhöht vorteilhafterweise eine Effektivität und Effizienz beziehungsweise eine Parallelität der Bestimmung der Nukleotidsequenzen.
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Unter einer Festphase kann ein Material, ein Stoff oder eine Zusammensetzung aus Materialen und/oder Stoffen in festem Aggregatzustand verstanden werden, worunter auch Gele fallen, insbesondere Agarosegele oder Hydrogele. Die Festphase kann mit dem Reaktionsträger verbunden sein, insbesondere kann die Festphase ein Teil des Reaktionsträgers sein. Die Festphase umfasst dabei vorzugsweise zumindest einen Teil einer Wand oder eines Bodens der ersten und/oder der zweiten Ausnehmung. Dadurch werden die Fängerprimer vorteilhafterweise in den Ausnehmungen immobilisiert.
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Alternativ oder zusätzlich kann die Festphase Partikel umfassen, insbesondere magnetische Partikel, welche mit Hilfe eines Magneten vorteilhafterweise bezüglich der Festphase immobilisiert werden können. Unter magnetischen Partikeln können dabei Partikel mit einem magnetischen oder magnetisierbaren Material verstanden werden, beispielsweise paramagnetische Polymerpartikel.
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Die Verwendung von Partikeln als Festphase hat den Vorteil, dass bei Verwendung einer flüssigen Probe mit darin enthaltenen zu bindenden Nukleotidsträngen eine Kontaktfläche zwischen Festphase und Probe größer ist als bei Verwendung einer planaren Phase, was für eine erhöhte und somit verbesserte Reaktionskinetik aufgrund verkürzter Diffusionswege sorgt. Die Verwendung von magnetischen Partikeln als Festphase hat zudem den Vorteil, dass zum einen die Partikel über eine Magnetkraft an wohldefinierten und somit einfach unterscheidbaren Orten in der mikrofluidischen Vorrichtung festgehalten werden können. Zum anderen können die immobilisierten Nukleotidstränge über magnetische Aktuation an einen beliebigen Ort befördert werden, beispielsweise für eine nachfolgende Prozessierung oder Analyse. Ferner ist von Vorteil, dass eine Spülung der partikelförmigen Festphase im Vergleich zu einer planaren Festphase effektiver durchgeführt werden kann
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Gemäß einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung umfasst die Festphase poröses Material, wobei die ersten und/oder die zweiten Fängerprimer in Poren des porösen Materials immobilisiert sind. Dies hat den Vorteil, dass die Oberfläche zur Immobilisierung von Fängerprimern und damit sequenzierbaren Nukleotidsträngen aufgrund der Poren deutlich vergrößert ist.
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In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung liegen in zumindest einer der Ausnehmungen weitere Primer für die Bestimmung der Nukleotidsequenz in ungebundener Form vor, insbesondere in getrockneter Form. Die weiteren Primer sind dabei vorzugsweise ausgebildet, die PCR zur Vervielfältigung der an die Fängerprimer anbindenden Nukleotidstränge zu unterstützen. Vorzugsweise sind die weiteren Primer zumindest teilweise mit Primern für die PCR dieser Nukleotidstränge identisch. In einer Ausgestaltung sind die weiteren Primer in der ersten Ausnehmung beziehungsweise in der zweiten Ausnehmung mit den ersten beziehungsweise mit den zweiten Fängerprimer zumindest teilweise identisch. Beispielsweise ist eine Sequenz der weiteren Primer in der ersten Ausnehmung beziehungsweise in der zweiten Ausnehmung mit einer Teilsequenz beginnend am 3'-Ende der ersten beziehungsweise der zweiten Fängerprimer identisch.
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In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung liegen in zumindest einer der Ausnehmungen weitere Primer für die Durchführung einer Amplifikationsreaktion vor, insbesondere in getrockneter Form. Unter einer Amplifikationsreaktion ist ein Verfahren zur Vervielfältigung von Nukleotidsträngen zu verstehen, beispielweise eine isotherme Amplifikationsreaktion oder eine PCR. Vorzugsweise sind die weiteren Primer für eine Vervielfältigung der zu sequenzierenden Nukleotidstränge ausgebildet, also insbesondere auf die zu sequenzierenden Nukleotidstränge und die ersten beziehungsweise zweiten Fängerprimer abgestimmt. Im Falle einer PCR als Amplifikationsreaktion kann es sich bei den weiteren Primern um Reverse-Primer oder Forward-Primer handeln, wenn die Fängerprimer Forward-Primer beziehungsweise Reverseprimer sind. Ferner können weitere Reagenzien für die Durchführung der Amplifikationsreaktion, insbesondere einer PCR, in zumindest einer der Ausnehmungen vorliegen, insbesondere in getrockneter Form, beispielsweise Additive für die Amplifikationsreaktion.
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Gegenstand der Erfindung ist auch eine mikrofluidische Vorrichtung mit einem erfindungsgemäßen Reaktionsträger. Beispielsweise ist der Reaktionsträger lösbar in der mikrofluidischen Vorrichtung angeordnet, beispielsweise über einen Einrastmechanismus oder Einklippmechanismus. Alternativ kann der Reaktionsträger auch über eine Klebung mit der mikrofluidischen Vorrichtung verbunden sein, was vorteilhafterweise eine besonders fluiddichte Verbindung ermöglicht. Der Reaktionsträger kann somit vorteilhafterweise nach der Herstellung und Immobilisierung der ersten und zweiten Fängerprimer in die Vorrichtung eingebracht werden kann.
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Gemäß einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung umfasst die mikrofluidische Vorrichtung einen Bereich für eine Vorvervielfältigung der zu sequenzierenden Nukleotidstränge. Bei diesem Bereich kann es sich insbesondere um eine Kammer der Vorrichtung handeln, wobei vorzugsweise eine fluidische Verbindung zwischen der Kammer und dem Reaktionsträger unterbrochen werden kann, beispielsweise durch ein Ventil. Unter einer Vorvervielfältigung ist eine Vervielfältigung der zu sequenzierenden Nukleotidstränge zu verstehen, bevor die zu sequenzierenden Nukleotidstränge mit dem Reaktionsträger in Kontakt gebracht werden, beispielsweise eine Vervielfältigung über eine PCR, insbesondere als Teil einer verschachtelte PCR. Dies hat den Vorteil, dass eine große Anzahl der zu sequenzierenden Nukleotidstränge in der mikrofluidischen Vorrichtung erzeugt werden können. Optional kann in diesem Bereich auch eine Verdünnung, insbesondere mit einer Pufferlösung, erfolgen, insbesondere nach der Vorvervielfältigung.
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Vorzugsweise umfasst die mikrofluidische Vorrichtung einen an den Reaktionsträger angrenzenden Bereich, wobei der Bereich für eine Aufnahme eines Magneten derart ausgebildet ist, dass sich ein Magnetfeld des Magneten zur Fixierung einer oben beschriebenen magnetischen oder magnetisierbaren Festphase in den Ausnehmungen in eine oder mehrere der Ausnehmungen erstrecken kann. Bei dem Magneten kann es sich um einen Permanentmagneten oder einen Elektromagneten handeln, welcher ein für die Manipulation der Partikel geeignetes Magnetfeld erzeugen kann. Beispielsweise kann der Reaktionsträger eine Ausnehmung zur Aufnahme eines Magneten aufweisen. Die Vorrichtung kann neben dem vorzugsweisen Einrast- oder Einklippmechanismus einen Bereich, insbesondere eine Ausnehmung, für die Aufnahme des Magneten aufweisen.
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Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zum Bestimmen einer Nukleotidsequenz mit einem erfindungsgemäßen Reaktionsträger. In einem ersten Schritt des Verfahrens werden erste Fängerprimer der ersten Ausnehmung und zweite Fängerprimer in der zweiten Ausnehmung des Reaktionsträgers immobilisiert, wobei die ersten Fängerprimer von den zweiten Fängerprimern verschieden sind. In einem zweiten Schritt werden zu sequenzierende Nukleotidstränge an die ersten und/oder zweiten Fängerprimer gebunden. Davor können die zu sequenzierende Nukleotidstränge in einem optionalen Schritt vervielfältigt worden sein, insbesondere durch Durchführung einer PCR. In einem dritten Schritt wird die Sequenz der gebundenen Nukleotidstränge bestimmt, insbesondere über ein sequencing-by-synthesis-Verfahren.
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Zu den Vorteilen des erfindungsgemäßen Verfahrens und den folgenden vorteilhaften Weiterbildungen und Ausgestaltungen wird auch auf die oben angeführten Vorteile verwiesen.
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Vorzugsweise umfasst der Schritt des Immobilisierens eine Bindung der Fängerprimer an die Festphase des Reaktionsträgers.
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Bei der Festphase kann es sich um eine mobile Festphase handeln, beispielsweise um vorzugsweise magnetische Partikel, wie oben ausgeführt. In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens erfolgt die Bindung der Fängerprimer an die Festphase vor der Immobilisierung der Festphase am Reaktionsträger. Dies hat den Vorteil, dass die Bindung der Fängerprimer an die Festphase auch separat vom Reaktionsträger und insbesondere außerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung erfolgen kann.
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Gemäß einer besonders vorteilhaften Weiterbildung des Verfahrens erfolgt während des Bindens der Nukleotidstränge an die ersten und/oder zweiten Fängerprimer ein Verschluss der Ausnehmungen, insbesondere durch eine Abdeckung mit einer Flüssigkeit. Dies hat den Vorteil, dass in jeder Ausnehmung eine separate und querkontaminationsfreie Reaktion ablaufen kann. Ferner werden vorteilhafterweise die Ausnehmungen vor Kontaminationen geschützt und ein Austreten von Material aus den Ausnehmungen erschwert. Bei der Flüssigkeit kann es sich insbesondere um eine unpolare Flüssigkeit handeln, beispielsweise ein Öl.
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Figurenliste
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Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen schematisch dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente werden gleiche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung der Elemente verzichtet wird.
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Es zeigen
- 1 und 2 ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung und
- 3 ein Flussdiagramm zu einem Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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Ausführungsformen der Erfindung
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1 zeigt schematisch ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung 200 mit einem Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Reaktionsträgers 100 zur Bestimmung einer Nukleotidsequenz. Der Reaktionsträger 100 umfasst in diesem Beispiel eine erste Ausnehmung 101, ein zweite Ausnehmung 102 und eine dritte Ausnehmung 103, welche jeweils als Vertiefungen im Reaktionsträger 100 ausgeführt sind. Beispielsweise umfassen die Vertiefungen 101, 102, 103 jeweils ein Volumen zwischen 1 Pikoliter und 100 Mikroliter, bevorzugt zwischen 1 Nanoliter und 10 Mikroliter.
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Alle Ausnehmungen 101, 102, 103 umfassen eine Festphase 110, in diesem Beispiel magnetische Partikel 110. Bei den Partikeln 110 kann es sich insbesondere um magnetische Mikro- oder Nanopartikel mit einem beispielhaften Durchmesser zwischen 10 Nanometer und 500 Mikrometer, vorzugsweise zwischen 100 Nanometer und 100 Mikrometer handeln, wie beispielsweise Dynabeads® oder BioMag® sowie BioMag® „Unconjugated Particles“. An die Partikel 110 in der ersten Ausnehmung 101 sind erste Fängerprimer 121, an die Partikel 110 in der zweiten Ausnehmung 102 zweite Fängerprimer 122 und an die Partikel 110 in der dritten Ausnehmung 103 dritte Fängerprimer 123 gebunden. Unterschiedliche Fängerprimer 121, 122, 123 ermöglichen somit einen parallelen und ortsaufgelösten Nachweis verschiedener Nukleotidstränge. Alternativ oder zusätzlich kann ein Teil des Reaktionsträgers 100, insbesondere ein Teil einer Wand 131 oder eines Bodens 132 einer oder mehrerer Ausnehmungen 101, 102, 103, poröses Material aufweisen, wobei in den Poren Fängerprimer immobilisiert sind. Beispielsweise kann dieser Teil des Reaktionsträgers 100 poröses Silizium umfassen.
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Die Ausnehmungen 101, 102, 103 können wie oben beschrieben ferner Stoffe für eine PCR umfassen, beispielsweise in gefriergetrockneter Form, insbesondere Polymerasen, Nukleotide, Salze und auch PCR-Enhancer. Außerdem können weitere für die PCR erforderliche Primer, beispielsweise für eine Konzentration zwischen 0,1 und 1,5 Mikromolar, sowie weitere Fängerprimer, beispielsweise für eine Konzentration zwischen 0,001 und 1 Mikromolar, in den Ausnehmungen 101, 102, 103 vorgelagert sein, letztere um die PCR zu unterstützen und insbesondere eine PCR auch in der flüssigen Phase zu ermöglichen. Diese Stoffe und Primer können ganz oder teilweise in dehydrierter, insbesondere in gefriergetrockneter Form in den Ausnehmungen 101, 102, 103 vorliegen, um bei einem Einfüllen einer flüssigen Probe mit zu sequenzierenden Nukleotidsträngen wieder rehydriert und somit aktiviert zu werden. Um eine Verschleppung von Reagenzien aus den Ausnehmungen zu verhindern, können die in den Ausnehmungen gelagerten Stoffe mit Polyethylenglykol (PEG) überlagert sein. Eine solche Anwendung von PEG ermöglicht insbesondere eine verzögerte und temperaturinduzierte Aufnahme der Stoffe in eine Flüssigkeit, insbesondere in die Probenflüssigkeit.
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In 1 ist auch schematisch dargestellt, dass der Reaktionsträger 100 beispielsweise über Rasthaken 141, 142 mit der Vorrichtung 200 vorzugsweise lösbar verbunden werden kann. Ferner ist schematisch gezeigt, dass die Vorrichtung 200 einen Bereich 210 für eine Vervielfältigung und vorzugsweise Verdünnung der zu sequenzierenden Nukleotidsträngen aufweist. Dieser Bereich 210 kann insbesondere als eine Kammer 210 in der Vorrichtung 200 ausgeführt sein, welche mit dem Reaktionsträger über ein Ventil 211 fluidisch verbunden ist.
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Wie in 2a dargestellt, können die magnetischen Partikel 110 durch einen Magneten 300 in den Vertiefungen 102 fixiert werden, wobei der Magnet 300 beispielsweise in einem an Reaktionsbereich 101 angrenzenden zweiten Bereich 105 angeordnet sein kann. In 2b sind beispielhaft zwei Partikel 110 mit immobilisierten Fängermolekülen 121 gezeigt, an welche sequenzierbare Nukleotidstränge 400 gebunden sind. An einem der beiden Partikel 110 sind bereits Sequenzierprimer 401 für eine Sequenzierung über ein sequencing-by-synthesis-Verfahren an den immobilisierten Nukleotidsträngen 400 gebunden.
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3 zeigt ein Flussdiagramm zu einem Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens 500 zum Bestimmen einer Nukleotidsequenz, welches beispielsweise mit den oben beschriebenen Ausführungsbeispielen des erfindungsgemäßen Reaktionsträgers 100 und der erfindungsgemäßen Vorrichtung 200 durchgeführt werden kann.
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In einem ersten Schritt 501 des Verfahrens 500 werden die ersten Fängerprimer 121 der ersten Ausnehmung 101 und zweite Fängerprimer 122 in der zweiten Ausnehmung 102 des Reaktionsträgers 100 immobilisiert. Soweit vorhanden, können weitere Fängerprimer in weiteren Ausnehmungen des Reaktionsträgers immobilisiert werden. Wie oben beschrieben, kann dies vorzugsweise über eine Bindung der Fängerprimer 121, 122, 123 an eine mobile Phase in Form von magnetischen Partikeln 110 erfolgen, welche mit Hilfe eines Magneten 300 in den Ausnehmungen 101, 102, 103 des Reaktionsträgers 100 gehalten werden können. Die Bindung der Fängerprimer 121, 122, 123 an die Festphase kann beispielsweise über Silane erfolgen, beispielsweise APTES, an welche Linker angebunden werden, beispielsweise 1,4-phenylene diisothiocyanate (PDITC), glutaraldehyde, s-SIAB, s-MBS, s-GMBS, s-MBP. Auch eine direkte Immobilisierung unter Verwendung von poly(C,T)-getaggten Nukleinsäuren in Kombination mit UV-initiierter Immobilisierung ist möglich (Y. Sun, R. Dhumpa, D. Bang, J. Hogberg, K. Handberg, A. Wolff, „A lab-on-a-chip device for rapid identification of avian influenza viral RNA by solid-phase PCR", Lab Chip, vol. 11, pp. 1457-1463, 2011).
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In einem zweiten Schritt 502 werden zu sequenzierende Nukleotidstränge 400 an die Fängerprimer gebunden, vorzugsweise im Rahmen einer Festphasen-PCR. Vorzugsweise sind die Ausnehmungen während des Bindens der Nukleotidstränge 400 an die Fängerprimer verschlossen, insbesondere durch eine Abdeckung mit einer Flüssigkeit, wie beispielsweise mit einer Ölschicht oder einer Silikonschicht, um eine möglichst kontaminationsfreie Bindung zu gewährleisten. Davor können die zu sequenzierende Nukleotidstränge in einem optionalen Schritt vervielfältigt worden sein, insbesondere durch Durchführung einer PCR. Dies hat den Vorteil, dass abhängig von der Anzahl der Ausnehmungen eine ausreichende Menge an Nukleotidsträngen für die Durchführung des zweiten Schritts 502 bereitgestellt wird.
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Anschließend kann eine Spülung der Partikel 110 mit einem Waschpuffer, zum Beispiel mit einer phosphatgepufferten Salzlösung (kurz PBS), in einem dritten Schritt 503 erfolgen, um auch gegebenenfalls Reaktionskomponenten der PCR zu entfernen. Die an die Fängerprimer 121, 122, 123 gebundenen Nukleotidstränge können zwei über Wasserstoffbrücken miteinander verbundene Sequenzen von Nukleotiden aufweisen, welche komplementär zueinander sind und wobei ein Ende einer Sequenz jeweils an einen Fängerprimer gebunden ist beziehungsweise die Verlängerung dessen darstellt. Mit anderen Worten handelt es sich jeweils um zwei zueinander komplementäre Nukleotidstränge, wobei jeweils einer der beiden Nukleotidstränge an den Fängerprimer direkt gebunden ist. Zur Vorbereitung der Sequenzierung kann der nicht direkt an den Primer gebundene Nukleotidstrang durch Lösung der Wasserstoffbrücken entfernt werden, beispielsweise unter Einsatz einer Natronlauge. Die Natronlauge kann dabei sowohl zur Entfernung dieser Nukleotidstränge als auch zur oben beschriebenen Spülung verwendet werden. Die Natronlauge kann eine Konzentration von 0,1 Molar und weitere Stoffe wie Detergenzien oder Salze aufweisen. Anschließend kann mit Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid, kurz Tris-HCI, oder Kochsalzlösung gewaschen werden, um insbesondere die Natronlauge zur neutralisieren.
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In einem vierten Schritt 504 wird die Sequenz der gebundenen Nukleotidstränge bestimmt, insbesondere über ein sequencing-by-synthesis-Verfahren, welches im Folgenden beispielhaft dargelegt wird. Der vierte Schritt 504 kann dabei vorzugsweise die folgenden Schritte fünf bis zehn umfassen.
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In einem fünften Schritt 505 wird der Sequenzierprimer 401 zu den gebundenen ersten Nukleotidsträngen gegeben, wobei der Sequenzierprimer 401 derart ausgestaltet ist, dass er an ein freies Ende der ersten Nukleotidstränge 400 anbindet, wie in 2b dargestellt. In einem sechsten Schritt 506 erfolgt eine Zugabe von Nukleotiden einer von mehreren vorgegebenen Sorten zu den gebundenen ersten Nukleotidsträngen, wobei die zugegebenen Nukleotide ein Label, vorzugsweise eine Fluorophor, und einen Polymeraseterminator aufweisen. Insbesondere handelt es sich bei den vorgegebenen Sorten um Adenosintriphosphat, Guanosintriphosphat, Cytidintriphosphat und Thymidintriphosphat. Als Fluorophore eignen sich beispielsweise Cyaninfarbstoffe wie Cy3, oder Cy5 oder Atto-Äquivalente. Beispielsweise handelt es sich bei dem Polymeraseterminator um eine Veresterung der 3'-Hydroxyl-Gruppe eines Nukleotids. Die Zugabe erfolgt dabei unter Beigabe von Polymerase, so dass eine Bindung jeweils eines der zugegebenen Nukleotide an die gebundenen Nukleotidstränge erfolgt, wenn eine Komplementarität des zugegebenen Nukleotids mit dem in Bezug auf den gebundenen Sequenzierprimer nächstgelegenen Nukleotids ohne komplementären Nukleotid eines jeweiligen gebundenen ersten Nukleotidstrangs vorliegt. Die Zugabe der Polymerase kann dabei gemeinsam oder vor der Zugabe der Nukleotide erfolgen. In einem siebten Schritt 507 werden ungebundene Nukleotide entfernt, vorzugsweise über eine Spülung der Festphase, beispielsweise mit PBS, bevor in einem achten Schritt 508 eine Detektion der gebundenen Nukleotide über Detektion des Labels erfolgt. Für die optische Detektion kann ein konventionelles optisches System bestehend aus Anregungslicht, Anregungsfilter, Detektionsfilter und Detektor zum Einsatz kommen.
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Wenn die Sequenz der gebundenen Nukleotide über die Detektion der Label noch nicht bis zu einer gewünschte Länge bestimmt ist, erfolgt in einem neunten 509 Schritt eine Entfernung des Labels und des Polymeraseterminators, beispielsweise über eine Spülung der gebundenen ersten Nukleotidstränge mit Na2PdCl4/P(PhS03Na)3 als Puffer bei einer Verwendung von 3'-O-allyl Gruppen als Polymeraseterminator. Dadurch werden an den gebundenen ersten Nukleotidstränge freie 3'-Hydroxyenden generiert, wodurch ein Einbau des nächsten komplementären Nukleotides ermöglicht wird. Anschließend erfolgt in einem zehnten Schritt 510 eine erneute Zugabe von Polymerase und von Nukleotiden einer der anderen vorgegebenen Sorten mit Label und Polymeraseterminator und eine Wiederholung der oben ausgeführten Schritte sieben 507 bis zehn 510, bis die Sequenz der gebundenen Nukleotide bis zur gewünschten oder vorgegebenen Länge über die Detektion der Label in einem der achten Schritte 508 bestimmt ist.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- (u.a. Bentley et al. (6 November 2008). „Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry“. Nature. 456 (7218): 53-59 [0001]
- Ju et al. (26 Oktober 2006) „Fourcolor DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators“, PNAS 2006 103 (52) 19635-19640; doi:10.1073/pnas.0609513103 [0001]
- Y. Sun, R. Dhumpa, D. Bang, J. Hogberg, K. Handberg, A. Wolff, „A lab-on-a-chip device for rapid identification of avian influenza viral RNA by solid-phase PCR“, Lab Chip, vol. 11, pp. 1457-1463, 2011 [0028]
