DE102005029811B4

DE102005029811B4 - Oligonukleotidanordnungen, Verfahren zu deren Einsatz und deren Verwendung

Info

Publication number: DE102005029811B4
Application number: DE102005029811A
Authority: DE
Inventors: Thomas Ehben; Christian Dr. Zilch
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: BIOVILLE GMBH, DE
Priority date: 2005-06-27
Filing date: 2005-06-27
Publication date: 2009-03-12
Anticipated expiration: 2025-06-28
Also published as: DE102005029811A1; US20100323360A1; US20070003959A1

Abstract

Oligonukleotidanordnungen aufweisend jeweils mindestens zwei durch mindestens einen Spacer verknüpfte hybridisierbare Oligonukleotidsequenzen als Primersequenzen, dadurch gekennzeichnet, dass der Spacer ausgewählt ist aus funktionalisierten linearen oder verzweigten Kohlenstoffketten.

Description

Die Erfindung betrifft Oligonukleotidanordnungen aufweisend jeweils mindestens zwei über zumindest einen Spacer (Verbindungsstück) verknüpfte Oligonukleotidsequenzen und ein Verfahren unter Verwendung der Oligonukleotidanordnungen zur Amplifikation und/oder Detektierung von Nukleinsäuresequenzen sowie deren Verwendung in der Lifescience-Forschung und im Rahmen von High-Throughput-Techniken.
Nukleinsäureassays stellen in zunehmendem Maße ein wichtiges Instrument dar, um Aufschluss über Erkrankungen, Gesundheitsrisiken und Therapiemöglichkeiten eines Patienten zu erhalten und sind insbesondere zur Detektion von Krankheitserregern geeignet, da sie in der Lage sind, Erreger spezifisch anhand bestimmter in diesen auftretender DNA- oder RNA-Sequenzen zu identifizieren.
Diese Tests bieten gegenüber bisher angewandten labordiagnostischen Methoden viele Vorteile, weil das Kultivieren von Bakterien oder Viren oder der Nachweis einer Immunantwort im menschlichen Körper präparativ aufwendig ist und häufig unwirtschaftlich lange Analysezeiten erfordert.
Die meisten herkömmlichen Immunoassays zur Diagnose von Infektionen können lediglich die Präsenz von Erregern indirekt über die Erfassung einer Immunantwort des menschlichen Körpers nachweisen. Mit einem Nukleinsäureassay, das das Genom des Erregers analysiert, lassen sich zusätzlich Informationen über den Erreger gewinnen, z. B. über Subtypen oder Mutationen, die zu Resistenzen gegenüber bestimmten Medikamenten geführt haben. Solche Informationen haben zusätzliche therapeutische Relevanz. Diese spezifischen Erregerinformationen werden heute u. a. bei der Diagnose von HIV, HCV, Chlamydia und Gonorrhoe verwendet.
Durch den direkten Nachweis der Erreger können Nukleinsäureassays Infektionskrankheiten häufig in einem früheren Stadium als herkömmliche Assays erkennen, wenn z. B. ein Virus bereits latent im Patienten vorhanden ist, die Krankheit aber noch nicht ausbricht und somit noch keine Immunreaktion im Patienten ausgelöst hat.
Bisher haben in der Anwendung im wesentlichen zwei Varianten eines Nukleinsäureassays zum Stand der Technik beigetragen.
(1) Dies ist zum einen der homogene Nukleinsäureassay mit Hybridisierungssonden. Dabei werden bestimmte Sequenzabschnitte, die in einer nukleinsäurehaltigen Probe enthalten sind, mit zu diesen Abschnitten komplementären markierten Oligonukleotiden (Sonden) hybridisiert und mittels der Marker detektiert.
Die Polymerase-Ketten-Reaktion ("Polymerase Chain Reaction", PCR) kann weiterhin Teil eines Nukleinsäureassays sein und die oben genannten Hybridisierungssonden ersetzten oder generieren. Hier werden an Starteroligonukleotidsequenzen (Primer) freie Desoxynukleotide unter Ausnutzung des Templateffektes einer Zielsequenz, die in einer DNA-Probe vorliegt, und unter Zuhilfenahme einer DNA-Polymerase angefügt, was die Zielsequenzen in hohem Maße vervielfacht. Diese so durch Amplifikation gewonnenen Nukleinsäuresequenzen werden dann auch als Amplikons bezeichnet.
Alternative Verfahren zur PCR bzw. deren Weiterentwicklungen sind z. B. die "strand displacement amplification" (Walker, G. T., et al., Nucleic Acids Res. (1992)7, 1691–1996), die Ligase-Kettenreaktion ("ligase chain reaction"), die "rolling circle amplification", die Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifikation ("nucleic acid sequence-based amplification"), die "branched DNA", die transkriptions-vermittelte Amplifikation ("transcription-mediated amplification"), "hybrid capture" und "Invader".
Gängige bekannte Methoden zur Detektierung beinhalten z. B. den Einsatz von Fluoreszenzmarkern, Enzymen, Radioisotopen, magnetischen Partikeln, Quantum Dots (Nanokristalle), die Detektierung mittels Antikörpern und interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffen.
Unter Anwendung homogener Nukleinsäureassays werden der Flüssigphase zur Detektierung zu Beginn i. d. R. Moleküle zugegeben, die ein fluoreszenzoptisches Signal abgeben, dessen Intensität vom Verlauf der Amplifikationsreaktion abhängig ist. Am häufigsten sind folgende Verfahren:

– FRET (Fluorescent Resonant Energy Transfer): Während jeder Phase der Amplifikationszyklen, in denen die Nukleinsäuren einzelsträngig vorliegen, lagern sich hieran Fluoreszenzmoleküle und sogenannte Quencher ("Auslöscher") in unmittelbarer Nähe an. Die Quencher führen durch Resonanzeffekte zu einer lokalen Auslöschung der optischen Emission der Fluoreszenzmoleküle, solange diese Nähe aufrechterhalten bleibt. Kommt es zu einer Amplifikation der jeweiligen Nukleinsäure, werden hierbei sowohl die Fluoreszenzmoleküle als auch die Quencher von der Nukleinsäure gelöst und verlieren ihre räumliche Nähe. Die optische Auslöschung bricht zusammen und ein Fluoreszenzsignal kann durch die transparente Reaktionskammer hindurch gemessen werden.
– "Molecular Beacon" oder "Hairpin": Der Flüssigphase sind Moleküle beigegeben, die komplementär zur gesuchten Zielsequenz sind (oder zu einem Teil von ihr). An zwei entfernten Stellen eines solchen "Beacons" befinden sich je ein Fluoreszenz- und ein Quenchermolekül. Diese Stellen sind durch komplementäre Gruppen lose miteinander verbunden. Befindet sich ein "Beacon" frei in Lösung, formt es sich deshalb so, dass Fluoreszenzmolekül und Quencher räumlich nah beieinander sind und die optische Emission ausgelöscht wird. Sobald durch Amplifikation eine hohe Konzentration der gesuchten Nukleinsäure vor liegt, lagern sich die "Beacons" mit einer hierzu komplementären Gruppe an diese Nukleinsäuremoleküle an. Dies geschieht während der Phasen der Amplifikation, in denen die Nukleinsäuren einzelsträngig vorliegen. Die ursprünglich bestehenden losen komplementären Verbindungen werden dabei aufgebrochen, die "Beacons" werden gestreckt und Fluoreszenzmolekül und Quencher werden räumlich voneinander getrennt. Es kommt zu einer Signalemission.
– Hybridisierungssonden: Hier befinden sich z. B. zwei verschiedene Fluoreszenzmarker in der Flüssigphase, die nur in unmittelbarer räumlicher Nähe zueinander ein geeignetes fluoreszenzoptisches Signal emittieren. Dabei fungiert einer der Marker als Akzeptor, der andere als Donator. Die Emission wird durch Ladungsträgeraustausch initiiert. Beide Marker sind mit jeweils einer Hybridisierungssonde gekoppelt, die eine komplementäre Sequenz zu nahe beieinanderliegenden Bereichen der gesuchten Zielsequenz aufweisen. Kommt es zu einer starken Amplifikation der Zielsequenz und zu einer Steigerung von deren Konzentration, können sich die Marker vermehrt in unmittelbarer Nähe zueinander an die Zielsequenz anlagern. Dadurch wird ein Ladungsträgeraustausch ermöglicht, und ein optisches Signal wird emittiert.
– Interkalierende Fluoreszenzfarbstoffe: Diese Stoffe lagern sich zwischen den Basenpaaren doppelsträngiger DNA an, wodurch eine Signalemission initiiert wird. Erhöht sich durch Amplifikation die Konzentration dieser doppelsträngigen DNA (jeweils nach jeder Elongationsphase der Zyklen), verstärkt sich somit auch die Signalemissi on.

Diese Verfahren sind in der Forschung und teilweise in der medizinischen Routine etabliert, haben aber z. T. den Nachteil, dass sie einen erheblichen apparativen Aufwand mit sich bringen und die Kosten für die speziellen Marker relativ hoch liegen. Diese Verfahren können jedoch auch im Rahmen des Detektionsschrittes für die vorliegende Erfindung Anwendung finden.
Bei der technischen Realisierung der Nukleinsäureassays für die klinische Routine sind zwei Varianten von Bedeutung.
Bei homogenen Assays finden die erforderlichen chemischen Reaktionen in einer homogenen Flüssigphase statt. Die z. B. aus Blut oder anderen Patientenproben gewonnene und aufbereitete Nukleinsäure wird hierbei zyklisch amplifiziert, d. h. bei jedem extern durch Temperaturschwankungen gesteuerten Reaktionszyklus nimmt die Anzahl der Nukleinsäuremoleküle (Amplikons) zu, sofern die gesuchte Sequenz in der Patientenprobe vorhanden war.
Spezifische Primerpaare in der Lösung sorgen dabei dafür, dass nur die gesuchte Zielsequenz amplifiziert wird. Durch Mischung verschiedener Primerpaare ist es auch möglich, mehrere Zielsequenzen gleichzeitig zu amplifizieren (Multiplex-Verfahren).
Qualitative Messungen sind möglich, indem nach einer vorher definierten Anzahl von Amplifikationszyklen geprüft wird, ob die Konzentration der aufgedoppelten Nukleinsäuremoleküle einen bestimmten Schwellwert übersteigt.
Für eine Quantifizierung wird diese Konzentration nach jedem Zyklus erfasst und die Anzahl der Zyklen bis zum Erreichen eines bestimmten Schwellwertes bestimmt. Diese Anzahl ist ein Maß für die Konzentration der gesuchten Nukleinsäure in der Patientenprobe.
Das Multiplex-Verfahren wird hierbei auch eingesetzt, um parallel zur Patientenprobe auch Kontrollen mitzuverstärken, die man der Lösung vor Beginn der Amplifikation in bekannter Menge zugibt.
(2) Als weiteres Verfahren eines Nukleinsäureassays sind die sogenannten Mikroarrays (gelegentlich auch "Gen- oder Biochips" genannt) bekannt. Hier werden die Nukleinsäureassays in Gegenwart einer mit einem Trägermaterial verbundenen DNA-Sequenz (gleich Fängermolekül) durchgeführt. Statt jedoch die Konzentration der gesuchten Zielsequenz in der homogenen Flüssigphase zu messen, wird nach der Amplifikation eine Hybridisierung durchgeführt, bei der lokal immobilisierte Fängermoleküle bestimmte Nukleinsäuren spezifisch anlagern. Die Konzentrationen der Anlagerungen am Trägermaterial werden infolge der erhöhten Signalemission messtechnisch erfasst. Bei qualitativen Assays ist das Überschreiten eines bestimmten Schwellwertes ein Indiz für das Vorhandensein einer gesuchten Zielsequenz in der Patientenprobe. Bei quantitativen Assays wird die Menge der jeweils an spezifischen Fängermolekülen angelagerten Nukleinsäuren erfasst. Sie ist ein Maß für die Konzentration der jeweiligen Nukleinsäuresequenz in der Patientenprobe.
Der wesentliche Vorteil von Mikroarrays gegenüber homogenen Assays ist die hohe Parallelisierung. Bei der Amplifikation können Primer eingesetzt werden, die z. T. nicht spezifisch für bestimmte Zielsequenzen sind, sondern bestimmte Sequenzabschnitte unabhängig von genetischen Variationen der Patientenprobe verstärken. Während der Hybridisierung erfolgt dann eine feine Differenzierung durch die Verwendung einer Vielzahl verschiedener Fängermoleküle. Die für die klinische Diagnostik entwickelten Mikroarrays haben z. T. über 100 verschiedene Fängermoleküle.
Bei Mikroarrays werden während der Amplifikation alle amplifizierten Kopien der Nukleinsäuresequenzen mit einem Marker gekoppelt. Meist handelt es sich um fluoreszenzoptische Marker, z. B. Cy3 oder Cy5. Ist eine bestimmte Nukleinsäuresequenz in hoher Konzentration in der Patientenprobe vorhanden, wird sie stark amplifiziert und während der Hybridisierung in großer Konzentration von den jeweiligen Fängermolekülen angelagert. Es kommt zu einer lokal erhöhten Fluoreszenzemission, die messtechnisch für die verschiedenen Fängermoleküle erfasst wird.
Auch dieses Verfahren ist etabliert, hat aber den Nachteil, dass die Signalemission durch die begrenzte Hybridisierungseffizienz beeinträchtigt ist, d. h. nicht jedes der Fängermoleküle lagert auch tatsächlich ein markiertes Nukleinsäuremolekül an. Zusätzlich problematisch ist die Notwendigkeit, die Emission der durch Fängermoleküle angelagerten, markierten Nukleinsäuren von denjenigen nichtangelagerten, also frei in Lösung befindlichen Nukleinsäuren zu unterscheiden. Dies wird entweder durch mehrere Waschschritte nach abgeschlossener Hybridisierung oder durch dreidimensional auflösende Signalerfassung erreicht (z. B. Messung im evaneszenten Feld oder konfokale Optik).
Durch die Technologie der Amplifikation kann die Sensitivität stark erhöht werden, was vor allem für die Detektion von Nukleinsäuren wichtig ist, die in nur sehr geringer Konzentration in der Patientenprobe vorkommen. Für die Bestimmung dieser Konzentration ist eine hohe Sensitivität und eine große dynamische Bandbreite sehr wichtig.
Bei der Amplifizierung wird ein bestimmter Abschnitt auf der Ziel-DNA des zu untersuchenden Materials (z. B. eines Bakteriums, Viruses oder Chromosoms) unter Zuhilfenahme passender Oligonukleotide als Primer kopiert. Die Primer sind üblicherweise mit geeigneten Markern (mit z. B. fluoreszierenden, radioaktiven oder enzymatischen Eigenschaften) verknüpft, die nach der Aufbereitung der Amplifikations-Produkte eine Detektierung ermöglichen (Schweitzer, B., Kingsmore, S., Curr. Opin. Biotech. (2001) 12, 21–27).
In der WO 03/038059 A2 sind Oligonukleotid-Primer für PCR-Reaktionen beschrieben, die an Nanopartikel, insbesondere kolloidale Goldpartikel gebunden sind. Die Primer sind über Linker, z. B. Thiolgruppen oder Kohlenstoffketten, an die Goldpartikel gekoppelt.
Nicewarner-Pena et al haben in Journal of the American Chemical Society (2002) 124, 7314–7323 ebenfalls an Nanopartikel gebundene Oligonukleotide für Hybridisierungsreaktionen und enzymatische Primer-Extension beschrieben.
Durch Godrich et al wurden in Langmuir (2004) 20, 10246–10251 DNA: Nanospären-Biokonjugate beschrieben, welche mit komplementären Nukleinsäuren Aggregate bilden.
Obwohl die oben genannten Techniken eine ausgeprägte Sensitivität besitzen, beinhalten sie jedoch die Probleme eines hohen Zeit- und apparativen Aufwandes, hohe Kosten der Marker und eventuell aufwendige Schutzvorrichtungen wie im Falle der Radioisotope. Es herrscht somit ein steigendes Verlangen nach einfacheren und kostengünstigeren Messmethoden, die einen hohen Probendurchsatz ermöglichen und zumindest vergleichbare Analysenkraft aufweisen. Weiterhin sollte auch der personelle und apparative Aufwand für die Auswertung möglichst gering sein, um einen dezentralen Einsatz der Methode zu ermöglichen. Sie sollten dabei jedoch keinen negativen Einfluss auf die sensible Reaktionskinetik der Nukleinsäureamplifikation haben.
Obige Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche. Bevorzugte Ausführungsformen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche oder nachfolgend beschrieben.
Die Erfindung besteht somit u. a. in der Bereitstellung von Oligonukleotidanordnungen, die jeweils mindestens zwei, vorzugsweise mehr als drei, besonders bevorzugt mehr als 100 und insbesondere mehr als 1000, durch einen oder mehrere Spacer verbundene hybridisierbare Oligonukleotidsequenzen aufweisen, wobei zumindest einer der Spacer mindestens einen Marker aufweisen kann. Bei dem Marker kann es sich um Fluoreszenzmoleküle, andere optisch aktive Moleküle, magnetische Partikel, Quantum Dots, Enzyme, elektrisch aktive Moleküle oder Radioisotope handeln.
Weiterhin können die Marker aber auch affinitiv zu ihrem Komplementär wirken, wie z. B. bei Antigen(Hapten)/Antikörperwechselwirkungen (z. B. Digoxigenin oder Biotin) oder Thiolgruppen auf Goldoberflächen. Die Marker können aber auch lediglich zur Unterstützung der Konglomeratbildung dienen. Als derartige "passive" Marker können u. a. Metalle, Metallionen und Polymere eingesetzt werden. Auch Marker, die einen optischen Farbumschlag als Folge der Konglomeratbildung auslösen, sind Teil der Erfindung.
Schließlich kann die Detektion der gebildeten Netzwerke auch rein optisch, wie z. B. mittels Trübungsmessung, oder gravi metrisch, wie z. B. mittels der Piezo-Sensor-Technik der Siemens AG, durchgeführt werden.
Weiterhin stellt die Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation und/oder Detektierung von Nukleinsäuren unter Verwendung dieser Marker bereit. Die hybridisierbaren Oligonukleotidsequenzen werden im Folgenden auch als Primer bzw. Primersequenzen bezeichnet.
Die Erfindung ist weiterhin dadurch ausgezeichnet, dass "upstream"-(komplementär zur sense DNA) und "downstream"-(komplementär zur antisense DNA)hybridisierbare Oligonukleotidsequenzen gleichzeitig Bestandteil einer Oligonukleotidanordnung sein können oder die Oligonukleotidanordnungen in der Summe aus jeweils Oligonukleotidanordnungen mit lediglich "upstream"- und solchen mit lediglich "downstream"-hybridisierbaren Oligonukleotidsequenzen zusammengesetzt sind.
In den Oligonukleotidanordnungen dienen die Oligonukleotide als Primer (Starteroligonukleotide) in gewohnter Weise für Amplifizierungsreaktionen oder als Sonden zur Hybridisierung zu der den Zielsequenzen komplementären Oligonukleotiden.
Die in der Erfindung offenbarten, die hybridisierbaren Oligonukleotide verbindenden, Spacer sind selbst nicht zur Hybridisierung befähigt und z. B. aus funktionalisierten linearen oder verzweigten Kohlenstoffketten mit z. B. 5 bis 20 Kohlenstoffatomen aufgebaut. Anstatt von Kohlenstoffketten kann der Fachmann aber auch Oligonukleotidanordnungen synthetisieren, die einen andersartigen Spacer aufweisen. Ein Spacer kann erfindungsgemäß gleichzeitig auch mehr als zwei Oligonukleotidsequenzen binden.
Die Oligonukleotidanordnungen können weiterhin mit mindestens einem Marker versehen sein, wobei dieser, für den Fall, dass nur ein Spacer in der Anordnung vorhanden ist, mit der Oligonukleotidanordnung, vorzugsweise im Bereich des Spacers, ver knüpft ist. Wenn mehrere Spacer zur Anordnung gehören, ist der Marker mit mindestens einem dieser Spacer verbunden.
Die Oligonukleotidanordnungen können in den eingangs beschriebenen Mikroarrays oder homogenen Assays eingesetzt werden.
Weiterhin Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Vernetzung von Nukleinsäuresequenzen bzw. solche enthaltenden Molekülen, indem die erfindungsgemäßen Oligonukleotidanordnungen durch Koppelung an den Nukleinsäuresequenzen an mehrere der hybridisierbaren Oligonukleotidsequenzen einer Oligonukleotidanordnung Konglomerate bilden.
Die Nukleinsäuresequenzen bzw. solche enthaltenden Moleküle sind hierbei vorzugsweise durch eine Elongation im Rahmen einer Amplifikationsreaktion oder einer Primer-Extension generierte DNA-Teilstränge.
Die Oligonukleotidanordnungen lagern sich nach der Amplifizierungs-, Primer-Extentsion- und/oder Hybridisierungsreaktion zu Netzwerken von Nukleinsäuresequenzen zusammen, die die Reaktionslösung messbar eintrüben und deren Konzentration so nach einem weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung mittels Trübungsmessung oder colorimetrisch bestimmt werden kann.
Vorteilhaft ist dabei der geringe apparative Aufwand für die Detektierung, der sich nach einer Ausführungsform der Erfindung lediglich auf leicht zugängliche Spektrophotometer mit einer Lichtquelle im sichtbaren Bereich erstreckt. Diese Lichtquellen sind dadurch sehr einfach gehalten und können somit z. B. in tragbaren Analysegeräten eingesetzt werden. Weiterhin führt die Signalverstärkung durch Konglomeratbildung zu einem verbesserten Signal-Rauschverhältnis.
Beim Einsatz in Verbindung mit homogenen Assays sind keine signalemittierenden Marker erforderlich, wodurch sich die Kosten pro Assay verringern lassen und ggf. sogar eine Assayauswertung mit bloßem Auge ermöglicht wird.
Beim Einsatz in Verbindung mit Mikroarrays kommt es durch die hohe Anzahl der im Bereich der Fänger angelagerten Markermoleküle zu einem besonders großen Konzentrationsgefälle zwischen Markern an der Oberfläche und Markern in Lösung. Dadurch können nicht nur etwaige Waschschritte entfallen, sondern es verringern sich auch die Anforderungen an eine dreidimensionale Differenzierung bei der Auswertung, z. B. die Verwendung einer konfokalen Optik. Bei Minimierung des Kavitätsvolumens (weitere Steigerung des Konzentrationsgefälles) und Verzicht auf jegliche Waschschritte kann so ganz auf eine dreidimensionale Auflösung verzichtet werden.
Die erfindungsgemäßen Oligonukleotidanordnungen führen so überraschend zu einer optimierten Signalemission und stellen somit eine sensitivere, einfachere und kostengünstigere Detektierungstechnik für amplifizierte DNA-Sequenzen aus Nukleinsäureassays dar.
Die Erfindung ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass die Primer solche Moleküle umfassen, die mit Nukleinsäuren, wie z. B. DNA, RNA, oder derivatisierten Nukleinsäuren und deren Gemischen hybridisieren.
Die Erfindung ist auch dadurch gekennzeichnet, dass die Detektierungsmethode auch für die "Real-time" PCR (Echtzeit-PCR) sowie bei der Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR) in der Gegenwart von Reverser Transkriptase zur Bestimmung von RNA eingesetzt werden kann.
Weiterhin liefert das erfindungsgemäße Verfahren Vorteile im Bereich der High-Throughput-Verfahren und im mobilen/dezentralen Einsatzbereich ('Point-of-care'-Bereich).
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist die Anwendung dieses Verfahrens in Amplifizierungsreaktionen wie z. B. der PCR, der Ligase-Kettenreaktion ("ligase chain reaction"), "strand displacement amplification" (Strang-Verdrängungs-Amplification), "rolling circle amplification", "nucleic acid sequence-based amplification" (Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifikation), "branched DNA", "transcription-mediated amplification" (Transkriptions-vermittelnde Amplifikation), "hybrid capture" oder "Invader".
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist der Einsatz von miteinander verknüpften Nukleinsäuresequenzen, die als Hybridisierungssonden eingesetzt werden können (multivalente Nukleinsäuresonden). Diese Sonden können nun entweder aus zwei oder mehreren Nukleinsäuresequenzen, die zu einer bestimmten Region oder zu verschiedenen Regionen der Zielsequenz komplementär sind, bestehen.
Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung, dass die erwähnten Sonden alle dem Fachmann bekannten Markermoleküle tragen können.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf allen Gebieten, auf denen Nukleinsäureanalysen betrieben werden, angewandt werden, wie z. B. in der medizinischen, forensischen, Lebensmittel- und Umweltanalytik, im Pflanzenschutz, der Tiermedizin oder allgemein in der Life Science Forschung.
Das erfindungsgemäße Detektionsverfahren kann z. B. vorteilhaft bei Erbkrankheiten und in der Onkologie eingesetzt werden.
Es lässt sich so beispielhaft das somatische Genom daraufhin untersuchen, ob Erbkrankheiten vorliegen (z. B. zystische Fibrose), ob ein Patient ein erhöhtes Erkrankungsrisiko trägt (z. B. für Brustkrebs, nachweisbar durch Mutationen auf den BRCA1- und BRCA2-Genen) oder ob ein bestimmtes Therapeutikum mit seinem individuellen Genom verträglich ist (z. B. Herceptin-Test von Abbott). Ein weiteres Einsatzgebiet ist die HLA-Typisierung. Bei der Gewebstypisierung im Vorfeld von Trans plantationen erlauben Nukleinsäureassays wesentlich differenziertere Aussagen über die Übereinstimmung von Gewebetypen. Dies ist vor allem bei Knochenmarkstransplantationen wichtig, und bei Organtransplantationen lassen sich so bessere Verträglichkeiten erreichen.
Den sich in herkömmlichen Mikroarrays oftmals negativ auf die Sensitivität auswirkenden sterischen Einflüssen bei der Hybridisierung der Nukleinsäuresequenzen an den immobilisierten Fängermolekülen wird mit der Erfindung begegnet, weil vorliegend die Konglomeratbildung zu einem verbesserten Signal-Rauschverhältnis und somit zu einer Signalverstärkung führt.
Erreicht werden kann eine Einstellung der Konglomeratbildungsgeschwindigkeit durch Variation folgender Parameter:

1) Die Multivalenz der Oligonukleotidanordnungen, also die Anzahl der Primersequenzen, die eine Oligonukleotidanordnung aufweist.
2) Das Verhältnis der jeweils zu einer Zielsequenz gehörenden "upstream"- und "downstream"-Primersequenzen, die in einer Anordnung enthalten sind. Ein in etwa ausgewogenes Verhältnis ermöglicht eine maximale Hybridisierung der zueinander komplementären Amplikons, während ein stark "upstream"- oder "downstream"-lastiges Verhältnis der Primer dazu führt, dass die Zahl der erzeugten Amplikons, die sich wegen ihrer Komplementarität verbinden können, geringer ausfällt und
3) ggf. das Hinzufügen von monovalenten und niedrigervalenten Primern zur 'Verdünnung' bzw. zunehmender Linearisierung der Netzwerke.
4) Ein weiterer Steuerparameter ist das Ausmaß des Vorhandenseins freier Primer.

Gemäß einer typischen Anwendung der Erfindung finden die erforderlichen chemischen Reaktionen in einer homogenen Flüssigphase statt. Die z. B. aus Blut oder anderen Patientenproben gewonnene und aufbereitete Nukleinsäure wird hierbei der Reaktionskammer, die bereits alle erforderlichen Agenzien (einschließlich der Oligonukleotidanordnungen) enthält, zugegeben und zyklisch amplifiziert, d. h. bei jedem extern durch Temperaturschwankungen gesteuerten Reaktionszyklus nimmt die Anzahl der Nukleinsäuremoleküle exponentiell zu, sofern die fragliche Sequenz in der Patientenprobe vorhanden war.
Die spezifischen Primersequenzen an der Oligonukleotidanordnung sorgen dabei dafür, dass nur die gesuchte Zielsequenz amplifiziert wird. Durch Mischung verschiedener Oligonukleotidanordnungen oder von Oligonukleotidanordnungen mit unterschiedlichen Primersequenzen ist es auch möglich, mehrere Zielsequenzen gleichzeitig zu amplifizieren (Multiplex).
Qualitative Messungen sind möglich, indem nach einer vorher definierten Anzahl von Reaktionszyklen geprüft wird, ob die Konzentration der angelagerten Nukleinsäuremoleküle einen bestimmten Schwellwert übersteigt. Für eine Quantifizierung kann diese Konzentration nach jedem Zyklus erfasst und die Anzahl der Zyklen bis zum Erreichen eines bestimmten Schwellwertes bestimmt werden. Diese Anzahl ist ein Maß für die Konzentration der gesuchten Nukleinsäure in der Patientenprobe.
Das Multiplex-Verfahren kann hierbei genutzt werden, um parallel zur Patientenprobe auch Kontrollen mitzuverstärken, die man der Lösung vor Beginn der Amplifikation in bekannter Menge zugibt.
Bei Anwendung der Erfindung in homogenen Assays werden jeweils mehrere Oligonukleotidsequenzen (Primersequenzen), die für die Zielsequenz spezifisch sind, untereinander durch geeignete Spacer gekoppelt. Während der Amplifikationszyklen werden die Oligonukleotidanordnungen über ihre Primersequenzen an die neu entstehenden Nukleinsäurekopien (Amplikons) angefügt, so dass Konglomerate von Nukleinsäuremolekülen entstehen, deren Größe von Zyklus zu Zyklus zunimmt. Die Bildung dieser Konglomerate hängt dabei stark von der Anzahl der gekoppelten Primersequenzen ab. Ab einer bestimmten Anzahl von Zyklen erreicht die Konglomeratgröße Ausmaße, die zu einer optischen Eintrübung oder einer Präzipitation der vorher homogenen Flüssigphase führt.
Diese Eintrübung führt bei Durchleuchtung des Assays mit sichtbarem Licht zu einer Streuung und/oder Absorption. Diese kann mit einfacher, dem Fachmann bekannter Messtechnik erfasst werden und macht eine Fluoreszenzoptik überflüssig. Die Assays werden dadurch kostengünstiger, und der Geräteaufwand sinkt. Bei qualitativen Assays ist sogar eine Erkennung der Eintrübung mit bloßem Auge denkbar, wodurch der Geräteaufwand weiter vereinfacht werden kann. Dies kann bei dezentralen und/oder mobilen Applikationen mit geringem Testdurchsatz sinnvoll sein.
Die Wirkung der Molekülkonglomerate auf die Lichtdurchlässigkeit lässt sich noch weiter steigern, indem die gekoppelten Primer zusätzlich mit Markermolekülen verbunden werden. Diese müssen nicht aktiv Signale emittieren, sondern können lediglich dazu dienen, während der Amplifikation die Eintrübung durch Konglomeratbildung zu verstärken. Als die Eintrübung verstärkende passive Marker kommen neben Metallen auch Metallionen oder Polymere in Frage. Weiterhin kann, in Gegenwart von farbgebenden Substanzen, eine durch die Konglomeratbildung verursachte Farbvertiefung bzw. ein Farbumschlag der Lösung zur Detektion herangezogen werden.
Bei Einsatz der erfindungsgemäßen Oligonukleotidanordnungen in üblichen Mikroarrays mit separaten Amplifikations- und Hybridisierungsschritten werden an die immobilisierten Fängermoleküle schichtenweise Netzwerke von über die Amplikons miteinander verbundenen Marker enthaltenden Oligonukleotidanordnungen angelagert und verbinden diese so zu großen Konglomeraten aus Nukleinsäuren und Markern, vorzugsweise erfolgt die Netzwerkbildung schichtweise vom Träger aufwachsend. Gleichfalls kann es Gegenstand der Erfindung sein, dass sich an die immobilisierten Fängermoleküle, statt einzelner, markierter Oligonukleotidanordnungen, nun bereits ausgedehnte, vorgeformte Konglomerate anlagern. Beide Möglichkeiten führen aber letztendlich zu einer Steigerung der Signalemission im Bereich der jeweiligen Fängermoleküle.
Zwar kann es theoretisch durch die Größe der Konglomerate zu sterischen Inhibitionen bei der Hybridisierung an den Fängermolekülen kommen, jedoch tritt dieser Aspekt in den Hintergrund, wenn man zusätzlich die geringe Hybridisierungseffizienz eines Mikroarrays in Betracht zieht, d. h. von den immobilisierten Fängermolekülen lagert sich ohnehin nur ein geringer Teil Nukleinsäuremoleküle aus der Lösung an. Am durchschnittlichen Abstand dieses Teils der Fängermoleküle muss sich die Größenordnung der Konglomeratabmessungen orientieren, damit eine signifikante sterische Inhibition vermieden wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat folgende Vorteile:

– die Signalverstärkung durch Konglomeratbildung führt zu einem verbesserten Signal-/Rauschverhältnis
– beim Einsatz in Verbindung mit homogenen Assays sind nicht notwendigerweise signalemittierende Marker erforderlich, wodurch sich die Kosten pro Assay verringern lassen und ggf. sogar eine Assayauswertung mit bloßem Auge ermöglicht wird
– beim Einsatz in Verbindung mit Mikroarrays kommt es durch die hohe Anzahl der im Bereich der immobilisierten Fänger angelagerten Markermoleküle zu einem besonders großen Konzentrationsgefälle zwischen Markern an der Oberfläche und Markern in Lösung. Dadurch verringern sich die Anforderungen an eventuelle Waschschritte oder an eine dreidimensionale Differenzierung bei der Auswertung, z. B. die Verwendung einer konfokalen Optik. Ggf. kann bei Minimierung des Kavitätsvolumens (weitere Steigerung des Konzentrationsgefälles) ganz auf eine dreidimensionale Auflösung verzichtet werden

Die Erfindung ist auch zur Durchführung in einem neuartigen Assay einsetzbar, der in der zeitgleich eingereichten Patentanmeldung „ Verfahren zum Nachweis von Oligonukleotidsequenzen" desselben Anmelders und derselben Erfinder beschrieben ist und durch Verweis auch zum Gegenstand dieser Anmeldung gemacht wird.
In den 1 bis 8 wird die Erfindung beispielhaft veranschaulicht. Es zeigen:
1: Doppelsträngiger Ausschnitt einer die Zielsequenz enthaltenden DNA-Sequenz, wobei S1 und S2 die Enden der sense Ziel-DNA und S1* (in den Figuren als "S1-Überstrich" dargestellt) und S2* (in den Figuren als "S2-Überstrich" dargestellt) die Enden der antisense Ziel-DNA abkürzen. Dementsprechend sind als Primer S1* und S2 in den Oligonukleotideanordnungen enthalten. S0 bzw. S0* (in den Figuren als "S0-Überstrich" dargestellt) bezeichnen schließlich die von S1/S2 und S1*/S2* eingeschlossene DNA Sequenz. Die eigentliche Zielsequenz S0 bzw. S0* kann grundsätzlich die Enden S1/S2 bzw. S1*/S2* umfassen.
2: Minimale Ausstattung einer Oligonukleotidanordnung mit zwei Primern, die über nur einen Spacer verbunden sind.
3: Ausstattung einer Oligonukleotidanordnung mit beispielsweise vier Primern und wahlweise einem Marker, der hier durch einen mittig angeordneten Kreis dargestellt ist.
4: Einzelne Oligonukleotideanordnung nach einer Elongationsreaktion, wie z. B. Amplifikation oder Primer-Extension, vor der Konglomeratbildung.
5: Schematische Bildung von Molekülkonglomeraten oder -netzwerken nach erfolgter Hybridisierung der Anordnungen aus 4.
6: Anordnung, wie sie bei Mikroarrays auftreten kann, wobei einer der beiden Primer als Fängerprimer an eine Matrix gebunden wurde, und der Zusatz der erfindungsgemäßen Oligonukleotidanordnungen nach erfolgter Amplifikation und Hybridisierung wiederum ein Netzwerk aufbaut, das jetzt aber immobilisiert und mit dem Träger verbunden vorliegt.
7: Die auf eine Dimension reduzierte zweidimensionale Anordnung der an die Amplikons unmittelbar oder mittelbar gekoppelten Markermoleküle nach erfolgter Hybridisierung mit den Fängermolekülen, wie sie in einem bekannten Mikroarray besteht.
8: Die auf zwei Dimensionen reduzierte dreidimensionale schichtenweise Anordnung der an die Amplikons beispielsweise unmittelbar oder mittelbar gekoppelten Markermoleküle nach erfolgter Hybridisierung mit den Fängermolekülen, wie sie in einem erfindungsmäßigen Mikroarray auftreten. Die schichtenweise Anhäufung der Markermoleküle führt so zu einer Steigerung der Signalemission im Bereich der jeweiligen Fängermoleküle.

Claims

Oligonukleotidanordnungen aufweisend jeweils mindestens zwei durch mindestens einen Spacer verknüpfte hybridisierbare Oligonukleotidsequenzen als Primersequenzen, dadurch gekennzeichnet, dass der Spacer ausgewählt ist aus funktionalisierten linearen oder verzweigten Kohlenstoffketten.
Oligonukleotidanordnungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotidanordnungen keinen Marker aufweisen.
Oligonukleotidanordnungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotidanordnungen jeweils zumindest einen Marker aufweisen, der vorzugsweise an mindestens einen Spacer gebunden ist.
Oligonukleotidanordnungen gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass jede Oligonukleotidanordnung mehr als drei, besonders bevorzugt mehr als 100 und insbesondere mehr als 1000, durch einen oder mehrere Spacer verbundene hybridisierbare Oligonukleotidsequenzen aufweist.
Oligonukleotidanordnungen gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotidanordnungen solche beinhalten, die ausschließlich hybridisierbare Oligonukleotidsequenzen aufweisen, die entweder "upstream" einer Zielsequenz sind oder solche, die hybridisierbare Oligonukleotidsequenzen aufweisen, die "downstream" einer Zielsequenz sind, vorzugsweise etwa zu gleichen Anteilen.
Oligonukleotidanordnungen gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass jede Oligonukleotidanordnung zumindest eine Oligonukleotidsequenz beinhaltet, die upstream" einer Zielsequenz ist, und eine, die "downstream" einer Zielsequenz ist.
Oligonukleotidanordnungen gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotidsequenzen aus 5 bis 100, bevorzugt aus 10 bis 35 und besonders bevorzugt aus 15 bis 30, Nukleotiden aufgebaut sind.
Oligonukleotidanordnungen gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotide AMP, GMP, CMP, TMP, UMP, IMP und ihre Derivate umfassen.
Oligonukleotidanordnungen gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Spacer alle Oligonukleotidsequenzen verknüpft.
Oligonukleotidanordnungen gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Marker ausgewählt sind aus einem oder mehreren Mitgliedern der Gruppe, bestehend aus optisch, elektrochemisch oder magnetisch aktiven Molekülen oder Molekülresten, magnetischen Partikeln oder Quantum Dots, Farbstoffen, Radioisotopen, Enzymen, Vitaminen, Haptenen oder Antikörpern.
Oligonukleotidanordnungen gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotidanordnungen über Bindungsstellen für Konglomeratbildung beschleunigende passive Marker verfügen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend Metalle, Metallionen, Farbstoffe oder Polymere.
Verfahren zur Bestimmung von Zielnukleinsäuren, umfassend die Schritte (a) Zugabe einer eine Zielnukleinsäure enthaltende Probenlösung zu einer alle Agenzien umfassenden Reaktionskammer enthaltend Oligonukleotidanordnungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, (b) Amplifikation, Primer-Extension oder Reverse Transkription, (c) Hybridisierung und (d) Detektierung der Zielnukleinsäuren.
Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierung der an den aus Oligonukleotidanordnungen und einer Zielsequenz entstandenen Amplikons untereinander zur Konglomeratbildung führt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren in Mikroarrays durchgeführt wird unter Einsatz von immobilisierten Oligonukleotiden, die im Laufe der Amplifikation Amplikons bilden und diese in Lösung befindliche Amplikons binden.
Verfahren gemäß Anspruche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren im Laufe der Amplifikation den Schritt der Hybridisierung von in Lösung gebildeten Netzwerken an die immobilisierten Amplikons umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt der Detektierung die Bestimmung der Anwesenheit von Konglomeraten qualitativ bzw. die Konglomeratkonzentration quantitativ durch Trübungsmessung, gravimetrische und elektrochemische Methoden oder, im Falle der Anwesenheit von Marken, auch durch optische, bevorzugt colorimetrische und magnetische Methoden umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt der Detektierung die Bestimmung der Konglomeratkonzentration quantitativ durch Trübungsmessung oder gravimetrisch umfasst, gravimetrisch insbesondere unter piezoelektronischer Anregung und Schwingungsmessung.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren im Rahmen der Echtzeit-PCR und der Reverse-Transkriptase-PCR in Gegenwart von Reverser Transkriptase zur Bestimmung von RNA eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass es im High-Throughput-Verfahren eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 18, wobei der Schritt der Amplifizierung die Polymerase Kettenreaktion, Ligase-Kettenreaktion, "strand displacement amplification", "rolling circle amplification", eine "nucleic acid sequence-based amplification", "branched DNA", "transcription-mediated amplification", "hybrid capture" oder "Invader" umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17 umfassend den Einsatz passiver Marker zur beschleunigten Konglomeratbildung.
Verwendung des Verfahrens nach zumindest einem der Ansprüche 12 bis 21 im Rahmen der medizinischen, forensischen, Lebensmittel- und Umweltanalytik, im Pflanzenschutz, der Tiermedizin oder allgemein in der Lifescience-Forschung.
Verwendung des Verfahrens nach zumindest einem der Ansprüche 12 bis 21 im Rahmen von High-Throughput-Techniken und im mobilen und dezentralen Einsatzbereich.