JP2004527742A - 蛍光−相関分光法による分析物の測定 - Google Patents
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Abstract
本発明は、蛍光−相関分光法によるプローブ中の分析物の測定法に関し、この際、プローブ液中の測定容量物と光学的励起−／検出装置との間の間隔は、≧１ｍｍであり、プローブ液は光学的装置と熱的に隔離している。この方法は、特に、温度可変性経過の測定に、例えば核酸−ハイブリダイゼーション溶融曲線の測定に、又は核酸−増幅反応の実施に好適である。更に、本発明による方法の実施に好適な装置が明らかにされる。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光−相関分光法によるプローブ中の分析物の測定法に関し、この際、プローブ中の測定容量物と光学的励起−／検出装置との間の間隔は、≧１ｍｍであり、プローブ液は光学的装置と熱的に隔離している。この方法は、特に、温度可変性経過の測定に、例えば核酸−ハイブリダイゼーション溶融曲線の測定に、又は核酸−増幅反応の実施に好適である。更に、本発明による方法の実施に好適な装置が明らかにされる。
【０００２】
分析物の検出のための蛍光−相関分光法（FCS）の使用は公知である。EP−B−０６７９２５１は、蛍光−分光法による分析物の検出法及び装置を開示していて、この際、検査すべきプローブの一部である測定容量物中の測定が実施され、又この際、測定容量物は光学的焦点装置から≦１０００μｍの操作間隔で配置されている。更に、焦点装置はプローブと直接接触しているか、又は透視シートによってだけプローブと分離している。従来は、プローブと光学的装置との間で僅かな距離及び直接接触が、蛍光−相関分光法では不可欠な特徴であるとされてきた。しかし、この配置は、プローブの温度変化と共に進行する過程が大きな困難の下でしか試みられ得ないという欠点を有する。
【０００３】
DE−A−３６４２７９８は、標本台上に可動的に設置されている架台を有する顕微鏡を開示していて、この際、標本台の垂直移動のための駆動装置が誘導装置から離れた独立した標本台支柱を形成している。顕微鏡の温度は、冷却気の供給によって、かつ断熱フィルターの使用によって調節され得る。蛍光−相関分光法における使用についての言及はない。
【０００４】
GB−A−２３５１５５６は、放射測定法を記載していて、この際、相応する範囲から同時に放射測定することができるように、並行配置されている数個の読取ヘッドを形成するための共焦光学的単チャンネル系及び光電検出器が平行配置されている。焦点光学器として、開口数０．４、焦点距離８ｍｍ及び口径５ｍｍの１０個の（１０ｘ）顕微鏡−対物レンズを使用することができる。焦点光学器がプローブと熱的に隔離され得ることについての言及はない。
【０００５】
DE−C−４２１８７２９は、光学的位置解放検出器を有する毛細管電気泳動装置を開示している。毛細管内の温度は恒温維持され得る。共焦蛍光−分光法についての言及はない。
【０００６】
DE−A−１９７４８２１１は、蛍光−相関分光法に使用することができるレンズ配列（Linsenarray）を有する光学系を記載している。プローブ中の共焦容量要素の生成のために、焦点距離ｆ＝７．５及び開口数０．６を有するレンズを使用する。プローブからの焦点光学器の熱的隔離は言及されていない。
【０００７】
DE−A−１９９１９０９２は、蛍光分析に使用することができる対象物配列（Gegenstandarray）の光学的評価のための装置を記載している。ここでも、焦点光学器とプローブとの熱的隔離についての言及はない。
【０００８】
本発明の基礎にある課題は、これらの公知技術水準の欠点を少なくとも部分的に回避する蛍光−相関分光法の実施のための方法と装置を用意することにある。
【０００９】
従って、本発明の課題は、次の過程：
（a）担体中のプローブ液の準備、
（b）焦点光学器を有する光源及び測定容量物からの放射線を受けるための検出器の使用下に、プローブ液の一部である測定容量物中の発光分子の光学的励起によるルミネセンス測定の実施
を包含する、蛍光−相関分光法によるプローブ中の分析物の測定法であり、この方法は、プローブ液中の測定容量物と光源の焦点装置との間の間隔は≧１ｍｍであり、プローブ液は光源及び特に焦点光学器と熱的に隔離されていることを特徴とする。
【００１０】
本発明による方法のもう１つの利点は、担体、従ってプローブの温度を、光学的励起−又は検出装置及び特にその焦点光学器、例えば、１又は数種の微細対物レンズに関係なく調整し、変えることができることにある。
【００１１】
この方法は、その他については原則的に、EP−B−０６７９２５１に記載された方法により実施することができる。その際、測定容量物中の１又はもっと少ない分析分子の測定を行うことが有利であり、この際、測定すべき分析分子の濃度は、≦１０−１４であることが有利である。分析分子のルミネセンス測定によって調べられる物質特異性パラメーターが測定される。このパラメーターとは、併進拡散−係数、回転拡散−係数及び／又は発光分子の励起状態の励起波長、放射波長及び／又は寿命、及び／又はこれらの測定数量の組合せである。装置的詳細については、EP０６７９２５１の開示が参照される。
【００１２】
本発明による方法の１つの重要な特徴は、プローブ液中の測定容量物と光源の焦点光学器との間の間隔が、≧１ｍｍ、有利に１．５〜１０ｍｍ、特に有利に２〜５ｍｍであることにある。更に、プローブ液を含有する担体と光学的焦点装置との間に、空気、保護ガスを含有し得る、又は真空であってよい気相領域が設置されていることが有利である。
【００１３】
本発明による方法の実施に使用される担体は、有利に、プローブ収容のための有利に別々の数個の容器を包含する微細構造である。この容器の容量は、有利に≦１０−６ｌ、特に有利に１０−８ｌの範囲にある。すなわち、担体は、例えば、プローブ液収容のための１０〜１０００μｍの直径を有する数個の窪みを有する微細波形構造を包含することができる。好適な微細構造は、例えば、DE１００２３４２１．６及びDE１００６５６３２．３に記載されている。更に、担体は、担体又は／及び個々のプローブ容器の温度調節をその中で可能にする少なくとも１種の温度−調節要素、例えば、ペルティエ（Peltier）−要素を含有することが有利である。
【００１４】
更に、この方法に使用される担体は、それがプローブの光学的検出を可能にするように形成されていることが有利である。従って、少なくともプローブ容器の範囲で、光学的に透明な担体が使用されることが有利である。この際、担体は、完全に光学的に透明であるか、又はプローブ液中に光学的に透明なベース及び光学的に不透明な刻み目付きの被覆層を含有することができる。好適な担体材料は、例えば、金属（例えば、被覆層用の珪素）及びガラス（ベース用）から成る複合物質の担体である。この種類の担体は、例えば、ガラス上にプローブ液用の刻み目を前以て付けた金属層を載せることによって形成することができる。選択的に、例えば、ポリスチロール又はアクリレート−又はメタクリレートを基礎とするポリマーから成るプラスチック担体を使用することができる。更に、担体は、測定中に実際に周囲とは隔離された密閉系を得るために、プローブ液用の蓋を有することが有利である。
【００１５】
特に有利な１実施態様では、放射進路中に測定容量物及び光学的装置の光源又は検出器の間に配置されているレンズ要素を含有する担体が使用される。例えば、レンズ要素は、微細波形構造の床部に設置されていてよい。この種類のレンズ要素は、例えば、加熱及び、例えば、金属、例えば、珪素から成るマスター−型の使用下に耐光物質の形成によって成形され、次いで担体上に載せられ得る。選択的に、例えば、完全プラスチック構造から成る担体の場合には、レンズ要素は担体に組み込まれ、例えば、製造の間に射出成形によって形成され得る。レンズ要素、有利に凸面レンズ要素の使用によって、光学的測定装置の開口数は拡大され得る。この開口数は、０．５〜１．２の範囲にあることが有利である。
【００１６】
更に、担体は、より高い屈折率を生じさせるために、透明な抗反射被覆で被覆されていることが有利である。抗反射被覆として、例えば、透明な酸化物又は窒化物を使用することができる。抗反射被覆は、光学器上に使用することも有利である。
【００１７】
更に、測定容量物中の測定すべき分析物の濃縮を達成するために、担体中に電場を、特にプローブ容器の範囲に発生させることができる。そのような電場の発生に好適である電極の例は、例えば、DE１０１０３３０４．４に記載されている。
【００１８】
本発明による方法は、担体及び光学器の熱的アンカップリングに基づき、環境によって異なる温度での測定の実施、及び特に測定の間での温度変化を可能にする。担体及び光学器の空間的アンカップリングは、担体、特に数個の別々の容器を有する微細波形構造の簡素化走査を可能にする。
【００１９】
本発明による方法は、原則的に、任意の分析物の検出に好適である。ルミネセンス測定によって検出可能な標識化基、特に蛍光標識化基を有する１又は数種の分析物結合物質をプローブに添加することが有利である。この場合には、本発明による方法は、有利に、検出すべき分析物への標識化基の結合の測定を包含する。この検出は、例えば、分析物への結合に基づく、標識化基の可動性変化によって、又は分析物への結合に基づく、標識化基のルミネセンスの変化によって（強度又は／及び消光時間）、又は数種の標識化基を使用する場合には、いわゆる交差相関によって行うことができる。交差相関測定の場合には、少なくとも２種の異なる標識化物、特に蛍光標識化物が使用され、その相関信号は、測定容量物中で測定される。この交差相関測定は、例えば、Schwille et al. (Biophys.J.72(1997),1878−1886)及びRigler et al. (J.Biotechnol.63(1998),97−109)に記載されている。
【００２０】
本発明による方法は、生体、特に哺乳動物、例えば、ヒト中の生体分子、例えば、核酸、蛋白質又はその他から由来する分析分子の検出に特に好適である。更に、試験管内で生物プローブから発生した分析物、例えば、逆転写によってｍRNAから製造されたcDNA−分子、又は試験管内翻訳によってmRNA又はDNAから製造された蛋白質を検出することもできる。更に、この方法は、ライブラリー要素から存在して、既知特性、例えば、検出試薬との結合を示すはずの分析物の検出に好適である。そのようなライブラリーの例は、ファージライブラリー又はリボソームライブラリーである。
【００２１】
特に有利な１実施態様で、測定は、核酸ハイブリダイゼーションを包含し、この際、１又は数種のルミネセンス標識化ゾンデが分析物としての特異的核酸に結合する。この種類のハイブリダイゼーション法は、例えば、遺伝子発現の分析に、例えば、遺伝子発現プロフィールの調査に、突然変異、例えば、単ヌクレオチド多型（SNP）の分析に使用することができる。しかし、本発明による方法は、特に、１又は数回のサーモサイクリング(Thermocycling)−過程で、酵素反応の測定又は／及び核酸増幅の測定にも好適である。核酸−多型の有利な測定法は、DE１００５６２２６．４及びDE１００６５６３１．５に記載されている。この際、２−又は多色−交差相関測定を実施することが特に有利である。
【００２２】
もう１つの有利な実施態様で、測定は、蛋白質−蛋白質−又は蛋白質−リガンド−相互作用の検出を包含し、この際、蛋白質リガンドとして、例えば、低分子の作用物質、ペプチド、核酸等を使用することができる。この種類の測定にも、２−又は多色相関測定を実施することが有利である。
【００２３】
選択的に有利な１実施態様で、（それが遊離型で存在する場合に）蛍光強度又は／及び−消光時間に関して、結合状態にある場合とは異なる測定信号を示す、いわゆる“モレキュラールビーコン(Molecular Beacon)”ソンデ又はプライマーを使用することができる。
【００２４】
もう１つの有利な選択的実施態様で、測定は、エネルギードナーとして少なくとも１種のルミネセンスマーカーから、かつ受容体として少なくとも１種のルミネセンスマーカーから生成されるエネルギー伝達の測定を包含することができる。ドナー及び受容体は、分析物及び１又は数種の検出試薬、有利に少なくとも２種の検出試薬を含有する複合体中に存在する。
【００２５】
本発明のもう１つの課題は、蛍光−相関分光法（FCS）による分析物の測定のための、特に、
（a）測定すべき分析物を含有するプローブ液の収容用の少なくとも１個の容器を有する担体、
（b）プローブ液の一部である測定容量物中にルミネセンスを包含する光学的励起装置及び
（c）測定容量物からのルミネセンスの検出のための光学的検出装置
を包含する方法の実施のための装置であり、この装置は、焦点光学器と測定容量物との間の間隔が≧１ｍｍであること、かつ担体は励起装置と熱的に隔離していることを特徴とする。
【００２６】
担体は、有利に、プローブ液の収容用の、有利に少なくとも１０２個の多数の容器を有する微細構造であり、この際、プローブ液は別々の容器で１又は数種の給源から由来してよい。プローブ液の担体容器中への装入は、例えば、圧電液体放出−装置によって行うことができる。
【００２７】
担体容器は、それが分析物と検出試薬との結合を液状で可能にさせるように構造されている。容器とは担体表面上の窪みのことであり、この際、この窪みは、原則的に任意の形、例えば、円形、正方形、菱形等を有することができる。担体は、１０３又はより多数の別々の容器を包含することもできる。
【００２８】
光学的励起装置は、相応する光学装置によってプローブ液中の測定容量物に焦点を合わせられる強力な焦点光源、有利にレーザー光線を包含する。光源は、２又は数種のレーザー光線を含有することもでき、その場合には、光源は各々プローブ液中への進入の前に異なる光学器によって測定容量物に焦点される。検出装置は、例えば、繊維結合のアバランシュ−フォトダイオードデテクター（Avalanche−Fotodiodendetektor）又は電子検出器を包含することができる。しかし、回折光学器又は量子−波形−レーザー（Quanten−Well−Laser）によって発生されるレーザー点の点マトリックスから成る、並びにアバランシュ−フォトダイオードマトリックス又は電子検出器マトリックス、例えば、CCD−カメラによって発生される検出器マトリックスから成る励起−又は／及び検出−マトリックスを使用することもできる。
【００２９】
担体は、既製形で準備されていてよく、この際、数個の別個の担体容器中に、ルミネセンス標識化検出試薬、有利にルミネセンス標識化ハイブリダイゼーションゾンデ又は−プライマーを充填する。引続いて、検出試薬を含有する担体を有利な方法で乾燥させる。
【００３０】
本発明の有利な１実施態様で、各々異なる検出試薬、例えば、核酸ハイブリダイゼーションの検出のための試薬、例えば、プライマー又は／及びゾンデがその中に注入されている多数の、例えば、１００個の別個の容器を含有する既製担体を準備する。この場合には、この担体に、検査すべき生体、例えば、ヒトの患者から由来するプローブを充填することができ、従って、各容器中で、単一プローブからの異なった分析物が測定される。この種類の担体は、例えば、遺伝子発現プロフィールを描くために、例えば、病気の診断に又は核酸多型の測定に、例えば、特定の遺伝的素質の検出に使用することができる。
【００３１】
更に、本発明のもう１つの課題は、核酸多型の測定法である。この方法は、前記の蛍光−相関分光法と組み合わせて有利に使用することができるが、他の単一分子検出法又は慣用の検出法に応用することもできる。
【００３２】
この方法は、次の過程：
（a）１個の検査すべき核酸マトリックス及びハイブリダイゼーション条件下にマトリックスに結合する２個のゾンデの準備、
（この際、ゾンデは次のように選択される、すなわち、
（i）これらは、直接並行してマトリックスに結合し、従って、第１ゾンデの３′−末端は、第２ゾンデの５′−末端に直接隣接していて、
（ii）第１ゾンデの３′−末端又は／及び第２ゾンデの５′−末端については、そこで、マトリックス上の多型の出現が予想され得る位置が選択され、
（iii）第１ゾンデの３′−末端又は／及び第２ゾンデの５′−末端でのヌクレオチドは、これが前測定された最初の多型変体を示す場合には、マトリックス上での各々の位置にたいして相補的であり、これが他の多型変体を示す場合には、マトリックス上での各々の位置に対して非相補的である）、
（ｂ）マトリックスでのゾンデのハイブリダイゼーション、
（ｃ）選択的に、第１ゾンデの３′−末端でのヌクレオチド及び第２ゾンデの５′−末端でのヌクレオチドが、マトリックスの各々の位置に対して相補的である場合にだけ、第１及び第２ゾンデのライゲーションが行われるという条件下に、マトリックス及びそれに結合した第１及び第２ゾンデを包含するハイブリダイゼーション複合体をリガーゼで処理すること、及び
（ｄ）マトリックス上に存在する多型変体を測定するために、第１ゾンデと第２ゾンデとの間でライゲーションが行われたかどうかの確認
を包含する。
【００３３】
核酸多型とは、最も簡単な場合には、単一ヌクレオチド多型（SNP）のことである。しかし、多型は、２種又はそれ以上のヌクレオチドにも該当し得る。
【００３４】
核酸マトリックスとして、任意の素性、例えば、天然の起源からのDNA、しかし又、組換え製造のDNA又は合成のDNAを使用することができる。DNAは、本方法によって測定されるべき核酸多型が出現する生体から由来することが有利である。DNAは、単鎖形で、例えば、単鎖のｃDNAとして使用されることが有利である。しかし、二重鎖のDNAを使用することも可能であり、これは加熱によって単鎖DNAに分割され、その後に、ゾンデでのハイブリダイゼーションに使用される。
【００３５】
ハイブリダイゼーションゾンデは、有利に少なくとも部分的に単鎖DNAから成る。いずれにせよ、有利にDNA−リガーゼの使用下に、第１ゾンデの３′−末端は、第２ゾンデの５′−末端に連結可能でなければならない。しかし、ゾンデは部分的に核酸類似物、例えばペプチド核酸から構成されていてもよい。第１ゾンデは、３′−末端に、１個の遊離３′−OH基を含有し、第２ゾンデは５′−末端に、１個の５′−ホスフェート基を含有することが有利である。
【００３６】
第１及び第２ゾンデは、各々、その共通の出現が交差相関測定によって検出可能である１個の異なる標識化基を有することが有利である。これは、単一の分子（ライゲーション生成物）中の２つの異なる標識化基の存在が、２つの別々の分子（第１及び第２ゾンデ）中の存在とは別々に検出可能であることを意味する。ライゲーション生成物と単一のゾンデとの間の大きさの違いは、強く異なるハイブリダイゼーション−融点を生じさせ、従って、本方法の高い感度を生じさせる。例えば、ハイブリッドの融点曲線測定を実施する場合には、単一ゾンデにおいて、交差相関は、単一ゾンデの最低融点以上で既に消滅し、一方で、ライゲーション生成物は、なお実際により高い温度まで（有利に、≧１０℃より高いその融点まで）交差相関信号を示す。
【００３７】
標識化基として、蛍光標識化物、例えば、フルオレスセイン、ローダミン、フィコエリスリン、CY3、CY5 又はその誘導体を使用することが有利である。蛍光標識化基の区別は、放射波長、励起状態の寿命又はその組合せを介して行うことができる。
【００３８】
前記のように、検出は、単一分子測定によって、例えば、場所−又は／及び時間解放の蛍光−分光法で有利に行うことができ、これは、極めて小さい容量要素、例えば、微細溝又は微細波形中で、蛍光信号を単一光子計測まで下がって把握することができる。
【００３９】
検出は、例えば、同焦点の単一分子検出によって、例えば、蛍光相関分光法によって行うことができる。検出は、選択的に、時間的解放の消光測定、いわゆる、タイム−ゲッティング（Time−Gating）によって行うこともでき、この際、蛍光分子の励起は、測定容量物内で行われ、引続き、光検出器で、≧１００ｐｓの時間的間隔で、検出インターバルが開始される。この測定法は、例えば、Rigler et al. :Ultrafast Phenomena D.H.Auston,Hrsg.Springer 1984 に記載されている。
【００４０】
更に、本発明を、次の図によって説明する。各図は次のことを示す：
図１Ａ：１〜２ｃｍ２の面積を有する担体は、例えば、１０４個までの窪みを有することができる。
【００４１】
容器（４）中の分析物の検出には、担体ベースの下に配置された励起−及び検出装置を有利に使用することができる。この装置は、光源（６）、例えば、レーザーを含有することができ、これを用いて、光を、光学的焦点装置（８）を経て、プローブ液内の測定容量物（１０）中に放射させることができる。測定容量物から放出されたルミネセンス放射線は、光学的焦点装置（８；８ａ）を経て検出器（１２）に伝導される。測定容量物（１０）は、焦点装置（８）から、≧１ｍｍ及び有利に＞１ｍｍの操作間隔で配置されている。更に、担体（２）は、例えば、光学的焦点装置（８）と担体（２）との間に気相範囲を配置することによって、光学的励起−及び検出装置から熱的に隔離されている。
【００４２】
図１Ｂ：担体（２０）は、同様に、プローブ液収容用の多数の別個の容器（２２）を有する。光学的励起−及び検出装置（非図示）とプローブ液中に含有される測定容量物（非図示）の間の放射進路中に、有利に凸レンズ要素（２４）が付加的に配置されている。このレンズ要素は、有利に抗反射被覆（２６）を有する。
【００４３】
図２：担体（３０）は、更に、温度調節要素（３４）、例えば、ペルティエ−要素を含有する。この温度調節要素は、有利に少なくとも部分的に担体周囲を囲んで配置されている。温度可変測定を可能にするために、プローブ液を実際に周囲から隔離する被覆（３６）を周囲から容器（３２）に装備する。そのために、例えば、被覆（非図示）を使用することができる。
【００４４】
図３：装置は、場合により、フレーム保持体（３６）上での付加的な加熱−又は冷却要素（非図示）の使用下に設置することができる。
【００４５】
図４：容器（４２ａ）及び（４２ｂ）は、遮断体（４６）で分割されている。この遮断体は、持続的遮断体として又は弁として、例えば、加圧による透過性の疎水性膜弁として形成されていてよい。プローブ液を、同時に多数の容器中に又は（第１容器の充填後に）弁（４６）を経て第２容器に充填することができる。
【００４６】
図５：プローブ液を、場合により担体上にそれ自体組み込まれた貯蔵容器（５０）から、導管（５２）を経て、各々平行にプローブ容器（５４）に導入する。プローブ液を、場合により、容器（５４）から、弁（５６）を経て、もう１つの容器（５８）に導入することができ、すなわち、平行充填を、連続充填と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１Ａ】本発明による方法の実施に好適な、担体上に窪みの形で形成されたプローブ液を収容するための多数の容器（４）を有する担体（２）を示す略図。
【図１Ｂ】本発明による方法の実施に好適な担体（２０）の特に有利な１実施例を示す略図。
【図２】プローブ液を収容するための多数の別個の容器（３２）を有する、本発明の方法の実施に好適な特に有利な担体（３０）を示す略図。
【図３】温度調節要素（３４）を有する図２に記載された担体（３０）を示す平面図。
【図４】入口（４４ａ、４４ｂ）を経る、別個の容器（４２ａ；４２ｂ）を有する担体（４０）へのプローブの充填を示す略図。
【図５】担体中へのプローブ液の充填のための特に有利な実施態様を示す略図。
【符号の説明】
【００４８】
２ 担体
４ 容器
６ 光源
８ 光学的焦点装置
８ａ 光学的焦点装置
１０ 測定容量物
２０ 担体
２２ 容器
２４ 凸レンズ要素
２６ 抗反射被覆
３０ 担体
３２ 容器
３４ 温度調節要素
３６ 被覆
４２ａ 容器
４２ｂ 容器
４４ａ 入口
４４ｂ 入口
４６ 遮断体
５０ 貯蔵容器
５２ 導管
５４ プローブ容器
５６ 弁
５８ 容器
【０００１】
本発明は、蛍光−相関分光法によるプローブ中の分析物の測定法に関し、この際、プローブ中の測定容量物と光学的励起−／検出装置との間の間隔は、≧１ｍｍであり、プローブ液は光学的装置と熱的に隔離している。この方法は、特に、温度可変性経過の測定に、例えば核酸−ハイブリダイゼーション溶融曲線の測定に、又は核酸−増幅反応の実施に好適である。更に、本発明による方法の実施に好適な装置が明らかにされる。
【０００２】
分析物の検出のための蛍光−相関分光法（FCS）の使用は公知である。EP−B−０６７９２５１は、蛍光−分光法による分析物の検出法及び装置を開示していて、この際、検査すべきプローブの一部である測定容量物中の測定が実施され、又この際、測定容量物は光学的焦点装置から≦１０００μｍの操作間隔で配置されている。更に、焦点装置はプローブと直接接触しているか、又は透視シートによってだけプローブと分離している。従来は、プローブと光学的装置との間で僅かな距離及び直接接触が、蛍光−相関分光法では不可欠な特徴であるとされてきた。しかし、この配置は、プローブの温度変化と共に進行する過程が大きな困難の下でしか試みられ得ないという欠点を有する。
【０００３】
DE−A−３６４２７９８は、標本台上に可動的に設置されている架台を有する顕微鏡を開示していて、この際、標本台の垂直移動のための駆動装置が誘導装置から離れた独立した標本台支柱を形成している。顕微鏡の温度は、冷却気の供給によって、かつ断熱フィルターの使用によって調節され得る。蛍光−相関分光法における使用についての言及はない。
【０００４】
GB−A−２３５１５５６は、放射測定法を記載していて、この際、相応する範囲から同時に放射測定することができるように、並行配置されている数個の読取ヘッドを形成するための共焦光学的単チャンネル系及び光電検出器が平行配置されている。焦点光学器として、開口数０．４、焦点距離８ｍｍ及び口径５ｍｍの１０個の（１０ｘ）顕微鏡−対物レンズを使用することができる。焦点光学器がプローブと熱的に隔離され得ることについての言及はない。
【０００５】
DE−C−４２１８７２９は、光学的位置解放検出器を有する毛細管電気泳動装置を開示している。毛細管内の温度は恒温維持され得る。共焦蛍光−分光法についての言及はない。
【０００６】
DE−A−１９７４８２１１は、蛍光−相関分光法に使用することができるレンズ配列（Linsenarray）を有する光学系を記載している。プローブ中の共焦容量要素の生成のために、焦点距離ｆ＝７．５及び開口数０．６を有するレンズを使用する。プローブからの焦点光学器の熱的隔離は言及されていない。
【０００７】
DE−A−１９９１９０９２は、蛍光分析に使用することができる対象物配列（Gegenstandarray）の光学的評価のための装置を記載している。ここでも、焦点光学器とプローブとの熱的隔離についての言及はない。
【０００８】
本発明の基礎にある課題は、これらの公知技術水準の欠点を少なくとも部分的に回避する蛍光−相関分光法の実施のための方法と装置を用意することにある。
【０００９】
従って、本発明の課題は、次の過程：
（a）担体中のプローブ液の準備、
（b）焦点光学器を有する光源及び測定容量物からの放射線を受けるための検出器の使用下に、プローブ液の一部である測定容量物中の発光分子の光学的励起によるルミネセンス測定の実施
を包含する、蛍光−相関分光法によるプローブ中の分析物の測定法であり、この方法は、プローブ液中の測定容量物と光源の焦点装置との間の間隔は≧１ｍｍであり、プローブ液は光源及び特に焦点光学器と熱的に隔離されていることを特徴とする。
【００１０】
本発明による方法のもう１つの利点は、担体、従ってプローブの温度を、光学的励起−又は検出装置及び特にその焦点光学器、例えば、１又は数種の微細対物レンズに関係なく調整し、変えることができることにある。
【００１１】
この方法は、その他については原則的に、EP−B−０６７９２５１に記載された方法により実施することができる。その際、測定容量物中の１又はもっと少ない分析分子の測定を行うことが有利であり、この際、測定すべき分析分子の濃度は、≦１０−１４であることが有利である。分析分子のルミネセンス測定によって調べられる物質特異性パラメーターが測定される。このパラメーターとは、併進拡散−係数、回転拡散−係数及び／又は発光分子の励起状態の励起波長、放射波長及び／又は寿命、及び／又はこれらの測定数量の組合せである。装置的詳細については、EP０６７９２５１の開示が参照される。
【００１２】
本発明による方法の１つの重要な特徴は、プローブ液中の測定容量物と光源の焦点光学器との間の間隔が、≧１ｍｍ、有利に１．５〜１０ｍｍ、特に有利に２〜５ｍｍであることにある。更に、プローブ液を含有する担体と光学的焦点装置との間に、空気、保護ガスを含有し得る、又は真空であってよい気相領域が設置されていることが有利である。
【００１３】
本発明による方法の実施に使用される担体は、有利に、プローブ収容のための有利に別々の数個の容器を包含する微細構造である。この容器の容量は、有利に≦１０−６ｌ、特に有利に１０−８ｌの範囲にある。すなわち、担体は、例えば、プローブ液収容のための１０〜１０００μｍの直径を有する数個の窪みを有する微細波形構造を包含することができる。好適な微細構造は、例えば、DE１００２３４２１．６及びDE１００６５６３２．３に記載されている。更に、担体は、担体又は／及び個々のプローブ容器の温度調節をその中で可能にする少なくとも１種の温度−調節要素、例えば、ペルティエ（Peltier）−要素を含有することが有利である。
【００１４】
更に、この方法に使用される担体は、それがプローブの光学的検出を可能にするように形成されていることが有利である。従って、少なくともプローブ容器の範囲で、光学的に透明な担体が使用されることが有利である。この際、担体は、完全に光学的に透明であるか、又はプローブ液中に光学的に透明なベース及び光学的に不透明な刻み目付きの被覆層を含有することができる。好適な担体材料は、例えば、金属（例えば、被覆層用の珪素）及びガラス（ベース用）から成る複合物質の担体である。この種類の担体は、例えば、ガラス上にプローブ液用の刻み目を前以て付けた金属層を載せることによって形成することができる。選択的に、例えば、ポリスチロール又はアクリレート−又はメタクリレートを基礎とするポリマーから成るプラスチック担体を使用することができる。更に、担体は、測定中に実際に周囲とは隔離された密閉系を得るために、プローブ液用の蓋を有することが有利である。
【００１５】
特に有利な１実施態様では、放射進路中に測定容量物及び光学的装置の光源又は検出器の間に配置されているレンズ要素を含有する担体が使用される。例えば、レンズ要素は、微細波形構造の床部に設置されていてよい。この種類のレンズ要素は、例えば、加熱及び、例えば、金属、例えば、珪素から成るマスター−型の使用下に耐光物質の形成によって成形され、次いで担体上に載せられ得る。選択的に、例えば、完全プラスチック構造から成る担体の場合には、レンズ要素は担体に組み込まれ、例えば、製造の間に射出成形によって形成され得る。レンズ要素、有利に凸面レンズ要素の使用によって、光学的測定装置の開口数は拡大され得る。この開口数は、０．５〜１．２の範囲にあることが有利である。
【００１６】
更に、担体は、より高い屈折率を生じさせるために、透明な抗反射被覆で被覆されていることが有利である。抗反射被覆として、例えば、透明な酸化物又は窒化物を使用することができる。抗反射被覆は、光学器上に使用することも有利である。
【００１７】
更に、測定容量物中の測定すべき分析物の濃縮を達成するために、担体中に電場を、特にプローブ容器の範囲に発生させることができる。そのような電場の発生に好適である電極の例は、例えば、DE１０１０３３０４．４に記載されている。
【００１８】
本発明による方法は、担体及び光学器の熱的アンカップリングに基づき、環境によって異なる温度での測定の実施、及び特に測定の間での温度変化を可能にする。担体及び光学器の空間的アンカップリングは、担体、特に数個の別々の容器を有する微細波形構造の簡素化走査を可能にする。
【００１９】
本発明による方法は、原則的に、任意の分析物の検出に好適である。ルミネセンス測定によって検出可能な標識化基、特に蛍光標識化基を有する１又は数種の分析物結合物質をプローブに添加することが有利である。この場合には、本発明による方法は、有利に、検出すべき分析物への標識化基の結合の測定を包含する。この検出は、例えば、分析物への結合に基づく、標識化基の可動性変化によって、又は分析物への結合に基づく、標識化基のルミネセンスの変化によって（強度又は／及び消光時間）、又は数種の標識化基を使用する場合には、いわゆる交差相関によって行うことができる。交差相関測定の場合には、少なくとも２種の異なる標識化物、特に蛍光標識化物が使用され、その相関信号は、測定容量物中で測定される。この交差相関測定は、例えば、Schwille et al. (Biophys.J.72(1997),1878−1886)及びRigler et al. (J.Biotechnol.63(1998),97−109)に記載されている。
【００２０】
本発明による方法は、生体、特に哺乳動物、例えば、ヒト中の生体分子、例えば、核酸、蛋白質又はその他から由来する分析分子の検出に特に好適である。更に、試験管内で生物プローブから発生した分析物、例えば、逆転写によってｍRNAから製造されたcDNA−分子、又は試験管内翻訳によってmRNA又はDNAから製造された蛋白質を検出することもできる。更に、この方法は、ライブラリー要素から存在して、既知特性、例えば、検出試薬との結合を示すはずの分析物の検出に好適である。そのようなライブラリーの例は、ファージライブラリー又はリボソームライブラリーである。
【００２１】
特に有利な１実施態様で、測定は、核酸ハイブリダイゼーションを包含し、この際、１又は数種のルミネセンス標識化ゾンデが分析物としての特異的核酸に結合する。この種類のハイブリダイゼーション法は、例えば、遺伝子発現の分析に、例えば、遺伝子発現プロフィールの調査に、突然変異、例えば、単ヌクレオチド多型（SNP）の分析に使用することができる。しかし、本発明による方法は、特に、１又は数回のサーモサイクリング(Thermocycling)−過程で、酵素反応の測定又は／及び核酸増幅の測定にも好適である。核酸−多型の有利な測定法は、DE１００５６２２６．４及びDE１００６５６３１．５に記載されている。この際、２−又は多色−交差相関測定を実施することが特に有利である。
【００２２】
もう１つの有利な実施態様で、測定は、蛋白質−蛋白質−又は蛋白質−リガンド−相互作用の検出を包含し、この際、蛋白質リガンドとして、例えば、低分子の作用物質、ペプチド、核酸等を使用することができる。この種類の測定にも、２−又は多色相関測定を実施することが有利である。
【００２３】
選択的に有利な１実施態様で、（それが遊離型で存在する場合に）蛍光強度又は／及び−消光時間に関して、結合状態にある場合とは異なる測定信号を示す、いわゆる“モレキュラールビーコン(Molecular Beacon)”ソンデ又はプライマーを使用することができる。
【００２４】
もう１つの有利な選択的実施態様で、測定は、エネルギードナーとして少なくとも１種のルミネセンスマーカーから、かつ受容体として少なくとも１種のルミネセンスマーカーから生成されるエネルギー伝達の測定を包含することができる。ドナー及び受容体は、分析物及び１又は数種の検出試薬、有利に少なくとも２種の検出試薬を含有する複合体中に存在する。
【００２５】
本発明のもう１つの課題は、蛍光−相関分光法（FCS）による分析物の測定のための、特に、
（a）測定すべき分析物を含有するプローブ液の収容用の少なくとも１個の容器を有する担体、
（b）プローブ液の一部である測定容量物中にルミネセンスを包含する光学的励起装置及び
（c）測定容量物からのルミネセンスの検出のための光学的検出装置
を包含する方法の実施のための装置であり、この装置は、焦点光学器と測定容量物との間の間隔が≧１ｍｍであること、かつ担体は励起装置と熱的に隔離していることを特徴とする。
【００２６】
担体は、有利に、プローブ液の収容用の、有利に少なくとも１０２個の多数の容器を有する微細構造であり、この際、プローブ液は別々の容器で１又は数種の給源から由来してよい。プローブ液の担体容器中への装入は、例えば、圧電液体放出−装置によって行うことができる。
【００２７】
担体容器は、それが分析物と検出試薬との結合を液状で可能にさせるように構造されている。容器とは担体表面上の窪みのことであり、この際、この窪みは、原則的に任意の形、例えば、円形、正方形、菱形等を有することができる。担体は、１０３又はより多数の別々の容器を包含することもできる。
【００２８】
光学的励起装置は、相応する光学装置によってプローブ液中の測定容量物に焦点を合わせられる強力な焦点光源、有利にレーザー光線を包含する。光源は、２又は数種のレーザー光線を含有することもでき、その場合には、光源は各々プローブ液中への進入の前に異なる光学器によって測定容量物に焦点される。検出装置は、例えば、繊維結合のアバランシュ−フォトダイオードデテクター（Avalanche−Fotodiodendetektor）又は電子検出器を包含することができる。しかし、回折光学器又は量子−波形−レーザー（Quanten−Well−Laser）によって発生されるレーザー点の点マトリックスから成る、並びにアバランシュ−フォトダイオードマトリックス又は電子検出器マトリックス、例えば、CCD−カメラによって発生される検出器マトリックスから成る励起−又は／及び検出−マトリックスを使用することもできる。
【００２９】
担体は、既製形で準備されていてよく、この際、数個の別個の担体容器中に、ルミネセンス標識化検出試薬、有利にルミネセンス標識化ハイブリダイゼーションゾンデ又は−プライマーを充填する。引続いて、検出試薬を含有する担体を有利な方法で乾燥させる。
【００３０】
本発明の有利な１実施態様で、各々異なる検出試薬、例えば、核酸ハイブリダイゼーションの検出のための試薬、例えば、プライマー又は／及びゾンデがその中に注入されている多数の、例えば、１００個の別個の容器を含有する既製担体を準備する。この場合には、この担体に、検査すべき生体、例えば、ヒトの患者から由来するプローブを充填することができ、従って、各容器中で、単一プローブからの異なった分析物が測定される。この種類の担体は、例えば、遺伝子発現プロフィールを描くために、例えば、病気の診断に又は核酸多型の測定に、例えば、特定の遺伝的素質の検出に使用することができる。
【００３１】
更に、本発明のもう１つの課題は、核酸多型の測定法である。この方法は、前記の蛍光−相関分光法と組み合わせて有利に使用することができるが、他の単一分子検出法又は慣用の検出法に応用することもできる。
【００３２】
この方法は、次の過程：
（a）１個の検査すべき核酸マトリックス及びハイブリダイゼーション条件下にマトリックスに結合する２個のゾンデの準備、
（この際、ゾンデは次のように選択される、すなわち、
（i）これらは、直接並行してマトリックスに結合し、従って、第１ゾンデの３′−末端は、第２ゾンデの５′−末端に直接隣接していて、
（ii）第１ゾンデの３′−末端又は／及び第２ゾンデの５′−末端については、そこで、マトリックス上の多型の出現が予想され得る位置が選択され、
（iii）第１ゾンデの３′−末端又は／及び第２ゾンデの５′−末端でのヌクレオチドは、これが前測定された最初の多型変体を示す場合には、マトリックス上での各々の位置にたいして相補的であり、これが他の多型変体を示す場合には、マトリックス上での各々の位置に対して非相補的である）、
（ｂ）マトリックスでのゾンデのハイブリダイゼーション、
（ｃ）選択的に、第１ゾンデの３′−末端でのヌクレオチド及び第２ゾンデの５′−末端でのヌクレオチドが、マトリックスの各々の位置に対して相補的である場合にだけ、第１及び第２ゾンデのライゲーションが行われるという条件下に、マトリックス及びそれに結合した第１及び第２ゾンデを包含するハイブリダイゼーション複合体をリガーゼで処理すること、及び
（ｄ）マトリックス上に存在する多型変体を測定するために、第１ゾンデと第２ゾンデとの間でライゲーションが行われたかどうかの確認
を包含する。
【００３３】
核酸多型とは、最も簡単な場合には、単一ヌクレオチド多型（SNP）のことである。しかし、多型は、２種又はそれ以上のヌクレオチドにも該当し得る。
【００３４】
核酸マトリックスとして、任意の素性、例えば、天然の起源からのDNA、しかし又、組換え製造のDNA又は合成のDNAを使用することができる。DNAは、本方法によって測定されるべき核酸多型が出現する生体から由来することが有利である。DNAは、単鎖形で、例えば、単鎖のｃDNAとして使用されることが有利である。しかし、二重鎖のDNAを使用することも可能であり、これは加熱によって単鎖DNAに分割され、その後に、ゾンデでのハイブリダイゼーションに使用される。
【００３５】
ハイブリダイゼーションゾンデは、有利に少なくとも部分的に単鎖DNAから成る。いずれにせよ、有利にDNA−リガーゼの使用下に、第１ゾンデの３′−末端は、第２ゾンデの５′−末端に連結可能でなければならない。しかし、ゾンデは部分的に核酸類似物、例えばペプチド核酸から構成されていてもよい。第１ゾンデは、３′−末端に、１個の遊離３′−OH基を含有し、第２ゾンデは５′−末端に、１個の５′−ホスフェート基を含有することが有利である。
【００３６】
第１及び第２ゾンデは、各々、その共通の出現が交差相関測定によって検出可能である１個の異なる標識化基を有することが有利である。これは、単一の分子（ライゲーション生成物）中の２つの異なる標識化基の存在が、２つの別々の分子（第１及び第２ゾンデ）中の存在とは別々に検出可能であることを意味する。ライゲーション生成物と単一のゾンデとの間の大きさの違いは、強く異なるハイブリダイゼーション−融点を生じさせ、従って、本方法の高い感度を生じさせる。例えば、ハイブリッドの融点曲線測定を実施する場合には、単一ゾンデにおいて、交差相関は、単一ゾンデの最低融点以上で既に消滅し、一方で、ライゲーション生成物は、なお実際により高い温度まで（有利に、≧１０℃より高いその融点まで）交差相関信号を示す。
【００３７】
標識化基として、蛍光標識化物、例えば、フルオレスセイン、ローダミン、フィコエリスリン、CY3、CY5 又はその誘導体を使用することが有利である。蛍光標識化基の区別は、放射波長、励起状態の寿命又はその組合せを介して行うことができる。
【００３８】
前記のように、検出は、単一分子測定によって、例えば、場所−又は／及び時間解放の蛍光−分光法で有利に行うことができ、これは、極めて小さい容量要素、例えば、微細溝又は微細波形中で、蛍光信号を単一光子計測まで下がって把握することができる。
【００３９】
検出は、例えば、同焦点の単一分子検出によって、例えば、蛍光相関分光法によって行うことができる。検出は、選択的に、時間的解放の消光測定、いわゆる、タイム−ゲッティング（Time−Gating）によって行うこともでき、この際、蛍光分子の励起は、測定容量物内で行われ、引続き、光検出器で、≧１００ｐｓの時間的間隔で、検出インターバルが開始される。この測定法は、例えば、Rigler et al. :Ultrafast Phenomena D.H.Auston,Hrsg.Springer 1984 に記載されている。
【００４０】
更に、本発明を、次の図によって説明する。各図は次のことを示す：
図１Ａ：１〜２ｃｍ２の面積を有する担体は、例えば、１０４個までの窪みを有することができる。
【００４１】
容器（４）中の分析物の検出には、担体ベースの下に配置された励起−及び検出装置を有利に使用することができる。この装置は、光源（６）、例えば、レーザーを含有することができ、これを用いて、光を、光学的焦点装置（８）を経て、プローブ液内の測定容量物（１０）中に放射させることができる。測定容量物から放出されたルミネセンス放射線は、光学的焦点装置（８；８ａ）を経て検出器（１２）に伝導される。測定容量物（１０）は、焦点装置（８）から、≧１ｍｍ及び有利に＞１ｍｍの操作間隔で配置されている。更に、担体（２）は、例えば、光学的焦点装置（８）と担体（２）との間に気相範囲を配置することによって、光学的励起−及び検出装置から熱的に隔離されている。
【００４２】
図１Ｂ：担体（２０）は、同様に、プローブ液収容用の多数の別個の容器（２２）を有する。光学的励起−及び検出装置（非図示）とプローブ液中に含有される測定容量物（非図示）の間の放射進路中に、有利に凸レンズ要素（２４）が付加的に配置されている。このレンズ要素は、有利に抗反射被覆（２６）を有する。
【００４３】
図２：担体（３０）は、更に、温度調節要素（３４）、例えば、ペルティエ−要素を含有する。この温度調節要素は、有利に少なくとも部分的に担体周囲を囲んで配置されている。温度可変測定を可能にするために、プローブ液を実際に周囲から隔離する被覆（３６）を周囲から容器（３２）に装備する。そのために、例えば、被覆（非図示）を使用することができる。
【００４４】
図３：装置は、場合により、フレーム保持体（３６）上での付加的な加熱−又は冷却要素（非図示）の使用下に設置することができる。
【００４５】
図４：容器（４２ａ）及び（４２ｂ）は、遮断体（４６）で分割されている。この遮断体は、持続的遮断体として又は弁として、例えば、加圧による透過性の疎水性膜弁として形成されていてよい。プローブ液を、同時に多数の容器中に又は（第１容器の充填後に）弁（４６）を経て第２容器に充填することができる。
【００４６】
図５：プローブ液を、場合により担体上にそれ自体組み込まれた貯蔵容器（５０）から、導管（５２）を経て、各々平行にプローブ容器（５４）に導入する。プローブ液を、場合により、容器（５４）から、弁（５６）を経て、もう１つの容器（５８）に導入することができ、すなわち、平行充填を、連続充填と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１Ａ】本発明による方法の実施に好適な、担体上に窪みの形で形成されたプローブ液を収容するための多数の容器（４）を有する担体（２）を示す略図。
【図１Ｂ】本発明による方法の実施に好適な担体（２０）の特に有利な１実施例を示す略図。
【図２】プローブ液を収容するための多数の別個の容器（３２）を有する、本発明の方法の実施に好適な特に有利な担体（３０）を示す略図。
【図３】温度調節要素（３４）を有する図２に記載された担体（３０）を示す平面図。
【図４】入口（４４ａ、４４ｂ）を経る、別個の容器（４２ａ；４２ｂ）を有する担体（４０）へのプローブの充填を示す略図。
【図５】担体中へのプローブ液の充填のための特に有利な実施態様を示す略図。
【符号の説明】
【００４８】
２ 担体
４ 容器
６ 光源
８ 光学的焦点装置
８ａ 光学的焦点装置
１０ 測定容量物
２０ 担体
２２ 容器
２４ 凸レンズ要素
２６ 抗反射被覆
３０ 担体
３２ 容器
３４ 温度調節要素
３６ 被覆
４２ａ 容器
４２ｂ 容器
４４ａ 入口
４４ｂ 入口
４６ 遮断体
５０ 貯蔵容器
５２ 導管
５４ プローブ容器
５６ 弁
５８ 容器
Claims (23)
- 次の過程：
（a）担体中のプローブ液の準備、
（b）焦点光学器を有する光源及び測定容量物からの放射線を受けるための検出器の使用下に、プローブ液の一部である測定容量物中の発光分子の光学的励起によるルミネセンス測定の実施
を包含する、蛍光−相関分光法によるプローブ中の分析物の測定において、プローブ液中の測定容量物と光源の焦点装置との間の間隔は≧１ｍｍであり、プローブ液は、光源及び特に焦点光学器とは熱的に隔離されていることを特徴とする方法。 - 間隔は、１〜１０ｍｍ、有利に２〜５ｍｍである、請求項１に記載の方法。
- 担体と焦点光学器との間に気相範囲が設置されている、請求項１又は２に記載の方法。
- 担体は、放射線進路中に、測定容量物と光源又は検出器との間に配置されているレンズ要素を含有する、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
- 光学的測定装置は、０．５〜１．２の口径数を有する、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
- 担体は、プローブ収容用の多数の、有利に少なくとも１０２個の別個の容器を含有する、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
- 担体は、有利に１０〜１０００μｍの直径を有する多数の窪みを有する微細波形構造を包含する、請求項６に記載の方法。
- 担体は、少なくとも１個の温度調節要素を包含する、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
- 測定は、少なくとも部分的に、環境と異なる温度で実施される、請求項８に記載の方法。
- 温度は測定の間に変動される、請求項８又は９に記載の方法。
- 測定は、少なくとも１種のルミネセンス標識化検出試薬と分析物との結合を包含する、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
- 測定は、核酸−ハイブリダイゼーションを包含し、この際、１又は数個のルミネセンス標識化ゾンデが特異的核酸と結合する、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
- 測定は、少なくとも２種の異なるルミネセンス標識化物を含有する分析物及び１種以上の検出試薬から成る複合体から由来する交差相関信号の測定を包含する、請求項１１又は１２に記載の方法。
- 測定は、少なくとも１種のルミネセンス標識化検出試薬から由来する信号の測定を包含し、この際、検出試薬のルミネセンス強度又は／及び−消光時間が、分析物との結合においては、非結合状態における場合とは異なっている、請求項１１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
- ルミネセンス強度又は／及び−消光時間の差異は、消光−又はエネルギー伝達過程によって喚起される、請求項１４に記載の方法。
- 測定は、分析物及び１又は数種の検出試薬から成る複合体中に存在する、ドナーとしての少なくとも１種のルミネセンスマーカー及び受容体としての少なくとも１種のルミネセンスマーカーから由来するエネルギー伝達の測定を包含する、請求項１１から１５までのいずれか１項に記載の方法。
- 測定は酵素反応を包含する、請求項１から１６までのいずれか１項に記載の方法。
- 測定は、核酸−増幅、特に１又は数種のサーモサイクリング−過程を包含する、請求項１２から１７までのいずれか１項に記載の方法。
- 測定は、核酸における突然変異分析を包含する、請求項１２から１８までのいずれか１項に記載の方法。
- 測定は、核酸における遺伝子発現分析を包含する、請求項１２から１９までのいずれか１項に記載の方法。
- 測定は、核酸−ハイブリダイゼーションにおける温度依存性溶融曲線の測定を包含する、請求項１２から２０までのいずれか１項に記載の方法。
- 蛍光−相関分光法（FCS）による分析物の測定のための、特に、請求項１から２１までのいずれか１項に記載の方法の実施のための、
（a）測定すべき分析物を含有するプローブ液の収容用の少なくとも１個の容器を有する担体、
（b）プローブ液の一部分である測定容量物中のルミネセンスの励起のための光源及び焦点光学器を包含する光学的励起装置及び
（c）測定容量物からのルミネセンスの検出のための光学的検出装置
を包含する装置において、焦点光学器と測定容量物との間の間隔は≧１ｍｍであり、担体は励起装置と熱的に隔離されていることを特徴とする装置。 - 次の過程：
（a）１個の検査すべき核酸マトリックス及びハイブリダイゼーション条件下にマトリックスに結合する２個のゾンデの準備、
（この際、ゾンデは次のように選択される、すなわち、
（i）これらは、直接並行してマトリックスに結合し、従って、第１ゾンデの３′−末端は、第２ゾンデの５′−末端に直接隣接していて、
（ii）第１ゾンデの３′−末端又は／及び第２ゾンデの５′−末端については、そこで、マトリックス上の多型の出現が予想され得る位置が選択され、
（iii）第１ゾンデの３′−末端又は／及び第２ゾンデの５′−末端でのヌクレオチドは、これが前測定された最初の多型変体を示す場合には、マトリックス上での各々の位置にたいして相補的であり、これが他の多型変体を示す場合には、マトリックス上での各々の位置に対して非相補的である）、
（ｂ）マトリックスでのゾンデのハイブリダイゼーション、
（ｃ）選択的に、第１ゾンデの３′−末端でのヌクレオチド及び第２ゾンデの５′−末端でのヌクレオチドが、マトリックスの各々の位置に対して相補的である場合にだけ、第１及び第２ゾンデのライゲーションが行われるという条件下に、マトリックス及びそれに結合した第１及び第２ゾンデを包含するハイブリダイゼーション複合体をリガーゼで処理すること、及び
（ｄ）マトリックス上に存在する多型変体を測定するために、第１ゾンデと第２ゾンデとの間でライゲーションが行われたかどうかの確認
を包含する核酸多型の測定法。
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