JPH11502608A - 生体高分子の適応度を評価するための方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 500ms 以下の測定時間および分析される分子の短い拡散距離を特徴とするレーザー励起FCS を用いた、特に1 μM 以下の希釈液中の一つの分子または少数の分子を同定する方法であって、検定される分子の発光値を決定する物質特異的パラメータを測定することにより望ましくは10^-14ｌ以下の小容積ユニットの測定が行われる。本発明を実施するのに使用される望ましい装置は非常に希釈した溶液の小測定部分の蛍光励起のため、および共焦点結像による次の測定における発光を結像するためのそれ自身知られた顕微鏡システムであり、少なくとも一つの望ましくは1.2N.A．以上の高開口数の光学システムを使用し、光量が顕微鏡対物レンズの後ろにある対物板中の共焦点的に配置したピンホール開口によって制限され、かつ、測定部分は観察用対物レンズから0 乃至1000μm の距離に位置する。

Description

【発明の詳細な説明】 生体高分子の適応度を評価するための方法および装置 本発明の目的は、レーザー励起蛍光相関分光光度法を用いた、特に1 μM 以下 の希薄溶液中の一つまたは少数の分子の同定方法、特定の用途における該方法の 使用、並びに本発明の方法を実施するための装置に関する。 近年、生物学的活性分子の分析は特異性および感度の点で着実に進歩してきて おり、また、基本的に新しい技術によって補われてきている。この点に関しては 従来の分析技術に適応しうる量にまで単一の細胞または分子を増幅するクローニ ング法または遺伝子物質の酵素的増幅を挙げることが出来る。しかし、多くの場 合、定性的にも定量的にも単一分子または数分子に直接適応しうる十分な感度を 有する分析法があればより望ましい。 例えば、電子顕微鏡は、単一分子を直接検出しうる技術である。トンネル型電 子顕微鏡を用いた単一のDNA 分子の配列決定が試みられている。しかし、この方 法は非常に煩雑である。 単一分子の単なる分析だけではなく、構造や他の分子との相互作用または分子 構造など、その分子の状態パラメータに関する情報も多くの分野で重要である。 最近の進化的生物工学的方法は非常に複雑な分子集合体に関するものである。 その目的は標的構造と特異的相互作用を起こす分子を同定すること、即ち、望ま しい機能に関する特定の適応度を測定することである。この適応度は結合定数ま たは速度定数などの熱力学的パラメータに帰結させることができる。 例えば、分析する分子が低濃度でのみ存在する場合、検定法の感度を増加する ことは問題の解決にとってさして重要ではないことがしばしばある。むしろ、多 かれ少なかれ同時に分析すべき大量の試料に対処しなければならない。例えば、 10⁶個の分析試料を時間のスケールで分析しなければならないなら、試料を１ms から最高で1s以内で測定および評価しうる分析法しか考えられないのは明白であ る。本発明に課せられた問題は、取り分け、単一分子の単なる分析に止まらず、 他の分子との特異的相互作用または得られた分子構造に関する情報を得られる方 法を提供する事である。さらに、多量の試料を同時に分析することである。 本発明の方法は化学発光に基づいており、また蛍光相関顕微鏡(FCS)の名前で 知られている技術を利用している。蛍光性を有する発色分子構造を用いて発色性 リガンドの分子環境に関する情報を得ることができる。化学発色団の回転拡散お よび並進拡散は、相互作用分子へのエネルギー移動の種々の経路、化学反応速度 および励起状態の寿命と同様に測定しうる。 物理化学的現象に基づき、本発明は単一分子または少数分子から該分子の性質 に関する情報ならびに一つの分子について特定される一つの化学発色団の種々の 状態の分子種数に関する情報または特定の相互作用機能に関する適応度の情報を 得るために分光学的測定パラメータを利用した新しい解答を提供している。 今日まで約20年間、D.マグデ(Magde)のグループ(エルソン(Elson),E.L.および マグデ(Magde),D.(1974)蛍光相関顕微鏡、概念および理論; Biopolymer 13，1-2 7)およびR.リグラー(Rigler)(アーレンバーグ(Ehernberg),M.およびリグラー(Ri gler),R.(1974)回転ブラウン運動および蛍光強度の揺らぎ; Chem.Phys．4,390-4 01)により追跡されてきた蛍光相関顕微鏡法は技術的な困難さから実際的分析法 に組み込まれることはなかった。測定時間および色素の光誘導性消光(光消光)に 関して上述の要求に答えることは出来なかった。リグラー(Rigler)等は分子の回 転時間を測定できた。マグデ(Magde)等は揺らぎ時間を通して特定の化学反応定 数を測定しえた。 FCS 測定の原理はレーザー光の強力な励起光で溶液内の比較的限られた小さい 容積エレメントを照射することにより非常に希薄な溶液(10nM以下)中の蛍光性分 子を測定することである。この容積内に存在する対応する励起スペクトル特性を 有する分子のみがこの光で励起される。この容積エレメントから発せられる蛍光 の像が高感度のフォトマルチプライヤー上に結ばれる。もし、この溶液を希釈す れば各照射容積エレメント内に存在する分子濃度を有意に変化させうる。 特に非常に希薄な溶液は特定の時間内に特定の容積エレメント内に同時に存在 する分子数の分布はポアソン分布を示す。一度この容積エレメント内に拡散して きた分子はその分子型に特徴的な拡散速度(並進)に従う平均的時間内に再びこの 容積エレメントから出ていき、もはや観測できなくなる。もし、一つの分子が観 測エレメント内で平均滞在時間内に何度も励起されるならば、この分子から多 くの発光シグナルが検出できる。別の言葉で言えば、希薄溶液の場合、一度観測 エレメントに拡散してきた分子が再びその容積エレメントから離れる前に１回以 上励起されうる確率は、新たに拡散してくる分子が励起される確率よりもはるか に大きい。この事は対応する発光シグナルが新たにそのエレメントに侵入してく る分子よりも同じ１つの分子から発せられる確率が大きいことを意味している。 従って、発光シグナルの時間変化と関連する分子種の相対拡散時間の相関関係を 明確にすることができる。 もし、励起光と発光の偏光面の回転をパラメータとして測定すれば、おおよそ の分子量、形状パラメーターまたは周囲のマトリクスに関する情報を引き出しう る分子の回転拡散係数を決定しうる。 同じ１つの分子を何回も（数千回）励起し、多くの単一測定に由来する発光シ グナルを蓄積することにより希薄溶液中の単一分子を検出することさえ可能であ ることが判明している。 この測定原理の実質的な実現には多くの技術的困難がある。最近のレーザー技 術を採用しても、この観察領域が大きすぎて低い並進拡散係数を有する生物学的 分子は約50msも存在することになる。この時間は発色団として使用する各色素リ ガンドが消光されてしまうほど十分長い。頻繁に行われる励起が環境にある分子 、特に酸素に対する発色構造の化学的反応性を増加し、発光は変化を受けるか、 あるいは消光する。もちろん、発光（蛍光）の損失は分子の測定エレメントから の離脱と混同されることから光消光は測定誤差に直接結びつき、また、測定法を 規格化することによる区別が困難であるか、あるいは異常な技術的経費によって 始めて獲得されうることになる。 今日まで一般的に使用されている方法における本測定原理の実質的実現は狭い 範囲に限定されてきたが、このことは本発明の方法によって克服されうる。 本発明に記載されているようにFCS の作業に関するルーチン方法への重大な進 展は励起光学系の特定要素、単一光子検出および試料取扱法の同時使用を要求す る試料総容積がμｌレンジとなる極小測定容積（望ましくは10^-14 -10^-17ｌ）の 導入により達成される。実験レイアウトで示される装置の測定容積は2×10^-16ｌ であり、この容積はこれまで文献で見られる測定容積の約1000倍小さい。従っ て、照射領域の大きさは約0.1 μm²となる。FCS が特に測定容積当たり0.1-10個 の色素分子濃度に対する正確なデータを提供するとすると、作業濃度は約10^-7 - 10^-9M となる。最高検出効率およびバックグランド補正を用いた測定は技術的に 単一光子検出と組み合わせた高開口共焦点光学系で実現されうる。 もし拡散時間と比較して反応時間が遅いならば並進拡散によって結合定数が測 定できる。この事は観察されるリガンドが観測領域に入ってから出るまでにその 分子構造を変えないか、またはほとんど変えないことを示している。また、混合 状態を示す相関関係も測定される。もう一度繰り返すと、分子の滞在時間が従来 の観測領域の場合よりも約1000倍短くなることから、非常に小さい測定容積を用 いた本発明の方法の重要性は明らかであり、例えばリガンド／レセプター相互作 用などに関する、通常の大きさの平衡定数および速度定数の測定への道が切り開 かれた。 １．本発明の小容積測定領域の重要性 本発明の方法の実施に伴う小容積エレメントの重要性およびその使用は従来法 とは異なる実験的特徴を有している。 小容積エレメントには以下に示す特徴がある。 - バックグランド散乱光、特にラマン散乱光、 - 光照射間の蛍光色素の寿命、 - 短い測定時間、 - 高分子複合体、ウイルス、細胞の拡散時間、 - エレメントに存在しない複合体の統合／保存、および - 測定の間の複合体の寿命。 以下の説明から小容積エレメントを実現する上で本発明に望ましい意味で同時 に幾つかのパラメータが正の効果を有し、累積効果を通して本発明に関する問題 に対して解答を出した方法論の非線型／指数的改善を行ったことは明白である。 単一分子の測定に必要なSN（シグナル・トゥー・ノイズ）比1000はf1およびサ ブf1領域における小容積エレメントにより達成される。この比の低下は測定容積 の半径の 3乗（r³）に比例する。この挙動は長いカラム容積をレーザー光が照射 し、実質的にビームの２次元内での拡散を解析していた初期の実験装置では完全 に無視されていた。 それでも測定技術的理由からより大きい容積を分析するならば、本発明に従い マルチアレイ検出により多くの小容積エレメントを同時に測定すること、および ／または、異なる空間部位の種々の小空間エレメントを連続して測定することが 可能となる。測定容積としての各ガウス分布空間エレメントに対してSN比の特徴 が維持される。本発明に従って、全ての空間エレメントは各々単一の空間エレメ ントの単一測定と同様に絞られた励起光で共焦点的に照射されることが望ましく 、また、空間エレメントの像はピンホールでスクリーンに形成される。 単一分子の安全な同定および測定、および特定の測定時間における測定容積内 の複合体化または遊離リガンドの数に基づく平衡定数の測定に必要な単一分子の 計数の可能性に関する本技術の方法論的改善は、測定容積10^-14ｌ以下の使用に より達成される。このことは、本発明に従い直径100 μm 以下、望ましくは20-3 0 μm 以下のピンホール開口の使用、並びに予め絞られたレーザー励起光の使用 により可能となる。対物板に存在するこの大きさのピンホール開口を用いると、 0.33-0.5μm のガウス測定容積の直径は60倍にも達する。異なる像スケールを有 する光学系を使用すると、対応するピンホール開口を使用しなければならない。 このことは遊離したローダミンに関して測定容積からの拡散平均時間が約40μs となることを意味しており、一方従来技術では750 μs となる。しかし、同時に 1000倍以上も減少した測定容積における分子の滞在確率も1000倍以上小さくなり 、その結果不都合に長い測定時間を要することになることから、ガウス分布測定 容積の半径の10以上の減少は適当ではないと言わなければならない。従って、本 発明の本方法の至適測定容積は10^-14 -10^-17ｌとなる。とにかく可視光では減少 した寸法の空間エレメントを光の回折性のためさらに大きく減少することはでき ない。しかし、このことは測定シグナルを発生するために核蛍光を励起する場合 など本発明にしたがってＸ線照射を用いることにより克服しうる。 - 測定時間が実質的に許容されうる範囲（msからs）にあること、 - SN比が1 を超え、特に100 から1000の範囲にあること、 - 励起のための照射光による破壊が起こらないように小分子、分子複合体、また は分子断片の拡散平均時間（測定容積を横切る）が大きくならないこと、 以上の特徴を踏まえて、至適ガウス分布測定容積は10^-14ｌ以下、特に10^-17ｌ 以下となる。 SN比が高いことは、測定時間が短いことに加えて、適当なフィルターを使用し ていることでうまく説明される。簡便のため、これらの光学フィルターはラマン 散乱光を抑制する緩衝バンドフィルターおよび／または10⁷の懸濁因子に対応す る10^-7の光学密度を有する励起光波長に近い散乱光をカットするラマンカット・ オフ・フィルターを使用する。 本発明の方法および本発明に従った単一分子、分子複合体、および／または分 子断片の蛍光分光光度法用装置を使用するにあたって、励起用の照射光を鋭く絞 り込むことに加えて、励起光のビーム経路中に非常に小さなオリフィスを有する ピンホール開口が共焦点的に存在する事が重要である。対物板のピンホール開口 のオリフィスサイズは像の大きさおよび対物板上に結像される測定容積の大きさ に依存して選択される。40（100）の像サイズおよび測定容積0.1 μm 以下の半 径の場合、最低限4 μm（10μm）のピンホール開口半径が必要となる。 バックグランド散乱光、特にラマン散乱光 試料を通過する励起光の強度がより強くなり、また単一光子検出器に結像され る容積がより大きくなれば、試料中に存在する分子および固体によって散乱され 検出器に到達する光の強度はより小さくなる。即ち、自己相関をとることにより それらはシグナルと簡単に区別することができる。 本発明に従って、従来のフィルターで水のラマンバンドを抑制すると単一のロ ーダミン分子を0.2f1 の空間領域においてSN比1000で測定できる。このような小 さい空間領域を用いずに従来の測定を行うとSN比は僅か10^-3となる。 光照射中の蛍光色素の寿命 本発明に使用しうる生物学的に有用な蛍光色素は限られた寿命しか持っていな い。フルオレセインなどの色素は明らかに光感受性が高い。しかし、特に大きい 複合体の平均滞在時間の詳細な測定の場合、色素はその分子が再び測定容積の外 に出る前に約10,000-1,000,000回励起される。早熟の消光は並進係数を大きく見 積もらせるので（小分子）、早熟の消光は測定結果に誤差を生じさせる。 高分子複合体、ウイルス、細胞の拡散時間- 短い測定時間 特に大きい分子複合体、ウイルスまたは細胞は極端に並進拡散係数が小さい。 本発明のように測定容積が小さいと、ウイルスおよび細胞は結合した色素の有意 な消光無しに取り扱うことができ、遊離のM13 DNA の場合の拡散係数は約10^-8cm² /sであり、また大腸菌は約5×10^-9cm²/sであった。この測定容積内の細菌の滞 在時間は約30msであった。これまで可能であったより大きい測定容積ではこれら の大きい複合体が並進拡散により測定容積を出ていくまでに長い測定時間を要す ることになるであろう。 測定容積領域に存在しない複合体の統合／保存 色素が特定の化学反応により励起状態から反応し、消光してしまうことが統計 的確率で起こる。もし、この事が測定容積以外から来る光で起こるならば、失活 した色素がシグナルを全く提供せず、その測定に何ら寄与しないのでその測定は 影響を受けない。しかし、この方法の質が測定可能な分子および分子複合体の効 果的濃度が未だ測定容積以外に存在する色素標識分子の早熟消光で減少し感度が 影響を受ける事により非常に制限を受ける。もしもレーザービームが最高までに 絞りこまれていなかったら、これらの負の要因は煩わしいものになるであろうし 、また、標識分子が本発明の望ましい態様である幾つかの色素分子として提供さ れているならばその分子の測定不能部分は予備照射で予め消光させておかれる。 測定の間の複合体の寿命 検出される標的分子および標識したテスト試薬の複合体は、該複合体が測定時 間を通して安定に存在する場合に限り本発明の方法で検出が可能である。このこ とは、複合体がそれ自身秒の単位の衰退時間を有する場合の、大きい測定容積内 の平均滞在時間が秒の範囲にある場合について論じているのではない。この事は 例えば結合定数10⁶ｌ・mol^-1の金属イオン複合体化等の生物学的反応に関するも のである。しかし、本発明に従う小容積エレメントは短い平均滞在時間を意味し ているので（＜1ms）、実際の全ての複合体化反応において複合体は測定容積内 の滞在時間を通して安定に存在する。 マルチアレイ検出 本発明のマルチアレイ検出は、マルチアレイ検出器上に別々に結像された種々 の容積領域を持つ大きい容積領域を非至適様式で照射し、かつ、入射した光子を 記録し測定の間に別々に評価する事で達成される。この事は市販のマルチアレイ 単一光子検出器を用いることで可能である。この方法の１つの欠点は望ましくな い照射が測定容積外の有意な光失活を起こしてしまうことにある。マイチアレイ 検出、即ち種々の空間位置での測定容積の並行FCS 分析または種々の空間位置の 測定容積の連続的FCS 分析において、比較的大容積エレメントが実験アレイにお いて照射されるのは今まで述べてきた意味で利点が無く、一方、小空間エレメン トの測定は2Dパターンに整列させた小さな空間エレメントを同時に結像させ、測 定し評価する事によって達成される。この実験においては（第24図）、多くの発 色団が拡散により測定容積内に到達するまでに消光してしまうであろう。 低濃度では、比較的容積が大きいエレメントが測定される。測定時間は必要と される測定データの精度（SN比）に依存して10乃至100ms の範囲にあるので、10 ,000から100,000 個の測定容積は1000s で測定される。従って、10^-14 -10^-15M の極端に低い濃度が測定される。この事は結合定数 k_ass≧10⁶mol／ｌから k_ass ＝10¹⁵mol／ｌまでの特異的生物学的相互作用が測定できることを示している。 １つの例では本発明の技術を用いてどの様に結合定数または反応定数が測定さ れるかが示される。本発明に従う反応物の結合平衡の測定は、少なくとも１つの 反応物が化学的に１つの色素分子に結合し、かつ、その反応物の回転拡散速度お よび／または並進拡散速度が複合体形成の間に変化するという事実に基づいてい る。もし、平衡定数が非常に希薄な溶液の実験条件と適合しないならば、即ち、 低い結合定数が高い反応物濃度を必要とするならば、このことは例えば大量の非 標識反応物を与えるか、または標識化合物に対して過剰の非標識反応物を添加す ることにより達成しうる。 マグネ(Magne)によって示されたようにFCS を用いた分子揺らぎによる反応速 度の測定は、これまで行われてきた測定装置では拡散経路が長いことにより満足 に行うことができなかった。本発明の測定技術を用いることにより、特に生物学 的反応に関連する約10^-6s^-1乃至10³s^-1の範囲の複合体の解離速度定数の測定が 可能となった。このような測定は例えば、蛍光標識分子の相互交換により行いう る。 また、本発明の技術は生物学的高分子の構造変化の測定ならびに関連する熱力 学的および速度論的定数の測定を可能にする。構造の揺らぎは、例えば回転拡散 出できる。 この方法はDNA／RNA 分析にも使用しうる（DNA／RNA 分析については以下参照 ）。遺伝子解析、特に感染性病原の同定において、診断方法の感度が重要となる ことが多い。この事は近年特に遺伝子ターゲット配列の増幅を目的とした酵素依 存的方法の導入に関連して明らかになってきた。本方法を用いることにより予備 的な酵素依存的増幅の必要体を幾つかの診断方法で省略することができ、例えば それによって強く増幅された単一配列の混入の問題を克服できることが期待され る。 また、本方法は既存のRIA、ELISA またはその他の方法（以下参照、レセプタ ースクリーニング）等の診断法の代わりに使用しうる。本発明の方法の１つの利 点はこのシステムが自己校正型であることである。校正曲線または内部標準を施 す必要はない。各実験で問題となる分子の測定から内部校正が得られる。例えば 、レーザー強度の変化は測定精度に影響しない。連続測定におけるドリフトの問 題は発生しない。測定は校正する事無しに何度でも反復でき、同じ結果を与える 。装置の校正も省略することができる。望ましい応用にはテスト試薬として抗体 を使用しない検定法または抗体を使用したELISA、RIA またはFIA に基づく従来 の検定法の代替法が挙げられる。特定のターゲット分子（リガンド）を認識する 為 の特異的認識分子（レセプター分子、テスト試薬）としての抗体に加えて、別の 分子を使用する全ての検定法が考えられる。一般に、抗体に加えて可能なレセプ ター分子とはその表面に特定の認識部位を有するか（例えば、抗体、一本鎖抗体 、膜レセプター、可溶性レセプター、酵素、構造タンパク質、多糖類、ペプチド 、複合体二次代謝物等）またはターゲット分子内に特異的認識部位を含む（例え ば、HDL、VLDL、LDL）全ての分子および分子複合体である。 一般的形のレセプターおよび一つ以上のリガンド間の特異的複合体の形成が分 析的に興味ある物である場合、および／または少なくとも１つの関連分子が少な くとも１つの色素標識で提供され、かつ、複合体の形成が色素標識の回転拡散お よび／または並進拡散の変化で明確となる場合、FCS 検定を行うことができる。 利点を有する態様に関する同様の熱力学的規則性はELISA、EIA、RIA またはFIA 型の検定にも同様に適用しうる（図1 および2 参照）。 本発明の方法の性能は市場に存在する技術と比較したときに特に明確となる。 よく採用される方法には関連する装置にいわゆるTDX システムを採用するシカゴ のアボット(Abbott)のいわゆるFPIA技術がある。ここでは蛍光標識した分子の偏 光解消を同種の検定法で測定している。 偏光での励起後に発せられる蛍光色素の蛍光の偏光解消は、基本的にその分子 の分子量、形状パラメータに依存する性質である。大きな分子に比べ比較的小さ な分子は励起と蛍光の発光との間により多く回転し、その結果発光のより大きな 偏光解消を起こす。この効果は小さい蛍光標識分子が例えば、抗体の結合部位に 関し非標識ターゲット分子と競合するような場合に利用される。従って、蛍光の 偏光解消は複合体に結合した標識分子の相対的位置に関する情報を提供する。し かし、この方法は望ましい検出限界に到達していないのは明白である。製造業者 自身、10^-9Mという比較的低い検出感度を提供している。本発明の方法は至適条 件でない時でも２桁以上もこの方法より感度が高い。この事はFPIAキットを本発 明に従って使用したときにも正しい。より感度の高い色素を使用することにより 、さらに高い感度が達成できる。この事は例えば薬剤診断などの場合に特に重要 である。 本発明の方法は種々の試料条件に依存して定量的および定性的検定に特に優れ た性能を示す。蛍光の偏光解消度は媒体の粘度／温度条件に依存する。粘度が増 加すると、回転拡散定数が低くなるため全ての分子の蛍光偏光解消度は減少し、 直ちに結果に影響する。同様の妨害効果は励起状態の寿命に影響する媒体の条件 により引き起こされる。寿命の延長は偏光解消の増加と同様の効果を示す。しか し、本発明に従って並進拡散を測定する方法では、これらの効果は結果の質に重 大な影響をおよぼさない。実際に、この事は試料調製およびスケール決定におけ る経費の節約および顕著に大きいダイナミックレンジを意味する。 ２．複合体形成における反応速度の重要性 特異的認識反応を伴う核酸の再生の場合のように（以下参照）、会合速度が遅 すぎて認識反応に基づく均一な検定法は実際的ではない。例えば特異的複合体形 成の反応速度を増加するために標識抗体を使用する場合の不均一検定法において は反応物を過剰提供し、かつ、複合体に結合しなかった過剰な反応物は次の段階 で除去されるが、このことは均一検定法では容易に行えない。 この問題を以下の例で説明する：本発明の方法に従う検出により≦10^-15Mの濃 度の蛍光色素で標識した化合物を測定しうる。もし、蛍光標識した特異的テスト 試薬をターゲット分子または分子複合体に使用したなら、少なくとも3 つの必要 条件が満足されねばならない。1.複合体に結合していない蛍光標識した分子と結 合した蛍光標識分子間のサイズの差は、異なる並進拡散を簡単に検出できるよう に拡散定数が約2 倍異なるくらいに大きくなくてはならない。2.ターゲット分子 と複合体を形成する結合定数は十分大きくなければならない。3.会合の反応速度 は実験的に許容しうる分から時間の時間スケールで複合体の形成が行われるよう に十分大きくなければならない。 もし、複合体に結合していない100 個のテスト試薬の内、１つの複合体化した ターゲット分子が検出できれば、本発明に従って10^-15Mの生成複合体を検出する のに10^-13Mのテスト試薬を使用することができる。平衡状態では、対応する２分 子会合反応の対応する会合定数 k_assが少なくとも10¹³M^-1であるならば複合体形 成は十分効率よく起こる。このような高い結合定数はタンパク質のような生体分 子では殆どありえない。通常抗体の結合定数は10⁶から10¹⁰M^-1の範囲に ある。 生体分子の複合体化反応における抗体の反応速度定数は k_ass＝10⁷ M^-1s^-1の 範囲を越えることはまず無い。基本的に結合定数の差はしばしば10から10^-3s^-1 の範囲にくる複合体の解離速度定数 k_dissの差に寄因する。しかし、上述の場合 、 k_ass=10⁷ M^-1 s^-1の速度定数はテスト試薬の濃度を10^-10Mとしたときに会合 の寿命が1000s 付近になることを意味している。 本発明に従って、低い結合定数にもかかわらず認識反応の均一検定法で10^-15M にも達する光学検出反応の感度を利用した幾つかの代替法が考えられる。 反応条件を変えることにより会合定数を極端に変化させることができる。核酸 について、相補的核酸配列の会合がどのように10,000から100,000 倍も加速され るかを以下に説明する。長い鎖状DNA の配列モチーフの認識反応は純粋な拡散支 配の反応よりも速く進行する。おそらく律速段階はDNA へのタンパク質因子の到 達であり、その後実際の結合部位への速い一次元拡散段階が続いている。 一般に加速は会合の律速段階の拡散過程を短くすることで達成しうる。このこ とは単純に反応混合物を濃縮することにより行われる。 本発明では均一検定法において媒体の条件を変化させ、試料容積を減少するこ となく効果的に反応分子の滞在空間を減少させている。本発明では、基本的に水 和水被覆の構造に影響を与える例えばポリエチレングリコール類、デキストラン 、ポリビニルピロリドン、カオトロピック試薬類、有機溶媒またはこれらの組み 合わせ物を添加することで行っている。本発明では水性２相系を用いて１相に選 択的に反応物を濃縮している。 別の可能性として標識した反応物の過剰量の使用が挙げられる。もし、共同し て１つの分析物を認識し、結合する２つの色素標識した反応物を使用すると、い わゆるエネルギー転移複合体が形成される。１つの色素標識は発光した蛍光が隣 接する第２の色素分子（10-100Å）を励起する励起光受容体として働き、第２の 色素から発した蛍光が本発明の測定シグナルとして検出される。エネルギー転移 は色素間距離の6 乗に比例して減少するので、反応物は過剰に使用しうる。３者 複合体の並進拡散定数を本発明に従って測定する。 本発明では、もし、非複合体化テスト試薬が化学的にまたは照射により分光学 的に変化を受け、複合体とは異なる分光特性になるならば、過剰成分としての色 素標識テスト試薬の使用も可能である。この事は例えばインターカレーション(i ntercalating)色素の場合に可能である。 本発明の電気的トラップによる濃縮については本明細書の別の箇所で説明する 。 もし、例えば小分子に対する標識化抗体の使用の場合などのように複合体形成 がテスト試薬の分子量および／または形状をわずかにしか変化させないならば、 本発明の複合体に対する過剰の第２の抗体の使用は本発明で検出しうる第３の複 合体の生成を可能にする。 本発明に従って少なくとも一つのターゲット分子と反応できる、少なくとも二 つの異なる色素で標識された少なくとも二つの異なるテスト試薬であって、少な くとも二つの色素の蛍光シグナルを本発明に従って測定しうる試薬も使用するこ とが出来る。この方法は二つの様式で使用しうる。 ａ）試料における少なくとも二つの分析物の同時測定 一つの試料中に存在する複数の分析物を検出する上で実験的問題がしばしば生 ずる。二つの独立する検定法とは異なり、少なくとも二つの異なる分析物の検出 は二つの独立する異なる色素で標識し、望ましくは異なる波長の光で励起するか 、もしくは異なる発光波長の光を独立に検出できる二つの独立するテスト試薬の 反応により本発明に従って独立に行うことができる。このことは、たとえば図16 に図示した二つの独立する光学系を用いて行いうる。 ３．相互相関 ｂ）一つの分析物に少なくとも二つの異なるテスト試薬が同時に結合することに よる検出特異性の向上 一つのテスト試薬を結合することにより、不十分な特異性しか有さない場合で も類似の分析分子から特定の分析物を区別することができる。このことは自分自 身の病原性またはそれらの生産物の病原性など、その生物学的活性が極端に異な る相同的核酸配列で例示される。腫瘍抗原、構造蛋白質または細胞型特異的表面 マーカー等の蛋白質も分析しうるが、唯一のリガンドの結合だけでは不満足であ る。 本発明に従い、特定の分子は、少なくとも光学的に異なる蛍光分子で標識した 少なくとも二つのテスト試薬と同時に複合体を形成しうる。本発明に従い同時の 複合体形成はエネルギー転移複合体の形成（フェルスター転移、上述）または異 なる波長を有する励起および／または発光のシグナルの生成を通して特異的に検 出しうる。一つの分析物に対する異なるテスト試薬の結合は異なる光学シグナル の時間相関で確認される。 二つの異なる標識を付されたテスト試薬による分析物の二重複合体化は、上述 の特異性の向上という利点ばかりではなく、各試薬をより高い濃度で使用しうる という実際的利点もある。本発明に従い検出される蛍光シグナルの時間相互相関 により、非標識の遊離テスト試薬のシグナルは電気的シグナル処理のレベルで効 率的に抑制しうる。この方法は分析物の異なる配列断片に結合する少なくとも二 つの異なる標識テスト試薬を使用することによる核酸分析物の場合に特によく使 用される。異なる色素からの蛍光の発光波長は異なる。通常測定される検出シグ ナルの単一の自己相関の代わりに、本発明では異なる波長のシグナルの相互相関 が測定される。もし、両プローブがターゲット分析物に同時に結合するならば、 相互相関で分子の数および二重標識核酸断片の拡散時間が分かる。結合しなかっ たプローブ分子は自己相関では見えてくるが、このシグナルは相互相関では抑制 される。 ４．蛍光相関顕微鏡法を実施するための方法および装置 このように本発明に従い分子または分子複合体に化学的に結合または物理的に 会合した異なる色素の蛍光シグナルの相互相関を用いて感度および特異性を向上 することが出来る。しかし、至適手順で実験するために以下に示す本発明の方法 ならびに関連する装置により特に有効に実施しうる幾つかの必要条件が満足され なければならない。 本発明の方法は小容積エレメントを用いる蛍光相関分光法と相互相関法を組み 合わせている。この方法はFACS分析(蛍光活性化細胞分別)で使用されている相関 法とは明らかに異なる。そこでは細胞の様な大きな複合体に由来するいくつかの 光学パラメータ、例えば蛍光シグナルと前方散乱光の組み合わせ、または異なる 蛍光シグナルが同時に測定されている。セルソーターの場合、単一細胞を含む 単一液滴のシグナルが測定される。細胞型またはサブタイプを同定するためにと るシグナルの相関は液滴から検出される種々のシグナルの強度分布のみを問題に している。相関は各強度に関する幾つかのパラメータの平行した検出と考えてよ い。ここで示している方法は二つのストカスチック過程、小空間エレメント中の 種々の発色団の拡散特性を時間とリンクさせている。実際に細胞のレベルでは、 本発明の方法は発色団を有し測定領域に存在する種々の分子を区別しうるが、セ ルソーターでは、発色団が小分子の一部であるか、または複合体として存在する か、または細胞に結合しているかにかかわらず、液滴中の発色団の濃度を総合的 に検出するにすぎない。 FCS 分析と組み合わせた相互相関とは以下の方法論を意味している：容積エレ メントは出来るかぎり強く絞ったレーザー光またはＸ線で照射される。その電磁 波照射の強度は照射によって励起されうる分子の大部分が励起状態に励起される のに十分な大きさを有するように選ばれる。それから発せられる蛍光を単一光子 測定装置のピンホール開口による共焦点像で検出することから、非常に小容積の 細長い円錐形の光を測定することになる。この測定容積エレメントに分子が拡散 してくると、励起され、この測定容積エレメントに留まるかぎり発光によって測 定される。その平均滞在時間は分子、分子複合体または細胞の大きさおよび形に 特徴的なものとなる。 このように種々の濃度で存在する分子は相関分光法で区別でき、また同時に計 数しうる。例えば、レセプター／リガンド相互作用等の複合体形成の結合定数又 はこのような複合体の衰退速度などの速度定数をこのように測定しうる。この方 法では特に蛍光性を有する分子が単位時間当たり、容積エレメント内に僅かしか 存在しない場合に良好な結果を示す。この事は10^-9以下の濃度範囲の場合に相当 する。しかし、逆に第２の反応物との複合体形成は10⁷/sよりも速く進行するこ とは無いという問題が生ずる。２つの反応物が10^-9で等モル存在したとすると反 応時間は1 分以上かかることを意味する。この反応時間を短縮するには、例えば 過剰量の蛍光標識反応物を使用することで達成される。反応物の濃度が10^-9Mの 場合、10^-12Mの濃度のターゲット分子との複合体は分単位の反応時間の後に検出 しうる。より低い濃度の場合、複合体と遊離のリガンドとのSN（シグナル・ト ゥー・シグナル）比が大きくなりすぎて信頼できる濃度測定は出来ない。もし、 測定すべき複合体の結合定数がリガンド濃度≦10^-9にするほど高くない場合にも 別の実験的問題が生ずる。しかし、ウイルス抗原、病原体の核酸または特定のホ ルモンは有意に10^-9M以下の濃度で検出しなければならない。典型的な応用分野 はしばしば低い結合定数を有し、各分化した細胞の抗原から脱分化した細胞の腫 瘍抗原を区別する上で特異性がそれほど高くないモノクローナル抗体で腫瘍抗原 を診断する場合である。２つの異なる発色団を用いた相互相関法で上述の感度お よび特異性の向上が可能となる。 少なくとも３個の発色団を有する分子または分子複合体が実験的に区別される 必要がある：発色団1 を有する遊離リガンド、発色団2 を有する遊離リガンド、 発色団1 を有する複合体、発色団2 を有する複合体並びに発色団1 および発色団 2 を有する複合体。測定容積内に複合体が存在する時間内に発色団1 および発色 団2 を有する複合体のみが、腫瘍抗原またはウイルスまたは関連するDNA または RNA 等の病原体として検出すべきターゲット分子となる。 ここでの相互相関法では発色団1 および発色団2 が相関している。分子複合体 が測定容積内に存在する１つの同じ時間枠で励起される場合にのみ、両タイプの 発色団が検出され、これらのシグナルが両発色団を有する複合体として認識され る。 相互相関法を成功させるための重要な必要条件は： - ターゲット分子上の発色団1 および2 の距離は測定容積の寸法に比べて十分小 さく、その結果分子が測定容積に侵入し、再び出ていく間に測定の誤差範囲で両 色素が同時に励起光で照射されなければならない(複合体内での距離＜0.1 μm) 。 - 両色素に対して測定容積が同じ大きさとなり、互いに結合している両色素は同 じ時間枠内で励起光に照射されなければならない。 - 両測定容積は測定の誤差範囲内で同じ空間位置を占めなければならない。 この問題を解くことは些細な問題ではない。例えば、１つの問題は、良く知られ ているように異なる波長の光は屈折率の違いから異なるサイズの像を結ぶことに ある。しかし、波長の異なる２つのレーザーが不均等な絞りにより不均等な大き さの測定容積を照射したり、またはフォトマル上での検出が異なる測定容積をカ バーしていたならば測定にとって障害となる。 本発明ではこの問題を少なくとも２つの発光波長のいわゆるストーク・シフト によって区別しうる強い重なった励起スペルトルを有する２つの色素と１つの励 起波長を有する１つのレーザーを組み合わせて用いることで解決している。それ とは別に、同一の空間位置を有する容積エレメントが２つの独立するレーザー光 源で照射されることもある。簡便性のため、共焦点光学系は両方の場合で色補正 、即ち両発光波長に対して補正されて、両波長に対して１つで同じ空間エレメン トが測定されることになる。 本発明では異なる波長の蛍光を結像するのに、同じスケールで異なる波長の光 を結像しうる顕微鏡で馴染みの深い結像光学系を使用している。しかし、また、 本発明の方法の性能にとっては、同様の大きさの測定容積、同様の強度特性、お よび両波長で照射される同様の空間的位置が重要である。本発明においてこの事 は異なる強度を有する２つの調整された固定光学系を使用し、結果的に両波長が 光線が同じ大きさおよび位置に予め絞られる励起光学系側の装置、または固定的 に調整された予め絞るための光学系を第２光線経路の可変光線拡大素子と組み合 わせた装置を用いること、または両光線経路で予め絞るための可変光線拡大素子 を採用することにより達成される。 簡便のためこの装置は２つの対物レンズが照射される測定部分の２つの反対側 に位置するコンパクトな二重顕微鏡で実現される。入射光および測定部分の分子 、分子複合体、ベシクル（vesicles）または細胞から発せられる光線のための光 学系は２つの顕微鏡の各「部分」の共通するガイドまたは支持装置の両側に配置 される。各入射光はダイクロイック・ミラーで対物レンズのほうに反射される。 帰ってくる光線はこれらのダイクロイック・ミラーを透過しレンズ、共焦点素子 およびフィルター等の種々の光学素子を通過した後に検出器に到達する。 簡便のため、二色性（dichroic）ミラー上に差し込む光線の光学軸は２つの対 物レンズの移動方向に対して直角に配している。重なった異なる波長の２つの光 線は光線経路中の最初のものが二色性ミラーである並んだ２つの鏡にぶつかる。 ２つの光線の内の１つはこの二色性ミラーで反射するが、もう一つの光線はこの 二色性ミラーを直線的に透過し、第１光線とは反対の方向に後ろの鏡で反射され る。両光線の反射方向は対物レンズの移動方向に平行である。さらに、両反射光 は反射または二色性ミラーで反射され、入射光の光学系を通過していく。二重顕 微鏡の光学素子のこのような配置は、測定部分に入り、そこから進んでいく光線 の光学系に沿った２つの対物レンズはそれらに沿った光源を除去または移動する ことなしに取り除くことが出来るという利点を有する。特に、レーザー光源など の光源は二重顕微鏡から離して設置する事が出来る。光源と２つの光線を重ねて 、かつ供給する二重顕微鏡の間の相対的位置を変える必要がない。 また、全4 π固定角に渡る測定容積からの蛍光シグナルをカバーする必要があ る場合にこの装置を使用することができる。特に、この事は単一の分子の検出に 於いて全ての発光光子を検出することが重要である場合に起こる。この場合、上 述した装置は１つだけの励起波長だけが使用され、両方の検出素子は一緒になっ て全4 π固定角をカバーするように使用される。 第１図はリガンドL に特異的な結合性を示すレセプターを有する細胞を用いた 関連するエフェクター分子のレセプター検定法を示している。リガンドは本発明 に従って色素標識したものが提供されている。本発明において、レセプターおよ びリガンドのモル比および全濃度は約50% のレセプターが結合し、約50% のレセ プターが未結合でいるように選択される。本発明に従った分析において、この事 は遅い並進拡散分子から検出されるのと約同数の発光シグナルが速い並進拡散分 子から検出されることで見て取れる（右上の模式図；左のステップは遊離リガン ドに対応し、右のステップはレセプターに結合したリガンドに対応する）。 活性物質が添加されたとき、平衡の移動は特異的レセプター結合を有する活性 物質候補の相互作用を示す。レセプター機能のアンタゴニスト活性化因子または 阻害因子の場合、標識リガンドの置換が観察される（シグナルは遊離リガンドの みのシグナルに対応する）。同様のシグナルは、レセプターまたはリガンドとの 活性物質のアロステリック相互作用が標識リガンドの結合を妨害する場合に見ら れる。 同様に、活性物質はレセプターへのリガンドの結合を促進し、結合したリガン ドの測定値を増加する（右下）。 また、この検定法は細胞が観察される特異的反応を妨害しないレセプターをよ り多く有している場合にも行いうる。 もし、レセプター認識反応が迅速に平衡に達しないならば、標識リガンドおよ び活性物質をレセプターに対して同時に競争させうる利点がある。 第２図は同じ特異性および結合強度を有する天然のリガンドを認識するが異な るシグナルを伝達する異なる細胞上の異なるレセプターの使用について説明して いる。活性物質はこれらのレセプターを選択的に活性化または妨害することで興 味深い。この事は天然の活性物質の変異体と同様に構造的に関連しない活性物質 でも行いうる。 例えば、先ず各ターゲット・レセプターに対する検定を別々に行う。第１図の 脚注に示した規則を適用する。基本的に、活性物質を効果的におよび特異的にレ セプター結合の１つと相互作用することについて、従って種々のレセプター機能 の区別が可能であるかどうかを検定する（左下に可能な場合を示した）。同様の 方向に作用する効果で、右下に示したような測定結果が見て取れる。 特異的実施例により、以下に詳しく示すように、本発明のFCS 検定法は抗体に 依存する特異性に限定されず、均一または固相検定における分子、細胞、組織系 に対して等しく有用であり、熱力学的パラメータ（結合定数）および速度パラメ ータ（速度定数）の測定が可能であり、生体系（細胞培養物、組織）の非破壊研 究が可能であり、および溶液中で分析する場合に表面との非特異的相互作用が妨 害しない点で優れている。 ５．細胞または天然または人工的ベシクル構造に存在する未知のレセプターに対 する既知の蛍光標識リガンドの結合による医薬活性物質のスクリーニング 天然物と同様に化学的に合成された医薬活性物質は未だ知られていない標的分 子として存在する。これらの標的分子には細胞外分子（例えばプロテアーゼ・イ ンヒビター）、表面膜レセプター（例えばインシュリン）、可溶性メディエータ ーレセプター（ステロイドホネルモン・レセプター）または細胞構造タンパク質 または酵素として存在する。 従って、本発明により既知の活性物質の医薬的に重要な標的分子を発見し、特 徴付け、場合によってはこれらを単離する非常に重要な問題が解決される： - オルファン（orphan）・レセプターの探索 - 医薬作用のメカニズムの解明 - 活性物質類似体の探索 - 望ましくは区別しうる生物学的標的における（種々の細胞分化、腫瘍／非腫瘍 、病原／非病原等）種々のレセプター分子の差異の探索。 医薬速度論 本発明にしたがって医薬速度論に関する研究もなしうる： - 特定の活性物質の投与後種々の時間間隔で新たに添加される色素標識比較物質 を用いた競争実験で組織試料または体液を分析しうる。 複合体の解離速度定数による活性物質の標的分子の区別 もし、過剰の色素標識活性物質をレセプターと活性物質の種々の複合体混合物 に添加したなら、活性物質の解離分子は色素標識活性物質と置換するであろう。 場合によってはこの実験は逆標識でも行いうる。例えば、典型的な問題は異なる レセプターを検出する為の種々の細胞系列の分析にある（例えば：腫瘍表面抗原 、タンパク質P 結合型レセプターＩ、II、III）。一般に、多くの試料を同時に 分析する場合、第19図に示したような図ができる。本発明に従って、解離速度定 数が小さい場合、固定時間間隔であらゆる位置で反復して結合および解離活性物 質の比を測定する事により同時に、および／または反復して長い期間に渡る実験 で非常に多くの分析物を分析しうる。第19図にこの結果を図示してある。 このように、例えば１つで同じ試料中、または解離速度（k_D）は非常に異なる が反応速度定数（k_R）は同等である種々の細胞型または分化段階を含む種々の試 料中の特異的標的分子と種々の熱力学的安定性の複合体を形成する種々のレセプ ターまたは抗原決定基を検定しうる。従って所謂オルファン試薬またはオルファ ンレセプターまたは多機能分子群のメンバーに関する生物学的構造も機能検定法 で検出しうる。 実際に取り扱う上での利点は均一溶液での作業が、nMレンジのルーチン分析に おいて実際には無視できる程の（秒または分のレンジ）短いインキュベーション 時間に由来しており、かつ激しい洗浄ステップまたは二次インキュベーションの 必要もない。 試料キャリヤーとしては本発明にしたがって対物レンズに液体試料を接触する ことなく、従って汚染されることなく近づけうるシート状キャリヤーを使用する ことが望ましい（第３図）。 第３図は例えば特許出願PCT/EP 89/01320、PCT/EP 89/01387、PCT/DE 91/0008 2、PCT/DE 91/00081、PCT/DE 91/00083、PCT/DE 91/00704 に説明され、使用さ れている様なウェルを有するキャリヤーシートの使用が示されている。マルチ・ ウェル・シートと呼ばれるこの反応キャリヤーは本発明のFCS 分析のための試料 を受容しうるウェルを有している。これらは二次元的に移動可能なシート挿入装 置で制御され、試料を含むウェルの底が対物レンズに接近し、その結果液体試料 部分は対物レンズから約100-1000μm よりも離れることはない。シートと対物レ ンズの間の媒体は水が望ましく、これには対物レンズの補正が関係している（上 述参照）。そのシートはレーザー励起光および発光の両方に関して光学的に透明 で化学的に不活性である。シートはカバーシートでシールされていることが望ま しい。市場に出回っている自動ピペットシステムが使用できる点で、市販のマイ クロプレートシステムまたはオカサキフォーマットに対応するウェル間距離を有 するシートが望ましい。さらに、反応キャリヤーとしてのシートは汚染が低く、 簡単に廃棄でき、かつシール状態でコンパクトに納めうるものである。 ６．イオン性分子の分析 「電気的トラップ」を採用することにより本発明の方法の測定領域内で荷電分 子（カチオンおよびアニオン）を特異的に分析しうる。この事は、例えば機械的 誘導流による誘導の有無に係わらず特定のイオン性分子を観測部分に電場で濃縮 するか、または単一の分子を測定領域に直接輸送してくるような、測定領域に分 子流を誘導する事により行いうる。このことは静電場、例えば約1V/1μm の範囲 の電場強度を有する２つのキャピラリーの末端間で行いうる。本発明に従って、 １つ以上のトラップ分子が観測部分に入るやいなや観測領域内の電場内で該分子 を振動させることもできる（以下参照）。 本発明の装置の技術的な説明 ７．光学系 本発明の方法は技術的には焦点の結像特性に関して高い性能を有する顕微鏡光 学系を用いて行いうる。特に、励起光の発生前のレンズ系は色的にも構造的にも 補正したものでなければならない。高い開口数1.2N.A．以上を有するドイツ、オ ーベルコッケン、ツァイス社のNeofluarシステムが望ましく、カバーグラスまた は分離コート無しでも使用しうる。作用距離は0.17-0.9mmである。対物レンズは 水に対して補正してあり、最高作用距離で最高の開口数を提供する。油浸対物レ ンズは適していない。本発明に従い、光量は顕微鏡対物レンズの後ろにある対物 板にある共焦点ピンホール開口で制限される。 ８．レーザー光源 >200-1000nm の波長のレーザー光源として、特にアルゴン、クリプトン、ヘリ ウム−ネオン、ヘリウム−カドミウム並びに可変ダイオード・レーザー（赤から 赤外線）など周波数ダブリングの可能性を有する連続レーザーを使用するのが望 ましい。本発明に従って≧10MHz の高周波数パルスレーザーも使用しうる。 ９．レーザー強度 0.5mW のレーザー強度で観察容積内の色素分子の数パーセントを励起するのに 十分である。5mW のレーザー強度では励起分子の割合は50% となる。さらにそれ 以上レーザー強度を上げるのは光効率から見て適当ではない。 10．化学発光団 結合するのに適した化学発光団または蛍光色素には、蛍光分光学的検出法にお いて長時間使用しうるような多くの基本的色素構造物並びにそれらの色素のオリ ゴマーがある。色素としては標的分子との特異的な妨害相互作用に寄与せず、ま たはP 42 34 086.1（ヘンコ(Henco)等）に提唱されているように、核酸二本鎖に インターカレートしうるような特異的結合性を利用して特異的に使用しうる色素 が望ましい。 使用する色素は量子収率0.1-1 で吸光係数が約30,000から100,000 のものが望 ましい。 例えば疎水相互作用を防ぐように親水性残基を多く含むクマリン類またはロー ダミンＢ誘導体由来の色素、または二本鎖中にインターカレートしうるチアゾー ル・オレンジ基本構造に基づく色素が適していることが分かった。 本発明の測定法に関して、光消光（光安定性）に対する色素の耐性は重要なこ とである。しかし、先に述べたように、本発明に従って非常に小さい容積が使用 される場合、測定時間は約1000倍大きい領域を測定する場合に比べて数桁短くな ることから、測定性能に関して傑出した重要性を有するとは言えない。 11．三重項状態の意義 本発明では、色素は三重項状態を生成しないほうが望ましい。 色素を選択する場合、三重項状態を生成しにくい色素を選択することが重要で ある。三重項状態は化学反応の確率を増加し、シグナルを提供しないか、または 不都合な波長のシグナルを提供し、かつ、分子が再び励起される状態の一重項状 態に戻るまでの時間を長くする。 もし、標識するのに色素多量体、特に特定のクマリン誘導体のような親水性色 素に基づく色素を使用するなら、測定時間を有意に短くする事ができる。各測定 容積の数が多くなれば、少ない分子の測定領域の通過で十分な測定精度を得なけ ればならないことになる。 12．測定部分 第4 図にみられるように、測定部分はレーザー絞り光学系の対物レンズから10 0-1000μm まで接近していなければならない。最も単純な場合、この事は対物レ ンズ自体へ垂らし、分析する分子を含む液滴で行われる。このような測定システ ムは種々の試料間の汚染の可能性が高くなることから分析物が少ないときに限ら れる。カバーガラスおよび油浸を用いる従来の顕微鏡に相当する技術も使用しう る。本発明の方法は光学系から水性試料を離すのに水浸および非常に薄いガラス またはプラスチックシートを使用している。このシートは同時に平たいキャリヤ ーまたはキャピラリーの形で測定部分の下をシールするのに役立っている。 多くの生体高分子の進化的至適化の実験で起こるような大量の試料をスクリー ニングする目的では試料に向いた側を化学的に修飾したメンブレンも使用される 。望ましい修飾とは例えば核酸を固定ためのイオン交換性などの特異的結合性、 および／または抗体コーティングおよびキレート試薬特にNTA(ニトリロ三酢酸) またはIDA(イミノ二酢酸)によるコーティングなどのタンパク質に関する特異的 結合性を有し、標的構造に対する相互作用でこれらを分析するために高い結合定 数（k_ass≧10¹⁰）で金属キレートを介して表面に結合しうる(His)₆などの結合オ リゴペプチドを含むペプチドまたは組み換えタンパク質を選択的に固定するため の表面構造である。 13．分子トラップ 小容積エレメント内の単一分子の検出の可能性には、本発明に従い後に示され る電場を用いた分子トラップの使用がある。この種の分析は荷電分子などの電場 と相互作用する分子に対してのみ使用しうる。 14．検出 測定シグナルの検出はなだれ(avalanche)・ダイオード検出器の使用が望まし い単一フォトン計数器を含む蛍光顕微鏡の光学系で行うことが望ましい。例えば 、EG & G社のSPC-100 およびSPC-200 を使用することが適当であることが分かっ た。シグナル分析はデジタル・コリレーターまたはマルチチャンネルカウンター MCSを用いて行う。 方法および応用 15．分子の特性 相関法は直接３個の分子的特性：数(N)、並進拡散定数 D_tおよび回転拡散定数 D_rを明らかにする。後者の２つは分子の大きさと形（例えば半径、形および容 積）の関数であり、例えば酵素的切断または他のリガンドとの複合体の形成によ る分子の変化に関する情報を提供する。拡散に相関する拡散時間の測定も本発明 に従って迅速かつ高感度に実施されるので、分子サイズの分析および溶液中の 分子集団の分布の分析はクロマトグラフィーによる分離なしに本方法で行いうる 。 16．結合定数の測定 R.リグラー(Rigler)が示したように、互いに反応する分子の相関関数の分析に より、その相互作用が分子数N および特徴的拡散時間の重み付け因子を測定する ことで決定しうる。特異的反応の場合は常にそうなるが、反応速度定数の値が拡 散時間よりも小さい場合、相関関数は重み付けした拡散時間の総計で与えられる ： G(t)= 1 + 1 / N（X（1 + t /τ_x）^-1+ y（1 + t / τ_y）^-1） こでx、y およびτ_x、τ_yは分子X およびY の割合および拡散時間である。τ= ω²D。ωは試料容積の半径であり、D は拡散定数である。 反応速度定数が拡散時間よりも大きい場合、相関関数は G(T)= 1 + 1 / N（1 + 4 <D> t / ω²）^-1 ここで<D> = xD_x + yD_y。 もし、D_xおよび D_yが異なり、レセプターとしての大きい分子（タンパク質、 核酸、抗体）に対する小さいリガンドの結合は通常所謂不均一検定法で行われる 分子分離過程無しに簡単に行いうる。また、相当する関係も回転拡散係数又は回 転拡散時間も誘導しうる。高い測定感度はラジオイムノアッセイ技術(RIA)とし て知られているラジオアイソトープの感度を越える。これらは高い比活性で標識 したときのみ同様の効果を示す。本発明に従って遂行したときは、分子分離過程 および煩雑な校正を省くことができる。従って相関法は今日使用されているラジ オイムノアッセイの代替物となりうる。以上に示した技術に従い、均一相または 不均一相（固相に結合して）において測定すべき抗体と拮抗させて抗体への結合 を分析する蛍光標識抗原を放射能標識した抗原試薬の代わりに使用することがで きる。本発明の方法の利点の１つは測定法の感度を同時に増加できる一方で望ま しくない放射能を排除しうることに基づく。 17．酵素反応の生成物 酵素触媒が分子構造および分子量を変化させる場合、反応生成物の形成は分子 数および拡散時間の変化をもたらしうる。典型的な例には核酸の複製および切断 、タンパク質およびペプチドの切断があるが、触媒抗体の選択も挙げられる。 18．メンブレンおよび細胞における分子動力学 FCS 法を用いた粘性環境下での大きな分子の回転拡散を測定できるということ は細胞表面ばかりでなく、細胞内部での特異的レセプターの動力学の解析にとっ て特に重要である。同時に、標識したリガンドの結合はレセプターなどの細胞構 造物のところでの回転拡散および並進拡散を測定することで決定しうる。例とし てはニューロトランスミッターや成長ホルモンなどの組織因子ばかりではなくCa⁺² 等のカチオンリガンドも挙げられる。 また、本発明の方法は揺らがないか、または非常にゆっくりと揺らぐ分子に対 しても使用しうる。このことは、例えば非常に粘性の高い媒体中、ゲルマトリク スまたは組織中、固相を使用して、または非常に大きな分子複合体または細胞を 用いて測定する場合に対応する。 意外なことに、質量が大きいにも係わらず細胞でさえ水性懸濁液中で測定しう る。ブラウン運動および攪拌は、例えば測定容積内にそのレセプターを有するメ ンブレンを導入し、かつ色素標識の消光減少を介在することなしに再びそこから 出ていくのに十分な効果を有している。図式で示した第5 図は、本発明にしたが ったほぼ定常状態の分子測定を示している。例えば、長方形で示されているよう に、それらは固定化細胞上のメンブレン・レセプターとして存在しうる。座標軸 は本発明に従った定常状態の測定容積のに強制的相対運動による非揺らぎ分子の 分析を示している。これはレーザーの座標、測定容積の座標、または試料の座標 の相対的変化、またはこれらを組み合わせることにより行いうる。 揺らぎが強く制限されるか、または色素標識が定常的に結合している場合、本 発明では測定容積に対する揺らぎを強制しなければならない。この事は試料容積 およびそこに含まれる測定容積の強制運動（例えば振動、流れ）および／または 試料内の測定容積の位置座標の連続的または非連続的変化によって行う。この事 は焦点を変えること、および／または照射される容積エレメントの位置を変化す ることにより行うことが望ましい。固定化標識分子の場合、このように強制され た測定容積の位置座標に対する相対運動は、結合色素の「見かけの」並進拡散を 決定する。非固定化分子に結合する色素分子を区別するために、強制相対運動は 非固定化分子の運動よりもゆっくりしていなければならない。 本発明で示した操作はゆっくり拡散する複合体の並進拡散の時間が分析には関 係せず、むしろそれに結合した色素標識の絶対数または相対数が重要である場合 に可能となる。このことは、例えば細胞培養物または組織のレセプター結合定数 を測定する場合に相当する。 本発明の方法で特に利点を示すのは分子および／または細胞運動の測定である 。このような測定は技術的、生物学的および医学的に興味深く、また、まだ広ま っていないような特殊な技術を使用することによってのみ可能となる。本発明に 従った実施例を以下に示す：受精能力測定に関する精子の運動の測定、マクロフ ァージの運動、収縮要素の活性、天然または人工膜中の膜タンパク質の運動、活 性または能動輸送分子の運動。このことは細胞、分子複合体または問題の分子を 標識抗体または抗体誘導体などの特異的色素標識リガンドで標識すること、また は色素標識で直接標識することによって行うことが望ましい。 本発明の１つの重要な利点は、とりわけ細胞または天然または人工ベシクル構 造体上に存在する既知のレセプターへの既知の蛍光標識リガンドの結合による活 性物質の薬学的スクリーニングの可能性にある。現在、レセプター結合活性物質 の探索における研究の望ましい方向には、第１にプロテイン・キナーゼ・レセプ ター群などの特定のレセプターのクローニングおよびそれらを個々に発現する事 が含まれる。ついでこれらの標的構造を例えばELISA プレート等に個々に固定化 し、ELISA 検定法を用いて分析する。これを行うためにはかなりの量の研究能力 および人員が必要とされ、かつ、クローニングされ、個々に発現されたレセプタ ーがその機能または特異性を変化または喪失する危険が伴う。 第1 図および第2 図に見られるように、本発明ではレセプターのクローニング を完全に省くことができる。レセプターは特異的リガンド相互作用に関する相互 の結合定数の範囲内の濃度で使用しなければならないので、細胞または天然また はクローニングした細胞の断片を使用することができる。また、このことは高い 反応物濃度で起こりうる他のリガンドまたはレセプターとの非特異的相互作用の 危険を抑制しうる。従って、他のレセプターの存在はこの検定を妨害しない。 単一の標識リガンドを使用する検定で種々の細胞／細胞系列を使用する場合、 レセプターの機能的挙動の差も結合リガンドの変異体との競争を通して区別しう る。異なる組織における１つで同じエフェクターに関して区別されたレセプター 機能は稀に起こる調節メカニズム（例えば,TNF、キニン）ではないように考えら れる（第2 図参照）。この効果は１つのレセプター型を認識する選択的リガンド 変異体を使用することにより薬学的に用いることができる。 第26-28 図は、 （ｉ）細胞外膜のレセプターとの会合に関する蛍光標識したリガンドの挙動の測 定、 （ii）結合および遊離リガンドの区別、および／または （iii）細胞質ゾル中を通過する場合のリガンド運動の測定、 に関する本発明に従ったFCS 法の応用を示している。 また、（ｉ）乃至（iii）のテーマは、とりわけ標識分子種の運動の三次元的イ メージ化を行いうるダイナミック・レーザー・スキャンニング顕微鏡法において 本発明を応用する例となる。得られる特定の分子濃度の分布から、この分子の局 在化に関する結論が引き出される。また、この方法は例えば区画化された標的分 子との会合（例えばウイルス核酸とのセンス／アンチセンス相互作用）等の各細 胞または組織区画中の分子状態の評価を可能にする。 （ｉ）乃至（iii）はラット由来の細胞結合レセプター（EGF レセプター）とヒ トの上皮成長因子(EGF)で例示される。EGF レセプターを有する細胞は各腫瘍組 織に由来するラット膀胱細胞NBD2である。この細胞をPBS（リン酸緩衝液）中シ ャーレ上に表面固定化する。これらを集密化単層に到達するまで標準培地で増殖 させる。培地にはテトラメチルローダミンで標識したEGF が含まれている。励起 用には500 nmのアルゴンレーザー(0.5mW)が選ばれた。遊離のEGF 因子の回転拡 散定数（τ_Dfree）は0.145ms である。その濃度は6nM であった。第26a 図は遊 離EGF の自己相関関数を示している。 細胞単層との30分間のインキュベーションの後、測定容積が細胞外膜を含む場 合第26b 図に見られる自己相関関数が見られた（第5 図参照）。測定で検出され たリガンドの88% は関連する拡散時間τ_Dcomplex=14.54msを持つレセプター結合 複合体中に存在する。この時間は細胞膜中のレセプターの拡散に関係する量であ る。拡散時間τ_Dfree=0.145msにはリガンドの12% が含まれている。１つの空間 要素中には約１つのEGF レセプターが存在する。関連する膜表面は0.5×10^-8cm² である。30分間の洗浄後、第26c 図に示される自己相関関数が見られ、そこから 以下のことが見て取れる：測定容積当たり約0.5 個のEGF レセプターが高い親和 性で結合しているリガンドを保持している。 もし、FCS 測定容積が少なくとも大部分が細胞の細胞質ゾル内に有るなら、第 27図が得られる（細胞質ゾル中のEGF）。進入したEGF の38% は移動中に妨害を 受け（レセプターへの結合または粘性の高い媒体の影響による）（拡散時間τ=3 .3ms）、またEGF の62% が遊離因子と同様の移動度を有している。 第28a 図はM13/pUC(-21)プライマー（5'-TGACCGGCAGCAAAATGT-3'）の配列を有 するDNA オリゴヌクレオチドと対応する相補的配列を含むバクテリオファージM1 3 のウイルス一本鎖DNA との相互作用を示している。このオリゴヌクレオチドは 5'-C₆位置にボディパイ（モレキュラー・プローブ社）で標識してある。会合反 応の時間経過は40℃の溶液中、本発明に従って測定された。この溶液には10nMト リス緩衝液（pH7.5）および0.18M 塩化ナトリウム中の50nMのオリゴヌクレオチ ドおよび50nMのM13mp18(+)DNA が含まれている。連続的自己相関関数の変化は会 合の速度論を明らかにする。自己相関は、0、0.5、1、2、4、8、16、32、64、12 8、192 および256 分後に測定した。遊離プライマーの拡散時間は0.17msであり 、複合体形成後には2.9ms であった。第29図は会合した複合体中のプライマーの 割合を実験的に明らかにする会合経過を示している。再会合速度は0.07min^-1で ある。 第28b 図は標識したプライマーDNA の自己相関の例である。第28c 図は遊離お よひM13 DNA 結合プライマーの混合物の自己相関関数を示している。 測定領域の細胞は、インサイチュウ(in situ)および基本的に非破壊的に分析 できる。特にこの事は薬学速度論的研究に関連する。 19．反応速度パラメータ 秒の単位の拡散時間を測定できることは、高い会合定数の２分子の速度論的相 互作用の解析および再結合および解離速度定数の測定を可能にする。この事は抗 原／抗体、リガンド／レセプターおよび同様の相互作用などの高い生物学的特異 性を有する相互作用の特性に対して特に興味深い。10^-6s^-1迄の定数を有する特 に遅い過程の解析は本発明に本質的な自己校正の利点により簡単に行われる（第 19図）。 20．単一分子の検出 高感度の本測定法により少なくとも１つの検出レーザー光を通過する単一の分 子が観測される。≦1 μm の出口を有する特別なガラスピペットの形をしたいわ ゆる「分子ロート」を用いることにより、単一の分子を直径1-5 μm のレーザー 光中に流れにより導入しうる。電場の作用により、ブラウン運動が制限され、各 分子はレーザー光の最高強度の部位に通される。反対側の検出器および液浸光学 系を伴う光学ユニットの配置が良好な光子流並びに全ての空間方向に発せられる 発光の検出精度および効率を保証する（第６図）。例えば、この配置はエクソヌ クレアーゼ的分解による単一のDNA またはRNA 分子の配列分析（J.H.ジェット(J ett)等、US 4,962,037）ばかりでなく、標識および荷電を提供された単一分子の 検出にも有用である。 21．定常または振動場における電気的分子とラップを用いた単一分子の検出 また、イオン化した単一分子を電場内の強制並進により観察域に導入しうる。 別に、測定容積内で単一または反復並進を強制することもできる。これは第6 図 に図示した配置で行うことが望ましい。分子流は中央に観察域が存在する大きな 試料容積を通過する。定常的または振動的な電場により観察域内を荷電分子を移 動させることができる。このようにして分子を表面的に絞ることができる。この 「分子フォーカシング」は定量的に検出すべき分子が全測定容積内に１つまたは 数分子しか存在しない場合に重要となる。 これを行うために、試料はB.サクマン(Sakmann)およびE.ネハー(Neher)が示し たように２つのマイクロキャピラリーの出口の間にマイクロドロップとして固 定するのが望ましい。このキャピラリーはキャピラリーの出口で水性バッファシ ステムと接触するように導電性の金属層で、望ましくはクロムで下塗りした上に 金で蒸気コートすることが望ましい。測定エレメントは試料液滴内にあり、顕微 鏡の対物レンズは液滴と直接接しているか、または液滴がシートで対物レンズで 離されている。 一度、キャピラリーの末端を離れた後、単一分子または分子複合体が検出され れば、速度論的データが得られる。小さい容積中での場または温度ジャンプを技 術的に実現するのは難しいことではない。もし、反応複合体がウェン（Wien）効 果を示すかまたは十分高い反応エンタルピーを有するなら、これらのパラメータ は、例えば反応速度定数を測定するための緩和法に使用することができる。 測定容積内での核酸などの荷電分子のキャリヤー・フリーな電気的濃縮を伴う 単一分子の検出の原理は、非常に希薄な溶液中の単一分子の分析に非常に重要で ある。特に以下に示す２つの特徴が重要である：本発明に従う10-1000 μｌもの 大量の試料容積から10^-9μｌの測定領域への１つまたは数分子の能動輸送は10¹⁰ から10¹²倍の濃縮を意味する（第20図、第21図）。 1ml 当たり１つの分子とは約10^-21Mの濃度に相当する。先に述べた濃度は測定 領域中で最終濃度10^-9Mとなる。DNA 分析のセクションで示したように、同時に 濃縮される色素標識プローブとのハイブリダイゼーションを速い反応速度で行う ことができる。 このことは診断において傑出した進歩を意味する。このように、これまで実現 できなかった感度の診断が、特に酵素依存の増幅操作やそれに伴う増幅産物によ る汚染の危険などの問題を避けて行うことができる。このことは細菌およびウイ ルス診断において特に重要である。 もし、ウイルスまたは細菌が希薄溶液中に存在し、これも負に荷電している過 剰の共存核酸で汚染していないならば、分析は汚染核酸の予備的分離無しに行い うる。このことは、例えば非常に少量の生物物質を遺伝的に分析する法廷化学分 析の場合にあたる。臨床分析では精液、尿または血漿などの体液の無細胞上清に 関する分析となる。 大量の共存核酸は濃縮過程およびハイブリダイゼーションを妨害する。しかし 、 核酸は特異的ハイブリダイゼーション法などにより予め濃縮する事ができる。こ の事を行うためには特定の核酸を大容量の試料から、例えば望ましくはプローブ と相同的ではない逆鎖プローブを結合したモル過剰量の固相を添加することによ り抽出し共存する汚染核酸から分離する。続いて核酸を溶出し、本発明に従って 測定容積内でこれらを濃縮する。 基本的にその他の分子も本発明の電気的トラップにより測定領域内で濃縮しう る。核酸の場合の様な分子の本質的性質としての荷電、または培地条件による荷 電、または特定のリガンドとの反応による荷電のいずれかのターゲット分子の荷 電性が必要となる。 本発明の望ましい操作において核酸以外の検出反応における標識リガンドまた は特異的色素標識がプローブを解析でき、テスト分子は特異的複合体形成が既に 起こった後にのみ電場による測定領域への輸送が起こる。本発明に従い、この事 は荷電していないか、またはターゲット分子およびレセプター・ターゲット複合 体および測定領域で濃縮されるリガンドと異なる荷電を有する場合でさえ非複合 体化プローブで行うことができる。 第30図は双極子トラップ中の荷電分子の動きを示している。レーザー照射容積 エレメント内の水中の負に荷電したローダミン標識したdUTP分子の濃度および振 動の変化を電場強度10kV/cm および周波数4Hz の振動電場で示されている。観察 の光学軸は電場勾配に対して直角である（第6 図参照）。測定領域内の分子を濃 縮する効果は明白である。この濃縮効果は電場が解消され、分子が拡散で観察領 域から離れるときに解除される。第6 図に示したマイクロキャピラリーを逆にす ることでも同様の結果が得られる。 第31図は水中の単一のローダミン6G分子の光子シャワーを示している。光子シ ャワーとは分子がガウス分布測定領域内に存在する間に受ける検出される光子の 総量を意味する。従って、単一の発色団を有する単一分子の信頼しうる検出の可 能性が証明された。第31a 図：2.5×10^-11M；第31b 図：4×10^-10M。チャンネル 時間は拡散時間と同じ4×10^-5sec ならびに ガウス分布測定領域0.24flであっ た。 22.PNA（タンパク質様核酸） 本発明に従う特に適当な分子とは、荷電していないか、またはそのリン酸バッ クボーンの荷電と反対の荷電を通して複合体の静電的安定化に寄与していること から核酸に結合する挙動が特にしっかりしている分子である。ハイブリダイズし うる分子が必ずしも核酸の化学的特徴を有している必要はない。いわゆるPNA 分 子が特に本発明に有利に利用しうることが示されてきた。 比較的長鎖の核酸ターゲットの場合、このことは電荷および電気泳動の分離挙 動を決定し、例えばプローブ分子の反対電荷を過剰解消してしまう過剰負電荷の ターゲット分子によって成し遂げられる。このように複合体化したターゲット分 子をハイブリダイゼーションの完結後測定領域内で選択的に濃縮しうるが、過剰 の標識プローブ分子は測定領域から除去される。 また、例えば、本発明の方法は酵素的核酸増幅操作無しに、血清約100 μｌ-1 0 ml（10^-20〜10^-22Mに相当する）中の単一ウイルス粒子の直接検出を可能にす る。 実施例として血清試料中の核酸による検出では、以下の必要事項が満足されなけ ればならない： - 上述した量の血清にはハイブリダイゼーションしうる核酸（DNA またはRNA） を含む単一のウイルスが含まれなければならない。 - その溶液には蛍光標識したテスト試薬として本発明の特異的核酸プローブを含 まなくてはならない。プローブの長さは、血清中には高モル過剰量のRNA 分子が 存在することからターゲット配列に対して高い特異性が保証されるように選択さ れなければならない。 - プローブの長さを選択する場合、相補的RNA またはDNA に対する結合の安定性 を考慮しなければならない。可能なら解離速度は10^-5sec^-1以下であるべきであ る。このことは遊離のプローブ分子が除去され、即ち推定濃度10^-20Mでの平衡が 解離分子側に完全に偏った場合でさえも１日はハイブリッドが安定に保持される ことを意味する。本発明に従うと、このことは後に電気泳動で遊離プローブが望 ましくは10^-20M に希釈される場合に起こる。 - ハイブリダイズしたとき、プローブは会合およびハイブリダイゼーションが秒 から分の範囲で起こるような高い濃度で存在しなければならない。本発明の場合 、以下に議論する物質が会合を促進するためにハイブリダイゼーション媒体が添 加されるならば低い濃度でも使用しうる。 - プローブは少なくとも本発明に従う１つ、望ましくはそれ以上の蛍光色素に化 学的に結合される。遊離のプローブの電気泳動移動度は複合体を形成したプロー ブの移動度とは異なる。この事は単にサイズの差または構造の差または本発明に 従って修飾した中性または陽性に荷電したプローブ誘導体を使用する事で行いう る。 本発明の分析は望ましい態様で示す特定の電気泳動ユニットと組み合わせた本 発明で請求している装置で行われる。 それにはキャピラリーの出口（直径約10^-3mm）を有する電気泳動セルが含まれ 、本発明に従う単分子蛍光装置（FCS）と組み合わされる。 第12図は電気泳動セルの望ましい態様を模式図で示してある。それには（1） 分析する試料および／または洗浄溶液の添加／収集を目的とした少なくとも１つ の出口；（2）壁電極；（3）リング電極；（4）ネハー・キャピラリー；（5）電 極としての金メッキチップ；（6）液滴出口；（7）レーザー光線が含まれる。 電気泳動セルはプライマー溶液が出来るかぎり正確な量で添加される測定試料 で満たされている。壁電極とリング電極の間の電圧は例えば分の範囲内でリング 電極中のプローブおよびハイブリッドの濃縮が起こる時間に渡って供給される。 その後、壁電極とキャピラリー・チップの間に高電圧がかけられることが望まし い。この時点から遊離プローブおよびハイブリッドの分離は電気泳動で出来るか ぎり適正に行えるようにキャピラリーの長さが選ばれる。遊離プローブはハイブ リッドが測定にかかる時間とは明らかに異なる時間に電極の出口に出現するので 、この時点で未結合のプライマーの濃度は十分に希釈されている。この溶液は液 滴として出てくることが望ましく、その結果逆拡散が起こりえなくなる。もし可 能なら２つの時間：T_s、遊離プローブが出現してからの時間、および T_z、ハイ ブリッドが出現してからの時間は固定しておく。ハイブリッドは所定の時間にマ イクロドロップとして出現し単一の分子蛍光として検出しうる。また、キャピラ リーから出口までの光学的測定もできる。 もし、遊離プローブからのシグナルが大きく揺らいでいるなら、単一分子の測 定は困難である。１ml当たり１個の分子は10^-20から 10 ^-22Mに相当する。しか し反応時間のために、会合のためのプローブ濃度は約10^-10Mでなければならない 。この場合、本発明の電気泳動との組み合わせが未分離の混合物の種々の測定よ りもシャープな分離を可能にする。さらに、生成されるハイブリッドは正確に計 算できる時間に、≦10^-12ｌの容積内に出現し、これは本発明の方法で検出可能 である。適当な蛍光標識を選択する事で蛍光を至適化する事ができる。 23．分子トラップとの組み合わせが有る場合、又は無い場合に単一分子ソーティ ング法に関して目的の標識複合体を大量に選択するための装置。 分子、分子複合体、ウイルスまたは細胞が目的分子としてFCS で認識される場 合、直接的大量濃縮できる可能性がある。これは、電気泳動により各分子が測定 直後の限定された時間、限定された場所に存在し、そこで電気泳動的に分離しう ることが前提となる。 電場での移動度の測定、キャピラリー電気泳動での実時間測定、相関の実時間測 定、シーケンシング 例えば、キャピラリー電気泳動法を用いた電場での分子、または分子複合体の 移動度の測定により、その分子の性質に関する情報が得られる。従って、例えば 蛍光標識を用いたエドマン分解産物としてのタンパク質またはペプチドのアミノ 酸はこの電気泳動の移動度により測定しうる。近年、ペプチドおよびタンパク質 の配列分析は非常に重要になってきた。現在市販されている気相分析器における 分析量のタンパク質の使用は重要な進歩である。このようにして、二次元ゲル（ オファーレル・ゲル）の単一スポット由来のタンパク質はシーケンシングしうる 。 この方法の効率は引き続き行われるキャピラリー電気泳動の評価における分解 産物の分析的測定の感度が増加できれば、さらに向上することができる。従来の 検出法と比較して、実時間測定（実時間相関）と組み合わせたFCS によるピーク 測定で驚くべき感度の高さが達成できる。このように、キャピラリー電気泳動で 得られる分析量のペプチドおよびタンパク質で配列決定するのに十分である。当 初の量として、単一細胞はそこに含まれているタンパク質の配列を分析する(K) に十分な量である。一方、この方法の感度は測定すべき2Dゲル電気泳動で分離し たタンパク質、ペプチドまたは分解産物の実質的に長い配列の構造に対しても有 効である。 PCR などの酵素依存の増幅反応ではかなりの付加的ステップ無しにはこのよう な感度は達成しえない。高い増幅を受けた生産物による汚染に関する酵素依存の 増幅に関する問題は本発明の方法では発生しない。 電気泳動法と組み合わせた本発明の方法は、核酸への応用に限定されない。タ ンパク質およびタンパク質の複合体または低分子化学リガンドも荷電キャリヤー が提供され、本発明の分析が可能となる。例えば、負または正に荷電したポリペ プチドはそれらを非変性の条件で電気泳動にかけるため組み換え法で調製した抗 体に結合しうる。例えば、ウイルス当たりに大量に生成されるか、血清中に単独 で分泌される表面タンパク質の抗原分析が可能な場合、低いウイルス濃度でも検 出が可能である。 単一分子を検出するための電気的トラップの変化には双極子の代わりに四極子 を組み込むことがあげられる。四極子面の振動場を適用することにより、適当な 電場強度での荷電分子の四極子領域からの熱的拡散を防ぐことができる。もし、 本発明に従って更に２つの電極を四極子の上下に配置すれば（六極子）、適当な 電圧を外の六極子電極と四極子の平均電圧の間にかけた後に荷電分子は四極子の 振動場に動き、そこで濃縮される。 六極子電極は２つの顕微鏡対物レンズの金属被服ガラス表面で形成しうる。も し、単一分子が約40μｌの六極子容積内に存在するなら、これは4×10^-20Mの濃 度に相当する。六極子電極と四極子面の間（距離約1 mm）に100 V の電圧をかけ ると、核酸分子は約1 秒以内に四極子面に移動する。四極子面に捕まった分子は 約6fl の容積内に存在し、これは約2.5×10^-10Mの濃度に相当し、濃度は6.4×10⁹ 濃縮したことになる。その存在は分子数（N=1）およびこの分子に特徴的に拡散 時間を測定することにより証明される。 四極子および／または六極子に実際にかけられる電圧および電位差は分析溶液 のイオン強度に依存する。 種々の要素が四極子面の異なる空間位置を示す、位置感受性検出器を使用する 場合（なだれ型フォトダイオード検出器）、検出器と四極子の電極間のフィード バック配置により、電場勾配は分子が常に四極子内の固定した位置に留まるよう に調整される。この位置は各検出器によって規定される。 24．電気的トラップ 簡便のため、上述の「電気的トラップ」は測定部分を通る共通軸上に有る２つ の正（負）に荷電した極（電極）の間の中央に測定部分を配置することより実現 される。この軸と直角の面に、少なくとも２つ、望ましくは４つの電極があり、 その間に振動電場が生成される。電極はそれらが、もしくはそのペアが互いに向 き合うように配置される。これらの電極に回転振動電場をかけ、その中に正（負 ）に荷電した分子を置く。振動電場に垂直な２つの電極の荷電のために分子はこ の振動電場からの動きを制限される。先に紹介し、後により詳しく説明する二重 顕微鏡を使用する場合、電極は２つの相対する対物レンズのサポートとなること が望ましく、その共通の焦点中に測定部分が設定される。 ルーチン分析に「電気的トラップ」を使用する時、ターゲット分子複合体は観 察するために比較的大容積の試料から（10-100μｌ）非常に小容積の測定領域に もってくることが重要である。これを行うために、簡便性のため本発明では荷電 ターゲット分子は大きなポテンシャル勾配を越えてゼロポテンシャルの容積エレ メントに運ばれ、その内外では例えば固定および／または測定領域の運動制御の ため、例えば四極子等の多極電場で制御される。このことは試料を受け取る数ミ リメートルまたは数センチメートルの長さのキャピラリーで行われることが望ま しく（第20図、第21図）、その一端には例えば+100（または-100）V の電圧がか けられ、もう一端は0Vにアースされている。アースされている電極はピンホール を有し、その後ろには例えば低電圧の四極子振動電場がかけられている（第20図 参照）。電気泳動移動度μ=ca.10^-4から10^-6cm²/Vs に従い、ターゲット分子は ピンホールに迅速に移動し、幾何学的に隣接する四極子電場へと動きつづける。 もしキャピラリー電気泳動で見られるような電気的移動に関して電気浸透効果が 重なることが望まれるなら、キャピラリーは例えばガラスまたは石英で作成する 。 別に非荷電の表面を有するテフロンで作られたキャピラリーは電気浸透効果が実 質的に排除される場合に使用しうる。 25．大量の試料集合体における変異体スペルトルの適応度の測定 進化論的スクリーニング検定法において、本発明の方法は選択する分子（タン パク質、ペプチド、核酸、抗体）へのリガンドの結合を測定するのに有用である 。本方法で達成される高い測定感度は、特に、特定の生理学的または生物学的に 興味のある非常に特異的な相互作用の分析を可能にする。その相互作用はリガン ドまたは標識したリガンドの結合または未標識のリガンドと標識したインヒビタ ーとの競争を通して測定される。このように変異体スペルトルの適応度測定は大 容量の試料集合体から行うことができる。 適応度パラメータには、テストの特定の媒体条件下での - アフィニティー・パラメータ - 速度パラメータ - 酵素的パラメータ がある。 26．遺伝子型／表現型結合のための試料キャリヤーシステム 本発明の分析および表現型変異体の大容量試料集合体の評価において、対応す る遺伝子型、例えばコードしているプラスミドまたはコードしているmRNAは、選 抜されて進化過程を続けることが重要である。この問題は決して些細なことでは ない。この過程はより選択的に選抜が行われることにより、より詳細にいうと、 対応する遺伝子型が不要な表現型をコードする配列の混入無しに単離できれば、 成功する確率が高くなる。 27．テスト・セル 中程度の試料数（<10,000）には固定して空間的に分離した容積エレメントが 採用され、これを以後テスト・セルと呼ぶ。これらはPCT/EP 89/01320、PCT/EP 89/01387、PCT/DE 91/00082、PCT/DE 91/00081、PCT/DE 91/00083、PCT/DE 91/00704 に示されているシステムと同等のシート・システムの一部とすること ができ、各容積エレメントにはシールされたシート・エレメント内に試料が含ま れている。シールされたエレメントから同定された表現型はコードする遺伝子ま たはmRNA転写物に従って直接的なメカニカルな方法で単離しうる。 28．マイクロコンパートメンタリゼーション また、超微量試料容積の光学的測定および評価を含む本発明の方法は、非常に 少量の試料を通常では取り扱えないマイクロコンパートメンタリゼーション（微 小区分化）することを可能にする。このことは正と同定される遺伝子型を得るた めに各コンパートメントを充填および選択的に空にすることに関して達成される 。 マイクロコンパートメントは特許出願DE 42 37 383.1に示されている平行に配 置されたキャピラリー・エレメントのような規則的および非規則的多孔性キャリ ヤー、またはコントロールド・ポア・ガラスなどの多孔性物質または容積エレメ ントがキャピラリー内で一次元的に分離しているが、そのペアは直接接触してい るキャピラリーからなる板状キャリヤーから構築しうる。 特に望ましい形のマイクロコンパートメンタリゼーションを第4 図に示した。 光学的に透明な平板キャリヤーの下の、各々の表現型および遺伝子型を含む組み 換えまたは天然の細胞または人工ベシクルの形で分析される試料中に存在する容 積エレメントが使用される。別の態様では、容積エレメントはキャリヤーに適用 している間またはそれ以後に設定される。ゲルまたはベシクル形成ポリマー、特 にカプロラクタム誘導体ポリマー等の熱可塑性構造に基づくポリマーが望ましい 。 この応用は、先ず、分離した水性容積エレメントを生成するポリマーの分離ま たはピエゾ制御のマイクロディスペンサーを用いた微分散液滴の適用による均一 溶液から行なわれる。 これまで述べてきたように、細胞の内容物も分析することができる。例えば、 細胞を先に説明したベシクル構造で包み、後に高温で分解することができる。こ の場合、ベシクル中に含まれ、分解した細胞の内容物を伴う反応分子又は分子複 合体を含む溶液の、少なくとも部分的混合が起こる。反応分子は本発明のFCS 法 で検出および定量しうる細胞成分との特異的相互作用または反応を行う、例えば 核酸プローブ、酵素またはタンパク質である。この技術はインサイチュウ・ハイ ブリダイゼーションまたは細胞特異的タンパク質染色と同様の技術である。 また、K.ヘンコ(Henco)等、DE 42 37 381.6の出願に示されているような核酸 および分析する表現型分子構造の同時固定のためのキャリヤーも遺伝子型／表現 型の結合を行うための反応キャリヤーとして有用である。 もちろん、遺伝子型をキャリヤーのX/Y 位置に限定する、いわゆるAFFYMAX 技 術の範囲にあるS.フォダー(Foder)等に採用されたキャリヤーも使用しうる。 29．選択された表現型フォトマーキング 各容積エレメント内で本発明にしたがって選択された変異体の指定およびマー キングは示された分析光学系を用いることによる位置の光学的マーキングが望ま しい（第7 図）。このことはキャリヤー表面の光活性化可能なコーティングが励 起され、例えば選択的脱色により簡単に認識される反応産物を生成しうる波長の 光を反射することで行いうる。もし、相関分析が分析される各容積エレメントの 所定の値を示すならば光信号が活性化される。 ここでは従来の光反応性コーティングを使用しうる。これもレーザー光源が望 ましいが別の光源が使用されるか、また分析に使用しているレーザーを使用する こともできる。測定と光活性化による位置のマーキングの分離は、例えばマーキ ング反応には二倍周波数を使用することで行いうる。また、望ましいエレメント のX/Y 位置は電子データ蓄積により収集しうる。 キャリヤー上の位置のマーキング後、望ましい核酸が対応する容積エレメント から、例えば機械的方法で得られる。 30．選択された表現型および遺伝子型の光活性化 選択された容積エレメントをマーキングする代わりに、第7 図に従う対応する 遺伝子型をマーキングする事が本発明では特に有用である。 本発明に従う以下に示す幾つかの代替法が望ましい： （1）容積エレメントの表面構造体への核酸の光活性化結合、 （2）核酸特異的リガンドの光化学的活性化、 （3）選択されたもの以外の全ての容積エレメントの光化学的不活性化。 代替法（1）では、二本鎖インターカレート試薬として360 nmの光照射で核酸 両鎖を互いに化学的に結合させるソラレン（psoralen）誘導体を使用しうる。こ のようなリガンドは例えばキャリヤー表面に化学的に結合することができる（第 8 図）。 このように十分な数の表現型コードプラスミドをスクリーニングの間にポジテ ィブに選択された表面セグメントに結合しうる。続いて、固定されなかった核酸 を全て洗い流す。選択された核酸は直接表面上での酵素依存増幅反応に供される 。 別に、その核酸はソラレン結合の可逆性を利用して回収しうる。このことは、 例えば260 nmの光で行いうる。代替法（2）では、核酸結合リガンドは、次に生 成が可能で、かつ、望ましくない核酸を分離しうる別の分子に結合しうる。この 事は、DNA またはRNA 認識リガンド、特にビオチン、アビジン、スカレプトアビ ジン、免疫グロブリン、オリゴペプチドまたはオリゴヌクレオチド等のアフィニ ティー・リガンドに結合した光活性化可能なソラレン誘導体またはインターカレ ーティング色素を結合することにより例示される。 第8 図に見られるように、これらの化合物をポジティブに選択された容積エレ メント由来のDNA またはRNA と光誘導的に化学結合した後、全ての容積エレメン ト由来のDNA および／またはRNA を一緒に精製し、また、選択基準を満足しなか った核酸からそれらを同時に分離することが可能となる。分子は疎水クロマトグ ラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィーまたは表面がアダプター分子の リガンドに結合する適当な性質を有する磁性粒子で行うことが望ましい。このよ うな特異的結合の望ましい例には、オリゴ- dT/ オリゴ- dA、アビジン- ストレ プトアビジン／ビオチン、NTA-IDA/(His)₆および同様の既知複合体形成試薬があ る。 次のステップでは、このようにプールされた精製核酸を直接酵素依存増幅反応 またはcDNA合成に使用することができ、または先ず光化学的に誘導した結合の逆 反応でリガンドから脱離することもできる。 本発明では、分析の選択基準に満たない核酸を選択的に不活性化することも考 えうる（代替法（3））。このことはソラレン等のクロスリンク物質を用い、ク ロスリンクした構造ではもはや連続的酵素反応で増幅されないようになることで 行いうる。しかし、この方法の欠点はポジティブに選択された容積ユニットに対 する濃縮因子が逆に影響を受けることから、不活性化は完全に行われなければな らないということである。代替法（1、2）において、濃縮の収率はたいして重要 ではない。酵素依存増幅法により、非常に少数のコピーも本発明をカバーする程 度に濃縮することができる。しかし、ほとんどの応用に対しては、ポジティブに 選択された容積エレメント由来の核酸の割合が出来るかぎり大きいほうが有利で ある。このことは、例えば分析で考えられている容積エレメントよりも大きい容 積エレメントを光学系が照射することで達成される。 31．フラクション分析／フロー・インジェクション分析／GC/MS カップリング 分析／調製分離法とカップリングしたフロー・インジェクション分析は、活性 物質を発見し、または化学的または酵素的に生ずる擬種を至適化する(DE 43 22 147およびWO 92/18645)緩慢な化学的または生化学的反応の方法に本発明の方法 をカップリングする上で特に重要である。 先に示したように、本方法は数に関して複雑であり、また進化過程で予備的に 発生する分子集合体の解析および評価に特に有用である。しかし、この事は別に しても分子多様性を有する複雑なシステムの機能的解析はかなり重要である。多 様性は複製メカニズムを通して進化システムだけで発生するのではないのと同様 に、サブポピュレーションのコンパートメンタリゼーションは細胞またはベシク ル構造でのみ生ずるのではない。 合成化学において種々の分子型の非常に複雑なシステムが故意に、または無作 為に生成しており、所定の種類の複雑性を選択的に生成しうる。微生物または植 物は種々の二次代謝物を合成し、そこから多量の医学的活性物質が誘導された。 周知のようにHPLC、FPLC、ガス・クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー法 を使用して、このような化合物を効率的に分離および単離することができる。 本発明の方法は核酸またはタンパク質等いわゆる複製系由来の変異体の平行分 析を行うばかりではなく、化学的または代謝的に複雑な混合物由来の変異体も分 析する。従来、この操作は、先ず複雑な混合物を個々のフラクションに精製し、 これらを化学的に分析、および／またはその構造を解析し、可能ならば純粋な形 で個々に生物学的検定することであった。 現在、本発明の方法を用いることにより、例えば薬学的検定を行うために当初 分析的に少量しか存在しなかったフラクションまたは個々の物質を分取して使用 することが可能である。本発明の方法の望ましい態様では、得られたフラクショ ンを直接FCS 検定に連結することができる。FCS 検定において各問題にポジティ ブに応答する以前に、個々の物質を生産することは省略される。現在行われてい る活性物質に対するブラインド・スクリーニングは活性物質を含むフラクション を選択的に調査することで置き換えることができる。 材料の複雑な混合物中の機能性化合物の分析は薬学において厄介な作業である 。第１に、すでに述べてきた微生物および植物由来の天然物の複雑な混合物が知 られている。日本の研究所および企業は、最初の抗生物質を導入したことから各 々の新しい検定法においてスクリーニングに導入しうる新しい構造の精製物質の 拡張バンクを持続的に確立していくことによっては追いつくことが困難である他 の国に対して、天然物質をスクリーニングする上でリードしている。この事は、 これまで知られている活性構造の二重開発を意味する反復検出が回避されること から、生物を培養するよりも単純である。 その利点のため、本発明の方法は本操作を断念することができるが、個々の分 子が実質的に純粋物質として回収されることから非常に拡張されか、複雑な混合 物の分析も可能である。単一の微生物は千個以上の複雑な構造の二次代謝物を合 成しうるが、そのいくつかは少量として存在するのみで抽出物の全混合物の分析 ににおいてその機能で同定する事は出来ないことを知っておかなければならない 。本発明では微生物由来の物質の混合物または幾つかの微生物または植物抽出物 の混合物を先ず、例えばクロマトグラフィーで分離し個々のフラクションについ て分離マトリクスの終わりにあるキャピラリー中、望ましくは「オン・ライン」 で機能化合物の存在を検定する（第9 図参照）。 以後第9 図を説明する。本発明によりクロマトグラフィーによる分離を組み合 わせて複雑な物質混合物を分析しうる。クロマトグラフィーによる分離後、標識 した参照分子を連続的に、かつ一定濃度でフラクションに添加し、さらに、これ に特異的結合ターゲット分子を一定濃度で添加する。第1 図に示したように、各 濃度で約分子の50% が複合体を形成し、その結果分離された混合物由来の妨害物 質を最高感度で検出しうるように各濃度を選択する。 その後、合わせた試料はキャピラリー・フロー管を通して検出ユニットに入る 。このフラクションは、目的の結合平衡を特異的にシフトするかどうかを分析さ れる。 例えば、複雑なシンソン(synthon)混合物を使用したとき、アルキル反応にお ける多様な置換または非置換アルキル残基の混合物も上述のように分析的にカバ ーしうる。従って、各反応ステップ後、反応混合物から形成される化合物を分離 してその特性を調べる必要はもはや無い。 望ましい態様（第9 図）では、混合物をレセプターを含む溶液に添加する前に 、先ず各フラクションに妨害を分析する物質の部分標本を添加し、競争反応を測 定することができる。別に、若しレセプターが既に占有されているならば、遅い 解離速度定数は置換反応の検出を複雑にする。遅しルセプター置換反応は、時間 変化、即ちk _dissの測定を可能にする。 32．ターゲット分子との物理的相互作用に関するパラメータの大まかな評価を伴 う生物機能的相互作用に関する複合体混合物のスクリーニング もし、本発明に従い例えばLC/FCSカップリングにより、ターゲット分子との相 互作用に関して種々の物資混合物を分析するなら、対応する各ガイド構造の質的 評価を可能にする結合定数の上限または下限を直接評価することができる。この ことは以下の実施例で説明する。 各探索される物質が0.1 % 量しか含まれない1000個の物質を含む10μgの物質 混合物をLC分離装置にかける。このことは絶対量が1 ngであることに対応する。 フラクションの分離後、この量の物質が5 μｌの容積に存在する。分子量を200 ダルトンと仮定すると、これは10^-6Mの濃度に対応する。ターゲット分子、例え ばレセプターを同程度の濃度で添加すると、複合体の形成は、反応速度が所定の 最高値を越え、かつ、結合定数が＞10⁶あるならば、所定の時間内に完了するこ とができる。 この検出反応は活性であると同定される化合物の構造データを直接得るために 、HPLC/MS またはGC/MS とカップリングする事ができる。 また、本発明の分析法の物質の微量化はオンライン分析に使用する場合のシグ ナルのドリフトの問題をこおむるバイオセンサー技術を用いた種々の代替法に対 抗して本発明の分析法を使用を可能にしている。上述のクロマトグラフィーのか わりに試料ディスペンサーを使用できる。 DNA／RNA プローブ検定法 本発明の技術の強力な検出感度をフルに利用したとき、DNA またはRNA プロー ブ技術に特異的な問題が生ずる。分子レベルでの本発明の検出反応は少なくとも 互いに相補的な一本鎖構造からなる二本鎖構造の形成を必要とし、該一本鎖は化 学的な修飾を含みうるDNA またはRNA 基本構造物、またはDNA およびRNA の混合 物を含み、かつ、該修飾は特に基本構造、特に塩基の化学発光性を修正する構造 または特異的分子または分子複合体への特異的結合性を有する、および／または 化学発光置換基である置換基を保持する構造に適するものである。 しかし、二本鎖構造の形成は比較的ゆっくりとした反応である（ハイブリダイ ゼーション、cot 速度論）。実験的には、このことは細胞由来のゲノムDNA の再 生が実験条件に依存して週または月の単位で継続する過程であり、その結果、こ の実験は事実上完全には行うことができない。例えば真核生物ゲノムあたり>100 ,000個の割合で生成する反復ゲノムセグメントだけは再ハイブリダイゼーション しうる（デビッドソン(Davidson)およびウェットマー(Wetmur)）。 実際によく使用されている近似式で変性二本鎖の再生が表されている。 ｔ_1/2 = N × ln2 /(3.5 × 10⁵ × L × C₀） ｔ_1/2はT = T_m - 20、イオン強度1 Mにおける秒の単位で示された再生の時間を 示している。L はプローブ断片の長さ、N はユニット配列の長さ、C₀はヌクレオ チドの濃度および3.5×10⁵は再生の本質的速度定数の近似値である。 反応速度が２つの反応物（+ および- 鎖）の濃度の総計に依存するので、一般 に再生速度を促進するには２つの可能性がある。従来のブロット検定法では過剰 量の成分が速度を決定するので、通常プローブは過剰量で使用され、後に洗浄ス テップで過剰のプローブが分離される。PCR（ポリメレース・チェーン・リアク ション）などの酵素依存増幅反応の導入で、その反応速度を測定する程度までに 検出すべきターゲット核酸を増幅することができる。しかし、もし増幅反応が本 発明の方法で免ぜられるならば、またはその検出がワンポット操作におけるプロ ーブ成分の厄介な分離無しに行われるならば、本発明に１つ以上のプロセスおよ び操作が組み合わされる。 本発明の検出に十分であるガス相（空気細菌）または溶液または懸濁液の小容 積試料中のウイルスまたは細菌病原体の検出感度は、簡単な濾過ステップを用い ることで増加することができる。これらは大量の容積からフィルターまたはフィ ルターシステムを用いて抽出し、小容積に含めることができる。別法には例えば 被覆磁性粒子による濃縮がある。 DNA／RNA 分析ではインターカレーティング置換基を有するプローブを使用す ることができる。インターカレーションで蛍光挙動が変化するか、または増加す るこれらの発色リガンドの使用は特に望ましい。チアゾール・オレンジ類の置換 基は特に有用である。インターカレーション状態ではこれらの蛍光収率は遊離状 態に比べて約1000倍大きい。従って、1000倍過剰量の非色素インターカレーティ ングプローブ存在下でのインターカレーションにより特異的複合体の形成を測定 することができる。 プローブに結合したオリゴマーまたはマルチマー色素を使用することにより、 より少ない個々の事象が必要とされるシグナルを生成して検出されなければなら ないことから感度はさらに10-100倍増加しうる。 過剰濃度の二本鎖分析物は反応を促進するのに必ずしも望ましくない。もしも 過剰に存在する分析物のカウンター鎖が複合体とさらにハイブリダイゼーション するならば、複合体由来の既に会合したプローブの不都合な置換が起こる。 本発明ではこの問題は例えばPCR 反応における非対称な開始により、または細 胞内で天然に生成するRNA ポリメラーゼによる、または3SR などの相同的増幅反 応で生成することによる特異的RNA 配列の決勝戦(run-off)生成によるようなカ ウンター鎖無しに特定の極性のみで存在する過剰量の分析物に注意することで解 決している。 また、置換反応は複合体を熱力学的に安定化するインターカレーティング置換 基（例えばアクリジン色素）により、または不可逆的クロスリンクを開始するこ とにより（ソラレン誘導体）で防ぐことができる（特許出願P 42 34 086.1 参照 ）。 本発明の上述のパラメータの至適化を通して10^-12Mの範囲の標識プローブの使 用が可能であり、かつ10^-14M範囲の分析物（カウンター鎖）が検出できるならば 、再生の反応速度（複合体形成）は受け入れがたいほど遅くなる。上述の近似式 を用いて200 ヌクレオチドの長さのフラグメントは、本発明の方法による光学的 測定前に寿命の10倍待たなくてはならないなら、会合するのに約23,000分（16日 ）かかるであろう。 フェノールに基づく有機性溶剤およびチオシアネートまたはパークロレート類 のようなカオトロピック塩の組み合わせを用いることにより、反応速度を約100, 000 倍も促進することができる（キュンケル(Kunkel)等）。実際にはこの方法は フィルター検定法ではうまく行かなかった。しかし、この方法は溶液でうまく行 うことができる本発明の方法と組み合わせることができる。このように、上述の 例の反応速度が秒の範囲でシフトするばかりでなく、同時にその溶液がRNA 分析 物に対する例えばリボヌクレアーゼの作用による分解プロセスを防ぐ。 また、この方法は種々の輸送ベシクル、LDL、VLDL、およびHDL 間の鎖を探す ならば脂質代謝における種々の診断に必要とされる大きなベシクル複合体の検出 を可能とする。従って、今日まで比較的複雑な電気泳動法を困難な定量に使用し なければならなかった。本発明に従って、色素標識ベシクルは移動度および／ま たは回転拡散測定により区別しうる。このベシクルを蛍光標識した特異的抗体で 染色しうる。別に蛍光ラベル分子は特異的に、かつ永久にベシクル構造中に取り 込まれうる。 インビトロ・トランスレーション生産物の機能検定法 本発明のスクリーニング技術の使用は、インビトロタンパク質生合成と組み合 わせたタンパク質またはペプチドの形をした複製分子の分析に特に重要である。 インビトロタンパク質生合成は組み換え細胞システムを回避している。しかし、 インビトロタンパク質合成の効率が小さすぎて合成産物の機能の検出を出費をか けることなく行うことは不可能である。平均して１つのmRNA分子から１つ以上の ペプチドまたタンパク質分子が生産される。この結果はより悪くなりうる。しか し、本発明の方法の感度はmRNAがμMの濃度範囲でのみ合成混合物中で使用しな ければならず、また分析には小容量の試料で十分なことから機能の測定が可能と なる。 分子サイズの分布の測定 高分子化学の分析において、ポリマーの分布を測定することは重要である。こ の事は超遠心法および物理的フロー法の代替法となる本発明の方法を用いて容易 に行いうる。オリゴマーに本質的な蛍光を用いることもできるし、また発光性リ ガンドとの会合または結合を観測することもできる。 イン・サイチュウ・ハイブリダイゼーションとは標識した核酸プローブと相補 的ターゲット核酸との特異的二本鎖形成を分析する目的物の幾何学的配置を固定 して行う方法である。分析される目的物は分子または分子複合体の表面固定調製 物である。例には染色体、転写複合体または翻訳複合体の調製物が含まれる。ル ーチン分析では、表面固定した組織スライスまたは細胞培養物由来の細胞が重要 となる。 ダイナミック・レーザー相関分光光度法 その感度のために本発明の方法は、核酸以外のリガンドの場合、ハイブリダイ ズした、または複合体を形成した蛍光標識結合リガンドの位置を決定することが できる。本発明の利点は単一分子の検出感度が高いことに基づいている。このこ とは酵素依存増幅反応が必要な場合、または多糸染色体の場合のようなターゲッ ト分子が局所的に高濃度になることを必要とされる場合の直接分析を可能にする 。目的構造の相対的位置を決定しうる本発明の方法における二重または多重標識 の使用も請求の範囲に含まれる。 ダイナミック・プロセスの分析に関してピンホールを使用することによる最小 容積エレメントの共焦点イメージングを含む本発明の方法は、本発明に従い構造 の空間高分解能を得るためにレーザー・スキャンニング顕微鏡で使用される従来 法と組み合わせて使用しうる。レーザー・スキャンニング顕微鏡を用いる場合は 蛍光強度のみが測定量として使用されるが、本発明の「レーザー相関顕微鏡」は 二次または三次元的に結像される空間座標(x,y,z)で規定される測定エレメント における相関関数およびその動的内容を使用している（第10図）。このように、 例えば細胞または他の生物学的対象物における標識分子の二次元的（断面）また は三次元的な動的像を描くことができる。 以下に第10図を説明する。本発明の光学系の原理機構が示されている。試料は 試料ホルダーに納められ、それは二次または三次元的にコントロール可能なピエ ゾ素子で所定のスクリーン内に移すことができる。各関連容積エレメントを動的 プロセスに関して分析し、全体としてコンピュータにより二次（断面）または三 次元像に組み立てられる。 33．流行病的に保存されている遺伝子セグメントの測定 ハイブリッド二本鎖の解離定数の測定を通して、上述の解離定数の測定と同様 にホモロジー評価を行うことができる。このことはHIウイルスのような発散病原 体の流行病学的解析に非常に重要である。診断プローブを開発し、その信頼性を 評価するために、種々の生物由来のいくつかの遺伝子セグメントをそれらのパラ メータについて検定しなければならない（第22図）。 ターゲットゲノムに関する多数の突然変異の同時検定法 遺伝病の分析において、多数の変異体の存在を同時に検定するという問題がし ばしば発生する。このことは特に優性遺伝子病またはX 染色体コード型の病気の 場合である。劣性病の場合、１つの対立遺伝子上に特定の点突然変異が発生した か、または両方に発生したかを評価することは重要である（今日までに30以上の 変異体が示されてきた嚢胞性繊維症参照）。本発明の操作は１つの試料中の種々 の突然変異を同時に分析することを可能にする（第23図）。 表現発現細菌の結合特異性による単一細菌の検出 最近のバイオテクノロジー的研究の重要な多くの応用に関して、もし所定の試 料中の機能性生体分子の検出の代わりに、単一の細菌またはウイルスの検出法が できたならば非常に便利で効率的である。非常に興味深い重要な利点は、表現型 発現産物、例えば天然または組み換え表面タンパク質のその遺伝子テンプレート への結合である。 微生物のゲノムには約10⁷個のヌクレオチドが含まれる。ショットガン発現に より平均長100 アミノ酸残基のフラグメントが従来法により発現できる。読み枠 の変化（因子3）および仮定される非コード相補鎖を考慮すると、10⁸個の組み換 え細菌クローンは約100 倍の各セグメントを含んでいる。10D の1 mlの懸濁液 に含まれる10⁸個の組み換え細菌クローンを、例えばアレルギー患者由来のIgE に対する結合性に関し、本発明の方法を用いて約24時間で個々に試験することが 可能である。対応する特徴の細菌を単離するか、または少なくとも非常に濃縮し 、かつ生物的に増殖しなければならないか、または対応するゲノムセグメントを 酵素依存増幅法で増幅し、かつ特徴付けなければならない。 このような問題は例えば、WO92/18645に示されている突然変異誘発法および淘 汰法を用いることによるペプチドおよび／またはタンパク質の進化的至適化の方 法に関連している。24時間以内に約10⁹個の細菌を、所定の濃度のターゲット分 子と相互作用する能力を有する表面タンパク質／ペプチドを発現する細菌の存在 に関して特異的色素標識した物質への結合性によりスクリーニングすることがで きる。対応する細菌は従来法で反応混合物からクローニングしうる。 別の重要な応用は、cDNAライブラリーまたはサブジェニックな構造要素のライ ブラリー（形空間）由来の遺伝子セグメントの機能的マッピングに関するゲノム ・プロジェクトに由来する。このように、例えば、ターゲット分子への結合挙動 など、広い集合体由来のゲノムおよび／またはサブジェニックなセグメントの機 能を測定しうる。 遺伝子的にコードされているペプチドセグメントの機能指定を示す方法論の使 用は、アレルギー研究において非常に重要である。アレルギー原に関する免疫優 性エピトープの同定は（例えばアスペルギラス、ミルクタンパク質、α−アミラ ーゼ）非常に重要であり、今日まで解決しにくかった問題である。実際に発生し た典型的問題を以下に示す。 通常、病気に関連する物質の混合物中のIgE 結合分子の決定。例えば、大豆の レシチンのどの部分が免疫原か、純粋な物質だけか、調製物の不純物と相互作用 する純粋物質か、または宿主生物の構造物との相互作用か、この問題に答えるこ とは非常に重要である。本発明では混合物中の種々の物質を患者由来の標識化Ig E で分類する事ができる。 サブジェニック遺伝子セグメントの発現により、上述の方法により免疫優性エ ピトープを決定し特徴を明らかにすることができる。これらの結果を用いて、 - 対応する免疫優性領域を欠く進化的に類似する機能分子、例えば少ない免疫原 性α−アミラーゼをWO92/18645に示されている方法を用いて生成できる。また、 - 特異的エピトープを遺伝子工学の標準的方法により調製でき、または純粋なテ スト試薬としてまたは感度減少に使用しうる。 装置 この測定配置は以下に示す配置のレーザー光の回折制限フォーカシングにより 本発明の方法を行うのに特に有効な装置である。第14図に示したように、この装 置はプレ・フォーカスしたレーザー光に特徴がある。フォーカシングレンズと一 定の結像距離を保つ交換可能な顕微鏡光学系を組み合わせることにより、プレ・ フォーカスしたレーザー光の径を変えることができる。二色性ミラーにより反射 後、プレ・フォーカスしたレーザー光はカバーガラスがある場合も無い場合も空 気または水浸漬光学系により例えばキャリヤー上、または吊り下がった１滴中に 存在する試料容積に結像される。通常蛍光の発光が励起光の方向に対して180° の角度にある浸漬光学系により集められ、結像される。対物板25には、適当なカ ット・オフまたは干渉フィルターの通過後、半導体検出器エレメント（なだれ型 フォトダイオード）上に適当なスケールの像をつくるピンホールがある。この適 当なスケールはフォリダイオードの大きさに試料の像を調節することから決まる 。フォトダイオードは100 μm の範囲で比較的小さく作り、それらが共焦点検出 器に対しピンホールを置換できるようにすることが望ましい。本発明の装置の特 別な態様では、このダイオードも検出器に組み合わされて配置することもできる 。 ピンホール開口50の結像は種々の発光波長に対して至適化した、例えば２つの 検出エレメント53、54上のビーム・スプリッター60を用いて行いうる。ピンホー ル開口の代わりに、例えば１つ以上の半導体検出エレメント（アレイ）を結像板 に置くことができる。 望ましい態様では、レーザー光の回折制限フォーカシング生成用のユニットお よび観察ユニットに相互に分割しうる本発明の装置は、以下のような構築エレメ ントを有している。レーザー光21をプレ・フォーカスするための器具20にはレー ザー光21を屈折させるためのレーザー光路中の二色性ミラー30が含まれる。回折 制限フォーカシングで生成されたレーザー光は、例えばキャリヤー上に位置する か、または吊り下がった液滴1 に存在する試料に二色性ミラー30で屈折された後 別のレンズ40により結像される。 場合によっては、観測ユニットはフィルター器具51、光子計数器具52、相関器 具71および／またはマルチチャンネル・スケーラー器具72を有している。測定シ グナルは場合によってはコンピュータで処理され、および／または評価される。 第15図はレーザー光21をプレ・フォーカスするためのプレ・フォーカシング器 具20を図で示している。顕微鏡光学系に相当するレンズL22 およびアレイ23によ り、レーザー光21はレンズ22を通して結像板 B₁上に結像される。アレイ23は最 初の像として結像板 B₂にレーザー光を結像する。アレイ23は例えば顕微鏡のノ ーズ・ピースの形をしたレンズの交換可能な配置を提供されることが望ましい。 プレ・フォーカシングしたレーザー光21の径はそれで変えることができる。 本発明の装置の望ましい態様では、検出ユニットは２つの検出器52および54を 含み、試料から検出器53および54へ発せられる光55を分割するビーム・スプリッ ター60を有している。この配置は第16図に示した。試料1 から発した光55が検出 器53または54に入る前に結像レンズ56、57およびフィルター・エレメント58、59 を通ることには利点がある。特に、各検出器53および54が異なる波長の光を検出 できることは有利である。この事は適当なフィルターを選択することで達成され る。 もし、検出器エレメントが検出器アレイ状に結像板に設置されるならばピンホ ール開口50の使用は不要である。検出器エレメントは<100μm の大きさを持つこ とが望ましい。本発明の装置の別の態様はビーム経路にピンホール50を配置して いる。 第25図では、測定領域（62に示した）を調べるのに使用する二重顕微鏡の側面 が図示してある。この顕微鏡は単独プレートを有する垂直サポート63（長方形チ ューブ）を有している。サポート63の上側には、中央支持アーム65が水平軸の回 りに回転するように取り付けられている。中央支持アーム65は凹むように工夫さ れ、ビーム・スプリッター66および45°反射鏡67のような光学エレメントと共に 内側に提供されている。支持アーム65のベアリング軸68も凹むように工夫され、 ２つの重なるレーザー光は理想的な回転軸に沿って支持アームに照射され、光路 中のビーム・スプリッター66およびミラー67（広いルーフ・プリズム）に衝突す る。ビーム・スプリッター66およびミラー67を通して、２つの重なるレーザー光 が２つの反対側にある支持アーム65からガイドされてくる。すなわち、この部分 で支持アームは開口69が提供されている（ガラスカバープレート）。 支持アーム65を離れた２つのレーザー光70、71はこれらの光を偏向させるビー ム・スプリッター72、73にぶつかり、その結果、光の方向は支持アーム65の軸方 向と平行になる。 支持アーム65のフリーの端には支持アーム74が結合しており、両方のアームで T 型構造を採るように配置している。サポート63から逸れた支持アーム74の前面 には、対物レンズ78を含む対物ノーズ・ピース77を伴うボディー・パーツ76の縦 の動きをガイドするガイド器具75がある。２つのノーズ・ピース77の相対的配置 は、対物レンズ78が互いに向かい合い、共通の光学軸上にある一方、２つの対物 レンズ78管に支持アーム74によって支えられている標本台がある。支持アーム74 の内側には、反対のネジ山を持つ２つのスピンドル81を有する二重スピンドル・ ドライブ80がある。このスピンドル81は支持アーム74に投影されるアーム82とス レッド結合状態にあり、かつ、ボディー・パーツ76に連結している。従って、二 重スピンドルドライブ88が運転されるとき、２つのボディー・パーツ76は運転方 向に依存して互いの方向に、または互いから遠ざかるように移動し、その結果２ つの対物レンズの焦点が結合しうる。 二重ガイド・システムは２つの置換可能なボディー・パーツ76の各々と連結し ている。これらの二重ガイド・システムの各々は２つのフィッシュ・テール・ス ライド・レール83、84の形で具現される。これらのスライド・レール83、84は支 持アーム74の２つの末端が向き合うように配置されており、ボディー・パーツ76 に沿って移動する。２つのスライド・レール83、84は支持アーム74越しに両側（ ガラス・スライド側と支持アーム65との連結側）に突き出す一方、支持アーム65 に対しては平行である。互いに向き合っている内側には半透鏡またはビーム・ス プリッター72、73から来るレーザー光をプレ・フォーカスするための光学エレメ ント85、86が提供されている。互いに向き合っていない２つのスライド・レール 83、84側では測定領域からくる光を処理するための光学系（レンズ、開口、フィ ルター等）がある。88はピンホールであり、89は蛍光を検出する検出器にピンホ ール開口を結像するためのバイコンベックス・レンズと呼ばれる。さらに、互い に向き合っていないスライド・レール83、84の外側には、45°の角度に合わし、 測定領域62から来る光を光学エレメント87、88に反射する鏡89がある。さらに、 相互相関をとるために必要なレーザー光からの情報を電気シグナルに変換する検 出器90、91がスライド・レール83、84側に存在する。 第25図に示した二重顕微鏡の作動モードを以下に示す。ベアリング軸68を通し て、種々の波長の２つの重なったレーザー光（70、71）が支持アーム65に入り込 み、ビーム・スプリッター66に進入した後1 つのレーザー光71はビーム・スプリ ッター・エレメント66によって一方に90°反射され、また、もう一つのレーザー 光70はミラー67により反対方向に90°反射される。支持アーム65の隙間69から出 たレーザー光70、71はビーム・スプリッターまたは半透鏡72、73にぶつかり、そ こから光学エレメント86を通過する。その後、レーザー光は、その端でサポート 63および検体ステージ79に面する側に長い穴92が提供されている（第25図ではサ ポート63に面する長い穴92だけが描かれている）支持アーム74に進入する。さら に、レーザー光はボディー・パーツ76を通り、そこで半透鏡93にぶつかってから 、ノーズ・ピース77および対物レンズ78を通過して測定領域62に到達する。測定 部分62から反射された光は偏向無しに半透鏡93を通過し、反射鏡89によりスライ ド・レール83、84の外側の光学エレメント87、88に送られる。その後、検出器90 、91に衝突する。 同様に用いられる対物レンズ78に依存して調整可能なように、測定部分へのレ ンズの焦点62、ボディー・パーツ76およびスライド・レール83、84は先に示した ように移動可能である。半透鏡72、73は光学エレメント86のように互いに向き合 うスライド・レール83、84側に存在するので、反射鏡67および半透鏡（ビーム・ スプリッター）からの半透鏡72、73の距離はボディー・パーツ76およびスライド ・レール83、84が移動したときに変化する。レーザー光70、71が支持アーム65に 平行に走っている半透鏡72、73の後の領域では、該鏡からの光の距離は変化する 。これにより長い穴92内の支持アーム74の相対的位置は変化する。このことから 、中央支持アーム65の外側にある全ての光学系は変化するし、２つの移動方向は 中央支持アーム65を離れたレーザー光70、71の方向と一致する。 全体の二重顕微鏡は非常にコンパクトな構造をしている。全てのエレメントは 重さが「実質的に均一に」分布するように配置されている。検体ステージ79に向 かった二重顕微鏡のオペレーターは作業領域の顕微鏡の装備および光学系に邪魔 されることはない。二重顕微鏡の中央支持アーム65および全ての光学装置は回転 しうる（矢印94参照）。中央支持アームは同軸の２つのベアリングによりサポー ト63に固定してあり、曲がることはない。２つの対物レンズ78の内の１つは測定 部分62が検体ステージ79に位置する部位から２つの対物レンズ78の共通焦点のオ フセットのバランスをとるためにピエゾ素子または別の調整エレメント（示さず ）で正確に位置決めされる。 レンズ、フィルター、反射鏡、半透鏡等、ここで示された光学エレメントに加 えて、行われる測定に必要とされるならば別の光学エレメントもレーザー光70、 71の光路に置くことができる。 第17図はローダミンで標識したデオキシリボ核酸を示している。縦軸は規格化 した強度相関関数を示している。横軸は対数時間軸である。濃度は容積エレメン ト当たり（2×10^-16ｌ）の標識分子で与えられる。第17a 図は拡散時間0.067ms の容積ユニット当たり2 分子のモノヌクレオチド・ウラシルを示している。第17 b 図は拡散時間1.8ms を有する容積ユニット当たり0.3 分子に相当する500 塩基 対のDNA を示している。 第18図はヒトのリンパ球における細胞結合レセプター（β−アドレナリン・レ セプター）と蛍光標識レセプターリガンドとの相互作用を示している。このシス テムの座標軸は第17図と同様である。第18a 図は拡散時間1.1ms の容積ユニット 当たり10.7分子に相当するBSS 中の標識リガンドを示している。 第18b 図は拡散時間13s の容積ユニット当たり72分子に相当するBSS 中のリガ ンドで標識したリンパ球レセプターを示している。 第18c 図は遊離のリガンド76% およびリンパ球レセプターに結合したリガンド 24% の状態を示している。 10-100ms以内の蛍光相関関数を得ることができるので、10乃至100s以内に1000 ピクチャー・エレメントをコードしうる。特に、本発明の方法の各ピクチャー・ エレメントは、一般的に半径0.1-1 μm および長さ1-3 μm を有するポアソン分 布空間エレメントに相当する。この相関関数は所定の時間以内に各ピクチャー・ エレメント内で計算され、各軸x、y、ｚについて蓄積される。その後、この調製 物は新しい座標点にピエゾ素子で移動されることが望ましい。この調製物を移動 させる代わりに、例えばレーザー光を所定の限度内に適当な鏡装置で動かすこと もできる（第9 図参照）。ダイナミック・ピクチャー・エレメントはコンピュー タで１つの像に組み立てることができる。 第6 図は試料容積および測定容積に関する電気的分子トラップを用いた光学検 出ユニットの望ましい配置を示している。１つまたは２つの検出器（検出器1／2 ）はテキストに示したように１つまたは２つの光学ユニットにより共焦点的に結 像された測定容積エレメントからの蛍光シグナルを検出する。水性試料はエマー ジェンス・レンズの表面に直接接するか、または第3 図に示したように薄いシー トで対物レンズから分離されている。 試料は約1 μm のキャピラリー末端の内径を有する少なくとも２つのキャピラ リーの間に提供される。イオン性分子に対して分子トラップとして機能する場合 、このキャピラリーは導電性表面層、望ましくはクロム・プライマー上の金でコ ーティングされており、そこに静電場または振動電場をかけることができる。電 場の制御は光学検出ユニットと対応するコンピュータで行うことが望ましく、ま た、問題の分子が進入してきたとき、限定された方法で調節しうることが望まし い。 第3 図は特定の適応度パラメータで大量の変異体をスクリーニングするための 本発明に従った配置の望ましい態様を示している。試料は第6 図に従った光学検 出ユニットを用いて検定しうる。試料は水浸した対物レンズに接することが望ま しいシート状表面下で液滴として存在する。このシートは特定のコーティングを 施してあり、各試料由来の分子を表面に選択的に結合させうる。試料は、例えば マイクロディスペンシング・システムを用いて決まった位置に規則正しく置くこ ともできるし、ランダム分布として置くこともできる。試料からの溶媒の蒸発を 防ぐために、液滴は保護マトリクス、例えばポリマーまたはオイルで囲むことが できる。 第7 図は選択された遺伝子型のFCS タギングを模式的に示している。特定の試 料が第3 図に従って予備選択した適応度パラメータに対応するなら、各容積セグ メントへの接近は、例えば光学的にその位置をマークするか、または続いて試料 への接近を可能にする光活性化可能なコーティングが提供されている表面により 容易に行いうる。 選択された容積セグメント、または第8 図に示したようにコードしている核酸 等、中に含まれる分子への接近も、例えば核酸と反応するようにエレメント中の 可溶性反応物を光活性化することで行いうる。このように標識された核酸は、さ らに例えばPCR 反応を行うための単離を比較的簡単に行うことができる。 第11図は本発明の検定法の選択を示している。「Ag」は抗原を示しているが、 例えば二本鎖構造で検出される核酸のような一般的な意味での分析物を示してい る。 「Ak」は抗体を示しているが、一般的には例えば抗体フラグメント、結合ドメ イン、または分析物に相補的な核酸等、分析物に対する特異的テスト試薬を示し ている。 「F」は発光色素、特に蛍光色素を示している。 (A) 蛍光標識されたテスト試薬による分析物"Ag"の本発明に従う特異的複合体形 成であって、複合体型の蛍光標識テスト試薬は本発明により遊離型のものと区別 される。この一群は分析物の1000倍過剰まで許容される。 (B) しかし、(A) と同様に、非標識型の過剰に添加された第２のテスト試薬の結 合は、小さすぎる複合体と非複合体型標識テスト試薬とのサイズの差を増加する のに使用される。 (C) 少量のテスト試薬および蛍光標識競合分析物の添加を用いた競合RIA 類似検 定法。 (D) 過剰量のテスト試薬を用いた検定法であって、エネルギー転移により色素標 識が特異的複合体形成を示す少なくとも２つの異なるテスト試薬が使用される。 (E)(D)と同様に、異なる色素を本発明に従って独立に検出し、共通の複合体の形 成は異なる光学的シグナルの時間相関で測定される検定法。 第19図は、n 個の反応混合物中のn 個のレセプター分子に由来し、かつ、色素 標識リガンドを含む複合体が平行した実験においてどの様な解離挙動を示しうる かを表している。限定した時間間隔でいくつかの反応混合物を反復して分析する 。最初は、過剰量の非標識リガンドを混合物に添加し、解離したどの複合体も非 標識リガンドとの複合体を再び形成するようにする。曲線1、3 およびn から各 解離速度定数が見積もられ、曲線2 およびn-1 は２つの区別可能な解離過程を明 らかにし、かつ区別可能なレセプターを示している。 第20図は本発明の電気的トラップの種々の態様を示している。(a)a,b,c,dは四 極子電極を示している（金属被覆ネハーキャピラリーまたは平坦試料キャリヤー （シリコン、硝子およびその他の基剤）上の微細構造に金属蒸着した電極）；六 極子電極の場合（例えば１つまたは２つの対物レンズの金属蒸着したエマージェ ンス・レンズ）。調整はx,y,z 方向で行う。(b) エッチングした電極チャンネル を有する平坦キャリヤー、または電場内で荷電分子の運動をコントロールしうる LIGA技術で調製したキャリヤーの使用。e およびf の底板は六極子電極同様に被 覆した、または金属蒸着カバーで被覆した対物レンズでありうる。(c) キャピラ リー末端の電極（約±0-100V）および接地電圧（0V）の電極を含む大容量受容の ための鉱物（例えば、硝子、シリコン、なたは電気浸透キャピラリー効果を防ぐ テフロン等のプラスチック）からできたキャピラリー。 第21図は電気的トラップによる荷電分子の検出の可能性を説明している。(a) もしターゲット分子が四極子または六極子電場内に存在するなら、その分子は電 極a,b,c,d 上のランダム振動電場で強制運動を起こさせられる。これらは本発明 にしたがって計数しうる。(b) トラップ内の分子の位置はマルチエレメント検出 器で認識しうる。正のフィードバックで四極子／六極子電場を調整し、分子ジェ ット(gets)は決まった領域／容積エレメント内の位置に固定される。 第22図はウイルスゲノムに流行病学的に保存されている遺伝子セグメントの分 析を示している。種々のウイルス種のDNA／RNA 混合物はセグメント毎、各々標 識化したカウンター鎖プローブで標識し、過剰の非標識プローブによる置換実験 に使用する。融解温度以下での遊離した標識プローブの迅速な出現は、多くのウ イルス種が多くのミスマッチを含んでプローブと複合体を形成していることを示 している。これらの領域では、ウイルス種は明らかに非常に不均一である。 第23図では、相互相関によって同時にゲノムセグメント上のいくつかの突然変 異の少なくとも１つの存在を示すための本発明の方法を説明している。非標識フ ラグメントの混合物を分析するDNA またはRNA 混合物に添加する。色素F2を含む プローブp のハイブリダイゼーションは、もし検索している突然変異の１つが存 在するならば、色素F1で標識した少なくとも１つのプローブm1-m6 の同時のハイ ブリダイゼーションと相関していなければならない。プローブm1-m6 は変異した 配列に各々相補的であり、ストリンジェント条件下野生型配列の二本鎖構造は効 率的に形成できない。分析する核酸の望ましい濃度は10^-10 - 10^-14Mであり、一 方プローブは望ましくは10^-8-10^-11Mの濃度で提供される。 第24図は本発明の小さい励起容積(a)、小さい測定容積(b) および平行測定の 小さい容積(c) を示している。(a) プレ・フォーカス無しの励起光の断面図が本 発明の小さい測定容積の像と共に示されている。色素標識の光不活性化が実際の 測定容積に入る前に起こり、測定容積内の有効濃度が実際の濃度よりも低くなる 領域が形成される。このことはプレ・フォーカスした励起光を照射し、かつ対物 板中のピンホール開口で結像することにより大部分防止された。光強度がガウス 分布しているガウス容積が形成される(b)。(c) は小さい測定容積の望ましい像 と共にプレ・フォーカスを伴う平行照射励起光の断片、または試料容積内の種々 の空間座標を持つ種々の容積エレメントの連続照射および測定を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５９５ Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ 33/58 27/26 ３２５Ａ (31)優先権主張番号 Ｐ４３４２７０３．０ (32)優先日 1993年12月15日 (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｋ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アイゲン・マンフレッド ドイツ連邦共和国、ゲッチンゲン Ｄ― 37075、ゲオルグ―デヒオ―ベーク 14 (72)発明者 ヘンコ・カルステン ドイツ連邦共和国、エルクラス Ｄ― 40699、キルヒベルク ４ (72)発明者 ウロ・メッツ エストニア、タリン ＥＥ―0013、テドレ 24 (72)発明者 イェルカー・ビデングレン スウェーデン、ソルナ Ｓ―17132、スヨ ベゲン ２ (72)発明者 ミハエル・シュトゥケ ドイツ連邦共和国、ゲッチンゲン Ｄ― 37077、アウフ・デル・リース 36 (72)発明者 ミハエル・ブリンクマイヤー ドイツ連邦共和国、ゲッチンゲン Ｄ― 37077、ハノーファーシェ・シュトラーセ 134 (72)発明者 ウォルフガング・ジム ドイツ連邦共和国、ロスドルフ Ｄ― 37124、シュタイン・フルルベーク ２ベ ー (72)発明者 オラフ・レーマン ドイツ連邦共和国、ゲッチンゲン Ｄ― 37077、シーエ・シュトラーセ 19

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．測定時間500ms 以下で、かつ分析する分子の拡散経路が短いレーザー励起FC Sを用いた、特に1 μM以下の濃度に希釈した１つまたは少数の分子を同定する方 法であって、少なくとも１つの望ましくは10^-14ｌ以下の小さな容積ユニットま たは多数の該容積ユニットにおいて、測定されるべき分子の発光測定によって決 定される物質特異的パラメータを決定することによって行われる方法。 ２．前記物質特異的パラメータとして、並進拡散係数、回転拡散係数、励起およ び発光波長、発光置換基の各励起状態の寿命、またはこれらの測定量の組み合わ せを決定する請求項1 記載の方法。 ３．定常的または非常にゆっくり拡散する発光複合体を分析するために、測定容 積に対し試料容積を動かすこと、および／または経時的にレーザービーム光の位 置および／または検出光学系の焦点の位置を変化させることにより、測定容積の 空間座標を分析中に試料容積の空間座標に対して変化させる、但し、測定した並 進拡散係数が実質的な並進拡散係数と測定部分の座標の上に載せた相対的位置と 変化の組み合わせに対応している、ことを特徴とする請求項1 および2 の少なく とも1 項記載の方法。 ４．前記測定部分の座標の経時変化が、定常的または非常にゆっくり拡散する発 光複合体の見かけの拡散時間を規定することを特徴とする請求項3 記載の方法。 ５．置換基の発光が測定されるべき分子と直接相互作用し、該置換基が測定され るべき分子のタイプまたは機能と相関する分光学的パラメータを有する発光リガ ンドまたはリガンド複合体である、ことを特徴とする請求項1 乃至4 のいずれか 1 項記載の方法。 ６．相関の評価による並進拡散および／または回転拡散の測定を用いた機能性の 評価が、特に、存在する分子の絶対数および／またはその経時変化の測定により 、および／または構造的に異なるリガンドおよび／またはリガンド複合体の特異 的濃度の測定により、かつそれらから誘導される特異的相互作用の熱力学的結合 定数および／またはリガンド結合分子に関する特異的認識反応または酵素過程の 速度定数を通して行われる請求項1 乃至5 の少なくとも1 項記載の方法。 ７．前記測定分子または分子複合体がイオン性または非イオン性である請求項1 乃至6 の少なくとも1 項記載の方法。 ８．前記測定が時間に対して一定または変化するスーパーインポースされた(sup er-imposed)電場または磁場中で行われることを特徴とする請求項1 乃至7 の少 なくとも1 項記載の方法。 ９．試料容積のイオン性分子または分子複合体が測定エレメントを通過すること 、または短時間測定エレメント中に留まることを整流した電場または交流電場で 強制する請求項8 記載の方法。 10．もし電気的分子トラップを使用するなら、標識したリガンドが複合体を作る ターゲット分子よりも小さい荷電を有するか、またはターゲット分子の荷電と反 対荷電を有することを特徴とする請求項8 および／または9 の少なくとも1項記 載の方法。 11．前記分析が遊離した色素標識リガンド、特に核酸プローブを特に複合体化し たリガンド、特に核酸ハイブリッドから分離するための電気泳動分離法と組み合 わされ、かつ多重に結合蛍光色素を有するリガンドを使用することが望ましいこ とを特徴とする請求項1 乃至10の少なくとも1 項記載の方法。 12．標識テスト試薬および分析物の複合体および検出すべき遊離の分析物を第１ の電気泳動ステップで予備濃縮し、かつ検出すべき複合体を第２の電気泳動ステ ップで測定容積エレメントに輸送することを特徴とする請求項1 乃至11の少なく とも1 項記載の方法。 13．発光性リガンドおよび／または発光性リガンド複合体が量子収率0.1 以上で 30,000以上の吸光係数を有すること、および／または効果的測定時間を短縮する ために発色リガンドとして１つ以上の色素オリゴマーを使用することを特徴とす る請求項1 乃至12の少なくとも1 項記載の方法。 14．前記測定部分がエマージェンス対物レンズから1000μm 以下の作動距離に配 置され、該対物レンズは直接試料容積に接しているか、または試料容積が透明シ ートでエマージェンス・レンズから分離されていることを特徴とする請求項１乃 至13の少なくとも1 項記載の方法。 15．前記規定された分子および／または分子の平衡混合物および／または速度反 応過程は少なくとも１つの試料容積エレメントで分析され、複数の試料容積エレ メントの場合、該エレメントが二次元配列の二次元キャリヤー上、特にメンブレ ンまたはシートおよび／またはウェハ表面に、または線状に望ましくはキャピラ リー中で配列し、望ましくは試料容積が試験管内で修正した天然の細胞内または 細胞上、および／または人工的に調製したベシクル、特にリポソームまたはベシ クル形成性を有する可溶性ポリマーに基づくベシクル中に存在することを特徴と する請求項1 乃至14の少なくとも1 項記載の方法。 16．前記各試料容積がマイクロディスペンシング・システムを用いて生成するこ とを特徴とする請求項1 乃至15の少なくとも1 項記載の方法。 17．前記表現型的に選択したDNA 又はRNA の遺伝子型への接近は各容積エレメン トの局所的位置をマークすること、望ましくは光学的マーキング用の光化学的活 性化可能な物質を用いた表現型分析に使用されるレーザーシステムを用いること 、または可溶性または表面結合型の選択された容積エレメントの内容物と接触し 、特にソラレン誘導体により、および結合した構造エレメント、特にオリゴヌク レオチドまたはビオチンまたはアビジンまたはストレプトアビジンまたはオリゴ ペプチドまたは金属錯化試薬またはこれらの組み合わせ物に結合した活性化可能 物質への特異的結合により選択された遺伝子型の構造エレメントと安定な化学的 相互作用を行いうる光化学的活性化可能な試薬による選択された遺伝子型の選択 的分離を可能にすることにより対応する測定位置の光化学的標識をマーキングす ることによる対応する測定位置の光化学的標識で可能となることを特徴とする請 求項1 乃至16の少なくとも1 項記載の方法。 18．スクリーニング操作において、医学的に活性のある物質をレセプターに対す る発光標識リガンドの結合で該相互作用を検定する事による特異的レセプターと の相互作用で分析し、そのキャリヤー細胞上の天然のレセプター、ならびにレセ プターを過剰発現するキャリヤー細胞上のレセプター、または発現された分子ま たは分子複合体の形のレセプターを使用することを特徴とする請求項1 乃至17の 少なくとも1 項記載の方法。 19．潜在的に活性な物質および特異的レセプターおよび特に標識された生理学的 リガンドとの相互作用の分析において、異なる結合能が変異体および標識され た天然のリガンドの結合を妨害する事で測定される少なくとも２つのレセプター が使用されることを特徴とする請求項1 乃至18の少なくとも1 項記載の方法。 20．試料容積内で特異的レセプターまたは生細胞の細胞内物質との潜在的活性物 質の相互作用の分析において、細胞の主要な部分が分裂可能か、または代謝的に 活性を維持していることを特徴とする請求項1 乃至19の少なくとも1 項記載の方 法。 21．特異的認識反応の検出に関して、潜在的活性物質が複雑な天然、合成または 半合成混合物中に存在し、かつ、該混合物が分析前にクロマトグラフィーで分離 される、但し、望ましくは特異的認識反応で競合する標識化リガンドをクロマト グラフィー分離後に分離されたフラクションに添加し、かつ引き続いて競争反応 をターゲット分子との特異的相互作用で分析する、ことを特徴とする請求項1 乃 至20の少なくとも1 項記載の方法。 22．前記クロマトグラフィーユニットの代わりに、試料ディスペンジョン・ユニ ットを使用することを特徴とする請求項1 乃至21の少なくとも1 項記載の方法。 23．試料容積中の相同的な相補的核酸分子のタイプおよび／または数をハイブリ ダイゼーションにより、少なくとも１つの標識した核酸プローブを用いて分析す る、但し、望ましくはプローブ結合色素標識がプローブの二次構造と相互作用し ないか、または望ましくは特異的相互作用が可能であり、かつ、特に置換型チア ゾール・オレンジ色素を用いることで分光学的蛍光挙動を変化させる、ことを特 徴とする請求項1 乃至22の少なくとも1 項記載の方法。 24．核酸検出を目的とした標識プローブとしては、望ましくは合成または細胞性 RNA またはDNA 型の特定の極性を有する（+ または- 鎖）過剰成分としての一本 鎖核酸を使用することを特徴とする請求項23記載の方法。 25．ハイブリダイゼーションにおける複合体形成の反応速度がカオトロピック塩 および／または有機溶媒、特にフェノールを含む媒体中で検定を行うことで促進 されることを特徴とする請求項23および／または24の少なくとも1 項記載の方法 。 26．ハイブリダイズした核酸の相補性の程度を複合体の熱力学的安定性を介して 分析することを特徴とする請求項23乃至25の少なくとも1 項記載の方法。 27．相補的核酸の検出が内部標準を用いて定量され、該内部標準が少なくとも１ つの点突然変異で定量される核酸の配列と区別され、かつ該分析が内部標準とプ ローブの複合体および分析する核酸分子とプローブの複合体の種々の構造が色素 分子の並進拡散および／または回転拡散に関して区別される温度で行われること を特徴とする請求項23乃至26の少なくとも1 項記載の方法。 28．色素標識リガンドとの複合体形成の感度が、有効反応容積を減少する、およ び／または反応物周囲の水和を変化させる、および／または特にポリマーおよび ／またはオリゴマー、望ましくはポリエチレングリコール類、デキストラン類、 タンパク質類、ポリビニルピロリドン類、カオトロピック試薬類、有機溶媒など を使用することにより相分離により反応物の有効濃度を実現する、特異的反応物 を反応媒体に添加することにより会合速度を増加することで増進されることを特 徴とする請求項1 乃至27の少なくとも1 項記載の方法。 29．検出されるべき複合体を、望ましくはテスト試薬および検出されるべき分析 物との複合体の間のサイズおよび／または形の差を増加する目的で過剰量添加さ れる少なくとも１つの付加的リガンドと反応させることを特徴とする請求項１乃 至28の少なくとも1 項記載の方法。 30．検出反応の特異性を、望ましくは反応物に対し過剰となるテスト試薬の組み 合わせ物との少なくとも三者複合体を形成させることで増加し、蛍光検出される 色素が少なくともモノマーとして結合する第２のテスト試薬の蛍光色素の励起に 適合する発光波長を有する少なくとも１つの色素リガンドで少なくとも１つのテ スト試薬が標識されていることを特徴とする請求項1 乃至29の少なくとも1 項記 載の方法。 31．少なくとも２つの分析物が、少なくとも２つの独立した異なる色素で標識さ れ、かつ、異なる波長の光で励起されるか、または異なる発光波長の光で独立し て検出される２つの異なるテスト試薬の反応により、１回の検定の１つの試料で 一緒に分析されることを特徴とする請求項1 乃至30の少なくとも1 項記載の方法 。 32．特定の分析物が、各々少なくとも２つの光学的に異なる蛍光分子で標識され た少なくとも２つのテスト試薬と同時に複合体を形成し、該同時複合体形成が エネルギー転移複合体の形成および／または異なる励起および／または発光波長 を有するシグナルの時間相関によって検出されることを特徴とする請求項1 乃至 31の少なくとも1 項記載の方法。 33．試料がベシクル構造の混合物、特に液体保有ベシクル、特にVLDL、LDL およ び／またはHDL 型のベシクルに対し、該ベシクルを蛍光標識抗体で染色すること および／または蛍光標識分子を特異的および持続的にベシクル構造に取り込むこ とにより分析することを特徴とする請求項1 乃至32の少なくとも1 項記載の方法 。 34．試験管内タンパク質生合成の産物を、特異的結合性または酵素活性に関して 分析することを特徴とする請求項1 乃至33の少なくとも1 項記載の方法。 35．オリゴマーまたはポリマー分布物が平均並進拡散係数および／または平均回 転拡散係数およびそれぞれの分布の半値幅に関して分析されることを特徴とする 請求項1 乃至34の少なくとも1 項記載の方法。 36．望ましくは固定化細胞または細胞会合物、組織、オルガネラ、ゲル構造物お よびその他の三次元的に仕切られた試料容積を含む固定化構造をもつ試料容積に おいて、いくつかの容積エレメントが特定の分子のダイナミクスまたは反応速度 に関してカバーされており、該容積エレメントの位置座標も同様に考慮され、か つ、続いて容積エレメントが二次または三次元的像に組み合わされることを特徴 とする請求項1 乃至35の少なくとも1 項記載の方法。 37．レセプター分子および試料中に存在しうるリガンドの間の複合体形成が溶液 中の色素標識リガンドとの競争、または固相結合分子の関与、または細胞関連分 子の関与により分析され、かつ、生物学的試料がシート状で提供されることで分 析されるべき測定部分が1000μm 以下の望ましい距離で分析されることを特徴と する請求項1 乃至36の少なくとも1 項記載の方法。 38．蛍光の偏向解消の検出を目的とした検定法として開発されたキット・システ ムを使用する請求項1 乃至37の少なくとも1 項記載の方法。 39．望ましくは固定化細胞または細胞会合体、組織、オルガネラ、ゲル構造体を 含む三次元的構造を有する試料容積中におけるダイナミック・プロセスまたは反 応速度プロセスの二次元的または三次元的結像を目的とした請求項36記載の 方法の使用。 40．表面固定調製物、特に染色体、転写複合体、翻訳複合体、または細胞または 組織構造体などの高分子複合体の、望ましくは少なくとも２つの本発明に従って 標識したリガンドの使用による特定のターゲット分子の局在化および／または参 照位置に対する空間的相関によるインサイチュウ分析を目的とした請求項1 乃至 39の少なくとも1項記載の方法の使用。 41．評価すべき容積エレメントを反応条件に同時にまたは連続的にさらし、かつ 、限定した反応時間後、反応産物の分析を行うことによる特異的物質の転換また は色素リガンド保有分子の結合反応の反応効率の測定を目的とした請求項1 乃至 38の少なくとも1 項記載の方法の使用。 42．特異的分子および／または分子複合体および／または分子および／または分 子複合体の分子環境を定性的または定量的にカバーすること、特に生理的に活性 なレセプター、特に表面レセプターの測定および／または評価またはレセプター 結合リガンド又はリガンド複合体の評価等を目的とした請求項1 乃至38の少なく とも1 項記載の方法の使用。 43．発光団保有リガンドと検索分子のレセプター分子への競合的結合を測定する ことによるラジオイムノアッセイまたは酵素結合イムノアッセイの代替法として の請求項1 乃至38の少なくとも1 項記載の方法の使用。 44．複製分子、特に核酸またはそれらに由来するタンパク質またはペプチド、複 雑な化学反応生産物、化学反応で合成された生産物の複雑なシステム、または細 胞合成産物などの二次代謝物の複雑な混合物のような複雑な分子集合体を分析す ることを目的とした請求項1 乃至38の少なくとも1 項記載の方法の使用。 45．複雑な物質混合物の分析を分析的分画を含めてオンラインで行う請求項1 乃 至38の少なくとも1 項記載の方法の使用。 46．分子、分子複合体または細胞、特に精子、単球、収縮性エレメント、活性ま たは能動輸送分子およびメンブレン分子の移動度の測定を目的とした請求項1 乃 至38の少なくとも1 項記載の方法の使用。 47．非常に希釈した溶液の小さな測定部分における蛍光の励起のためのレーザー フォーカシング用、および次の測定のための発生した蛍光の共焦点的結像用に 知られている顕微鏡光学系を含み、望ましくは≧1.2N.A．の高開口数の光学シス テムを少なくとも１つ使用し、光量は顕微鏡の対物レンズの後ろにある対物板に ある共焦点的に配置したピンホール開口で制限されており、および／または測定 部分は望ましくは観察用対物レンズから1000μm の距離に位置する請求項1 乃至 38の少なくとも1 項記載の方法を実施するための装置。 48．測定シグナルの生成側に、レーザー光（21）をプレ・フォーカシングするた めの装置（20）、該レーザー光（21）を屈折させるための二色性ミラー（30）、 および測定容積にレーザー光をフォーカスするための付加的レンズ（40）が提供 され、かつ、観察ユニットが光子計数装置（52）、相関装置（71）、およびマル チチャンネル・スケーラー装置（72）を有し、かつ場合によっては測定シグナル がコンピュータで処理および／または評価される、測定シグナルを生成するユニ ットおよび観察ユニットを含むレーザー光の回折制限フォーカシングを行うため の請求項47記載の装置。 49．プレ・フォーカシングのための装置（20）に顕微鏡光学系に相当するレンズ （22）およびアレイ（23）が提供され、光軸を合わせたレーザー光（21）がレン ズL により結像板 B₁ 上よび前記アレイ（23）により結像板 B₂（第１像）上に フォーカスされる請求項48記載の装置。 50．前記アレイ（23）にプレ・フォーカスしたレーザー光（21）の径を変化させ るための交換可能なレンズが提供される請求項49記載の装置。 51．検出ユニットが、試料から検出器（53,54）に発せられる光（55）を分離す るビーム・スプリッター（60）を有する２つの検出器（53,54）によって構成さ れる請求項48乃至50の少なくとも1 項記載の装置。 52．発生した光（55）が各検出器（53,54）の前に結像レンズ（56,57）およびフ ィルター・エレメント（58,59）を通過する請求項52記載の装置。 53．検出器（53,54）が異なる波長の光を検出する請求項48乃至52の少なくとも1 項記載の装置。 54．１つ以上の検出器エレメントが、場合によっては検出器アレイの形で結像板 に設置される請求項48乃至53の少なくとも1 項記載の装置。 55．ピンホール開口（50）が光路（55）に配置される請求項48乃至54の少なくと も1 項記載の装置。 56．90°を超える角度をとるような２つの対物レンズを使用することを特徴とす る請求項47乃至55の少なくとも1 項記載の装置。 57．発光波長＞200 nmの波長を有する連続レーザー、特にアルゴン、クリプトン 、ヘリウム−ネオン、ヘリウム−カドミウムレーザーまたは出力0.5mW 以上で20 MHz 以上の高周波数を有するパルスレーザーを光源として使用することを特徴と する請求項47乃至56の少なくとも1 項記載の装置。 58．発光を検出するためになだれ型ダイオード検出器などの単一光子計数を目的 とした装置が発光経路中、望ましくはピンホール開口の板中に配置され、かつ、 シグナル分析をデジタル相関器またはマルチチャンネルカウンターで行うことを 特徴とする請求項47乃至57の少なくとも1 項記載の装置。 59．測定部分が２つのキャピラリー間の試料容積内に固定され、該キャピラリー は外側に化学的に不活性な導電性コーティング、特に金属蒸着コーティング、特 にクロム・プライミング上の金蒸着コーティングが施され、前記導電性コーティ ングはコンピュータ・コントロールされる整流(rectified)電場または交流電場 に連結され、さらに測定部分を通して互いに電気的に連結されていることを特徴 とする請求項47乃至58の少なくとも1 項記載の装置。 60．互いに向き合う２つの顕微鏡光学系が測定部分を囲んでいることを特徴とす る請求項47乃至59の少なくとも1 項記載の装置。 61．分析する試料および／または洗浄液のチャージ／ディスチャージを目的とし た少なくとも１つの口を有する少なくとも１つの電気泳動セル、壁電極、リング 電極、ネハー(Neher)キャピラリー、キャピラリー末端の電極および液滴出口を 有する電気泳動装置が提供されることを特徴とする特に請求項47乃至60の少なく とも1 項記載の装置。 62．少なくとも四個の電極、望ましくはピン電極または望ましくは＜1 mmの穴が 整列しているウェハ構造物の蒸着電極を有する四極子エレメントを有する電気ト ラップであって、望ましくは少なくとも六極子配置の少なくとも２つの付加的電 極と組み合わせ、四極子エレメントには交流(alternating)電圧が提供され、か つ、六極子電極には直流(direct)電圧をかけて、その結果、その極性が 分析する分子の荷電と反対となる電気トラップを特徴とする請求項61記載の装置 。 63．試料を受け取ることを目的としたシートは、特にイオン交換リガンドまたは アフィニティーリガンド、特にオリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗 体またはキレート試薬、特にイミノ二酢酸またはニトリロ三酢酸リガンドの形で 分子誘導体化による分子に対する特異的結合性を有しており、特にシートが特異 的部位においてリガンドとして異なる結合特異性の異なる分子構造を有している ことを特徴とする請求項61および62の少なくとも1 項記載の装置。 64．試料容積が二次元または三次元的にコントロール可能な試料受容装置に固定 されており、のぞましくは試料が二次元的または三次元的ピエゾ素子を用いて測 定光学系に対して限定された空間座標に固定しうることを特徴とする請求項61乃 至63の少なくとも1 項記載の装置。 65．前記装置が限定された座標においてレーザー光を屈折し、および／または焦 点位置を明確に決定しうる装置を装着することを特徴とする請求項61乃至64の少 なくとも1 項記載の装置。 66．単一微生物、特に細菌、懸濁細胞またはウイルスを検出および／または同定 する方法であって、天然または遺伝子組み換えした膜タンパク質の表面発現構造 エレメントと蛍光標識したターゲット分子との特異的相互作用または酵素活性を 同定基準として検出する方法。 67．少なくとも１つの遺伝子産物が内膜または外膜または外皮に提示される微生 物の少なくとも１つの特異的遺伝子を検出および分取することを目的とした請求 項66記載の方法の使用。 68．限定された遺伝子セグメントの遺伝子産物の機能を決定することを目的とし た請求項66記載の方法の使用。 69．いくつかの小さい容積エレメントを共通するより大きい、またはいくつかの 小さい励起容積の内から測定容積として分析する、および／または試料内の１又 は複数の測定容積の空間座標の変化を伴い、または伴わないで連続的に分析する ことを特徴とするいくつかの小さい容積ユニット中の一つ以上の分子を同定する ことを目的とした請求項1 記載の方法。 70．全てまたはいくつかの測定容積を含む励起容積を照射する光学系を有する、 またはいくつかの励起容積の平行照射を行う光学システムを有するマルチアレイ 検出器を使用する前記方法を行うことを目的とした装置。 71．蛍光光度法を用いて望ましくは10^-14ｌ以下の小さい測定容積中の、特に1μ M以下の濃度に希釈した１つ以上の分子、分子複合体、および／または分子フラ グメントを検出することを目的とした装置であって、 (a) 第１の波長のレーザー光を発生するためのレーザー光発生装置、 (b) 測定容積内にレーザー光を高度にフォーカスし、レーザー光が基本的に測 定域のみをカバーするような測定容積にレーザー光をフォーカスすることを目的 としたフォーカシング装置、 (c) 一つ以上の分子、分子複合体および／または分子フラグメントのレーザー 光励起によって発生した蛍光を検出することを目的とした検出装置、および (d) 検出装置によって検出される蛍光量を制限するための測定容積に対して共 焦点的に蛍光の光路内の対物板に配置されたピンホール開口であって、特に直径 100 μm 以下、望ましくは20-30 μm 以下のピンホール開口、 以上(a) 乃至(d) の装置を含む装置。 72．測定容積および対物板間のイメージ・スケールが1：100、1：60または1：40 であり、かつ、測定容積は各方向に0.1 μm 以下の大きさを有する場合、前記ピ ンホール開口が各々直径約10μm、6 μm または4 μm であることを特徴とする 請求項71記載の装置。 73．レーザー光に関する光学系および／または蛍光に関する光学系が望ましくは 1.2N.A．以上の高開口数を有することを特徴とする請求項71または72記載の装置 。 74．測定容積がフォーカシング装置から最大1,000 μm まで離れていることを特 徴とする請求項71乃至73のいずれか1 項記載の装置。 75．フォーカシング装置がレーザー光をプレ・フォーカスするためのプレ・フォ ーカシング装置および測定容積上にプレ・フォーカスされたレーザー光をフォー カスするためのフォーカシング対物レンズを有することを特徴とする請求項71乃 至74のいずれか1 項記載の装置。 76．フォーカシング対物レンズと測定容積の間の距離が1,000 μm 以下であるこ とを特徴とする請求項74および75記載の装置。 77．プレフォーカシング装置およびフォーカシング対物レンズの間に半透明の鏡 を置き、フォーカシング対物レンズにプレ・フォーカスしたレーザー光を屈折さ せることを特徴とした請求項75記載の装置。 78．フォーカシング対物レンズに面さない半透鏡側にピンホール開口を配置する ことを特徴とする請求項77記載の装置。 79．検出装置が蛍光を検出するための少なくとも一つ、望ましくはそれ以上の検 出器を有することを特徴とする請求項71乃至78記載の装置。 80．ピンホール開口と検出装置の間に少なくとも一つの光学フィルター、および ／または少なくとも一つ以上の結像レンズおよび／または少なくとも一つの半透 鏡および／または少なくとも一つの反射鏡を配置することを特徴とする請求項71 乃至78記載の装置。 81．第一の波長と異なる波長の付加的レーザー光を発生するための付加的レーザ ー光発生装置、基本的に付加的レーザー光が測定容積を独占的にカバーするよう に高度に測定容積に前記付加的レーザー光をフォーカスするための付加的フォー カシング装置、一つ以上の分子、分子複合体および／または分子フラグメントの 励起によって生成する蛍光の検出を目的とした付加的検出装置、および二つの検 出装置を連結する相関ユニットを特徴とする請求項71乃至80のいずれか1 項記載 の装置。 82．(a)第一の支持アーム(65)と第一の支持アーム(65)に直行して連結された第 二の指示アーム(74)を含むT 型支持体、 (b) 二つのレーザー光および二つの蛍光に対する光学エレメント（レンズ、フ ィルター、ミラー、検出器）の光軸を合わせ、これらを支持する第二の支持アー ム(74)に面して末端に配置された支持装置(83,84)であって、フォーカスされた レーザー光が、測定容積を有し、かつ、第二の支持アーム(74)に面するように支 持され、その両端間で望ましくは中間に分離可能なように配置されているガラス スライド上に入射される装置、 (c) 二つの支持装置(83,84)が長さ方向に第二の支持アーム(74)に面して各末 端と同期して動くことができ、二つの支持装置(83,84)が第一の支持アーム(65) の方向に張り出し、二つのレーザー光が支持装置(83,84)で支持されているレー ザー光の光学エレメント上に第一の支持アーム(65)の内側から光学的開口(69)を 通して屈折鏡および／または半透鏡(66,67,72,73)によって屈折されうる、 以上(a) 乃至(c) の事項を特徴とする請求項81記載の装置。 83．レーザー光用の光学エレメントが二つの支持装置(83,84)の内側に互いに向 き合うように配置しており、かつ、蛍光用の光学エレメントが二つの支持装置(8 3,84)の外側に互いに向き合わないように配置していることを特徴とする請求項8 2記載の装置。 84．フォーカシング対物レンズの一つが、特に該フォーカシング対物レンズの焦 点のオフセットを解消するようにピエゾ素子で動かされる調節エレメントで位置 決めされうることを特徴とする請求項82または83記載の装置。