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Die
vorliegende Erfindung betrifft die nicht-isotope Quantifizierung
von Polynukleotiden, insbesondere die sequenz-spezifische Erkennung
und Quantifizierung mit Hilfe der optischen Affinitäts-Sensor-Technologie.
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Es
wurde ein Verfahren zur direkten Quantifizierung von Nukleinsäuren in
klinischen Proben von Cytomegalovirus (CMV), Hepatitis B (HBV),
Hepatitis C (HCV) und Immunodeficiency-Virus (HIV) unter Verwendung
der verzweigten DNA (bDNA)-Technologie entwickelt (Dewar et al.
(1994), J. Infect. Dis. 170, 1172–1179;
US-4 868 105 ). Das Verfahren, das
weitverzweigte Oligonukleotide zur Signalverstärkung und enzymatischen Signalerzeugung
verwendet, ist im Stande, einige Tausend Genome (physiologische
Konzentrationen) eines gegebenen Virus nachzuweisen. Ein Nukleinsäure-Sandwich-Assay
in Lösungsphase
unter Verwendung der bDNA-Technologie wird in
US-4 868 105 beschrieben.
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Ein
Nukleinsäure-Sandwich-Assay
in Lösungsphase
verwendet das Minimum eines Sets von Capture-Proben und eines Sets
von Label-Proben, um die Target-Nukleinsäure nachzuweisen, indem die
Label-Probe (in einem Capture-Probe/Target-Nukleinsäure/Label-Probe-Sandwich) auf
einer Oberfläche
derart immobilisiert wird, dass eine Trennung von gebundenem und
nicht-gebundenem Label und Nachweis/Quantifizierung von gebundenem
(oder nicht-gebundenem) Label und hiermit der Target-Nukleinsäure möglich wird.
Die Capture- und Label-Proben umfassen Nukleinsäuren mit Bereichen, die zur
Target-Nukleinsäure komplementär sind.
Die Label-Probe kann bDNA umfassen, wie in
US-4 868 105 beschrieben.
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Die
Verwendung eines Verfahren zur Signalverstärkung erlaubt einen sensitiven
Nachweis und Quantifizierung, besitzt jedoch den Nachteil, dass
die Quantifizierung möglicherweise
nicht exakt ist, insbesondere wenn das zu bestimmende Target-Polynukleotid
in einem komplexen Medium, wie Blut, Gewebe oder Pflanzenextrakten,
erhalten wird. In der Probe vorhandene Moleküle können in die Signalverstärkung eingreifen
und hierdurch die Reproduzierbarkeit und damit die Eignung zur Verwendung
als quantitative Methode reduzieren. Es können Probenherstellungsstufen
durchgeführt
werden, um den Gehalt an störenden
Verunreinigungen zu reduzieren, jedoch können diese zeitaufwendig sein
und weitere Quellen für
eine Veränderung
einschleusen.
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Somit
sind Nachteile der Signalverstärkungs-Stategien,
insbesondere bDNA, i), die Notwendigkeit einer weiteren Verstärkungsstufe,
ii) die mühsame
Chemie möglicherweise
begleitet von eine ziemlich hohen NSB/nicht-spezifischen Hybridisierung
(NSH) durch das letzte Paar der Assay-Stufen, d.h. Hybridisierung
von bDNA zu dem Oberflächengebundenen
Target-DNA-Komplex und Hybridisierung der Label-Probe (sperriges Enzym-Label) zu der bDNA,
iii) langsame, schleppende Bindungskinetik, daher geringe Effizient
der bDNA-Stufe selbst, und iv) ausgedehntes (sich hinziehendes)
Assay-Verfahren.
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Polynukleotide
besitzen die Tendenz, stark mit anderen geladenen Makromolekülen, wie
Proteinen, zu assoziieren. Über
den Daumen gepeilt, je größer/sperriger
das Nukleotid ist, um so stärker
kann diese Assoziation sein. Dies macht die Durchführung des
gesamten bDNA-Assays in einer Stufe unmöglich, da die bDNA sich in
dem Probenmedium an Makromoleküle
binden kann. Die nicht-spezifische Bindung von verschiedenen Spezies
an den Komplex in Lösungsphase
oder an die Oberfläche
kann eine überproportionale
Menge an bDNA während
der späteren
Phase des Assays einfangen. All dies kann zu einer erhöhten Messungs-Variabilität führen, insbesondere
wenn es sich um komplexe Probenmedien handelt.
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Bei
der vorstehenden Methode ist es auch nötig, das an das Target-Polynukleotid
gebundene Label vom nicht-gebundenen Label zu trennen. Dies kann
in die Messungen eine weitere Variabilität einführen. Wird das Label durch
Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder Absorption nachgewiesen, kann
die optische Opazität des
Probenmediums den Nachweis des in dem Probenmedium verbleibenden
Labels beeinträchtigen
und eine zusätzliche
Variabilität
mit sich bringen.
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Andere
Methoden zum Nachweis eines Polynukleotids in niedrigen Konzentrationen
macht von einer Amplifikationsmethode, wie der Polymerase-Kettenreaktion
Gebrauch, um die Anzahl der Kopien des Target-Polynukleotids vor
der Verwendung einer Nachweismethode zu erhöhen. Diagnostische Systeme,
die mit Target-Amplifikationsmethoden arbeiten, wie PCR, können andere
Quantifizierungsprobleme aufweisen, d.h. Fehler während des
Amplifikationsverfahrens einführen.
Mutationen in der Target-Polynukleotid-Sequenz können ebenfalls einen Effekt
mit dem Faktor von einigen Hunderten auf die Nachweis-Effizienz ausüben (Urdea (1994),
Biotechnology, 12, 926–928).
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Es
besteht daher ein Bedarf für
ein Verfahren zum Nachweis eines Target-Polynukleotids bei sehr
geringen Konzentrationen, das keine Amplifikationsstufe erfordert
und das weniger zu Störungen
infolge von Komponenten des Probenmaterials neigt.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Diesem
Bedarf kann mit Hilfe eines Verfahrens genügt werden, das auf dem Nachweis
der Lumineszenz beruht, die in dem evaneszenten Feld eines optischen
Wellenleiters angeregt wird.
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Das
Verfahren des Nachweises eines Target-Polynukleotids verwendet einen
Nukleinsäure-Sandwich-Assay in
Lösungsphase,
worin der feste Träger
ein optischer planarer Wellenleiter ist, und das Label nachgewiesen
wird durch Messen der Lumineszenz, die in dem evaneszenten Feld
des Wellenleiters angeregt wird oder durch Messen der Lumineszenz,
die in dem Nah-Feld des Wellenleiters erzeugt wird.
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Das
Phänomen
des evaneszenten Felds kann unter Verwendung des Beispiels eines
planaren optischen Wellenleiters beschrieben werden. Wird eine Lichtwelle
in einen planaren optischen Wellenleiter gekuppelt, der von Medien
mit niedrigeren Brechungsindices umgeben ist, ist sie durch nahezu
vollständige
Reflexion an den Grenzflächen
der Wellenleiterschicht begrenzt. Im einfachsten Fall besteht ein
planarer optischer Wellenleiter aus ei nem Dreischichtensystem: Substrat,
Wellenleiterschicht, Überschicht
(oder zu untersuchende Proben), wobei die Wellenleiterschicht den
höchsten
Brechungsindex aufweist. Zusätzliche
Zwischenschichten können
die Wirkung des planaren optischen Wellenleiters weiter verbessern.
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Bei
dieser Anordnung gelangt eine Fraktion bzw. ein Teil der elektromagnetischen
Energie in das Medium mit dem niedrigeren Brechungsindex. Dieser
Teil wird als evaneszentes (schwächer
werdendes) Feld bezeichnet. Die Stärke des evaneszenten Felds
hängt in
sehr großem
Ausmaß von
der Dicke der Wellenleiterschicht selbst und von dem Verhältnis der
Brechungsindices der Wellenleiterschicht und der sie umgebenden Medien
ab. Im Fall von dünnen
Wellenleitern, d.h. Schichtdicken, die gleich sind wie oder geringer
sind als die zu leitende Wellenlänge,
können
diskrete Moden des geleiteten Lichts unterschieden werden.
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Unter
Verwendung eines evaneszenten Felds ist es beispielsweise möglich, Lumineszenz
in Medien mit relativ geringem Brechungsindex anzuregen und diese
Lumineszenz lediglich in unmittelbarer Nachbarschaft zu dem Wellenleiterbereich
anzuregen. Dieses Prinzip ist als evaneszente Lumineszenz-Anregung
bekannt.
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Evaneszente
Lumineszenz-Anregung ist bei der Analyse von Nutzen, da die Anregung
auf die unmittelbare Nähe
zur Wellenleiterschicht begrenzt ist. Somit werden etwaige lumineszierende
Moleküle,
die sich nicht in unmittelbarer Nähe zur Wellenleiterschicht
befinden, nicht nachgewiesen und müssen nicht entfernt werden,
um lumineszierende Moleküle,
die beispielsweise über
biochemische Wechselwirkung an die Oberfläche des Wellenleiters gebunden
wurden, zu bestimmen.
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Methoden
und Vorrichtungen zur Bestimmung der evaneszent angeregten Lumineszenz
von Antikörpern
oder Antigenen, die mit Lumineszenz-Farbstoffen einem Labelling
unterzogen worden sind, sind bekannt und werden zum Beispiel in
US-A-4 582 809 beschrieben.
Die dort beanspruchte Anordnung verwendet eine optische Faser zur
evaneszenten Lumineszenz-Anregung. Derartige optische Fasern besitzen
typischerweise einen Durchmesser bis zu einem Millimeter und leiten
eine Vielzahl von Moden bzw. Wellentypen, wenn Laserlicht in sie
eingekoppelt wird. Die evaneszent angeregte Lumineszenz kann einfach
lediglich mittels des Teils gemessen werden, der in die Fasern zurückgekoppelt
wird. Die Vorrichtung ist relativ groß und vergleichsweise große Probenvolumina
sind notwendig. Die Empfindlichkeit ist durch die relativ schwachen
evaneszenten Feld-Intensitäten, die
mit hochgradigen Multimoden-Wellenleitern assoziiert sind, begrenzt.
Die Empfindlichkeit ist weiterhin durch die Endflächen-Output-Kopplung
begrenzt: da die Anregungs- und Lumineszenz-Strahlung co-linear
laufen und durch Strahlenteiler und Filter (z.B. Sperrfilter oder
Bandfilter) getrennt werden müssen,
beschränkt
das Unterscheidungsvermögen
der Filtereinheit die Nachweisempfindlichkeit.
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Photometrische
Instrumente zur Bestimmung der Lumineszenz von Biosensoren unter
evaneszenten Anregungs-Bedingungen bei Verwendung von planaren optischen
Wellenleitern sind ebenfalls bekannt und werden zum Beispiel in
WO 90/06503 beschrieben, wo planare Wellenleiter von 160 nm bis
1000 nm Dicke verwendet werden. Die Anregungswelle wird ohne Gitterkoppler
eingekoppelt.
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Es
wurden verschiedene Versuche unternommen, um die Empfindlichkeit
der evaneszent angeregten Lumineszenz zu erhöhen und integrierte optische
Sensoren herzustellen. Diese schlossen Verbesserungen ein bei der
Herstellung von planaren Wellenleitern mit hoher gleichmäßiger optischer
Qualität
und reproduzierbaren konstanten Schichtdicken, und Verbesserungen
hinsichtlich der Natur der Einkopplung der Lichtwelle in die Wellenleiterschicht
einschließlich
der Verwendung von Gittern (Chemical, Biochemical and Environmental Fiber
Sensors V (1994), Proc. SPIE, 2068, 313–325). Die Verwendung von Gittern
in Kombination mit Lumineszenz wird in
US-A-5 081 012 und WO 95/33198
beschrieben. In
US-A-5
081 012 wird Anregungslicht in einen Wellenleiterfilm mit
einer Dicke von 200 nm bis 1000 nm eingekoppelt und durch den als
Messbereich zu verwendenden Teil bis zu einem zweiten reflektierenden
Gitter mit dem Ergebnis weitergeleitet, das die eingekoppelte Lichtwelle
zumindest zweimal durch den Messbereich zwischen den Gittern passieren
muss. Es wird angenommen, dass dies die Empfindlichkeit erhöht. Ein
Nachteil jedoch besteht darin, dass die Reflexion zu einer erhöhten Streuung
des Anregungslichts und einer Erhöhung in der Hintergrund-Strahlungsintensität führen kann.
In WO 95/33198 wird ein erstes Gitter zur Einkopplung des Anregungslichts
in den Wellenleiter und ein zweites separates Gitter für die Auskopplung
der Menge an Lumineszenz verwendet, die entlang der weitergeleiteten
Anregungs-Mode angeregt und in den Wellenleiter zurückgekoppelt
wurde.
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Außer der
Verwendung eines evaneszenten Felds, das mit Anregungslicht assoziiert
ist, welches in der Wellenleiterschicht für die Anregung lumineszierender
Moleküle
nahe der Wellenleiteroberfläche
weitergeleitet wird, ist es auch möglich, Luminophore in dem Nah-Feld
des Wellenleiters unter Verwendung klassischer Konfigurationen der
Trans-Illumination
oder Oberflächen-Illumination
anzuregen. Der sich an der Oberfläche der Wellenleiterschicht
befindende Analyt wird direkt mit dem Anregungslicht entweder durch
den Träger
des planaren Wellenleiters oder durch Strahlung entgegengesetzt
zur Wellenleiterschicht bestrahlt. Es sollte zu verstehen sein,
dass das Nah-Feld durch die Eindringtiefe des evaneszenten Felds
der geleiteten Lumineszenz begrenzt ist. In diesem Fall ist die
Menge an Anregungslicht, die sich in dem Wellenleiter fortbewegt,
vernachlässigbar.
Von der Menge der Lumineszenz, die aus Luminophoren in dem Nah-Feld
des Wellenleiters stammt, wird jedoch eine signifikante Menge in
den Wellenleiter eingekoppelt und kann einem optischen Detektor
unter Verwendung eines auskoppelnden Beugungsgitters zugeführt werden.
Aufgrund der hohen geometrischen Raum-Selektivität des Rückkopplungsmechanismus bei
dieser Konfiguration, die zu sehr niedrigen Hintergrund-Signalen
führt,
kann eine hohe Empfindlichkeit erreicht werden.
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Es
wurden auch Verbesserungen erzielt, um den Nachweis von evaneszent
angeregter Lumineszenz in Mehrfachproben gleichzeitig oder in rascher
Abfolge zu ermöglichen.
WO 94/27137 schlägt
zum Beispiel eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Durchführung von
Immuno-Assays unter Verwendung der evaneszent angeregten Fluoreszenz
vor.
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In
WO 92/19976 wird eine Anordnung beschrieben, die eine Vielzahl integrierter
Messstreifen zum Nachweis eines komplexen Signals, zum Beispiel
dem Nachweis eines Geruchs durch eine künstliche Nase, umfasst.
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In
WO 96/35940 wird eine Sensor-Plattform auf Basis von zumindest zwei
planaren, getrennten, anorganischen, dielektrischen Wellenleiterbereichen
auf einem üblichen
Substrat beschrieben, wobei die Plattform geeignet ist zur parallelen
evaneszenten Anregung und Nachweis der Lumineszenz von identischen
oder verschiedenen Analyten. Derartige getrennte Wellenleiterbereiche
können
jeweils ein oder mehrere Kopplungsgitter aufweisen. Ein wesentlicher
Vorteil dieser Sensor-Plattform besteht darin, dass beispielsweise mehrere
Probenlösungen
gleichzeitig mit einem hohen Empfindlichkeitsgrad analysiert werden
können.
Als Folge der Realzeit-Messtauglichkeit sind keine Wasch- oder Reinigungsstufen
zwischen den einzelnen Messungen notwendig mit dem Ergebnis, dass
ein hoher Probendurchsatz je Zeiteinheit erreicht wird. Zusätzlich zur
zeitgleichen Analyse einer Vielzahl von Probenlösungen ist es auch möglich, dass
eine Probenlösung
hinsichtlich mehrerer ihrer Analyte gleichzeitig oder in Abfolge
auf einer Sensor-Plattform untersucht wird. Dies ist insbesondere
im Fall einer Blut- oder Serum-Untersuchung von Vorteil, die so
besonders rasch und wirtschaftlich durchgeführt werden kann. Sollen mehrere
Probenlösungen
gleichzeitig analysiert werden, verhindern die getrennten Wellenleiterbereiche
einen Cross-Talk
zwischen lumineszierenden Signalen von verschiedenen Proben. Es
können
ein hoher Selektivitätsgrad
und niedrige Fehlerraten mit dieser Methode erzielt werden.
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Die
individuellen separaten Wellenleiterbereiche können selektiv auf optischen,
chemischen oder fluidikalen Wegen angesprochen werden.
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Besonders
geeignet ist eine Sensor-Plattform mit physikalisch oder optisch
separaten planaren Wellenleiterbereichen, worin lediglich ein Modus
oder eine geringe Anzahl von Moden geleitet wird. Eine derartige Sensor-Plattform
wird in WO 95/33197 beschrieben. Sie zeichnet sich durch einen besonders
hohen Empfindlichkeitsgrad und eine außerordentlich kleine Struktur
aus. Unter Verwendung der Wellenleiter-Filmparameter wie in WO 95/33197
beschrieben, kann die Abdämpfung
der geleiteten Lichtwelle geringer als 3 dB/cm sein, wodurch ein
in großem
Abstand geleiteter Strahl und eine geringe Streuung der geleiteten
Welle in das sie umgebende Medium erzielt wird. Eine derartige Sensorplattform
mag als "Chip" bekannt sein. In
der Regel wird nicht der gleiche Empfindlichkeitsgrad mit multi-modalen
Wellenleitern planarer Struktur erzielt.
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Die
Verwendung von auf evaneszent angeregter Fluoreszenz basierender
Methoden für
den Nachweis und die Quantifizierung von Polynukleotiden wird in
WO 95/33198, WO 96/35940 und WO 95/33197 erwähnt, jedoch werden keine Methoden
zur Optimierung der Empfindlichkeit des Nachweises beschieben. WO 95/16055
beschreibt eine Masse-Fluoreszenz-Anregungsmethode,
worin die Empfindlichkeit erhöht
wird, indem man eine Amplifier-Bindung verwendet, die an das Target
gebunden ist, woran multiple Label-Proben gebunden sind und indem man spezielle
Bindungsbedingungen für
Capture, Capture-Extender, Label-Extender und Label-Proben aufrechterhält.
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Diese
Erfindung verwertet die Empfindlichkeit des Nachweises der evaneszent
angeregten Lumineszenz bei einem Verfahren zum Nachweis von Polynukleotiden,
insbesondere bei geringen Konzentrationen. Das Verfahren macht Gebrauch
von multiplen fluoreszent einem Labelling unterzogenen Polynukleotiden
(Label-Extender-Proben), die gebunden sind an ein Target-Polynukleotid
oder dieses binden, welches an der Oberfläche eines optischen planaren
Wellenleiters abgefangen (d.h. denaturiert und immobilisiert) ist.
Das Target-Polynukleotid wird abgefangen durch Binden an eine oder
eine Reihe von Capture-Extender-Proben,
die sich an multiple Kopien einer einzelnen Spezies einer Capture-Probe,
welche an den Wellenleiter gebunden sind, binden. Alternativ können die
Capture-Extender-Probe
(wenn keine Capture-Probe verwendet wird) oder die Capture-Probe
weiter einen Liganden umfassen, der zur Bindung an einen Rezeptor
befähigt
ist, welcher an der Oberfläche
des Wellenleiters gebunden ist. Dies ist möglich, da das Label nicht zu
weit von der Oberfläche
des Wellenleiters platziert wird, da die evaneszente Lumineszenz
exponentiell mit dem Abstand von der Oberfläche abnimmt. Das gebundene
Label wird hiernach in dem evaneszenten Feld nachgewiesen. Das gebundene
Label ist der Menge des in der Assay-Probe vorhandenen Target-Polynukleotids
proportional und die Menge des Target-Polynukleotids kann durch
Bezugnahme auf Proben quantifiziert werden, die bekannte Mengen
des Target-Polynukleotids enthalten oder unter Verwendung einer
Referenzkurve, die hergestellt wurde unter Verwendung eines Polynukleotids
mit der gleichen Sequenz bekannter Konzentration und Reinheit. Die
Quantifizierung ist auch möglich
unter Verwendung von internen Standards oder einer Zwei- oder Multi-Wellenlängenmethode,
d.h.
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Energietransfer
oder Zwei-Label-Koinzidenzmethode. Der bzw. die internen Standards
müssen
nicht das Target-Polynukleotid sein. Sie können eine beliebige Sequenz
sein, die so ausgestaltet ist, dass sie die als internen Standard
zu verwendenden Kriterien erfüllt.
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Die
Methode kann zu einer höheren
Effizienz der Nachweiskaskade im Vergleich zu der bDNA-Methode führen (d.h.
einer weitaus höheren
Gesamtausbeute an abgefangenem Label) und daher zu einer gleichen oder
höheren
Empfindlichkeit, was den Nachweis von < 50 Target-Sequenzen erlaubt, die äquivalent
sein können
zur physiologischen Konzentration einer relevanten biologischen
Target-Probe (z.B. HIV-virale mRNA).
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Unter "optischer planarer
Wellenleiter" ist
ein Wellenleiter zu verstehen, der im Wesentlichen aus einem planaren
Träger
und einer dünnen
transparenten Schicht auf einer Oberfläche mit einem höheren Brechungsindex
als demjenigen des Trägers
besteht, wobei der Träger
und die dünne
Wellenleiterschicht auf seiner Oberfläche zumindest in dem spektralen
Bereich zwischen der nachzuweisenden Anregungs- und Emissionswellenlänge transparent
ist. Im Kontakt mit der Wellenleiterschicht wird ein optisches Kopplungselement, vorzugsweise
ein optisches Beugungselement (DOE) zur Einkopplung von Anregungslicht
moduliert. Vorzugsweise ist das DOE ein Reliefgitter. Das Gitter
kann zuerst in der Trägerschicht,
zum Beispiel mit Hilfe photolithographischer Methoden, wie in Proc.
SPIE, 2068 (1993), 313–325,
beschrieben, erzeugt und dann nach Abscheiden der Wellenleiterschicht
in die Wellenleiterschicht transferiert werden, oder es kann in
der abgeschiedenen Wellenleiterschicht gebildet werden. Bevorzugter
sind in der Wellenleiterschicht zwei separate modulierte Gitter,
eines das als Einkopplungsgitter verwendet wird und ein anderes
für die
Auskopplung von angeregtem Emissionslicht. Gitterkonstanten und
Dimensionen werden in WO 95/33198,
EP-A-0 759 159 und WO 96/35940 beschrieben.
Die planare Wellenleitertechnologie ist aus dem Stand der Technik,
zum Beispiel wie in den vorstehenden Literaturstellen beschrieben,
gut bekannt. Transparenz in diesem und im folgenden Zusammenhang
bedeutet Transparenz im spektralen Bereich von der Anregung bis
zur nachzuweisenden Emissionswellenlänge.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
besitzt den Vorteil, dass die Trennung von gebundenem und nicht-gebundenem
Label nicht notwendigerweise erforderlich ist, da lediglich gebundenes
Label nachgewiesen wird. Die optische Opazität der Probe beeinträchtigt nicht
signifikant den Nachweis von gebundenem Label. Es wurde gefunden,
dass die inkorporierte dreifache Selektivität, d.h. das evaneszente Feld
für die
räumliche
Auflösung,
die biochemische Erkennung für
die chemische Selektivität
und das Fluoreszenz-Labelling für verbesserte
Selektivität
und Empfindlichkeit des Nachweises die Messung geringster Mengen
an Analyten in einem komplexen Probenmedium, wie Blut, Gewebe oder
Pflanzenextrakte, ohne langwierige Probenherstellung erlaubt.
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Es
versteht sich, dass das Verfahren der Erfindung eine Methode des
Nachweises eines Target-Polynukleotids anwenden kann, welche einen
Nukleinsäure-Sandwich-Assay
in Lösungsphase
umfasst, der ähnlich
sein kann demjenigen, wie er in
US-4
868 105 , wie vorstehend erläutert, beschrieben wird, mit
der Ausnahme, dass der feste Träger
ein optischer planarer Wellenleiter ist, das gebundene Label von
dem nicht-gebundenen Label vor der Messung des gebundenen Labels
abgetrennt oder nicht abgetrennt werden kann, und das Label nachgewiesen
wird durch Messen der Lumineszenz, die in dem evaneszenten Feld
des Wellenleiters angeregt wird, oder durch Messen der Lumineszenz,
die in dem Nah-Feld des Wellenleiters erzeugt wird.
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Es
wurde gefunden, dass die zwei oder drei Hybridisierungs-Wechselwirkungen,
die nötig
sind, um das fluoreszierende Label in das evaneszente Feld zu bringen,
das erfindungsgemäße Verfahren
selektiver machen als die zuvor beschriebenen Methoden des Polynukleotid-Nachweises
unter Verwendung von planaren Wellenleitern, die eine einzige Hybridisierungs-Wechselwirkung
in Betracht ziehen. Es wurden gefunden, dass die Multiple-Capture- und -Label-Extender-Proben,
die sich an ein Target-Polynukleotid binden können, das Verfahren empfindlicher
machen als die früher
beschriebenen Methoden.
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Es
ist auch ersichtlich, dass das Wiederbeschichten des Wellenleiters
mit Capture-Proben nicht nötig ist,
um verschiedene Target-Polynukleotide unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Methode
nachzuweisen, da das Target-Polynukleotid nicht direkt zur Cap ture-Probe
hybridisiert, ganz im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Methoden
(zum Beispiel in WO 95/33198 und WO 96/35940), wo das Target-Polynukleotid
direkt zu dem an den Wellenleiter gebundenen Polynukleotid hybridisiert,
wo ein Wiederbeschichten mit einem verschiedenen Polynukleotid erforderlich
sein kann. Die Sequenz der Capture-Extender-Probe kann derart variiert
werden, dass verschiedene Capture-Extender-Proben imstande sind,
sich an eine gemeinsame Capture-Probe, jedoch verschiedene Target-Polynukleotide
zu binden.
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Ein
erster Aspekt der Erfindung umfasst ein Verfahren zum Nachweis eines
Target-Polynukleotids, bei dem zwei Sets von Reagenzien, ein Labelling-Set
und ein Capture-Set, eingesetzt werden, und worin ein optischer
planarer Wellenleiter verwendet wird, umfassend
- 1)
die Bereitstellung des Labelling-Sets der Reagenzien, welches umfasst:
a)
eine Vielzahl von Label-Proben, jeweils umfassend einen Label-Teil
und einen Nukleinsäurebereich
(der vorzugsweise einsträngig
ist) mit gleichen oder verschiedenen Sequenzen L1 (vorzugsweise
zwischen etwa 5 und 100 Nukleotiden (nt) lang; bevorzugter zwischen
etwa 8 und 100 nt lang), die komplementär sind zu gleichen oder verschiedenen
Sequenzen des Target-Polynukleotids, und gegebenenfalls zweite Sequenzen
zwischen dem Label-Teil und Sequenzen L1, die weder komplementär sind zu
einer Sequenz des Target-Polynukleotids noch zu dem Capture-Extender
oder Capture-Proben und die weniger als etwa 500 nt lang sind, wobei
der Label-Teil ein Label umfasst, das ein Signal liefert, welches
nachweisbar ist durch Lumineszenz einschließlich evaneszent angeregter
Lumineszenz, oder
b) eine Vielzahl von (b1) Label-Extender-Proben,
von denen eine jede eine Labelbindende Nukleinsäuresequenz L2 und Nukleinsäuresequenzen
L1 umfasst, worin die Sequenzen L1 komplementär sind zu Nukleinsäuresequenzen
des Target-Polynukleotids und die Sequenz L2 komplementär ist zu
der Nukleinsäuresequenz
L3 einer Label-Probe, und gegebenenfalls (b2) eine Label-Probe,
umfassend eine Nukleinsäuresequenz
L3, die komplementär
ist zu der Sequenz L2, und ein Label-Teil, umfassend ein Label,
das ein Signal liefert, welches nachweisbar ist durch Lumineszenz
einschließlich
der evaneszent angeregten Lumineszenz, und
- 2) die Bereitstellung des Capture-Sets von Reagenzien, umfassend
c)
eine Vielzahl von Capture-Proben, umfassend gleiche oder verschiedene
Nukleinsäuresequenzen
D1, die komplementär
sind zu Nukleinsäuresequenzen
des Target-Polynukleotids,
worin die Nukleinsäuresequenzen
D1 (vorzugsweise zwischen etwa 10 und 100 nt lang) nicht komplementär sind zu
Sequenzen L1, L2 und L3, die in der Label-Probe und der Label-Extender-Probe
enthalten sind, und worin die Capture-Probe gebunden ist an oder
befähigt
ist, spezifisch gebunden zu werden an die Oberfläche der Wellenleiterschicht
eines Wellenleiters, entweder direkt oder über verknüpfende Gruppen; oder
d)
eine Vielzahl von (d1) Capture-Extender-Proben, jeweils umfassend
einen Nukleinsäurebereich
(vorzugsweise einsträngig)
mit einer Sequenz C1 (vorzugsweise zwischen etwa 10 und 100 nt lang),
die komplementär
ist zu einer Sequenz des Target-Polynukleotids,
und gegebenenfalls einen zweiten Bereich, der nicht komplementär ist zu
einer Sequenz des Target-Polynukleotids und vorzugsweise kleiner
ist als etwa 500 nt lang, und weiterhin umfassend eine Capture-Probenerkennungs-Nukleinsäuresequenz
C2, und (d2) eine Capture-Probe und worin die Capture-Probe gebunden
ist an oder befähigt
ist, gebunden zu werden an die Oberfläche der Wellenleiterschicht
eines Wellenleiters entweder direkt oder über verknüpfende Gruppen, umfassend Nukleinsäuresequenzen
D2, die komplementär
sind zur Sequenz C2, worin die Sequenzen L1 und C1 nicht-identische,
nicht-komplementäre
Sequenzen sind;
- 3) Kombinieren in einem wässrigen
Medium unter bindenden Bedingungen für komplementäre Sequenzen, einer
Testprobe, worin die Anwesenheit des Target-Polynukleotids bestimmt
werden soll (das derart behandelt worden sein kann, dass das Target-Polynukleotid in
einsträngiger
Form vorliegt), mit
a) Zusammensetzungen 1a) und 2c) oder 1a)
und 2d), oder (b) Zusammensetzungen 1b) und 2c) oder 1b) und 2d),
oder (c) Zusammensetzungen 1a), 1b) und 2c) oder 1a), 1b) und 2d),
oder (d) Zusammensetzungen 1a), 2c) und 2d) oder 1b), 2c) und 2d),
oder (e) Zusammensetzungen 1a), 1b), 2c) und 2d), so dass Komplexe
gebildet werden;
- 4) Binden der Komplexe von Stufe 3 an den Wellenleiter über eine
Vielzahl von Kopien der Capture-Probe (die Capture-Probe kann an
den Wellenleiter vor dem Binden an die Komplexe von Stufe 3 gebunden
werden oder an den Wellenleiter nach Binden an die Komplexe von
Stufe 3 gebunden werden);
- 5) wenn die Zusammensetzung 1b) keine Label-Probe umfasst und
ein Label nicht in Stufe 3 eingeschlossen ist, um besagte Komplexe
einem Labelling zu unterziehen, dann Kombinieren des gebundenen
Komplexes von Stufe 4 mit dem Label;
- 6) Nachweis des an das Target-Polynukleotid gebundenen Labels
durch Messen der Lumineszenz, die in dem evaneszenten Feld des Wellenleiters
angeregt wird, oder durch Messen der Lumineszenz, die in dem nahen
Feld des Wellenleiters erzeugt wird,
wobei zumindest zwei
Label-Proben oder Label-Extender, Capture-Proben oder Capture-Extender-Proben mit verschiedenen
Nukleinsäuresequenzen,
die zu verschiedenen Target-Nukleinsäuresequenzen
komplementär sind,
verwendet werden.
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Es
ist bevorzugt, dass jede der Sequenzen L1 komplementär ist zu
einem jeweiligen physikalisch eigenständigen nicht-überlappenden
Bereich des besagten Target-Polynukleotids; und es ist bevorzugt,
dass jede der Sequenzen L1 und C1 nicht-identische, nicht komplementäre Sequenzen
sind, die vorzugsweise jeweils komplementär sind zu physikalisch eigenständigen nicht-überlappenden
Bereichen des Target-Polynukleotids.
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Eine
Vielzahl bedeutet im Zusammenhang mit der Erfindung, dass bis zu
100, vorzugsweise 5 bis 80, insbesondere 5 bis 50, meist bevorzugt
5 bis 40, und ganz besonders bevorzugt 10 bis 30, mit verschiedenen Nukleinsequenzen
verwendet werden können.
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Vorzugsweise
wird die Lumineszenz unter Verwendung eines optischen Kopplungselements
in den Wellenleiter eingekoppelt, weitergeleitet und ausgekoppelt.
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Es
ist bevorzugt, dass C1, C2, L1 und D1 nicht in Bezug aufeinander
identisch sind und dass C1, L1 und D1 in Bezug aufeinander nicht
komplementär
sind. Es ist weiterhin bevorzugt, dass wenn der Label-Extender eine
Bindungsstelle für
den Label umfasst und diese Bindungsstelle eine einsträngige Nukleinsäuresequenz
(L2) umfasst und das Label eine einsträngige Nukleinsäuresequenz
(L3), die komplementär
ist zu L2, umfasst, jenes L3 nicht zur D1 komplementär ist.
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Als
bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung in diesem Zusammenhang wird die in dem evaneszenten
Feld des Wellenleiters angeregte Lumineszenz nachgewiesen.
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Weitere
Ausführungsformen
umfassen den Nachweis von Lumineszenz, Chemolumineszenz, Biolumineszenz
oder Elektrolumineszenz, die in dem Nah-Feld des Wellenleiters erzeugt
werden. Vorzugsweise wird diese Lumineszenz unter Verwendung eines
optischen Kopplungselements in den Wellenleiter eingekoppelt, weitergeleitet
und ausgekoppelt.
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Ein
bevorzugtes optisches Kopplungselement für die Einkopplung von Anregungslicht
in den Wellenleiter oder das Ausleiten von Lumineszenz aus dem Wellenleiter
sind in dem Wellenleiter oder in dem Trägermaterial modulierte Gitter.
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Es
versteht sich, dass die folgenden Punkte für mehrere Aspekte der vorliegend
beschriebenen Erfindung relevant sein können.
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Es
ist bevorzugt, dass der optische planare Wellenleiter ein optischer
planarer Wellenleiter auf einem kontinuierlichen Substrat ist. Es
ist weiterhin bevorzugt, dass das Substrat transparentes Glas, Quarz
oder ein transparentes thermoplastisches Kunststoffmaterial wie
Polycarbonat ist. Es können
weiterhin eine transparente Zwischenschicht zwischen dem Substrat
und der Wellenleiterschicht mit einem geringeren Brechungsindex
als demjenigen des Wellenleiters, vorzugsweise auch geringer als
der Brechungsindex des Substrats, vorgesehen sein.
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Der
Brechungsindex des Wellenleiters sollte größer sein als derjenige des
Substrats und jeglicher Zwischenschichten, die verwendet werden.
Die planare transparente Wellenleiterschicht besteht vorzugsweise aus
einem Material mit einem Brechungsindex von größer als 1,8, noch bevorzugter
von größer als
2,0. Geeignete Materialien umfassen zum Beispiel anorganische Materialien,
insbesondere anorganische Metalloxide wie TiO2,
ZnO, Nb2O5, Ta2O5, HfO2 oder
ZrO2. TiO2 oder
Ta2O5 sind bevorzugt.
Es ist bevorzugt, dass Kombinationen von anorganischen Metalloxiden
nicht eingesetzt werden.
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Die
Dicke der Wellenleiterschicht beträgt vorzugsweise von 40 bis
1000 nm, bevorzugter von 40 bis 300 nm und meist bevorzugt von 70
bis 160 nm.
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Die
Modulationstiefe der Gitter beträgt
vorzugsweise von 3 bis 60 nm, bevorzugter von 3 bis 30 nm. Das Verhältnis von
Modulationstiefe zur Dicke der Wellenleiterschicht ist vorzugsweise
gleich oder geringer als 0,5 und bevorzugter gleich oder geringer
als 0,2.
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Die
Gitter können
in Form von optischen Beugungsgittern, vorzugsweise in Form von
Reliefgittern, vorliegen. Die Reliefstruktur kann verschiedene Formen
aufweisen, zum Beispiel sinusförmige,
rechteckige oder sägezahnförmige Strukturen.
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Die
Gitterstruktur kann auf dem Substrat erzeugt werden und dann zur
Wellenleiterschicht transferiert werden, wo die Gitterstruktur sich
dann selbst reproduziert, oder das Gitter wird in der Wellenleiterschicht selbst
erzeugt.
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Der
Gitterabstand kann von 200 nm bis 1000 nm betragen und wird derart
gewählt,
dass er eine Einkopplung von Licht in oder Auskopplung aus dem Wellenleiter
in der ersten Beugungs-Ordnung erlaubt.
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Die
Wellenleiterschichten leiten vorzugsweise lediglich 1, 2, 3 oder
4 Moden und sind vorzugsweise monomodale Wellenleiter.
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Es
versteht sich, dass die Label-Extender-Proben, Capture-Extender-Proben
und Capture-Probe
Bereiche von einsträngiger
Nukleinsäure
umfassen können.
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Es
versteht sich ferner, dass unter "Nukleinsäure" DNA, RNA, PNA (Peptidnukleinsäure) oder
andere modifizierte Oligonukleotide wie 2'-O-Methyl- oder P=S (Phosphorthioat)-Analoga umfasst sind.
Modifizierte Oligonukleotide und Nukleinsäure-Analoga können bei
der Optimierung des Assays hinsichtlich Empfindlichkeit und Spezifizität wertvoll
sein. Zusätzlich
können
modifizierte Oligonukleotide von Nukleasen nicht verdaut werden
und sind daher in realen Testproben wie Blutserum oder Pflanzenextrakten
stabil. Eine Optimierung kann erzielt werden, indem man kinetische
Analysen durchführt,
zum Beispiel unter Verwendung von einer Computer-gestützten Assay-Anordnung.
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Es
versteht sich, dass die Stufen nicht in der angegebenen Reihenfolge
durchgeführt
werden müssen, obgleich
es bevorzugt ist, wenn die Stufen in der angegebenen Reihenfolge
durchgeführt
werden. Insbesondere versteht es sich, dass die Reihenfolge, in
der das Target-Polynukleotid die Label-Extender-Probe, die Capture-Extender-Probe,
die Capture-Probe
und das Label (wenn in der Label-Extender-Probe umfasst) binden,
für die
Arbeitsweise der Erfindung nicht kritisch ist. Es ist bevorzugt,
dass das Target-Polynukleotid an die Label-Extender-Probe und Capture-Extender-Probe
vor dem Binden an die Capture-Probe
bindet (d.h. dass eine "Pre-Inkubation"-Stufe durchgeführt wird).
Das kann das Signal optimieren und den Hintergrund minimieren.
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Der
Hybridisierungs-Assay kann in jeder möglichen Reihenfolge und Kombination,
in Abhängigkeit
von dem spezifischen Assay-Target (ss oder ds; DNA, RNA) und in
Abhängigkeit
davon, ob Empfindlichkeit oder Spezifizität bei dem speziellen Assay
am wichtigsten ist, durchgeführt
werden. Die beiden Extreme sind:
- 1) Ein Verfahren,
bei dem der gesamte Assay in einer Stufe in situ durchgeführt wird,
zum Beispiel in einer Vertiefung, wo die Lösung mit der Oberfläche des
planaren Wellenleiters (PWG) mit einem immobilisierten Rezeptor
in Kontakt tritt oder in einer separaten Pre-Inkubationskammer. Der immobilisierte
Rezeptor ist imstande, den Capture-Extender zu binden und kann daher
das gesamte Sandwich, welches in der Lösung gebildet wird, einschließlich des
Labels binden.
- 2) Alternativ können
die gleichzeitigen Hybridisierungsstufen nacheinander direkt auf
der Oberfläche
des PWG durchgeführt
werden (d.h. innerhalb eines sequenziellen Verfahrens). Zwischen
diesen Extremen kann jede Variation vorgenommen werden.
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Somit
betrifft ein Aspekt der Erfindung ein Verfahren gemäß der vorstehend
beschriebenen ersten Ausführungsform,
worin Stufen 3 und 4 kombiniert sind derart, dass eine Testprobe,
worin die Anwesenheit des Target-Polynukleotids bestimmt werden
soll, kombiniert wird mit den Label-Extender-Proben und den Capture-Extender-Proben
und der gegebenenfalls an den planaren Wellenleiter gebundenen Capture-Probe
derart, dass (Label-Extender-Probe)
+ (Target-Polynukleotid) + (Capture-Extender-Probe) + (Capture-Probe)-Komplexe
gebildet werden, die an den planaren Wellenleiter über die
Capture-Probe gebunden werden. Es ist bevorzugt, dass die Capture-Probe
auf der Wellenleiteroberfläche
immobilisiert ist, jedoch versteht sich, dass mehrere Komplexe multiple
Sandwich-Anordnungen möglich
sind.
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Die
Lösung,
in der die Assay-Stufen durchgeführt
werden, ist eine wässrige
Lösung.
Es kann sich um eine beliebige geeignete Pufferlösung handeln, zum Beispiel
75 mM Natriumzitrat, 750 mM Natriumchlorid, 0,1% Tergitol NP-40
(Tergitol ist eine Handelsbezeichnung für eine Reihe von Netzmitteln),
eingestellt auf pH 7,0.
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Geeignete
Pufferkomponenten können
umfassen
| 0–2 M | Natriumzitrat |
| 0–2 M | Natriumchlorid |
| 0–2% | Tergitol® NP-40 |
| 0–2% Gew./Vol. | Tween-20® oder
80 oder ein anderes Detergens |
| 0–2 M | Tris-HCl,
pH 6–8 |
| 0–2% | Rinderserumalbumin
(BSA) |
| 0–500 mM | EDTA |
| 0–2% Gew./Vol. | Tartrazin |
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Unter "komplementärer Sequenz" ist eine Sequenz
zu verstehen, die imstande ist, mit einer Polynukleotid-Sequenz
unter den in dem Assay verwendeten Bedingungen zu hybridisieren.
Unter "Hybridisieren" ist zu verstehen,
dass die Sequenzen imstande sind, zusammen eine stabile Struktur
zu ergeben, die durch aus dem Stand der Technik gut bekannte Hybridisierungs-Assays
nachgewiesen werden kann. Diese Bedingungen können derart sein, dass die
Hybridisierung lediglich dann erfolgt, wenn die Sequenzen zu zumindest
60% invers identisch sind, bevorzugter zumindest 80% invers identisch,
noch bevorzugter zumindest 90% invers identisch und meist bevorzugt
zumindest 95% invers identisch. Unter "% invers identisch" ist der Prozent-Anteil an Basen (in
dem betrachteten Bereich) zu verstehen, die theoretisch imstande
sind, Basenpaare zu bilden, wenn einsträngige Sequenzen mit einem 5'-3'-Strang und die anderen
3'-5' angeordnet sind.
Die Hybridisierungsstufen können
zwischen 0°C
und 90°C
in dem vorstehend beschriebenen Puffer durchgeführt werden, vorzugsweise werden
sie bei 53°C
durchgeführt.
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Es
versteht sich, dass das Target-Polynukleotid oder das Signal vor
dem Nachweis verstärkt
werden kann, jedoch ist diese Verstärkung nicht wesentlich.
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Es
versteht sich, dass das Polynukleotid bei extrem geringer Konzentration
nachgewiesen werden kann. Hierunter ist zu verstehen, dass weniger
als 104 Kopien eines Target-Polynukleotids
nachgewiesen werden können,
vorzugsweise weniger als 103 Kopien, noch
bevorzugter 102 Kopien oder weniger. Probenvolumen
können
zwischen 10 nl und 10 ml betragen. Es wurde nun gezeigt, dass es
möglich
ist, weniger als 1000 Äquivalente
der genomen DNA in 10 μl
einer Probe, wie in den Beispielen beschrieben, nachzuweisen.
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Es
ist nicht wesentlich, die Probe und nicht-gebundenes Label vor dem
Abfangen des spezifischen Target-bezogenen Signals nicht zu entfernen.
In Fällen
von extrem hoher Empfindlichkeit kann es vorkommen, dass das "bulk"-Signal, welches
die temporär
in unmittelbarer Nachbarschaft zur Oberfläche (in dem evaneszenten Feld)
befindlichen Labels repräsentiert,
das spezifische Signal auf Grund der hohen Label-Konzentration im
Vergleich zu dem bei dem Versuch verwendeten Target-Level maskiert.
In solchen Fällen
ist es vorteilhaft, nicht-gebundene Labels (durch Waschen der Zelle)
vor der Signalaufzeichnung zu entfernen.
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Das
Target-Polynukleotid kann DNA oder RNA, ss oder ds, sein. Zum Beispiel
kann es eine mRNA, eine virale DNA oder eine genome Sequenz eines
pathogenen Organismus sein. Es kann jegliches Gel von Interesse,
zum Beispiel für
experimentelle oder diagnostische Zwecke sein. Es versteht sich,
dass das Target-Polynukleotid sich von einem pflanzlichen Pathogen
oder einem tierischen oder menschlichen Pathogen ableiten kann.
Ein Beispiel für
ein pflanzliches Pathogen, von dem sich ein Target-Polynukleotid
ableiten kann, ist Pseudocercosporella herpotrichoides. Eine bevorzugte
Möglichkeit,
die in der klinischen Diagnostik von Bedeutung ist, besteht darin,
dass das Pathogen ein Virus ist. Es ist besonders bevorzugt, wenn
der Virus CMV (Cytomegalovirus), HBV (Hepatitis B-Virus), HCV (Hepatitis
C-Virus) oder HIV (human immunodeficiency-Virus) ist. Dieser Assay
kann zum Beispiel angewandt werden, um die fünf Genotypen des Hepatitis
C-Virus zu identifizieren und zu differenzieren (Cha et al., (1972),
PNAS, 89, 7144–7148).
Andere Targets sind Marker-Gene oder Wirkstoff-bedingte Messages,
d.h. mRNAs, deren Menge sich als Reaktion auf einen speziellen Wirkstoff
verändert.
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Es
versteht sich, dass das Target-Polynukleotid ein Polynukleotid sein
kann, das eine Sequenz umfasst, die mit einer Erkrankung verknüpft ist.
Zum Beispiel kann es eine Mutation umfassen, die statistisch mit Krebs
oder mit einer speziellen Form von Krebs verknüpft ist. Beispiele für Krebsformen,
die mit speziellen Mutationen verknüpft sind, umfassen Prostatakrebs,
Brustkrebs, Darmkrebs und Leukämien.
Ein Beispiel für
eine Mutation, die mit einer Erkrankung verknüpft sein kann, ist das cystische
Fibrose-Gen. In Enzymen durch Pharmaco- und Toxicogenetik identifizierte
Mutationen können
ebenfalls nachgewiesen werden, wobei diese ein P450-Enzym umfassen
können.
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Die
Kombination der planaren Wellenleitertechnologie mit DNA/RNA-Hybridisierung
erlaubt den Nachweis von Erkrankungs-Markern wie einsträngige DNA,
RNA oder denaturierte doppelsträngige
DNA. Das DNA-Target kann zum Beispiel ein DNA-Fragment, virale DNA
oder genome DNA sein.
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Ist
das Polynukleotid ein ds-Polynukleotid oder eine Triple Helix, sollte
diese vor dem Nachweis denaturiert werden. Die Denaturierung kann
mit Hilfe jeder geeigneten Maßnahme
erfolgen, wie Wärmeanwendung oder
Veränderung
der Ionenstärke
oder des pH. Alternativ können
einsträngige
Kopien durch asymmetrische PCR hergestellt werden. Es ist bevorzugt,
dass einsträngige
Kopien eher durch Denaturierung als durch asymmetrische PCR hergestellt
werden, da die Anwendung einer PCR-Stufe, wie vorstehend beschrieben,
Variabilität
bedingen kann. Es versteht sich, dass die Denaturierung nach Kombinieren
der das Target-Polynukleotid enthaltenden Probe mit den Assay-Reagenzien
erfolgen kann. Vorzugsweise erfolgt dies nach Kombination. Dies
besitzt den Vorteil, dass die Gelegenheiten für eine Renaturierung des Target-Polynukleotids
vor dem Kontakt mit den Assay-Reagenzien
reduziert sind. Die Denaturierung kann zweckmäßig durch Erhitzen auf 95°C während 5
Minuten durchgeführt
werden.
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Das
Set von Label-Extender-Proben zum Nachweis eines gegebenen Target-Polynukleotids
umfasst zumindest zwei Probentypen und kann bis zu 30 Probentypen
umfassen. Es ist bevorzugt, wenn das Set zwischen 5 und 30, bevorzugter
zwischen 10 und 25, und meist bevorzugt zwischen 15 und 25 Probentypen
umfasst. Es versteht sich, dass (i) die optimale Größe des Sets
abhängig
sein kann vom Target und Assay und (ii) die erzielte Amplifikation
der Anzahl der verwendeten Label-Extender-Proben proportional ist.
Jede Label-Extender-Probe
umfasst einen einsträngigen
Nukleinsäure-Bereich
und ein Label-Teil, wobei der Nukleinsäure-Bereich eine Sequenz L1,
die komplementär
ist zu einer Sequenz des Target-Polynukleotids, aufweist, und das
Label-Teil ein Label, welches ein durch Lumineszenz, zum Beispiel
evaneszent angeregte Lumineszenz, nachweisbares Signal ergibt, oder
eine Bindestelle für
dieses Label umfasst, worin jede der besagten Sequenzen L1 zu physisch
verschiedenen, nicht-überlappenden
Bereichen des Target-Polynukleotids komplementär ist. Jede Label-Extender-Probe
kann weiterhin einen zweiten Nukleinsäure-Bereich umfassen, der nicht zu einer
Sequenz des Target-Polynukleotids komplementär ist und der weniger als etwa
500 nt aufweist.
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Die
Bindestelle für
das Label kann eine einsträngige
Polynukleotid-Sequenz umfassen. Sie kann eine Sequenz (L2) sein,
die zu einer Sequenz (L3) eines Polynukleotids, an das ein oder
mehrere Label-Moleküle gebunden
sind, komplementär
ist. Diese zweite Sequenz wird derart ausgewählt werden, dass sie nicht
zu einer Sequenz der Target-Polynukleotidsequenz oder irgendeiner
anderen Sequenz, die voraussichtlich in der Probe vorzufinden ist,
komplementär
ist. Es versteht sich, dass wenn die Bindestelle für das Label
eine einsträngige
Polynukleotid-Sequenz umfasst, die Label-Extender-Probe einen "Ketten-Extender", wie er in einigen
aus dem Stand der Technik bekannten Sandwich-Assays verwendet wird,
entsprechen kann und das Label einer "Label-Probe" entspricht.
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Die
Bindestelle und das Label können
jeweils alternativ Moleküle
mit hoher Spezifizierung und Affinität füreinander, zum Beispiel Biotin/Avidin
oder Streptavidin, umfassen. Somit kann die Bindestelle Biotin umfassen
und as Label kann Avidin umfassen, oder umgekehrt. Alternativ kann
das Label direkt an die Label-Extender-Probe gebunden sein.
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Der
Bereich L1 wird im Allgemeinen zwischen 5 und 5000 Nukleotide, vorzugsweise
zwischen 10 und 500 Nukleotiden, bevorzugter zwischen 15 und 20
Nukleotide in der Länge
umfassen. Es versteht sich, dass der Bereich L1 an einen zweiten
Nukleinsäure-Bereich
gebunden sein kann, der zu einer Sequenz des Target-Polynukleotids
am 3'- oder 5'-Ende nicht komplementär ist.
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Die
komplementären
Sequenzen werden derart gewählt,
dass Sequenzen des Target-Polynukleotids für die Bindung der Capture-Extender-Probe
hieran verbleiben. Gewöhnlich
werden zumindest 25 Nukleotide verfügbar bleiben. Die zu den Label-Extender-Proben
komplementären
Sequenzen können
getrennt oder im Wesentlichen angrenzend sein. Sie können mit
Sequenzen alternieren, die zu den Sequenzen der Capture-Extender-Probe
komplementär
sind. Es ist bevorzugt, dass die zu dem Label- und dem Capture-Extender-Proben komplementären Sequenzen über die
Target-Sequenz verteilt sind und alternieren.
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Die
Sequenzen und die Anzahl der Capture-Extender-Proben, die zu dem
Target-Polynukleotid komplementär
sind, können
auf Basis von speziellen Kriterien ausgewählt werden. Zum Beispiel können, wenn
es erwünscht
ist, die Menge des Polynukleotids mit einer speziellen Mutation
zu quantifizieren, die Sequenzen dann so gewählt werden, dass unter den
Assay-Bedingungen eine Bindung an den Polynukleotid-Molekülen nur
mit dieser speziellen Mutation erfolgt.
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Die
Label-Extender-Probe kann zweckmäßig nach
bekannten Methoden der Oligonukleotid-Synthese oder durch Klonen
hergestellt werden und kann in geeigneter Weise für das Labelling
modifiziert werden. Es ist bevorzugt, wenn die Sequenzen durch Synthese
hergestellt werden. Indem man für
eine Endgruppe sorgt, die eine geeignete Funktionalität besitzt,
können
mit einem Label versehene Moleküle über die
funktionelle Gruppe verknüpft
werden. Beispiele umfassen Carboxy, Thio, Amin oder Hydrazin.
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Das
Label umfasst eine lumineszierende Verbindung. Vorzugsweise besitzt
die Verbindung eine Lumineszenz-Wellenlänge im Bereich von 330 nm bis
1000 nm. Beispiele umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein: Rhodamine, Phycoerythrin,
Umbelliferon, Luminol, Texas-Rot, Fluorescein-Derivate, Cumarin-Derivate, Distyrylbiphenyle,
Stilben-Derivate,
Phthalocyanine, Naphthalocyanine, Polypyridyl/Ruthenium-Komplexe
wie Tris-(2,2'-bipyridyl)-rutheniumchlorid,
Tris-(1,10-phenanthrolin)-rutheniumchlorid, Tris-(4,7-diphenyl-1,10-phenanthrolin)-rutheniumchlorid
und Polypyridyl/Phenazin/Ruthenium-Komplexe, Platin/Porphyrin-Komplexe
wie Octaethyl-Platin-Porphyrin, langlebige Europium- und Terbium-Komplexe
oder Cyanid. Besonders geeignet für Analysen von Blut oder Serum
sind Farbstoffe mit Absorptions- und Emissionswellenlängen im
Bereich von 5600 bis 900 nm.
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Farbstoffe
wie Fluorescein-Derivate, die funktionelle Gruppen aufweisen, über die
sie kovalent gebunden werden können,
wie Fluoresceinisothiocyanat, sind bevorzugt. Funktionelle fluoreszierende
Farbstoffe, die im Handel von Biological Detection Systems, Inc.,
erhältlich
sind, zum Beispiel die mono- und bi-funktionellen Cy5(R)-Farbstoffe
(Clin. Chemistry, (1994), 40(9), 1819–1822) sind besonders bevorzugt.
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Zusätzlich kann
die längere
Emissionswellenlänge
von roten und NIR (nahes Infrarot)-Farbstoffen für bestimmte Anwendungen aufgrund
der größeren Penetrationstiefe
des evaneszenten Felds (je längen
die Wellenlänge
ist, um so größer ist
die Eindringtiefe des evaneszenten Felds) von Vorteil sein. Das
Labelling der Oligonukleotide während
der letzten Stufe der DNA-Synthese ist günstig, was zu einer höheren Ausbeute
und Homogenität
des Label-versehenen Oligonukleotids, zum Beispiel mit Cy5(R), führt.
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Die
Capture-Probe kann eine Nukleinsäure-Sequenz,
die komplementär
ist zu der Capture-Proben-Erkennungssequenz,
umfassen, worin die Nukleinsäuresequenz
zwischen etwa 10 und 100 nt lang ist und nicht zu Sequenzen, die
in der Label-Extender-Probe enthalten sind, komplementär ist und
worin die Capture-Probe gebunden ist an oder imstande ist, spezifisch
gebunden zu werden an einen planaren Wellenleiter. Es kann ein Polynukleotid
mit zwischen 10 und 100 Nukleotiden in der Länge, vorzugsweise zwischen
15 und 50 Nukleotiden, bevorzugter zwischen 18 und 30 Nukleotiden
in der Länge
sein. Die Capture-Probe
kann eine "universelle" Sequenze aufweisen,
derart, dass sie bei dem Nachweis verschiedener unterschiedlicher
Target-Polynukleotide eingesetzt werden kann. Eine bevorzugte Capture-Proben-Sequenz
ist 3'-TTATAGTACTCCAATGCC-5'. Diese Sequenz besitzt
eine günstige
Stabilität
gegenüber
Exonukleasen aufgrund der Immobilisierung an der Oberfläche am 3'-Ende. Die Anknüpfung der
Capture-Probe am 3'-Ende
ist günstig,
da die Capture-Probe durch die meisten Exonukleasen, die Oligonukleotide
am 3'-Ende angreifen,
nicht verdaut werden kann.
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Die
Capture-Probe kann mit Hilfe bekannter Syntheseprotokolle synthetisiert
werden. Es ist bevorzugt, wenn sie auf einem Wellenleiter-"Chip" synthetisiert wird,
so dass sie durch das 3'-Ende
immobilisiert werden kann. Zum Beispiel kann sie mit einem Oligonukleotid-Synthesizer (Applied
Biosystems 394B) direkt auf dem Wellenleiter-Chip synthetisiert werden,
der silaniert ist mit 3-Glycidyloxypropyltrimethoxysilan über eine
Standardverfahren-Modifizierung, die angewandt wird bei der Oligonukleotid-Synthese
auf Teilchen (zum Beispiel wie in Gait (1990), Oligonucleotide synthesis:
a practical approach, Oxford University Press, NY, beschrieben). Anstelle
der Standard-Synthese wird 4-(4,4-Dimethoxytrityl)-hydroxybuttersäure als
stabile verknüpfende Gruppe
zur Verankerung des 3'-Endes
des Oligonukleotids an der Oberfläche verwendet. Die Oberfläche kann vor
der Verwendung in dem Assay gewaschen werden.
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Während die
vorstehende Methode angewandt werden kann, ist die folgende Methode
bevorzugt:
- a) PWG-Chips werden mit CHCl3 gereinigt
- b) die Silanierung in flüssiger
Phase der PWG-Chips erfolgt durch Behandlung mit 2% (Vol./Vol.)
3-Glycidyloxypropyltrimethoxysilan und 0,2% (Vol./Vol.) N-Ethyldiisopropylamin
in o-Xylol bei erhöhter
Temperatur (d.h. 50 bis 90°C)
während
mehrerer Stunden.
- c) Silanierte PWG-Chips werden in CH3CN
gereinigt
- d) PWG-Chips werden in einem Exsikkator unter Vakuum getrocknet
- e) Immobilisierung der Oligonukleotide
Die Oberflächen-gebundenen
Epoxyringe können über Ringöffnung mit
endständigen
Amino- oder Thiolgruppen der modifizierten Oligonukleotide reagieren:
100 μl einer
10 nmol einer Thiol- oder Amino-terminierten Capture-Probe enthaltenden
Lösung
werden bei 35°C über Nacht
in 100 mM wässrigem
Carbonatpuffer, pH 8,2, inkubiert.
- f) PWG-Chips mit immobilisierten Capture-Proben werden mit Wasser
gespült,
getrocknet und bei –20°C bis zur
Verwendung in dem PWG-Setup aufbewahrt.
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Die
Capture-Probe kann auf dem Wellenleiter auch mit Hilfe anderer Mittel
verankert werden. Zum Beispiel kann ein photochemisches Vernetzen,
wie in WO 94/27137 beschrieben, angewandt werden. Eine adhäsions-fördernde
Schicht kann zwischen die Wellenleiterbereiche und die immobilisierte
Capture-Probe platziert werden. Die Dicke der adhäsions-fördernden
Schicht ist vorzugsweise gleich oder geringer als 50 nm, bevorzugter
geringer als 20 nm und noch bevorzugter geringer als 10 nm.
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Die
Lösung,
die die Capture-Probe enthält,
kann tropfenweise unter Verwendung eines Multi-Pipettenkopfs oder
eines modifizierten Tintenstrahldruckkopfs mit piezoelektrischen
Antriebselementen aufgebracht werden. Dies besitzt den Vorteil,
dass das Verfahren rasch durchgeführt werden kann und dass sehr
geringe Mengen verwendet werden können. Wird eine "universelle" Capture-Probe verwendet,
kann die gleiche Lösung
auf sämtliche
Messbereiche aufgebracht werden.
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Die
Capture-Probe und anschließenden
Reagenzien können
mit Hilfe einer Strömungszelle
den Messbereichen zugeführt
werden. Die Trennung der Bereiche kann mechanisch unter Verwendung
von Trennstäben
oder im Fall eines laminaren Stroms fluidisch durchgeführt werden.
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Die
selektive Immobilisierung der spezifischen Erkennungselemente ausschließlich auf
den Nachweisbereichen, entweder direkt oder über adhäsions-fördernde Schichten, kann bei
Verwendung einer Probenzelle, die sowohl den Wellenleiterbereich
als auch Nicht-Wellenleiterbereiche bedeckt, zu einer Zunahme der Empfindlichkeit
der Nachweismethode führen,
da die nicht-spezifische Bindung der Analyte in den für die Signalerzeugung
nicht verwendeten Bereichen reduziert ist.
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Es
versteht sich, dass eine adhäsions-fördernde
Schicht selektiv lediglich im Wellenleiterbereich aufgebracht werden
kann oder in den Nicht-Wellenleiterbereichen deaktiviert werden
kann, beispielsweise mit Hilfe einer photochemischen Aktivierung
oder der vorstehend beschriebenen Zufuhr-Mittel.
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Generell
kann die Capture-Probe mit Hilfe von Methoden immobilisiert werden,
die die hydrophobe Adsorption oder kovalente Bindung direkt an die
Wellenleiterbereiche oder nach chemischer Oberflächenmodifizierung, zum Beispiel
durch Silanierung oder durch Aufbringen einer Polymerenschicht,
einschließen.
Um die Immobilisierung der Capture-Probe direkt auf dem Wellenleiter zu
fördern,
kann eine dünne
Zwischenschicht, die zum Beispiel aus SiO2 besteht
(Boksányi
et al., (1976), Advanc. Colloid interface Sci., 6, 95–137) als
adhäsions-fördernde
Schicht aufgebracht werden.
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Es
versteht sich, dass die hydrophobe Verknüpfung nicht möglich ist,
wenn die Capture-Probe
ein Polynukleotid ist. Kovalente oder ionische Verknüpfung sind
im Allgemeinen bevorzugt, jedoch sind auch andere Rezeptor/Liganden-Paare,
wie Avidin/Biotin, Antikörper-Haptene
oder Erkennungssysteme wie (His)6-markiertes
Oligonukleotid an NTA (Nitrilotriessigsäure) möglich.
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Der
Adhäsions-Promotor
kann eine funktionalisierte Silanschicht oder eine Polymerschicht
sein (z.B. Polylysin; M. Schena, D. Shalon, R. Heller, A. Chai,
P.O. Brown und R. W. Davis: Parallel human genome analysis: microarray
based expression monitoring of 1000 genes, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 93, (1996), 10614–10619),
die Funktionen (zum Beispiel Epoxy, -NH2,
-SH, -COOH, -NHS, Maleimid) aufweisen, wobei die Funktion vor der
Verknüpfung
der funktionalisierten Capture-Probe (Funktionen wie vorstehend
angegeben) aktiviert werden sollte. Im Fall von ionischen Verknüpfungen
sollten Bedingungen angewandt werden, die ionische Wechselwirkungen
zwischen der verknüpfenden
Funktion der Capture-Probe (jedoch nicht der Capture-Sequenz oder
eines Gliedes der gesamten Nachweiskaskade) und der adhäsions-fördernden
(also ionischen, komplementär
geladenen) Schicht fördern.
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Bei
einer nicht-kovalenten Verknüpfung
kann die Regenerierung der Oberfläche durchgeführt werden, indem
man Bedingungen schafft, die die Abspaltung der Capture-Probe von
der Oberfläche
begünstigen.
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Es
kann möglich
sein, das Target-Polynukleotid, die Capture-Extender-Probe und die
Label-Extender-Probe von der Wellenleiteroberfläche derart zu entfernen, dass
die Capture-Probe
unbeschädigt
bleibt und der Wellenleiter erneut für den Nachweis des gleichen
oder eines verschiedenen Target-Polynukleotids verwendet werden
kann. Zum Beispiel können
niedriger pH oder hoher pH, erhöhte
Temperatur, organische Lösungsmittel
oder chaotrope Mittel (Salze) verwendet werden, um das Target-Polynukleotid,
die Capture-Extender- Probe
und die Label-Extender-Probe abzuspalten. Ein pH < 4 kann die DNA
beschädigen
und ist daher nicht bevorzugt. Ein hoher pH, z.B. 10 mM NaOH, oder
50% wässrige
Harnstofflösung,
können
verwendet werden, um die dsDNA an der Sensor-Oberfläche zu denaturieren
und hierdurch das Target-Polynukleotid und die Capture-Extender-Probe
von der Capture-Probe abzuspalten.
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Capture-Extender-Proben
umfassen jeweils zweisträngige
Nukleinsäurebereiche,
wobei der erste Nukleinsäurebereich
eine Sequenz C1 zwischen etwa 10 und 100 nt Länge aufweist, die komplementär ist zu
einer Sequenz des Target-Polynukleotids und wobei der zweite Bereich
nicht komplementär
ist zu einer Sequenz des Target-Polynukleotids und weniger als etwa
500 nt Länge
aufweist und weiterhin eine Capture-Probe-Erkennungssequenz C2 umfasst,
worin die Sequenzen L1 und C1 nicht-identische, nicht-komplementäre Sequenzen
sind, die jeweils komplementär
zu physisch eigenständigen
nicht-überlappenden
Sequenzen des Target-Polynukleotids sind.
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Es
versteht sich, dass mehr als ein Typ des Target-Polynukleotids auf
einmal in einer Probe nachgewiesen werden kann. Capture-Extender-Proben
und Label-Extender-Proben von unterschiedlicher Spezifizität können gemischt
werden und die unterschiedlichen Target-Polynukleotide getrennt nachgewiesen
und quantifiziert werden, wenn Labels verwendet werden, die verschiedene
Emissionswellenlängen
besitzen und daher in einem geeigneten Wellenleitersystem voneinander
unterschieden werden können.
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Es
versteht sich, dass das Verhältnis
von Target zu Capture-Extender eine Optimierung für ein spezielles
Target-Polynukleotid und einen speziellen Konzentrationsbereich
erfordern wird. Dies kann erfolgen, indem man das Verhältnis der
Capture-Extender-Probe zu dem Target-Polynukleotid verändert, während man ein
konstantes Verhältnis
Target zu Label-Extender
verwendet. Das Optimierungsverfahren wird zur Bestimmung der besten
Ergebnisse hinsichtlich des Verhältnisses
von spezifischer zu nicht-spezifischer Bindung (d.h. Bindung in
Abwesenheit des Target-Polynukleotids) führen.
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Das
Verhältnis
von Target zu Label-Extender kann ähnlich optimiert werden, indem
man ein konstantes Verhältnis
Target zu Capture-Extender anwendet, um das optimale Verhältnis von
Target zu Label-Extender zu finden.
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Es
versteht sich, dass die Gewichtsverhältnisse oder Konzentrationen
der Bestandteile, zum Beispiel Label-Extender (LE), Capture-Extender
(CE) und Label-Probe (LP) im Wesentlichen Assay-spezifisch (d.h.
abhängig
von der Natur der Probe) und Target-spezifisch sind und für jedes
Target optimiert werden müssen.
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Es
ist bevorzugt, dass die Konzentrationen innerhalb der folgenden
Bereiche liegen:
- 1) 0,1 bis 30, bevorzugter
0,5 bis 20 und meist bevorzugt 0,5 bis 10 nM von LE,
- 2) 0,01 bis 20, bevorzugter 0,1 bis 10 und meist bevorzugt 0,1
bis 5 nM von CE,
- 3) 0,1 bis 30, bevorzugter 0,5 bis 20 und meist bevorzugt 0,5
bis 10 nM von LP.
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Es
versteht sich, dass die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines
Target-Polynukleotids
unter Verwendung eines planaren Wellenleiters umfasst, worin das
Target-Polynukleotid
auf dem Wellenleiter immobilisiert wird mit Hilfe von zwei Klassen
von Bindungswechselwirkungen, wobei die erste Klasse der Bindungswechselwirkung
mit multiplen Capture-Extender-Proben vonstatten geht, und die zweite
Klasse von Bindungswechselwirkung zwischen zumindest einer der Capture-Extender-Proben
und zumindest einer der multiplen Capture-Proben, die gebunden sind
oder befähigt
sind, gebunden zu werden, und anschließend gebunden werden an die
Oberfläche
des optischen planaren Wellenleiters. Es versteht sich, dass die
multiplen Capture-Proben zueinander identisch sein können.
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Es
versteht sich, dass die erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung
eines vollautomatisierten Analysesystems, zum Beispiel des in Sensors
and Actuators (1997), Vol. B38-39, 88-95, beschriebenen durchgeführt werden
können.
Dieses System ist so ausgestaltet, dass Bioaffinitäts-Wechselwirkungen
in Real-Zeit untersucht werden. Die hohe Empfindlichkeit und Selektivität dieses
Systems, kurze Assay-Zyklen und die Notwendigkeit der Herstellung
einer lediglich kleineren Probe kann den Nachweis von Polynukleoti den
ohne die Notwendigkeit einer Target-Amplifizierung durch PCR oder
unter Verwendung von verzweigter DNA für die Signal-Amplifizierung
erlauben. Dies kann dramatisch die Quantifizierung von zum Beispiel
mRNA als Marker von infektiösen
Erkrankungen erleichtern und vereinfachen.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung
eines erfindungsgemäßen Verfahrens
für die
Untersuchung oder Diagnose einer Erkrankung oder anderen Reaktion
eines lebenden Organismus, die mit dem Target-Polynukleotid assoziiert
sind. Zum Beispiel kann ein Organismus auf eine Veränderung
seiner Umgebung, zum Beispiel einer Temperaturänderung, auf osmotischen Schock
oder die Konzentration von Schwermetallionen, durch temporale oder
räumliche
Veränderung
in der Gen-Expression reagieren. So können Hitze- oder Kälteschock
Veränderungen
in den Expressions-Levels von speziellen Genen verursachen. Es versteht
sich, dass die Expression von rekombinanten Genen gemessen werden
können, zum
Beispiel eines rekombinanten Gens, dessen Expression durch einen
Wärmeschock-Promotor
kontrolliert wird.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung richtet sich auf einen
optischen planaren Wellenleiter, worin an die Oberfläche der
Wellenleiterschicht des planaren Wellenleiters gebunden ist
- a) eine Vielzahl von Capture-Proben, wie vorstehend
unter 2c) definiert, oder eine Vielzahl von Capture-Extender-Proben
und eine Capture-Probe wie vorstehend unter 2d) definiert;
- b) ein Target-Polynukleotid, das gebunden ist an die Capture-Probe
oder die Capture-Extender-Probe;
und
- c) eine Vielzahl von Label-Proben, wie vorstehend unter 1a)
definiert, die an das Target-Polynukleotid
gebunden sind, oder eine Vielzahl von Label-Proben-Extendern wie
vorstehend unter 1b) definiert, die an das Target-Polynukleotid
gebunden sind, und eine Label-Probe
wie vorstehend unter 1b) definiert, die an den Label-Proben-Extender
gebunden ist.
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Vorzugsweise
ist die Capture-Probe ein Polynukleotid mit einer Länge von
10 bis 100 Nukleotiden. Bevorzugter ist die Capture-Probe kovalent
an die Oberfläche
des Wellenleiters, wie vorstehend und in Beispiel 1 beschrieben,
gebunden.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Kit von Teilen, umfassend
eine Capture-Probe,
Capture-Extender-Probe, Label-Extender-Probe und gegebenenfalls
Label, sämtlich
wie vorstehend definiert, zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren
im Hinblick auf ein spezielles Target-Polynukleotid.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines Wellenleiters
in einem Nukleinsäure-Sandwich-Assay
zum Nachweis eines Target-Polynukleotids.
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Ein
weiterer Aspekt richtet sich auf die Verwendung eines nicht-Label-amplifizierten
Sandwich-Assays in einem Wellenleiter-vermittelten Polynukleotid-Nachweis-Assay.
Unter "nicht-Label-amplifizierter
Sandwich-Assay" ist
ein Nukleinsäure-Sandwich-Assay
zu verstehen, worin nicht bDNA verwendet wird.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen Sandwich-Assay zum
Nachweis eines Target-Polynukleotids unter Verwendung eines optischen
planaren Wellenleiters.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Zusammensetzung umfassend
einen optischen planaren Wellenleiter, worin an die Oberfläche der
Wellenleiterschicht direkt oder indirekt eine Capture-Probe oder Capture-Extender-/Capture-Proben
gebunden sind, an die Capture- oder Capture-Extender-/Capture-Probe das
Target-Polynukleotid gebunden ist, an das Target eine Label-Extender-Probe
gebunden ist und wenn die Label-Extender-Probe eine Bindestelle
für ein
Label umfasst, das besagte Label, worin sämtliche Komponenten wie bei
den vorangehenden Aspekten der Erfindung definiert sind.
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Die
Erfindung wird nun eingehender unter Bezugnahme auf die folgenden
Figuren und Beispiele beschrieben.
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1 veranschaulicht
eine Möglichkeit
eines planaren Wellenleiter-Assays [als Multiple Oligonucleotide
Hybridisation Assay – (MOHA)
bezeichnet]. Der planare Wellenleiter umfasst einen transparenten
Träger 1 und
eine Wellenleiterschicht 2. Auf der Oberfläche der
Wellenleiterschicht ist eine Capture-Probe 3 mit der Nukleinsäuresequenz
D2 gebunden, woran über
eine Sequenz C2 eine Vielzahl von Capture-Extender-Proben 4 mit
einer Vielzahl von unterschiedlichen Nukleinsäuresequenzen C1 gebunden ist.
Das Target-Polynukleotid 5 ist
an die Sequenzen C1 gebunden. An das Target-Polynukleotid ist eine
Vielzahl von Label-Extender-Proben 6 gebunden, die Nukleinsäure-Sequenzen
L1 und L2 aufweisen. An diese Label-Extender-Proben sind über deren
Nukleinsäure-Sequenzen
L3 Label-Proben 7 mit Nukleinsäure-Sequenzen L3 gebunden.
Bei einem weiteren Beispiel kann die Vielzahl von Capture-Proben 3' direkt an das
Target mit einer Nukleinsäure-Sequenz D1 gebunden
sein. Bei einer anderen Variante kann eine Vielzahl von Label-Proben 6' direkt an das
Target über
Nukleinsäure-Sequenzen
gebunden sein, die zu den ausgewählten
Target-Sequenzen komplementär sind.
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Beispiel 1: Assay für Pseudocercosporella
herpotrichoides: Sequenz-spezifischer Nachweis des ITS-Bereichs
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Der
intern transkribierte Sparer (ITS)-Bereich von Pseudocercosporella
herpotrichoides, das kausale Mittel der Augenflecken-Erkrankung
bei Weizen, wurde sequenziert und als einziges Target-Gen in einem PCR-basierenden
Diagnostik-Projekt verwendet. Da die ITS-Sequenz bekannt ist, ist
die Entwicklung von Oligonukleotid-Proben relativ unkompliziert.
Zusätzlich
werden mit verschiedenen Infektionsgraden verfügbare Augenfleckeninfizierte
Weizenextrakte mit Hilfe des vorstehend genannten Diagnostik-Projekts
charakterisiert. Aus diesen Gründen
repräsentierte
der Augenflecken-ITS-Bereich ein gutes Target für ein Modell eines DNA-Assays
auf Basis eines planaren Wellenleiters. Tabelle 1 zeigt das Molekulargewicht
und die Anzahl der Basenpaare der genomen DNA, und das PCR-amplifizierte ITS-Fragment
von Pseudocercosporella herpotrichoides. Diese Targets sind sämtlich doppelsträngige DNAs,
die vor der Verwendung denaturiert werden müssen. Zur Optimierung der Assay-Bedingungen
wurde ein einsträngiges
ITS-Fragment durch asymmetrische PCR unter Verwendung eines 20-fachen Überschusses
eines Primers hergestellt, der die interessierende Sequenz amplifiziert.
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Tabelle
1: Doppelsträngige
Target-DNA-Moleküle
von verschiedener Größe aus Pseudocercosporella
herpotrichoides
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Die
einsträngige
ITS-Target-Sequenz wird nachstehend beschrieben. Es werden auch
die für
die 20 Label-Extender (LE) und 5 Capture-Extender (CE) ausgewählten Bereiche
angegeben.
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Die
verwendeten Label-Extender-Proben und Capture-Extender-Proben werden
in Tabelle 2 gezeigt. Sie waren so beschaffen, dass sie für den Rye-Pathotyp
von P. herpotrichoides spezifisch sind. Die tatsächlichen Proben- und Hybridisierungsbedingungen
können
es ermöglichen,
dass der Assay mit dem Weizen-Pathotyp von P. herpotrichoides (98%
Gen-Erhaltung in
dem ITS-Bereich) eine Kreuzreaktion eingeht.
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Tabelle
2: Label-Extender- und Capture-Extender-Proben
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Der
ITS-Bereich ist ein guter Gen-Bereich für das Target zur Assay-Entwicklung,
da dieser Bereich bei dem Spezies-Level hoch-divergent ist. Die
extensivere Sequenz-Divergenz in dem ITS-Bereich war die Basis für die Entwicklung
der PCR-Assays, die imstande sind, Pflanzenpathogene einschließlich Septoria,
Mycosphaerella, P. herpotrichoides und Verticillium nachzuweisen.
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Ähnliche
Proben-Sets können
im Hinblick auf jede bekannte ITS-Sequenz aus einem beliebigen Target-Pathogen
von Interesse entwickelt werden. Diese können die Weizen-Pathogene Septoria
nodorum, Septoria tritci, Septoria avenae f. sp. Triticea, Fusarium
spp. Microdochium nivale, Drechslera tritici-repentis und Rhizoctonia
cerealis einschließen.
Da die ITS-Bereiche bekannt sind, können die Assays auch im Hinblick
auf Mais-Pathogene
Cercospora zea-maydis, Puccinia sorghi, Kabatiella zeae, Helminthosporium
turcicum, Helminthosporium maydis und Helminthosporium carbonum
entwickelt werden.
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Die
Assay-Charakteristiken werden wie nachstehend gezeigt zusammengefasst.
Messvolumen:
10 μl
Target-Konzentration:
1,7 aM bis 17 fM (1,7 × 10–23 bis
1,7 × 10–19 Mol
je 10 μl)
Label-Extender:
jeweils 1 nM (1 × 10–14 Mol
je 10 μl
sämtlicher
20 Label-Extender)
Capture-Extender: jeweils 0,1 nM (1 × 10–15 Mol
je 10 μl
sämtlicher
5 Capture-Extender)
Assay-Verfahren: 10 min Äquilibrierung/Waschen
30
min Inkubation (gestoppter Fluss),
10 min Waschen,
5 min
Regeneration,
5 min Waschen
Nachweis: 5 min nach der Inkubationsstufe
während
der Waschstufe
Denaturierung: 95°C während 30 min
Proben-Rack:
1°C
Gittersignal
(Durchschnitt von 3 Messungen): Blindwert 4013 ± 57 cps, 1,7 aM 3982 ± 175 cps,
17 aM 4711 ± 365,
170 aM 5721 ± 237,
1,7 fM 11641 ± 163,
17 fM 23509 ± 1270
cps: LOD: 10 aM.
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Eine
universelle Capture-Probe (Chip-3'-TTATAGTACTCCAATGCC-5') wurde über das
3'-Ende an der Chip-Oberfläche auf
folgende Weise immobilisiert:
- a) Oberflächenfunktionalisierung:
Flüssigphasen-Silanisierung
der PWG-Chips erfolgt durch Behandlung mit 2% (Vol./Vol.) 3-Glycidyloxypropyltrimethoxysilan
und 0,2% (Vol./Vol.) N-Ethyldiisopropylamin in o-Xylol bei erhöhter Temperatur
(d.h. 50–90°C) während mehrerer
Stunden; die silanisierten PWG-Chips werden in CH3CN
gereinigt und in einen Exzikkator unter Vakuum getrocknet.
- b) Immobilisierung der Oligonukleotide: Die Oberflächen-gebundenen
Epoxy-Ringe reagieren über
Ringöffnung
mit endständigen
Amino- oder Thiol-Gruppen der modifizierten Oligonukleotide: 100 μl einer Lösung, die
10 nmol einer Thio- oder Amino-terminierten Capture-Probe enthält, wird
bei 35°C über Nacht
in 100 mM wässrigem
Carbonatpuffer, pH 8,7, inkubiert; Chips mit immobilisierten Capture-Proben
werden mit Wasser gespült,
getrocknet und bei –20°C bis zur
Verwendung in dem PWG-Setup aufbewahrt.
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Das
genome DNA-Target vom R-Pathotyp (10–105 genome Äquivalente)
wurde mit einer Lösung
von 5 Capture-Extenders (CEs, jeweils 0,1 nM) und 20 Cy5-gekennzeichneten
Label-Extendern (LEs 1–20,
jeweils 1 nM) in einem Hybridisierungspuffer, pH 7,0 (75 mM Natriumzitrat,
750 nM Natriumchlorid, 0,1% Tergitol NP-40) gemischt. 200 μl dieser
Mi schung wurden auf 95°C
30 min erhitzt und anschließend
in einem Proben-Rack 30 min bei 1°C
aufbewahrt. Die Hybridisierungs-Assays erfolgten in dem gleichen
Hybridisierungspuffer bei 53°C.
Die Probenmischung wurde (unter Verwendung einer Apparatur und Methode
mit gestopptem Fluss) 30 min während
des Hybridisierungs-Assays inkubiert. Die niedrigste nachgewiesene
Menge der Target-DNA betrug 100 genome Äquivalente (in einem Volumen
von 10 μl),
bestimmt als das Signal oberhalb von drei Standardabweichungen des
Signals, ermittelt für
die negative Kontrolle mit drei Wiederholungen.
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Beispiel 2: Pseudocercosporella
herpotrichoides-Assay-Spezifizität:
(Sequenzspezifischer Nachweis der genomen DNA)
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Der
Target-Bereich der genomen DNA ist ihr ITS-Bereich und die CE- und
LE-Proben werden in Beispiel 1 beschrieben.
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Die
Spezifizität
für den
Nachweis des interessierenden cerealen Pathogens (Pseudocersprolella
herpotrichoides #308, R-Pathotyp) wurde mit dem nicht-spezifischen
Signal verglichen, das von einem anderen cerealen Pathogen mit der
gleichen Konzentration erhalten wurde: Microdochium nivale #18222,
Fusarium graminearum R-8417, Septoria tritici #26517, Ceratobasidium
cereale (Rhizoctonia cerealis) #44234, Drechslera sorokiniana #11404,
Cercospora arachidicula #52476 und Septoria nodorum #24425. Bei
einem Target-Level von 104 genomen Äquivalenten
eines jedes cerealen Pathogens wurde ein Verhältnis von spezifischem zu nicht-spezifischem
Signal von 6,1 in dem Assay für
Pseudocersprolella herpotrichoides #308 R-Pathotyp beobachtet, wohingegen
ein Verhältnis
von spezifischem zu nicht-spezifischem Signal von 1,0 für sämtliche
anderen cerealen Pathogene beobachtet wurde.
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Die
Assay-Charakteristiken werden wie nachstehend gezeigt zusammengefasst:
Messvolumen:
10 μl
Target-Konzentration:
1,7 fM (1,7 × 10
–18 Mol
je 10 μl)
Label-Extender:
jeweils 1 nM (1 × 10
–14 Mol
je 10 μl
sämtlicher
20 Label-Extender)
Capture-Extender: jeweils 0,1 nM (1 × 10
–15 Mol
je 10 μl
sämtlicher
5 Capture-Extender)
Assay-Verfahren: 10 min Äquilibrierung/Waschen
30
min Inkubation (gestoppter Fluss),
10 min Waschen,
5 min
Regeneration,
5 min Waschen
Nachweis: 5 min nach der Inkubationsstufe
während
der Waschstufe
Denaturierung: 95°C während 30 min
Proben-Rack:
1°C
Gittersignal
(Durchschnitt von 3 Messungen):
Blindwert 1201 ± 97 cps;
Interessierendes
Pathogen:
| Pseudocersprolella
herpotrichoides #308, R-pathotyp | 7270 ± 200 cps; |
| Micradochium
nivale #18222 | 1136 ± 206 cps; |
| Fusarium
graminearum R-8417 | 1235 ± 84 cps; |
| Septoria
tritici #26517 | 1166 ± 106 cps; |
| Ceratobasidium
cereale (Rhizoctonia cerealis) #44234 | 1295 ± 308 cps; |
| Drechslera
sorokiniana #11404 | 1172 ± 192 cps; |
| Cercospora
arachidicula #52476 | 1091 ± 115 cps |
| Septoria
nodorum #24425 | 1020 ± 63 cps. |
