JP2004347562A - 測定装置 - Google Patents
測定装置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004347562A JP2004347562A JP2003147683A JP2003147683A JP2004347562A JP 2004347562 A JP2004347562 A JP 2004347562A JP 2003147683 A JP2003147683 A JP 2003147683A JP 2003147683 A JP2003147683 A JP 2003147683A JP 2004347562 A JP2004347562 A JP 2004347562A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- light
- receiving sensitivity
- value
- light receiving
- light intensity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Abstract
【課題】条件が様々に異なる蛍光測定に適切に対応することができる測定装置を提供する。
【解決手段】試料９からの蛍光の強度を検出し光強度値を出力する受光感度を可変可能にした光検出装置６、光検出装置６より検出される光強度値を統計解析する統計解析装置７、光検出装置６の受光感度を設定する受光感度設定値を出力する受光感度設定装置１０を具備し、測定条件により光検出装置６の受光感度が最適になるように受光感度設定装置１０の受光感度設定値を決定する。
【選択図】 図１
【解決手段】試料９からの蛍光の強度を検出し光強度値を出力する受光感度を可変可能にした光検出装置６、光検出装置６より検出される光強度値を統計解析する統計解析装置７、光検出装置６の受光感度を設定する受光感度設定値を出力する受光感度設定装置１０を具備し、測定条件により光検出装置６の受光感度が最適になるように受光感度設定装置１０の受光感度設定値を決定する。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光信号を統計解析して蛍光を測定する測定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、蛍光信号を統計解析して蛍光を測定する測定装置には、蛍光相関分光による方法を用いたものが知られている。
【０００３】
この方法を用いた蛍光相関分光装置については、例えば、非特許文献１、非特許文献２および特許文献１などで論じられている。
【０００４】
このような蛍光相関分光装置は、例えば、図４に示すように、光源装置１０１、分光装置１０２、集光装置１０３、試料１０４を載置する試料保持装置１０５、光検出装置１０６および統計解析装置１０７から構成されている。
【０００５】
このような構成において、光源装置１０１から励起光が発せられると、励起光は、分光装置１０２、集光装置１０３を経由して試料１０４に照射され、試料１０４より蛍光を発生させる。また、試料１０４からの蛍光は、集光装置１０３および分光装置１０２を経由して光検出装置１０６に入射し、光検出装置１０６から蛍光の強度を示す光強度値（蛍光信号）を出力させる。そして、この光強度値を統計解析装置１０７に入力し、統計解析を行ない、光強度統計解析値として出力するようにしている。
【０００６】
このようにして試料１０４からの蛍光強度の統計解析が行われるが、さらに蛍光相関解析では、粒子の蛍光強度のゆらぎを測定し、この結果を解析して自己相関関数を求め、この自己相関関数から対象とする粒子の拡散時間、濃度、大きさなどを推測するようにしている。
【０００７】
【特許文献１】
特表平１１−５０２６０８号公報
【０００８】
【非特許文献１】
「”Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ”Ｒ．Ｒｉｇｌｅｒ，Ｅ．Ｓ．Ｅｌｓｏｎ（ｅｄｓ．）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（Ｂｅｒｌｉｎ）」
【０００９】
【非特許文献２】
金城政孝「蛋白質核酸酵素」（１９９９）Ｖｏｌ４４，Ｎｏ．９，Ｐ１４３１−１４３７
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、従来の蛍光相関分光装置では、光検出装置１０６の受光感度が予め設定されたものに固定されている。このため、以下のような問題を生じている。
【００１１】
すなわち、試料１０４からの蛍光について適正範囲よりも強い光量を検出する場合は、光検出装置１０６に到達した光子数に対して出力される光子計数の線形性が保たれなくなって、誤った光強度値を算出してしまう。また、光強度値がある値以上になると、常に誤った一定の光強度値を出力し続けたり、メモリがオーバーフローを起こして全くでたらめな光強度値を示してしまう。さらに、強い光が検出された場合は、光検出装置１０６内部に流れる電流が大きくなり過ぎ、光検出装置１０６自身が故障してしまうこともあった。
【００１２】
逆に、試料１０４からの蛍光について適正範囲よりも微弱な光量を検出する場合は、相対的にノイズの影響が大きくなり、正しい光強度値が得られず、また、光強度の分解能も十分に得られないという問題を生じる。
【００１３】
このようにして、従来では、光検出装置１０６の光検出に適した光量の範囲について何ら考慮されておらず、このため受光量が様々に異なる測定に適切に対応することができなかった。そこで、光検出装置１０６として、予め感度の異なるものを複数個用意することが考えられるが、これでは装置が大型化し、価格的にも高価なものになってしまう。
【００１４】
一方、このような蛍光相関分光装置では、例えば、光源装置１０１から光を集光装置１０３により試料１０４上に集光させ、その集光点、つまり側定点を移動させながら、試料１０４からの蛍光を再び集光装置１０３を通して光検出装置１０６で検出するようにもしている。
【００１５】
この場合、光検出装置１０６で検出される光強度値は、縦軸を光子計数、横軸を時間（／マイクロ秒）で表わした図５に示すようにして得られる。つまり、光検出装置１０６では、パルス状の光が検出される。
【００１６】
ところが、このパルス状の光は、各時間窓（図５中では１マイクロ秒）の光量であるため、これら時間窓ごとの光量が様々に異なる測定に対応することができなかった。
【００１７】
このように、従来の装置では、光検出装置１０６の光検出に適した各時間窓の光量の範囲についても何ら考慮されておらず、このため光検出装置１０６の個数を増やすことなく、各時間窓の光量が様々に異なる測定についても適切に対応することができなかった。
【００１８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、条件が様々に異なる蛍光測定に適切に対応することができる測定装置を提供することを目的とする。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、試料からの蛍光の強度を検出し光強度値を出力する受光感度を可変可能にした光検出手段と、前記光検出手段より検出される光強度値を統計解析する統計解析手段と、前記光検出手段の受光感度を設定する受光感度設定値を出力する受光感度設定手段と、を具備し、蛍光測定条件により前記光検出手段の受光感度が最適になるように前記受光感度設定手段の受光感度設定値を決定することを特徴としている。
【００２０】
請求項２記載の発明は、試料からの蛍光の強度を検出し光強度値を出力する受光感度を可変可能にした光検出手段と、前記光検出手段より検出される光強度値を統計解析し光強度統計解析値を出力する統計解析手段と、前記光検出手段の受光感度を設定する受光感度設定値を出力する受光感度設定手段と、を具備し、
前記統計解析手段の光強度統計解析値に応じて前記光検出手段の受光感度を最適になるように前記受光感度設定手段の受光感度設定値を決定することを特徴としている。
【００２１】
請求項３記載の発明は、試料からの蛍光の強度を検出し光強度値を出力する受光感度を可変可能にした光検出手段と、前記光検出手段より検出される光強度値を統計解析し光強度統計解析値を出力する統計解析手段と、前記光検出手段の光強度値または前記統計解析手段の光強度統計解析値に応じて前記光検出手段の受光感度を設定する受光感度設定値を出力する受光感度設定手段と、前記試料上での光強度の測定点の位置を移動させるとともに、測定点の位置データを出力する測定点移動手段と、前記測定点移動手段の測定点位置データと前記光検出手段の光強度値に基づいて観察像を生成する画像処理手段とを具備したことを特徴としている。
【００２２】
請求項４記載の発明は、請求項３記載の発明において、画像処理手段は、受光感度設定手段の受光感度設定値により前記光検出手段の光強度値を補正し、該補正された光強度値と前記測定点移動手段の測定点位置データに基づいて観察像を生成することを特徴としている。
【００２３】
この結果、本発明によれば、蛍光測定の条件により光検出手段の受光感度が最適になるように受光感度設定手段の受光感度設定値を決定しているので、光検出手段の個数を増やすことなく、受光量が様々に異なる測定に適切に対応することができる。
【００２４】
また、本発明によれば、統計解析手段の光強度統計解析値に応じて光検出手段の受光感度が最適になるように受光感度設定手段の受光感度設定値を決定しているので、光検出手段の個数を増やすことなく、各時間窓の光量が様々に異なる測定にも適切に対応することができる。
【００２５】
さらに、本発明によれば、蛍光像測定や蛍光相関測定において、光量が様々に異なる測定にも適切に対応することができる。また、光検出手段の光強度値を、受光感度設定手段の受光感度設定値により補正し、この補正された光強度値と測定点移動手段の測定点位置データから観察像を求めるようにしているので、精度の高い像を取得することができる。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００２７】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明が適用される測定装置の概略構成を示している。図において、１は光源装置で、この光源装置１には、励起光発生源として、例えば発振波長４８８ｍｍのアルゴンレーザが用いられている。
【００２８】
光源装置１からの光路上には、分光装置２が配置されている。この分光装置２には、例えば波長５００ｍｍ以下の光を反射し、５００ｍｍ以上の光を透過するダイクロイックミラーが用いられる。
【００２９】
分光装置２の反射光路には、測定点移動手段としての測定点移動装置３、集光装置４および試料保持装置５が配置されている。ここで、測定点移動装置３には、ガルバノスキャナーが用いられる。集光装置４には、例えば倍率４０倍で開口数１．２の対物レンズが用いられる。さらに、試料保持装置５は、顕微鏡用試料ステージで、この試料保持装置５には、試料９が載置されている。
【００３０】
分光装置２の透過光路には、光検出手段としての光検出装置６が配置されている。この光検出装置６には、光電子増倍管が用いられていて、分光装置２を介して入射される試料９からの蛍光を検出し、このときの蛍光量に応じた光強度値を出力するようになっている。
【００３１】
光検出装置６には、統計解析手段としての光強度統計解析装置７が接続されている。この光強度統計解析装置７は、統計解析を行うための相関関数解析ボードが設けられており、光検出装置６より入力される光強度値を統計解析して統計解析値を求め、この結果を外部に出力するようにしている。
【００３２】
光検出装置６には、画像処理手段としての画像処理装置８が接続されている。この画像処理装置８には、パーソナルコンピューターが用いられている。画像処理装置８は、測定点移動装置３からの測定点位置データと光検出装置６からの光強度値に基づいて、試料９の観察像として蛍光像を生成するようになっている。そして、この蛍光像は外部へ出力される。
【００３３】
光検出装置６には、受光感度設定手段としての受光感度設定装置１０が接続されている。この受光感度設定装置１０は、画像処理装置８と同様のパーソナルコンピューターが用いられ、光検出装置６に対して受光感度設定値を出力し、蛍光像測定に最適な受光感度を設定するようになっている。
【００３４】
なお、試料９として細胞を観察するような場合は、例えば、細胞内部はローダミングリーン色素で、細胞膜は炭素数１８程度のアルキル鎖で修飾されたローダミングリーンで標識するのが望ましい。また、分光装置２から集光装置４および光検出装置６などの光路には、各種レンズ、ミラーおよびピンホールなどの光学部品が適宜用いられている。さらに、光検出装置６の光学系は共焦点光学系であることが望ましい。
【００３５】
次に、このように構成した実施の形態を説明する。
【００３６】
光源装置１から励起光が出射されると、この励起光は、分光装置２で反射し、測定点移動装置３、集光装置４を通過して試料９に照射される。試料９は、励起光の照射により蛍光を発する。この試料９より発せられた蛍光は、集光装置４、測定点移動装置３を通り、分光装置２を透過して光検出装置６に入射される。
【００３７】
この場合、測定点移動装置３により試料９上の測定点の位置が制御される。このときの試料９上の移動位置は、励起光路と蛍光光路が一致しているので、これらの光路を一つの測定点移動装置３により移動させることができる。
【００３８】
光検出装置６は、入射される蛍光の強度に対応した光強度値を出力する。光検出装置６から出力される光強度値は、光強度統計解析装置７と画像処理装置８に送られる。
【００３９】
光強度統計解析装置７は、相関関数解析ボードにより光強度値を統計解析して光強度統計解析値を求め、この光強度統計解析値を外部に出力する。
【００４０】
また、画像処理装置８では、光検出装置６から出力される光強度値と測定点移動装置３から出力される試料９上の測定点の位置を示す測定点位置データから試料９の蛍光像を形成する。この蛍光像は外部へ出力される。
【００４１】
ところで、蛍光相関測定においては、測定位置を試料９上の特定の位置に合わせることができると便利であり、従って試料９の蛍光像があると、位置合わせが簡単にできる。また、蛍光相関測定では、試料９の蛍光像を取得するのと同じ光検出装置６を用いるのが望ましい。
【００４２】
しかしながら、蛍光相関測定には、蛍光像の取得時に比べ、光検出装置６に入射される光量が極端に少なくてよい。このため、蛍光像の取得に合わせて光検出装置６の受光感度を最適化してしまうと、蛍光相関測定の適正範囲よりも強い光量を検出することとなり誤検出を生ずるおそれがある。一方で、蛍光相関測定に合わせて光検出装置６の受光感度を最適化してしまうと、蛍光像の取得に十分な蛍光強度のダイナミックレンジが得られず、良質な蛍光像を取得することができないことがある。
【００４３】
そこで、本実施の形態では、次にようにしている。
【００４４】
ここでは、具体例として、試料９が細胞で、この細胞の細胞膜の流動性を測定するような場合を取り上げる。また、始めに試料９の蛍光像を取得し、この蛍光像を基に細胞膜の位置を特定し、この特定した位置で蛍光相関測定を行うようにする。
【００４５】
まず、受光感度設定装置１０の受光感度設定値により、光検出装置６の受光感度を蛍光像測定に適した値に設定する。このときの感度設定は、光検出装置６である光電子増倍管への印加電圧を調整することにより行われる。
【００４６】
この状態から、上述した動作を実行し、画像処理装置８おいて、光検出装置６から出力される光強度値と測定点移動装置３から出力される試料９上の測定点の位置を示す測定点位置データから試料９の蛍光像を取得する。この蛍光像より細胞膜の位置を特定することが可能となる。
【００４７】
次に、受光感度設定装置１０の受光感度設定値を変えて、光検出装置６の受光感度を蛍光相関測定に適した値に切り替える。このときの感度設定も、光検出装置６である光電子増倍管への印加電圧を調整することにより行われる。
【００４８】
この状態から、再び上述した蛍光測定を実行し、事前に特定された細胞膜の位置での蛍光相関測定を行い、細胞膜の流動性を求めるようにする。
【００４９】
同様にして、蛍光発光量が試料９内部や試料９間で、異なる蛍光相関測定を行なう場合も適用される。
【００５０】
従って、このようにすれば、蛍光測定の条件に応じて、光検出装置６の受光感度を最適に設定できるので、光検出装置６の個数を増やすことなく、例えば、蛍光像測定や蛍光相関測定などの光量が様々異なる測定に対して、光検出装置６により最適な蛍光測定を行なうことができる。また、光検出装置６の感度設定は、光検出装置６である光電子増倍管への印加電圧を調整することにより行われ、フィルターなどの光学調整に影響を与えるものを使用していないので、光学調整に影響を与えることなく、この発明を実施できるという特有の効果がある。
【００５１】
なお、第１の実施の形態の各構成は、各種の変形、変更が可能である。例えば、受光感度設定装置１０へ様々な装置からのデータや各種の設定条件を入力し、それらに基づいて受光感度設定値を出力してもよい。また、測定点位置データは、測定点移動装置３以外の他の手段から得るようにしてもよい。例えば、測定点移動装置３の代わりに可動式の試料保持装置を用いることができる。また、測定点移動装置３の設置位置を変えることもできる。さらに、励起光路と検出光路の重なる領域が無いようにすることで、分光装置２を省略することができる。あるいは、試料９が十分な蛍光を発する場合、光源装置１及び分光装置２は省略できる。さらにまた、複数の励起光学系や複数の検出光学系で構成したり、検出された信号を様々に処理したりして、特殊な効果を得ることができる。
【００５２】
（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。
【００５３】
図２は、第２の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００５４】
この場合、受光感度設定装置１０は、光強度統計解析装置７の光強度統計解析値が入力され、この光強度統計解析値に応じて光検出装置６の受光感度が最適になるように受光感度設定値を決定するようになっている。また、画像処理装置８は、省略されている。
【００５５】
その他は、図１と同様である。
【００５６】
次に、このように構成した実施の形態を説明する。
【００５７】
光源装置１から励起光が出射されると、この励起光は、分光装置２で反射し、測定点移動装置３、集光装置４を通過して試料９に照射される。試料９は、励起光の照射により蛍光を発する。この試料９より発せられた蛍光は、集光装置４、測定点移動装置３を通り、分光装置２を透過して光検出装置６に入射される。
【００５８】
この場合も、測定点移動装置３により試料９上の測定点の位置が制御される。このときの試料９上の移動位置は、励起光路と蛍光光路が一致しているので、これらの光路を一つの測定点移動装置３により移動させることができる。
【００５９】
光検出装置６は、入射される蛍光の強度に対応した光強度値を出力する。光検出装置６から出力される光強度値は、光強度統計解析装置７に送られる。
【００６０】
光強度統計解析装置７は、相関関数解析ボードにより光強度値を統計解析して光強度統計解析値を求め、この光強度統計解析値を外部に出力すると同時に、受光感度設定装置１０に出力する。
【００６１】
受光感度設定装置１０は、光強度統計解析装置７からの光強度統計解析値に基づいて光検出装置６の受光感度が最適になるように受光感度設定値を決定する。この受光感度設定値は、光検出装置６に向け出力され、光検出装置６の感度が設定される。
【００６２】
この場合、光強度統計解析装置７の光強度統計解析値は、１粒子当たりの蛍光発光量に相当するもので、図５で述べた各時間窓ごとの光量が、受光感度設定装置１０からの受光感度設定値として光検出装置６にフィードバックされる。
【００６３】
これにより、図５に示すように各時間窓ごと光量が様々に異なる場合も、光検出装置６の受光感度は最適化されるので、このとき受光感度により最適な蛍光測定を行なうことができる。この場合の光検出装置６の感度の自動化は、光検出装置６である光電子増倍管への印加電圧を調整することにより行われる。
【００６４】
また、１粒子当たりの蛍光発光量が異なるようなサンプルを測定する場合も、光検出装置６の受光感度が自動的に最適化されるので、この受光感度により最適な測定を行なうことができる。
【００６５】
従って、このようにすれば、各時間窓ごとの光量の範囲に対して光検出装置６の受光感度が自動的に最適化されるので、光検出装置６の個数を増やすことなく、各時間窓の光量が様々に異なるような場合も、光検出装置６により最適な蛍光測定を行なうことができる。また、光検出装置６の感度の自動化は、光検出装置６である光電子増倍管への印加電圧を調整することにより行われ、フィルターなどの光学調整に影響を与えるものを使用していないので、光学調整に影響を与えることなく、この発明を実施できるという特有の効果がある。
【００６６】
なお、第２の実施の形態の各構成は、各種の変形、変更が可能である。例えば、受光感度設定装置１０へ様々な装置からのデータや各種の設定条件を入力し、それらに基づいて受光感度設定値を出力してもよい。また、測定点位置データは、測定点移動装置３の他の手段から得るようにしてもよい。例えば、測定点移動装置３の代わりに可動式の試料保持装置を用いることができる。また、測定点移動装置３の設置位置を変えることもできる。さらに、励起光路と検出光路の重なる領域が無いようにすることで、分光装置２を省略することができる。あるいは、試料９が十分な蛍光を発する場合、光源装置１及び分光装置２は省略できる。さらにまた、複数の励起光学系や複数の検出光学系で構成したり、検出された信号を様々に処理したりして、特殊な効果を得ることができる。
【００６７】
（第３の実施の形態）
次に、本発明の第３の実施の形態を説明する。
【００６８】
図３は、第３の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００６９】
この場合、受光感度設定装置１０は、光強度統計解析装置７の光強度統計解析値と光検出装置６の光強度値が入力され、これら光強度統計解析値と光強度値に基づいて受光感度設定値を決定するようになっている。また、受光感度設定装置１０の受光感度設定値は、光検出装置６に出力されると同時に、画像処理装置８にも出力されるようになっている。画像処理装置８は、受光感度設定装置１０より与えられる受光感度設定値に基づいて光検出装置６の光強度値を補正し、この補正した光強度値と測定点移動装置３から出力される試料９上の測定点の位置を示す測定点位置データから試料９の観察像として蛍光像を形成するようになっている。
【００７０】
その他は、図１と同様である。
【００７１】
次に、このように構成した実施の形態を説明する。
【００７２】
まず、光強度統計解析値取得は、以下の動作により行われる。
【００７３】
光源装置１から励起光が出射されると、この励起光は、分光装置２で反射し、測定点移動装置３、集光装置４を通過して試料９に照射される。試料９は、励起光の照射により蛍光を発する。この試料９より発せられた蛍光は、集光装置４、測定点移動装置３を通り、分光装置２を透過して光検出装置６に入射される。
【００７４】
この場合も、測定点移動装置３により試料９上の測定点の位置が制御される。このときの試料９上の移動位置は、励起光路と蛍光光路が一致しているので、これらの光路を一つの測定点移動装置３により移動させることができる。
【００７５】
光検出装置６は、入射される蛍光の強度に対応した光強度値を出力する。光検出装置６から出力される光強度値は、光強度統計解析装置７に送られると同時に、受光感度設定装置１０にも送られる。
【００７６】
光強度統計解析装置７は、相関関数解析ボードにより光強度値を統計解析して光強度統計解析値を求め、この光強度統計解析値を外部に出力すると同時に、受光感度設定装置１０に出力する。
【００７７】
受光感度設定装置１０は、光強度統計解析装置７からの光強度統計解析値に基づいて受光感度設定値を決定する。この受光感度設定値は、光検出装置６に向け出力され、光検出装置６の受光感度が設定される。
【００７８】
これにより、第２の実施の形態で述べたと同様にして各時間窓ごとの光量の範囲に対して光検出装置６の受光感度が自動的に最適化されるので、各時間窓の光量が様々に異なるような場合も、光検出装置６により最適な測定を行なうことができる。
【００７９】
一方、蛍光像取得時は以下のように作用する。
【００８０】
光源装置１から励起光が出射されると、この励起光は、分光装置２で反射し、測定点移動装置３、集光装置４を通過して試料９に照射される。試料９は、励起光の照射により蛍光を発する。この試料９より発せられた蛍光は、集光装置４、測定点移動装置３を通り、分光装置２を透過して光検出装置６に入射される。
【００８１】
この場合も、測定点移動装置３により試料９上の測定点の位置が制御される。このときの試料９上の移動位置は、励起光路と蛍光光路が一致しているので、これらの光路を一つの測定点移動装置３により移動させることができる。
【００８２】
光検出装置６は、入射される蛍光の強度に対応した光強度値を出力する。光検出装置６から出力される光強度値は、光強度統計解析装置７、画像処理装置８および受光感度設定装置１０に送られる。
【００８３】
受光感度設定装置１０では、光検出装置６から出力される光強度値に基づいて受光感度設定値を決定する。この受光感度設定値は、光検出装置６に出力されると同時に、画像処理装置８にも送られる。
【００８４】
光検出装置６は、このときの受光感度設定値により受光感度が設定される。また、画像処理装置８では、光検出装置６からの光強度値を、受光感度設定装置１０より与えられる受光感度設定値により補正し、この補正された光強度値と測定点移動装置３から出力される試料９上の測定点の位置を示す測定点位置データから試料９の蛍光像を形成する。この蛍光像は外部へ出力される。
【００８５】
このようにすれば、例えば、試料９が細胞であり、この細胞の細胞膜の流動性を測定するような場合、始めに画像処理装置８により試料９の蛍光像を取得し、この蛍光像を用いて細胞膜の位置を特定する。そして、この特定された細胞膜の位置について蛍光相関測定を行うことにより、細胞膜の流動性を求めることができる。
【００８６】
この場合も、光強度統計解析装置７の光強度統計解析値および光検出装置６の光強度値が光感度設定値として光検出装置６にフィードバックされ、光検出装置６の受光感度は自動的に最適化されるので、このときの受光感度により最適な蛍光測定を行なうことができる。この場合の光検出装置６の受光感度の自動化は、光検出装置６である光電子増倍管への印加電圧を調整することにより行われる。
【００８７】
従って、このようにしても、蛍光像取得の際は、光検出装置６からの光強度値に基づいた受光感度設定装置１０の受光感度設定値により光検出装置６の受光感度が自動的に最適化され、また、光強度統計解析値取得の際は、各時間窓ごとの光量の範囲に対して光検出装置６の受光感度が自動的に最適化されるので、蛍光像測定や蛍光相関測定において光量が様々異なる測定に対しても、光検出装置６により最適な蛍光測定を行なうことができる。また、蛍光像は、光検出装置６の光強度値を、受光感度設定装置１０からの受光感度設定値により補正し、この補正された光強度値と測定点移動装置３からの測定点位置データから求めるようにしているので、精度の高い蛍光像を取得することもできる。
【００８８】
また、この場合も、光検出装置６の感度の自動化は、光検出装置６である光電子増倍管への印加電圧を変化させることにより行われ、フィルターなどの光学調整に影響を与えるものを使用していないので、光学調整に影響を与えることなく、この発明を実施できるという特有の効果がある。
【００８９】
なお、第３の実施の形態の各構成は、各種の変形、変更が可能である。例えば、受光感度設定装置１０へ様々な装置からのデータや各種の設定条件を入力し、それらに基づいて受光感度設定値を出力してもよい。また、測定点位置データは、測定点移動装置３以外の他の手段から得るようにしてもよい。例えば、測定点移動装置３の代わりに可動式の試料保持装置を用いることができる。また、測定点移動装置３の設置位置を変えることもできる。さらに、励起光路と検出光路の重なる領域が無いようにすることで、分光装置２を省略することができる。あるいは、試料９が十分な蛍光を発する場合、光源装置１及び分光装置２は省略できる。さらにまた、複数の励起光学系や複数の検出光学系で構成したり、検出された信号を様々に処理したりして、特殊な効果を得ることができる。
【００９０】
その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。
【００９１】
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【００９２】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、条件が様々に異なる蛍光測定に適切に対応することができる測定装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【図３】本発明の第３の実施の形態の概略構成を示す図。
【図４】従来の測定装置の概略構成を示す図。
【図５】従来の測定装置の光検出装置で検出される光強度値を説明する図。
【符号の説明】
１…光源装置
２…分光装置
３…測定点移動装置
４…集光装置
５…試料保持装置
６…光検出装置
７…光強度統計解析装置
８…画像処理装置
９…試料
１０…受光感度設定装置
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光信号を統計解析して蛍光を測定する測定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、蛍光信号を統計解析して蛍光を測定する測定装置には、蛍光相関分光による方法を用いたものが知られている。
【０００３】
この方法を用いた蛍光相関分光装置については、例えば、非特許文献１、非特許文献２および特許文献１などで論じられている。
【０００４】
このような蛍光相関分光装置は、例えば、図４に示すように、光源装置１０１、分光装置１０２、集光装置１０３、試料１０４を載置する試料保持装置１０５、光検出装置１０６および統計解析装置１０７から構成されている。
【０００５】
このような構成において、光源装置１０１から励起光が発せられると、励起光は、分光装置１０２、集光装置１０３を経由して試料１０４に照射され、試料１０４より蛍光を発生させる。また、試料１０４からの蛍光は、集光装置１０３および分光装置１０２を経由して光検出装置１０６に入射し、光検出装置１０６から蛍光の強度を示す光強度値（蛍光信号）を出力させる。そして、この光強度値を統計解析装置１０７に入力し、統計解析を行ない、光強度統計解析値として出力するようにしている。
【０００６】
このようにして試料１０４からの蛍光強度の統計解析が行われるが、さらに蛍光相関解析では、粒子の蛍光強度のゆらぎを測定し、この結果を解析して自己相関関数を求め、この自己相関関数から対象とする粒子の拡散時間、濃度、大きさなどを推測するようにしている。
【０００７】
【特許文献１】
特表平１１−５０２６０８号公報
【０００８】
【非特許文献１】
「”Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ”Ｒ．Ｒｉｇｌｅｒ，Ｅ．Ｓ．Ｅｌｓｏｎ（ｅｄｓ．）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（Ｂｅｒｌｉｎ）」
【０００９】
【非特許文献２】
金城政孝「蛋白質核酸酵素」（１９９９）Ｖｏｌ４４，Ｎｏ．９，Ｐ１４３１−１４３７
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、従来の蛍光相関分光装置では、光検出装置１０６の受光感度が予め設定されたものに固定されている。このため、以下のような問題を生じている。
【００１１】
すなわち、試料１０４からの蛍光について適正範囲よりも強い光量を検出する場合は、光検出装置１０６に到達した光子数に対して出力される光子計数の線形性が保たれなくなって、誤った光強度値を算出してしまう。また、光強度値がある値以上になると、常に誤った一定の光強度値を出力し続けたり、メモリがオーバーフローを起こして全くでたらめな光強度値を示してしまう。さらに、強い光が検出された場合は、光検出装置１０６内部に流れる電流が大きくなり過ぎ、光検出装置１０６自身が故障してしまうこともあった。
【００１２】
逆に、試料１０４からの蛍光について適正範囲よりも微弱な光量を検出する場合は、相対的にノイズの影響が大きくなり、正しい光強度値が得られず、また、光強度の分解能も十分に得られないという問題を生じる。
【００１３】
このようにして、従来では、光検出装置１０６の光検出に適した光量の範囲について何ら考慮されておらず、このため受光量が様々に異なる測定に適切に対応することができなかった。そこで、光検出装置１０６として、予め感度の異なるものを複数個用意することが考えられるが、これでは装置が大型化し、価格的にも高価なものになってしまう。
【００１４】
一方、このような蛍光相関分光装置では、例えば、光源装置１０１から光を集光装置１０３により試料１０４上に集光させ、その集光点、つまり側定点を移動させながら、試料１０４からの蛍光を再び集光装置１０３を通して光検出装置１０６で検出するようにもしている。
【００１５】
この場合、光検出装置１０６で検出される光強度値は、縦軸を光子計数、横軸を時間（／マイクロ秒）で表わした図５に示すようにして得られる。つまり、光検出装置１０６では、パルス状の光が検出される。
【００１６】
ところが、このパルス状の光は、各時間窓（図５中では１マイクロ秒）の光量であるため、これら時間窓ごとの光量が様々に異なる測定に対応することができなかった。
【００１７】
このように、従来の装置では、光検出装置１０６の光検出に適した各時間窓の光量の範囲についても何ら考慮されておらず、このため光検出装置１０６の個数を増やすことなく、各時間窓の光量が様々に異なる測定についても適切に対応することができなかった。
【００１８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、条件が様々に異なる蛍光測定に適切に対応することができる測定装置を提供することを目的とする。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、試料からの蛍光の強度を検出し光強度値を出力する受光感度を可変可能にした光検出手段と、前記光検出手段より検出される光強度値を統計解析する統計解析手段と、前記光検出手段の受光感度を設定する受光感度設定値を出力する受光感度設定手段と、を具備し、蛍光測定条件により前記光検出手段の受光感度が最適になるように前記受光感度設定手段の受光感度設定値を決定することを特徴としている。
【００２０】
請求項２記載の発明は、試料からの蛍光の強度を検出し光強度値を出力する受光感度を可変可能にした光検出手段と、前記光検出手段より検出される光強度値を統計解析し光強度統計解析値を出力する統計解析手段と、前記光検出手段の受光感度を設定する受光感度設定値を出力する受光感度設定手段と、を具備し、
前記統計解析手段の光強度統計解析値に応じて前記光検出手段の受光感度を最適になるように前記受光感度設定手段の受光感度設定値を決定することを特徴としている。
【００２１】
請求項３記載の発明は、試料からの蛍光の強度を検出し光強度値を出力する受光感度を可変可能にした光検出手段と、前記光検出手段より検出される光強度値を統計解析し光強度統計解析値を出力する統計解析手段と、前記光検出手段の光強度値または前記統計解析手段の光強度統計解析値に応じて前記光検出手段の受光感度を設定する受光感度設定値を出力する受光感度設定手段と、前記試料上での光強度の測定点の位置を移動させるとともに、測定点の位置データを出力する測定点移動手段と、前記測定点移動手段の測定点位置データと前記光検出手段の光強度値に基づいて観察像を生成する画像処理手段とを具備したことを特徴としている。
【００２２】
請求項４記載の発明は、請求項３記載の発明において、画像処理手段は、受光感度設定手段の受光感度設定値により前記光検出手段の光強度値を補正し、該補正された光強度値と前記測定点移動手段の測定点位置データに基づいて観察像を生成することを特徴としている。
【００２３】
この結果、本発明によれば、蛍光測定の条件により光検出手段の受光感度が最適になるように受光感度設定手段の受光感度設定値を決定しているので、光検出手段の個数を増やすことなく、受光量が様々に異なる測定に適切に対応することができる。
【００２４】
また、本発明によれば、統計解析手段の光強度統計解析値に応じて光検出手段の受光感度が最適になるように受光感度設定手段の受光感度設定値を決定しているので、光検出手段の個数を増やすことなく、各時間窓の光量が様々に異なる測定にも適切に対応することができる。
【００２５】
さらに、本発明によれば、蛍光像測定や蛍光相関測定において、光量が様々に異なる測定にも適切に対応することができる。また、光検出手段の光強度値を、受光感度設定手段の受光感度設定値により補正し、この補正された光強度値と測定点移動手段の測定点位置データから観察像を求めるようにしているので、精度の高い像を取得することができる。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００２７】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明が適用される測定装置の概略構成を示している。図において、１は光源装置で、この光源装置１には、励起光発生源として、例えば発振波長４８８ｍｍのアルゴンレーザが用いられている。
【００２８】
光源装置１からの光路上には、分光装置２が配置されている。この分光装置２には、例えば波長５００ｍｍ以下の光を反射し、５００ｍｍ以上の光を透過するダイクロイックミラーが用いられる。
【００２９】
分光装置２の反射光路には、測定点移動手段としての測定点移動装置３、集光装置４および試料保持装置５が配置されている。ここで、測定点移動装置３には、ガルバノスキャナーが用いられる。集光装置４には、例えば倍率４０倍で開口数１．２の対物レンズが用いられる。さらに、試料保持装置５は、顕微鏡用試料ステージで、この試料保持装置５には、試料９が載置されている。
【００３０】
分光装置２の透過光路には、光検出手段としての光検出装置６が配置されている。この光検出装置６には、光電子増倍管が用いられていて、分光装置２を介して入射される試料９からの蛍光を検出し、このときの蛍光量に応じた光強度値を出力するようになっている。
【００３１】
光検出装置６には、統計解析手段としての光強度統計解析装置７が接続されている。この光強度統計解析装置７は、統計解析を行うための相関関数解析ボードが設けられており、光検出装置６より入力される光強度値を統計解析して統計解析値を求め、この結果を外部に出力するようにしている。
【００３２】
光検出装置６には、画像処理手段としての画像処理装置８が接続されている。この画像処理装置８には、パーソナルコンピューターが用いられている。画像処理装置８は、測定点移動装置３からの測定点位置データと光検出装置６からの光強度値に基づいて、試料９の観察像として蛍光像を生成するようになっている。そして、この蛍光像は外部へ出力される。
【００３３】
光検出装置６には、受光感度設定手段としての受光感度設定装置１０が接続されている。この受光感度設定装置１０は、画像処理装置８と同様のパーソナルコンピューターが用いられ、光検出装置６に対して受光感度設定値を出力し、蛍光像測定に最適な受光感度を設定するようになっている。
【００３４】
なお、試料９として細胞を観察するような場合は、例えば、細胞内部はローダミングリーン色素で、細胞膜は炭素数１８程度のアルキル鎖で修飾されたローダミングリーンで標識するのが望ましい。また、分光装置２から集光装置４および光検出装置６などの光路には、各種レンズ、ミラーおよびピンホールなどの光学部品が適宜用いられている。さらに、光検出装置６の光学系は共焦点光学系であることが望ましい。
【００３５】
次に、このように構成した実施の形態を説明する。
【００３６】
光源装置１から励起光が出射されると、この励起光は、分光装置２で反射し、測定点移動装置３、集光装置４を通過して試料９に照射される。試料９は、励起光の照射により蛍光を発する。この試料９より発せられた蛍光は、集光装置４、測定点移動装置３を通り、分光装置２を透過して光検出装置６に入射される。
【００３７】
この場合、測定点移動装置３により試料９上の測定点の位置が制御される。このときの試料９上の移動位置は、励起光路と蛍光光路が一致しているので、これらの光路を一つの測定点移動装置３により移動させることができる。
【００３８】
光検出装置６は、入射される蛍光の強度に対応した光強度値を出力する。光検出装置６から出力される光強度値は、光強度統計解析装置７と画像処理装置８に送られる。
【００３９】
光強度統計解析装置７は、相関関数解析ボードにより光強度値を統計解析して光強度統計解析値を求め、この光強度統計解析値を外部に出力する。
【００４０】
また、画像処理装置８では、光検出装置６から出力される光強度値と測定点移動装置３から出力される試料９上の測定点の位置を示す測定点位置データから試料９の蛍光像を形成する。この蛍光像は外部へ出力される。
【００４１】
ところで、蛍光相関測定においては、測定位置を試料９上の特定の位置に合わせることができると便利であり、従って試料９の蛍光像があると、位置合わせが簡単にできる。また、蛍光相関測定では、試料９の蛍光像を取得するのと同じ光検出装置６を用いるのが望ましい。
【００４２】
しかしながら、蛍光相関測定には、蛍光像の取得時に比べ、光検出装置６に入射される光量が極端に少なくてよい。このため、蛍光像の取得に合わせて光検出装置６の受光感度を最適化してしまうと、蛍光相関測定の適正範囲よりも強い光量を検出することとなり誤検出を生ずるおそれがある。一方で、蛍光相関測定に合わせて光検出装置６の受光感度を最適化してしまうと、蛍光像の取得に十分な蛍光強度のダイナミックレンジが得られず、良質な蛍光像を取得することができないことがある。
【００４３】
そこで、本実施の形態では、次にようにしている。
【００４４】
ここでは、具体例として、試料９が細胞で、この細胞の細胞膜の流動性を測定するような場合を取り上げる。また、始めに試料９の蛍光像を取得し、この蛍光像を基に細胞膜の位置を特定し、この特定した位置で蛍光相関測定を行うようにする。
【００４５】
まず、受光感度設定装置１０の受光感度設定値により、光検出装置６の受光感度を蛍光像測定に適した値に設定する。このときの感度設定は、光検出装置６である光電子増倍管への印加電圧を調整することにより行われる。
【００４６】
この状態から、上述した動作を実行し、画像処理装置８おいて、光検出装置６から出力される光強度値と測定点移動装置３から出力される試料９上の測定点の位置を示す測定点位置データから試料９の蛍光像を取得する。この蛍光像より細胞膜の位置を特定することが可能となる。
【００４７】
次に、受光感度設定装置１０の受光感度設定値を変えて、光検出装置６の受光感度を蛍光相関測定に適した値に切り替える。このときの感度設定も、光検出装置６である光電子増倍管への印加電圧を調整することにより行われる。
【００４８】
この状態から、再び上述した蛍光測定を実行し、事前に特定された細胞膜の位置での蛍光相関測定を行い、細胞膜の流動性を求めるようにする。
【００４９】
同様にして、蛍光発光量が試料９内部や試料９間で、異なる蛍光相関測定を行なう場合も適用される。
【００５０】
従って、このようにすれば、蛍光測定の条件に応じて、光検出装置６の受光感度を最適に設定できるので、光検出装置６の個数を増やすことなく、例えば、蛍光像測定や蛍光相関測定などの光量が様々異なる測定に対して、光検出装置６により最適な蛍光測定を行なうことができる。また、光検出装置６の感度設定は、光検出装置６である光電子増倍管への印加電圧を調整することにより行われ、フィルターなどの光学調整に影響を与えるものを使用していないので、光学調整に影響を与えることなく、この発明を実施できるという特有の効果がある。
【００５１】
なお、第１の実施の形態の各構成は、各種の変形、変更が可能である。例えば、受光感度設定装置１０へ様々な装置からのデータや各種の設定条件を入力し、それらに基づいて受光感度設定値を出力してもよい。また、測定点位置データは、測定点移動装置３以外の他の手段から得るようにしてもよい。例えば、測定点移動装置３の代わりに可動式の試料保持装置を用いることができる。また、測定点移動装置３の設置位置を変えることもできる。さらに、励起光路と検出光路の重なる領域が無いようにすることで、分光装置２を省略することができる。あるいは、試料９が十分な蛍光を発する場合、光源装置１及び分光装置２は省略できる。さらにまた、複数の励起光学系や複数の検出光学系で構成したり、検出された信号を様々に処理したりして、特殊な効果を得ることができる。
【００５２】
（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。
【００５３】
図２は、第２の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００５４】
この場合、受光感度設定装置１０は、光強度統計解析装置７の光強度統計解析値が入力され、この光強度統計解析値に応じて光検出装置６の受光感度が最適になるように受光感度設定値を決定するようになっている。また、画像処理装置８は、省略されている。
【００５５】
その他は、図１と同様である。
【００５６】
次に、このように構成した実施の形態を説明する。
【００５７】
光源装置１から励起光が出射されると、この励起光は、分光装置２で反射し、測定点移動装置３、集光装置４を通過して試料９に照射される。試料９は、励起光の照射により蛍光を発する。この試料９より発せられた蛍光は、集光装置４、測定点移動装置３を通り、分光装置２を透過して光検出装置６に入射される。
【００５８】
この場合も、測定点移動装置３により試料９上の測定点の位置が制御される。このときの試料９上の移動位置は、励起光路と蛍光光路が一致しているので、これらの光路を一つの測定点移動装置３により移動させることができる。
【００５９】
光検出装置６は、入射される蛍光の強度に対応した光強度値を出力する。光検出装置６から出力される光強度値は、光強度統計解析装置７に送られる。
【００６０】
光強度統計解析装置７は、相関関数解析ボードにより光強度値を統計解析して光強度統計解析値を求め、この光強度統計解析値を外部に出力すると同時に、受光感度設定装置１０に出力する。
【００６１】
受光感度設定装置１０は、光強度統計解析装置７からの光強度統計解析値に基づいて光検出装置６の受光感度が最適になるように受光感度設定値を決定する。この受光感度設定値は、光検出装置６に向け出力され、光検出装置６の感度が設定される。
【００６２】
この場合、光強度統計解析装置７の光強度統計解析値は、１粒子当たりの蛍光発光量に相当するもので、図５で述べた各時間窓ごとの光量が、受光感度設定装置１０からの受光感度設定値として光検出装置６にフィードバックされる。
【００６３】
これにより、図５に示すように各時間窓ごと光量が様々に異なる場合も、光検出装置６の受光感度は最適化されるので、このとき受光感度により最適な蛍光測定を行なうことができる。この場合の光検出装置６の感度の自動化は、光検出装置６である光電子増倍管への印加電圧を調整することにより行われる。
【００６４】
また、１粒子当たりの蛍光発光量が異なるようなサンプルを測定する場合も、光検出装置６の受光感度が自動的に最適化されるので、この受光感度により最適な測定を行なうことができる。
【００６５】
従って、このようにすれば、各時間窓ごとの光量の範囲に対して光検出装置６の受光感度が自動的に最適化されるので、光検出装置６の個数を増やすことなく、各時間窓の光量が様々に異なるような場合も、光検出装置６により最適な蛍光測定を行なうことができる。また、光検出装置６の感度の自動化は、光検出装置６である光電子増倍管への印加電圧を調整することにより行われ、フィルターなどの光学調整に影響を与えるものを使用していないので、光学調整に影響を与えることなく、この発明を実施できるという特有の効果がある。
【００６６】
なお、第２の実施の形態の各構成は、各種の変形、変更が可能である。例えば、受光感度設定装置１０へ様々な装置からのデータや各種の設定条件を入力し、それらに基づいて受光感度設定値を出力してもよい。また、測定点位置データは、測定点移動装置３の他の手段から得るようにしてもよい。例えば、測定点移動装置３の代わりに可動式の試料保持装置を用いることができる。また、測定点移動装置３の設置位置を変えることもできる。さらに、励起光路と検出光路の重なる領域が無いようにすることで、分光装置２を省略することができる。あるいは、試料９が十分な蛍光を発する場合、光源装置１及び分光装置２は省略できる。さらにまた、複数の励起光学系や複数の検出光学系で構成したり、検出された信号を様々に処理したりして、特殊な効果を得ることができる。
【００６７】
（第３の実施の形態）
次に、本発明の第３の実施の形態を説明する。
【００６８】
図３は、第３の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００６９】
この場合、受光感度設定装置１０は、光強度統計解析装置７の光強度統計解析値と光検出装置６の光強度値が入力され、これら光強度統計解析値と光強度値に基づいて受光感度設定値を決定するようになっている。また、受光感度設定装置１０の受光感度設定値は、光検出装置６に出力されると同時に、画像処理装置８にも出力されるようになっている。画像処理装置８は、受光感度設定装置１０より与えられる受光感度設定値に基づいて光検出装置６の光強度値を補正し、この補正した光強度値と測定点移動装置３から出力される試料９上の測定点の位置を示す測定点位置データから試料９の観察像として蛍光像を形成するようになっている。
【００７０】
その他は、図１と同様である。
【００７１】
次に、このように構成した実施の形態を説明する。
【００７２】
まず、光強度統計解析値取得は、以下の動作により行われる。
【００７３】
光源装置１から励起光が出射されると、この励起光は、分光装置２で反射し、測定点移動装置３、集光装置４を通過して試料９に照射される。試料９は、励起光の照射により蛍光を発する。この試料９より発せられた蛍光は、集光装置４、測定点移動装置３を通り、分光装置２を透過して光検出装置６に入射される。
【００７４】
この場合も、測定点移動装置３により試料９上の測定点の位置が制御される。このときの試料９上の移動位置は、励起光路と蛍光光路が一致しているので、これらの光路を一つの測定点移動装置３により移動させることができる。
【００７５】
光検出装置６は、入射される蛍光の強度に対応した光強度値を出力する。光検出装置６から出力される光強度値は、光強度統計解析装置７に送られると同時に、受光感度設定装置１０にも送られる。
【００７６】
光強度統計解析装置７は、相関関数解析ボードにより光強度値を統計解析して光強度統計解析値を求め、この光強度統計解析値を外部に出力すると同時に、受光感度設定装置１０に出力する。
【００７７】
受光感度設定装置１０は、光強度統計解析装置７からの光強度統計解析値に基づいて受光感度設定値を決定する。この受光感度設定値は、光検出装置６に向け出力され、光検出装置６の受光感度が設定される。
【００７８】
これにより、第２の実施の形態で述べたと同様にして各時間窓ごとの光量の範囲に対して光検出装置６の受光感度が自動的に最適化されるので、各時間窓の光量が様々に異なるような場合も、光検出装置６により最適な測定を行なうことができる。
【００７９】
一方、蛍光像取得時は以下のように作用する。
【００８０】
光源装置１から励起光が出射されると、この励起光は、分光装置２で反射し、測定点移動装置３、集光装置４を通過して試料９に照射される。試料９は、励起光の照射により蛍光を発する。この試料９より発せられた蛍光は、集光装置４、測定点移動装置３を通り、分光装置２を透過して光検出装置６に入射される。
【００８１】
この場合も、測定点移動装置３により試料９上の測定点の位置が制御される。このときの試料９上の移動位置は、励起光路と蛍光光路が一致しているので、これらの光路を一つの測定点移動装置３により移動させることができる。
【００８２】
光検出装置６は、入射される蛍光の強度に対応した光強度値を出力する。光検出装置６から出力される光強度値は、光強度統計解析装置７、画像処理装置８および受光感度設定装置１０に送られる。
【００８３】
受光感度設定装置１０では、光検出装置６から出力される光強度値に基づいて受光感度設定値を決定する。この受光感度設定値は、光検出装置６に出力されると同時に、画像処理装置８にも送られる。
【００８４】
光検出装置６は、このときの受光感度設定値により受光感度が設定される。また、画像処理装置８では、光検出装置６からの光強度値を、受光感度設定装置１０より与えられる受光感度設定値により補正し、この補正された光強度値と測定点移動装置３から出力される試料９上の測定点の位置を示す測定点位置データから試料９の蛍光像を形成する。この蛍光像は外部へ出力される。
【００８５】
このようにすれば、例えば、試料９が細胞であり、この細胞の細胞膜の流動性を測定するような場合、始めに画像処理装置８により試料９の蛍光像を取得し、この蛍光像を用いて細胞膜の位置を特定する。そして、この特定された細胞膜の位置について蛍光相関測定を行うことにより、細胞膜の流動性を求めることができる。
【００８６】
この場合も、光強度統計解析装置７の光強度統計解析値および光検出装置６の光強度値が光感度設定値として光検出装置６にフィードバックされ、光検出装置６の受光感度は自動的に最適化されるので、このときの受光感度により最適な蛍光測定を行なうことができる。この場合の光検出装置６の受光感度の自動化は、光検出装置６である光電子増倍管への印加電圧を調整することにより行われる。
【００８７】
従って、このようにしても、蛍光像取得の際は、光検出装置６からの光強度値に基づいた受光感度設定装置１０の受光感度設定値により光検出装置６の受光感度が自動的に最適化され、また、光強度統計解析値取得の際は、各時間窓ごとの光量の範囲に対して光検出装置６の受光感度が自動的に最適化されるので、蛍光像測定や蛍光相関測定において光量が様々異なる測定に対しても、光検出装置６により最適な蛍光測定を行なうことができる。また、蛍光像は、光検出装置６の光強度値を、受光感度設定装置１０からの受光感度設定値により補正し、この補正された光強度値と測定点移動装置３からの測定点位置データから求めるようにしているので、精度の高い蛍光像を取得することもできる。
【００８８】
また、この場合も、光検出装置６の感度の自動化は、光検出装置６である光電子増倍管への印加電圧を変化させることにより行われ、フィルターなどの光学調整に影響を与えるものを使用していないので、光学調整に影響を与えることなく、この発明を実施できるという特有の効果がある。
【００８９】
なお、第３の実施の形態の各構成は、各種の変形、変更が可能である。例えば、受光感度設定装置１０へ様々な装置からのデータや各種の設定条件を入力し、それらに基づいて受光感度設定値を出力してもよい。また、測定点位置データは、測定点移動装置３以外の他の手段から得るようにしてもよい。例えば、測定点移動装置３の代わりに可動式の試料保持装置を用いることができる。また、測定点移動装置３の設置位置を変えることもできる。さらに、励起光路と検出光路の重なる領域が無いようにすることで、分光装置２を省略することができる。あるいは、試料９が十分な蛍光を発する場合、光源装置１及び分光装置２は省略できる。さらにまた、複数の励起光学系や複数の検出光学系で構成したり、検出された信号を様々に処理したりして、特殊な効果を得ることができる。
【００９０】
その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。
【００９１】
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【００９２】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、条件が様々に異なる蛍光測定に適切に対応することができる測定装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【図３】本発明の第３の実施の形態の概略構成を示す図。
【図４】従来の測定装置の概略構成を示す図。
【図５】従来の測定装置の光検出装置で検出される光強度値を説明する図。
【符号の説明】
１…光源装置
２…分光装置
３…測定点移動装置
４…集光装置
５…試料保持装置
６…光検出装置
７…光強度統計解析装置
８…画像処理装置
９…試料
１０…受光感度設定装置
Claims (4)
- 試料からの蛍光の強度を検出し光強度値を出力する受光感度を可変可能にした光検出手段と、
前記光検出手段より検出される光強度値を統計解析する統計解析手段と、
前記光検出手段の受光感度を設定する受光感度設定値を出力する受光感度設定手段と、を具備し、
蛍光測定条件により前記光検出手段の受光感度が最適になるように前記受光感度設定手段の受光感度設定値を決定することを特徴とする測定装置。 - 試料からの蛍光の強度を検出し光強度値を出力する受光感度を可変可能にした光検出手段と、
前記光検出手段より検出される光強度値を統計解析し光強度統計解析値を出力する統計解析手段と、
前記光検出手段の受光感度を設定する受光感度設定値を出力する受光感度設定手段と、を具備し、
前記統計解析手段の光強度統計解析値に応じて前記光検出手段の受光感度が最適になるように前記受光感度設定手段の受光感度設定値を決定することを特徴とする測定装置。 - 試料からの蛍光の強度を検出し光強度値を出力する受光感度を可変可能にした光検出手段と、
前記光検出手段より検出される光強度値を統計解析し光強度統計解析値を出力する統計解析手段と、
前記光検出手段の光強度値または前記統計解析手段の光強度統計解析値に応じて前記光検出手段の受光感度を設定する受光感度設定値を出力する受光感度設定手段と、
前記試料上での光強度の測定点の位置を移動させるとともに、測定点の位置データを出力する測定点移動手段と、
前記測定点移動手段の測定点位置データと前記光検出手段からの光強度値に基づいて観察像を生成する画像処理手段と
を具備したことを特徴とする測定装置。 - 画像処理手段は、受光感度設定手段の受光感度設定値により前記光検出手段の光強度値を補正し、該補正された光強度値と前記測定点移動手段の測定点位置データに基づいて観察像を生成することを特徴とする請求項３記載の測定装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003147683A JP2004347562A (ja) | 2003-05-26 | 2003-05-26 | 測定装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003147683A JP2004347562A (ja) | 2003-05-26 | 2003-05-26 | 測定装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004347562A true JP2004347562A (ja) | 2004-12-09 |
Family
ID=33534148
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003147683A Pending JP2004347562A (ja) | 2003-05-26 | 2003-05-26 | 測定装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2004347562A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020122803A (ja) * | 2016-01-22 | 2020-08-13 | ソニー株式会社 | 微小粒子測定装置、情報処理装置及び情報処理方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5821143A (ja) * | 1981-07-30 | 1983-02-07 | Shimadzu Corp | 螢光測定装置 |
| JPH11502608A (ja) * | 1993-01-18 | 1999-03-02 | エボテック・バイオシステムズ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 生体高分子の適応度を評価するための方法および装置 |
| WO2001063259A1 (de) * | 2000-02-22 | 2001-08-30 | Carl Zeiss Jena Gmbh | Verfahren und anordnung zur detektion des von einer probe kommenden lichtes |
| WO2002048693A1 (fr) * | 2000-12-14 | 2002-06-20 | Olympus Optical Co., Ltd. | Analyseur fluorometrique et analyse fluorometrique |
| JP2003083894A (ja) * | 2001-09-14 | 2003-03-19 | Sumitomo Electric Ind Ltd | 蛍光値補正方法、蛍光値補正装置、蛍光値補正プログラム及び前記蛍光値補正プログラムを記録した記録媒体 |
-
2003
- 2003-05-26 JP JP2003147683A patent/JP2004347562A/ja active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5821143A (ja) * | 1981-07-30 | 1983-02-07 | Shimadzu Corp | 螢光測定装置 |
| JPH11502608A (ja) * | 1993-01-18 | 1999-03-02 | エボテック・バイオシステムズ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング | 生体高分子の適応度を評価するための方法および装置 |
| WO2001063259A1 (de) * | 2000-02-22 | 2001-08-30 | Carl Zeiss Jena Gmbh | Verfahren und anordnung zur detektion des von einer probe kommenden lichtes |
| WO2002048693A1 (fr) * | 2000-12-14 | 2002-06-20 | Olympus Optical Co., Ltd. | Analyseur fluorometrique et analyse fluorometrique |
| JP2003083894A (ja) * | 2001-09-14 | 2003-03-19 | Sumitomo Electric Ind Ltd | 蛍光値補正方法、蛍光値補正装置、蛍光値補正プログラム及び前記蛍光値補正プログラムを記録した記録媒体 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020122803A (ja) * | 2016-01-22 | 2020-08-13 | ソニー株式会社 | 微小粒子測定装置、情報処理装置及び情報処理方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4783931B2 (ja) | 検出器の分光学的及び空間分解能を増大させるための方法 | |
| US20060000984A1 (en) | Method for increasing the spectral and spatial resolution of detectors | |
| US7330257B2 (en) | Spectroscope and spectrum laser microscope | |
| JP2012032183A (ja) | 試料観測装置および試料観測方法 | |
| JP2011513740A (ja) | 光子混合検出器を用いた時間分解分光分析方法およびシステム | |
| US7705987B2 (en) | Fluorescence correlation microscopy with real-time alignment readout | |
| KR20170052256A (ko) | 라만 산란을 이용한 물질의 농도 측정 장치 및 방법 | |
| JP2008015492A (ja) | 光信号の検出のための方法および装置 | |
| US10753872B2 (en) | Apparatus and method for measuring fluorescence lifetime | |
| JP2023133540A (ja) | 定量的撮像のための強度安定化のためのシステムおよび方法 | |
| JP2007114764A (ja) | 走査顕微鏡を用いた検出装置および方法 | |
| JP3984132B2 (ja) | 蛍光分光分析装置 | |
| US7154602B2 (en) | Method for measuring fluorescence correlations in the presence of slow signal fluctuations | |
| CN114460061A (zh) | 一种时间门控拉曼光谱系统及拉曼光谱校正方法 | |
| CN111289497B (zh) | 一种瞬稳态激光诱导击穿光谱检测系统 | |
| US8542439B2 (en) | Method and device for scanning-microscopy imaging of a specimen | |
| JP2010250102A (ja) | 顕微鏡 | |
| JP2004354346A (ja) | 測定装置 | |
| JP2004347562A (ja) | 測定装置 | |
| US20090173891A1 (en) | Fluorescence detection system | |
| US6172785B1 (en) | Light-scanning device | |
| JP3618416B2 (ja) | 顕微鏡用測光装置 | |
| JP5394893B2 (ja) | レーザ走査型顕微鏡 | |
| JP2004347561A (ja) | 測定装置 | |
| JP2004354347A (ja) | 蛍光測定装置 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060526 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20071218 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080415 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080805 |