JP2012032183A

JP2012032183A - 試料観測装置および試料観測方法

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Publication number: JP2012032183A
Application number: JP2010169793A
Authority: JP
Inventors: Yoshinori Iketaki; 慶記池滝
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2010-07-28
Filing date: 2010-07-28
Publication date: 2012-02-16

Abstract

【課題】多色光を用いて試料を高精度で観測できる試料観測装置を提供する。
【解決手段】波長の異なる複数の光をそれぞれパルス光として試料３１に順次照射する光照射部１０と、光照射部１０からのパルス光の照射により試料３１から発生する応答光を受光して光応答信号を出力する光検出部４０と、光照射部１０からのパルス光の照射に同期して、光検出部４０から、当該照射されたパルス光に対応する光応答信号を取得するサンプリング部５０と、サンプリング部５０で取得された光応答信号を処理する信号処理部７０と、を備える。
【選択図】図１

Description

本発明は、試料観測装置および試料観測方法に関するものである。

試料観測方法として、例えば、溶液または生体試料内の分子の運動を分析する蛍光相関分析法（ＦＣＳ法）が知られている。蛍光相関分析法は、ブラウン運動などの粒子の拡散運動に関する分析に古くから用いられている。例えば、図４に示すように、希薄な蛍光分子１０１の溶液１０２に、細いレーザ励起光ビーム１０３を集光させて、蛍光強度を長時間測定すると、測定される蛍光強度は、測定領域内の蛍光分子数に比例する。したがって、揺らぎの大きは、測定領域内の蛍光分子数をＮとして、Ｓ／Ｎで表現すると、（１／Ｎ）^１／２となる。

蛍光相関分析法は、このように蛍光の小さな揺らぎの大きさと、後述する時間相関とを計測する方法である。この計測法において、物理量である蛍光相関関数が１／２に減少する時間、すなわち相関時間t_０は、次式で表される。

上記式（１）において、Ｄは蛍光分子の並進拡散係数であり、Ｗはレーザビームの動径方向の強度分布関数がガウス分布であるときのビーム半径である。このt_０は、物理的には、蛍光分子が拡散によってレーザ励起光ビーム１０３を横切る時間に相当する。

蛍光の揺らぎを測定する場合、通常、蛍光を光電子増倍管で受光して、その出力電流ｆ（ｔ）を測定する。この場合、出力電流ｆ（ｔ）は、レーザ光の強度が極端に大きくなければ、蛍光量に比例する。したがって、蛍光相関関数は、このｆ（ｔ）について時間（Ｔ）に関する相関関数を求めることに他ならない。この蛍光相関関数をＧ（τ）とすると、Ｇ（τ）は次式で与えられる。

また、レーザ強度がガウス分布に近い場合、蛍光相関関数Ｇ（τ）は、次式のようになる。

前述したように、蛍光相関分析法は、蛍光性分子の並進拡散係数（式（１）におけるＤ）が得られる物理量を測定するものであるが、基本的には、蛍光の揺らぎを与える熱力学量であれば、どんな量でも同じ原理で測定することができる。例えば、蛍光分子が流動してレーザビームを横切れば、蛍光の揺らぎを観測することができる。また、化学反応などで蛍光性分子が他の分子と結合すれば、その結合した分子の速度を揺らぎとして観測することができる。これにより、化学反応の進行をリアルタイムで知ることが可能となる。

また、蛍光の偏光を分析すれば、分子の回転運動を測定することもできる。さらに、Ｇ（τ）の強度から、観察領域に存在する分子数を直接測定することもできる。具体的には、例えば図５に示すように、期待する揺らぎ現象が完結するような特定の計測時間（Ｔ）内の揺らぎ関数ｆ（ｔ）を測定し、その測定した揺らぎ関数ｆ（ｔ）から上記式（２）を用いて蛍光相関関数Ｇ（τ）を求めればよい。なお、この蛍光相関法では、励起光源として、一般に、アルゴンレーザやクリプトンレーザの連続発振レーザが用いられる。

図６は、従来の代表的な蛍光相関分析装置の要部構成図である。この蛍光相関分析装置は、例えば特許文献１に開示されているもので、励起光源としてアルゴンレーザ等の連続発振レーザ１１１が用いられる。連続発振レーザ１１１から射出されたレーザビームは、ビームスプリッタ１１２を透過してレンズ１１３により蛍光色素を含有した観察試料溶液１１４に集光照射される。これにより、蛍光色素は励起されて、蛍光を発生する。

観察試料溶液１１４から発生した蛍光は、レンズ１１３により平行光にされた後、ビームスプリッタ１１２で反射され、さらに、レンズ１１５により集光されてピンホール１１６を経て、光電子増倍管やＣＣＤ等の光検出器１１７で検出される。この光検出器１１７の出力は、プリアンプ１１８で増幅された後、アナログ・デジタル（ＡＤ）変換回路１１９によりデジタルデータに変換されて、時系列データとしてコンピュータ１２０のメモリに取り込まれる。そして、コンピュータ１２０により、上記式（２）に従って蛍光相関関数Ｇ（τ）が計算される。

また、従来の蛍光顕微鏡として、例えば、複数の異なる色素分子で染色された試料に複数波長の励起光を照射し、これにより発生する複数波長の蛍光像を、重畳して観測したり、個々の像として観測したりすることを可能としたものが提案されている（例えば、特許文献２参照）。この蛍光顕微鏡では、複数波長の励起光の照射によって試料から発生する複数波長の蛍光を、複数段のダイクロイックミラーで分離してそれぞれＣＣＤカメラで撮像し、それらの画像信号を処理して、複数波長の蛍光像を重畳して表示したり、分離して表示したりしている。

特開２００１−２７２３４６号公報特開２００８−１３９５４３号公報

ところで、近年、蛍光相関法では、更に高度な計測が行われている。その一例として、光源を多色化して、複数の異なる色素分子で染色された試料の複数の蛍光相関を同時に計測することが試みられている。これにより、より多角的なデータを取得して、例えば、細胞内の代謝物質の挙動を分子間相互作用の観点から解明しようとしている。

このような多色照明による蛍光相関分析装置として、本発明者は、例えば図７に示す構成を考案した。この蛍光相関分析装置は、第１の光、第２の光、第３の光の連続光をそれぞれ射出するレーザ光源１３１，１３２，１３３を備える。レーザ光源１３１は、第１の光として、例えば波長５４３ｎｍの光を射出するＨｅ−Ｎｅレーザからなる。レーザ光源１３２は、第２の光として、例えば波長６４７ｎｍの光を射出するＫｒレーザからなる。レーザ光源１３３は、第３の光として、例えば波長４８８ｎｍの光を射出するＡｒレーザからなる。

レーザ光源１３１から射出された第１の光は、反射ミラー１３５で反射された後、ダイクロイックミラー１３６，１３７を順次透過し、さらに、反射ミラー１３８で反射された後、ダイクロイックミラー１３９で反射されて、対物レンズ１４１により試料１４２に集光される。レーザ光源１３２から射出された第２の光は、ダイクロイックミラー１３６で反射されて第１の光と同軸に合成され、その後、第１の光と同じ光路を経て試料１４２に集光される。レーザ光源１３３から射出された第３の光は、ダイクロイックミラー１３７で反射されて第１の光および第２の光と同軸に合成され、その後、第１の光および第２の光と同じ光路を経て試料１４２に集光される。

試料１４２は、第１の光、第２の光、第３の光に励起されて、それぞれ対応する第１の蛍光、第２の蛍光、第３の蛍光を発生する３種類の色素分子で染色されている。第１の光に励起されて第１の蛍光を発生する色素分子は、例えばTexas Redが用いられる。第２の光に励起されて第２の蛍光を発生する色素分子は、例えばNail Blueが用いられる。第３の光に励起されて第３の蛍光を発生する色素分子は、例えばAlexa 488が用いられる。

試料１４２から発生される第１の蛍光、第２の蛍光、第３の蛍光を含む応答光は、対物レンズ１４１により捕集された後、ダイクロイックミラー１３９を透過して、往路と分離される。そして、往路と分離された応答光は、反射ミラー１４５で反射された後、ダイクロイックミラー１４６で反射および透過される。さらに、ダイクロイックミラー１４６の透過光は、ダイクロイックミラー１４７で反射および透過される。これにより、試料１４２からの応答光は、３つの検出系に分岐される。

ダイクロイックミラー１４６で反射される応答光の検出系では、応答光が光学フィルタ１５１を透過して光検出器１５２で受光される。ダイクロイックミラー１４６を透過してダイクロイックミラー１４７で反射される応答光の検出系では、応答光が光学フィルタ１５３を透過して光検出器１５４で受光される。さらに、ダイクロイックミラー１４７を透過した応答光の検出系では、応答光が反射ミラー１５５で反射された後、光学フィルタ１５６を透過して光検出器１５７で受光される。

ここで、光学フィルタ１５１は、例えば第１の蛍光を透過するように構成される。光学フィルタ１５３は、例えば第２の蛍光を透過するように構成される。光学フィルタ１５６は、例えば第３の蛍光を透過するように構成される。また、光検出器１５２，１５４，１５７は、それぞれ例えばアバランシェフォトダイオードで構成される。

光検出器１５２の出力は、第１相関演算回路１６１に供給されて相関演算される。光検出器１５４の出力は、第２相関演算回路１６２に供給されて相関演算される。同様に、光検出器１５７の出力は、第３相関演算回路１６３に供給されて相関演算される。そして、これら第１相関演算回路１６１、第２相関演算回路１６２、第３相関演算回路１６３の相関結果は、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）１６５に供給されて処理される。これにより、例えば、分子間相互作用の観点から、試料１４２の細胞内の代謝物質の挙動が解明される。

しかしながら、本発明者による検討によると、図７に示す構成の蛍光相関分析装置は、以下に説明するような改良すべき点があることが判明した。すなわち、一般に、色素分子の蛍光発光帯域は、比較的広い。そのため、異なる色素分子を並存させると、多くの場合、各蛍光発光帯域のサイドローブが重複することになる。

その結果、光学フィルタ１５１，１５３，１５６により、それぞれ対応する蛍光発光帯域のほぼ全域の応答光を透過させるようにすると、重複した帯域の蛍光が混合して、計測精度の低下を招くことになる。また、これを防止するため、光学フィルタ１５１，１５３，１５６の透過帯域を、対応する色素分子の発光波長のピーク波長にマッチした狭帯域とすると、対応する光検出器１５２，１５４，１５７で受光される計測対象の蛍光の受光量が低下して、Ｓ／Ｎの劣化を招くことになる。そのため、試料を精度良く分析できないことになる。

このような不都合は、上述した蛍光相関分析装置に限らず、上記の特許文献２に開示されているような蛍光顕微鏡においても、試料から発生する複数波長の蛍光を、複数段のダイクロイックミラーで分離しているため、同様に生じるものである。その他、多色光を用いて複数の色素分子で染色された試料を観測する共焦点レーザ顕微鏡や、多色光を用いて各色光に対応するラマン散乱を観測するラマン顕微鏡等においても、試料からの対応する応答光を、光学フィルタやダイクロイックミラーを用いて分離して受光しようとすると、同様に生じるものである。

したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の目的は、多色光を用いて試料を高精度で観測できる試料観測装置および試料観測方法を提供することにある。

上記目的を達成する第１の観点に係る試料観測装置の発明は、
波長の異なる複数の光をそれぞれパルス光として試料に順次照射する光照射部と、
前記光照射部からの前記パルス光の照射により前記試料から発生する応答光を受光して光応答信号を出力する光検出部と、
前記光照射部からの前記パルス光の照射に同期して、前記光検出部から、当該照射されたパルス光に対応する光応答信号を取得するサンプリング部と、
前記サンプリング部で取得された光応答信号を処理する信号処理部と、
を備えることを特徴とするものである。

第２の観点に係る発明は、第１の観点に係る試料観測装置において、
前記光照射部は、波長の異なる光を連続的に射出する複数の光源と、これら複数の光源から射出される光を所定の周期のパルス信号に基づいてそれぞれパルス光に変換する光パルス制御部とを備え、
前記光検出部は、前記光応答信号を２値化して出力し、
前記サンプリング部は、前記パルス信号に基づくゲート信号と前記光応答信号との論理演算に基づいて、前記試料に照射された前記パルス光に対応する光応答信号を取得し、
前記信号処理部は、前記サンプリング部で取得された前記光応答信号を計数する、
ことを特徴とするものである。

第３の観点に係る発明は、第２の観点に係る試料観測装置において、
前記光検出部は、前記光応答信号を２値化する際の閾値が調整可能である、
ことを特徴とするものである。

第４の観点に係る発明は、第２の観点に係る試料観測装置において、
前記光検出部は、少なくとも前記複数の光源に対応して前記光応答信号を分岐して出力し、
前記サンプリング部は、前記パルス信号に基づいて、前記複数の光源に対応するゲート信号を生成し、これらゲート信号と分岐された前記光応答信号との論理積に基づいて、前記試料に順次照射される前記パルス光の各々に対応する光応答信号を独立して取得し、
前記信号処理部は、独立して取得される前記光応答信号をそれぞれ計数する、
ことを特徴とするものである。

第５の観点に係る発明は、第１の観点に係る試料観測装置において、
前記複数の光源は、前記試料を染色する複数の色素分子の励起光を射出し、
前記光検出部は、前記試料から発生する蛍光を受光する、
ことを特徴とするものである。

第６の観点に係る発明は、第２の観点に係る試料観測装置において、
前記信号処理部は、取得される光応答信号の計数値に基づいて、該光応答信号を時間領域で相関演算する、
ことを特徴とするものである。

第７の観点に係る発明は、第１の観点に係る試料観測装置において、
前記光検出部は、前記試料に照射された前記励起光の散乱光を除去する分光光学素子を備える、
ことを特徴とするものである。

第８の観点に係る発明は、第７の観点に係る試料観測装置において、
前記分光光学素子は、光学フィルタまたは回折格子からなる、
ことを特徴とするものである。

第９の観点に係る発明は、第２の観点に係る試料観測装置において、
前記光検出部は、前記パルス信号に基づく前記パルス光の立ち上がりまたは立下りよりも、短い光応答速度を有する、
ことを特徴とするものである。

第１０の観点に係る発明は、第９の観点に係る試料観測装置において、
前記光検出部は、前記試料から発生する応答光を受光するアバランシェフォトダイオードを備える、
ことを特徴とするものである。

第１１の観点に係る発明は、第１０の観点に係る試料観測装置において、
前記アバランシェフォトダイオードは、ＴＴＬレベルに２値化した光応答信号を出力するものである、
ことを特徴とするものである。

第１２の観点に係る発明は、第２の観点に係る試料観測装置において、
前記光パルス制御部は、前記複数の光源から連続的に射出される光をそれぞれパルス変調する、音響光学変調素子または電気光学変調素子からなる変調光学素子を備える、
ことを特徴とするものである。

第１３の観点に係る発明は、第１の観点に係る試料観測装置において、
前記光照射部は、波長の異なる光のパルス光を射出する複数のパルス光源を備え、
前記光検出部は、前記光応答信号を２値化して出力し、
前記サンプリング部は、前記複数のパルス光源から射出されるパルス光をそれぞれ検出する複数の光検出素子を備え、該複数の光検出素子の出力に基づくゲート信号と前記光応答信号との論理演算に基づいて、前記試料に照射された前記パルス光に対応する光応答信号を取得し、
前記信号処理部は、前記サンプリング部で取得された前記光応答信号を計数する、
ことを特徴とするものである。

第１４の観点に係る発明は、第１３の観点に係る試料観測装置において、
前記複数のパルス光源の各々は、モードロックレーザからなる、
ことを特徴とするものである。

さらに、上記目的を達成する第１５の観点に係る試料観測方法の発明は、
波長の異なる複数の光をそれぞれパルス光として試料に順次照射して前記試料からの応答光を光電変換し、該光電変換された光応答信号から、前記試料への前記パルス光の照射に同期して、当該照射されたパルス光に対応する光応答信号をサンプリングし、該サンプリングされた光応答信号に基づいて前記試料を観測する、ことを特徴とするものである。

本発明によると、多色光の各色光の応答光を時間領域で重複することなく検出できるので、試料を高精度で観測することが可能となる。

本発明の第１実施の形態に係る試料観測装置の要部構成図である。図１のパルス発生回路の動作を説明するための図である。本発明の第２実施の形態に係る試料観測装置の要部構成図である。蛍光相関法を説明するための図である。揺らぎ関数ｆ（ｔ）を説明するための図である。従来の代表的な蛍光相関分析装置の要部構成図である。本発明者が先に考案した多色照明による蛍光相関分析装置の要部構成図である。

以下、本発明の実施の形態について、図を参照して説明する。

（第１実施の形態）
図１は、本発明の第１実施の形態に係る試料観測装置の要部の構成を示す図である。この試料観測装置は、蛍光相関分析装置を構成するもので、光照射部１０、光検出部４０、サンプリング部５０および信号処理部７０を備える。光照射部１０は、異なる波長である第１の光、第２の光、第３の光を射出する連続発振型の３個のレーザ光源１１，１２，１３を備える。レーザ光源１１，１２，１３は、例えば、Ｈｅ−Ｎｅレーザ（波長：５４３ｎｍ）、Ｋｒレーザ（波長：６４７ｎｍ）、Ａｒレーザ（波長：４８８ｎｍ）からなる。これらレーザ光源１１，１２，１３から射出されるレーザ光は、それぞれ変調光学素子１４，１５，１６によりパルス光に変調される。変調光学素子１４，１５，１６は、例えば、それぞれ音響光学変調素子または電気光学変調素子で構成される。

また、光照射部１０は、クロック発生回路１７、パルス発生回路１８、パルス調整回路２１，２２，２３を備える。クロック発生回路１７は、例えば、蛍光相関分析装置の全体を制御する所定周期のシステムクロックを発生するシステムクロック発生回路で構成される。クロック発生回路１７からのクロックは、パルス発生回路１８に供給される。パルス発生回路１８は、例えば、２ビットカウンタとデコーダとを有し、クロック発生回路１７からのクロックを２ビットカウンタで計数し、その計数値をデコーダで復号して、計数値毎にパルス信号を生成する。すなわち、図２に示すように、パルス発生回路１８は、計数値「０」でパルス信号Ｐ０を生成し、計数値「１」でパルス信号Ｐ１を生成し、計数値「２」でパルス信号Ｐ２を生成し、計数値「３」でパルス信号Ｐ３を生成する。つまり、クロック発生回路１７からのクロックを、異なるタイミングで１／４分周して、パルス信号Ｐ０〜Ｐ３を生成する。

パルス発生回路１８は、パルス信号Ｐ１をパルス調整回路２１へ出力し、パルス信号Ｐ２をパルス調整回路２２へ出力し、パルス信号Ｐ３をパルス調整回路２３へ出力する。パルス調整回路２１，２２，２３は、パルス発生回路１８からの対応するパルス信号Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３の幅やタイミングをそれぞれ調整する。そして、パルス調整回路２１，２２，２３で整形されたパルス信号は、対応する変調光学素子１４，１５，１６に駆動パルス信号Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３として供給されて、これらを駆動する。これにより、レーザ光源１１，１２，１３から射出されるレーザ光は、変調光学素子１４，１５，１６により時間領域で重複しないパルス光に変調される。したがって、変調光学素子１４，１５，１６、クロック発生回路１７、パルス発生回路１８、パルス調整回路２１，２２，２３は、光パルス制御部を構成する。

ここで、蛍光相関計測では、一般にマイクロ秒の時間分解能が必要とされるが、変調光学素子１４，１５，１６を構成する音響光学変調素子や電気光学変調素子は、１０ｎｓｅｃより速い応答速度を有し、最大数１０ＭＨｚのパルス変調が可能である。したがって、クロック発生回路１７からのクロックを、パルス発生回路１８で異なるタイミングで１／４分周してパルス信号Ｐ０〜Ｐ３を生成し、そのうちのパルス信号Ｐ１〜Ｐ３を調整して駆動パルス信号Ｄ１〜Ｄ３を生成しても、変調光学素子１４，１５，１６を数ＭＨｚの変調周波数で駆動することが可能となる。これにより、蛍光相関法において十分なサンプリング周波数を得ることができる。

光照射部１０において、変調光学素子１４から射出される第１の光のパルス光は、反射ミラー２５で反射された後、ダイクロイックミラー２６，２７を順次透過し、さらに、反射ミラー２８で反射された後、ダイクロイックミラー２９で反射されて、対物レンズ３０により試料３１に集光される。また、変調光学素子１５から射出される第２の光のパルス光は、ダイクロイックミラー２６で反射されて第１の光と同軸に合成され、その後、第１の光と同じ光路を経て試料３１に集光される。同様に、変調光学素子１６から射出される第３の光のパルス光は、ダイクロイックミラー２７で反射されて第１の光および第２の光と同軸に合成され、その後、第１の光および第２の光と同じ光路を経て試料３１に集光される。なお、試料３１は、スキャニングステージに搭載されて、観察領域を自由に選択できるようになっている。

試料３１は、例えば生体細胞を有するもので、例えば前述したように、第１の光に励起されて第１の蛍光を発生するTexas Red、第２の光に励起されて第２の蛍光を発生するNail Blue、第３の光に励起されて第３の蛍光を発生するAlexa 488の３種の色素分子で染色されている。

試料３１への第１の光、第２の光、第３の光の照射により、試料３１からそれぞれ発生する応答光は、対物レンズ３０で捕集された後、ダイクロイックミラー２７を透過して光検出部４０に入射される。

光検出部４０は、分光光学素子４１，４２，４３、光検出器４４、分岐回路４５を備える。光検出部４０に入射した試料３１からの応答光は、分光光学素子４１，４２，４３を経て共通の光検出器４４で受光される。分光光学素子４１，４２，４３は、試料３１からの励起光の散乱光を除去するもので、第１の光、第２の光、第３の光の波長のみを除去する狭帯域の光学フィルタ（ノッチフィルタ）または回折格子からなる。

光検出器４４は、例えば、アバランシェフォトダイオードで構成される。アバランシェフォトダイオードは、受光した試料３１からの応答光を光電変換して、一般的なＴＴＬ（Transistor-Transistor Logic）レベルに２値化された光応答信号を出力する。ここで、一般に分子の蛍光寿命は、数１００ピコ秒から数ナノ秒の間である。アバランシェフォトダイオードは、この蛍光寿命に追従できる光応答速度を有している。また、アバランシェフォトダイオードは、駆動パルス信号Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３により変調光学素子１４，１５，１６から射出される第１の光、第２の光、第３の光のパルス光の立ち上がりまたは立下りよりも、短い光応答速度を有する。つまり、アバランシェフォトダイオードは、変調光学素子１４，１５，１６よりも短い光応答速度を有する。

これにより、光検出器４４は、試料３１に対する第１の光、第２の光、第３の光のパルス光の照射と同期して、各パルス光に対応する蛍光信号を、ＴＴＬレベルに２値化された光応答信号として出力する。光検出器４４からの光応答信号は、分岐回路４５により４経路に分岐されてサンプリング部５０に供給される。

なお、光検出器４４は、好ましくは、光応答信号を２値化する際の閾値を調整可能に構成する。このように構成すれば、光検出器４４から出力する光応答信号のＳ／Ｎを向上することが可能となる。すなわち、一般に、アバランシェフォトダイオードや光電子増倍管といった高感度光検出器は、光が入射しない場合でも、微弱なノイズパルス（暗電流パルス）を発生する。このノイズパルスは、目的する光応答信号のパルスよりも低い波高値を持つ。したがって、光検出器の個体差や実際のノイズレベルに応じて、２値化する際の閾値を、ノイズパルスの波高値よりも高く、かつ目的する光応答信号のパルスよりも低い適切な値に調整して、ＴＴＬレベルに２値化すれば、最良のＳ／Ｎを実現できる。具体的には、光検出器の出力信号の波高値をＡ／Ｄ変換した後、デジタル演算器、例えばコンパレータなので選別する。

サンプリング部５０は、４つの論理回路５１，５２，５３，５４と、４つのパルス調整回路５５，５６，５７，５８とを備える。論理回路５１，５２，５３，５４は、それぞれ論理積回路からなる。論理回路５１，５２，５３，５４の一方の入力端子には、光検出部４０の分岐回路４５で４経路に分岐された光応答信号がそれぞれ供給される。

パルス調整回路５５，５６，５７は、光照射部１０のパルス発生回路１７から出力される対応するパルス信号Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３を入力し、それらのタイミング（遅延時間）や幅を調整してゲート信号Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３を生成する。また、パルス調整回路５８は、光照射部１０のパルス発生回路１８で生成されたパルス信号Ｐ０を入力し、そのタイミング（遅延時間）や幅を調整してゲート信号Ｇ０を生成する。これにより、パルス調整回路５５，５６，５７，５８は、パルス発生回路１８で生成されたパルス信号Ｐ０〜Ｐ３と同期し、かつ時間領域で互いに重複しないゲート信号Ｇ０〜Ｇ３を生成する。

パルス調整回路５５で生成されたゲート信号Ｇ１は、論理回路５１の他方の入力端子に供給され、パルス調整回路５６で生成されたゲート信号Ｇ２は、論理回路５２の他方の入力端子に供給され、パルス調整回路５７で生成されたゲート信号Ｇ３は、論理回路５３の他方の入力端子にゲート信号として供給される。これにより、共通の光検出器４４から出力される光応答信号から、論理回路５１で第１の光に対応する光応答信号のみがサンプリングされ、論理回路５２で第２の光に対応する光応答信号のみがサンプリングされ、論理回路５３で第３の光に対応する光応答信号のみがサンプリングされる。そして、論理回路５１，５２，５３でそれぞれサンプリングされた光応答信号は、信号処理部７０に供給される。

また、パルス調整回路５８で生成されたゲート信号Ｇ０は、論理回路５４の他方の入力端子に供給される。これにより、論理回路５４において、試料３１への光照射期間に対応しない信号、すなわち電気系のノイズや光検出器４４の暗信号などのノイズ信号をサンプリングする。この論理回路５４でサンプリングされたノイズ信号は、信号処理部７０に供給される。

信号処理部７０は、４つの相関演算回路７１，７２，７３，７４と、ＰＣ（パーソナルコンピュータ）７５とを備える。相関演算回路７１は、論理回路５１でサンプリングされた第１の光に対応する光応答信号の計数値に基づいて当該応答信号を時間領域で相関演算して、その結果をＰＣ７５に供給する。相関演算回路７２は、論理回路５２でサンプリングされた第２の光に対応する光応答信号の計数値に基づいて当該応答信号を時間領域で相関演算して、その結果をＰＣ７５に供給する。相関演算回路７３は、論理回路５３でサンプリングされた第３の光に対応する光応答信号の計数値に基づいて当該応答信号を時間領域で相関演算して、その結果をＰＣ７５に供給する。また、相関演算回路７４は、論理回路５４でサンプリングされたノイズ信号の計数値に基づいて当該ノイズ信号を時間領域で相関演算して、その結果をＰＣ７５に供給する。

ＰＣ７５は、例えば、蛍光相関分析装置の全体を制御するホストコンピュータで構成される。ＰＣ７５は、相関演算回路７１，７２，７３，７４からの相関結果を収集して処理し、必要に応じてモニタに表示する。この際、相関演算回路７４からの相関結果は、他の相関結果の補正等に供される。

本実施の形態に係る蛍光相関分析装置によると、レーザ光源１１，１２，１３から射出される第１の光、第２の光、第３の光は、パルス信号Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３に基づく駆動パルス信号Ｄ１，Ｄ２，Ｄ３により時間領域で重畳することなくパルス光に変調されて、試料３１に順次照射される。これにより試料３１から発生する応答光は、共通の光検出器４４で光電変換されて、２値化された光応答信号として少なくとも３経路に分岐される。そして、その３経路において、パルス信号Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３に基づくゲート信号Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３により、それぞれ対応する光応答信号のみがサンプリングされて相関演算される。つまり、各経路において、他のパルス光の照射による光応答信号が混在することなく、対応するパルス光の照射による光応答信号のみがサンプリングされて相関演算される。これにより、３種の異なる色素分子で染色された試料３１の各色素分子による蛍光相関を、同時に、高精度で計測することができる。したがって、例えば、細胞内の代謝物質の挙動を分子間相互作用の観点から高精度で解明することが可能となる。

（第２実施の形態）
図３は、本発明の第２実施の形態に係る試料観測装置の要部の構成を示す図である。この試料観測装置は、図１に示した蛍光相関分析装置において、光照射部１０が、連続発振型のレーザ光源１１，１２，１３に代えて、モードロックレーザ８１，８２，８３を備える。モードロックレーザ８１，８２，８３は、第１の光、第２の光、第３の光のパルス光を、時間領域で重畳することなく、互いに異なるタイミングで射出する。そして、モードロックレーザ８１，８２，８３から射出されたパルス光が、試料３７へ順次照射される。

光検出部４０は、光検出器４４からの２値化された光応答信号を、分岐回路４５により３経路に分岐して、サンプリング部５０の論理回路５１，５２，５３の一方の入力端子にそれぞれ供給する。

また、サンプリング部５０は、モードロックレーザ８１，８２，８３から射出されるパルス光の散乱光をそれぞれ検出する光検出素子６１，６２，６３を備える。光検出素子６１，６２，６３の各々は、例えば、ＰＩＮフォトダイオードで構成される。光検出素子６１，６２，６３の出力は、パルス調整回路５５，５６，５７に供給されてそれぞれタイミング（遅延時間）や幅が調整されて、ゲート信号Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３が生成される。これらのゲート信号Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３は、対応する論理回路５１，５２，５３の他方の入力端子に供給される。その他の構成動作は、図１と同様であるので、同一作用を成す構成要素には、同一参照符号を付して説明を省略する。なお、図３において、図１に示した変調光学素子１４，１５，１６、クロック発生回路１７、パルス発生回路１８、パルス調整回路２１，２２，２３，５８、論理回路５４および相関演算回路７４は、設けられていない。ただし、図１の場合と同様に、論理回路５４および相関演算回路７４を設けて、電気系のノイズや光検出器４４の暗信号などのノイズ信号の相関演算を行う場合は、ゲート信号Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３が全てローレベルのときにハイレベルとなるゲート信号Ｇ４を生成して、光検出部４０からの応答信号をサンプリングすればよい。

このように、本実施の形態に係る蛍光相関分析装置では、モードロックレーザ８１，８２，８３を用いて、時間領域で重畳することなく、互いに異なるタイミングで射出される第１の光、第２の光、第３の光のパルス光を、試料３７へ順次照射させる。そして、モードロックレーザ８１，８２，８３から射出されるパルス光の散乱光を検出して、各パルス光に対応するゲート信号Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３を生成し、これらゲート信号Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３により対応する光応答信号のみをサンプリングして相関演算する。したがって、第１実施の形態の場合と同様に、対応するパルス光の照射による光応答信号のみをサンプリングして相関演算できる。これにより、試料３１の各色素分子による蛍光相関を、同時に、高精度で計測することができ、細胞内の代謝物質の挙動を分子間相互作用の観点から高精度で解明することが可能となる。

なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、上記実施の形態で示したように、時間領域で蛍光成分を分離することに加えて、空間領域で蛍光成分を分離してもよい。この場合は、例えば、図１の光検出部４０において、分光光学素子４１，４２，４３を経た応答光を、３つの光路に分岐して、それぞれの光路に異なる蛍光波長を割り当てる。そして、各光路において、割り当てられた蛍光波長に対応したバンドパスフィルタやグレーティングなどの既存の分光光学素子を経て、応答光を専用の光検出器で光電変換する。そして、光電変換された光応答信号を、図１と同様に、対応する論理回路の一方の入力端子に供給する。また、この場合、各光検出器毎に、対応する蛍光成分をサンプリングするゲート信号のローレベル時に、ノイズ信号をサンプリングして相関演算を行うことも可能である。

また、図１では、連続発振型のレーザ光源１１，１２，１３を用いて、レーザ光源１１，１２，１３からの連続光を対応する変調光学素子１４，１５，１６でそれぞれパルス光に変調するようにしたが、カレント電流を制御してパルス出力が可能なパルスＹＡＧレーザ等の半導体レーザを用いることも可能である。

さらに、上記各実施の形態や変形例において、光検出器の受光部前面に共焦点ピンホールを配置して、３次元分解能を持たすことも可能である。また、本発明は、蛍光相関分析装置に限らず種々の試料観測装置、例えば、蛍光顕微鏡、共焦点レーザ顕微鏡やラマン顕微鏡等の種々の顕微分光装置にも有効に適用することができる。例えば、蛍光顕微鏡や共焦点レーザ顕微鏡の場合は、相関演算回路を介することなく、サンプリングした光応答信号をＰＣ等の処理部に直接導入して処理すればよい。そして、試料の各計測微小領域の応答信号を位置に関数として２次元マッピングを行う。この２次元マッピングは、試料を移動させるステージ走査方式、ガルバノミラーにより照射光を偏向する光学的走査方式、あるいは両走査方式の組み合わせにより行うことができる。

また、応答光を光電変換する光検出器は、アバンラシェフォトダイオードに限らず、光電子増倍管やマルチチャンネルプレートなどの高速応答素子を用いることが可能である。

１０光照射部
１１，１２，１３レーザ光源
１４，１５，１６変調光学素子
１７クロック発生回路
１８パルス発生回路
２１，２２，２３パルス調整回路
３０対物レンズ
３１試料
４０光検出部
４１，４２，４３分光光学素子
４４光検出器
４５分岐回路
５０サンプリング部
５１，５２，５３，５４論理回路
５５，５６，５７，５８パルス調整回路
６１，６２，６３光検出素子
７０信号処理部
７１，７２，７３，７４相関演算回路
７５ＰＣ（パーソナルコンピュータ）
８１，８２，８３モードロックレーザ

Claims

波長の異なる複数の光をそれぞれパルス光として試料に順次照射する光照射部と、
前記光照射部からの前記パルス光の照射により前記試料から発生する応答光を受光して光応答信号を出力する光検出部と、
前記光照射部からの前記パルス光の照射に同期して、前記光検出部から、当該照射されたパルス光に対応する光応答信号を取得するサンプリング部と、
前記サンプリング部で取得された光応答信号を処理する信号処理部と、
を備えることを特徴とする試料観測装置。
前記光照射部は、波長の異なる光を連続的に射出する複数の光源と、これら複数の光源から射出される光を所定の周期のパルス信号に基づいてそれぞれパルス光に変換する光パルス制御部とを備え、
前記光検出部は、前記光応答信号を２値化して出力し、
前記サンプリング部は、前記パルス信号に基づくゲート信号と前記光応答信号との論理演算に基づいて、前記試料に照射された前記パルス光に対応する光応答信号を取得し、
前記信号処理部は、前記サンプリング部で取得された前記光応答信号を計数する、
ことを特徴とする請求項１に記載の試料観測装置。
前記光検出部は、前記光応答信号を２値化する際の閾値が調整可能である、
ことを特徴とする請求項２に記載の試料観測装置。
前記光検出部は、少なくとも前記複数の光源に対応して前記光応答信号を分岐して出力し、
前記サンプリング部は、前記パルス信号に基づいて、前記複数の光源に対応するゲート信号を生成し、これらゲート信号と分岐された前記光応答信号との論理積に基づいて、前記試料に順次照射される前記パルス光の各々に対応する光応答信号を独立して取得し、
前記信号処理部は、独立して取得される前記光応答信号をそれぞれ計数する、
ことを特徴とする請求項２に記載の試料観測装置。
前記複数の光源は、前記試料を染色する複数の色素分子の励起光を射出し、
前記光検出部は、前記試料から発生する蛍光を受光する、
ことを特徴とする請求項１に記載の試料観測装置。
前記信号処理部は、取得される光応答信号の計数値に基づいて、該光応答信号を時間領域で相関演算する、
ことを特徴とする請求項２に記載の試料観測装置。
前記光検出部は、前記試料に照射された前記励起光の散乱光を除去する分光光学素子を備える、
ことを特徴とする請求項１に記載の試料観測装置。
前記分光光学素子は、光学フィルタまたは回折格子からなる、
ことを特徴とする請求項７に記載の試料観測装置。
前記光検出部は、前記パルス信号に基づく前記パルス光の立ち上がりまたは立下りよりも、短い光応答速度を有する、
ことを特徴とする請求項２に記載の試料観測装置。
前記光検出部は、前記試料から発生する応答光を受光するアバランシェフォトダイオードを備える、
ことを特徴とする請求項９に記載の試料観測装置。
前記アバランシェフォトダイオードは、ＴＴＬレベルに２値化した光応答信号を出力するものである、
ことを特徴とする請求項１０に記載の試料観測装置。
前記光パルス制御部は、前記複数の光源から連続的に射出される光をそれぞれパルス変調する、音響光学変調素子または電気光学変調素子からなる変調光学素子を備える、
ことを特徴とする請求項２に記載の試料観測装置。
前記光照射部は、波長の異なる光のパルス光を射出する複数のパルス光源を備え、
前記光検出部は、前記光応答信号を２値化して出力し、
前記サンプリング部は、前記複数のパルス光源から射出されるパルス光をそれぞれ検出する複数の光検出素子を備え、該複数の光検出素子の出力に基づくゲート信号と前記光応答信号との論理演算に基づいて、前記試料に照射された前記パルス光に対応する光応答信号を取得し、
前記信号処理部は、前記サンプリング部で取得された前記光応答信号を計数する、
ことを特徴とする請求項１に記載の試料観測装置。
前記複数のパルス光源の各々は、モードロックレーザからなる、
ことを特徴とする請求項１３に記載の試料観測装置。
波長の異なる複数の光をそれぞれパルス光として試料に順次照射して前記試料からの応答光を光電変換し、該光電変換された光応答信号から、前記試料への前記パルス光の照射に同期して、当該照射されたパルス光に対応する光応答信号をサンプリングし、該サンプリングされた光応答信号に基づいて前記試料を観測する、ことを特徴とする試料観測方法。