JP4441695B2 - 試料の検査方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、蛍光顕微鏡法、特にレーザ走査型顕微鏡法、蛍光相関分光法および走査型近視野顕微鏡法における、主として生物学上の試料、プレパラートおよび付属する構成成分を検査するための方法に関するものである。
それに加え作用物質を検査するための蛍光検出に基づく方法（ハイ・スループット・スクリーニング）も含まれる。
【０００２】
少数の広域スペクトル色素帯の検出から完全なスペクトルの同時記録へと移行することにより、空間的部分構造または動力学的過程において、殆どが分析面または機能面からなされる試料特性の確認、分離、分類に関し新たな可能性が開けてくる。それにより、オーバーラップ部分を持つ蛍光スペクトルの場合では、多重蛍光団を含む試料の同時検査が、厚い試料の空間構造においても可能となる。
【０００３】
【従来の技術】
生物プレパラートを検査するための光学顕微鏡の古典的利用分野の１つに蛍光顕微鏡法（文献：Ｐａｗｌｅｙ「生物共焦点顕微鏡法ハンドブック」、プレーナム・プレス１９９５年）がある。この場合では特定の色素が細胞部分への特殊標識付けのために使用される。
色素分子は、入射した一定エネルギを持つ光子１個の吸収により光子基底状態から励起状態へ励起される。この励起は一般に一光子吸収と称される（図１ａ）。
【０００４】
色素分子は、このように励起された状態からさまざまな方法で基底状態に戻ることができる。蛍光顕微鏡法では蛍光光子の放射下での移行が最も重要である。放射される光子の波長はストークス変位のため励起放射に比較して原則的に赤側にずれる。すなわち長波長側である。ストークス変位が蛍光光線の励起光線からの分離を可能にする。
【０００５】
蛍光は、ブロックフィルタと組み合わせた適当なダイクロイック・ビームスプリッタによって励起放射から分離し別途観察する。そうすることによって、さまざまな色素で着色された個々の細胞部分の描写が可能である。しかし原則的には、プレパラートのいくつかの部分を、独特な堆積の仕方をするさまざまな色素で同時に着色することもできる（多重蛍光）。個々の色素から送出される蛍光信号を区別するために、ここでも特殊なダイクロイック・ビームスプリッタを使用する。
【０００６】
高いエネルギを持つ一光子による色素分子の励起（一光子吸収）のほかに、より小さいエネルギを持つ複数の光子による励起も可能である（図１ｂ）。この場合、個々の光子のエネルギ総和は高エネルギ光子の何倍にも相当する。この種の色素励起は多光子吸収と称される（文献：Ｃｏｒｌｅ、Ｋｉｎｏ「共焦点走査型光学顕微鏡法と関連画像システム」；アカデミック・プレス１９９６年）。しかし、色素放射はこの種の励起によっては影響されない。すなわち、多光子吸収の場合放射スペクトルは負のストークス・シフトを起すため、励起放射に比較するとその波長は短い。励起光線を放射光線から分離するのは一光子吸収の場合と同じ方法で行う。
【０００７】
以下に現状技術を共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）の例で説明する（図２）。
ＬＳＭは大きく分けて、光源、走査モジュール、検出ユニット、顕微鏡の４モジュールから成っている。これらのモジュールは以下により詳しく説明する。それに加え、ＤＥ１９７０２７５３Ａ１も参考になる。
【０００８】
プレパラート中にあるさまざまな色素の個別励起は、さまざまな波長のレーザをＬＳＭ内で使用する。励起波長の選択は検査対象色素の吸収特性に従って行う。励起光線は光源モジュール内で生成される。この場合さまざまなレーザ（アルゴン、アルゴン・クリプトン、TiSaレーザ）が使用の対象になる。そのほか、光源モジュールでは、波長の選択および必要な励起波長の強度調整を、たとえば音響光学結晶の使用により行う。
【０００９】
それに続き、レーザビームは、ファイバまたは適当なミラー装置を通じて走査モジュール内に導かれる。光源で生成されたレーザビームは、対物レンズを通り、回折の抑制下でスキャナ、走査レンズ系、円筒レンズを経由してプレパラート内へ集束される。スキャナにより試料をｘ−ｙ方向にドット走査する。試料走査における画素上の滞留時間は、多くの場合マイクロ秒未満ないし数秒の範囲とする。
【００１０】
蛍光の共焦点検出（デスキャン検出）の場合、焦平面（試料）からおよびその上下にある平面から放射された光は、スキャナを通じてダイクロイック・ビームスプリッタ（ＭＤＢ）に達する。ＭＤＢは蛍光を励起光から分離する。続いて蛍光は、正確に焦平面と共役な平面内にある絞り（共焦点絞り／ピンホール）で焦点を結ぶ。これによって焦点外の蛍光成分が遮断される。絞りの寸法をさまざまに変化させることによって、顕微鏡の光学分解能を調節することが可能である。絞りの後ろに別のダイクロイック・ブロックフィルタ（ＥＦ）があり、これが再度励起ビームを差し止める。蛍光は、ブロックフィルタを通過した後、点像検出器（ＰＭＴ）によって測定される。
【００１１】
多光子吸収を利用した場合、色素蛍光の励起は、励起強度が特に強い小ボリューム部分に起こる。この領域は、共焦点装置を使用した場合の検出領域より極僅かに大きいだけである。したがって共焦点絞りの使用を省くことができ、検出を対物レンズの直後で行うことができる（ノンデスキャン検出）。
多光子吸収によって励起される色素蛍光を検出するための別の装置では、さらにデスキャン検出が行われるが、この場合では対物レンズのひとみは検出ユニット内へ結像する（非共焦点デスキャン検出）。
【００１２】
３次元照明による像のうち、対応の一光子吸収もしくは多光子吸収と接続している２検出器の装置によって、対物レンズの焦平面内に存在する平面（光学的断面）のみが再現される。それに続いて、試料のさまざまな深さｚにおけるｘ−ｙ平面内のいくつかの光学的断面の描画により、コンピュータでサポートされた試料３次元像が生み出される。
したがって、ＬＳＭは厚いプレパラートを検査するのに適している。励起波長は使用色素の固有吸収特性で決定される。色素の放射特性に合わせたダイクロイックフィルタにより、それぞれの色素から送出される蛍光のみが確実に点像検出器で測定されることになる。
【００１３】
バイオメディカル分野においては、目下のところいくつかのさまざまな細胞領域がさまざまな色素で同時に標識付けされている（多重蛍光）。現状技術では、個々の色素はさまざまな吸収特性に基づき、または放射特性（スペクトル）に基づき別々に検出されている（図３ａ）。図３ａは各種典型的な色素の放射スペクトルを示している。放射信号は波長別に表わされている。ナンバー１から４の色素にはそれぞれ放射スペクトルの位置および形態に差のあることが認められる。それぞれ別個の検出には、複数色素の蛍光に対する追加分割を副ビームスプリッタ（ＤＢＳ）で行ない、個々の色素放射検出を別々の点像検出器（ＰＭＴｘ）内で行う。
【００１４】
図３ｂに描かれた各色素の放射スペクトルは強度に重なり合うこともあり、その場合では各色素の放射信号をＤＢＳで分離するのは困難である。しかし、それらの色素が異なった吸収特性を持っていれば、ＤＥ ＣＺ７３０２に記述されているようなマルチトラッキング法によりそれぞれを選択的に励起させることができる。図３ｂは、色素ＣＦＰおよびシアンＧＦＰについて波長別の放射信号を示したものである。その場合励起は４５８ｎｍおよび４８８ｎｍの２レーザ線によって行った。これらの色素は、検査試料への毒性作用がなく、生体プレパラートの検査には特に適している。両色素ＣＦＰ、ＧＦＴをできる限り効果的に検出するため、一走査方向においてＣＦＰを波長４５８ｎｍで励起して４６０〜５５０ｎｍの蛍光を検出し、スキャナの復路ではＧＦＰに対して波長４８８ｎｍで選択的励起を行なって、波長領域４９０〜６５０ｎｍで検出する。
【００１５】
使用色素の放射スペクトル位置が未知である場合、あるいは周辺条件（試料内外の条件：温度、濃度、ｐＨ値）に依存して放射スペクトルに位置移動が起きる場合では（図３ｃ）、色素蛍光を効果的に検出するにも限界がある。図３ｃも同様に放射信号を波長の関数で描いたものである。波長シフトは数１０ｎｍに至ることもある。試料内の放射スペクトルの測定には、今日ではＬＳＭとの組み合わせの場合も含めて分光計が使用される。この目的には点像検出器の代わりに、殆どの場合高分解能を持つ従来型分光計が使用される（Dixon他の特許ＵＳ ５，１９２，９８０）。しかしこれらは放射スペクトルを点単位でのみ、あるいはある領域について平均的に記録するだけである。つまり、一種のスペクトル分析である。
【００１６】
蛍光顕微鏡法のまた別な適用例では、特に生物プレパラート中のイオン濃度（たとえばＣａ＋，Ｋ＋，Ｍｇ２＋，Ｚｎ＋，…）の測定に用いられている。それには、特別な色素や、またはイオン濃度に依存してスペクトルのずれる色素配合（たとえば、フラ、インド、フルオ；モレキュラー・プローブズ社）が使用される。
図４ａはカルシウムイオンの濃度に依存するインド−１の放射スペクトルを示している。
図４ｂはフルオ−３とフラレッド色素との組み合わせの場合で、カルシウムイオン濃度に依存する放射スペクトルの例を示している。
これらの特殊色素は放射率識別色素と称される。図４ａに示した２つの蛍光領域を検出して、両強度の比率を出すと、対応のイオン濃度を導き出すことができる。多くの場合この測定によって生プレパラート中のイオン濃度の動的変化が分析されるが、それには１ミリ秒以内の時間分割が要求される。
【００１７】
多重蛍光記録で障害になる望ましくない現象は、背景信号の重なりである。それは、個別レーザの試料からの反射であったり、または試料構成部分から発する広帯幅の自己蛍光信号の場合もあるが、それらは検査対象である蛍光標識付け試料箇所のスペクトル特性に覆い被さって、そのため検査を困難にしているばかりか一部では阻止している。
【００１８】
細胞およびその他粒子の検査および分類に流動細胞計量計が用いられる。その場合、細胞を液体に溶かし、毛管を通じてポンピングする。細胞検査には側面からレーザ光線を照射してそれを毛管に集束させる。細胞は各種の色素またはバイオ分子で着色しておく。励起された蛍光および後方散乱励起光を測定する。現技術状況については、Ｍ．Ｒ．Ｍｅｌａｍｅｄ、Ｔ．Ｌｉｎｄｍｏ、Ｍ．Ｌ．Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ著“Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ”（「流動細胞の計量および分類」第２版、Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．社（ニューヨーク）出版、１９９０年刊、８１〜１０７ページ）に記述されている。
【００１９】
後方散乱信号から細胞の大きさが測定できる。個々の細胞の蛍光スペクトル特性から様々な細胞を分離／分類することが、または個別に計量することができる。細胞の分類は、静電界において様々な毛管の使用下で行う。その結果は、例えば色素Ａ着色の細胞数と色素Ｂ着色の細胞数がしばしば棒グラフで描かれ比較される。流動速度は、典型例では数１０〜１００ｃｍ／秒である。従って、高感度の検出が必要になる。検出量の制限のため、現状技術では共焦点検出が行われている。
流量測定の精度は様々なファクタに影響される。そのファクタとしては、例えば非特殊性蛍光、細胞の自己蛍光、光学系構成部の蛍光および使用検出器の雑音がある。
【００２０】
本発明の課題は、吸収特性および放射特性が極僅かしか違わず、しかも顕微鏡の画像形成システムで別々に測定および表示のできる色素の使用下で、フレキシブルに自由にプログラミングできる新しい検出方法を実現することである。個々の色素間の漏話は、本発明に基づく方法では確実に掌握され、データプロセッシングによって排除される。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
この方法は顕微鏡の画像形成システムにも分析システムにも適用できる。この顕微鏡システムというのは、２００ｎｍまでの光学分解能を持つ、生物プレパラートの３次元検査用レーザ走査型顕微鏡や、１０ｎｍまでの分解能を持つ、表面の高度分解検査のための走査型近視野顕微鏡などの画像形成システム、および分子濃度の定量測定や分子拡散の測定のための蛍光相関性顕微鏡のことである。さらに、蛍光検出をベースとする色素検査法および流動細胞計量測定法も含まれる。
上記システムではすべて、プレパラートの特殊標識化に蛍光色素が使用される。上記の課題は、独立した請求項に基づく方法および装置によって解消される。その他の好ましい実施態様は従属請求項の対象である。
【００２２】
本発明に基づく方法により、同時使用可能な色素記号数を増やすことができる。それにより、例えば同時検査可能な細胞特性数を増やすことが可能になる。個々の色素間でスペクトル特性が強度にオーバラップする場合、個別色素の蛍光信号を別々に検出するためには現状技術レベルでは波長領域を制限しなければならず、そのため検出感度が低下する。即ち、増幅度を高めて使用するので、検出器の雑音が大きくなる。しかし本発明に基づく方法ではこれが防止でき、その上、非特殊性蛍光信号、自己蛍光および測定装置の蛍光をそれぞれ分別することができる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明に基づく方法の背景には、スペクトル分割された蛍光検出がある。その場合では放射光が、走査モジュール内または顕微鏡内（多光子吸収の場合）でメインカラースプリッタ（ＭＤＢ）、あるいは７３４６ＤＥまたは７３２３ＤＥに基づくＡＯＴＦ（音響光学フィルタ）など励起光線を被検出光線から分離するための素子によって、励起光から分割される。透過光装置の場合ではこの種の素子は完全に省くこともできる。
【００２４】
それに続いて配置されている検出器ユニットの構成図を図５に示してある。試料から出た光は、共焦点検出の場合では結像レンズ系ＰＯ、さらには絞り（ピンホール）ＰＨを通って焦点を結び、それによって焦点外に生じる蛍光が遮断される。ノンデスキャン検出の場合には絞りは不要である。この場合では光は角分散素子ＤＩによってそのスペクトル成分へ分解される。角分散素子としてはプリズム、格子および音響光学素子が使用される。分散素子によってそのスペクトル成分へ分割された光は、続いてライン検出器ＤＥ上へ結像される。つまり、このライン検出器ＤＥは波長に依存する放射信号Ｓを測定し、これを電気信号ＥＳへ変換する。加えて、検出ユニットには励起波長を抑制するための線型フィルタを直列接続することもできる。
【００２５】
図５にブロック接続図で示した検出器ユニットを光学的ビーム光路として用いた場合の考え得る実施態様を図６に示している。本構造は本質的にはサーニー・ターナー構造に基づくものである。共焦点検出の場合、試料からの光Ｌはピンホールレンズ系ＰＯにより共焦点絞りＰＨを通され集束する。ノンデスキャン検出で多光子吸収の場合には、この絞りは不要である。第１の結像鏡Ｓ２は蛍光を視準する。続いて光は線形格子Ｇ、たとえばミリ当たり線数６５１本を有する格子上に当たる。格子は光をその波長に応じてさまざまな方向に偏向させる。
第２の結像鏡Ｓ１はスペクトル分割された個々の波長成分を、対応ライン検出器ＤＥのチャネル上へ集束させる。浜松製作所のＨ７２６０ライン２次電子増倍管を使用するのが特に好ましい。当検出器は３２チャネル型で高感度を有する。
【００２６】
上記実施態様の自由なスペクトル領域は約３５０ｎｍである。自由なスペクトル領域はこの装置ではライン検出器の３２チャネルに均等に配分されるので、光学的分解能は約１０ｎｍとなる。したがって、この装置は分光測定には限定的にしか適さない。しかし、これを結像システムに使用するのは有利である。これは、検出スペクトル帯域が相対的に広く、検出チャネルごとの信号がなお比較的大きいからである。自由なスペクトル領域の移動は、加えて、たとえば格子をＤＰだけねじることによっても行なえる。
【００２７】
上記の実施態様では、検出器ＤＥの各個別チャネルが検出する放射スペクトル幅は約１０ｎｍの帯域である。それにより、測定対象の各画像点毎に、当該画像点に存在する個別色素のスペクトル成分総和が記録される。加えて、ずっと後の方で記述しているスイッチレジスタＳＲを使ってオペレータが任意の個別チャネルを切換えることもできる。これは特に単一または複数の励起レーザ線の抑制には有効である。
【００２８】
図７には検出器ＤＥの個別チャネルに対する読出し装置が図式化されている。その場合、多チャネルＰＭＴの陽極に流れる電流は、それぞれ第１増幅器Ａ（電流／電圧変換器として接続）によって電圧に変換され増幅される。電圧は、信号を一定時間（例えば画素上滞留時間）の間積分する積分器Ｉに供給される。迅速に値を求めるため、積分器Ｉの後に、単純な比較器として次のようなスイッチング閾値を有する比較器Ｋを、即ち閾値を越えたときにデジタル出力信号を発するか、またはウィンドウ比較器として形成されていて、入力信号がスイッチング閾値の上限と下限との間にあるか、または入力信号がスイッチング閾値の外（下または上）にあれば、デジタル出力信号を発するという比較器Ｋを配置させることができる。
【００２９】
比較器もしくはウィンドウ比較器の配置は、積分器の前にすることも後にすることもできる。積分器なしの接続装置（いわゆる増幅モード）も同様に考え得る。増幅器モードでの配置の場合、比較器Ｋは然るべき基準に適合させて設置する。比較器Ｋの出力は直接アクティブなチャネルに接続する（オンライン）スイッチ・レジスタＳＲの制御信号として用いられるか、またはアクティブなチャネルを個別選択するために（オフライン）、その時の状態が付属連結器Ｖを通じてコンピュータに伝えられる。スイッチ・レジスタＳＲの出力信号は後続のＡ／Ｄ変換のため、レベル適合用の別な増幅器Ａ１へ直接導かれる。
【００３０】
ＡＤ変換された値、即ち試料の各画像点で測定されたスペクトル分解蛍光信号は、データ加工のために適当なデータ伝送装置を通じてコンピュータ（ＰＣまたはデジタル信号プロセッサＤＳＰ）へ伝送される。続いて、走査モード如何では、スペクトル分解による個々の測定画像点から、付属座標ｘ、ｙ、ｚ、時間および寿命を用いたラムダスタック（検出光線の分散、分割機能を持つ検出チャネルにより測定し、少なくとも一つの付属（画像）座標ｘ、ｙおよび／またはｚおよび／または測定時間ｔによって分類の上、記憶素子へ保存した画像点毎のスペクトル分布）が形成される。
【００３１】
但し、
・ ＸおよびＹはＳＣによって走査する。
・ Ｚは、例えばプレパラートを光学軸に沿って移動させることによって実現する。
・ 時間：種々の時間にデータ記録を行う。
・ 寿命：データ記録は蛍光寿命の間に時間分割して行う。
【００３２】
蛍光測定の場合ではアーチファクトの回避のため、試料から後方散乱した励起光を抑制することや、あるいは少なくともそれが放射最大値以下か同程度になるまで弱めることは有効である。それには、上記の付属光線フィルタまたは光学強度を弱めるために最適化された然るべきメインカラースプリッタ（ＭＤＢ）が使用できる。
【００３３】
励起レーザ光線のスペクトル幅は個別チャネルで検出される帯域幅よりはるかに小さいので、後方散乱または反射した励起光線については、図７に描かれたＳＲにより対応の個別チャネルを特定して遮断することもできる。励起波長が２つの検出チャネルに及ぶ場合、格子角度を捻るか、走査検出器を移動させるかまたは図６のＳ１またはＳ２を傾斜させることにより、励起光線が１つの検出チャネルだけに入るように励起光線を移動させることができる。
上記の両装置構成では、個別チャネルの検出には主として積分器接続装置を使用した。それにより、個別チャネル内の光子の計数および光子数の加算も制限なく行える。
【００３４】
以下では試料情報、即ちラムダスタックの様々な表示法について述べる。
上記方法で記録されたラムダスタックの最も簡易な形態は、隣接する非常に狭い波長領域からの蛍光強度の値を含んだｘ−ｙ画像の積層である。このラムダスタックの記録とｚ積層または／および時間列とを組合せれば複雑なデータが得られる。
【００３５】
これらの観察者用データの処理は以下のように様々な方法で行われる：
ａ）ラムダ最大値の投射
ラムダスタックからグレー階調画像を生成する。それには、各画素のｘ、ｙポジション毎にその波長領域について、投射画像の当該画素明度を定義付けする強度最大値を求める。
ｂ）コード化ラムダの投射
この場合もａ）と同様に投射されたラムダ最大値を算出し、各画素に対して、ラムダスタックの明度最高画素を生む波長領域の平均波長に相当する色素を付与する。
ｃ）簡易ラムダスタック（ｘｙλ）表示画面の観察
ここではラムダスタックの個別画像を少なくとも一部はシリーズで表示する。その場合、個々の画像毎に、強度が記録されている領域の平均波長を付記表示することもできる。
ｄ）より複雑なラムダスタック（ｘｙλ）表示画面の観察
ｘｙラムダスタックをｚまたは／および時間の関数で記録する場合、画面内にそれぞれシリーズ形式でｚ平面または時点を表示させるにはスライダを使用することができる。別な形式では、スペクトルの異なる画像を横列に、時間またはｚ平面の異なる画像を縦列に表示することにより、記録されたｘｙ画像をすべて同時に表示することができる。
次の観察画面間で選択することができる：ｘｙ−λ、ｘｙ−ｚ、ｘｙ−ｔ、ｘｙ−λ−ｚ、ｘｙ−λ−ｔ、ｘｙ−ｚ−ｔ。尚、挙げていない次元はスライダによって開けることができる。
ラムダ最大値またはコード化ラムダの投射と横列および縦列の表示画面観察との組合せにより、ｘｙ−ｚ−ｔ−λ情報の同時表示が可能になる。
ｅ）ラムダスタックの直交切断
これは、自由にポジショニングできる水平標識線と垂直標識線をそれぞれ一つずつ持つラムダスタックの選択λ平面を示している。ラムダスタックがこれらの線によって切断され、生じた切断像がλ平面の横（ｙ切断面）およびλ平面の上（ｘ切断面）に投射される。擬似／真正色素のコード化は自由選択により実施できる。画像内の個別色素成分の重なりによって、色に忠実な試料像が作られる。
【００３６】
参照スペクトルは、例えば純流動状態にある、即ち溶剤に溶かされた、または検査試料の不連続個別領域で結合している個々の色素の放射スペクトルである。
【００３７】
参照スペクトル生成のための領域選択は、以下の方法によって行うことができる。
ラムダスタックは各画素毎のスペクトル情報を補足資料として含んでいる。
図８ａは、例えば、様々に着色された細胞領域を表わす、ＬＳＭ画像内におけるそれぞれのＲＯＩ（ＲＯＩ １〜４）の分布状態を図示したものである。
図８ｂには放射スペクトル１から４の典型例がそれぞれ対応の励起波長（Ｌ１〜Ｌ４）と共に描かれている。
【００３８】
ＲＯＩに対する調整についてはオペレータは、例えば次のように行うことができる：個別ＲＯＩ内の色素励起に要するすべての、または殆どの励起光線を使用してスペクトル走査を実行および記録し、それに基づき個別励起レーザ光線の間にそれぞれの総合チャネル枠を設けることが可能である（図７ｂに表示されている通り、Ｌ１〜Ｌ２、Ｌ２〜Ｌ３、Ｌ３〜Ｌ４およびＬ４〜最大放射波長）。これらの総合チャネルは個別色素の蛍光帯域部分に相当する。また、同一総合チャネル内で様々な色素が強力に重なり合っているので、それらの信号の同時合算も行なわれる。これらの総合チャネルは、続いて、カラーコード化により様々な画像チャネルに分解され、相互に重畳表示される。
【００３９】
画像チャネルにおける様々な局部的色素混合により、オペレータまたは自動模様識別器は、それぞれのＲＯＩの位置設定が可能になり、例えば個別ＲＯＩにおいて最も強く現われる色素に基づいて、それぞれの加算調整に対する定義付けができる。
様々なＲＯＩに対する第２調整法では蛍光重心ＣＺ ７４４７の測定が行われる。その場合、検出器内では励起レーザ光線で照射されるすべての個別チャネルのスイッチが遮断される。各ＲＯＩは、使用されるそれぞれの色素の放射特性に変化が現われるため特徴的な蛍光重心を有している。従って、それぞれのＲＯＩは特徴的な色素重心の位置によって区別し、明確に分離することができる。
【００４０】
任意に選択した試料箇所のスペクトル特性を明確化するために、オペレータはＲＯＩ関数を使用することができる（ＲＯＩ：対象領域、図１４参照）。その場合、図２で記録された試料領域ＲＯＩ １およびＲＯＩ ２（図１４）が描画用具３（例えば、多角形、楕円形または閉じた弧形）によってマーキングされ、当該スペクトル特性がラムダスタックの各λ平面毎にＲＯＩに含まれるｘ−ｙ画素の平均値に基づきグラフ表示される（グラフ１）。
原則的には、選択した様々な試料箇所の複数スペクトル特性を、共通の、または別々のグラフ１に同時に描出することができる。
【００４１】
視覚的に具象化されたスペクトル特性１により、選択試料箇所における蛍光放射線のスペクトル分布が解明される。
様々なＲＯＩの複数スペクトル特性を描出することによって、例えば使用色素の放射スペクトルが大きく重なり合っているかどうかを究明することができる。
様々なＲＯＩのスペクトル特性は、図１２に示されているように、カラーコード化された多チャネル画像（「チャネル抽出」用操作素子４、（図１４）の生成に利用できる。
【００４２】
そのような多チャネル画像（図１２ｂ）の生成では、スペクトル特性から波長領域ＲＯＩ １〜５（図１２ａ）を選択し、例えば、当該波長領域における各画像点の総和または平均値から当該平面におけるラムダスタックの強度レベルを求めることができる。但しここでは、各画像チャネルは１色素を表わしている（チャネル１〜チャネル５）。
この操作は、加えて個別チャネルの電子総和（図７参照）を求めるのにも利用できる（「ハードウェア選択」６、（図１４）。続いて、然るべき調整のなされた多チャネル画像を直接走査することができる。
【００４３】
後に再利用する時のために、個別ＲＯＩの、即ち特殊環境下での個別色素のスペクトル特性をスペクトルデータバンク７（図１４）に保存することができる。その場合、グラフデータに加えて、ラムダスタックの記録に必要な特殊パラメータとしての使用レーザ線、強度、フィルタ構成（ＭＤＢ、ＮＦＴ、ＥＦ）、検出器の設定（増幅度、積分時間、ピンホールの位置および直径）および被検プレパラートの周辺条件／調製に関する付記事項も保存可能である。
【００４４】
ラムダスタックの一定時間に亘る記録では、様々な時点でのスペクトル特性を求め、シリーズデータとしてまとめておくことができる。続いて、これらのデータを、例えば図１３ｂのように３次元表示により明確化し、それより各ＲＯＩにおけるスペクトル特性の経時変化を求めることができる。このグラフはＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー伝達）またはＦＲＡＰ（フォトブリーチング後の蛍光回収）など２種またはそれ以上の蛍光色素による検査の結果評価にも併用でき有用である（図１３参照）。部分図ｂには蛍光信号（強度）が波長および時間の関数で描かれている。波長領域５３０ｎｍ〜５６０ｎｍでは信号は時間と共に増大するのが認められる。
図１３ａは、また別な表示形態によるものである。様々な時点における個別チャネルのスペクトルが描かれている。この場合の各部分図は、例えば１０ｎｍの波長領域を表わしている。
【００４５】
次に、分析用アルゴリズム、例えば試料から放射された総蛍光信号に対する個別色素の割合を選択的に表示するためのアルゴリズムについて記述する。分析は定量的または定性的に行うことができる。定量分析では画像点毎に、試料から放射された総蛍光信号に対する各個別色素の割合（即ち濃度）を計算する。例えば、成分分解分析のための一次関数式（文献：Ｌａｎｓｆｏｒｄその他著“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ”（「バイオメディカル光学ジャーナル」）第６巻（第３号）３１１〜３１８ページ、２００１年７月刊）が使用される。
【００４６】
分析にはいわゆる参照スペクトルが必要である。これは個別色素の蛍光スペクトルを表わすものである。結果の精度は参照スペクトルの精度に決定的な影響を受ける。従って、本発明に基づく方法では参照スペクトルの記録はプレパラートの検査中に同時に行う（下記参照）。各色素がそれぞれの割合で各画像チャネルに組み入れられる。その場合、各画像チャネルには特定色素が１つずつ割当てられる。色素の明度は組込割合によって決まってくる。続いて、個別画像チャネルを１画像にまとめ重ね合わせて表示することができる。そのようにして生じるのがカラーコード化された画像である（前出コード化ラムダ参照）。
【００４７】
定性分析では分類を行う。即ち、各画像点に、それぞれ試料から放射された総蛍光信号に対して最大の割合を占める色素だけを割当てる。その割当ては、やはり１画像内の様々な画像チャネルに対して行う。その場合、各画像チャネルに特定色素を一つずつ割当てることができる。それには、例えば主要成分分析（ＰＣＡ／文献：Ｉ．Ｔ．Ｊｏｌｉｆｆｅ著“Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ”（「主要成分分析」）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ社／ニューヨーク、１９８６年刊）などのアルゴリズムを使用する。この種のアルゴリズムによっていわゆる画像のマスキング（色素マスク）が得られる。その場合、同色領域には同一色素が存在する。
【００４８】
以下では、色素蛍光分離法の作業過程を説明する。
選択されたＲＯＩのスペクトル特性がそれぞれ、使用された試料内色素の正に１色素の放射信号だけを表わしている（参照信号）という場合では、放射信号の定量分析（例えばデジタル式成分分解５（図１４））に、この方法を使用すれば非常に有利になる（図９Ａ）。その場合の入力データは、基礎となるラムダスタックおよびｎ個の選択試料箇所（ＲＯＩ）のスペクトル特性である。尚、ｎは試料に使用した色素数である。定量分析（例えば、成分分解）の結果は、それぞれ１色素の放射信号情報しか含まないｎ個の個別チャネルからの画像である。
【００４９】
放射信号の定量分析（例えば、デジタル式成分分解）のための別な作業方法では、入力データとしてラムダスタックおよびスペクトルデータバンクに予め保存されている対応の参照スペクトルが使用される（図９Ｂ）。この参照スペクトルは、試料（または特定領域）にそれぞれ正に１蛍光色素だけでマーキングした実験（較正測定）の結果から取り出すことができる。この作業法は例えば、本来の実験では色素分布が圧倒的に局所に限定されていて、従ってどの色素についても、他からの放射によるスペクトル漏話のない純粋な放射信号を持った試料箇所が見出せない、即ちＲＯＩの書き込みができないという場合に必要である。
【００５０】
加えて、オペレータはラムダスタックの記録前にデータバンクから参照スペクトルを選択することもでき、その捕捉の間にラムダスタックの定量分析（例えば、デジタル式成分分解）を即時実施することができる。結果としてｎチャネルの画像がスクリーン上に表示される。この場合、ラムダスタック・データの集約的中間保存は省略できる。
【００５１】
図１１に図式化した別な方法では、定量分析されたデータファイル（カラーコード化された画像）および色素数に相当する参照スペクトルが、ラムダスタックに代わるデータ媒体に保存される。その長所は、データファイルの規模のものが信号情報の目立った損失もなく保存できることである。例えば、ラムダスタックが３２の個別チャネルにより、５１２×５１２の画素点および８ビットで検出される場合、画像スタックの大きさは約１６メガバイトである。カラーコード化された画像の保存によればデータファイルの大きさは３２ポイント縮小し、参照スペクトルを含めて約０.５メガバイトとなる。参照スペクトル内のデータポイントの数は色素数に３２を掛けた値である。
【００５２】
次に、保存データ（参照スペクトル）とカラーコード化した画像からコンピュータで改めてラムダスタックを算出することができる。この計算は、最も簡単な例では参照スペクトルとカラーコード化画像のそれぞれの画像チャネルとを掛け合わせることによって行う。データ削減は、特にいわゆる時系列記録の場合、正確には３次元画像情報による時系列記録の場合に必要である。
【００５３】
その経過図式が図９Ｃに描かれているさらに別な方法では、ラムダスタックからスタートして第１ステップでは定性分析が行われる。この分析によって、１つには、プレパラート内で同一色素が空間分布している領域を探し出すことができる。また一つには、続く定量分析に必要な参照スペクトルをオペレータの操作なしに自動的に生成させることができる。例えばＰＣＡなどの定性分析には、ラムダスタック以外に入力パラメータを追加する必要はない。そうして得た参照スペクトルとラムダスタックは、続いて、その結果がやはりカラーコード化された画像として現われる定量分析のための入力パラメータとして利用される。
【００５４】
図９Ｄに基づく別な方法では、ラムダスタックについて制限的な定性分析が行われる。制限的な定性分析では、オペレータが予め定義付けした、例えば色素データバンクに保存されているスペクトルしか対象にできない。
アルゴリズムは予備的に定義付けしたこれらの色素スペクトルから、スペクトル分解により測定された蛍光信号に最も適合している目的物（即ち色素）を探し出し、そのようにして参照スペクトルを改めて定義付けする。
【００５５】
そうして得た参照スペクトルとラムダスタックは、続いて、その結果がやはりカラーコード化された画像として現われる定量分析のための入力パラメータとして利用される。
放射率識別色素は、様々なバイオメディカル分野で、例えば細胞小室または細胞溶液内のイオン濃度、代謝基質濃度またはそれらの変化の測定に使用される。
【００５６】
特殊な結合パートナー（例えばＣａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｈ＋などの配位子）との可逆的相互作用により、この種色素（インド−１、ＳＮＡＲＦ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）の蛍光放射にスペクトルのシフトが起こる。所定時間に観察体積で測定された放射スペクトルについては、通例、所定体積における相対的割合が解離定数（ＫＤ）によって表わされ、色素、配位子間の親和性によっても特徴付けられている、２つの状態にある色素ＦＦ（遊離色素）およびＦＢ（結合配位子を持つ色素）（図１５Ａ）が関与している。このように、ＦＦとＦＢの蛍光比率は配位子濃度の尺度である。上記方法の適用目的は、上記装置およびオペレータの設定するＲＯＩにより、それぞれの結合状態ＦＦおよびＦＢに所属する放射スペクトル（図１５Ｂ）を検査対象生体系（生体内）で、または溶液中（試験管内）で測定することである。
【００５７】
イオン敏感性の放射率識別色素の場合では、これは無イオン条件または飽和条件の設定によって達成される。参照スペクトルは定性分析によっても求めることができる。その場合では、オペレータが色素成分数（記述の方法では図１５Aに従いＦＦおよびＦＢの２成分）を予備設定しておけば有利である。この参照スペクトルは、一ラムダスタックまたは定量分析（例えば、一次関数式の成分分解アルゴリズム）により様々な時点でまたは様々な試料平面で記録された一連のラムダスタックの画像点における蛍光放射に対する色素状態（ＦＦまたはＦＢ）の割合を計算するのに利用できる（図９）。
【００５８】
続いて、２種の画像チャネルに組み込まれた信号の画素単位での区分により、色素濃度に依存しない、配位子濃度Ｒの準一次関数的尺度（比率、図１０）、その空間分布および／または時間関数の動力学データが得られる。それぞれの放射率識別色素および既知の配位子濃度によって検証された試験管内または生体内の較正データを基に、Ｒの値から絶対濃度データを求めることができる（方程式の較正、滴定の較正）。
【００５９】
記述の方法に準じて、例えば下記のような２色素の配合を利用することもできる：
（１）同一の配位子と相互反応をする２色素
（２）放射重心に差はないが、配位子結合によってそれに変化が現われる２色素
（３）蛍光収量が、配位子結合に依存して互いに逆方向に変化する２色素（例えば、フルオ−３とフラレッド／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）
【００６０】
ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー伝達）とは、励起された蛍光団（供与体）の光子エネルギーが、他の蛍光団（受容体）へ放射なしに伝達されることである。その前提条件は、特に、供与体放射スペクトルと受容体励起スペクトルのオーバラッピングおよび供与体と受容体の緊密な空間会合である。バイオメディカル分野では、このＦＲＥＴ現象は、例えば、イオン濃度または代謝基質濃度（Ｃａ２＋、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ）あるいはそのほか配位子依存性の構造変化（例えば、タンパク質のフォスフォリル化状態、ＤＮＡの配座変化）の測定、追跡に利用される。
【００６１】
これは、ＦＲＥＴパートナーである供与体と受容体（例えば、合成フルオロクロムＦＩＴＣとローダミン、または遺伝学上コード化された蛍光タンパク質ＣＦＰとＹＦＰ）のカップリングによって、つまり観察対象イオン、代謝基質または配位子との特有な相互作用によって二次構造に変化の現われる分子（例：宮脇その他“Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ”（「アメリカ国立科学アカデミー議事録」第９６巻、２１３５〜２１４０ページ、図１７／１９９９年３月刊）への、あるいは永続的に、または周辺条件に依存して相互作用する２つの分子のそれぞれ１つへのカップリングによって行われる。
【００６２】
図１６は、ＦＲＥＴパートナーについてそれぞれ供与体と受容体間の距離が異なる場合の放射スペクトルを示している（Ａ：距離が大きくＦＲＥＴなし／Ｂ：距離が小さくＦＲＥＴ相互作用あり）。双方いずれの場合も、遊離ＦＲＥＴ系と配位子結合ＦＲＥＴ系の観察体積に占める割合の差は、ＦＲＥＴ系の蛍光放射におけるスペクトル差に関係している。供与体蛍光を優先的に励起する場合、配位子結合の増減は、両ＦＲＥＴパートナーの蛍光放射増幅における逆方向の変化として現われる（図１６）。
【００６３】
ここに記述した方法を、例えば上記ＦＲＥＴ測定に利用する目的は、試料をＦＲＥＴパートナーＦＬ１（供与体励起λ１）の最適励起付近の光で照射することにある。単一ラムダスタックまたはラムダスタック・シリーズ（ｚまたはｔ）形式の多チャネル検出器で捕捉されるスペクトル領域は、両ＦＲＥＴパートナーの放射領域を含んでいる（図１８（１Ａ））。ＲＯＩ（上記参照）の定義付けによってスペクトル特性の時間的状況を明らかにすることができる（図１８（１Ｂ））。
【００６４】
ラムダスタックとして記録された蛍光信号は、次に定量分析（例えば、一次関数的な成分分解分析）にかける（図１８（２））。それに必要な参照スペクトルは、先ずは例えばＦＲＥＴパートナーの一方しか含まない調製液中、つまり溶液中（生体内または試験管内）で励起波長（λ１、供与体励起）においてラムダスタックを記録し、ＲＯＩ関数を利用することによって求めることができる（上記および図９参照）。
【００６５】
定量分析の結果判明したチャネルにおけるＲＯＩの定義付けより、ＦＲＥＴパートナーの蛍光強度およびその経時変化をグラフに描くことが可能になる。定量分析（成分分解分析またはＰＣＡ）の結果判明した両画像チャネルの画素単位の区分から、その画素値が蛍光共鳴エネルギ伝達またはＦＲＥＴシステム／配位子相互反応の尺度になっていて（図１８（３））、適当な較正データ（滴定の較正など）を基に、例えば観察対象のイオン、代謝基質、配位子の各濃度の算出ができる画像を得ることができる。
【００６６】
上記方法の別な適用例として、それぞれの検査において対象から外れた、または分析の支障になる信号の分離に使用されることがある。そのような可能性のあるのは、例えば背景光、自己蛍光、後方散乱励起光または室内光の場合である。まずは、それ以上着色されない対照光線（自己蛍光、後方散乱励起光）の中で、あるいはプレパラート不在の光線（背景光、室内光）下でこの信号のスペクトル分布を求めれば、そうして得られたスペクトルも検査対象色素の参照スペクトルと同様、一次関数的成分分解分析に加えることができる（図９および１０）。それらは成分分解後に別々の画像チャネルに割り振られ、検査対象信号から分離されるので、検査対象信号は別途観察することができる。
【００６７】
λスタック：
検出チャネルで検出した光線を分散分割下で測定し、少なくとも１つの補助的（画像点）座標ｘ、ｙおよび／またはｚおよび／または測定時間ｔへ分類の上、記憶素子に保存した画像点毎のスペクトル分布
定量分析：
試料からの総信号（例えば、蛍光信号）に対する各スペクトル特性の持分（割合）を画像点毎に計算する（成分分解法）。この計算は、個々のスペクトル発光体（例えば、色素）のスペクトルを特徴付け、画像を生成する（ＲＯＩ）データバンクに保存されている、または定性分析（ＰＣＡ）により生成される参照スペクトルによって行われる。
画像チャネル：
試料の画像表示において色をそれぞれの選択スペクトル領域に振り分ける（擬似色表示）。その場合、例えば然るべきフィルタ使用のもと複数の検出チャネルで測定した色強度は、色素／スペクトル特性の割合に一致している。
試料領域に複数のスペクトル特性／色素が含まれていれば、複数色の画像表示が重なったカラーコード化画像（配合画像）が生成される。
定性分析：
試料からの総信号に対して最大の関与割合を持つスペクトル特性／色素を各画像点に振り当てる。
色素マスク：
異なった箇所のスペクトル特性／色素を別々の色で表示する。その場合、強度はそれぞれ均等にする。
ＲＯＩ：
オペレータによって選択、マーキングされた領域。その場合、同一のスペクトル特性／色素領域は定性分析により自動的に検索、マーキングできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】一光子吸収（ａ）、多重光子吸収（ｂ）
【図２】現状技術の共焦点レーザ走査型顕微鏡
【図３】色素の放射スペクトル（ａ）、色素ＣＦＰおよびシアンＦＰについて波長別の放射信号（ｂ）、放射信号の波長の関数（ｃ）
【図４】カルシウムイオンの濃度に依存するインド−１の放射スペクトル（ａ）、カルシウムイオン濃度に依存するフルオ−３とフラレッド色素との組み合わせの放射スペクトル
【図５】検出器ユニットの構成図
【図６】検出器ユニットを光学的ビーム光路として用いた場合の実施態様
【図７】検出器の個別チャネルに対する読出し装置の図式
【図８】ＬＳＭ画像内のＲＯＩの分布状態（ａ）、放射スペクトル（ｂ）
【図９】本発明方法の経過図式
【図１０】一次関数的成分分解分析の図式
【図１１】本発明の別の方法の図式
【図１２】ＲＯＩのスペクトル特性（ａ）、多チャネル画像（ｂ）
【図１３】スペクトル特性データの３次元表示（Ａ）、蛍光信号の波長および時間関数（Ｂ）
【図１４】装置パネル
【図１５】蛍光放射のスペクトルシフト（Ａ）、蛍光比率（Ｂ）
【図１６】供与体と受容体間の距離が異なる場合のＦＲＥＴパートナーの放射スペクトル、距離が大きくＦＲＥＴなし（Ａ）、距離が小さくＦＲＥＴ相互作用あり（Ｂ）
【図１７】ＦＲＥＴパートナーである供与体と受容体のカップリング
【図１８】ラムダスタックまたはラムダスタック・シリーズ形式の多チャネル検出器で捕捉されるスペクトル領域
【符号の説明】
ＥＦ ダイクロイック・ブロックフィルタ
ＰＭＴ 点像検出器
ＤＢＳ 副ビームスプリッタ
ＰＯ 結像レンズ系
ＰＨ 絞り（ピンホール）
ＤＩ 角分散素子
ＤＥ ライン検出器
Ｓ 放射信号
ＥＳ 電気信号
Ｌ 光
ＰＯ ピンホールレンズ系
Ｓ２ 結像鏡
Ｇ 線形格子
Ａ 第１増幅器
Ｉ 積分器
Ｋ 比較器
ＳＲ スイッチ・レジスタ
Ｖ 付属連結器
Ａ１ 増幅器
ＰＣ コンピュータ
４ チャネル抽出用操作素子
５ デジタル式成分分解
６ ハードウェア選択用操作素子
【発明が属する技術分野】
本発明は、蛍光顕微鏡法、特にレーザ走査型顕微鏡法、蛍光相関分光法および走査型近視野顕微鏡法における、主として生物学上の試料、プレパラートおよび付属する構成成分を検査するための方法に関するものである。
それに加え作用物質を検査するための蛍光検出に基づく方法（ハイ・スループット・スクリーニング）も含まれる。
【０００２】
少数の広域スペクトル色素帯の検出から完全なスペクトルの同時記録へと移行することにより、空間的部分構造または動力学的過程において、殆どが分析面または機能面からなされる試料特性の確認、分離、分類に関し新たな可能性が開けてくる。それにより、オーバーラップ部分を持つ蛍光スペクトルの場合では、多重蛍光団を含む試料の同時検査が、厚い試料の空間構造においても可能となる。
【０００３】
【従来の技術】
生物プレパラートを検査するための光学顕微鏡の古典的利用分野の１つに蛍光顕微鏡法（文献：Ｐａｗｌｅｙ「生物共焦点顕微鏡法ハンドブック」、プレーナム・プレス１９９５年）がある。この場合では特定の色素が細胞部分への特殊標識付けのために使用される。
色素分子は、入射した一定エネルギを持つ光子１個の吸収により光子基底状態から励起状態へ励起される。この励起は一般に一光子吸収と称される（図１ａ）。
【０００４】
色素分子は、このように励起された状態からさまざまな方法で基底状態に戻ることができる。蛍光顕微鏡法では蛍光光子の放射下での移行が最も重要である。放射される光子の波長はストークス変位のため励起放射に比較して原則的に赤側にずれる。すなわち長波長側である。ストークス変位が蛍光光線の励起光線からの分離を可能にする。
【０００５】
蛍光は、ブロックフィルタと組み合わせた適当なダイクロイック・ビームスプリッタによって励起放射から分離し別途観察する。そうすることによって、さまざまな色素で着色された個々の細胞部分の描写が可能である。しかし原則的には、プレパラートのいくつかの部分を、独特な堆積の仕方をするさまざまな色素で同時に着色することもできる（多重蛍光）。個々の色素から送出される蛍光信号を区別するために、ここでも特殊なダイクロイック・ビームスプリッタを使用する。
【０００６】
高いエネルギを持つ一光子による色素分子の励起（一光子吸収）のほかに、より小さいエネルギを持つ複数の光子による励起も可能である（図１ｂ）。この場合、個々の光子のエネルギ総和は高エネルギ光子の何倍にも相当する。この種の色素励起は多光子吸収と称される（文献：Ｃｏｒｌｅ、Ｋｉｎｏ「共焦点走査型光学顕微鏡法と関連画像システム」；アカデミック・プレス１９９６年）。しかし、色素放射はこの種の励起によっては影響されない。すなわち、多光子吸収の場合放射スペクトルは負のストークス・シフトを起すため、励起放射に比較するとその波長は短い。励起光線を放射光線から分離するのは一光子吸収の場合と同じ方法で行う。
【０００７】
以下に現状技術を共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）の例で説明する（図２）。
ＬＳＭは大きく分けて、光源、走査モジュール、検出ユニット、顕微鏡の４モジュールから成っている。これらのモジュールは以下により詳しく説明する。それに加え、ＤＥ１９７０２７５３Ａ１も参考になる。
【０００８】
プレパラート中にあるさまざまな色素の個別励起は、さまざまな波長のレーザをＬＳＭ内で使用する。励起波長の選択は検査対象色素の吸収特性に従って行う。励起光線は光源モジュール内で生成される。この場合さまざまなレーザ（アルゴン、アルゴン・クリプトン、TiSaレーザ）が使用の対象になる。そのほか、光源モジュールでは、波長の選択および必要な励起波長の強度調整を、たとえば音響光学結晶の使用により行う。
【０００９】
それに続き、レーザビームは、ファイバまたは適当なミラー装置を通じて走査モジュール内に導かれる。光源で生成されたレーザビームは、対物レンズを通り、回折の抑制下でスキャナ、走査レンズ系、円筒レンズを経由してプレパラート内へ集束される。スキャナにより試料をｘ−ｙ方向にドット走査する。試料走査における画素上の滞留時間は、多くの場合マイクロ秒未満ないし数秒の範囲とする。
【００１０】
蛍光の共焦点検出（デスキャン検出）の場合、焦平面（試料）からおよびその上下にある平面から放射された光は、スキャナを通じてダイクロイック・ビームスプリッタ（ＭＤＢ）に達する。ＭＤＢは蛍光を励起光から分離する。続いて蛍光は、正確に焦平面と共役な平面内にある絞り（共焦点絞り／ピンホール）で焦点を結ぶ。これによって焦点外の蛍光成分が遮断される。絞りの寸法をさまざまに変化させることによって、顕微鏡の光学分解能を調節することが可能である。絞りの後ろに別のダイクロイック・ブロックフィルタ（ＥＦ）があり、これが再度励起ビームを差し止める。蛍光は、ブロックフィルタを通過した後、点像検出器（ＰＭＴ）によって測定される。
【００１１】
多光子吸収を利用した場合、色素蛍光の励起は、励起強度が特に強い小ボリューム部分に起こる。この領域は、共焦点装置を使用した場合の検出領域より極僅かに大きいだけである。したがって共焦点絞りの使用を省くことができ、検出を対物レンズの直後で行うことができる（ノンデスキャン検出）。
多光子吸収によって励起される色素蛍光を検出するための別の装置では、さらにデスキャン検出が行われるが、この場合では対物レンズのひとみは検出ユニット内へ結像する（非共焦点デスキャン検出）。
【００１２】
３次元照明による像のうち、対応の一光子吸収もしくは多光子吸収と接続している２検出器の装置によって、対物レンズの焦平面内に存在する平面（光学的断面）のみが再現される。それに続いて、試料のさまざまな深さｚにおけるｘ−ｙ平面内のいくつかの光学的断面の描画により、コンピュータでサポートされた試料３次元像が生み出される。
したがって、ＬＳＭは厚いプレパラートを検査するのに適している。励起波長は使用色素の固有吸収特性で決定される。色素の放射特性に合わせたダイクロイックフィルタにより、それぞれの色素から送出される蛍光のみが確実に点像検出器で測定されることになる。
【００１３】
バイオメディカル分野においては、目下のところいくつかのさまざまな細胞領域がさまざまな色素で同時に標識付けされている（多重蛍光）。現状技術では、個々の色素はさまざまな吸収特性に基づき、または放射特性（スペクトル）に基づき別々に検出されている（図３ａ）。図３ａは各種典型的な色素の放射スペクトルを示している。放射信号は波長別に表わされている。ナンバー１から４の色素にはそれぞれ放射スペクトルの位置および形態に差のあることが認められる。それぞれ別個の検出には、複数色素の蛍光に対する追加分割を副ビームスプリッタ（ＤＢＳ）で行ない、個々の色素放射検出を別々の点像検出器（ＰＭＴｘ）内で行う。
【００１４】
図３ｂに描かれた各色素の放射スペクトルは強度に重なり合うこともあり、その場合では各色素の放射信号をＤＢＳで分離するのは困難である。しかし、それらの色素が異なった吸収特性を持っていれば、ＤＥ ＣＺ７３０２に記述されているようなマルチトラッキング法によりそれぞれを選択的に励起させることができる。図３ｂは、色素ＣＦＰおよびシアンＧＦＰについて波長別の放射信号を示したものである。その場合励起は４５８ｎｍおよび４８８ｎｍの２レーザ線によって行った。これらの色素は、検査試料への毒性作用がなく、生体プレパラートの検査には特に適している。両色素ＣＦＰ、ＧＦＴをできる限り効果的に検出するため、一走査方向においてＣＦＰを波長４５８ｎｍで励起して４６０〜５５０ｎｍの蛍光を検出し、スキャナの復路ではＧＦＰに対して波長４８８ｎｍで選択的励起を行なって、波長領域４９０〜６５０ｎｍで検出する。
【００１５】
使用色素の放射スペクトル位置が未知である場合、あるいは周辺条件（試料内外の条件：温度、濃度、ｐＨ値）に依存して放射スペクトルに位置移動が起きる場合では（図３ｃ）、色素蛍光を効果的に検出するにも限界がある。図３ｃも同様に放射信号を波長の関数で描いたものである。波長シフトは数１０ｎｍに至ることもある。試料内の放射スペクトルの測定には、今日ではＬＳＭとの組み合わせの場合も含めて分光計が使用される。この目的には点像検出器の代わりに、殆どの場合高分解能を持つ従来型分光計が使用される（Dixon他の特許ＵＳ ５，１９２，９８０）。しかしこれらは放射スペクトルを点単位でのみ、あるいはある領域について平均的に記録するだけである。つまり、一種のスペクトル分析である。
【００１６】
蛍光顕微鏡法のまた別な適用例では、特に生物プレパラート中のイオン濃度（たとえばＣａ＋，Ｋ＋，Ｍｇ２＋，Ｚｎ＋，…）の測定に用いられている。それには、特別な色素や、またはイオン濃度に依存してスペクトルのずれる色素配合（たとえば、フラ、インド、フルオ；モレキュラー・プローブズ社）が使用される。
図４ａはカルシウムイオンの濃度に依存するインド−１の放射スペクトルを示している。
図４ｂはフルオ−３とフラレッド色素との組み合わせの場合で、カルシウムイオン濃度に依存する放射スペクトルの例を示している。
これらの特殊色素は放射率識別色素と称される。図４ａに示した２つの蛍光領域を検出して、両強度の比率を出すと、対応のイオン濃度を導き出すことができる。多くの場合この測定によって生プレパラート中のイオン濃度の動的変化が分析されるが、それには１ミリ秒以内の時間分割が要求される。
【００１７】
多重蛍光記録で障害になる望ましくない現象は、背景信号の重なりである。それは、個別レーザの試料からの反射であったり、または試料構成部分から発する広帯幅の自己蛍光信号の場合もあるが、それらは検査対象である蛍光標識付け試料箇所のスペクトル特性に覆い被さって、そのため検査を困難にしているばかりか一部では阻止している。
【００１８】
細胞およびその他粒子の検査および分類に流動細胞計量計が用いられる。その場合、細胞を液体に溶かし、毛管を通じてポンピングする。細胞検査には側面からレーザ光線を照射してそれを毛管に集束させる。細胞は各種の色素またはバイオ分子で着色しておく。励起された蛍光および後方散乱励起光を測定する。現技術状況については、Ｍ．Ｒ．Ｍｅｌａｍｅｄ、Ｔ．Ｌｉｎｄｍｏ、Ｍ．Ｌ．Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ著“Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ”（「流動細胞の計量および分類」第２版、Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．社（ニューヨーク）出版、１９９０年刊、８１〜１０７ページ）に記述されている。
【００１９】
後方散乱信号から細胞の大きさが測定できる。個々の細胞の蛍光スペクトル特性から様々な細胞を分離／分類することが、または個別に計量することができる。細胞の分類は、静電界において様々な毛管の使用下で行う。その結果は、例えば色素Ａ着色の細胞数と色素Ｂ着色の細胞数がしばしば棒グラフで描かれ比較される。流動速度は、典型例では数１０〜１００ｃｍ／秒である。従って、高感度の検出が必要になる。検出量の制限のため、現状技術では共焦点検出が行われている。
流量測定の精度は様々なファクタに影響される。そのファクタとしては、例えば非特殊性蛍光、細胞の自己蛍光、光学系構成部の蛍光および使用検出器の雑音がある。
【００２０】
本発明の課題は、吸収特性および放射特性が極僅かしか違わず、しかも顕微鏡の画像形成システムで別々に測定および表示のできる色素の使用下で、フレキシブルに自由にプログラミングできる新しい検出方法を実現することである。個々の色素間の漏話は、本発明に基づく方法では確実に掌握され、データプロセッシングによって排除される。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
この方法は顕微鏡の画像形成システムにも分析システムにも適用できる。この顕微鏡システムというのは、２００ｎｍまでの光学分解能を持つ、生物プレパラートの３次元検査用レーザ走査型顕微鏡や、１０ｎｍまでの分解能を持つ、表面の高度分解検査のための走査型近視野顕微鏡などの画像形成システム、および分子濃度の定量測定や分子拡散の測定のための蛍光相関性顕微鏡のことである。さらに、蛍光検出をベースとする色素検査法および流動細胞計量測定法も含まれる。
上記システムではすべて、プレパラートの特殊標識化に蛍光色素が使用される。上記の課題は、独立した請求項に基づく方法および装置によって解消される。その他の好ましい実施態様は従属請求項の対象である。
【００２２】
本発明に基づく方法により、同時使用可能な色素記号数を増やすことができる。それにより、例えば同時検査可能な細胞特性数を増やすことが可能になる。個々の色素間でスペクトル特性が強度にオーバラップする場合、個別色素の蛍光信号を別々に検出するためには現状技術レベルでは波長領域を制限しなければならず、そのため検出感度が低下する。即ち、増幅度を高めて使用するので、検出器の雑音が大きくなる。しかし本発明に基づく方法ではこれが防止でき、その上、非特殊性蛍光信号、自己蛍光および測定装置の蛍光をそれぞれ分別することができる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
本発明に基づく方法の背景には、スペクトル分割された蛍光検出がある。その場合では放射光が、走査モジュール内または顕微鏡内（多光子吸収の場合）でメインカラースプリッタ（ＭＤＢ）、あるいは７３４６ＤＥまたは７３２３ＤＥに基づくＡＯＴＦ（音響光学フィルタ）など励起光線を被検出光線から分離するための素子によって、励起光から分割される。透過光装置の場合ではこの種の素子は完全に省くこともできる。
【００２４】
それに続いて配置されている検出器ユニットの構成図を図５に示してある。試料から出た光は、共焦点検出の場合では結像レンズ系ＰＯ、さらには絞り（ピンホール）ＰＨを通って焦点を結び、それによって焦点外に生じる蛍光が遮断される。ノンデスキャン検出の場合には絞りは不要である。この場合では光は角分散素子ＤＩによってそのスペクトル成分へ分解される。角分散素子としてはプリズム、格子および音響光学素子が使用される。分散素子によってそのスペクトル成分へ分割された光は、続いてライン検出器ＤＥ上へ結像される。つまり、このライン検出器ＤＥは波長に依存する放射信号Ｓを測定し、これを電気信号ＥＳへ変換する。加えて、検出ユニットには励起波長を抑制するための線型フィルタを直列接続することもできる。
【００２５】
図５にブロック接続図で示した検出器ユニットを光学的ビーム光路として用いた場合の考え得る実施態様を図６に示している。本構造は本質的にはサーニー・ターナー構造に基づくものである。共焦点検出の場合、試料からの光Ｌはピンホールレンズ系ＰＯにより共焦点絞りＰＨを通され集束する。ノンデスキャン検出で多光子吸収の場合には、この絞りは不要である。第１の結像鏡Ｓ２は蛍光を視準する。続いて光は線形格子Ｇ、たとえばミリ当たり線数６５１本を有する格子上に当たる。格子は光をその波長に応じてさまざまな方向に偏向させる。
第２の結像鏡Ｓ１はスペクトル分割された個々の波長成分を、対応ライン検出器ＤＥのチャネル上へ集束させる。浜松製作所のＨ７２６０ライン２次電子増倍管を使用するのが特に好ましい。当検出器は３２チャネル型で高感度を有する。
【００２６】
上記実施態様の自由なスペクトル領域は約３５０ｎｍである。自由なスペクトル領域はこの装置ではライン検出器の３２チャネルに均等に配分されるので、光学的分解能は約１０ｎｍとなる。したがって、この装置は分光測定には限定的にしか適さない。しかし、これを結像システムに使用するのは有利である。これは、検出スペクトル帯域が相対的に広く、検出チャネルごとの信号がなお比較的大きいからである。自由なスペクトル領域の移動は、加えて、たとえば格子をＤＰだけねじることによっても行なえる。
【００２７】
上記の実施態様では、検出器ＤＥの各個別チャネルが検出する放射スペクトル幅は約１０ｎｍの帯域である。それにより、測定対象の各画像点毎に、当該画像点に存在する個別色素のスペクトル成分総和が記録される。加えて、ずっと後の方で記述しているスイッチレジスタＳＲを使ってオペレータが任意の個別チャネルを切換えることもできる。これは特に単一または複数の励起レーザ線の抑制には有効である。
【００２８】
図７には検出器ＤＥの個別チャネルに対する読出し装置が図式化されている。その場合、多チャネルＰＭＴの陽極に流れる電流は、それぞれ第１増幅器Ａ（電流／電圧変換器として接続）によって電圧に変換され増幅される。電圧は、信号を一定時間（例えば画素上滞留時間）の間積分する積分器Ｉに供給される。迅速に値を求めるため、積分器Ｉの後に、単純な比較器として次のようなスイッチング閾値を有する比較器Ｋを、即ち閾値を越えたときにデジタル出力信号を発するか、またはウィンドウ比較器として形成されていて、入力信号がスイッチング閾値の上限と下限との間にあるか、または入力信号がスイッチング閾値の外（下または上）にあれば、デジタル出力信号を発するという比較器Ｋを配置させることができる。
【００２９】
比較器もしくはウィンドウ比較器の配置は、積分器の前にすることも後にすることもできる。積分器なしの接続装置（いわゆる増幅モード）も同様に考え得る。増幅器モードでの配置の場合、比較器Ｋは然るべき基準に適合させて設置する。比較器Ｋの出力は直接アクティブなチャネルに接続する（オンライン）スイッチ・レジスタＳＲの制御信号として用いられるか、またはアクティブなチャネルを個別選択するために（オフライン）、その時の状態が付属連結器Ｖを通じてコンピュータに伝えられる。スイッチ・レジスタＳＲの出力信号は後続のＡ／Ｄ変換のため、レベル適合用の別な増幅器Ａ１へ直接導かれる。
【００３０】
ＡＤ変換された値、即ち試料の各画像点で測定されたスペクトル分解蛍光信号は、データ加工のために適当なデータ伝送装置を通じてコンピュータ（ＰＣまたはデジタル信号プロセッサＤＳＰ）へ伝送される。続いて、走査モード如何では、スペクトル分解による個々の測定画像点から、付属座標ｘ、ｙ、ｚ、時間および寿命を用いたラムダスタック（検出光線の分散、分割機能を持つ検出チャネルにより測定し、少なくとも一つの付属（画像）座標ｘ、ｙおよび／またはｚおよび／または測定時間ｔによって分類の上、記憶素子へ保存した画像点毎のスペクトル分布）が形成される。
【００３１】
但し、
・ ＸおよびＹはＳＣによって走査する。
・ Ｚは、例えばプレパラートを光学軸に沿って移動させることによって実現する。
・ 時間：種々の時間にデータ記録を行う。
・ 寿命：データ記録は蛍光寿命の間に時間分割して行う。
【００３２】
蛍光測定の場合ではアーチファクトの回避のため、試料から後方散乱した励起光を抑制することや、あるいは少なくともそれが放射最大値以下か同程度になるまで弱めることは有効である。それには、上記の付属光線フィルタまたは光学強度を弱めるために最適化された然るべきメインカラースプリッタ（ＭＤＢ）が使用できる。
【００３３】
励起レーザ光線のスペクトル幅は個別チャネルで検出される帯域幅よりはるかに小さいので、後方散乱または反射した励起光線については、図７に描かれたＳＲにより対応の個別チャネルを特定して遮断することもできる。励起波長が２つの検出チャネルに及ぶ場合、格子角度を捻るか、走査検出器を移動させるかまたは図６のＳ１またはＳ２を傾斜させることにより、励起光線が１つの検出チャネルだけに入るように励起光線を移動させることができる。
上記の両装置構成では、個別チャネルの検出には主として積分器接続装置を使用した。それにより、個別チャネル内の光子の計数および光子数の加算も制限なく行える。
【００３４】
以下では試料情報、即ちラムダスタックの様々な表示法について述べる。
上記方法で記録されたラムダスタックの最も簡易な形態は、隣接する非常に狭い波長領域からの蛍光強度の値を含んだｘ−ｙ画像の積層である。このラムダスタックの記録とｚ積層または／および時間列とを組合せれば複雑なデータが得られる。
【００３５】
これらの観察者用データの処理は以下のように様々な方法で行われる：
ａ）ラムダ最大値の投射
ラムダスタックからグレー階調画像を生成する。それには、各画素のｘ、ｙポジション毎にその波長領域について、投射画像の当該画素明度を定義付けする強度最大値を求める。
ｂ）コード化ラムダの投射
この場合もａ）と同様に投射されたラムダ最大値を算出し、各画素に対して、ラムダスタックの明度最高画素を生む波長領域の平均波長に相当する色素を付与する。
ｃ）簡易ラムダスタック（ｘｙλ）表示画面の観察
ここではラムダスタックの個別画像を少なくとも一部はシリーズで表示する。その場合、個々の画像毎に、強度が記録されている領域の平均波長を付記表示することもできる。
ｄ）より複雑なラムダスタック（ｘｙλ）表示画面の観察
ｘｙラムダスタックをｚまたは／および時間の関数で記録する場合、画面内にそれぞれシリーズ形式でｚ平面または時点を表示させるにはスライダを使用することができる。別な形式では、スペクトルの異なる画像を横列に、時間またはｚ平面の異なる画像を縦列に表示することにより、記録されたｘｙ画像をすべて同時に表示することができる。
次の観察画面間で選択することができる：ｘｙ−λ、ｘｙ−ｚ、ｘｙ−ｔ、ｘｙ−λ−ｚ、ｘｙ−λ−ｔ、ｘｙ−ｚ−ｔ。尚、挙げていない次元はスライダによって開けることができる。
ラムダ最大値またはコード化ラムダの投射と横列および縦列の表示画面観察との組合せにより、ｘｙ−ｚ−ｔ−λ情報の同時表示が可能になる。
ｅ）ラムダスタックの直交切断
これは、自由にポジショニングできる水平標識線と垂直標識線をそれぞれ一つずつ持つラムダスタックの選択λ平面を示している。ラムダスタックがこれらの線によって切断され、生じた切断像がλ平面の横（ｙ切断面）およびλ平面の上（ｘ切断面）に投射される。擬似／真正色素のコード化は自由選択により実施できる。画像内の個別色素成分の重なりによって、色に忠実な試料像が作られる。
【００３６】
参照スペクトルは、例えば純流動状態にある、即ち溶剤に溶かされた、または検査試料の不連続個別領域で結合している個々の色素の放射スペクトルである。
【００３７】
参照スペクトル生成のための領域選択は、以下の方法によって行うことができる。
ラムダスタックは各画素毎のスペクトル情報を補足資料として含んでいる。
図８ａは、例えば、様々に着色された細胞領域を表わす、ＬＳＭ画像内におけるそれぞれのＲＯＩ（ＲＯＩ １〜４）の分布状態を図示したものである。
図８ｂには放射スペクトル１から４の典型例がそれぞれ対応の励起波長（Ｌ１〜Ｌ４）と共に描かれている。
【００３８】
ＲＯＩに対する調整についてはオペレータは、例えば次のように行うことができる：個別ＲＯＩ内の色素励起に要するすべての、または殆どの励起光線を使用してスペクトル走査を実行および記録し、それに基づき個別励起レーザ光線の間にそれぞれの総合チャネル枠を設けることが可能である（図７ｂに表示されている通り、Ｌ１〜Ｌ２、Ｌ２〜Ｌ３、Ｌ３〜Ｌ４およびＬ４〜最大放射波長）。これらの総合チャネルは個別色素の蛍光帯域部分に相当する。また、同一総合チャネル内で様々な色素が強力に重なり合っているので、それらの信号の同時合算も行なわれる。これらの総合チャネルは、続いて、カラーコード化により様々な画像チャネルに分解され、相互に重畳表示される。
【００３９】
画像チャネルにおける様々な局部的色素混合により、オペレータまたは自動模様識別器は、それぞれのＲＯＩの位置設定が可能になり、例えば個別ＲＯＩにおいて最も強く現われる色素に基づいて、それぞれの加算調整に対する定義付けができる。
様々なＲＯＩに対する第２調整法では蛍光重心ＣＺ ７４４７の測定が行われる。その場合、検出器内では励起レーザ光線で照射されるすべての個別チャネルのスイッチが遮断される。各ＲＯＩは、使用されるそれぞれの色素の放射特性に変化が現われるため特徴的な蛍光重心を有している。従って、それぞれのＲＯＩは特徴的な色素重心の位置によって区別し、明確に分離することができる。
【００４０】
任意に選択した試料箇所のスペクトル特性を明確化するために、オペレータはＲＯＩ関数を使用することができる（ＲＯＩ：対象領域、図１４参照）。その場合、図２で記録された試料領域ＲＯＩ １およびＲＯＩ ２（図１４）が描画用具３（例えば、多角形、楕円形または閉じた弧形）によってマーキングされ、当該スペクトル特性がラムダスタックの各λ平面毎にＲＯＩに含まれるｘ−ｙ画素の平均値に基づきグラフ表示される（グラフ１）。
原則的には、選択した様々な試料箇所の複数スペクトル特性を、共通の、または別々のグラフ１に同時に描出することができる。
【００４１】
視覚的に具象化されたスペクトル特性１により、選択試料箇所における蛍光放射線のスペクトル分布が解明される。
様々なＲＯＩの複数スペクトル特性を描出することによって、例えば使用色素の放射スペクトルが大きく重なり合っているかどうかを究明することができる。
様々なＲＯＩのスペクトル特性は、図１２に示されているように、カラーコード化された多チャネル画像（「チャネル抽出」用操作素子４、（図１４）の生成に利用できる。
【００４２】
そのような多チャネル画像（図１２ｂ）の生成では、スペクトル特性から波長領域ＲＯＩ １〜５（図１２ａ）を選択し、例えば、当該波長領域における各画像点の総和または平均値から当該平面におけるラムダスタックの強度レベルを求めることができる。但しここでは、各画像チャネルは１色素を表わしている（チャネル１〜チャネル５）。
この操作は、加えて個別チャネルの電子総和（図７参照）を求めるのにも利用できる（「ハードウェア選択」６、（図１４）。続いて、然るべき調整のなされた多チャネル画像を直接走査することができる。
【００４３】
後に再利用する時のために、個別ＲＯＩの、即ち特殊環境下での個別色素のスペクトル特性をスペクトルデータバンク７（図１４）に保存することができる。その場合、グラフデータに加えて、ラムダスタックの記録に必要な特殊パラメータとしての使用レーザ線、強度、フィルタ構成（ＭＤＢ、ＮＦＴ、ＥＦ）、検出器の設定（増幅度、積分時間、ピンホールの位置および直径）および被検プレパラートの周辺条件／調製に関する付記事項も保存可能である。
【００４４】
ラムダスタックの一定時間に亘る記録では、様々な時点でのスペクトル特性を求め、シリーズデータとしてまとめておくことができる。続いて、これらのデータを、例えば図１３ｂのように３次元表示により明確化し、それより各ＲＯＩにおけるスペクトル特性の経時変化を求めることができる。このグラフはＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー伝達）またはＦＲＡＰ（フォトブリーチング後の蛍光回収）など２種またはそれ以上の蛍光色素による検査の結果評価にも併用でき有用である（図１３参照）。部分図ｂには蛍光信号（強度）が波長および時間の関数で描かれている。波長領域５３０ｎｍ〜５６０ｎｍでは信号は時間と共に増大するのが認められる。
図１３ａは、また別な表示形態によるものである。様々な時点における個別チャネルのスペクトルが描かれている。この場合の各部分図は、例えば１０ｎｍの波長領域を表わしている。
【００４５】
次に、分析用アルゴリズム、例えば試料から放射された総蛍光信号に対する個別色素の割合を選択的に表示するためのアルゴリズムについて記述する。分析は定量的または定性的に行うことができる。定量分析では画像点毎に、試料から放射された総蛍光信号に対する各個別色素の割合（即ち濃度）を計算する。例えば、成分分解分析のための一次関数式（文献：Ｌａｎｓｆｏｒｄその他著“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ”（「バイオメディカル光学ジャーナル」）第６巻（第３号）３１１〜３１８ページ、２００１年７月刊）が使用される。
【００４６】
分析にはいわゆる参照スペクトルが必要である。これは個別色素の蛍光スペクトルを表わすものである。結果の精度は参照スペクトルの精度に決定的な影響を受ける。従って、本発明に基づく方法では参照スペクトルの記録はプレパラートの検査中に同時に行う（下記参照）。各色素がそれぞれの割合で各画像チャネルに組み入れられる。その場合、各画像チャネルには特定色素が１つずつ割当てられる。色素の明度は組込割合によって決まってくる。続いて、個別画像チャネルを１画像にまとめ重ね合わせて表示することができる。そのようにして生じるのがカラーコード化された画像である（前出コード化ラムダ参照）。
【００４７】
定性分析では分類を行う。即ち、各画像点に、それぞれ試料から放射された総蛍光信号に対して最大の割合を占める色素だけを割当てる。その割当ては、やはり１画像内の様々な画像チャネルに対して行う。その場合、各画像チャネルに特定色素を一つずつ割当てることができる。それには、例えば主要成分分析（ＰＣＡ／文献：Ｉ．Ｔ．Ｊｏｌｉｆｆｅ著“Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ”（「主要成分分析」）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ社／ニューヨーク、１９８６年刊）などのアルゴリズムを使用する。この種のアルゴリズムによっていわゆる画像のマスキング（色素マスク）が得られる。その場合、同色領域には同一色素が存在する。
【００４８】
以下では、色素蛍光分離法の作業過程を説明する。
選択されたＲＯＩのスペクトル特性がそれぞれ、使用された試料内色素の正に１色素の放射信号だけを表わしている（参照信号）という場合では、放射信号の定量分析（例えばデジタル式成分分解５（図１４））に、この方法を使用すれば非常に有利になる（図９Ａ）。その場合の入力データは、基礎となるラムダスタックおよびｎ個の選択試料箇所（ＲＯＩ）のスペクトル特性である。尚、ｎは試料に使用した色素数である。定量分析（例えば、成分分解）の結果は、それぞれ１色素の放射信号情報しか含まないｎ個の個別チャネルからの画像である。
【００４９】
放射信号の定量分析（例えば、デジタル式成分分解）のための別な作業方法では、入力データとしてラムダスタックおよびスペクトルデータバンクに予め保存されている対応の参照スペクトルが使用される（図９Ｂ）。この参照スペクトルは、試料（または特定領域）にそれぞれ正に１蛍光色素だけでマーキングした実験（較正測定）の結果から取り出すことができる。この作業法は例えば、本来の実験では色素分布が圧倒的に局所に限定されていて、従ってどの色素についても、他からの放射によるスペクトル漏話のない純粋な放射信号を持った試料箇所が見出せない、即ちＲＯＩの書き込みができないという場合に必要である。
【００５０】
加えて、オペレータはラムダスタックの記録前にデータバンクから参照スペクトルを選択することもでき、その捕捉の間にラムダスタックの定量分析（例えば、デジタル式成分分解）を即時実施することができる。結果としてｎチャネルの画像がスクリーン上に表示される。この場合、ラムダスタック・データの集約的中間保存は省略できる。
【００５１】
図１１に図式化した別な方法では、定量分析されたデータファイル（カラーコード化された画像）および色素数に相当する参照スペクトルが、ラムダスタックに代わるデータ媒体に保存される。その長所は、データファイルの規模のものが信号情報の目立った損失もなく保存できることである。例えば、ラムダスタックが３２の個別チャネルにより、５１２×５１２の画素点および８ビットで検出される場合、画像スタックの大きさは約１６メガバイトである。カラーコード化された画像の保存によればデータファイルの大きさは３２ポイント縮小し、参照スペクトルを含めて約０.５メガバイトとなる。参照スペクトル内のデータポイントの数は色素数に３２を掛けた値である。
【００５２】
次に、保存データ（参照スペクトル）とカラーコード化した画像からコンピュータで改めてラムダスタックを算出することができる。この計算は、最も簡単な例では参照スペクトルとカラーコード化画像のそれぞれの画像チャネルとを掛け合わせることによって行う。データ削減は、特にいわゆる時系列記録の場合、正確には３次元画像情報による時系列記録の場合に必要である。
【００５３】
その経過図式が図９Ｃに描かれているさらに別な方法では、ラムダスタックからスタートして第１ステップでは定性分析が行われる。この分析によって、１つには、プレパラート内で同一色素が空間分布している領域を探し出すことができる。また一つには、続く定量分析に必要な参照スペクトルをオペレータの操作なしに自動的に生成させることができる。例えばＰＣＡなどの定性分析には、ラムダスタック以外に入力パラメータを追加する必要はない。そうして得た参照スペクトルとラムダスタックは、続いて、その結果がやはりカラーコード化された画像として現われる定量分析のための入力パラメータとして利用される。
【００５４】
図９Ｄに基づく別な方法では、ラムダスタックについて制限的な定性分析が行われる。制限的な定性分析では、オペレータが予め定義付けした、例えば色素データバンクに保存されているスペクトルしか対象にできない。
アルゴリズムは予備的に定義付けしたこれらの色素スペクトルから、スペクトル分解により測定された蛍光信号に最も適合している目的物（即ち色素）を探し出し、そのようにして参照スペクトルを改めて定義付けする。
【００５５】
そうして得た参照スペクトルとラムダスタックは、続いて、その結果がやはりカラーコード化された画像として現われる定量分析のための入力パラメータとして利用される。
放射率識別色素は、様々なバイオメディカル分野で、例えば細胞小室または細胞溶液内のイオン濃度、代謝基質濃度またはそれらの変化の測定に使用される。
【００５６】
特殊な結合パートナー（例えばＣａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｈ＋などの配位子）との可逆的相互作用により、この種色素（インド−１、ＳＮＡＲＦ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）の蛍光放射にスペクトルのシフトが起こる。所定時間に観察体積で測定された放射スペクトルについては、通例、所定体積における相対的割合が解離定数（ＫＤ）によって表わされ、色素、配位子間の親和性によっても特徴付けられている、２つの状態にある色素ＦＦ（遊離色素）およびＦＢ（結合配位子を持つ色素）（図１５Ａ）が関与している。このように、ＦＦとＦＢの蛍光比率は配位子濃度の尺度である。上記方法の適用目的は、上記装置およびオペレータの設定するＲＯＩにより、それぞれの結合状態ＦＦおよびＦＢに所属する放射スペクトル（図１５Ｂ）を検査対象生体系（生体内）で、または溶液中（試験管内）で測定することである。
【００５７】
イオン敏感性の放射率識別色素の場合では、これは無イオン条件または飽和条件の設定によって達成される。参照スペクトルは定性分析によっても求めることができる。その場合では、オペレータが色素成分数（記述の方法では図１５Aに従いＦＦおよびＦＢの２成分）を予備設定しておけば有利である。この参照スペクトルは、一ラムダスタックまたは定量分析（例えば、一次関数式の成分分解アルゴリズム）により様々な時点でまたは様々な試料平面で記録された一連のラムダスタックの画像点における蛍光放射に対する色素状態（ＦＦまたはＦＢ）の割合を計算するのに利用できる（図９）。
【００５８】
続いて、２種の画像チャネルに組み込まれた信号の画素単位での区分により、色素濃度に依存しない、配位子濃度Ｒの準一次関数的尺度（比率、図１０）、その空間分布および／または時間関数の動力学データが得られる。それぞれの放射率識別色素および既知の配位子濃度によって検証された試験管内または生体内の較正データを基に、Ｒの値から絶対濃度データを求めることができる（方程式の較正、滴定の較正）。
【００５９】
記述の方法に準じて、例えば下記のような２色素の配合を利用することもできる：
（１）同一の配位子と相互反応をする２色素
（２）放射重心に差はないが、配位子結合によってそれに変化が現われる２色素
（３）蛍光収量が、配位子結合に依存して互いに逆方向に変化する２色素（例えば、フルオ−３とフラレッド／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）
【００６０】
ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー伝達）とは、励起された蛍光団（供与体）の光子エネルギーが、他の蛍光団（受容体）へ放射なしに伝達されることである。その前提条件は、特に、供与体放射スペクトルと受容体励起スペクトルのオーバラッピングおよび供与体と受容体の緊密な空間会合である。バイオメディカル分野では、このＦＲＥＴ現象は、例えば、イオン濃度または代謝基質濃度（Ｃａ２＋、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ）あるいはそのほか配位子依存性の構造変化（例えば、タンパク質のフォスフォリル化状態、ＤＮＡの配座変化）の測定、追跡に利用される。
【００６１】
これは、ＦＲＥＴパートナーである供与体と受容体（例えば、合成フルオロクロムＦＩＴＣとローダミン、または遺伝学上コード化された蛍光タンパク質ＣＦＰとＹＦＰ）のカップリングによって、つまり観察対象イオン、代謝基質または配位子との特有な相互作用によって二次構造に変化の現われる分子（例：宮脇その他“Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ”（「アメリカ国立科学アカデミー議事録」第９６巻、２１３５〜２１４０ページ、図１７／１９９９年３月刊）への、あるいは永続的に、または周辺条件に依存して相互作用する２つの分子のそれぞれ１つへのカップリングによって行われる。
【００６２】
図１６は、ＦＲＥＴパートナーについてそれぞれ供与体と受容体間の距離が異なる場合の放射スペクトルを示している（Ａ：距離が大きくＦＲＥＴなし／Ｂ：距離が小さくＦＲＥＴ相互作用あり）。双方いずれの場合も、遊離ＦＲＥＴ系と配位子結合ＦＲＥＴ系の観察体積に占める割合の差は、ＦＲＥＴ系の蛍光放射におけるスペクトル差に関係している。供与体蛍光を優先的に励起する場合、配位子結合の増減は、両ＦＲＥＴパートナーの蛍光放射増幅における逆方向の変化として現われる（図１６）。
【００６３】
ここに記述した方法を、例えば上記ＦＲＥＴ測定に利用する目的は、試料をＦＲＥＴパートナーＦＬ１（供与体励起λ１）の最適励起付近の光で照射することにある。単一ラムダスタックまたはラムダスタック・シリーズ（ｚまたはｔ）形式の多チャネル検出器で捕捉されるスペクトル領域は、両ＦＲＥＴパートナーの放射領域を含んでいる（図１８（１Ａ））。ＲＯＩ（上記参照）の定義付けによってスペクトル特性の時間的状況を明らかにすることができる（図１８（１Ｂ））。
【００６４】
ラムダスタックとして記録された蛍光信号は、次に定量分析（例えば、一次関数的な成分分解分析）にかける（図１８（２））。それに必要な参照スペクトルは、先ずは例えばＦＲＥＴパートナーの一方しか含まない調製液中、つまり溶液中（生体内または試験管内）で励起波長（λ１、供与体励起）においてラムダスタックを記録し、ＲＯＩ関数を利用することによって求めることができる（上記および図９参照）。
【００６５】
定量分析の結果判明したチャネルにおけるＲＯＩの定義付けより、ＦＲＥＴパートナーの蛍光強度およびその経時変化をグラフに描くことが可能になる。定量分析（成分分解分析またはＰＣＡ）の結果判明した両画像チャネルの画素単位の区分から、その画素値が蛍光共鳴エネルギ伝達またはＦＲＥＴシステム／配位子相互反応の尺度になっていて（図１８（３））、適当な較正データ（滴定の較正など）を基に、例えば観察対象のイオン、代謝基質、配位子の各濃度の算出ができる画像を得ることができる。
【００６６】
上記方法の別な適用例として、それぞれの検査において対象から外れた、または分析の支障になる信号の分離に使用されることがある。そのような可能性のあるのは、例えば背景光、自己蛍光、後方散乱励起光または室内光の場合である。まずは、それ以上着色されない対照光線（自己蛍光、後方散乱励起光）の中で、あるいはプレパラート不在の光線（背景光、室内光）下でこの信号のスペクトル分布を求めれば、そうして得られたスペクトルも検査対象色素の参照スペクトルと同様、一次関数的成分分解分析に加えることができる（図９および１０）。それらは成分分解後に別々の画像チャネルに割り振られ、検査対象信号から分離されるので、検査対象信号は別途観察することができる。
【００６７】
λスタック：
検出チャネルで検出した光線を分散分割下で測定し、少なくとも１つの補助的（画像点）座標ｘ、ｙおよび／またはｚおよび／または測定時間ｔへ分類の上、記憶素子に保存した画像点毎のスペクトル分布
定量分析：
試料からの総信号（例えば、蛍光信号）に対する各スペクトル特性の持分（割合）を画像点毎に計算する（成分分解法）。この計算は、個々のスペクトル発光体（例えば、色素）のスペクトルを特徴付け、画像を生成する（ＲＯＩ）データバンクに保存されている、または定性分析（ＰＣＡ）により生成される参照スペクトルによって行われる。
画像チャネル：
試料の画像表示において色をそれぞれの選択スペクトル領域に振り分ける（擬似色表示）。その場合、例えば然るべきフィルタ使用のもと複数の検出チャネルで測定した色強度は、色素／スペクトル特性の割合に一致している。
試料領域に複数のスペクトル特性／色素が含まれていれば、複数色の画像表示が重なったカラーコード化画像（配合画像）が生成される。
定性分析：
試料からの総信号に対して最大の関与割合を持つスペクトル特性／色素を各画像点に振り当てる。
色素マスク：
異なった箇所のスペクトル特性／色素を別々の色で表示する。その場合、強度はそれぞれ均等にする。
ＲＯＩ：
オペレータによって選択、マーキングされた領域。その場合、同一のスペクトル特性／色素領域は定性分析により自動的に検索、マーキングできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】一光子吸収（ａ）、多重光子吸収（ｂ）
【図２】現状技術の共焦点レーザ走査型顕微鏡
【図３】色素の放射スペクトル（ａ）、色素ＣＦＰおよびシアンＦＰについて波長別の放射信号（ｂ）、放射信号の波長の関数（ｃ）
【図４】カルシウムイオンの濃度に依存するインド−１の放射スペクトル（ａ）、カルシウムイオン濃度に依存するフルオ−３とフラレッド色素との組み合わせの放射スペクトル
【図５】検出器ユニットの構成図
【図６】検出器ユニットを光学的ビーム光路として用いた場合の実施態様
【図７】検出器の個別チャネルに対する読出し装置の図式
【図８】ＬＳＭ画像内のＲＯＩの分布状態（ａ）、放射スペクトル（ｂ）
【図９】本発明方法の経過図式
【図１０】一次関数的成分分解分析の図式
【図１１】本発明の別の方法の図式
【図１２】ＲＯＩのスペクトル特性（ａ）、多チャネル画像（ｂ）
【図１３】スペクトル特性データの３次元表示（Ａ）、蛍光信号の波長および時間関数（Ｂ）
【図１４】装置パネル
【図１５】蛍光放射のスペクトルシフト（Ａ）、蛍光比率（Ｂ）
【図１６】供与体と受容体間の距離が異なる場合のＦＲＥＴパートナーの放射スペクトル、距離が大きくＦＲＥＴなし（Ａ）、距離が小さくＦＲＥＴ相互作用あり（Ｂ）
【図１７】ＦＲＥＴパートナーである供与体と受容体のカップリング
【図１８】ラムダスタックまたはラムダスタック・シリーズ形式の多チャネル検出器で捕捉されるスペクトル領域
【符号の説明】
ＥＦ ダイクロイック・ブロックフィルタ
ＰＭＴ 点像検出器
ＤＢＳ 副ビームスプリッタ
ＰＯ 結像レンズ系
ＰＨ 絞り（ピンホール）
ＤＩ 角分散素子
ＤＥ ライン検出器
Ｓ 放射信号
ＥＳ 電気信号
Ｌ 光
ＰＯ ピンホールレンズ系
Ｓ２ 結像鏡
Ｇ 線形格子
Ａ 第１増幅器
Ｉ 積分器
Ｋ 比較器
ＳＲ スイッチ・レジスタ
Ｖ 付属連結器
Ａ１ 増幅器
ＰＣ コンピュータ
４ チャネル抽出用操作素子
５ デジタル式成分分解
６ ハードウェア選択用操作素子
Claims (30)
- レーザ走査型顕微鏡、蛍光式検査装置または流動細胞計量計の操作によって、複数の試料点における試料からの放射光線をスペクトル分割する試料の検査方法において、
スペクトル分布を個別検出チャネルで測定し、その信号を位置座標ｘ、ｙまたはｚの少なくとも１つまたは測定時点ｔを持つ検出信号に割り振り保存することによってλスタックを形成し、
λスタックに基づき参照スペクトルを生成し、
試料から発せられる全信号に対する各色素の割合を、各画像点毎の参照スペクトルとの比較に基づいて決定および保存することを特徴とする試料の検査方法。 - レーザ走査型顕微鏡、蛍光式検査装置または流動細胞計量計の操作によって、複数の試料点における試料からの放射光線をスペクトル分割する試料の検査方法において、
スペクトル分布を個別検出チャネルで測定し、その信号を位置座標ｘ、ｙまたはｚの少なくとも１つまたは測定時点ｔを持つ検出信号に割り振り保存することによってλスタックを形成し、
各検出チャネルごとに、ＲＯＩに含まれる画像点の平均強度を決定する方法により各ＲＯＩのスペクトル特性を決定し、
該ＲＯＩのスペクトル特性に基づいて波長領域を選択し、
各画像チャネルが１波長領域に対応した多チャネル画像を生成し、
前記波長領域に対応するλスタック内平面の各画像点の強度を合計または平均することを特徴とする試料の検査方法。 - 色またはスペクトル領域に応じて配分された画像チャネルおよび色配分を基に擬似色画像を生成する請求項１あるいは２に記載の試料の検査方法。
- 入力手段により、または自動的に検査対象試料領域としてのＲＯＩがマーキングされる請求項２〜３のうちの１に記載の試料の検査方法。
- ＲＯＩを参照スペクトルの生成に利用する請求項２〜４のうちの１に記載の試料の検査方法。
- 試料領域内に複数の色素が含まれている場合に、複数の画像チャネルを重ね合わすことによりカラーコード化された画像を生成する請求項１〜５のうちの１に記載の試料の検査方法。
- 入力手段により対象試料領域としてＲＯＩをマーキングし、それより参照スペクトルを形成し、その参照スペクトルに基づき定量分析することによってカラーコード化された画像を生成する請求項２〜６のうちの１に記載の試料の検査方法。
- 入力手段により対象試料領域としてＲＯＩをマーキングし、データバンク保存の参照スペクトルを用いて定量分析を行う請求項２〜７のうちの１に記載の試料の検査方法。
- 定量分析を行う上に、参照スペクトルの形成および保存に利用するためのＲＯＩとして対象試料領域を形成する請求項２〜８のうちの１に記載の試料の検査方法。
- 色素データバンクに基づいて定量分析および表示される色素の選択のための入力手段を備える請求項１〜９のうちの１に記載の試料の検査方法。
- 色素データバンクがマーキングされたＲＯＩで生成される請求項１０に記載の試料の検査方法。
- 複数の画像チャネルの重なりによって生じるカラーコード化画像から、イオン濃度測定のためにスペクトル成分の比率を求める請求項６〜１１のうちの１に記載の試料の検査方法。
- 自己蛍光、反射または不特定の蛍光など、好ましくない信号に相当する画像チャネルまたは検出チャネルが切断される請求項１〜１２のうちの１に記載の試料の検査方法。
- 保存されたカラーコード化画像および参照スペクトルから、個別検出チャネルにより測定されたスペクトル分布に相当するλスタックを算出する請求項６〜１３のうちの１に記載の試料の検査方法。
- このλスタックから別なカラーコード化画像を形成および／またはＲＯＩをマーキングおよび評価する請求項１４に記載の試料の検査方法。
- スペクトル分布が、まとめて検出され、画像チャネルの割当てられる検出スペクトル幅が変更できる請求項１〜１５のうちの１に記載の試料の検査方法。
- ＲＯＩのスペクトルを評価する請求項１〜１６のうちの１に記載の試料の検査方法。
- スペクトル幅設定のための調整素子を備える請求項１〜１７のうちの１に記載の試料の検査方法。
- 調整スペクトル幅を、デジタル信号結合または検出チャネルの電子結合によって生成する請求項１〜１８のうちの１に記載の試料の検査方法。
- 調整素子およびスペクトル幅のモニタ上での表示を、スペクトル幅調整素子の調整領域に空間が取れるように行う請求項１〜１９のうちの１に記載の試料の検査方法。
- モニタ上でのポジションが当該スペクトル領域のポジションに相当するスライダ制御器を備える請求項３〜２０のうちの１に記載の試料の検査方法。
- コンピュータマウスのカーソルを、調整素子に設定した場合は調整波長が、２つの調整素子間に設定した場合は調整波長領域がモニタ上に表示される請求項１〜２１のうちの１に記載の試料の検査方法。
- モニタ上に試料部分領域または試料全体の経時状況を波長別に表示する請求項１〜２２のうちの１に記載の試料の検査方法。
- 各ｘ，ｙ画素ポジション毎に、当該波長領域に亘って強度最高値を求めて表示し、それによりλスタックからグレー階調画像を生成する請求項２〜２３のうちの１に記載の試料の検査方法。
- 各画素を、さらにλスタックの最高明度画素が属する波長領域の平均波長に相当する色によって特徴付ける請求項２４に記載の試料の検査方法。
- λスタックの個別画像を、画像スクリーン上に並列的または相前後させて少なくとも部分的にはシリーズ形式で表示する請求項２４あるいは２５に記載の試料の検査方法。
- ｘｙ、λ表示のほかに時間関数および／またはｚ関数の図面を生成し表示する請求項２４〜２６のうちの１に記載の試料の検査方法。
- λスタックを、切断し、生じた切断画像を表示する請求項２４〜２７のうちの１に記載の試料の検査方法。
- 定量分析に成分分解法が含まれている請求項１〜２８のうちの１に記載の試料の検査方法。
- 定性分析に、ＰＣＡ法が含まれる請求項１〜２９のうちの１に記載の試料の検査方法。
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