DE19811729A1

DE19811729A1 - Verfahren und Vorrichtung zum Nachweis einer Nukleotidsequenz

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Publication number: DE19811729A1
Application number: DE19811729A
Authority: DE
Inventors: Wolf Bertling
Original assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Current assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Priority date: 1998-03-18
Filing date: 1998-03-18
Publication date: 1999-09-23
Anticipated expiration: 2018-03-19
Also published as: JP2002506654A; DE19811729C2; WO1999047700A1; CA2323075A1; EP1064407A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer Nukleotidsequenz mittelts Fluoreszenz, wobei bei Vorliegen der nachzuweisenden Nukleotidsequenz N eine einen strahlungslosen oder direkten Energieübergang ermöglichende Wechselwirkung zwischen einem ersten F1 und einem zweiten Molekül F2 erzeugt oder beseitigt wird. Zur Vermeidung von Kontaminationen und zur Verbesserung der Sensitivität des Verfahrens wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, daß mindestens eines der Moleküle F1, F2 an die Oberfläche einer festen Phase M gebunden ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1. Sie betrifft außerdem eine Mikrotiterplatte und einem Kit zur Durchführung des Verfahrens.

Aus der US 4,996,143 ist ein Verfahren bekannt, bei dem ein erster und ein zweiter Primer in einem Abstand von 2 bis 7 Nukleotiden an die nachzuweisende Nukleotidsequenz gebunden werden. Der erste und der zweite Primer sind jeweils mit ei nem fluorophoren Molekül versehen. Im Bindungszustand kommt es infolge des Förster-Effekts zu einem strahlungslosen Ener gieübergang vom einem fluorophoren Molekül auf das andere. Das bewirkt eine spezifische Fluoreszenz. - Das bekannte Ver fahren ist nicht besonders sensitiv.

Aus der US 5,607,834 ist es bekannt, zum Nachweis einer Nu kleotidsequenz einen Primer mit einer Haarnadelschleife zu verwenden. Dabei sind an den Schleifenabschnitten der Haarna delschleife gegenüberliegend ein fluorophores Molekül und ein Quencher vorgesehen. Der Abstand zwischen dem fluorophoren Molekül und dem Quencher ermöglichen einen strahlungslosen die Fluoreszenz löschenden Energieübergang. Wenn der Primer allerdings mit einem komplementären Gegenstrang hybridisiert, wird die Haarnadelschleife geöffnet. Die eine Fluoreszenz lö schende räumliche Beziehung zwischen dem fluorophoren Molekül und dem Quencher wird geändert. Damit ist eine Fluoreszenz beobachtbar.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere ein einfach und kostengünstig durchführbares Verfahren mit ver besserter Sensitivität und geringerer Kontaminationswahr scheinlichkeit angegeben werden. Ferner soll auf möglichst effiziente Weise die Konzentration der nachzuweisenden Nu kleotidsequenz bestimmbar sein.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 19 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 18 und 20 bis 34.

Nach Maßgabe der Erfindung ist mindestens eines der fluoro phoren Moleküle an die Oberfläche einer festen Phase gebun den. Das Verfahren erlaubt eine qualitative und quantitative Bestimmung der nachzuweisenden Nukleotidsequenz. Durch die Bindung des mindestens einen fluorophoren Moleküls an eine feste Phase ist eine einfache Fluoreszenzmessung, insbesondere eine Online-Detektion, möglich. Das Verfahren ist einfach und kostengünstig durchführbar, weil auf Waschschritte, welche das Kontaminationsrisiko erhöhen, verzichtet werden kann.

Nach einer besonderen Ausgestaltung ist ein erster Primer an die feste Phase gebunden. Es kann sein, daß das erste fluoro phore Molekül über den ersten Primer an die feste Phase ge bunden ist. Dabei weist der erste Primer vorteilhafterweise eine Haarnadelschleife auf, und das erste fluorophore Molekül ist am einen Schleifenabschnitt und das zweite fluorophore Molekül gegenüberliegend am anderen Schleifenabschnitt in ei nem die Wechselwirkung ermöglichenden Abstand gebunden. Die Wechselwirkung wird zweckmäßigerweise durch Hybridisierung mit einem zum ersten Primer komplementären Gegenstrang oder durch eine am ersten Primer erfolgende Synthese beseitigt.

Durch die vorgenannte Verfahrensführung wird die Wahrschein lichkeit einer Kontamination weiter gesenkt.

Nach einer weiteren Verfahrensausgestaltung kann das zweite fluorophore Molekül auch an einen zweiten Primer gebunden sein. Es ist aber auch möglich mit dem zweiten fluorophoren Molekül versehene Nukleotide oder eine weitere Nukleinsäure sequenz in einen Synthesestrang einzubauen. Der zweite Primer befindet sich in Lösung. Vorteilhafterweise werden der erste und der zweite Primer nach Amplifizierung und Denaturierung so hybridisiert, daß die Wechselwirkung erzeugt wird. Im hy bridisierten Zustand beträgt der Abstand zwischen dem ersten und zweiten fluorophoren Molekül vorzugsweise 2 bis 12 Nu kleotide. Die vorgenannte Verfahrensvariante ist besonderen sensitiv.

Die feste Phase kann einen, vorzugsweise elektrisch leitfähi gen, Kunststoff, z. B. ein Polycarbonat, Polycarben, Trime thylthiopen und/oder Triaminobenzol und/oder Kohlefasern ent halten. Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, daß die feste Phase eine Mikrotiterplatte ist.

Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal ist das erste Mole kül eine Akzeptorgruppe und das zweite fluorophore Molekül eine Donorgruppe. Die Akzeptorgruppe kann ein 6-Carboxy- Tetramethyl-Rhodamin und die Donor-Gruppe ein 6-Carboxy- Fluorescein sein. Weitere geeignete Donor-/Akzeptor-Paare sind aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich:

Es ist selbstverständlich möglich, daß das erste und das zweite fluorophore Molekül gegeneinander ausgetauscht sind. Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal kann das erste oder zweite fluorophore Molekül durch einen, vorzugsweise aus 4- [4'-Dimethylaminophenylazo]benzolsäure gebildeten, Quencher ersetzt sein.

Geeignete Quencher/Fluorophor-Paare sind aus der folgenden Tabelle ersichtlich:

Zur Bestimmung der Konzentration der nachzuweisenden Nukleo tidsequenz kann die Fluoreszenz mittels eines mit einer Da tenverarbeitungseinrichtung verbundenen Fluorometers erfaßt werden, wobei aus der zeitlichen Änderung der Fluoreszenzin tensität die Konzentration der nachzuweisenden Nukleotidse quenz ermittelt wird. Als Referenzpunkt wird dabei vorzugs weise die zweite Ableitung der Fluoreszenzintensität über der Anzahl der durchgeführten Amplifikationszyklen verwendet.

Nach der vorrichtungsseitigen Lösung ist zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Mikrotiterplatte mit einer mehrere muldenförmige Vertiefungen aufweisenden Oberseite vorgesehen, an der das erste Molekül gebunden ist. An die Oberseite kann ein erster Primer gebunden sein, wobei das er ste Molekül vorteilhafterweise über den ersten Primer an die Oberfläche gebunden ist. Nach einem weiteren Ausgestaltungs merkmal weist der erste Primer eine Haarnadelschleife auf, und das erste Molekül ist an einem Schleifenabschnitt und das zweite Molekül gegenüberliegend an einem zweiten Schleifenab schnitt in einem die Wechselwirkung ermöglichenden Abstand gebunden.

Nach einer weiteren vorrichtungsseitigen Ausgestaltung ist ein Kit mit einer erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte sowie einem mit einer zweiten Molekül versehenen Primer vorgesehen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der Zeichnung nä her erläutert. Hierin zeigen

Fig. 1 die Paarung des Strangs und des Gegenstrangs einer Ziel-DNA mit einem ersten und einem zweiten Primer,

Fig. 2 die Hybridisierung der synthetisierten Primer,

Fig. 3 die Anregung der fluorophoren Moleküle,

Fig. 4 die Paarung des Strangs und des Gegenstrangs einer Ziel-DNA bei einer weiteren Verfahrensvariante und

Fig. 5 die Anregung der fluorophoren Moleküle gemäß der Verfahrensvariante in Fig. 4.

In Fig. 1 ist ein erster Primer P1 an die Oberseite innerhalb einer Kavität einer aus Polycarbonat oder Polypropylen herge stellten Mikrotiterplatte M gebunden. Die Mikrotiterplatte M kann eine geregelte Widerstandsheizung enthalten. Sie kann auch selbst ein Widerstandsheizelement sein. An den ersten Primer P1 ist ein erstes fluorophores Molekül F1 gebunden.

In die Kavitäten wird die in einer Ziel-DNA enthaltene nach zuweisende Nukleinsäuresequenz N und die weiteren zur Durch führung einer Polymerasekettenreaktion (PCR) oder Ligase- Ketten-Reaktion (LCR) notwendigen Komponenten pipettiert. Diese enthalten insbesondere einen zweiten Primer P2 mit ei nem daran gebundenen zweiten fluorophoren Molekül F2. Die Ziel-DNA wird durch Temperaturerhöhung denaturiert, d. h. in einen Strang S und einen Gegenstrang G getrennt.

Sodann wird die Temperatur auf 50 bis 60° zurückgenommen. Der Strang S bindet mit einem komplementären Sequenzabschnitt an den ersten Primer P1. Der Gegenstrang G bindet an den in der Flüssigkeit befindlichen zweiten Primer P2. Anschließend er folgt mittels einer Taq-DNA-Polymerase eine Synthese des je weils fehlenden Sequenzabschnitts. Dann wird die Temperatur auf 94°C erhöht, so daß die die fluorophoren Moleküle F1, F2 enthaltenden Synthesestränge als Einzelstränge, nämlich als Synthesestrang SS1 und als Synthesegegenstrang SG1, in der Flüssigkeit vorliegen. Statt über den zweiten Primer P2 kann das zweite fluorophore Molekül F2 auch gebunden an Nukleotide oder eine weitere Nukleinsäuresequenz in den Synthesestrang SS1 eingebaut werden. Die Temperatur wird auf 50 bis 60° zu rückgenommen. Der Synthesestrang SS1 und der Synthesege genstrang SG1 hybridisieren, so daß das erste F1 und das zweite fluorophore Molekül F2 in einem Abstand von 6 bis 12 Nukleotiden vorliegen. Fig. 2 zeigt das schematisch.

Bei Anregung des als Donor ausgebildeten ersten fluorophoren Moleküls F1 kommt es zu einem strahlungslosen Energieübergang auf das als Akzeptor wirkende zweite fluorophore Molekül F2. Dadurch wird am zweiten fluorophoren Molekül F2 eine ver stärkte Fluoreszenz beobachtet. Die Fluoreszenz wird mittels eines Fluorometers detektiert. Die detektierten Werte werden an ein Datenverarbeitungssystem weitergeleitet.

Der erste Primer P1 kann auch eine Haarnadelschleife aufwei sen, wobei an einem ersten Schleifenabschnitt das erste fluo rophore Molekül F1 und gegenüberliegend an einem Schleifenab schnitt ein Quencher in einem die Wechselwirkung ermöglichen den Abstand gebunden sind. Bei geschlossener Haarnadelschlei fe bewirkt die Wechselwirkung eine Löschung der Fluoreszenz. Durch Hybridisierung mit einem zum ersten Primer P1 komple mentären Gegenstrang G oder durch eine am ersten Primer P1 erfolgende Synthese wird die Haarnadelschleife geöffnet. Die Wechselwirkung zwischen dem fluorophoren Molekül und dem Quencher wird aufgehoben. Bei Anregung der fluorophoren Mole küle kommt es zur Fluoreszenz.

Sodann wird durch Temperaturerhöhung der nächste PCR-Zyklus eingeleitet. Dabei kommt es zu einer weiteren Vermehrung des Synthesestrangs SS1 und des Synthesegegenstrangs SG1 und in folge dessen zu einer Verstärkung der Fluoreszenzintensität.

Die Änderung der Fluoreszenzintensität über der Anzahl der PCR- oder LCR-Zyklen ist ein Maß für die Ausgangskonzentration der Ziel-DNA: Je mehr Ziel-DNA in einer Probe enthalten ist, desto schneller nimmt die Fluoreszenzintensität zu.

Zur Durchführung des vorgenannten Verfahrens wird eine aus Polycarbonat oder Polypropylen hergestellte Mikrotiterplatte M verwendet. An die Oberseite der Mikrotiterplatte M ist im Bereich der Näpfchen der erste Primer P1 mit seinem 5'-Ende über einen Linker, der vorzugsweise aus 6 CH₂-Gruppen be steht, an eine Polypropylen-Oberfläche gebunden. Die Bindung des ersten Primers P1 an die Polypropylen-Oberfläche erfolgt nach dem Verfahren von Weiler-J. und Hoheisel-JD. (Anal.- Biochem., 1996; 243 (2): 218-27).

In Fig. 4 ist eine weitere Verfahrensvariante gezeigt. Dabei ist das erste fluorophore Molekül F1 unmittelbar an die feste Phase, d. h. die Oberseite der Mikrotiterplatte M, gebunden. Der erste Primer P1 ist in der Nähe des ersten fluorophoren Moleküls F1 an die feste Phase gebunden. Nach einer Hybridi sierung der Synthesestränge SS1 bzw. der Synthesegegenstränge SG1 kommt es bei einer Anregung zum strahlungslosen Energie übergang vom ersten fluorophoren Molekül F1 (Donor) zum zwei ten fluorophoren Molekül F2 (Akzeptor) und dort zu einer Fluoreszenz (Fig. 5).

Bezugszeichenliste

S Strang
G Gegenstrang
P1 erster Primer
P2 zweiter Primer
F1 erstes fluorophores Molekül
F2 zweites fluorophores Molekül
SS1 Synthesestrang
SG1 Synthesegegenstrang
M Mikrotiterplatte
N Nukleotidsequenz

Claims

1. Verfahren zum Nachweis einer Nukleotidsequenz N mittels Fluoreszenz, wobei bei Vorliegen der nachzuweisenden Nu kleotidsequenz (N) eine einen strahlungslosen oder direk ten Energieübergang ermöglichende Wechselwirkung zwischen einem ersten (F1) und einem zweiten fluorophoren Molekül (F2) erzeugt oder beseitigt wird, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der fluorophoren Moleküle (F1, F2) an eine festen Phase (M) gebunden ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein erster Primer (P1) an die feste Phase (M) gebunden ist.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das erste fluorophore Molekül (F1) über den ersten Primer (P1) an die feste Phase (M) gebunden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der erste Primer (P1) eine Haarnadelschleife aufweist, und das erste fluoropho re Molekül (F1) am einen Schleifenabschnitt und das zwei te fluorophore Molekül (F2) gegenüberliegend am anderen Schleifenabschnitt in einem die Wechselwirkung ermögli chenden Abstand gebunden sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Wechselwirkung durch Hybridisierung mit einem zum ersten Primer (P1) komple mentären Gegenstrang (G) oder durch eine am ersten Primer (P1) erfolgende Synthese beseitigt wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das zweite fluorophore Molekül (F2) an einen zweiten Pri mer (P2) gebunden ist.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mit dem zweiten fluorophoren Molekül (F2) versehene Nu kleotide oder eine weitere Nukleinsäuresequenz in einen Synthesestrang (SS1) eingebaut werden.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der erste (P1) und der zweite Primer (P2) nach Amplifi zierung und Denaturierung so hybridisiert werden, daß die Wechselwirkung erzeugt wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei im hybridisierten Zustand der Abstand zwischen dem ersten (F1) und zweiten fluorophoren Molekül (F2) 2 bis 12 Nu kleotide beträgt.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die feste Phase (M) einen, vorzugsweise elektrisch leit fähigen, Kunststoff enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Kunststoff ein Po lycarbonat, Trimethylthiophen, Triaminobenzol und/oder ein Polycarben, und/oder Kohlefasern enthält.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die feste Phase eine Mikrotiterplatte (M) ist.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das erste (F1) oder zweite fluorophore Molekül (F2) durch einen, vorzugsweise aus 4-[4'-Dimethylaminophenylazo] benzoesäure gebildeten, Quencher ersetzt ist.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das erste fluorophore Molekül (F1) eine Donorgruppe und das zweite fluorophore Molekül (F2) eine korrespondieren de Akzeptorgruppe ist.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Akzeptorgruppe 6-Carboxy-Tetramethyl-Rhodamin, Tetra methylrhodamin, Fluorescein, DABCYL oder Bodipy F1 ist.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Donorgruppe 6-Carboxy-Fluorescein, Fluorescein, IADEANS, EDANS oder Bodipy F1 ist.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Fluoreszenz mittels eines mit einer Datenverarbei tungseinrichtung verbundenen Fluorometers erfaßt wird.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei aus der zeitlichen Änderung der Fluoreszenzintensität die Konzentration der nachzuweisenden Nukleotidsequenz (N) ermittelt wird.

19. Mikrotiterplatte zur Durchführung des Verfahrens nach ei nem der Ansprüche 1-18, mit einer mehrere muldenförmige Vertiefungen aufweisenden Oberseite an der das erste flu orophore Molekül (F1) gebunden ist.

20. Mikrotiterplatte nach Anspruch 19, wobei an die Oberseite ein erster Primer (P1) gebunden ist.

21. Mikrotiterplatte nach Anspruch 20, wobei das erste fluo rophore Molekül (F1) über den ersten Primer (P1) an die Oberseite gebunden ist.

22. Mikrotiterplatte nach Anspruch 21, wobei der erste Primer (P1) eine Haarnadelschleife aufweist, und das erste fluo rophore Molekül (F1) am einen Schleifenabschnitt und das zweite fluorophore Molekül (F2) gegenüberliegend am zwei ten Schleifenabschnitt in einem die Wechselwirkung ermög lichenden Abstand gebunden sind.

23. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wo bei das erste fluorophore Molekül (F1) eine Akzeptorgrup pe und das zweite fluorophore Molekül (F2) eine Donor gruppe ist.

24. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wo bei das erste fluorophore (F1) oder das zweite fluoropho re Molekül (F2) eine durch einen, vorzugsweise aus 4-[4'- Dimethylaminophenylazo]benzoesäure gebildeten, Quencher ersetzt ist.

25. Mikrotiterplatte nach Anspruch 23 oder 24, wobei die Ak zeptorgruppe 6-Carboxy-Tetramethyl-Rhodamin, Tetrame thylrhodamin, Fluorescein, DABCYL oder Bodipy F1 ist.

26. Mikrotiterplatte nach einem der Anspruch 25, wobei die Donorgruppe 6-Carboxy-Fluorescein, Fluorescein, IADEANS, EDANS oder Bodipy F1 ist.

27. Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 19 bis 26, wo bei die Mikrotiterplatte (M) einen, vorzugsweise elek trisch leitfähigen, Kunststoff enthält.

28. Mikrotiterplatte nach Anspruch 27, wobei der Kunststoff ein Polycarbonat, Trimethylthiophen, Triaminobenzol und/oder Polycarben und/oder Kohlefasern enthält.

29. Kit mit einer Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 19 bis 28 sowie einem mit einem zweiten fluorophoren Mo lekül (F2) versehenen zweiten Primer (P2).

30. Kit nach Anspruch 29, wobei das erste fluorophore Molekül (F1) eine Akzeptorgruppe und das zweite fluorophore Mole kül (F2) eine Donorgruppe ist.

31. Kit nach Anspruch 29, wobei das erste (F1) oder und das zweite fluorophore Molekül (F2) durch einen, vorzugsweise aus 4-[4'-Dimethylaminophenylazo]benzoesäure gebildeten, Quencher ersetzt ist.

32. Kit nach Anspruch 30 oder 31, wobei die Akzeptorgruppe 6- Carboxy-Tetramethyl-Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Fluorescein, DABCYL oder Bodipy F1 ist.

33. Kit nach Anspruch 32, wobei die Donorgruppe 6-Carboxy- Fluorescein, Fluorescein, IADEANS, EDANS oder Bodipy F1 ist.

34. Kit nach einem Ansprüche 29 bis 33 umfassend zur Verviel fältigung mittels PCR oder LCR erforderliche Desoxi- Nukleotid-Triphosphate, Pufferkomponenten und Enzyme.