JP5394893B2 - レーザ走査型顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、レーザ走査型顕微鏡に関するものである。

従来、試料にレーザ光を照射して試料からの蛍光を検出するレーザ走査型顕微鏡において、複数の色素からの蛍光を取得する方法や、Photo Conversionによって互いに異なる複数の波長の蛍光を取得する方法が知られている（例えば、特許文献１から２参照）。

特開２００１−３５６２７２号公報 特開２００６−１１９１５２号公報

特許文献１には、１つの検出器に対して複数のバリアフィルタを電動で切り替えることにより、時系列に複数の波長範囲の輝度データを取得する方法が記載されている。しかしながら、複数のバリアフィルタを電動で切り替える方式は、フィルタワークを必要とするため、チャネル間の時間差が大きく、観察に支障をきたすという不都合がある。

また、特許文献１には、検出器を２つ用意し、これに対して１組のバリアフィルタにより、一度に複数の波長範囲の輝度データを取得することが記載されている。この場合、同時に複数の波長範囲の輝度データを取得することができるが、波長選択の範囲は設置されたフィルタの範囲で決まるため、波長選択の自由度が低いという不都合がある。

特許文献２には、試料から発せられた蛍光を波長別のスペクトル成分に分割し、複数のセルを有する複数セル光検出器によって各スペクトル成分を検出するレーザ走査型顕微鏡が記載されている。この場合、複数のスペクトル成分を同時に測定することができ、且つ合算するセルを調整することによって波長選択を任意に行うことができる。しかしながら、スペクトルの重なりあう試料を観察する際に、それぞれの色素による蛍光のデータが重なって取得されてしまうという不都合がある。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、複数の色素からの蛍光を取得する場合において、各色素による蛍光のスペクトルが重なっている場合にも、それぞれの蛍光を取得することができるレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、レーザ光を標本上で２次元走査する走査手段と、前記レーザ光の波長を切り替える波長選択手段と、該波長選択手段により切り替えられた波長のレーザ光が標本に照射されることにより、標本において発生した蛍光をスペクトル成分に分光する分光手段と、該分光手段により分光されたスペクトル成分をそれぞれ検出する複数のセルを有する光検出器と、前記波長選択手段によるレーザ光の波長の切り替えに同期して前記光検出器のゲイン及び／又は前記各セルの回路ゲインを切り替えるゲイン切替手段と、観察しようとする２以上の蛍光色素の選択を受け付ける入力部と、選択された前記蛍光色素の各々に対応するチャネルとして、前記複数のセルの内、各前記蛍光色素に応じて合算すべきセル群を決定し、このセル群の出力を合算して輝度データを生成する合算処理部と、前記合算された輝度データに基づいてスキャン画像を生成するコンピュータと、前記スキャン画像を表示する表示部と、第１の蛍光色素に対応するチャネルによる輝度データの取得を行うように予め設定されたパラメータに基づくレーザ光の波長、セル群、光検出器のゲイン及び／又は前記回路ゲインと、第２の蛍光色素に対応したチャネルによる輝度データの取得を行うように予め設定されたパラメータに基づくレーザ光の波長、セル群、光検出器のゲイン及び／又は前記回路ゲインとを、前記走査手段の動作に同期して切り替えることにより、前記２以上の蛍光色素の各々に個別に対応したスキャン画像を略同時に取得するシーケンシャルスキャン制御部とを備えるレーザ走査型顕微鏡を採用する。

本発明によれば、波長選択手段によりレーザ光の波長が切り替えられ、該レーザ光が標本に照射されることで発生した蛍光が、分光手段によりスペクトル成分に分光される。分光されたスペクトル成分は、複数のセルを有する光検出器によりそれぞれ検出される。この場合において、ゲイン切替手段によって、波長選択手段によるレーザ光の波長の切り替えに同期して、光検出器のゲインが切り替えられる。

これにより、波長選択手段によって切り替えられたレーザ光の波長毎に、光検出器の感度を調整することができ、標本上において発生した蛍光のスペクトル成分を高精度に検出することができる。また、レーザ光の波長毎に蛍光のスペクトル成分を検出することで、複数の色素からの蛍光を取得する場合において、各色素による蛍光のスペクトル成分が重なっている場合にも、色素毎の蛍光のスペクトル分布を得ることができる。

上記発明において、前記光検出器の複数のセルのうち少なくとも１つのセルを選択するセル選択部と、前記波長選択手段によるレーザ光の波長の切り替えに同期して、前記セル選択部により選択されたセルによって検出されたスペクトル成分を合算する合算部とを備えることとしてもよい。

このようにすることで、波長選択手段によって切り替えられたレーザ光の波長毎に、セル選択部により選択されたセルによって検出されたスペクトル成分を、合算部により合算することができる。これにより、レーザ光の波長毎に、所望の波長範囲における蛍光を取得することができる。また、選択されたセルからのデータのみを取得することで、全セルからのデータを取得する場合に比べて、取り扱うデータ量を減らすことができ、画像生成等の処理を高速化することができる。

上記発明において、前記ゲイン切替手段が、前記光検出器の各セルの感度を一括して調整することとしてもよい。
このようにすることで、波長選択手段によって切り替えられたレーザ光の波長毎に、ゲイン切替手段によって光検出器の各セルの感度を一括して調整することができ、標本からの蛍光の検出精度を向上させ、鮮明な画像を取得することができる。

上記発明において、前記光検出器は、前記ゲイン切替手段により感度が調整された際に、その感度が安定するまでスペクトル成分の検出を待機することとしてもよい。
光検出器の感度が安定する前に画像を生成すると、データが不正確になってしまう場合がある。したがって、ゲイン切替手段が光検出器の感度を調整した際に、その感度が安定するまで待機した後に、標本からの光を検出することで、精度の高い画像を取得することができる。

上記発明において、前記ゲイン切替手段が、前記光検出器の各セルにより検出されたスペクトル成分の増幅率をそれぞれ調整することとしてもよい。
このようにすることで、各セルの検出感度に応じた増幅率でスペクトル成分を増幅することができ、鮮明な画像を取得することができる。また、前述した各セルの感度の一括調整と併用することで、さらに鮮明な画像を取得することができる。

上記発明において、前記ゲイン切替手段が、前記レーザ光の照射領域ごとに前記光検出器のゲインを切り替えることとしてもよい。
このようにすることで、退色を抑えて鮮明な画像を取得するとともに、レーザ光が照射される領域を観察に必要な最小面積とすることができ、画像を生成する際に走査時間を短縮することができる。

上記発明において、同一の波長を有する前記レーザ光が照射される領域が複数ある場合、前記ゲイン切替手段が、同一の波長を有する前記レーザ光においても照射領域ごとに前記光検出器のゲインを切り替えることとしてもよい。
このように領域毎にゲインを切り替えることで、蛍光輝度が異なる細胞でもコントラストの高い画像を取得することができ、観察精度を向上することができる。

本発明によれば、複数の色素からの蛍光を取得する場合において、各色素による蛍光のスペクトルが重なっている場合にも、それぞれの蛍光を取得することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡の概略構成図である。 図１の光源Ａによる励起波長を示す図である。 図１の光源Ｂによる励起波長を示す図である。 図１の顕微鏡により実行される処理を示すフローチャートである。 図１のＣＰＵの機能ブロック図である。 図１のディスプレイに表示される画面例である。 図１の顕微鏡のタイミングチャートである。 第１の変形例に係る顕微鏡のタイミングチャートである。 第３の変形例に係る顕微鏡のセルの合算範囲を説明する図である。 第４の変形例に係る顕微鏡の各レーザ光の照射領域を説明する図である。 第５の変形例に係る顕微鏡の各レーザ光の照射領域を説明する図である。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡について、図面を参照して説明する。
図１は、本実施形態の顕微鏡１の構成図である。図１に示すように、本実施形態の顕微鏡１は、レーザ光を標本５に照射して標本５において発生した蛍光を検出するレーザ走査型顕微鏡であり、顕微鏡本体１００と、レーザ光を出射する光源ユニット２００と、パーソナルコンピュータ（以降では「ＰＣ」と表記する。）３００と、コントローラ４００とを主な構成要素として備えている。

光源ユニット２００は、コントローラ４００により制御され、レーザ光を射出するようになっている。このレーザ光は、標本５内の蛍光指示薬を励起させ、蛍光を発生させるようになっている。

光源ユニット２００は、光源Ａ２０２と、光源Ｂ２０３と、音響光学素子（波長選択手段）２０１とを備えている。
光源Ａ２０２は、波長λ_Ａのレーザ光Ｌ_Ａを出射するようになっている。
光源Ｂ２０３は、波長λ_Ｂのレーザ光Ｌ_Ｂを出射するようになっている。
音響光学素子２０１は、光源Ａ２０２からのレーザ光Ｌ_Ａと光源Ｂ２０３からのレーザ光Ｌ_Ｂとを切り替えることができ、光源ユニット２００から出射するレーザ光の波長選択および強度調節をするようになっている。

このような構成を有することで、光源ユニット２００は、蛍光試薬により多重染色された標本５を励起させる複数の波長のレーザ光を切り替えて出力することができるようになっている。本実施形態においては、蛍光試薬としてＩｎｄｏ−１とＳＮＡＲＦ−１を用いており、レーザ光Ｌ_Ａの中心波長λ_Ａは３５０ｎｍ、レーザ光Ｌ_Ｂの中心波長λ_Ｂは５１５ｎｍとする。これらのレーザ光は、シャッタや音響光学素子などにより独立して出射のＯＮ／ＯＦＦ切り替えができ、１フレームごとに順次制御されるようになっている。これにより、レーザ光Ｌ_Ａとレーザ光Ｌ_Ｂを順次切り替えて顕微鏡本体１００に導入させるようになっている。

顕微鏡本体１００は、光源ユニット２００からのレーザ光を標本５に照射する照射光学系１０と、照射系１０によりレーザ光を照射することで標本５において発生した蛍光を検出する検出光学系２０とを備えている。

照射光学系１０は、ダイクロイックミラー１１１、ミラー１１２、走査光学ユニット１１３、対物レンズ１１４、およびステージ１１５から構成されている。
検出光学系２０は、共焦点ピンホール１１６、ミラー１１７、分光素子（分光手段）１１８、複数セル光検出器（光検出器）１１９、増幅器１２０、Ａ／Ｄ変換器１２１、およびＣＰＵ（ゲイン切替手段、合算部）１２２から構成されている。

ダイクロイックミラー１１１は、光源ユニット２００からのレーザ光を反射する一方、標本５において発生して対物レンズ１１４により集光された蛍光を透過するようになっている。具体的には、ダイクロイックミラー１１１は、波長λ_Ａ（３５０ｎｍ）周辺と波長λ_Ｂ（５１５ｎｍ）周辺の光を反射する特性を有している。このような特性を有することで、ダイクロイックミラー１１１は、レーザ光の光路と標本５からの蛍光の光路とを分岐するようになっている。

走査光学ユニット１１３は、例えばアルミコートされた一対のガルバノミラー１１３ａ，１１３ｂを有しており、これら一対のガルバノミラー１１３ａ，１１３ｂの角度を変化させることで、ラスタスキャン方式で駆動されるようになっている。これにより、光源ユニット２００からのレーザ光を標本５上において２次元的に走査させるようになっている。

標本５では、光源ユニット２００からのレーザ光が照射されることによって、蛍光試薬が励起され、蛍光が発生する。
対物レンズ１１４は、走査光学ユニット１１３により走査されたレーザ光を標本５上に照射する一方、標本５から発生した蛍光を集光するようになっている。

ここで、本実施形態で使用している蛍光試薬Ｉｎｄｏ−１は、図２に示すように、波長λ_Ａのレーザ光Ｌ_Ａによる励起によって、波長λ_Ａ’、λ_Ａ”の蛍光を発する特性を有している。また、蛍光試薬ＳＮＡＲＦ−１は、図３に示すように、波長λ_Ｂのレーザ光Ｌ_Ｂによる励起によって、波長λ_Ｂ’、λ_Ｂ”の蛍光を発する特性を有している。カルシウムイオン（以降「Ｃａイオン」と表記する。）の濃度によりλ_Ａ’／λ_Ａ”の値が変化し、ｐＨの変動によりλ_Ｂ’／λ_Ｂ”の値が変化する。具体的には、それぞれの蛍光波長は、λ_Ａ’＝４０５ｎｍ、λ_Ａ”＝４８０ｎｍ、λ_Ｂ’＝５８０ｎｍ、λ_Ｂ”＝６３０ｎｍである。

共焦点ピンホール１１６は、標本５上におけるレーザ光の焦点位置から発生した蛍光のみを通過させるようになっている。すなわち、対物レンズ１１４により集光されてダイクロイックミラー１１１を透過した蛍光は、共焦点ピンホール１１６を通過することによりレーザ光の焦点位置（測定点）から光軸方向にずれた位置からの光がカットされる。これにより、光軸方向に焦点位置と同一な面からの蛍光だけがミラー１１７に入射する。

分光素子１１８は、例えばプリズムや回折格子であり、標本５において発生し、ミラー１１７により反射された蛍光を波長毎のスペクトル成分に分光し、分光したスペクトル成分を複数セル光検出器１１９に入射させるようになっている。

複数セル光検出器１１９は、分光素子１１８により分光されたスペクトル成分をそれぞれ検出する複数のセルを有しており、検出したスペクトル成分の輝度を電気信号へ変換する素子である。複数セル光検出器１１９には、波長毎に分割されたスペクトル成分が入射されるため、各セルにそれぞれ異なる波長の光が入射される。この複数セル光検出器１１９の具体例として、例えば浜松ホトニクス（株）製のＨ７２６０（３２セルフォトマルチプライヤ）を用いることができる。なお、複数セル光検出器１１９は、外部から感度調整を行うことができるが、感度（光検出器ゲイン）は全セル一括でしか調整できないものである。

複数セル光検出器１１９の後段には、電気信号を増幅する増幅器１２０がセル毎に設けられている。増幅器１２０は、複数セル光検出器１１９により変換された微弱信号を増幅することができる。この増幅器１２０により、各セルの回路ゲインを個別に調整することができるが、光検出器ゲインと比べてゲイン可変範囲が狭く、速度とＳ／Ｎを確保するためには１０倍程度が限界である。

増幅器１２０の後段には、Ａ／Ｄ変換器１２１がセル毎に設けられている。Ａ／Ｄ変換器１２１は、増幅器１２０により増幅された電気信号をデジタル信号に変換するものである。

Ａ／Ｄ変換器１２１の後段には、ＣＰＵ１２２が接続されている。ＣＰＵ１２２は、複数セル光検出器１１９の複数のセルにより検出され、デジタル化されて送られてきた輝度信号を合算するようになっている。
また、ＣＰＵ１２２は、音響光学素子２０１によるレーザ光の波長の切り替えに同期して複数セル光検出器１１９のゲインを切り替えるようになっている。

ＣＰＵ１２２には、ＰＣ３００の内部にあるパーソナルコンピュータ本体（以降「ＰＣ本体」と表記する。）３０１が接続されている。このＰＣ本体３０１には、ディスプレイ３０２および入力装置（セル選択部）３０３が接続されている。

入力装置３０３は、ユーザによりゲイン設定、色素選択についての入力が行われるようになっており、その入力結果をＰＣ本体３０１に送信するようになっている。入力装置３０３により色素選択の入力を行うと、この設定はＰＣ本体３０１を介してＣＰＵ１２２に送られ、ＣＰＵ１２２内では選択した色素に対応する合算セルの決定および合算処理が行われるようになっている。

また、入力装置３０３から光検出器ゲインの調整を行うと、ＰＣ本体３０１を介して、ＣＰＵ１２２によって複数セル光検出器１１９のゲインが一括調整される。また、入力装置３０３から回路ゲインの調整を行うと、ＰＣ本体３０１を介して、ＣＰＵ１２２によって増幅器１２０のゲインがセル毎に調整されるようになっている。

ＰＣ本体３０１は、ＣＰＵ１２２により合算された輝度信号に基づいてスキャン画像を生成するようになっている。
ディスプレイ３０２は、ＰＣ本体３０１に接続されており、ＰＣ本体３０１により生成されたスキャン画像の表示が行われるようになっている。
コントローラ４００は、走査光学ユニット１１３、ＣＰＵ１２２、および光源ユニット２００を制御して、これら装置間の同期をとるようになっている。

上記構成を有する顕微鏡１の作用について以下に説明する。
ここでは、細胞内のＣａイオン濃度、ｐＨの同時測定をフレームシーケンシャルで行う場合を例に説明する。ここで、細胞機能の研究において、細胞内のＣａイオン濃度変化と共にｐＨが重要な働きを担っているという報告があり、高速でこの二つのイオンの変化を同時測定したいという要求がある。そこで、これらのイオンを観察する蛍光色素として、Ｉｎｄｏ−１およびＳＮＡＲＦ−１を用いる。

まず、光源ユニット２００内の光源Ａ２０２（λ_Ａ＝３５０ｎｍ）と光源Ｂ２０３（λ_Ｂ＝５１５ｎｍ）のレーザ光のうち、Ｃａイオン濃度の測定に必要な波長である光源Ａ２０２からのレーザ光Ｌ_Ａが、音響光学素子２０１により選択されて出射される。レーザ光Ｌ_Ａは、顕微鏡本体１００内にあるダイクロイックミラー１１１に入射する。ここで、ダイクロイックミラー１１１は、３５０ｎｍ周辺の波長を反射する特性を有しているため、レーザ光Ｌ_Ａは、ミラー１１２に向けて反射される。レーザ光Ｌ_Ａは、ミラー１１２により反射されて走査光学ユニット１１３に入射する。走査光学ユニット１１３に入射したレーザ光Ｌ_Ａは、走査光学ユニット１１３の動作によって偏向され、標本５上において２次元的に走査される。

走査されたレーザ光Ｌ_Ａは、対物レンズ１１４に入射し、ステージ１１５上に置かれた標本５上に集光されて照射される。標本５の焦点面においては、レーザ光Ｌ_Ａにより標本５内の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。

標本５から発せられた蛍光は、対物レンズ１１４により集光され、走査光学ユニット１１３及びミラー１１２を通過して、ダイクロイックミラー１１１に入射する。ダイクロイックミラー１１１に入射した蛍光は、ダイクロイックミラー１１１を透過し、共焦点ピンホール１１６へ導光される。

共焦点ピンホール１１６では、標本５の焦点面において発生した蛍光のみを通過させ、レーザ光Ｌ_Ａの焦点位置（測定点）に対して光軸方向にずれた位置からの光がカットされる。これにより、光軸方向に測定点と同一な面からの蛍光だけがミラー１１７に入射される。

ミラー１１７で反射された蛍光は、分光素子１１８に入射し、波長毎のスペクトル成分に分解される。分解されたスペクトル成分は、複数セル光検出器１１９の各セルに入射し、各セルによりそれぞれの波長成分についての輝度に応じた電気信号に変換される。

これらの電気信号は、増幅器１２０によりそれぞれ増幅され、Ａ／Ｄ変換器１２１によりアナログ信号からデジタル信号に変換される。デジタル信号となった電気信号はＣＰＵ１２２に送られる。フレームシーケンシャルでは、この状態で走査光学ユニット１１３により１フレーム分走査がされるまでこの動作が続けられる。

次に、光源ユニット２００内の光源Ａ２０２（λ_Ａ＝３５０ｎｍ）と光源Ｂ２０３（λ_Ｂ＝５１５ｎｍ）のレーザ光のうち、ｐＨの測定に必要な波長である光源Ｂ２０３からのレーザ光Ｌ_Ｂが、音響光学素子２０１により選択されて出射される。レーザ光Ｌ_Ｂは、ダイクロイックミラー１１１に入射する。ここで、ダイクロイックミラー１１１は、５１５ｎｍ周辺の波長を反射する特性を有しているため、レーザ光Ｌ_Ｂはミラー１１２に向けて反射される。レーザ光Ｌ_Ｂは、ミラー１１２により反射されて走査光学ユニット１１３に入射する。走査光学ユニット１１３に入射したレーザ光Ｌ_Ｂは、走査光学ユニット１１３の動作によって偏向され、標本５上において２次元的に走査される。

走査されたレーザ光Ｌ_Ｂは、光源Ａ２０２からのレーザ光Ｌ_Ａと同様に、対物レンズ１１４に入射し、ステージ１１５上に置かれた標本５上に集光されて照射される。標本５から発せられた蛍光は先と同じ経路で進み、波長ごとに分解され、複数セル光検出器１１９の各セルに入射する。

そして、各セルによりそれぞれの波長成分についての輝度に応じた電気信号（電流信号）に変換される。この信号は増幅器１２０により増幅され、Ａ／Ｄ変換器１２１によりアナログ信号からデジタル信号に変換される。デジタル信号となった電気信号はＣＰＵ１２２に送られる。走査光学ユニット１１３により１フレーム分走査がされるまでこの動作が続けられる。

次に、ＣＰＵでの制御について、図４および図５を用いて説明を行う。図４はシーケンシャルスキャンのフローチャート、図５はＣＰＵ１２２内で実行される処理を展開して示した機能ブロック図である。

図４に示すように、ステップＳ１では、ユーザが入力装置３０３を用いて色素選択を行う。ここで、色素としてｉｎｄｏ−１とＳＮＡＲＦ−１を使用しているので、ユーザはＧＵＩを通じてこれら２色を選択する。この設定はＰＣ本体３０１を介してＣＰＵ１２２へ送られる。

ステップＳ２〜ステップＳ３はＣＰＵ１２２内での処理である。
ステップＳ２では、ＣＰＵ１２２は色素情報を受け取り、色素情報とセルとが対応付けられたデータテーブルを呼び出して、それぞれの色素に関して合算すべきセルを決定する（図５に示す色素選択処理）。ここでは、ｉｎｄｏ−１とＳＮＡＲＦ−１に関して合算すべきセル群を、それぞれチャネル１（ＣＨ１）、チャネル２（ＣＨ２）とする。

続いてステップＳ３において、ＣＰＵ１２２の処理によりＧＵＩ上に２色分の仮想的なセル群がチャネル１，チャネル２としてウインドウ表示される。このウインドウ表示の一例を図６に示す。ここでは、色素選択を行わないで、ユーザが任意に合算するセルを決定する方法にしてもよい。この場合は仮に未登録の色素があっても対応することができる。

ステップＳ４〜ステップＳ５はユーザが行う操作である。
ステップＳ４では、ユーザはＧＵＩ上で先ほど表示されたウインドウからセルを選択してスキャンを開始し、スキャン画像を見ながら回路ゲインの調整を行う（図５に示す回路ゲイン設定処理）。この動作を全てのセル群（チャネル）について行う。なお、このときに表示されているスキャン画像は、対応するセルの輝度データを合算表示しているものである。
ステップＳ５では、ユーザがシーケンシャルスキャンの開始命令を行う。

以降はＣＰＵ１２２内の処理である。
ステップＳ６では、シーケンシャルスキャン開始命令を受け取ると、スキャン動作に同期して、ＣＰＵ１２２により予め設定されたパラメータに基づいて、レーザ光の波長、複数セル光検出器１１９のセル合算範囲、回路ゲインをそれぞれ切り替えて、合算された輝度データを取得する。

本実施形態ではフレームシーケンシャルスキャンを行っているため、図７のタイミングチャートに示すように、Ｙガルバノの動作に同期して、レーザ光の波長および複数セル光検出器１１９による輝度データの取得の切り替えが行われる。この動作を全てのセル群（チャネル）についてシーケンシャルに行う。

最後にステップＳ７において、得られた輝度データから、多重染色に関してのスキャン画像を表示する。
なお、ここで説明した処理方法は一例であり、異なる構成で処理を行ってもよい。

以上のように、本実施形態に係る顕微鏡１によれば、音響光学素子２０１によりレーザ光の波長が切り替えられ、レーザ光が標本５に照射されることで発生した蛍光が、分光素子１１８によりスペクトル成分に分光される。分光されたスペクトル成分は、複数のセルを有する複数セル光検出器１１９によりそれぞれ検出される。この場合において、ＣＰＵ１２２によって、音響光学素子２０１によるレーザ光の波長の切り替えに同期して、複数セル光検出器１１９の回路ゲインが切り替えられる。

これにより、音響光学素子２０１によって切り替えられたレーザ光の波長毎に、複数セル光検出器１１９の感度を調整することができ、標本５上において発生した蛍光のスペクトル成分を高精度に検出することができる。また、レーザ光の波長毎に蛍光のスペクトル成分を検出することで、複数の色素からの蛍光を取得する場合（本実施形態ではｉｎｄｏ−１とＳＮＡＲＦ−１）において、各色素による蛍光のスペクトル成分が重なっている場合にも、色素毎の蛍光のスペクトル分布を得ることができる。

また、レーザ光の波長の切り替えに同期して、選択されたセルによって検出されたスペクトル成分をＣＰＵ１２２により合算することで、レーザ光の波長毎に、所望の波長範囲における蛍光を取得することができる。また、選択されたセルからのデータのみを取得することで、全セルからのデータを取得する場合に比べて、取り扱うデータ量を減らすことができ、画像生成等の処理を高速化することができる。

また、ＣＰＵ１２２が、増幅器１２０の回路ゲイン、すなわち複数セル光検出器１１９の各セルにより検出されたスペクトル成分の増幅率をそれぞれ調整することで、各セルの検出感度に応じた増幅率でスペクトル成分を増幅することができ、鮮明な画像を取得することができる。

［第１の変形例］
本実施形態に係る顕微鏡１の第１の変形例として、回路ゲインを切り替える代わりに、光検出器ゲイン（ＨＶ）を切り替えることにより（図５に示す光検出器ゲイン設定処理）、シーケンシャルスキャンを行うこととしてもよい。あるいは、検出器ゲインと回路ゲインを併用してシーケンシャルスキャンを行うこととしてもよい。

このようにすることで、音響光学素子２０１によって切り替えられたレーザ光の波長毎に、複数セル光検出器１１９の各セルの感度を一括して調整することができ、標本５からの蛍光の検出精度を向上させ、鮮明な画像を取得することができる。

また、光検出器ゲインのダイナミックレンジは広いため、色素間の輝度差が大きいサンプルにおいても、回路ゲインで調整する場合と比較して、Ｓ／Ｎを向上させることができる。
光検出器ゲインは、複数セルに対して１つしかないが、シーケンシャルにデータを取得するため、色素間の輝度差の大きいサンプルにおいても、データを取得することができ、通常の同時観察では観察できないサンプルの変化などを観察することができる。
なお、検出器ゲインと回路ゲインを併用することで、さらに鮮明な画像を取得することができる。

本変形例において、光検出器ゲインを切り替えた時に得られる輝度値が安定するまでに時間がかかる場合は、フレーム間にインターバル（待機時間）を設けてスキャンを行ってもよい。インターバルを設けた場合のタイミングチャートを図８に示す。ここでは、インターバルを例えば１０ｍｓと設定する。

複数セル光検出器１１９の感度が安定する前に画像を生成すると、データが不正確になってしまう場合がある。したがって、ＣＰＵ１２２が複数セル光検出器１１９の感度を調整した際に、その感度が安定するまで待機した後に、標本５からの蛍光を検出することで、精度の高い画像を取得することができる。

［第２の変形例］
本実施形態に係る顕微鏡１の第２の変形例として、ラインシーケンシャルスキャンで画像を取得することとしてもよい。このラインシーケンシャルスキャンでは、ラインごとに照射波長の切り替え、合算セル組み合わせの変更、ゲインの切り替えを行うことができる。

この場合はＸガルバノの動作に同期して、レーザ光の波長、複数セル光検出器１１９のセル合算範囲、およびゲインの切り替えが行われる。すなわち、図７、図８においてＹガルバノとして示している波形がＸガルバノの波形になる。
このようにすることで、フレームシーケンシャルスキャンでは観察できないような色素間の速い変化を観察することができる。

［第３の変形例］
本実施形態に係る顕微鏡１の第３の変形例として、画像取得の際、指定したセルの分だけ輝度データを取得するのではなく、全セルについての輝度データを取得し、その後に合算するセルを選択することとしてもよい。この場合、スキャン後にデータを見ながらユーザが任意に合算範囲を選択するなどの処理を行う。

具体的には、図９に示すように、スキャン１回目における蛍光のスペクトル分布がＦ１、スキャン２回目における蛍光のスペクトル分布がＦ２である場合を例に挙げて説明する。この場合、複数セル光検出器１１９の全セルによる輝度データの取得後に、例えばチャネル１の合算範囲をセルａ〜ｉ、チャネル２の合算範囲をセルｇ〜ｐと設定する。

このようにすることで、スキャンした後、データを見ながら任意にセルの合算範囲を選択することができるため、実験後のデータ処理における自由度を向上することができる。

［第４の変形例］
本実施形態に係る顕微鏡１の第４の変形例として、レーザ光の切り替えおよびゲインの切り替えを標本上の照射領域毎に行うこととしてもよい。
具体的には、図１０に示すように、標本５上において波長λ_Ａのレーザ光Ｌ_Ａが照射される領域を領域Ａ、標本５上において波長λ_Ｂのレーザ光Ｌ_Ｂが照射される領域を領域Ｂとした場合に、これら領域Ａと領域Ｂとで回路ゲインまたは光検出器ゲインを切り替えて、合算された輝度データを取得する。

このようにすることで、退色を抑えて鮮明な画像を取得するとともに、レーザ光Ｌ_Ａおよびレーザ光Ｌ_Ｂが照射される領域を観察に必要な最小面積とすることができ、走査時間の短縮ができる。

［第５の変形例］
本実施形態に係る顕微鏡１の第５の変形例として、第４の変形例において、同一波長のレーザ光による照射領域が複数個所ある場合に、同一波長のレーザ光が照射された領域においてもゲインを変えることとしてもよい。

具体的には、図１１に示すように、標本５上において波長λ_Ａのレーザ光Ｌ_Ａが照射される領域を領域Ａ１，Ａ２、標本５上において波長λ_Ｂのレーザ光Ｌ_Ｂが照射される領域を領域Ｂ１，Ｂ２とした場合に、これら領域Ａ１，Ａ２，Ｂ１，Ｂ２の全てにおいて回路ゲインまたは光検出器ゲインを切り替えて、合算された輝度データを取得する。

このように領域毎にゲインを切り替えることで、蛍光輝度が異なる細胞でもコントラストの高い画像を取得することができ、観察精度を向上することができる。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
例えば、本実施形態において、波長の異なる２種類のレーザ光を用いた場合について説明したが、３種類以上のレーザ光を採用し、それぞれの波長に同期して複数セル光検出器１１９のゲインを切り替えることとしてもよい。

１ レーザ走査型顕微鏡
５ 標本
１０ 照射光学系
２０ 検出光学系
１００ 顕微鏡本体
１１１ ダイクロイックミラー
１１２ ミラー
１１３ 走査光学ユニット
１１４ 対物レンズ
１１５ ステージ
１１６ 共焦点ピンホール
１１７ ミラー
１１８ 分光素子（分光手段）
１１９ 複数セル光検出器（光検出器）
１２０ 増幅器
１２１ Ａ／Ｄ変換器
１２２ ＣＰＵ（ゲイン切替手段、合算部）
２００ 光源ユニット
２０１ 音響光学素子（波長選択手段）
２０２ 光源Ａ
２０３ 光源Ｂ
３００ パーソナルコンピュータ（ＰＣ）
３０１ ＰＣ本体
３０２ ディスプレイ
３０３ 入力装置（セル選択部）
４００ コントローラ

Claims (8)

1. レーザ光を標本上で２次元走査する走査手段と、
   前記レーザ光の波長を切り替える波長選択手段と、
   該波長選択手段により切り替えられた波長のレーザ光が標本に照射されることにより、標本において発生した蛍光をスペクトル成分に分光する分光手段と、
   該分光手段により分光されたスペクトル成分をそれぞれ検出する複数のセルを有する光検出器と、
   前記波長選択手段によるレーザ光の波長の切り替えに同期して前記光検出器のゲイン及び／又は前記各セルの回路ゲインを切り替えるゲイン切替手段と、
   観察しようとする２以上の蛍光色素の選択を受け付ける入力部と、
   選択された前記蛍光色素の各々に対応するチャネルとして、前記複数のセルの内、各前記蛍光色素に応じて合算すべきセル群を決定し、このセル群の出力を合算して輝度データを生成する合算処理部と、
   前記合算された輝度データに基づいてスキャン画像を生成するコンピュータと、
   前記スキャン画像を表示する表示部と、
   第１の蛍光色素に対応するチャネルによる輝度データの取得を行うように予め設定されたパラメータに基づくレーザ光の波長、セル群、光検出器のゲイン及び／又は前記回路ゲインと、第２の蛍光色素に対応したチャネルによる輝度データの取得を行うように予め設定されたパラメータに基づくレーザ光の波長、セル群、光検出器のゲイン及び／又は前記回路ゲインとを、前記走査手段の動作に同期して切り替えることにより、前記２以上の蛍光色素の各々に個別に対応したスキャン画像を略同時に取得するシーケンシャルスキャン制御部とを備えるレーザ走査型顕微鏡。
2. 前記ゲイン切替手段が、前記光検出器の各セルの感度を一括して調整する請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
3. 前記ゲイン切替手段が、前記光検出器の各セルにより検出されたスペクトル成分の増幅率をそれぞれ調整する請求項１または請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
4. 前記光検出器は、前記ゲイン切替手段により感度が調整された際に、その感度が安定するまでスペクトル成分の検出を待機する請求項２または請求項３に記載のレーザ走査型顕微鏡。
5. 前記ゲイン切替手段が、前記レーザ光の照射領域ごとに前記光検出器のゲイン及び／又は前記回路ゲインを切り替える請求項１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
6. 同一の波長を有する前記レーザ光が照射される領域が複数ある場合、
   前記ゲイン切替手段が、同一の波長を有する前記レーザ光においても照射領域ごとに前記光検出器のゲイン及び／又は前記回路ゲインを切り替える請求項５に記載のレーザ走査型顕微鏡。
7. 前記走査手段が、前記レーザ光をＸＹ走査する一対の走査ミラーを備え、
   前記シーケンシャルスキャン制御部が、Ｘ走査ミラーの動作に同期してライン単位で前記切り替えを行う請求項１から請求項４のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
8. 前記走査手段が、前記レーザ光をＸＹ走査する一対の走査ミラーを備え、
   前記シーケンシャルスキャン制御部が、Ｙ走査ミラーの動作に同期してフレーム単位で前記切り替えを行う請求項１から請求項４のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。

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