DE10111420A1 - Bestimmung von Analyten durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie - Google Patents
Bestimmung von Analyten durch Fluoreszenz-KorrelationsspektroskopieInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie, wobei der Abstand zwischen dem Messvolumen in der Probe und der optischen Anregungs-/Detektionsrichtung >= 1 mm beträgt und die Probenflüssigkeit von der optischen Einrichtung thermisch isoliert ist. Das Verfahren eignet sich besonders zur Messung von temperaturveränderlichen Prozessen, z. B. der Bestimmung von Nukleinsäure-Hybridisierungsschmelzkurven oder zur Durchführung von Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen. Weiterhin wird eine zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Vorrichtung offenbart.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer
Probe durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie, wobei der Abstand
zwischen dem Messvolumen in der Probe und der optischen
Anregungs-/Detektionsrichtung ≧ 1 mm beträgt und die Probenflüssigkeit von der
optischen Einrichtung thermisch isoliert ist. Das Verfahren eignet sich
besonders zur Messung von temperaturveränderlichen Prozessen, z. B. der
Bestimmung von Nukleinsäure-Hybridisierungsschmelzkurven oder zur
Durchführung von Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen. Weiterhin wird
eine zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete
Vorrichtung offenbart.
Die Verwendung der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) zum
Nachweis von Analyten ist bekannt. EP-B-0 679 251 offenbart Verfahren
und Vorrichtungen zur Detektion von Analyten mittels Fluoreszenz-
Spektroskopie, wobei die Bestimmung in einem Messvolumen durchgeführt
wird, das Teil der zu untersuchenden Probe ist und wobei das
Messvolumen in einem Arbeitsabstand von ≦ 1000 µm von einer
optischen Fokussiervorrichtung angeordnet ist. Weiterhin steht die
Fokussiereinrichtung entweder direkt mit der Probe in Kontakt oder ist
lediglich durch eine optisch durchlässige Folie von der Probe getrennt.
Bisher wurde angenommen, dass der geringe Abstand und der unmittelbare
Kontakt zwischen Probe und optischer Vorrichtung ein notwendiges
Merkmal bei der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie darstellt. Diese
Anordnung hat jedoch den Nachteil, dass Prozesse, die mit einer
Temperaturänderung der Probe einhergehen, nur unter großen
Schwierigkeiten untersucht werden können.
Die der vorliegenden Anmeldung zugrunde liegende Aufgabe bestand darin,
Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung der Fluoreszenz-
Korrelationsspektroskopie bereitzustellen, die diese Nachteile des Standes
der Technik zumindest teilweise vermeiden.
Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Bestimmung eines
Analyten in einer Probe durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie,
umfassend die Schritte:
- a) Bereitstellen einer Probenflüssigkeit in einem Träger,
- b) Durchführen einer Lumineszenzmessung durch optische Anregung von lumineszierenden Molekülen in einem Messvolumen, das Teil der Probenflüssigkeit ist, unter Verwendung einer Lichtquelle mit Fokussieroptik und eines Detektors zum Auffangen von Emissionsstrahlung aus dem Messvolumen,
dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand zwischen dem Messvolumen in
der Probenflüssigkeit und der Fokussieroptik der Lichtquelle
≧ 1 mm beträgt und dass die Probenflüssigkeit von der Lichtquelle und
insbesondere von der Fokussieroptik thermisch isoliert ist.
Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin,
dass die Temperatur des Trägers und somit der Probe unabhängig von der
optischen Anregungs- bzw. Detektionsvorrichtung und insbesondere deren
Fokussieroptik, z. B. einem oder mehreren Mikroobjektiven, eingestellt und
verändert werden kann.
Ansonsten kann das Verfahren grundsätzlich nach der in EP-B-0 679 251
beschriebenen Methode durchgeführt werden. Dabei erfolgt vorzugsweise
die Messung von einem oder wenigen Analytmolekülen in einem
Messvolumen, wobei die Konzentration der zu bestimmenden
Analytmoleküle vorzugsweise ≦ 10-6 mol/l beträgt und das Messvolumen
vorzugsweise ≦ 10-14 l ist. Es werden stoffspezifische Parameter bestimmt,
die durch Lumineszenzmessung an den Analytmolekülen ermittelt werden.
Bei diesen Parametern kann es sich um Translationsdiffusions-
Koeffizienten, Rotationsdiffusions-Koeffizienten oder/und um die
Exzitationswellenlänge, die Emissionswellenlänge oder/und die Lebensdauer
eines angeregten Zustandes eines lumineszierenden Moleküls oder die
Kombination von einer oder mehrerer dieser Messgrößen handeln. Auf
Einzelheiten zu apparativen Details wird auf die Offenbarung von
EP 0 679 251 verwiesen.
Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht
darin, dass der Abstand zwischen dem Messvolumen in der
Probenflüssigkeit und der Fokussieroptik der Lichtquelle ≧ 1 mm,
vorzugsweise 1,5 bis 10 mm und besonders bevorzugt 2 bis 5 mm beträgt.
Weiterhin ist bevorzugt, dass zwischen dem die Probenflüssigkeit
enthaltenden Träger und der optischen Fokussiereinrichtung ein
Gasphasenbereich angeordnet ist, der Luft, Schutzgas oder Vakuum
enthalten kann.
Der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete
Träger ist vorzugsweise eine Mikrostruktur, die mehrere, vorzugweise
separate Behältnisse zur Aufnahme von Proben enthält. Das Volumen
dieser Behältnisse liegt vorzugsweise im Bereich von ≦ 10-6 l und
besonders bevorzugt ≦ 10-8 l. So kann der Träger eine Mikrowellstruktur
mit mehreren Vertiefungen zur Aufnahme von Probeflüssigkeit umfassen,
die beispielsweise einen Durchmesser zwischen 10 und 1000 µm
aufweisen. Geeignete Mikrostrukturen sind z. B. in DE 100 23 421.6 und
DE 100 65 632.3 beschrieben. Weiterhin umfasst der Träger vorzugsweise
mindestens ein Temperatur-Steuerungselement, z. B. ein Peltier-Element,
welches eine Temperaturregelung des Träger oder/und einzelner
Probenbehältnisse darin ermöglicht.
Weiterhin ist der für das Verfahren verwendete Träger zweckmäßigerweise
so ausgestaltet, dass er eine optische Detektion der Probe ermöglicht.
Vorzugsweise wird daher ein zumindest im Bereich der Probenbehältnisse
optisch transparenter Träger verwendet. Der Träger kann dabei entweder
vollständig optisch transparent sein oder eine optisch transparente Basis
und eine optisch undurchlässige Deckschicht mit Aussparungen in den
Probenbehältnissen enthalten. Geeignete Materialien für Träger sind
beispielsweise Verbundstoffträger aus Metall (z. B. Silizium für die
Deckschicht) und Glas (für die Basis). Derartige Träger können
beispielsweise durch Aufbringen einer Metallschicht mit vorgegebenen
Aussparungen für die Probenbehältnisse auf das Glas erzeugt werden.
Alternativ können Plastikträger, z. B. aus Polystyrol oder Polymeren auf
Acrylat- oder Methacrylatbasis eingesetzt werden. Weiterhin ist bevorzugt,
dass der Träger eine Abdeckung für die Probenbehältnisse aufweist, um
während der Messung ein geschlossenes und von der Umgebung im
Wesentlichen isoliertes System bereitzustellen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein Träger
verwendet, der ein Linsenelement enthält, das im Strahlengang zwischen
Messvolumen und Lichtquelle bzw. Detektor der optischen Vorrichtung
angeordnet ist. Beispielsweise kann das Linsenelement am Boden einer
Mikrowellstruktur angebracht sein. Ein derartiges Linsenelement lässt sich
beispielsweise durch Erhitzen und Formen eines Fotoresists unter
Verwendung einer Master-Form, z. B. aus Metall wie Silizium, erzeugen und
dann auf den Träger aufgebracht werden. Alternativ können - z. B. bei
Verwendung von Trägern aus Vollplastikstruktur - die Linsenelemente in
den Träger integriert, z. B. während der Herstellung durch Spritzgießen
erzeugt werden. Durch Verwendung eines Linsenelements, vorzugsweise
eines konvexen Linsenelements, kann die numerische Apertur der
optischen Messanordnung vergrößert werden. Diese numerische Apertur
liegt vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 1,2.
Der Träger ist weiterhin vorzugsweise mit einem transparenten
Antireflexionsüberzug beschichtet, um einen höheren Brechungsindex zu
erzeugen. Als Antireflexionsüberzüge können beispielsweise transparente
Oxide oder Nitride eingesetzt werden. Antireflexionsbeschichtungen
werden vorzugsweise auch auf der Optik verwendet.
Weiterhin können im Träger elektrische Felder, insbesondere im Bereich der
Probenbehältnisse erzeugt werden, um eine Konzentrierung der zu
bestimmenden Analyten im Messvolumen zu erreichen. Beispiele für
Elektroden, die zur Erzeugung solcher elektrischen Felder geeignet sind,
sind z. B. in DE 101 03 304.4 beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt aufgrund der thermischen
Entkopplung von Träger und Optik die Durchführung einer Bestimmung bei
einer von der Umgebung verschiedenen Temperatur und insbesondere eine
Veränderung der Temperatur während der Messung. Die räumliche
Entkopplung von Träger und Optik erlaubt ein vereinfachtes Scannen von
Trägern, insbesondere Mikrowellstrukturen mit mehreren separaten
Probenbehältnissen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist grundsätzlich zum Nachweis beliebiger
Analyten geeignet. Vorzugsweise werden eine oder mehrere Analyt-bindende
Substanzen der Probe zugegeben, die eine durch
Lumineszenzmessung nachweisbare Markierungsgruppe, insbesondere
Fluoreszenz-Markierungsgruppe tragen. Das erfindungsgemäße Verfahren
umfasst in diesem Fall vorzugsweise eine Bestimmung der Bindung der
Markierungssubstanz an den nachzuweisenden Analyten. Dieser Nachweis
kann beispielsweise durch Mobilitätsänderung der Markierungsgruppe auf
Grund der Bindung an den Analyten bzw. durch Änderung der Lumineszenz
der Markierungsgruppe (Intensität oder/und Abklingzeit) auf Grund der
Bindung an den Analyten bzw. bei Verwendung mehrerer
Markierungsgruppen - durch die sogenannte Kreuzkorrelation erfolgen. Bei
der Kreuzkorrelationsbestimmung werden mindestens zwei unterschiedliche
Markierungen, insbesondere Fluoreszenzmarkierungen, eingesetzt, deren
korreliertes Signal innerhalb des Messvolumens bestimmt wird. Diese
Kreuzkorrelationsbestimmung ist beispielsweise bei Schwille et al.
(Biophys. J. 72 (1997), 1878-1886) und Rigler et al. (J. Biotechnol. 63
(1998), 97-109) beschrieben.
Insbesondere eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis
von Biomolekülen, z. B. Nukleinsäuren, Proteinen oder anderen, in lebenden
Organismen, insbesondere in Säugern wie dem Menschen vorkommenden,
Analytmolekülen. Darüber hinaus können auch Analyten nachgewiesen
werden, die in vitro aus biologischen Proben erzeugt worden sind, z. B.
cDNA-Moleküle, die durch Reverse Transkription aus mRNA hergestellt
worden sind, oder Proteine, die durch in vitro Translation aus mRNA bzw.
aus DNA hergestellt worden sind. Weiterhin eignet sich das Verfahren zum
Nachweis von Analyten, die als Elemente einer Bibliothek vorliegen und
vorbestimmte Charakteristika, z. B. Bindung an das Nachweisreagenz,
zeigen sollen. Beispiele solcher Bibliotheken sind Phagenbibliotheken oder
ribosomale Bibliotheken.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Bestimmung
eine Nukleinsäurehybridisierung, wobei eine oder mehrere
lumineszenzmarkierte Sonden an eine Zielnukleinsäure als Analyten binden.
Derartige Hybridisierungsverfahren können beispielsweise zur Analyse der
Genexpression, z. B. zur Ermittlung eines Genexpressionsprofils, zur
Analyse von Mutationen, z. B. Einzelnukleotidpolymorphismen (SNP)
eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich jedoch
auch zur Bestimmung enzymatischer Reaktionen oder/und zur Bestimmung
von Nukleinsäureamplifikationen, insbesondere in einem Thermocycling-
Prozess. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäure-
Polymorphismen sind in DE 100 56 226.4 und DE 100 65 631.5
beschrieben. Dabei wird besonders bevorzugt eine Zwei- oder
Mehrfarben-Kreuzkorrelationsbestimmung durchgeführt.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die
Bestimmung den Nachweis einer Protein-Protein- oder Protein-Ligand-
Wechselwirkung, wobei als Proteinliganden z. B. niedermolekulare
Wirkstoffe, Peptide, Nukleinsäuren etc. eingesetzt werden können. Auch
für derartige Bestimmungen wird bevorzugt eine Zwei- oder
Mehrfarbenkorrelations-messung durchgeführt.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform können sogenannte
"Molecular Beacon" Sonden oder Primer eingesetzt werden, die - wenn sie
in freier Form vorliegen - ein hinsichtlich der Lumineszenzintensität
oder/und /Abklingzeit verschiedenes Messsignal als in gebundenem
Zustand ergeben.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zur Bestimmung
eines Analyten mittels Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS),
insbesondere zur Durchführung des Verfahrens, umfassend
- a) einen Träger mit mindestens einem Behältnis zur Aufnahme einer Probeflüssigkeit, die den zu bestimmenden Analyten enthält,
- b) eine optische Anregungseinrichtung umfassend eine Lichtquelle und eine Fokussieroptik zur Anregung von Lumineszenz in einem Messvolumen, das ein Teil der Probeflüssigkeit ist und
- c) eine optische Detektionseinrichtung zum Nachweis von Lumineszenz aus dem Messvolumen,
dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand zwischen der Fokussieroptik
und dem Messvolumen ≧ 1 mm ist und dass der Träger von der
Anregungseinrichtung thermisch isoliert ist.
Der Träger ist vorzugsweise eine Mikrostruktur mit mehreren, vorzugsweise
mindestens 102 Behältnissen zur Aufnahme einer Probeflüssigkeit, wobei
die Probeflüssigkeit in den separaten Behältnissen aus einer oder mehreren
Quellen stammen kann. Das Einbringen der Probeflüssigkeit in die
Behältnisse des Trägers kann z. B. mittels einer piezoelektrischen
Flüssigkeitsabgabe-Vorrichtung erfolgen.
Die Behältnisse des Trägers sind so ausgestaltet, dass sie eine Bindung des
Nachweisreagenz mit dem Analyten in Lösung ermöglichen. Vorzugsweise
handelt es sich bei den Behältnissen um Vertiefungen in der
Trägeroberfläche, wobei diese Vertiefungen grundsätzlich eine beliebige
Form aufweisen können, z. B. kreisförmig, quadratisch, rautenförmig etc.
Der Träger kann auch 103 oder mehr separate Behältnisse umfassen.
Die optische Anregungseinrichtung umfasst eine stark fokussierte
Lichtquelle, vorzugsweise einen Laserstrahl, der mittels entsprechender
optischer Einrichtungen auf das Messvolumen in der Probenflüssigkeit
fokussiert wird. Die Lichtquelle kann auch zwei oder mehrere Laserstrahlen
enthalten, die dann jeweils vor Eintritt in die Probeflüssigkeit durch
unterschiedliche Optiken auf das Messvolumen fokussiert wird. Die
Detektionseinrichtung kann beispielsweise einen fasergekoppelten
Avalanche-Fotodiodendetektor oder einen elektronischen Detektor
enthalten. Es können jedoch auch Anregungs- oder/und Detektions-
Matrices, bestehend aus einer Punktmatrix von Laserpunkten, erzeugt
durch eine Diffraktionsoptik oder einen Quanten-Well-Laser sowie einer
Detektormatrix, erzeugt durch eine Avalanche-Fotodiodenmatrix oder eine
elektronische Detektormatrix, z. B. eine CCD-Kamera, verwendet werden.
Der Träger kann in vorgefertigter Form bereit gestellt werden, wobei in
mehrere separate Behältnisse des Trägers lumineszenzmarkierte
Nachweisreagenzien, vorzugsweise lumineszenzmarkierte
Hybridisierungssonden bzw. -primer eingefüllt werden. Anschließend wird
der die Nachweisreagenzien enthaltende Träger günstigerweise getrocknet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein vorgefertigter
Träger bereitgestellt, der eine Vielzahl von separaten, z. B. 100 Behältnissen
enthält, in die jeweils unterschiedliche Nachweisreagenzien, z. B.
Reagenzien zum Nachweis einer Nukleinsäurehybridisierung wie Primer
oder/und Sonden eingefüllt vorliegen. Dieser Träger kann dann mit einer
aus einem zu untersuchenden Organismus, z. B. einem menschlichen
Patienten, stammenden Probe gefüllt werden, so dass in den jeweiligen
Behältnissen unterschiedliche Analyten aus einer einzigen Probe bestimmt
werden. Derartige Träger können beispielsweise zur Erstellung eines
Genexpressionsprofils, z. B. für die Diagnostik von Krankheiten, oder zur
Bestimmung von Nukleinsäurepolymorphismen, z. B. zum Nachweis einer
bestimmten genetischen Prädisposition, verwendet werden.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur
Bestimmung von Nukleinsäurepolymorphismen. Dieses Verfahren wird
vorzugsweise in Kombination mit dem zuvor genannten Fluoreszenz-
Korrelationssprektroskopie-Verfahren verwendet, es kann jedoch auch auf
andere Arten des Einzelmolekülnachweises oder auf konventionelle
Nachweisverfahren angewendet werden.
Dieses Verfahren umfasst die Schritte:
- a) Bereitstellen einer zu untersuchenden Nukleinsäurematrize und zwei
an die Matrize unter Hybridisierungsbedingungen bindenden Sonden,
wobei die Sonden so gewählt werden, dass
- a) sie unmittelbar nebeneinander an die Matrize binden, so dass das 3'-Ende der ersten Sonde direkt dem 5'-Ende der zweiten Sonde benachbart ist,
- b) für das 3'-Ende der ersten Sonde oder/und das 5'-Ende der zweiten Sonde solche Positionen gewählt werden, an denen das Auftreten eines Polymorphismus auf der Matrize zu erwarten ist,
- c) die Nukleotide am 3'-Ende der ersten Sonde oder/und am 5'-Ende der zweiten Sonde komplementär zu den jeweiligen Positionen auf der Matrize sind, wenn diese eine erste vorbestimmte Variante des Polymorphismus aufweist und nicht komplementär zu den jeweiligen Positionen auf der Matrize sind, wenn diese eine andere Variante des Polymorphismus aufweist,
- b) Hybridisieren der Sonden an die Matrize,
- c) Behandeln des Hybridisierungskomplexes, umfassend die Matrize und die daran gebundenen ersten und zweiten Sonden mit einer Ligase unter Bedingungen, dass eine Ligation der ersten und zweiten Sonden selektiv nur dann erfolgt, wenn das Nukleotid am 3'-Ende der ersten Sonde und das Nukleotid am 5'-Ende der zweiten Sonde komplementär zu den jeweiligen Positionen der Matrize sind, und
- d) Nachweisen, ob eine Ligation zwischen den ersten und zweiten Sonden stattgefunden hat, um die auf der Matrize vorliegende Variante des Polymorphismus zu bestimmen.
Bei dem Nukleinsäurepolymorphismus handelt es sich im einfachsten Fall
um einen Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP). Der Polymorphismus kann
aber auch zwei oder mehrere Nukleotide betreffen.
Als Nukleinsäurematrize kann DNA beliebiger Herkunft, beispielsweise aus
natürlichen Quellen, aber auch rekombinant hergestellte DNA oder
synthetische DNA verwendet werden. Vorzugsweise stammt die DNA aus
einem Organismus, bei dem Nukleinsäurepolymorphismen vorkommen, die
durch das Verfahren bestimmt werden sollen. Die DNA wird bevorzugt in
einzelstränger Form verwendet, z. B. als einzelsträngige cDNA. Es ist jedoch
auch möglich, doppelsträngige DNA einzusetzen, die durch Erhitzen in
einzelsträngige DNA aufgetrennt und dann zur Hybridisierung mit den
Sonden eingesetzt wird.
Die Hybridisierungssonden bestehen bevorzugt zumindest teilweise aus
einzelsträngiger DNA. Auf jeden Fall muss das 3'-Ende der ersten Sonde an
das 5'-Ende der zweiten Sonde ligierbar sein, vorzugsweise unter
Verwendung einer DNA-Ligase. Die Sonden können jedoch auch teilweise
aus Nukleinsäureanaloga, z. B. Peptidnukleinsäuren, ausgebildet sein.
Vorzugsweise enthält die erste Sonde eine freie 3'-OH Gruppe am 3'-Ende
und die zweite Sonde eine 5'-Phosphatgruppe am 5'-Ende.
Vorzugsweise tragen die erste und die zweite Sonde jeweils eine
unterschiedliche Markierungsgruppe, deren gemeinsames Auftreten durch
eine Kreuzkorrelationsbestimmung nachweisbar ist. Dies heißt, dass das
Vorhandensein beider unterschiedlicher Markierungsgruppen in einem
einzigen Molekül (Ligationsprodukt) getrennt vom Vorhandensein in zwei
separaten Molekülen (erste und zweite Sonde) nachweisbar ist. Die
Größenunterschiede zwischen Ligationsprodukt und einzelnen Sonden
resultieren in stark unterschiedlichen Hybridisierungs-Schmelzpunkten und
somit in einer hohen Empfindlichkeit des Verfahrens. Wenn man
beispielsweise eine Schmelzpunktkurvenmessung der Hybride durchführt,
verschwindet bei den Einzelsonden die Kreuzkorrelation schon oberhalb des
niedrigsten Schmelzpunkts einer Einzelsonde, während das
Ligationsprodukt noch bis zu wesentlich höheren Temperaturen (bis zu
seinem Schmelzpunkt, der vorzugsweise ≧ 10°C höher ist) ein
kreuzkorreliertes Signal ergibt.
Vorzugweise werden als Markierungsgruppen Fluoreszenzmarkierungen
verwendet, wie etwa Fluorescein, Rhodamin, Phycoerythrin, CY3, CY5
oder Derivate davon. Die Unterscheidung der
Fluoreszenzmarkierungsgruppen kann über die Emissionswellenlänge, über
die Lebensdauer der angeregten Zustände oder über eine Kombination
davon erfolgen.
Wie bereits ausgeführt, kann der Nachweis vorzugsweise mittels
Einzelmolekülbestimmung, z. B. mit orts- oder/und zeitaufgelöster
Fluoreszenz-Spektroskopie erfolgen, die in der Lage ist, in einem sehr
kleinen Volumenelement, wie etwa in einem Mikrokanal oder in einem
Mikrowell, Fluoreszenzsignale bis hinunter zur Einzelphotonenzählung zu
erfassen.
Beispielsweise kann die Detektion mittels konfokaler
Einzelmoleküldetektion, wie etwa durch Fluoreszenz-
Korrelationsspektroskopie, erfolgen. Alternativ kann die Detektion auch
durch eine zeitaufgelöste Abklingmessung, ein sogenanntes Time-Gating
erfolgen, wobei die Anregung der Fluoreszenzmoleküle innerhalb eines
Messvolumens und anschließend vorzugsweise in einem zeitlichen Abstand
von ≧ 100 ps das Öffnen eines Detektionsintervalls am Photodetektor
erfolgt. Diese Messmethode ist beispielsweise von Rigler et al. in:
"Ultrafast Phenomena" D. H. Auston, Hrsg. Springer 1984, beschrieben.
Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch die nachfolgenden Figuren
erläutert werden. Es zeigen:
Fig. 1A die schematische Darstellung eines zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten Trägers (2) mit einer Vielzahl
von in Form von Vertiefungen auf dem Träger ausgebildeten Behältnissen
(4) zur Aufnahme von Probenflüssigkeit. Ein Träger mit einer Fläche von
1-2 cm2 kann beispielsweise bis zu 104 Vertiefungen enthalten.
Für den Nachweis eines Analyten in einem Behältnis (4) kann eine
vorzugsweise unter der Trägerbasis angeordnete Anregungs- und
Detektionsvorrichtung eingesetzt werden. Diese Vorrichtung kann eine
Lichtquelle (6), z. B. einen Laser enthalten, mit der über eine optische
Fokussiereinrichtung (8) Licht in ein Messvolumen (10) innerhalb der
Probenflüssigkeit eingestrahlt werden kann. Die vom Messvolumen
emittierte Lumineszenzstrahlung wird über die optische
Fokussiereinrichtung (8; 8a) zu einem Detektor (12) geleitet. Das
Messvolumen (10) ist in einem Arbeitsabstand (14) von ≧ 1 mm und
vorzugsweise < 1 mm von der Fokussiereinrichtung (8) angeordnet.
Weiterhin ist der Träger (2) von der optischen Anregungs- und
Detektionsvorrichtung thermisch isoliert, z. B. dadurch, dass zwischen der
optischen Fokussiereinrichtung (8) und dem Träger (2) ein
Gasphasenbereich angeordnet ist.
Fig. 1B die schematische Darstellung einer besonders bevorzugten
Ausführungsform für einen zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens geeigneten Träger (20). Auch der Träger (20) besitzt eine
Vielzahl von separaten Behältnissen (22) zur Aufnahme einer
Probenflüssigkeit. Zusätzlich ist im Strahlengang zwischen der optischen
Anregungs- und Detektionsvorrichtung (nicht gezeigt) und dem in der
Probenflüssigkeit enthaltenen Messvolumen (nicht gezeigt) ein
vorzugsweise konvexes Linsenelement (24) angeordnet. Dieses
Linsenelement weist günstigerweise einen anti-reflektierenden Überzug (26)
auf.
Fig. 2 die schematische Darstellung eines besonders bevorzugten, für die
Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten Trägers (30)
mit einer Vielzahl von separaten Behältnissen (32) zur Aufnahme von
Probenflüssigkeiten. Der Träger enthält weiterhin ein Temperatur
steuerungselement (34), z. B. ein Peltier-Element. Das Temperatur
steuerungselement ist vorzugsweise zumindest teilweise um den
Trägerumfang herum angeordnet. Um eine temperaturveränderliche
Bestimmung zu ermöglichen, sind die Behältnisse (32) von der Umgebung
mit einer Abdeckung (36) versehen, die die Probenflüssigkeit im
Wesentlichen von der Umgebung isoliert. Hierzu können beispielsweise
Dichtungen (nicht gezeigt) eingesetzt werden.
Fig. 3 eine Draufsicht auf den in Fig. 2 dargestellten Träger (30) mit
dem Temperatursteuerungselement (34). Diese Anordnung kann
gegebenenfalls unter Verwendung zusätzlicher Heiz- oder Kühlelemente
(nicht gezeigt) auf einem Rahmenhalter (36) angebracht werden.
Fig. 4 das Einfüllen der Probe in einen Träger (40) mit separaten
Behältnissen (42a; 42b) über Zugänge (44a, 44b). Die Behältnisse (42a)
und (42b) sind durch eine Barriere (46) getrennt. Die Barriere kann als
permanente Barriere oder als Ventil, z. B. ein durch Druckbeaufschlagung
permeables hydrophobes Membranventil, ausgebildet sein. Die
Probenflüssigkeit kann gleichzeitig in mehrere Behältnisse oder - nach
Füllen des ersten Behältnisses - über ein Ventil (46) in das zweite Behältnis
eingefüllt werden.
Fig. 5 eine besonders bevorzugte Ausführungsform für das Einfüllen von
Probenflüssigkeit in den Träger. Die Probenflüssigkeit wird aus einem,
gegebenenfalls auf dem Träger selbst integrierten, Reservoir (50) über
Zuleitungen (52) jeweils parallel in Probenbehältnisse (54) geleitet.
Gegebenenfalls kann die Probenflüssigkeit aus dem Behältnis (54) über ein
Ventil (56) in ein weiteres Behältnis (58) geleitet werden, d. h. die parallele
Befüllung kann mit einer seriellen Befüllung kombiniert werden.
Claims (22)
1. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe durch
Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie, umfassend die Schritte:
- a) Bereitstellen einer Probenflüssigkeit in einem Träger,
- b) Durchführen einer Lumineszenzmessung durch optische Anregung von lumineszierenden Molekülen in einem Messvolumen, das Teil der Probenflüssigkeit ist, unter Verwendung einer Lichtquelle mit Fokussieroptik und eines Detektors zum Auffangen von Emissionsstrahlung aus dem Messvolumen,
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Abstand 1 bis 10 mm, vorzugsweise 2 bis 5 mm beträgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass zwischen dem Träger und der Fokussieroptik ein
Gasphasenbereich angeordnet ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Träger ein Linsenelement enthält, das im Strahlengang
zwischen Messvolumen und Lichtquelle bzw. Detektor angeordnet
ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass die optische Messanordnung eine numerische Apertur von 0,5
bis 1,2 aufweist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Träger mehrere, vorzugsweise mindestens 102 separate
Behältnisse zur Aufnahme von Proben enthält.
7. Verfahren nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Träger eine Mikrowellstruktur mit mehreren Vertiefungen
umfasst, die vorzugsweise einen Durchmesser zwischen 10 und
1000 µm aufweisen.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Träger mindestens ein Temperatursteuerungselement
umfasst.
9. Verfahren nach Anspruch 8,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Bestimmung zumindest teilweise bei einer von der
Umgebung verschiedenen Temperatur durchgeführt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Temperatur während der Messung verändert wird.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Bestimmung die Bindung von mindestens einem
lumineszenzmarkierten Nachweisreagenz an den Analyten umfasst.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Bestimmung eine Nukleinsäure-Hybridisierung umfasst,
wobei eine oder mehrere lumineszenzmarkierte Sonden an eine
Zielnukleinsäure binden.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Bestimmung die Messung eines kreuzkorrelierten Signals
umfasst, das von einem, mindestens 2 unterschiedliche
Lumineszenzmarkierungen enthaltenden, Komplex aus Analyt und
Nachweisreagenz(ien) stammt.
14. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Bestimmung die Messung eines von einem
lumineszenzmarkierten Nachweisreagenz stammenden Signals
umfasst, wobei die Lumineszenzintensität oder/und -abklingzeit des
Nachweisreagenz bei Bindung an den Analyten verschieden als im
nichtgebundenen Zustand ist.
15. Verfahren nach Anspruch 14,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Unterschiede der Lumineszenzintensität oder/und
-abklingzeit durch Quench- oder Energietransfervorgänge
hervorgerufen werden.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Bestimmung eine enzymatische Reaktion umfasst.
17. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 16,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Bestimmung eine Nukleinsäure-Amplifikation, insbesondere
einen Thermocycling-Prozess umfasst.
18. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 17,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Bestimmung eine Mutationsanalyse bei Nukleinsäuren
umfasst.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 18,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Bestimmung eine Genexpressionsanalyse bei Nukleinsäuren
umfasst.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 19,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Bestimmung die Messung einer temperaturabhängigen
Schmelzkurve bei einer Nukleinsäure-Hybridisierung umfasst.
21. Vorrichtung zur Bestimmung eines Analyten mittels Fluoreszenz-
Korrelationsspektroskopie (FCS), insbesondere zur Durchführung des
Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 20, umfassend
- a) einen Träger mit mindestens einem Behältnis zur Aufnahme einer Probenflüssigkeit, die den zu bestimmenden Analyten enthält,
- b) eine optische Anregungseinrichtung umfassend eine Lichtquelle und eine Fokussieroptik zur Anregung von Lumineszenz in einem Messvolumen, das ein Teil der Probeflüssigkeit ist und
- c) eine optische Detektionseinrichtung zum Nachweis von Lumineszenz aus dem Messvolumen,
22. Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäurepolymorphismen,
umfassend die Schritte:
- a) Bereitstellen einer zu untersuchenden Nukleinsäurematrize und
zwei an die Matrize unter Hybridisierungsbedingungen
bindenden Sonden, wobei die Sonden so gewählt werden,
dass
- a) sie unmittelbar nebeneinander an die Matrize binden, so dass das 3'-Ende der ersten Sonde direkt dem 5'-Ende der zweiten Sonde benachbart ist,
- b) für das 3'-Ende der ersten Sonde oder/und das 5'-Ende der zweiten Sonde solche Positionen gewählt werden, an denen das Auftreten eines Polymorphismus auf der Matrize zu erwarten ist,
- c) die Nukleotide am 3'-Ende der ersten Sonde oder/und am 5'-Ende der zweiten Sonde komplementär zu den jeweiligen Positionen auf der Matrize sind, wenn diese eine erste vorbestimmte Variante des Polymorphismus aufweist und nicht komplementär zu den jeweiligen Positionen auf der Matrize sind, wenn diese eine andere Variante des Polymorphismus aufweist,
- b) Hybridisieren der Sonden an die Matrize,
- c) Behandeln des Hybridisierungskomplexes umfassend die Matrize und die daran gebundenen ersten und zweiten Sonden mit einer Ligase unter Bedingungen, dass eine Ligation der ersten und zweiten Sonden selektiv nur dann erfolgt, wenn das Nukleotid am 3'-Ende der ersten Sonde und das Nukleotid am 5'-Ende der zweiten Sonde komplementär zu den jeweiligen Positionen der Matrize sind, und
- d) Nachweisen, ob eine Ligation zwischen den ersten und zweiten Sonden stattgefunden hat, um die auf der Matrize vorliegende Variante des Polymorphismus zu bestimmen.
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