JP2003185581A - 試料の検査方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】レーザ走査型顕微鏡、蛍光式検査装置または流
動細胞計量計の操作によって、複数の試料点、つまり分
布点における試料からの放射光線をスペクトル分割し、
吸収特性および放射特性が極僅かしか違わず、しかも顕
微鏡の画像形成システムで別々に測定および表示のでき
る色素の使用下で、フレキシブルに自由にプログラミン
グできる新しい試料の検査方法 【解決手段】スペクトル分布を個別検出チャネルで測定
し、その信号を位置座標ｘ、ｙまたはｚの少なくとも１
つまたは測定時点ｔを持つ検出信号に割り振り保存する
ことによってλスタックを形成し、色またはスペクトル
領域に応じて配分された画像チャネルおよび色配分を基
に擬似色画像を生成することを特徴に持つ、入力手段に
より、または自動的に検査対象試料領域としてのＲＯＩ
がマーキングされる方法
動細胞計量計の操作によって、複数の試料点、つまり分
布点における試料からの放射光線をスペクトル分割し、
吸収特性および放射特性が極僅かしか違わず、しかも顕
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グできる新しい試料の検査方法 【解決手段】スペクトル分布を個別検出チャネルで測定
し、その信号を位置座標ｘ、ｙまたはｚの少なくとも１
つまたは測定時点ｔを持つ検出信号に割り振り保存する
ことによってλスタックを形成し、色またはスペクトル
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に擬似色画像を生成することを特徴に持つ、入力手段に
より、または自動的に検査対象試料領域としてのＲＯＩ
がマーキングされる方法
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、蛍光顕微鏡法、特
にレーザ走査型顕微鏡法、蛍光相関分光法および走査型
近視野顕微鏡法における、主として生物学上の試料、プ
レパラートおよび付属する構成成分を検査するための方
法に関するものである。それに加え作用物質を検査する
ための蛍光検出に基づく方法（ハイ・スループット・ス
クリーニング）も含まれる。
にレーザ走査型顕微鏡法、蛍光相関分光法および走査型
近視野顕微鏡法における、主として生物学上の試料、プ
レパラートおよび付属する構成成分を検査するための方
法に関するものである。それに加え作用物質を検査する
ための蛍光検出に基づく方法（ハイ・スループット・ス
クリーニング）も含まれる。
【０００２】少数の広域スペクトル色素帯の検出から完
全なスペクトルの同時記録へと移行することにより、空
間的部分構造または動力学的過程において、殆どが分析
面または機能面からなされる試料特性の確認、分離、分
類に関し新たな可能性が開けてくる。それにより、オー
バーラップ部分を持つ蛍光スペクトルの場合では、多重
蛍光団を含む試料の同時検査が、厚い試料の空間構造に
おいても可能となる。
全なスペクトルの同時記録へと移行することにより、空
間的部分構造または動力学的過程において、殆どが分析
面または機能面からなされる試料特性の確認、分離、分
類に関し新たな可能性が開けてくる。それにより、オー
バーラップ部分を持つ蛍光スペクトルの場合では、多重
蛍光団を含む試料の同時検査が、厚い試料の空間構造に
おいても可能となる。
【０００３】
【従来の技術】生物プレパラートを検査するための光学
顕微鏡の古典的利用分野の１つに蛍光顕微鏡法（文献：
Ｐａｗｌｅｙ「生物共焦点顕微鏡法ハンドブック」、プ
レーナム・プレス１９９５年）がある。この場合では特
定の色素が細胞部分への特殊標識付けのために使用され
る。色素分子は、入射した一定エネルギを持つ光子１個
の吸収により光子基底状態から励起状態へ励起される。
この励起は一般に一光子吸収と称される（図１ａ）。
顕微鏡の古典的利用分野の１つに蛍光顕微鏡法（文献：
Ｐａｗｌｅｙ「生物共焦点顕微鏡法ハンドブック」、プ
レーナム・プレス１９９５年）がある。この場合では特
定の色素が細胞部分への特殊標識付けのために使用され
る。色素分子は、入射した一定エネルギを持つ光子１個
の吸収により光子基底状態から励起状態へ励起される。
この励起は一般に一光子吸収と称される（図１ａ）。
【０００４】色素分子は、このように励起された状態か
らさまざまな方法で基底状態に戻ることができる。蛍光
顕微鏡法では蛍光光子の放射下での移行が最も重要であ
る。放射される光子の波長はストークス変位のため励起
放射に比較して原則的に赤側にずれる。すなわち長波長
側である。ストークス変位が蛍光光線の励起光線からの
分離を可能にする。
らさまざまな方法で基底状態に戻ることができる。蛍光
顕微鏡法では蛍光光子の放射下での移行が最も重要であ
る。放射される光子の波長はストークス変位のため励起
放射に比較して原則的に赤側にずれる。すなわち長波長
側である。ストークス変位が蛍光光線の励起光線からの
分離を可能にする。
【０００５】蛍光は、ブロックフィルタと組み合わせた
適当なダイクロイック・ビームスプリッタによって励起
放射から分離し別途観察する。そうすることによって、
さまざまな色素で着色された個々の細胞部分の描写が可
能である。しかし原則的には、プレパラートのいくつか
の部分を、独特な堆積の仕方をするさまざまな色素で同
時に着色することもできる（多重蛍光）。個々の色素か
ら送出される蛍光信号を区別するために、ここでも特殊
なダイクロイック・ビームスプリッタを使用する。
適当なダイクロイック・ビームスプリッタによって励起
放射から分離し別途観察する。そうすることによって、
さまざまな色素で着色された個々の細胞部分の描写が可
能である。しかし原則的には、プレパラートのいくつか
の部分を、独特な堆積の仕方をするさまざまな色素で同
時に着色することもできる（多重蛍光）。個々の色素か
ら送出される蛍光信号を区別するために、ここでも特殊
なダイクロイック・ビームスプリッタを使用する。
【０００６】高いエネルギを持つ一光子による色素分子
の励起（一光子吸収）のほかに、より小さいエネルギを
持つ複数の光子による励起も可能である（図１ｂ）。こ
の場合、個々の光子のエネルギ総和は高エネルギ光子の
何倍にも相当する。この種の色素励起は多光子吸収と称
される（文献：Ｃｏｒｌｅ、Ｋｉｎｏ「共焦点走査型光
学顕微鏡法と関連画像システム」；アカデミック・プレ
ス１９９６年）。しかし、色素放射はこの種の励起によ
っては影響されない。すなわち、多光子吸収の場合放射
スペクトルは負のストークス・シフトを起すため、励起
放射に比較するとその波長は短い。励起光線を放射光線
から分離するのは一光子吸収の場合と同じ方法で行う。
の励起（一光子吸収）のほかに、より小さいエネルギを
持つ複数の光子による励起も可能である（図１ｂ）。こ
の場合、個々の光子のエネルギ総和は高エネルギ光子の
何倍にも相当する。この種の色素励起は多光子吸収と称
される（文献：Ｃｏｒｌｅ、Ｋｉｎｏ「共焦点走査型光
学顕微鏡法と関連画像システム」；アカデミック・プレ
ス１９９６年）。しかし、色素放射はこの種の励起によ
っては影響されない。すなわち、多光子吸収の場合放射
スペクトルは負のストークス・シフトを起すため、励起
放射に比較するとその波長は短い。励起光線を放射光線
から分離するのは一光子吸収の場合と同じ方法で行う。
【０００７】以下に現状技術を共焦点レーザ走査型顕微
鏡（ＬＳＭ）の例で説明する（図２）。ＬＳＭは大きく
分けて、光源、走査モジュール、検出ユニット、顕微鏡
の４モジュールから成っている。これらのモジュールは
以下により詳しく説明する。それに加え、ＤＥ１９７０
２７５３Ａ１も参考になる。
鏡（ＬＳＭ）の例で説明する（図２）。ＬＳＭは大きく
分けて、光源、走査モジュール、検出ユニット、顕微鏡
の４モジュールから成っている。これらのモジュールは
以下により詳しく説明する。それに加え、ＤＥ１９７０
２７５３Ａ１も参考になる。
【０００８】プレパラート中にあるさまざまな色素の個
別励起は、さまざまな波長のレーザをＬＳＭ内で使用す
る。励起波長の選択は検査対象色素の吸収特性に従って
行う。励起光線は光源モジュール内で生成される。この
場合さまざまなレーザ（アルゴン、アルゴン・クリプト
ン、TiSaレーザ）が使用の対象になる。そのほか、光源
モジュールでは、波長の選択および必要な励起波長の強
度調整を、たとえば音響光学結晶の使用により行う。
別励起は、さまざまな波長のレーザをＬＳＭ内で使用す
る。励起波長の選択は検査対象色素の吸収特性に従って
行う。励起光線は光源モジュール内で生成される。この
場合さまざまなレーザ（アルゴン、アルゴン・クリプト
ン、TiSaレーザ）が使用の対象になる。そのほか、光源
モジュールでは、波長の選択および必要な励起波長の強
度調整を、たとえば音響光学結晶の使用により行う。
【０００９】それに続き、レーザビームは、ファイバま
たは適当なミラー装置を通じて走査モジュール内に導か
れる。光源で生成されたレーザビームは、対物レンズを
通り、回折の抑制下でスキャナ、走査レンズ系、円筒レ
ンズを経由してプレパラート内へ集束される。スキャナ
により試料をｘ−ｙ方向にドット走査する。試料走査に
おける画素上の滞留時間は、多くの場合マイクロ秒未満
ないし数秒の範囲とする。
たは適当なミラー装置を通じて走査モジュール内に導か
れる。光源で生成されたレーザビームは、対物レンズを
通り、回折の抑制下でスキャナ、走査レンズ系、円筒レ
ンズを経由してプレパラート内へ集束される。スキャナ
により試料をｘ−ｙ方向にドット走査する。試料走査に
おける画素上の滞留時間は、多くの場合マイクロ秒未満
ないし数秒の範囲とする。
【００１０】蛍光の共焦点検出（デスキャン検出）の場
合、焦平面（試料）からおよびその上下にある平面から
放射された光は、スキャナを通じてダイクロイック・ビ
ームスプリッタ（ＭＤＢ）に達する。ＭＤＢは蛍光を励
起光から分離する。続いて蛍光は、正確に焦平面と共役
な平面内にある絞り（共焦点絞り／ピンホール）で焦点
を結ぶ。これによって焦点外の蛍光成分が遮断される。
絞りの寸法をさまざまに変化させることによって、顕微
鏡の光学分解能を調節することが可能である。絞りの後
ろに別のダイクロイック・ブロックフィルタ（ＥＦ）が
あり、これが再度励起ビームを差し止める。蛍光は、ブ
ロックフィルタを通過した後、点像検出器（ＰＭＴ）に
よって測定される。
合、焦平面（試料）からおよびその上下にある平面から
放射された光は、スキャナを通じてダイクロイック・ビ
ームスプリッタ（ＭＤＢ）に達する。ＭＤＢは蛍光を励
起光から分離する。続いて蛍光は、正確に焦平面と共役
な平面内にある絞り（共焦点絞り／ピンホール）で焦点
を結ぶ。これによって焦点外の蛍光成分が遮断される。
絞りの寸法をさまざまに変化させることによって、顕微
鏡の光学分解能を調節することが可能である。絞りの後
ろに別のダイクロイック・ブロックフィルタ（ＥＦ）が
あり、これが再度励起ビームを差し止める。蛍光は、ブ
ロックフィルタを通過した後、点像検出器（ＰＭＴ）に
よって測定される。
【００１１】多光子吸収を利用した場合、色素蛍光の励
起は、励起強度が特に強い小ボリューム部分に起こる。
この領域は、共焦点装置を使用した場合の検出領域より
極僅かに大きいだけである。したがって共焦点絞りの使
用を省くことができ、検出を対物レンズの直後で行うこ
とができる（ノンデスキャン検出）。多光子吸収によっ
て励起される色素蛍光を検出するための別の装置では、
さらにデスキャン検出が行われるが、この場合では対物
レンズのひとみは検出ユニット内へ結像する（非共焦点
デスキャン検出）。
起は、励起強度が特に強い小ボリューム部分に起こる。
この領域は、共焦点装置を使用した場合の検出領域より
極僅かに大きいだけである。したがって共焦点絞りの使
用を省くことができ、検出を対物レンズの直後で行うこ
とができる（ノンデスキャン検出）。多光子吸収によっ
て励起される色素蛍光を検出するための別の装置では、
さらにデスキャン検出が行われるが、この場合では対物
レンズのひとみは検出ユニット内へ結像する（非共焦点
デスキャン検出）。
【００１２】３次元照明による像のうち、対応の一光子
吸収もしくは多光子吸収と接続している２検出器の装置
によって、対物レンズの焦平面内に存在する平面（光学
的断面）のみが再現される。それに続いて、試料のさま
ざまな深さｚにおけるｘ−ｙ平面内のいくつかの光学的
断面の描画により、コンピュータでサポートされた試料
３次元像が生み出される。したがって、ＬＳＭは厚いプ
レパラートを検査するのに適している。励起波長は使用
色素の固有吸収特性で決定される。色素の放射特性に合
わせたダイクロイックフィルタにより、それぞれの色素
から送出される蛍光のみが確実に点像検出器で測定され
ることになる。
吸収もしくは多光子吸収と接続している２検出器の装置
によって、対物レンズの焦平面内に存在する平面（光学
的断面）のみが再現される。それに続いて、試料のさま
ざまな深さｚにおけるｘ−ｙ平面内のいくつかの光学的
断面の描画により、コンピュータでサポートされた試料
３次元像が生み出される。したがって、ＬＳＭは厚いプ
レパラートを検査するのに適している。励起波長は使用
色素の固有吸収特性で決定される。色素の放射特性に合
わせたダイクロイックフィルタにより、それぞれの色素
から送出される蛍光のみが確実に点像検出器で測定され
ることになる。
【００１３】バイオメディカル分野においては、目下の
ところいくつかのさまざまな細胞領域がさまざまな色素
で同時に標識付けされている（多重蛍光）。現状技術で
は、個々の色素はさまざまな吸収特性に基づき、または
放射特性（スペクトル）に基づき別々に検出されている
（図３ａ）。図３ａは各種典型的な色素の放射スペクト
ルを示している。放射信号は波長別に表わされている。
ナンバー１から４の色素にはそれぞれ放射スペクトルの
位置および形態に差のあることが認められる。それぞれ
別個の検出には、複数色素の蛍光に対する追加分割を副
ビームスプリッタ（ＤＢＳ）で行ない、個々の色素放射
検出を別々の点像検出器（ＰＭＴｘ）内で行う。
ところいくつかのさまざまな細胞領域がさまざまな色素
で同時に標識付けされている（多重蛍光）。現状技術で
は、個々の色素はさまざまな吸収特性に基づき、または
放射特性（スペクトル）に基づき別々に検出されている
（図３ａ）。図３ａは各種典型的な色素の放射スペクト
ルを示している。放射信号は波長別に表わされている。
ナンバー１から４の色素にはそれぞれ放射スペクトルの
位置および形態に差のあることが認められる。それぞれ
別個の検出には、複数色素の蛍光に対する追加分割を副
ビームスプリッタ（ＤＢＳ）で行ない、個々の色素放射
検出を別々の点像検出器（ＰＭＴｘ）内で行う。
【００１４】図３ｂに描かれた各色素の放射スペクトル
は強度に重なり合うこともあり、その場合では各色素の
放射信号をＤＢＳで分離するのは困難である。しかし、
それらの色素が異なった吸収特性を持っていれば、ＤＥ
ＣＺ７３０２に記述されているようなマルチトラッキ
ング法によりそれぞれを選択的に励起させることができ
る。図３ｂは、色素ＣＦＰおよびシアンＧＦＰについて
波長別の放射信号を示したものである。その場合励起は
４５８ｎｍおよび４８８ｎｍの２レーザ線によって行っ
た。これらの色素は、検査試料への毒性作用がなく、生
体プレパラートの検査には特に適している。両色素ＣＦ
Ｐ、ＧＦＴをできる限り効果的に検出するため、一走査
方向においてＣＦＰを波長４５８ｎｍで励起して４６０
〜５５０ｎｍの蛍光を検出し、スキャナの復路ではＧＦ
Ｐに対して波長４８８ｎｍで選択的励起を行なって、波
長領域４９０〜６５０ｎｍで検出する。
は強度に重なり合うこともあり、その場合では各色素の
放射信号をＤＢＳで分離するのは困難である。しかし、
それらの色素が異なった吸収特性を持っていれば、ＤＥ
ＣＺ７３０２に記述されているようなマルチトラッキ
ング法によりそれぞれを選択的に励起させることができ
る。図３ｂは、色素ＣＦＰおよびシアンＧＦＰについて
波長別の放射信号を示したものである。その場合励起は
４５８ｎｍおよび４８８ｎｍの２レーザ線によって行っ
た。これらの色素は、検査試料への毒性作用がなく、生
体プレパラートの検査には特に適している。両色素ＣＦ
Ｐ、ＧＦＴをできる限り効果的に検出するため、一走査
方向においてＣＦＰを波長４５８ｎｍで励起して４６０
〜５５０ｎｍの蛍光を検出し、スキャナの復路ではＧＦ
Ｐに対して波長４８８ｎｍで選択的励起を行なって、波
長領域４９０〜６５０ｎｍで検出する。
【００１５】使用色素の放射スペクトル位置が未知であ
る場合、あるいは周辺条件（試料内外の条件：温度、濃
度、ｐＨ値）に依存して放射スペクトルに位置移動が起
きる場合では（図３ｃ）、色素蛍光を効果的に検出する
にも限界がある。図３ｃも同様に放射信号を波長の関数
で描いたものである。波長シフトは数１０ｎｍに至るこ
ともある。試料内の放射スペクトルの測定には、今日で
はＬＳＭとの組み合わせの場合も含めて分光計が使用さ
れる。この目的には点像検出器の代わりに、殆どの場合
高分解能を持つ従来型分光計が使用される（Dixon他の
特許ＵＳ ５，１９２，９８０）。しかしこれらは放射
スペクトルを点単位でのみ、あるいはある領域について
平均的に記録するだけである。つまり、一種のスペクト
ル分析である。
る場合、あるいは周辺条件（試料内外の条件：温度、濃
度、ｐＨ値）に依存して放射スペクトルに位置移動が起
きる場合では（図３ｃ）、色素蛍光を効果的に検出する
にも限界がある。図３ｃも同様に放射信号を波長の関数
で描いたものである。波長シフトは数１０ｎｍに至るこ
ともある。試料内の放射スペクトルの測定には、今日で
はＬＳＭとの組み合わせの場合も含めて分光計が使用さ
れる。この目的には点像検出器の代わりに、殆どの場合
高分解能を持つ従来型分光計が使用される（Dixon他の
特許ＵＳ ５，１９２，９８０）。しかしこれらは放射
スペクトルを点単位でのみ、あるいはある領域について
平均的に記録するだけである。つまり、一種のスペクト
ル分析である。
【００１６】蛍光顕微鏡法のまた別な適用例では、特に
生物プレパラート中のイオン濃度（たとえばＣａ＋，Ｋ
＋，Ｍｇ２＋，Ｚｎ＋，…）の測定に用いられている。
それには、特別な色素や、またはイオン濃度に依存して
スペクトルのずれる色素配合（たとえば、フラ、イン
ド、フルオ；モレキュラー・プローブズ社）が使用され
る。図４ａはカルシウムイオンの濃度に依存するインド
−１の放射スペクトルを示している。図４ｂはフルオ−
３とフラレッド色素との組み合わせの場合で、カルシウ
ムイオン濃度に依存する放射スペクトルの例を示してい
る。これらの特殊色素は放射率識別色素と称される。図
４ａに示した２つの蛍光領域を検出して、両強度の比率
を出すと、対応のイオン濃度を導き出すことができる。
多くの場合この測定によって生プレパラート中のイオン
濃度の動的変化が分析されるが、それには１ミリ秒以内
の時間分割が要求される。
生物プレパラート中のイオン濃度（たとえばＣａ＋，Ｋ
＋，Ｍｇ２＋，Ｚｎ＋，…）の測定に用いられている。
それには、特別な色素や、またはイオン濃度に依存して
スペクトルのずれる色素配合（たとえば、フラ、イン
ド、フルオ；モレキュラー・プローブズ社）が使用され
る。図４ａはカルシウムイオンの濃度に依存するインド
−１の放射スペクトルを示している。図４ｂはフルオ−
３とフラレッド色素との組み合わせの場合で、カルシウ
ムイオン濃度に依存する放射スペクトルの例を示してい
る。これらの特殊色素は放射率識別色素と称される。図
４ａに示した２つの蛍光領域を検出して、両強度の比率
を出すと、対応のイオン濃度を導き出すことができる。
多くの場合この測定によって生プレパラート中のイオン
濃度の動的変化が分析されるが、それには１ミリ秒以内
の時間分割が要求される。
【００１７】多重蛍光記録で障害になる望ましくない現
象は、背景信号の重なりである。それは、個別レーザの
試料からの反射であったり、または試料構成部分から発
する広帯幅の自己蛍光信号の場合もあるが、それらは検
査対象である蛍光標識付け試料箇所のスペクトル特性に
覆い被さって、そのため検査を困難にしているばかりか
一部では阻止している。
象は、背景信号の重なりである。それは、個別レーザの
試料からの反射であったり、または試料構成部分から発
する広帯幅の自己蛍光信号の場合もあるが、それらは検
査対象である蛍光標識付け試料箇所のスペクトル特性に
覆い被さって、そのため検査を困難にしているばかりか
一部では阻止している。
【００１８】細胞およびその他粒子の検査および分類に
流動細胞計量計が用いられる。その場合、細胞を液体に
溶かし、毛管を通じてポンピングする。細胞検査には側
面からレーザ光線を照射してそれを毛管に集束させる。
細胞は各種の色素またはバイオ分子で着色しておく。励
起された蛍光および後方散乱励起光を測定する。現技術
状況については、Ｍ．Ｒ．Ｍｅｌａｍｅｄ、Ｔ．Ｌｉｎ
ｄｍｏ、Ｍ．Ｌ．Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ著“Ｆｌｏｗ
Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ”（「流
動細胞の計量および分類」第２版、Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ
ｓ，Ｉｎｃ．社（ニューヨーク）出版、１９９０年刊、
８１〜１０７ページ）に記述されている。
流動細胞計量計が用いられる。その場合、細胞を液体に
溶かし、毛管を通じてポンピングする。細胞検査には側
面からレーザ光線を照射してそれを毛管に集束させる。
細胞は各種の色素またはバイオ分子で着色しておく。励
起された蛍光および後方散乱励起光を測定する。現技術
状況については、Ｍ．Ｒ．Ｍｅｌａｍｅｄ、Ｔ．Ｌｉｎ
ｄｍｏ、Ｍ．Ｌ．Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ著“Ｆｌｏｗ
Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ”（「流
動細胞の計量および分類」第２版、Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ
ｓ，Ｉｎｃ．社（ニューヨーク）出版、１９９０年刊、
８１〜１０７ページ）に記述されている。
【００１９】後方散乱信号から細胞の大きさが測定でき
る。個々の細胞の蛍光スペクトル特性から様々な細胞を
分離／分類することが、または個別に計量することがで
きる。細胞の分類は、静電界において様々な毛管の使用
下で行う。その結果は、例えば色素Ａ着色の細胞数と色
素Ｂ着色の細胞数がしばしば棒グラフで描かれ比較され
る。流動速度は、典型例では数１０〜１００ｃｍ／秒で
ある。従って、高感度の検出が必要になる。検出量の制
限のため、現状技術では共焦点検出が行われている。流
量測定の精度は様々なファクタに影響される。そのファ
クタとしては、例えば非特殊性蛍光、細胞の自己蛍光、
光学系構成部の蛍光および使用検出器の雑音がある。
る。個々の細胞の蛍光スペクトル特性から様々な細胞を
分離／分類することが、または個別に計量することがで
きる。細胞の分類は、静電界において様々な毛管の使用
下で行う。その結果は、例えば色素Ａ着色の細胞数と色
素Ｂ着色の細胞数がしばしば棒グラフで描かれ比較され
る。流動速度は、典型例では数１０〜１００ｃｍ／秒で
ある。従って、高感度の検出が必要になる。検出量の制
限のため、現状技術では共焦点検出が行われている。流
量測定の精度は様々なファクタに影響される。そのファ
クタとしては、例えば非特殊性蛍光、細胞の自己蛍光、
光学系構成部の蛍光および使用検出器の雑音がある。
【００２０】本発明の課題は、吸収特性および放射特性
が極僅かしか違わず、しかも顕微鏡の画像形成システム
で別々に測定および表示のできる色素の使用下で、フレ
キシブルに自由にプログラミングできる新しい検出方法
を実現することである。個々の色素間の漏話は、本発明
に基づく方法では確実に掌握され、データプロセッシン
グによって排除される。
が極僅かしか違わず、しかも顕微鏡の画像形成システム
で別々に測定および表示のできる色素の使用下で、フレ
キシブルに自由にプログラミングできる新しい検出方法
を実現することである。個々の色素間の漏話は、本発明
に基づく方法では確実に掌握され、データプロセッシン
グによって排除される。
【００２１】
【課題を解決するための手段】この方法は顕微鏡の画像
形成システムにも分析システムにも適用できる。この顕
微鏡システムというのは、２００ｎｍまでの光学分解能
を持つ、生物プレパラートの３次元検査用レーザ走査型
顕微鏡や、１０ｎｍまでの分解能を持つ、表面の高度分
解検査のための走査型近視野顕微鏡などの画像形成シス
テム、および分子濃度の定量測定や分子拡散の測定のた
めの蛍光相関性顕微鏡のことである。さらに、蛍光検出
をベースとする色素検査法および流動細胞計量測定法も
含まれる。上記システムではすべて、プレパラートの特
殊標識化に蛍光色素が使用される。上記の課題は、独立
した請求項に基づく方法および装置によって解消され
る。その他の好ましい実施態様は従属請求項の対象であ
る。
形成システムにも分析システムにも適用できる。この顕
微鏡システムというのは、２００ｎｍまでの光学分解能
を持つ、生物プレパラートの３次元検査用レーザ走査型
顕微鏡や、１０ｎｍまでの分解能を持つ、表面の高度分
解検査のための走査型近視野顕微鏡などの画像形成シス
テム、および分子濃度の定量測定や分子拡散の測定のた
めの蛍光相関性顕微鏡のことである。さらに、蛍光検出
をベースとする色素検査法および流動細胞計量測定法も
含まれる。上記システムではすべて、プレパラートの特
殊標識化に蛍光色素が使用される。上記の課題は、独立
した請求項に基づく方法および装置によって解消され
る。その他の好ましい実施態様は従属請求項の対象であ
る。
【００２２】本発明に基づく方法により、同時使用可能
な色素記号数を増やすことができる。それにより、例え
ば同時検査可能な細胞特性数を増やすことが可能にな
る。個々の色素間でスペクトル特性が強度にオーバラッ
プする場合、個別色素の蛍光信号を別々に検出するため
には現状技術レベルでは波長領域を制限しなければなら
ず、そのため検出感度が低下する。即ち、増幅度を高め
て使用するので、検出器の雑音が大きくなる。しかし本
発明に基づく方法ではこれが防止でき、その上、非特殊
性蛍光信号、自己蛍光および測定装置の蛍光をそれぞれ
分別することができる。
な色素記号数を増やすことができる。それにより、例え
ば同時検査可能な細胞特性数を増やすことが可能にな
る。個々の色素間でスペクトル特性が強度にオーバラッ
プする場合、個別色素の蛍光信号を別々に検出するため
には現状技術レベルでは波長領域を制限しなければなら
ず、そのため検出感度が低下する。即ち、増幅度を高め
て使用するので、検出器の雑音が大きくなる。しかし本
発明に基づく方法ではこれが防止でき、その上、非特殊
性蛍光信号、自己蛍光および測定装置の蛍光をそれぞれ
分別することができる。
【００２３】
【発明の実施の形態】本発明に基づく方法の背景には、
スペクトル分割された蛍光検出がある。その場合では放
射光が、走査モジュール内または顕微鏡内（多光子吸収
の場合）でメインカラースプリッタ（ＭＤＢ）、あるい
は７３４６ＤＥまたは７３２３ＤＥに基づくＡＯＴＦ
（音響光学フィルタ）など励起光線を被検出光線から分
離するための素子によって、励起光から分割される。透
過光装置の場合ではこの種の素子は完全に省くこともで
きる。
スペクトル分割された蛍光検出がある。その場合では放
射光が、走査モジュール内または顕微鏡内（多光子吸収
の場合）でメインカラースプリッタ（ＭＤＢ）、あるい
は７３４６ＤＥまたは７３２３ＤＥに基づくＡＯＴＦ
（音響光学フィルタ）など励起光線を被検出光線から分
離するための素子によって、励起光から分割される。透
過光装置の場合ではこの種の素子は完全に省くこともで
きる。
【００２４】それに続いて配置されている検出器ユニッ
トの構成図を図５に示してある。試料から出た光は、共
焦点検出の場合では結像レンズ系ＰＯ、さらには絞り
（ピンホール）ＰＨを通って焦点を結び、それによって
焦点外に生じる蛍光が遮断される。ノンデスキャン検出
の場合には絞りは不要である。この場合では光は角分散
素子ＤＩによってそのスペクトル成分へ分解される。角
分散素子としてはプリズム、格子および音響光学素子が
使用される。分散素子によってそのスペクトル成分へ分
割された光は、続いてライン検出器ＤＥ上へ結像され
る。つまり、このライン検出器ＤＥは波長に依存する放
射信号Ｓを測定し、これを電気信号ＥＳへ変換する。加
えて、検出ユニットには励起波長を抑制するための線型
フィルタを直列接続することもできる。
トの構成図を図５に示してある。試料から出た光は、共
焦点検出の場合では結像レンズ系ＰＯ、さらには絞り
（ピンホール）ＰＨを通って焦点を結び、それによって
焦点外に生じる蛍光が遮断される。ノンデスキャン検出
の場合には絞りは不要である。この場合では光は角分散
素子ＤＩによってそのスペクトル成分へ分解される。角
分散素子としてはプリズム、格子および音響光学素子が
使用される。分散素子によってそのスペクトル成分へ分
割された光は、続いてライン検出器ＤＥ上へ結像され
る。つまり、このライン検出器ＤＥは波長に依存する放
射信号Ｓを測定し、これを電気信号ＥＳへ変換する。加
えて、検出ユニットには励起波長を抑制するための線型
フィルタを直列接続することもできる。
【００２５】図５にブロック接続図で示した検出器ユニ
ットを光学的ビーム光路として用いた場合の考え得る実
施態様を図６に示している。本構造は本質的にはサーニ
ー・ターナー構造に基づくものである。共焦点検出の場
合、試料からの光Ｌはピンホールレンズ系ＰＯにより共
焦点絞りＰＨを通され集束する。ノンデスキャン検出で
多光子吸収の場合には、この絞りは不要である。第１の
結像鏡Ｓ２は蛍光を視準する。続いて光は線形格子Ｇ、
たとえばミリ当たり線数６５１本を有する格子上に当た
る。格子は光をその波長に応じてさまざまな方向に偏向
させる。第２の結像鏡Ｓ１はスペクトル分割された個々
の波長成分を、対応ライン検出器ＤＥのチャネル上へ集
束させる。浜松製作所のＨ７２６０ライン２次電子増倍
管を使用するのが特に好ましい。当検出器は３２チャネ
ル型で高感度を有する。
ットを光学的ビーム光路として用いた場合の考え得る実
施態様を図６に示している。本構造は本質的にはサーニ
ー・ターナー構造に基づくものである。共焦点検出の場
合、試料からの光Ｌはピンホールレンズ系ＰＯにより共
焦点絞りＰＨを通され集束する。ノンデスキャン検出で
多光子吸収の場合には、この絞りは不要である。第１の
結像鏡Ｓ２は蛍光を視準する。続いて光は線形格子Ｇ、
たとえばミリ当たり線数６５１本を有する格子上に当た
る。格子は光をその波長に応じてさまざまな方向に偏向
させる。第２の結像鏡Ｓ１はスペクトル分割された個々
の波長成分を、対応ライン検出器ＤＥのチャネル上へ集
束させる。浜松製作所のＨ７２６０ライン２次電子増倍
管を使用するのが特に好ましい。当検出器は３２チャネ
ル型で高感度を有する。
【００２６】上記実施態様の自由なスペクトル領域は約
３５０ｎｍである。自由なスペクトル領域はこの装置で
はライン検出器の３２チャネルに均等に配分されるの
で、光学的分解能は約１０ｎｍとなる。したがって、こ
の装置は分光測定には限定的にしか適さない。しかし、
これを結像システムに使用するのは有利である。これ
は、検出スペクトル帯域が相対的に広く、検出チャネル
ごとの信号がなお比較的大きいからである。自由なスペ
クトル領域の移動は、加えて、たとえば格子をＤＰだけ
ねじることによっても行なえる。
３５０ｎｍである。自由なスペクトル領域はこの装置で
はライン検出器の３２チャネルに均等に配分されるの
で、光学的分解能は約１０ｎｍとなる。したがって、こ
の装置は分光測定には限定的にしか適さない。しかし、
これを結像システムに使用するのは有利である。これ
は、検出スペクトル帯域が相対的に広く、検出チャネル
ごとの信号がなお比較的大きいからである。自由なスペ
クトル領域の移動は、加えて、たとえば格子をＤＰだけ
ねじることによっても行なえる。
【００２７】上記の実施態様では、検出器ＤＥの各個別
チャネルが検出する放射スペクトル幅は約１０ｎｍの帯
域である。それにより、測定対象の各画像点毎に、当該
画像点に存在する個別色素のスペクトル成分総和が記録
される。加えて、ずっと後の方で記述しているスイッチ
レジスタＳＲを使ってオペレータが任意の個別チャネル
を切換えることもできる。これは特に単一または複数の
励起レーザ線の抑制には有効である。
チャネルが検出する放射スペクトル幅は約１０ｎｍの帯
域である。それにより、測定対象の各画像点毎に、当該
画像点に存在する個別色素のスペクトル成分総和が記録
される。加えて、ずっと後の方で記述しているスイッチ
レジスタＳＲを使ってオペレータが任意の個別チャネル
を切換えることもできる。これは特に単一または複数の
励起レーザ線の抑制には有効である。
【００２８】図７には検出器ＤＥの個別チャネルに対す
る読出し装置が図式化されている。その場合、多チャネ
ルＰＭＴの陽極に流れる電流は、それぞれ第１増幅器Ａ
（電流／電圧変換器として接続）によって電圧に変換さ
れ増幅される。電圧は、信号を一定時間（例えば画素上
滞留時間）の間積分する積分器Ｉに供給される。迅速に
値を求めるため、積分器Ｉの後に、単純な比較器として
次のようなスイッチング閾値を有する比較器Ｋを、即ち
閾値を越えたときにデジタル出力信号を発するか、また
はウィンドウ比較器として形成されていて、入力信号が
スイッチング閾値の上限と下限との間にあるか、または
入力信号がスイッチング閾値の外（下または上）にあれ
ば、デジタル出力信号を発するという比較器Ｋを配置さ
せることができる。
る読出し装置が図式化されている。その場合、多チャネ
ルＰＭＴの陽極に流れる電流は、それぞれ第１増幅器Ａ
（電流／電圧変換器として接続）によって電圧に変換さ
れ増幅される。電圧は、信号を一定時間（例えば画素上
滞留時間）の間積分する積分器Ｉに供給される。迅速に
値を求めるため、積分器Ｉの後に、単純な比較器として
次のようなスイッチング閾値を有する比較器Ｋを、即ち
閾値を越えたときにデジタル出力信号を発するか、また
はウィンドウ比較器として形成されていて、入力信号が
スイッチング閾値の上限と下限との間にあるか、または
入力信号がスイッチング閾値の外（下または上）にあれ
ば、デジタル出力信号を発するという比較器Ｋを配置さ
せることができる。
【００２９】比較器もしくはウィンドウ比較器の配置
は、積分器の前にすることも後にすることもできる。積
分器なしの接続装置（いわゆる増幅モード）も同様に考
え得る。増幅器モードでの配置の場合、比較器Ｋは然る
べき基準に適合させて設置する。比較器Ｋの出力は直接
アクティブなチャネルに接続する（オンライン）スイッ
チ・レジスタＳＲの制御信号として用いられるか、また
はアクティブなチャネルを個別選択するために（オフラ
イン）、その時の状態が付属連結器Ｖを通じてコンピュ
ータに伝えられる。スイッチ・レジスタＳＲの出力信号
は後続のＡ／Ｄ変換のため、レベル適合用の別な増幅器
Ａ１へ直接導かれる。
は、積分器の前にすることも後にすることもできる。積
分器なしの接続装置（いわゆる増幅モード）も同様に考
え得る。増幅器モードでの配置の場合、比較器Ｋは然る
べき基準に適合させて設置する。比較器Ｋの出力は直接
アクティブなチャネルに接続する（オンライン）スイッ
チ・レジスタＳＲの制御信号として用いられるか、また
はアクティブなチャネルを個別選択するために（オフラ
イン）、その時の状態が付属連結器Ｖを通じてコンピュ
ータに伝えられる。スイッチ・レジスタＳＲの出力信号
は後続のＡ／Ｄ変換のため、レベル適合用の別な増幅器
Ａ１へ直接導かれる。
【００３０】ＡＤ変換された値、即ち試料の各画像点で
測定されたスペクトル分解蛍光信号は、データ加工のた
めに適当なデータ伝送装置を通じてコンピュータ（ＰＣ
またはデジタル信号プロセッサＤＳＰ）へ伝送される。
続いて、走査モード如何では、スペクトル分解による個
々の測定画像点から、付属座標ｘ、ｙ、ｚ、時間および
寿命を用いたラムダスタック（検出光線の分散、分割機
能を持つ検出チャネルにより測定し、少なくとも一つの
付属（画像）座標ｘ、ｙおよび／またはｚおよび／また
は測定時間ｔによって分類の上、記憶素子へ保存した画
像点毎のスペクトル分布）が形成される。
測定されたスペクトル分解蛍光信号は、データ加工のた
めに適当なデータ伝送装置を通じてコンピュータ（ＰＣ
またはデジタル信号プロセッサＤＳＰ）へ伝送される。
続いて、走査モード如何では、スペクトル分解による個
々の測定画像点から、付属座標ｘ、ｙ、ｚ、時間および
寿命を用いたラムダスタック（検出光線の分散、分割機
能を持つ検出チャネルにより測定し、少なくとも一つの
付属（画像）座標ｘ、ｙおよび／またはｚおよび／また
は測定時間ｔによって分類の上、記憶素子へ保存した画
像点毎のスペクトル分布）が形成される。
【００３１】但し、
・ ＸおよびＹはＳＣによって走査する。
・ Ｚは、例えばプレパラートを光学軸に沿って移動さ
せることによって実現する。 ・ 時間：種々の時間にデータ記録を行う。 ・ 寿命：データ記録は蛍光寿命の間に時間分割して行
う。
せることによって実現する。 ・ 時間：種々の時間にデータ記録を行う。 ・ 寿命：データ記録は蛍光寿命の間に時間分割して行
う。
【００３２】蛍光測定の場合ではアーチファクトの回避
のため、試料から後方散乱した励起光を抑制すること
や、あるいは少なくともそれが放射最大値以下か同程度
になるまで弱めることは有効である。それには、上記の
付属光線フィルタまたは光学強度を弱めるために最適化
された然るべきメインカラースプリッタ（ＭＤＢ）が使
用できる。
のため、試料から後方散乱した励起光を抑制すること
や、あるいは少なくともそれが放射最大値以下か同程度
になるまで弱めることは有効である。それには、上記の
付属光線フィルタまたは光学強度を弱めるために最適化
された然るべきメインカラースプリッタ（ＭＤＢ）が使
用できる。
【００３３】励起レーザ光線のスペクトル幅は個別チャ
ネルで検出される帯域幅よりはるかに小さいので、後方
散乱または反射した励起光線については、図７に描かれ
たＳＲにより対応の個別チャネルを特定して遮断するこ
ともできる。励起波長が２つの検出チャネルに及ぶ場
合、格子角度を捻るか、走査検出器を移動させるかまた
は図６のＳ１またはＳ２を傾斜させることにより、励起
光線が１つの検出チャネルだけに入るように励起光線を
移動させることができる。上記の両装置構成では、個別
チャネルの検出には主として積分器接続装置を使用し
た。それにより、個別チャネル内の光子の計数および光
子数の加算も制限なく行える。
ネルで検出される帯域幅よりはるかに小さいので、後方
散乱または反射した励起光線については、図７に描かれ
たＳＲにより対応の個別チャネルを特定して遮断するこ
ともできる。励起波長が２つの検出チャネルに及ぶ場
合、格子角度を捻るか、走査検出器を移動させるかまた
は図６のＳ１またはＳ２を傾斜させることにより、励起
光線が１つの検出チャネルだけに入るように励起光線を
移動させることができる。上記の両装置構成では、個別
チャネルの検出には主として積分器接続装置を使用し
た。それにより、個別チャネル内の光子の計数および光
子数の加算も制限なく行える。
【００３４】以下では試料情報、即ちラムダスタックの
様々な表示法について述べる。上記方法で記録されたラ
ムダスタックの最も簡易な形態は、隣接する非常に狭い
波長領域からの蛍光強度の値を含んだｘ−ｙ画像の積層
である。このラムダスタックの記録とｚ積層または／お
よび時間列とを組合せれば複雑なデータが得られる。
様々な表示法について述べる。上記方法で記録されたラ
ムダスタックの最も簡易な形態は、隣接する非常に狭い
波長領域からの蛍光強度の値を含んだｘ−ｙ画像の積層
である。このラムダスタックの記録とｚ積層または／お
よび時間列とを組合せれば複雑なデータが得られる。
【００３５】これらの観察者用データの処理は以下のよ
うに様々な方法で行われる： ａ）ラムダ最大値の投射 ラムダスタックからグレー階調画像を生成する。それに
は、各画素のｘ、ｙポジション毎にその波長領域につい
て、投射画像の当該画素明度を定義付けする強度最大値
を求める。 ｂ）コード化ラムダの投射 この場合もａ）と同様に投射されたラムダ最大値を算出
し、各画素に対して、ラムダスタックの明度最高画素を
生む波長領域の平均波長に相当する色素を付与する。 ｃ）簡易ラムダスタック（ｘｙλ）表示画面の観察 ここではラムダスタックの個別画像を少なくとも一部は
シリーズで表示する。その場合、個々の画像毎に、強度
が記録されている領域の平均波長を付記表示することも
できる。 ｄ）より複雑なラムダスタック（ｘｙλ）表示画面の観
察 ｘｙラムダスタックをｚまたは／および時間の関数で記
録する場合、画面内にそれぞれシリーズ形式でｚ平面ま
たは時点を表示させるにはスライダを使用することがで
きる。別な形式では、スペクトルの異なる画像を横列
に、時間またはｚ平面の異なる画像を縦列に表示するこ
とにより、記録されたｘｙ画像をすべて同時に表示する
ことができる。 次の観察画面間で選択することができる：ｘｙ−λ、ｘ
ｙ−ｚ、ｘｙ−ｔ、ｘｙ−λ−ｚ、ｘｙ−λ−ｔ、ｘｙ
−ｚ−ｔ。尚、挙げていない次元はスライダによって開
けることができる。ラムダ最大値またはコード化ラムダ
の投射と横列および縦列の表示画面観察との組合せによ
り、ｘｙ−ｚ−ｔ−λ情報の同時表示が可能になる。 ｅ）ラムダスタックの直交切断 これは、自由にポジショニングできる水平標識線と垂直
標識線をそれぞれ一つずつ持つラムダスタックの選択λ
平面を示している。ラムダスタックがこれらの線によっ
て切断され、生じた切断像がλ平面の横（ｙ切断面）お
よびλ平面の上（ｘ切断面）に投射される。擬似／真正
色素のコード化は自由選択により実施できる。画像内の
個別色素成分の重なりによって、色に忠実な試料像が作
られる。
うに様々な方法で行われる： ａ）ラムダ最大値の投射 ラムダスタックからグレー階調画像を生成する。それに
は、各画素のｘ、ｙポジション毎にその波長領域につい
て、投射画像の当該画素明度を定義付けする強度最大値
を求める。 ｂ）コード化ラムダの投射 この場合もａ）と同様に投射されたラムダ最大値を算出
し、各画素に対して、ラムダスタックの明度最高画素を
生む波長領域の平均波長に相当する色素を付与する。 ｃ）簡易ラムダスタック（ｘｙλ）表示画面の観察 ここではラムダスタックの個別画像を少なくとも一部は
シリーズで表示する。その場合、個々の画像毎に、強度
が記録されている領域の平均波長を付記表示することも
できる。 ｄ）より複雑なラムダスタック（ｘｙλ）表示画面の観
察 ｘｙラムダスタックをｚまたは／および時間の関数で記
録する場合、画面内にそれぞれシリーズ形式でｚ平面ま
たは時点を表示させるにはスライダを使用することがで
きる。別な形式では、スペクトルの異なる画像を横列
に、時間またはｚ平面の異なる画像を縦列に表示するこ
とにより、記録されたｘｙ画像をすべて同時に表示する
ことができる。 次の観察画面間で選択することができる：ｘｙ−λ、ｘ
ｙ−ｚ、ｘｙ−ｔ、ｘｙ−λ−ｚ、ｘｙ−λ−ｔ、ｘｙ
−ｚ−ｔ。尚、挙げていない次元はスライダによって開
けることができる。ラムダ最大値またはコード化ラムダ
の投射と横列および縦列の表示画面観察との組合せによ
り、ｘｙ−ｚ−ｔ−λ情報の同時表示が可能になる。 ｅ）ラムダスタックの直交切断 これは、自由にポジショニングできる水平標識線と垂直
標識線をそれぞれ一つずつ持つラムダスタックの選択λ
平面を示している。ラムダスタックがこれらの線によっ
て切断され、生じた切断像がλ平面の横（ｙ切断面）お
よびλ平面の上（ｘ切断面）に投射される。擬似／真正
色素のコード化は自由選択により実施できる。画像内の
個別色素成分の重なりによって、色に忠実な試料像が作
られる。
【００３６】参照スペクトルは、例えば純流動状態にあ
る、即ち溶剤に溶かされた、または検査試料の不連続個
別領域で結合している個々の色素の放射スペクトルであ
る。
る、即ち溶剤に溶かされた、または検査試料の不連続個
別領域で結合している個々の色素の放射スペクトルであ
る。
【００３７】参照スペクトル生成のための領域選択は、
以下の方法によって行うことができる。ラムダスタック
は各画素毎のスペクトル情報を補足資料として含んでい
る。図８ａは、例えば、様々に着色された細胞領域を表
わす、ＬＳＭ画像内におけるそれぞれのＲＯＩ（ＲＯＩ
１〜４）の分布状態を図示したものである。図８ｂに
は放射スペクトル１から４の典型例がそれぞれ対応の励
起波長（Ｌ１〜Ｌ４）と共に描かれている。
以下の方法によって行うことができる。ラムダスタック
は各画素毎のスペクトル情報を補足資料として含んでい
る。図８ａは、例えば、様々に着色された細胞領域を表
わす、ＬＳＭ画像内におけるそれぞれのＲＯＩ（ＲＯＩ
１〜４）の分布状態を図示したものである。図８ｂに
は放射スペクトル１から４の典型例がそれぞれ対応の励
起波長（Ｌ１〜Ｌ４）と共に描かれている。
【００３８】ＲＯＩに対する調整についてはオペレータ
は、例えば次のように行うことができる：個別ＲＯＩ内
の色素励起に要するすべての、または殆どの励起光線を
使用してスペクトル走査を実行および記録し、それに基
づき個別励起レーザ光線の間にそれぞれの総合チャネル
枠を設けることが可能である（図７ｂに表示されている
通り、Ｌ１〜Ｌ２、Ｌ２〜Ｌ３、Ｌ３〜Ｌ４およびＬ４
〜最大放射波長）。これらの総合チャネルは個別色素の
蛍光帯域部分に相当する。また、同一総合チャネル内で
様々な色素が強力に重なり合っているので、それらの信
号の同時合算も行なわれる。これらの総合チャネルは、
続いて、カラーコード化により様々な画像チャネルに分
解され、相互に重畳表示される。
は、例えば次のように行うことができる：個別ＲＯＩ内
の色素励起に要するすべての、または殆どの励起光線を
使用してスペクトル走査を実行および記録し、それに基
づき個別励起レーザ光線の間にそれぞれの総合チャネル
枠を設けることが可能である（図７ｂに表示されている
通り、Ｌ１〜Ｌ２、Ｌ２〜Ｌ３、Ｌ３〜Ｌ４およびＬ４
〜最大放射波長）。これらの総合チャネルは個別色素の
蛍光帯域部分に相当する。また、同一総合チャネル内で
様々な色素が強力に重なり合っているので、それらの信
号の同時合算も行なわれる。これらの総合チャネルは、
続いて、カラーコード化により様々な画像チャネルに分
解され、相互に重畳表示される。
【００３９】画像チャネルにおける様々な局部的色素混
合により、オペレータまたは自動模様識別器は、それぞ
れのＲＯＩの位置設定が可能になり、例えば個別ＲＯＩ
において最も強く現われる色素に基づいて、それぞれの
加算調整に対する定義付けができる。様々なＲＯＩに対
する第２調整法では蛍光重心ＣＺ ７４４７の測定が行
われる。その場合、検出器内では励起レーザ光線で照射
されるすべての個別チャネルのスイッチが遮断される。
各ＲＯＩは、使用されるそれぞれの色素の放射特性に変
化が現われるため特徴的な蛍光重心を有している。従っ
て、それぞれのＲＯＩは特徴的な色素重心の位置によっ
て区別し、明確に分離することができる。
合により、オペレータまたは自動模様識別器は、それぞ
れのＲＯＩの位置設定が可能になり、例えば個別ＲＯＩ
において最も強く現われる色素に基づいて、それぞれの
加算調整に対する定義付けができる。様々なＲＯＩに対
する第２調整法では蛍光重心ＣＺ ７４４７の測定が行
われる。その場合、検出器内では励起レーザ光線で照射
されるすべての個別チャネルのスイッチが遮断される。
各ＲＯＩは、使用されるそれぞれの色素の放射特性に変
化が現われるため特徴的な蛍光重心を有している。従っ
て、それぞれのＲＯＩは特徴的な色素重心の位置によっ
て区別し、明確に分離することができる。
【００４０】任意に選択した試料箇所のスペクトル特性
を明確化するために、オペレータはＲＯＩ関数を使用す
ることができる（ＲＯＩ：対象領域、図１４参照）。そ
の場合、図２で記録された試料領域ＲＯＩ １およびＲ
ＯＩ ２（図１４）が描画用具３（例えば、多角形、楕
円形または閉じた弧形）によってマーキングされ、当該
スペクトル特性がラムダスタックの各λ平面毎にＲＯＩ
に含まれるｘ−ｙ画素の平均値に基づきグラフ表示され
る（グラフ１）。原則的には、選択した様々な試料箇所
の複数スペクトル特性を、共通の、または別々のグラフ
１に同時に描出することができる。
を明確化するために、オペレータはＲＯＩ関数を使用す
ることができる（ＲＯＩ：対象領域、図１４参照）。そ
の場合、図２で記録された試料領域ＲＯＩ １およびＲ
ＯＩ ２（図１４）が描画用具３（例えば、多角形、楕
円形または閉じた弧形）によってマーキングされ、当該
スペクトル特性がラムダスタックの各λ平面毎にＲＯＩ
に含まれるｘ−ｙ画素の平均値に基づきグラフ表示され
る（グラフ１）。原則的には、選択した様々な試料箇所
の複数スペクトル特性を、共通の、または別々のグラフ
１に同時に描出することができる。
【００４１】視覚的に具象化されたスペクトル特性１に
より、選択試料箇所における蛍光放射線のスペクトル分
布が解明される。様々なＲＯＩの複数スペクトル特性を
描出することによって、例えば使用色素の放射スペクト
ルが大きく重なり合っているかどうかを究明することが
できる。様々なＲＯＩのスペクトル特性は、図１２に示
されているように、カラーコード化された多チャネル画
像（「チャネル抽出」用操作素子４、（図１４）の生成
に利用できる。
より、選択試料箇所における蛍光放射線のスペクトル分
布が解明される。様々なＲＯＩの複数スペクトル特性を
描出することによって、例えば使用色素の放射スペクト
ルが大きく重なり合っているかどうかを究明することが
できる。様々なＲＯＩのスペクトル特性は、図１２に示
されているように、カラーコード化された多チャネル画
像（「チャネル抽出」用操作素子４、（図１４）の生成
に利用できる。
【００４２】そのような多チャネル画像（図１２ｂ）の
生成では、スペクトル特性から波長領域ＲＯＩ １〜５
（図１２ａ）を選択し、例えば、当該波長領域における
各画像点の総和または平均値から当該平面におけるラム
ダスタックの強度レベルを求めることができる。但しこ
こでは、各画像チャネルは１色素を表わしている（チャ
ネル１〜チャネル５）。この操作は、加えて個別チャネ
ルの電子総和（図７参照）を求めるのにも利用できる
（「ハードウェア選択」６、（図１４）。続いて、然る
べき調整のなされた多チャネル画像を直接走査すること
ができる。
生成では、スペクトル特性から波長領域ＲＯＩ １〜５
（図１２ａ）を選択し、例えば、当該波長領域における
各画像点の総和または平均値から当該平面におけるラム
ダスタックの強度レベルを求めることができる。但しこ
こでは、各画像チャネルは１色素を表わしている（チャ
ネル１〜チャネル５）。この操作は、加えて個別チャネ
ルの電子総和（図７参照）を求めるのにも利用できる
（「ハードウェア選択」６、（図１４）。続いて、然る
べき調整のなされた多チャネル画像を直接走査すること
ができる。
【００４３】後に再利用する時のために、個別ＲＯＩ
の、即ち特殊環境下での個別色素のスペクトル特性をス
ペクトルデータバンク７（図１４）に保存することがで
きる。その場合、グラフデータに加えて、ラムダスタッ
クの記録に必要な特殊パラメータとしての使用レーザ
線、強度、フィルタ構成（ＭＤＢ、ＮＦＴ、ＥＦ）、検
出器の設定（増幅度、積分時間、ピンホールの位置およ
び直径）および被検プレパラートの周辺条件／調製に関
する付記事項も保存可能である。
の、即ち特殊環境下での個別色素のスペクトル特性をス
ペクトルデータバンク７（図１４）に保存することがで
きる。その場合、グラフデータに加えて、ラムダスタッ
クの記録に必要な特殊パラメータとしての使用レーザ
線、強度、フィルタ構成（ＭＤＢ、ＮＦＴ、ＥＦ）、検
出器の設定（増幅度、積分時間、ピンホールの位置およ
び直径）および被検プレパラートの周辺条件／調製に関
する付記事項も保存可能である。
【００４４】ラムダスタックの一定時間に亘る記録で
は、様々な時点でのスペクトル特性を求め、シリーズデ
ータとしてまとめておくことができる。続いて、これら
のデータを、例えば図１３ｂのように３次元表示により
明確化し、それより各ＲＯＩにおけるスペクトル特性の
経時変化を求めることができる。このグラフはＦＲＥＴ
（蛍光共鳴エネルギー伝達）またはＦＲＡＰ（フォトブ
リーチング後の蛍光回収）など２種またはそれ以上の蛍
光色素による検査の結果評価にも併用でき有用である
（図１３参照）。部分図ｂには蛍光信号（強度）が波長
および時間の関数で描かれている。波長領域５３０ｎｍ
〜５６０ｎｍでは信号は時間と共に増大するのが認めら
れる。図１３ａは、また別な表示形態によるものであ
る。様々な時点における個別チャネルのスペクトルが描
かれている。この場合の各部分図は、例えば１０ｎｍの
波長領域を表わしている。
は、様々な時点でのスペクトル特性を求め、シリーズデ
ータとしてまとめておくことができる。続いて、これら
のデータを、例えば図１３ｂのように３次元表示により
明確化し、それより各ＲＯＩにおけるスペクトル特性の
経時変化を求めることができる。このグラフはＦＲＥＴ
（蛍光共鳴エネルギー伝達）またはＦＲＡＰ（フォトブ
リーチング後の蛍光回収）など２種またはそれ以上の蛍
光色素による検査の結果評価にも併用でき有用である
（図１３参照）。部分図ｂには蛍光信号（強度）が波長
および時間の関数で描かれている。波長領域５３０ｎｍ
〜５６０ｎｍでは信号は時間と共に増大するのが認めら
れる。図１３ａは、また別な表示形態によるものであ
る。様々な時点における個別チャネルのスペクトルが描
かれている。この場合の各部分図は、例えば１０ｎｍの
波長領域を表わしている。
【００４５】次に、分析用アルゴリズム、例えば試料か
ら放射された総蛍光信号に対する個別色素の割合を選択
的に表示するためのアルゴリズムについて記述する。分
析は定量的または定性的に行うことができる。定量分析
では画像点毎に、試料から放射された総蛍光信号に対す
る各個別色素の割合（即ち濃度）を計算する。例えば、
成分分解分析のための一次関数式（文献：Ｌａｎｓｆｏ
ｒｄその他著“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉ
ｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ”（「バイオメディカル光学ジャ
ーナル」）第６巻（第３号）３１１〜３１８ページ、２
００１年７月刊）が使用される。
ら放射された総蛍光信号に対する個別色素の割合を選択
的に表示するためのアルゴリズムについて記述する。分
析は定量的または定性的に行うことができる。定量分析
では画像点毎に、試料から放射された総蛍光信号に対す
る各個別色素の割合（即ち濃度）を計算する。例えば、
成分分解分析のための一次関数式（文献：Ｌａｎｓｆｏ
ｒｄその他著“Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉ
ｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ”（「バイオメディカル光学ジャ
ーナル」）第６巻（第３号）３１１〜３１８ページ、２
００１年７月刊）が使用される。
【００４６】分析にはいわゆる参照スペクトルが必要で
ある。これは個別色素の蛍光スペクトルを表わすもので
ある。結果の精度は参照スペクトルの精度に決定的な影
響を受ける。従って、本発明に基づく方法では参照スペ
クトルの記録はプレパラートの検査中に同時に行う（下
記参照）。各色素がそれぞれの割合で各画像チャネルに
組み入れられる。その場合、各画像チャネルには特定色
素が１つずつ割当てられる。色素の明度は組込割合によ
って決まってくる。続いて、個別画像チャネルを１画像
にまとめ重ね合わせて表示することができる。そのよう
にして生じるのがカラーコード化された画像である（前
出コード化ラムダ参照）。
ある。これは個別色素の蛍光スペクトルを表わすもので
ある。結果の精度は参照スペクトルの精度に決定的な影
響を受ける。従って、本発明に基づく方法では参照スペ
クトルの記録はプレパラートの検査中に同時に行う（下
記参照）。各色素がそれぞれの割合で各画像チャネルに
組み入れられる。その場合、各画像チャネルには特定色
素が１つずつ割当てられる。色素の明度は組込割合によ
って決まってくる。続いて、個別画像チャネルを１画像
にまとめ重ね合わせて表示することができる。そのよう
にして生じるのがカラーコード化された画像である（前
出コード化ラムダ参照）。
【００４７】定性分析では分類を行う。即ち、各画像点
に、それぞれ試料から放射された総蛍光信号に対して最
大の割合を占める色素だけを割当てる。その割当ては、
やはり１画像内の様々な画像チャネルに対して行う。そ
の場合、各画像チャネルに特定色素を一つずつ割当てる
ことができる。それには、例えば主要成分分析（ＰＣＡ
／文献：Ｉ．Ｔ．Ｊｏｌｉｆｆｅ著“Ｐｒｉｎｃｉｐａ
ｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ”（「主要
成分分析」）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ社／ニューヨーク、１
９８６年刊）などのアルゴリズムを使用する。この種の
アルゴリズムによっていわゆる画像のマスキング（色素
マスク）が得られる。その場合、同色領域には同一色素
が存在する。
に、それぞれ試料から放射された総蛍光信号に対して最
大の割合を占める色素だけを割当てる。その割当ては、
やはり１画像内の様々な画像チャネルに対して行う。そ
の場合、各画像チャネルに特定色素を一つずつ割当てる
ことができる。それには、例えば主要成分分析（ＰＣＡ
／文献：Ｉ．Ｔ．Ｊｏｌｉｆｆｅ著“Ｐｒｉｎｃｉｐａ
ｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ”（「主要
成分分析」）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ社／ニューヨーク、１
９８６年刊）などのアルゴリズムを使用する。この種の
アルゴリズムによっていわゆる画像のマスキング（色素
マスク）が得られる。その場合、同色領域には同一色素
が存在する。
【００４８】以下では、色素蛍光分離法の作業過程を説
明する。選択されたＲＯＩのスペクトル特性がそれぞ
れ、使用された試料内色素の正に１色素の放射信号だけ
を表わしている（参照信号）という場合では、放射信号
の定量分析（例えばデジタル式成分分解５（図１４））
に、この方法を使用すれば非常に有利になる（図９
Ａ）。その場合の入力データは、基礎となるラムダスタ
ックおよびｎ個の選択試料箇所（ＲＯＩ）のスペクトル
特性である。尚、ｎは試料に使用した色素数である。定
量分析（例えば、成分分解）の結果は、それぞれ１色素
の放射信号情報しか含まないｎ個の個別チャネルからの
画像である。
明する。選択されたＲＯＩのスペクトル特性がそれぞ
れ、使用された試料内色素の正に１色素の放射信号だけ
を表わしている（参照信号）という場合では、放射信号
の定量分析（例えばデジタル式成分分解５（図１４））
に、この方法を使用すれば非常に有利になる（図９
Ａ）。その場合の入力データは、基礎となるラムダスタ
ックおよびｎ個の選択試料箇所（ＲＯＩ）のスペクトル
特性である。尚、ｎは試料に使用した色素数である。定
量分析（例えば、成分分解）の結果は、それぞれ１色素
の放射信号情報しか含まないｎ個の個別チャネルからの
画像である。
【００４９】放射信号の定量分析（例えば、デジタル式
成分分解）のための別な作業方法では、入力データとし
てラムダスタックおよびスペクトルデータバンクに予め
保存されている対応の参照スペクトルが使用される（図
９Ｂ）。この参照スペクトルは、試料（または特定領
域）にそれぞれ正に１蛍光色素だけでマーキングした実
験（較正測定）の結果から取り出すことができる。この
作業法は例えば、本来の実験では色素分布が圧倒的に局
所に限定されていて、従ってどの色素についても、他か
らの放射によるスペクトル漏話のない純粋な放射信号を
持った試料箇所が見出せない、即ちＲＯＩの書き込みが
できないという場合に必要である。
成分分解）のための別な作業方法では、入力データとし
てラムダスタックおよびスペクトルデータバンクに予め
保存されている対応の参照スペクトルが使用される（図
９Ｂ）。この参照スペクトルは、試料（または特定領
域）にそれぞれ正に１蛍光色素だけでマーキングした実
験（較正測定）の結果から取り出すことができる。この
作業法は例えば、本来の実験では色素分布が圧倒的に局
所に限定されていて、従ってどの色素についても、他か
らの放射によるスペクトル漏話のない純粋な放射信号を
持った試料箇所が見出せない、即ちＲＯＩの書き込みが
できないという場合に必要である。
【００５０】加えて、オペレータはラムダスタックの記
録前にデータバンクから参照スペクトルを選択すること
もでき、その捕捉の間にラムダスタックの定量分析（例
えば、デジタル式成分分解）を即時実施することができ
る。結果としてｎチャネルの画像がスクリーン上に表示
される。この場合、ラムダスタック・データの集約的中
間保存は省略できる。
録前にデータバンクから参照スペクトルを選択すること
もでき、その捕捉の間にラムダスタックの定量分析（例
えば、デジタル式成分分解）を即時実施することができ
る。結果としてｎチャネルの画像がスクリーン上に表示
される。この場合、ラムダスタック・データの集約的中
間保存は省略できる。
【００５１】図１１に図式化した別な方法では、定量分
析されたデータファイル（カラーコード化された画像）
および色素数に相当する参照スペクトルが、ラムダスタ
ックに代わるデータ媒体に保存される。その長所は、デ
ータファイルの規模のものが信号情報の目立った損失も
なく保存できることである。例えば、ラムダスタックが
３２の個別チャネルにより、５１２×５１２の画素点お
よび８ビットで検出される場合、画像スタックの大きさ
は約１６メガバイトである。カラーコード化された画像
の保存によればデータファイルの大きさは３２ポイント
縮小し、参照スペクトルを含めて約０.５メガバイトと
なる。参照スペクトル内のデータポイントの数は色素数
に３２を掛けた値である。
析されたデータファイル（カラーコード化された画像）
および色素数に相当する参照スペクトルが、ラムダスタ
ックに代わるデータ媒体に保存される。その長所は、デ
ータファイルの規模のものが信号情報の目立った損失も
なく保存できることである。例えば、ラムダスタックが
３２の個別チャネルにより、５１２×５１２の画素点お
よび８ビットで検出される場合、画像スタックの大きさ
は約１６メガバイトである。カラーコード化された画像
の保存によればデータファイルの大きさは３２ポイント
縮小し、参照スペクトルを含めて約０.５メガバイトと
なる。参照スペクトル内のデータポイントの数は色素数
に３２を掛けた値である。
【００５２】次に、保存データ（参照スペクトル）とカ
ラーコード化した画像からコンピュータで改めてラムダ
スタックを算出することができる。この計算は、最も簡
単な例では参照スペクトルとカラーコード化画像のそれ
ぞれの画像チャネルとを掛け合わせることによって行
う。データ削減は、特にいわゆる時系列記録の場合、正
確には３次元画像情報による時系列記録の場合に必要で
ある。
ラーコード化した画像からコンピュータで改めてラムダ
スタックを算出することができる。この計算は、最も簡
単な例では参照スペクトルとカラーコード化画像のそれ
ぞれの画像チャネルとを掛け合わせることによって行
う。データ削減は、特にいわゆる時系列記録の場合、正
確には３次元画像情報による時系列記録の場合に必要で
ある。
【００５３】その経過図式が図９Ｃに描かれているさら
に別な方法では、ラムダスタックからスタートして第１
ステップでは定性分析が行われる。この分析によって、
１つには、プレパラート内で同一色素が空間分布してい
る領域を探し出すことができる。また一つには、続く定
量分析に必要な参照スペクトルをオペレータの操作なし
に自動的に生成させることができる。例えばＰＣＡなど
の定性分析には、ラムダスタック以外に入力パラメータ
を追加する必要はない。そうして得た参照スペクトルと
ラムダスタックは、続いて、その結果がやはりカラーコ
ード化された画像として現われる定量分析のための入力
パラメータとして利用される。
に別な方法では、ラムダスタックからスタートして第１
ステップでは定性分析が行われる。この分析によって、
１つには、プレパラート内で同一色素が空間分布してい
る領域を探し出すことができる。また一つには、続く定
量分析に必要な参照スペクトルをオペレータの操作なし
に自動的に生成させることができる。例えばＰＣＡなど
の定性分析には、ラムダスタック以外に入力パラメータ
を追加する必要はない。そうして得た参照スペクトルと
ラムダスタックは、続いて、その結果がやはりカラーコ
ード化された画像として現われる定量分析のための入力
パラメータとして利用される。
【００５４】図９Ｄに基づく別な方法では、ラムダスタ
ックについて制限的な定性分析が行われる。制限的な定
性分析では、オペレータが予め定義付けした、例えば色
素データバンクに保存されているスペクトルしか対象に
できない。アルゴリズムは予備的に定義付けしたこれら
の色素スペクトルから、スペクトル分解により測定され
た蛍光信号に最も適合している目的物（即ち色素）を探
し出し、そのようにして参照スペクトルを改めて定義付
けする。
ックについて制限的な定性分析が行われる。制限的な定
性分析では、オペレータが予め定義付けした、例えば色
素データバンクに保存されているスペクトルしか対象に
できない。アルゴリズムは予備的に定義付けしたこれら
の色素スペクトルから、スペクトル分解により測定され
た蛍光信号に最も適合している目的物（即ち色素）を探
し出し、そのようにして参照スペクトルを改めて定義付
けする。
【００５５】そうして得た参照スペクトルとラムダスタ
ックは、続いて、その結果がやはりカラーコード化され
た画像として現われる定量分析のための入力パラメータ
として利用される。放射率識別色素は、様々なバイオメ
ディカル分野で、例えば細胞小室または細胞溶液内のイ
オン濃度、代謝基質濃度またはそれらの変化の測定に使
用される。
ックは、続いて、その結果がやはりカラーコード化され
た画像として現われる定量分析のための入力パラメータ
として利用される。放射率識別色素は、様々なバイオメ
ディカル分野で、例えば細胞小室または細胞溶液内のイ
オン濃度、代謝基質濃度またはそれらの変化の測定に使
用される。
【００５６】特殊な結合パートナー（例えばＣａ２＋、
Ｍｇ２＋、Ｈ＋などの配位子）との可逆的相互作用によ
り、この種色素（インド−１、ＳＮＡＲＦ／Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）の蛍光放射にスペクトルの
シフトが起こる。所定時間に観察体積で測定された放射
スペクトルについては、通例、所定体積における相対的
割合が解離定数（ＫＤ）によって表わされ、色素、配位
子間の親和性によっても特徴付けられている、２つの状
態にある色素ＦＦ（遊離色素）およびＦＢ（結合配位子
を持つ色素）（図１５Ａ）が関与している。このよう
に、ＦＦとＦＢの蛍光比率は配位子濃度の尺度である。
上記方法の適用目的は、上記装置およびオペレータの設
定するＲＯＩにより、それぞれの結合状態ＦＦおよびＦ
Ｂに所属する放射スペクトル（図１５Ｂ）を検査対象生
体系（生体内）で、または溶液中（試験管内）で測定す
ることである。
Ｍｇ２＋、Ｈ＋などの配位子）との可逆的相互作用によ
り、この種色素（インド−１、ＳＮＡＲＦ／Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）の蛍光放射にスペクトルの
シフトが起こる。所定時間に観察体積で測定された放射
スペクトルについては、通例、所定体積における相対的
割合が解離定数（ＫＤ）によって表わされ、色素、配位
子間の親和性によっても特徴付けられている、２つの状
態にある色素ＦＦ（遊離色素）およびＦＢ（結合配位子
を持つ色素）（図１５Ａ）が関与している。このよう
に、ＦＦとＦＢの蛍光比率は配位子濃度の尺度である。
上記方法の適用目的は、上記装置およびオペレータの設
定するＲＯＩにより、それぞれの結合状態ＦＦおよびＦ
Ｂに所属する放射スペクトル（図１５Ｂ）を検査対象生
体系（生体内）で、または溶液中（試験管内）で測定す
ることである。
【００５７】イオン敏感性の放射率識別色素の場合で
は、これは無イオン条件または飽和条件の設定によって
達成される。参照スペクトルは定性分析によっても求め
ることができる。その場合では、オペレータが色素成分
数（記述の方法では図１５Aに従いＦＦおよびＦＢの２
成分）を予備設定しておけば有利である。この参照スペ
クトルは、一ラムダスタックまたは定量分析（例えば、
一次関数式の成分分解アルゴリズム）により様々な時点
でまたは様々な試料平面で記録された一連のラムダスタ
ックの画像点における蛍光放射に対する色素状態（ＦＦ
またはＦＢ）の割合を計算するのに利用できる（図
９）。
は、これは無イオン条件または飽和条件の設定によって
達成される。参照スペクトルは定性分析によっても求め
ることができる。その場合では、オペレータが色素成分
数（記述の方法では図１５Aに従いＦＦおよびＦＢの２
成分）を予備設定しておけば有利である。この参照スペ
クトルは、一ラムダスタックまたは定量分析（例えば、
一次関数式の成分分解アルゴリズム）により様々な時点
でまたは様々な試料平面で記録された一連のラムダスタ
ックの画像点における蛍光放射に対する色素状態（ＦＦ
またはＦＢ）の割合を計算するのに利用できる（図
９）。
【００５８】続いて、２種の画像チャネルに組み込まれ
た信号の画素単位での区分により、色素濃度に依存しな
い、配位子濃度Ｒの準一次関数的尺度（比率、図１
０）、その空間分布および／または時間関数の動力学デ
ータが得られる。それぞれの放射率識別色素および既知
の配位子濃度によって検証された試験管内または生体内
の較正データを基に、Ｒの値から絶対濃度データを求め
ることができる（方程式の較正、滴定の較正）。
た信号の画素単位での区分により、色素濃度に依存しな
い、配位子濃度Ｒの準一次関数的尺度（比率、図１
０）、その空間分布および／または時間関数の動力学デ
ータが得られる。それぞれの放射率識別色素および既知
の配位子濃度によって検証された試験管内または生体内
の較正データを基に、Ｒの値から絶対濃度データを求め
ることができる（方程式の較正、滴定の較正）。
【００５９】記述の方法に準じて、例えば下記のような
２色素の配合を利用することもできる： （１）同一の配位子と相互反応をする２色素 （２）放射重心に差はないが、配位子結合によってそれ
に変化が現われる２色素 （３）蛍光収量が、配位子結合に依存して互いに逆方向
に変化する２色素（例えば、フルオ−３とフラレッド／
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）
２色素の配合を利用することもできる： （１）同一の配位子と相互反応をする２色素 （２）放射重心に差はないが、配位子結合によってそれ
に変化が現われる２色素 （３）蛍光収量が、配位子結合に依存して互いに逆方向
に変化する２色素（例えば、フルオ−３とフラレッド／
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）
【００６０】ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー伝達）と
は、励起された蛍光団（供与体）の光子エネルギーが、
他の蛍光団（受容体）へ放射なしに伝達されることであ
る。その前提条件は、特に、供与体放射スペクトルと受
容体励起スペクトルのオーバラッピングおよび供与体と
受容体の緊密な空間会合である。バイオメディカル分野
では、このＦＲＥＴ現象は、例えば、イオン濃度または
代謝基質濃度（Ｃａ２＋、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ）あるい
はそのほか配位子依存性の構造変化（例えば、タンパク
質のフォスフォリル化状態、ＤＮＡの配座変化）の測
定、追跡に利用される。
は、励起された蛍光団（供与体）の光子エネルギーが、
他の蛍光団（受容体）へ放射なしに伝達されることであ
る。その前提条件は、特に、供与体放射スペクトルと受
容体励起スペクトルのオーバラッピングおよび供与体と
受容体の緊密な空間会合である。バイオメディカル分野
では、このＦＲＥＴ現象は、例えば、イオン濃度または
代謝基質濃度（Ｃａ２＋、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ）あるい
はそのほか配位子依存性の構造変化（例えば、タンパク
質のフォスフォリル化状態、ＤＮＡの配座変化）の測
定、追跡に利用される。
【００６１】これは、ＦＲＥＴパートナーである供与体
と受容体（例えば、合成フルオロクロムＦＩＴＣとロー
ダミン、または遺伝学上コード化された蛍光タンパク質
ＣＦＰとＹＦＰ）のカップリングによって、つまり観察
対象イオン、代謝基質または配位子との特有な相互作用
によって二次構造に変化の現われる分子（例：宮脇その
他“Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ”
（「アメリカ国立科学アカデミー議事録」第９６巻、２
１３５〜２１４０ページ、図１７／１９９９年３月刊）
への、あるいは永続的に、または周辺条件に依存して相
互作用する２つの分子のそれぞれ１つへのカップリング
によって行われる。
と受容体（例えば、合成フルオロクロムＦＩＴＣとロー
ダミン、または遺伝学上コード化された蛍光タンパク質
ＣＦＰとＹＦＰ）のカップリングによって、つまり観察
対象イオン、代謝基質または配位子との特有な相互作用
によって二次構造に変化の現われる分子（例：宮脇その
他“Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ”
（「アメリカ国立科学アカデミー議事録」第９６巻、２
１３５〜２１４０ページ、図１７／１９９９年３月刊）
への、あるいは永続的に、または周辺条件に依存して相
互作用する２つの分子のそれぞれ１つへのカップリング
によって行われる。
【００６２】図１６は、ＦＲＥＴパートナーについてそ
れぞれ供与体と受容体間の距離が異なる場合の放射スペ
クトルを示している（Ａ：距離が大きくＦＲＥＴなし／
Ｂ：距離が小さくＦＲＥＴ相互作用あり）。双方いずれ
の場合も、遊離ＦＲＥＴ系と配位子結合ＦＲＥＴ系の観
察体積に占める割合の差は、ＦＲＥＴ系の蛍光放射にお
けるスペクトル差に関係している。供与体蛍光を優先的
に励起する場合、配位子結合の増減は、両ＦＲＥＴパー
トナーの蛍光放射増幅における逆方向の変化として現わ
れる（図１６）。
れぞれ供与体と受容体間の距離が異なる場合の放射スペ
クトルを示している（Ａ：距離が大きくＦＲＥＴなし／
Ｂ：距離が小さくＦＲＥＴ相互作用あり）。双方いずれ
の場合も、遊離ＦＲＥＴ系と配位子結合ＦＲＥＴ系の観
察体積に占める割合の差は、ＦＲＥＴ系の蛍光放射にお
けるスペクトル差に関係している。供与体蛍光を優先的
に励起する場合、配位子結合の増減は、両ＦＲＥＴパー
トナーの蛍光放射増幅における逆方向の変化として現わ
れる（図１６）。
【００６３】ここに記述した方法を、例えば上記ＦＲＥ
Ｔ測定に利用する目的は、試料をＦＲＥＴパートナーＦ
Ｌ１（供与体励起λ１）の最適励起付近の光で照射する
ことにある。単一ラムダスタックまたはラムダスタック
・シリーズ（ｚまたはｔ）形式の多チャネル検出器で捕
捉されるスペクトル領域は、両ＦＲＥＴパートナーの放
射領域を含んでいる（図１８（１Ａ））。ＲＯＩ（上記
参照）の定義付けによってスペクトル特性の時間的状況
を明らかにすることができる（図１８（１Ｂ））。
Ｔ測定に利用する目的は、試料をＦＲＥＴパートナーＦ
Ｌ１（供与体励起λ１）の最適励起付近の光で照射する
ことにある。単一ラムダスタックまたはラムダスタック
・シリーズ（ｚまたはｔ）形式の多チャネル検出器で捕
捉されるスペクトル領域は、両ＦＲＥＴパートナーの放
射領域を含んでいる（図１８（１Ａ））。ＲＯＩ（上記
参照）の定義付けによってスペクトル特性の時間的状況
を明らかにすることができる（図１８（１Ｂ））。
【００６４】ラムダスタックとして記録された蛍光信号
は、次に定量分析（例えば、一次関数的な成分分解分
析）にかける（図１８（２））。それに必要な参照スペ
クトルは、先ずは例えばＦＲＥＴパートナーの一方しか
含まない調製液中、つまり溶液中（生体内または試験管
内）で励起波長（λ１、供与体励起）においてラムダス
タックを記録し、ＲＯＩ関数を利用することによって求
めることができる（上記および図９参照）。
は、次に定量分析（例えば、一次関数的な成分分解分
析）にかける（図１８（２））。それに必要な参照スペ
クトルは、先ずは例えばＦＲＥＴパートナーの一方しか
含まない調製液中、つまり溶液中（生体内または試験管
内）で励起波長（λ１、供与体励起）においてラムダス
タックを記録し、ＲＯＩ関数を利用することによって求
めることができる（上記および図９参照）。
【００６５】定量分析の結果判明したチャネルにおける
ＲＯＩの定義付けより、ＦＲＥＴパートナーの蛍光強度
およびその経時変化をグラフに描くことが可能になる。
定量分析（成分分解分析またはＰＣＡ）の結果判明した
両画像チャネルの画素単位の区分から、その画素値が蛍
光共鳴エネルギ伝達またはＦＲＥＴシステム／配位子相
互反応の尺度になっていて（図１８（３））、適当な較
正データ（滴定の較正など）を基に、例えば観察対象の
イオン、代謝基質、配位子の各濃度の算出ができる画像
を得ることができる。
ＲＯＩの定義付けより、ＦＲＥＴパートナーの蛍光強度
およびその経時変化をグラフに描くことが可能になる。
定量分析（成分分解分析またはＰＣＡ）の結果判明した
両画像チャネルの画素単位の区分から、その画素値が蛍
光共鳴エネルギ伝達またはＦＲＥＴシステム／配位子相
互反応の尺度になっていて（図１８（３））、適当な較
正データ（滴定の較正など）を基に、例えば観察対象の
イオン、代謝基質、配位子の各濃度の算出ができる画像
を得ることができる。
【００６６】上記方法の別な適用例として、それぞれの
検査において対象から外れた、または分析の支障になる
信号の分離に使用されることがある。そのような可能性
のあるのは、例えば背景光、自己蛍光、後方散乱励起光
または室内光の場合である。まずは、それ以上着色され
ない対照光線（自己蛍光、後方散乱励起光）の中で、あ
るいはプレパラート不在の光線（背景光、室内光）下で
この信号のスペクトル分布を求めれば、そうして得られ
たスペクトルも検査対象色素の参照スペクトルと同様、
一次関数的成分分解分析に加えることができる（図９お
よび１０）。それらは成分分解後に別々の画像チャネル
に割り振られ、検査対象信号から分離されるので、検査
対象信号は別途観察することができる。
検査において対象から外れた、または分析の支障になる
信号の分離に使用されることがある。そのような可能性
のあるのは、例えば背景光、自己蛍光、後方散乱励起光
または室内光の場合である。まずは、それ以上着色され
ない対照光線（自己蛍光、後方散乱励起光）の中で、あ
るいはプレパラート不在の光線（背景光、室内光）下で
この信号のスペクトル分布を求めれば、そうして得られ
たスペクトルも検査対象色素の参照スペクトルと同様、
一次関数的成分分解分析に加えることができる（図９お
よび１０）。それらは成分分解後に別々の画像チャネル
に割り振られ、検査対象信号から分離されるので、検査
対象信号は別途観察することができる。
【００６７】λスタック：検出チャネルで検出した光線
を分散分割下で測定し、少なくとも１つの補助的（画像
点）座標ｘ、ｙおよび／またはｚおよび／または測定時
間ｔへ分類の上、記憶素子に保存した画像点毎のスペク
トル分布 定量分析：試料からの総信号（例えば、蛍光信号）に対
する各スペクトル特性の持分（割合）を画像点毎に計算
する（成分分解法）。この計算は、個々のスペクトル発
光体（例えば、色素）のスペクトルを特徴付け、画像を
生成する（ＲＯＩ）データバンクに保存されている、ま
たは定性分析（ＰＣＡ）により生成される参照スペクト
ルによって行われる。 画像チャネル：試料の画像表示において色をそれぞれの
選択スペクトル領域に振り分ける（擬似色表示）。その
場合、例えば然るべきフィルタ使用のもと複数の検出チ
ャネルで測定した色強度は、色素／スペクトル特性の割
合に一致している。試料領域に複数のスペクトル特性／
色素が含まれていれば、複数色の画像表示が重なったカ
ラーコード化画像（配合画像）が生成される。 定性分析：試料からの総信号に対して最大の関与割合を
持つスペクトル特性／色素を各画像点に振り当てる。 色素マスク：異なった箇所のスペクトル特性／色素を別
々の色で表示する。その場合、強度はそれぞれ均等にす
る。 ＲＯＩ：オペレータによって選択、マーキングされた領
域。その場合、同一のスペクトル特性／色素領域は定性
分析により自動的に検索、マーキングできる。
を分散分割下で測定し、少なくとも１つの補助的（画像
点）座標ｘ、ｙおよび／またはｚおよび／または測定時
間ｔへ分類の上、記憶素子に保存した画像点毎のスペク
トル分布 定量分析：試料からの総信号（例えば、蛍光信号）に対
する各スペクトル特性の持分（割合）を画像点毎に計算
する（成分分解法）。この計算は、個々のスペクトル発
光体（例えば、色素）のスペクトルを特徴付け、画像を
生成する（ＲＯＩ）データバンクに保存されている、ま
たは定性分析（ＰＣＡ）により生成される参照スペクト
ルによって行われる。 画像チャネル：試料の画像表示において色をそれぞれの
選択スペクトル領域に振り分ける（擬似色表示）。その
場合、例えば然るべきフィルタ使用のもと複数の検出チ
ャネルで測定した色強度は、色素／スペクトル特性の割
合に一致している。試料領域に複数のスペクトル特性／
色素が含まれていれば、複数色の画像表示が重なったカ
ラーコード化画像（配合画像）が生成される。 定性分析：試料からの総信号に対して最大の関与割合を
持つスペクトル特性／色素を各画像点に振り当てる。 色素マスク：異なった箇所のスペクトル特性／色素を別
々の色で表示する。その場合、強度はそれぞれ均等にす
る。 ＲＯＩ：オペレータによって選択、マーキングされた領
域。その場合、同一のスペクトル特性／色素領域は定性
分析により自動的に検索、マーキングできる。
【図１】一光子吸収（ａ）、多重光子吸収（ｂ）
【図２】現状技術の共焦点レーザ走査型顕微鏡
【図３】色素の放射スペクトル（ａ）、色素ＣＦＰおよ
びシアンＦＰについて波長別の放射信号（ｂ）、放射信
号の波長の関数（ｃ）
びシアンＦＰについて波長別の放射信号（ｂ）、放射信
号の波長の関数（ｃ）
【図４】カルシウムイオンの濃度に依存するインド−１
の放射スペクトル（ａ）、カルシウムイオン濃度に依存
するフルオ−３とフラレッド色素との組み合わせの放射
スペクトル
の放射スペクトル（ａ）、カルシウムイオン濃度に依存
するフルオ−３とフラレッド色素との組み合わせの放射
スペクトル
【図５】検出器ユニットの構成図
【図６】検出器ユニットを光学的ビーム光路として用い
た場合の実施態様
た場合の実施態様
【図７】検出器の個別チャネルに対する読出し装置の図
式
式
【図８】ＬＳＭ画像内のＲＯＩの分布状態（ａ）、放射
スペクトル（ｂ）
スペクトル（ｂ）
【図９】本発明方法の経過図式
【図１０】一次関数的成分分解分析の図式
【図１１】本発明の別の方法の図式
【図１２】ＲＯＩのスペクトル特性（ａ）、多チャネル
画像（ｂ）
画像（ｂ）
【図１３】スペクトル特性データの３次元表示（Ａ）、
蛍光信号の波長および時間関数（Ｂ）
蛍光信号の波長および時間関数（Ｂ）
【図１４】装置パネル
【図１５】蛍光放射のスペクトルシフト（Ａ）、蛍光比
率（Ｂ）
率（Ｂ）
【図１６】供与体と受容体間の距離が異なる場合のＦＲ
ＥＴパートナーの放射スペクトル、距離が大きくＦＲＥ
Ｔなし（Ａ）、距離が小さくＦＲＥＴ相互作用あり
（Ｂ）
ＥＴパートナーの放射スペクトル、距離が大きくＦＲＥ
Ｔなし（Ａ）、距離が小さくＦＲＥＴ相互作用あり
（Ｂ）
【図１７】ＦＲＥＴパートナーである供与体と受容体の
カップリング
カップリング
【図１８】ラムダスタックまたはラムダスタック・シリ
ーズ形式の多チャネル検出器で捕捉されるスペクトル領
域
ーズ形式の多チャネル検出器で捕捉されるスペクトル領
域
ＥＦ ダイクロイック・ブロックフィルタ
ＰＭＴ 点像検出器
ＤＢＳ 副ビームスプリッタ
ＰＯ 結像レンズ系
ＰＨ 絞り（ピンホール）
ＤＩ 角分散素子
ＤＥ ライン検出器
Ｓ 放射信号
ＥＳ 電気信号
Ｌ 光
ＰＯ ピンホールレンズ系
Ｓ２ 結像鏡
Ｇ 線形格子
Ａ 第１増幅器
Ｉ 積分器
Ｋ 比較器
ＳＲ スイッチ・レジスタ
Ｖ 付属連結器
Ａ１ 増幅器
ＰＣ コンピュータ
４ チャネル抽出用操作素子
５ デジタル式成分分解
６ ハードウェア選択用操作素子
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ベルンハルト ジンメルマン
ドイツ国 14482 ポツダム アルト ノ
ヴァーヴェズ 62
(72)発明者 セバスチャン タイル
アメリカ合州国 Ｎ．Ｙ． 10570 プレ
ザントビレー ニューストリート ８
Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA16 DA02 EA01 FA01
FA02 FA06 GA04 GB01 HA01
HA02 HA09 HA15 JA02 JA04
JA05 KA02 KA09 LA02 LA03
NA01 NA06
Claims (29)
- 【請求項１】特にレーザ走査型顕微鏡、蛍光式検査装置
または流動細胞計量計の操作によって、複数の試料点、
つまり分布点における試料からの放射光線をスペクトル
分割する試料の検査方法において、 スペクトル分布を個別検出チャネルで測定し、その信号
を位置座標ｘ、ｙまたはｚの少なくとも１つまたは測定
時点ｔを持つ検出信号に割り振り保存することによって
λスタックを形成する検査方法。 - 【請求項２】色またはスペクトル領域に応じて配分され
た画像チャネルおよび色配分を基に擬似色画像を生成す
る請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】入力手段により、または自動的に検査対象
試料領域としてのＲＯＩがマーキングされる前記請求項
の１に記載の方法。 - 【請求項４】ＲＯＩを参照スペクトルの生成に利用する
前記請求項の１に記載の方法。 - 【請求項５】試料領域内に複数の色素が含まれている場
合に、複数の画像チャネルを重ね合わすことによりカラ
ーコード化された画像を生成する前記請求項の１に記載
の方法。 - 【請求項６】入力手段により対象試料領域としてＲＯＩ
をマーキングし、それより参照スペクトルを形成し、そ
の参照スペクトルに基づき定量分析することによってカ
ラーコード化された画像を生成する前記請求項の１に記
載の方法。 - 【請求項７】入力手段により対象試料領域としてＲＯＩ
をマーキングし、データバンク保存の参照スペクトルを
用いて定量分析を行う前記請求項の１に記載の方法。 - 【請求項８】定量分析を行う上に、参照スペクトルの形
成および保存に利用するためのＲＯＩとして対象試料領
域を形成する前記請求項の１に記載の方法。 - 【請求項９】色素データバンクに基づいて定量分析およ
び表示される色素の選択のための入力手段を備える前記
請求項の１に記載の方法。 - 【請求項１０】色素データバンクがマーキングされたＲ
ＯＩで生成される請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】複数の画像チャネルの重なりによって生
じるカラーコード化画像から、イオン濃度測定のために
スペクトル成分の比率を求める前記請求項の１に記載の
方法。 - 【請求項１２】自己蛍光、反射または不特定の蛍光な
ど、好ましくない信号に相当する画像チャネルまたは検
出チャネルが切断される前記請求項の１に記載の方法。 - 【請求項１３】保存されたカラーコード化画像および参
照スペクトルから、個別検出チャネルにより測定された
スペクトル分布に相当するλスタックを算出する前記請
求項の１に記載の方法。 - 【請求項１４】このλスタックから別なカラーコード化
画像を形成および／またはＲＯＩをマーキングおよび評
価する請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】スペクトル分布が、まとめて検出され、
画像チャネルの割当てられる検出スペクトル幅が変更で
きる前記請求項の１に記載の方法。 - 【請求項１６】ＲＯＩのスペクトルを評価する前記請求
項の１に記載の方法。 - 【請求項１７】スペクトル幅設定のための調整素子を備
える前記請求項の１に記載の方法。 - 【請求項１８】調整スペクトル幅を、デジタル信号結合
または検出チャネルの電子結合によって生成する前記請
求項の１に記載の方法。 - 【請求項１９】調整素子およびスペクトル幅のモニタ上
での表示を、スペクトル幅調整素子の調整領域に空間が
取れるように行う前記請求項の１に記載の方法。 - 【請求項２０】モニタ上でのポジションが当該スペクト
ル領域のポジションに相当するスライダ制御器を備える
前記請求項の１に記載の方法。 - 【請求項２１】コンピュータマウスのカーソルを、調整
素子に設定した場合は調整波長が、２つの調整素子間に
設定した場合は調整波長領域がモニタ上に表示される前
記請求項の１に記載の方法。 - 【請求項２２】モニタ上に試料部分領域または試料全体
の経時状況を波長別に表示する前記請求項の１に記載の
方法。 - 【請求項２３】各ｘ、ｙ画素ポジション毎に、当該波長
領域に亘って強度最高値を求めて表示し、それによりラ
ムダスタックからグレー階調画像を生成する前記請求項
の１に記載の方法。 - 【請求項２４】各画素を、さらにラムダスタックの最高
明度画素が属する波長領域の平均波長に相当する色によ
って特徴付ける請求項２３に記載の方法。 - 【請求項２５】ラムダスタックの個別画像を、画像スク
リーン上に並列的または相前後させて少なくとも部分的
にはシリーズ形式で表示する前記請求項の１に記載の方
法。 - 【請求項２６】ｘｙ、ラムダ表示のほかに時間関数およ
び／またはｚ関数の図面を生成し表示する前記請求項の
１に記載の方法。 - 【請求項２７】ラムダスタックを、切断し、生じた切断
画像を表示する前記請求項の１に記載の方法。 - 【請求項２８】定量分析に成分分解法が含まれている前
記請求項の１に記載の方法。 - 【請求項２９】定性分析に、ＰＣＡ法が含まれる前記請
求項の１に記載の方法。
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