DE102021102601A1

DE102021102601A1 - Verfahren zur Analyse von Veränderungen von Signaturen von Schlüsselmetaboliten in biologischen Proben

Info

Publication number: DE102021102601A1
Application number: DE102021102601.6A
Authority: DE
Inventors: Anuradha Ramoji; Adrian Tibor Press; Jürgen Popp; Michael Bauer
Original assignee: JENA, University of; Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU; Universitaetsklinikum Jena; Leibniz Institut fuer Photonische Technologien eV
Current assignee: Universitaetsklinikum Jena Koerperschaft Des De; Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU; Leibniz Institut fuer Photonische Technologien eV
Priority date: 2021-02-04
Filing date: 2021-02-04
Publication date: 2022-08-04
Also published as: WO2022167521A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüssel-Metaboliten bei einer Erkrankung, umfassend(a) die Ermittlung gewünschter Messareale in der biologischen Probe anhand eines, mittels optischer Methoden erzeugten Bildes der biologischen Probe,(b) ein bild-basiertes Screening der in Schritt (a) ermittelten gewünschten Messareale mittels mindestens einer spektroskopischen Methode, umfassend◯ die Identifikation und Quantifizierung von Schlüssel-Metaboliten der Stoffwechselerkrankung,◯ die Erfassung von Änderungen der Schlüssel-Metaboliten der Stoffwechselerkrankung, und(c) die Diagnose einer Erkrankung oder die Bestimmung der Verteilung der Schlüssel-Metaboliten in der biologischen Probe. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders für die Diagnose von Stoffwechselerkrankungen und proliferativen Erkrankungen.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüssel-Metaboliten bei einer Erkrankung, umfassend

(a) die Ermittlung gewünschter Messareale in der biologischen Probe anhand eines, mittels optischer Methoden erzeugten Bildes der biologischen Probe,
(b) ein bild-basiertes Screening der in Schritt (a) ermittelten gewünschten Messareale mittels mindestens einer spektroskopischen Methode, umfassend
- ◯ die Identifikation und Quantifizierung von Schlüssel-Metaboliten der Stoffwechselerkrankung,
- ◯ die Erfassung von Änderungen der Schlüssel-Metaboliten der Stoffwechselerkrankung, und
(c) die Diagnose einer Erkrankung oder die Bestimmung der Verteilung der Schlüssel-Metaboliten in der biologischen Probe.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders für die Diagnose von Stoffwechselerkrankungen und proliferativen Erkrankungen.
Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der individualisierten Medizin. Diese spielt insbesondere bei komplexen Krankheitsverläufen eine Rolle. Das Konzept der „individualisierten“ oder „personalisierten“ Versorgung, das eine Stratifizierung des Patienten auf der Grundlage einer besseren Einschätzung des komplexen Krankheitsverlaufs impliziert, ist eine Herausforderung, die für Schwerkranke jedoch viel versprechend ist. Eine umfassendere Überwachung des Stoffwechsels mit Hilfe der Massenspektrometrie zur Beurteilung des „Metaboloms“, d.h. der „Metabolomik“, hält derzeit Einzug in die klinische Routine.¹ Diese Technik kann in einem „ungezielten“ Ansatz oder zur Überwachung spezifischer Gruppen von Analyten durchgeführt werden. Das Metabolom als komplexes Reaktionsnetzwerk fasst alle charakteristischen Stoffwechsel-Eigenschaften einer Zelle bzw. eines Gewebes oder Organismus zusammen. Der Begriff Metabolom wurde als „Summe aller Stoffwechselprodukte (Metabolite)“ in Analogie zu den Begriffen Genom, Transkriptom und Proteom geprägt und entsprechend benannt. Das Wort leitet sich von Metabolismus (= Stoffwechsel) ab. Gelegentlich wird für Metabolom auch die Bezeichnung Metabonom verwendet, besonders im Zusammenhang mit der Toxizitätsbeurteilung von Wirkstoffen.
Das Metabolom umfasst:

• die Durchflussraten (= Umsatzraten), Metabolit-Spiegel und Enzym-aktivitäten der einzelnen Stoffwechselwege,
• die Interaktionen zwischen den verschiedenen Stoffwechselwegen sowie
• die Kompartimentierung der verschiedenen Stoffwechselwege innerhalb der Zellen.

Ein weiterer Gesichtspunkt ist der Einfluss des Nährstoff-Angebotes sowie der Effekt von Wirksubstanzen auf den Stoffwechsel und die verschiedenen Funktionen der Zellen, wie Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose.
Die Erforschung des Metaboloms wird als Metabolomik bezeichnet (im Englischen metabolomics oder metabonomics). Diese umfasst die Wechselwirkung der darin enthaltenen Metabolite, deren Identifizierung und Quantifizierung (vgl. Proteom und Genom). Als wesentliche Analysenmethoden werden in der Metabolomik GC/MS und LC/MS sowie NMR-Spektroskopie und Ionen-Mobilitäts-Spektrometer eingesetzt. Dabei kann man die Methoden aufspalten in Separationstechniken, Ionisationstechniken und Detektionstechniken. Da die Metaboliten von ihrer chemischen Zusammensetzung und Struktur sehr unterschiedlich sein können, reicht es oft nicht aus, nur eine Analysemethode zu benutzen, um das Metabolom eines Organismus komplett aufzuklären. Dazu kommt, dass es bis heute nicht bekannt ist, wie viele Stoffwechselprodukte es überhaupt gibt. Die häufigsten Probentypen sind Körperflüssigkeiten wie Plasma oder Serum, aber auch Harn, Liquor cerebrospinalis, Synovialflüssigkeit, Sputum oder Lavagen. Daneben kommen Gewebshomogenate bzw. Zellen oder Überstände von Zellkulturen in Betracht.
Im Bereich der Lebererkrankungen werden mit Hilfe der Massenspektrometrie Analyten wie z.B. die unkonjugierten und Glycin/Taurin-konjugierten primären Gallensäuren erfasst, wie in der Studie von Vanwijngarden et al. ⁴ Während Bilirubin traditionell ausschließlich zur Überwachung der ausscheidenden Leberfunktion auf der Intensivstation dient, z.B., im am weitesten verbreiteten Scoringsystem für multiple Organdysfunktionen, dem Sepsis-related (manchmal auch Sequential) organ failure assessment (SOFA)-Score,² deuten neuere Erkenntnisse daraufhin, dass Gallensäuren eine Leberfunktionsstörung mit höherer Sensitivität und Spezifität anzeigen könnten,³ oder zumindest weitgehend unabhängig von Bilirubin erhöht sein könnten.⁴ In jedem Fall können diese bescheidenen Erhöhungen des Bilirubins, selbst unter Berücksichtigung der Ungenauigkeit der gegenwärtigen klinischen Methoden zur Beurteilung kleinster Veränderungen, mit einer ausgeprägten Beeinträchtigung des Metabolismus der Phasen I und II in Verbindung gebracht werden, was bei diesen Patienten mit einer negativen Prognose assoziiert ist.⁵Neben der Analyse von Metaboliten aus dem Plasma und Serum mit der Massenspektrometrie werden in der klinischen Funktionsdiagnostik bislang zahlreiche verschiedene Methoden eingesetzt, um Stoffwechselstörungen zu diagnostizieren. Dazu gehören biochemische Assays (die sogenannte klinische Chemie), die Atemgasanalytik und die Pulsdensitometrie. Stoffwechselstörungen der Leber werden zum einen mit Hilfe von endogenen Clearance-Assays untersucht. Die biochemische Messung von Enzymaktivitaten (Transaminasen, alkaline Phosphatase) werden zur Beurteilung des Leberschadens herangezogen, und zusammen mit Leberfunktion assoziierten Metaboliten (Cholesterin, Bilirubin, Albumin) zur Untersuchung der Leberfunktion kombiniert..
Des Weiteren kommen klinisch exogene Clearance-Assays zum Einsatz. Dazu gehören unter anderem:

- der Indocyaningrün-Test (fluoreszenzbasierte Messung der exkretorischen Funktion);
- der Galaktosebelastungstest (Injektion von Galaktose und Messung des Anteils, der über die Niere ausgeschieden wird);
- der C¹⁴-Aminopyrin oder ¹⁴C-Galaktose Atemtest; und
- die Koffein-Clearance.

Unterstützt werden diese Assays im experimentellen Bereich mit bildgebenden Untersuchungsmethoden, die auf dem Matrix- Assistierten Laser-Desorption-Ionisierungs (MALDI) Imaging beruhen.
Die konventionell eingesetzten Methoden weisen jedoch zahlreiche Nachteile auf. Biochemische Assays bedürfen oft einer aufwändigen Probenvorbereitung und Präanalytik. Kritisch ist der Transport der meist empfindlichen biologischen Proben. Atemgasanalytik ist sehr aufwändig. Massenspektrometrische Untersuchungen (auch in Kombination mit exogener Clearance) sind sehr zeitaufwändig und stellen hohe Anforderungen an die Probenvorbereitung und Präanalytik. Dazu kommen zahlreiche klinische Nachteile. Biochemische Assays sind oft unpräzise, d.h. besitzen eine geringe Spezifität, und geben keinen genauen Aufschluss über den Stand der Dysfunktion. Oftmals basiert die Einschätzung auch auf Leberschädigungsparametern, die nur teilweise auf den Funktionsverlust und die Art des Funktionsverlusts hinweisen. Eine Differenzierung des Leberschadens ist mit diesen Assays nicht möglich. Die Atemgasanalytik ist in der Regel zeitaufwändig und bringt wenig Mehrgewinn. Es werden nur einzelne Analyte untersucht. Die Aussagekraft beschränkt sich hier, genauso wie bei der Fluoreszenzangiographie (Indocyanin Clearance Test) auf die Aussage der Leberfunktion. Die Art der Funktionsstörung kann nur indirekt beurteilt werden. Bei der Bildgebung von Metaboliten (Forschung) mittels MALDI gestaltet sich die Probenpräparation sehr aufwendig: Es werden spezielle beschichtete (Matrix) Objektträger verwendet. Für verschiedene Metabolitengruppen müssen verschiedene Beschichtungen verwendet werden. Bestimmte Metabolitengruppen können nicht gleichzeitig an einer Probe vermessen werden. Durch die Bildgebung wird die Probe in der Regel zerstört, eine Analytik im Anschluss ist nicht möglich. Die maximale erzielbare Auflösung ist relativ gering (Mikrometer-Maßstab).
Es besteht deshalb der Bedarf, verbesserte Methoden für eine umfassendere Beurteilung des Stoffwechsels und des Metaboloms bereitzustellen. Im Bereich der Lebererkrankungen werden solche verbesserten Methoden wahrscheinlich die vorgefasste Vorstellung einer Leberfunktionsstörung, die ein eher spätes und seltenes Ereignis auf der Intensivstation widerspiegelt, in Frage stellen und könnten geeignete Instrumente sein, um die hepatobiliäre Funktion besser zu überwachen sowie die metabolischen Bedürfnisse und die Ernährungsunterstützung bei Schwerkranken zu personalisieren ⁶.
US5615673A beschreibt ein Raman-(Hand)Gerät für die Blutgasanalyse im Allgemeinen. Die Analysemethode basiert auf Raman-Streuung ohne spezielle Auflösung.
US7524671 B2 beschreibt ein Raman-(Hand)Gerät für die Analyse von Blutanalyten im Allgemeinen. Die Analysemethode basiert auf Raman-Streuung ohne spezielle Auflösung.
US6031233 B2 beschreibt ein Infrarot-Gerät für die Blutanalyse im Allgemeinen. Die Analysemethode basiert auf IR-Absorption ohne spezielle Auflösung.
US20070178067 A1 beschreibt einen technischen Ansatz zur Identifizierung verschiedener Zellen/Zelltypen in einer zytologischen Biopsie.
Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, Methoden für eine umfassendere Beurteilung des Stoffwechsels und des Metaboloms bereitzustellen, die die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen.
Zur Lösung dieser Aufgabe stellt die Erfindung ein Verfahren zur Analyse von biologischen Proben nach Veränderungen von Signaturen von Schüsselmetaboliten bei einer Erkrankung gemäß Anspruch 1 bereit.
Erfindungsgemäß wird unter einer „biologischen Probe“ jede Art biologischen Materials verstanden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Blut, Plasma, Liquor, Urin, Speichel, (eu, und prokaryotische) Zellen (z.B. Fibroblasten, Bakterien), infektiöse organische Strukturen (z.B. Viren), Gewebe oder jede andere Probe, die Schlüsselmetaboliten enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Menge an Schlüsselmetaboliten in einer Körperflüssigkeitsprobe nachgewiesen, die von einem Säugetier, am meisten bevorzugt einem Menschen, stammt. Der Begriff „Körperflüssigkeit“ bezieht sich auf alle Flüssigkeiten, die im menschlichen Körper vorhanden sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Blut, Lymphe, Urin und Zerebrospinalflüssigkeit (CSF), die Schlüsselmetabolite enthalten. Die Blutprobe kann eine Plasmaprobe oder eine Serumprobe oder von diesen Proben abgeleitete Fraktionen umfassen. Die Probe kann vor der Verwendung behandelt werden, z. B. durch Aufbereitung von Plasma aus Blut, Verdünnung viskoser Flüssigkeiten und dergleichen. Vorzugsweise wird die Plasmaprobe mit einem Antikoagulans, wie z. B. EDTA, behandelt.
Die biologische Probe kann auch eine Gewebeprobe oder eine Biopsie sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die biologische Probe eine Probe, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Blut, Blutplasma, Blutserum, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (cerebrospinal fluid, CSF), Urin, Speichel, eine Gewebeprobe, eine Biopsie, Zellen und eine Zellkultur.
In einer Ausführungsform der Erfindung schließt das Verfahren zur Analyse von biologischen Proben nach Veränderungen von Signaturen von Schüsselmetaboliten bei einer Erkrankung den Schritt der Entnahme der biologischen Probe von einem Probanden ein. Besonders bevorzugt ist es jedoch, wenn das erfindungsgemäße Verfahren an einer biologischen Probe durchgeführt, die zuvor von einem Probanden entnommen worden ist.
Der Begriff „Proband“ bezieht sich auf ein Säugetier, das an einer Erkrankung, wie beispielsweise einer Stoffwechselerkrankung oder einer Krebserkrankung leidet oder bei dem der Verdacht besteht, dass es daran leidet. Vorzugsweise bezieht sich der Begriff „Proband“ auf einen Menschen.
Dabei hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn optische Methoden mit spektroskopischen Methoden in einer einfachen Art und Weise kombiniert werden. Mittels optischer Methoden wird zunächst ein optisches Bild der biologischen Probe erzeugt. Dieses optische Bild wird dazu verwendet, gewünschte Messareale in einer biologischen Probe zu ermitteln. „Gewünschte Messareale“ sind in einer flüssigen biologischen Probe, wie Blut, beispielsweise bestimmte Zelltypen, in denen Schlüsselmetabolite vermutet werden. In einer Gewebeprobe sind „gewünschte Messareale“ beispielsweise solche Bereiche, in den erkrankte Zellen vermutet werden, die Schlüsselmetabolite aufweisen könnten.
Konventionell wird bei Untersuchungen in der Medizin zunächst ein mikroskopisches Übersichtsbild erzeugt. Mikroskopische Übersichtsbilder können mit verschiedenen Methoden erzeugt werden, zum Beispiel mittels Hellfeldmikroskopie, Dunkelfeldmikroskopie, Phasenkontrastmikroskopie, Differentialinterferenzkontrast-mikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie, Polarisationsmikroskopie, Konfokalmikroskopie und Multiphotonenmikroskopie. Üblicherweise wird zunächst ein Weißlichtbild erzeugt. Normales Weißlicht enthält alle Farben. Wenn es auf eine Gewebeoberfläche oder eine biologische Probe trifft, werden alle Farben absorbiert. Dadurch mangelt es dem allerdings oft an Kontrast. Bei einer anderen, im Stand der Technik bekannten Methode, wird zur Erzeugung des optischen Bildes kein Weißlicht, sondern Licht verwendet, dass nur ausgewählte Farben des Lichtspektrums aufweist. So wird beispielsweise in der Endoskopie eine Mischung aus blauem und grünem Licht verwendet. Wenn blaues und grünes Licht auf die Gewebeoberfläche trifft, wird es vom Hämoglobin in den Blutgefäßen stark absorbiert. Das blaue Licht wird dabei von den Kapillargefäßen in der Schleimhaut absorbiert, wohingegen das grüne Licht tiefer in den submukösen Bereich eindringt, wo es von den Blutgefäßen reflektiert wird. Auf diese Weise kann ein wesentlich höherer Kontrast zwischen den Blutgefäßen und dem umgebenden Gewebe erzeugt werden als mit Weißlicht. Deshalb sind derartige optische Bilder kontrastreicher als Weißlichtbilder.
Sofern im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ein mikroskopisches Übersichtsbild erzeugt wird, wird das mikroskopische Übersichtsbild vorzugsweise mittels Hellfeldmikroskopie, Dunkelfeldmikroskopie, Phasenkontrastmikroskopie, Differentialinterferenzkontrastmikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie, Polarisationsmikroskopie, Konfokalmikroskopie oder Multiphotonenmikroskopie erzeugt
Es hat sich allerdings erwiesen, dass die Nutzung von Weißlicht für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ausreichend ist, da die optischen Bilder für die Auswahl gewünschter Messareale bei hohen Vergrößerungen der biologischen Probe im mikroskopischen Bereich sehr schnell und ohne besondere Anforderungen an die Auswertetechnik erzeugt werden und nicht der Kontrastverbesserung oberhalb des mikroskopischen Bereichs, wie beispielsweise in der Endoskopie, dienen. Folglich werden vorzugsweise Weißlichtbilder mit einem Mikroskop, besonders bevorzugt mit einem Lichtmikroskop, ganz besonders bevorzugt einem Hellfeldmikroskop erzeugt.
Erfindungsgemäß werden danach die im ersten Schritt ermittelten gewünschten Messareale auf das Vorhandensein von Schlüsselmetaboliten untersucht. Hierzu werden die im Weißlichtbild ermittelten gewünschten Messareale einem bild-basierten Screening unterzogen, wobei eine Messmethode zum Einsatz kommt, mit der die Schlüsselmetaboliten im submikroskopischen Bereich sichtbar gemacht werden können. Hierfür haben sich spektroskopische Methoden als besonders zweckmäßig erwiesen. Dieser Schritt kann prinzipiell mit jeder Lichtquelle und Anregungswellenlänge, die sich für die spektrale Bildgebung eignet, durchgeführt werden.
Für die Zwecke der Erfindung geeignete spektroskopische Methoden sind beispielsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus multiskaliger Spektroskopie, multimodalen Bildgebungsverfahren, hyperspektraler Bildgebung, Raman- und Resonance Raman Spektroskopie, oberflächenverstärkter Raman-Spektroskopie (SERS), plasmonenverstärkter Raman-Spektroskopie (PERS), schalenisolierter Nanopartikel-verstärkte Raman-Spektroskopie (SINERS), Räumlich versetzte Raman-Spektroskopie (SORS), Faserverstärkte Raman-Spektroskopie (FERS), Shifted-Excitation-Raman-Differenzspektroskopie (SERDS), spitzenverstärkter Raman-Spektroskopie (TERS) und kohärente Raman-Spektroskopie (coherent anti-Stokes Raman scattering, CARS), Infrarot-Spektroskopie, wie Nah-Infrarot-Spektroskopie (NIR); Ultraviolett-Spektroskopie (UV), sichtbares Spektroskopie (VIS), Terahertz-Spektroskopie (TR), Magnetresonanz-Spektroskopie (MR) und Massenspektroskopie.
Erfindungsgemäß wird mindestens ein Spektrum der biologischen Probe mit mindestens einer spektroskopischen Methode gemessen.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird mehr als ein Spektrum mit der mindestens einen spektroskopischen Methode der biologischen Probe gemessen. Vorzugsweise werden zwischen zwei bis zehn Spektren, besonders bevorzugt zwischen zwei bis fünf Spektren mit der mindestens einen spektroskopischen Methode gemessen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird nicht nur ein Spektrum der biologischen Probe gemessen, sondern ein Vielfaches von Spektren, wobei jedes Spektrum mit einer anderen spektroskopischen Methode gemessen wird. Da der physikalische Hintergrund der verschiedenen spektroskopischen Methoden grundsätzlich unterschiedlich ist, unterscheidet sich auch die in den Spektren verschiedener spektroskopischer Methoden enthaltene Information. Die physikalischen Hintergründe der erfindungsgemäß verwendeten spektroskopischen Methode sind dem Fachmann gut bekannt und werden in diesem Zusammenhang nicht weiter erläutert. Dementsprechend enthalten die mit unterschiedlichen spektroskopischen Methoden gewonnenen Spektren oft Informationen über die biologische Probe, die sich gegenseitig ergänzen. Die Kombination von Spektren, die mit unterschiedlichen spektroskopischen Methoden gewonnen werden, erhöht daher die Qualität der Bestimmung der Signaturen von Schlüsselmetaboliten erheblich.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren ferner den Schritt, jeweils mindestens ein Spektrum der biologischen Probe mit 1 bis 7 weiteren spektroskopischen Methoden, vorzugsweise mit 1 bis 4 weiteren spektroskopischen Methoden zu messen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Raman-Spektroskopie, IR-Spektroskopie und Massenspektroskopie in Kombination verwendet, um Spektren der biologischen Probe zu messen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Raman-Spektroskopie und IR-Spektroskopie in Kombination verwendet, um Spektren der biologischen Probe zu messen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden mindestens zwei Spektren mit der gleichen spektroskopischen Methode unter Verwendung unterschiedlicher Messeinstellungen gemessen. Unter Messeinstellungen werden erfindungsgemäß Einstellungen verstanden, die für ein bestimmtes Verfahren spezifisch sind und die in den Spektren gewonnenen Informationen beeinflussen können. So können z. B. in der Raman-Spektroskopie Spektren mit unterschiedlichen Raman-Anregungsfrequenzen und unterschiedlichen optischen Einstellungen oder in der Kernspinresonanz-Spektroskopie Spektren für unterschiedliche Kerne, z. B. ¹H oder ¹³C oder unterschiedliche Versuchsaufbauten, gewonnen werden. Analog zur Verwendung unterschiedlicher spektroskopischer Methoden können sich die in den Spektren enthaltenen Informationen gegenseitig ergänzen und somit die Qualität der Bestimmung der Signatur der Schlüsselmetabolite erhöhen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Raman-Spektroskopie als eine spektroskopische Methode verwendet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Raman-Spektroskopie mit zwei unterschiedlichen Raman-Anregungsfrequenzen eingesetzt.
Besonders bevorzugt erfolgt das bild-basierte Screening der im Weißlichtbild ermittelten gewünschten Messareale mit der nichtlinearen Raman-Spektroskopie. Darunter versteht man eine Gruppe von spektroskopischen Untersuchungsverfahren, die auf der nichtlinearen Raman-Streuung von Licht an Festkörpern oder Gasen basiert. Zur Anregung werden, in der Regel schmalbandige, Laser eingesetzt. Diese Verfahren gehören deshalb zur Laserspektroskopie. Der Unterschied zur linearen Raman-Spektroskopie besteht in der besonderen Anregungsart. Dabei sind entweder zwei Laserstrahlen unterschiedlicher Frequenz (Pump- und Stokes-Laser) mit geeigneten Frequenzen erforderlich (z. B. bei CARS) oder mehrere Photonen eines einzelnen Laserstrahls (z. B. bei SRS). Die Photonen werden in dem so genannten Raman-Medium (je nach Anwendung ein Festkörper oder Atome bzw. Moleküle im gasförmigen Zustand) überlagert. Durch die Wechselwirkung der Photonen mit der Materie des Mediums entsteht dabei ein laser-ähnlicher Ausgangsstrahl. Der ausgesendete Strahl wird genau dann resonant verstärkt, wenn die Überlagerung der Frequenzen der Eingangs-Photonen einer Raman-Resonanz entspricht. Das Signal erscheint um den Betrag der Raman-Resonanz zu niedrigeren bzw. höheren Frequenzen relativ zur Frequenz der Eingangs-Photonen verschoben. Diese Strahlen werden Stokes- bzw. Anti-Stokes-Strahlen genannt.
Die Gruppe der nichtlinearen Raman-Spektroskopien lässt sich nach dem ausgenutzten Effekt in drei Hauptverfahren unterteilen:

• Induzierte Raman-Streuung, auch stimulierte Raman-Streuung genannt (engl. stimulated Raman scattering, SRS);
• Kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (engl. coherent anti-Stokes Raman scattering, CARS);
• Hyper-Raman-Effekte (engl.: Hyper-Raman Effects)

Die kohärente Raman-Spektroskopie (CARS) dient unter anderem zur Untersuchung von Materialeigenschaften, thermodynamischen Eigenschaften (z. B. Temperatur) oder auch zur spezies-selektiven Mikroskopie. Sie wird unter anderem in der Molekülspektroskopie, der Plasma- und Verbrennungsdiagnostik, in der Mikroskopie und zur Qualitätssicherung von Diamanten eingesetzt. Außerdem kann sie bei der Untersuchung biologischer Systeme zur Sichtbarmachung von fast beliebigen wählbaren Molekülarten durch Anregung charakteristischer Schwingungsmodi (CH2-Schwingung für Lipide, Amidschwingung für Proteine, Phosphatschwingung für DNA) genutzt werden, die deshalb nicht erst durch Fluoreszenzfarbstoffe markiert werden müssen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt das bild-basierte Screening der im Weißlichtbild ermittelten gewünschten Messareale deshalb mittels kohärenter Raman-Spektroskopie (CARS).
Vorteilhafterweise benötigen die meisten spektroskopischen Methoden nur geringe Mengen an Proben zur Durchführung. Dementsprechend werden in einer Ausführungsform der Erfindung zwischen 1µl und 150µl, bevorzugt zwischen 30µl und 100µl, am meisten bevorzugt 50µl der biologischen Probe verwendet, um alle im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Spektren zu messen. Da biologische Proben aus dem Bereich der medizinischen Diagnostik ein begrenztes Volumen haben, ist es von großem Vorteil, dass nur ein kleiner Teil der biolgischen Probe zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens notwendig ist. Dies ermöglicht eine allgemeine ungezielte Screening-Diagnostik für alle Proben vor oder parallel zu einer gezielten konventionellen Labordiagnostik. Dennoch steht ein überwiegender Teil einer biologischen Probe zur Durchführung weiterer Diagnostik, wie z. B. der medizinischen Routinediagnostik im Labor, zur Verfügung.
Während des bild-basierten Screenings der im Weißlichtbild ermittelten gewünschten Messareale mittels spektroskopischen Methoden werden Schlüsselmetaboliten für eine bestimmte Erkrankung identifiziert und quantifiziert. In einem weiteren Schritt werden Änderungen der Schlüsselmetaboliten erfasst. Dabei wird entweder die Menge der in der biologischen Probe quantifizierten Schlüsselmetabolite mit der Menge der gleichen Schlüsselmetabolite in einer Kontrollprobe verglichen, oder die biologische Probe wird dahingehend mit einer Kontrollprobe verglichen, ob bestimmte Schlüsselmetabolite in der biologischen Probe und der Kontrollprobe vorhanden sind oder ob das Muster der Schlüsselmetaboliten in beiden Proben voneinander abweicht. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es auch möglich, zeitliche Änderungen des Auftretens und der Menge bzw. Konzentration von Schlüsselmetaboliten zu untersuchen. Solche zeitlichen Änderungen von Schlüsselmetaboliten treten häufig im Verlauf der Entwicklung von Krankheiten auf. Hierzu werden in zeitlichen Abständen regelmäßig Proben entnommen, in denen die Identität und Quantität der Schlüsselmetaboliten bestimmt und mit der Identität und Quantität der Schlüsselmetaboliten in vorherigen Proben, wie beispielsweise der Ausgansprobe und/oder einer Kontrollprobe verglichen werden. Je nach Erkrankung sind geeignete Probenahmeintervalle beispielsweise ein oder mehrere Stunden (beispielsweise über einen Zeitraum von 24 h), ein oder mehrere Tage (beispielsweise über einen Zeitraum von 1 Woche), ein oder mehrere Wochen (beispielsweise über einen Zeitraum von 1, 2 oder 3 Monaten) oder ein oder mehrere Monate (beispielsweise über einen Zeitraum von 3 Monaten, 6 Monaten, 9 Monaten oder 12 Monaten). Unter „Kontrollprobe“ wird eine biologische Probe aus einem gesunden Probanden verstanden.
Basierend auf den ermittelten Unterschieden in der Art, der Menge bzw. dem Muster an Schlüsselmetaboliten (hierin zusammenfassend auch als „Signatur“ der Schlüsselmetabolite bezeichnet), die in einer von einem Probanden gewonnenen biologischen Probe im Vergleich zu einer normalen Kontrollprobe vorhanden ist, kann eine Korrelation der Art oder Menge eines oder mehrerer Schlüsselmetaboliten mit einer wahrscheinlichen Diagnose einer Erkrankung hergestellt werden. Ein statistisch signifikanter Anstieg der Menge eines oder mehrerer Schlüsselmetaboliten im Vergleich zu den Kontrollproben ist hinreichend prädiktiv dafür, dass der Proband an einer für den oder die Schlüsselmetaboliten oder ein bestimmtes Muster an Schlüsselmetaboliten typischen Erkrankung leidet. Eine normale Menge eines oder mehrerer Schlüsselmetaboliten oder ein normales Muster an Schlüsselmetaboliten, wie sie für eine Kontrollprobe, die aus einer normalen Population isoliert wurde, charakteristisch ist, zeigt an, dass der Patient keine für den oder die Schlüsselmetaboliten oder ein bestimmtes Muster an Schlüsselmetaboliten typische Erkrankung hat. Ein positiver Hinweis auf eine Erkrankung, der auf einer erhöhten oder reduzierten Menge eines oder mehrerer Schlüsselmetaboliten oder einem veränderten Muster an Schlüsselmetaboliten im Vergleich zu einer normalen Kontrolle basiert, wird im Allgemeinen zusammen mit anderen Faktoren bei der endgültigen Bestimmung einer bestimmten Erkrankung berücksichtigt. Daher werden die erhöhten oder verringerten Mengen eines oder mehrerer Schlüsselmetaboliten oder ein verändertes Muster an Schlüsselmetaboliten des getesteten Probanden in der Regel zusammen mit anderen akzeptierten klinischen Symptomen der jeweiligen Krankheit bei der Erstellung einer bestimmenden Diagnose solch einer Erkrankung berücksichtigt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin dazu genutzt werden, die Verteilung der Schlüsselmetaboliten in der biologischen Probe zu bestimmen, z.B. durch Sichtbarmachen der Schlüsselmetaboliten in der biologischen Probe. Vorzugsweise wird die Bestimmung der Verteilung der Schlüsselmetaboliten in der biologischen Probe in einer Gewebeprobe oder einer Biopsie vorgenommen.
Das bild-basierte Screening der im Weißlichtbild ermittelten gewünschten Messareale mittels spektroskopischen Methoden erfolgt vorzugsweise in einer Vorrichtung, wie einem Mikroskop, die technisch dafür ausgerüstet ist, spektroskopische Analysen auf mikroskopischer Ebene durchzuführen. Besonders bevorzugt ist eine Vorrichtung, wie ein Mikroskop, mit der sowohl ein Weißlichtbild der biologischen Probe erzeugt werden kann, als auch eine Analyse der biologischen Probe mit einer spektroskopischen Methode vorgenommen werden kann.
Schlüsselmetabolite sind krankheitsspezifisch und werden ggf. erst mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert und detektiert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüsselmetaboliten bei einer Erkrankung die folgenden Schritte:

(a) die Ermittlung gewünschter Messareale in der biologischen Probe anhand eines, mittels optischer Methoden erzeugten Bildes der biologischen Probe,
(b) ein bild-basiertes Screening der in Schritt (a) ermittelten gewünschten Messareale mittels mindestens einer spektroskopischen Methode, umfassend
1. a. die Identifikation und Quantifizierung von Schlüsselmetaboliten der Stoffwechselerkrankung,
2. b. die Erfassung von Änderungen der Schlüsselmetaboliten der Stoffwechselerkrankung, und
(c) die Diagnose einer Erkrankung oder die Bestimmung der Verteilung der Schlüsselmetaboliten in der biologischen Probe.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin übliche, dem Fachmann geläufige Schritte zur Probenvorbereitung für die Erzeugung des optischen Bilds und/oder die mindestens eine spektrometrische Methode enthalten.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des Verfahrens zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüsselmetaboliten bei einer Erkrankung zur Diagnose einer Stoffwechselerkrankung, Stoffwechselstörung oder einer proliferativen Erkrankung.
Der Schritt „Diagnose der Erkrankung“ des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst dann weiterhin die Schritte:

• Vergleichen der nachgewiesenen Menge eines oder mehrerer Schlüsselmetabolite in der biologischen Probe mit einer für eine normale Kontrollprobe charakteristischen Menge der Schlüsselmetabolite (Referenzbereich); und/oder
• Vergleichen der Identität eines oder mehrerer Schlüsselmetabolite in der biologischen Probe mit den in einer normalen Kontrollprobe bzw. Referenzbereich vorhandenen Schlüsselmetaboliten; wobei die Anwesenheit zusätzlicher Schlüsselmetabolite oder die Abwesenheit von Schlüsselmetaboliten, vorzugsweise die Anwesenheit zusätzlicher Schlüsselmetabolite in der biologischen Probe im Vergleich zur normalen Kontrollprobe ein positiver Indikator für die Erkrankung ist; und/oder
• Vergleichen des Musters an Schlüsselmetaboliten in der biologischen Probe mit dem Muster an Schlüsselmetaboliten in einer normalen Kontrollprobe bzw. mit einem Referenzbereich; wobei die Änderungen des Musters an Schlüsselmetaboliten in der biologischen Probe im Vergleich zur normalen Kontrollprobe ein positiver Indikator für die Erkrankung ist.

In einer bevorzugten Variante stützt sich das erfindungsgemäße Verfahren auf die Untersuchung von Blutproben, wobei die Analyse der Signaturen von Schlüsselmetaboliten einzelnen Blutzellen durchgeführt wird. Besonders geeignete Blutzellen für die Analyse von Veränderungen von Signaturen von Schüssel-Metaboliten bei einer Erkrankung sind Erythrozyten. Bei den Erythrozyten kommt es zu verschiedenen Krankheiten und Sonderformen. Durch Störungen des Stoffwechsels, Krankheiten sowie durch Vitamin- und Eisenmangel verändern sich die Zahl und das Aussehen der Erythrozyten und auch deren Signatur von Schlüsselmetaboliten. Man spricht von sogenannten Anämien. Erythrozyten sind deshalb besonders geeignet für das erfindungsgemäße Verfahren. Bei Blutuntersuchungen stellen die Erythrozyten in dem erfindungsgemäßen Verfahren die gewünschten Messareale dar, in denen die Signatur von Schlüsselmetaboliten analysiert werden soll. In diesem Falle umfasst das Verfahren zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüssel-Metaboliten bei einer Erkrankung die Schritte

i. Probenvorbereitung einer Blutprobe für spektroskopische Detektionsverfahren
ii. Optional: Aufnahme eines mikroskopischen Übersichtsbildes der Blutprobe,
iii. Identifikation von Erythrozyten in der Blutprobe oder optional in dem mikroskopischen Übersichtsbild,
iv. Definition der gewünschten Messareale in den Erythrozyten,
v. Erzeugen von Bildern der Erythozyten, vorzugsweise etwa 200 Stück, mit spektralen Informationen mittels der mindestens einen spektroskopischen Methode,
vi. Analyse der metabolischen Signatur mittels statistischer Methoden und durch Korrelation mit einer spektralen Referenzbibliothek von Reinsubstanzen,
vii. Auswertung der Metaboliten-Signaturen in den Erythrozyten,
viii. Diagnose der Erkrankung.

Zur Probenvorbereitung in Schritt i. wird üblicherweise ein Blutausstrich für eine mikroskopische Untersuchung hergestellt. Genauso geeignet ist jede andere Methode der Probenvorbereitung, die es ermöglicht, Blutzellen mittels spektroskopischen Verfahren zu detektieren und zu vermessen (z.B. Kapillaren oder durchflusszytometrische Verfahren).
Sofern das erfindungsgemäße Verfahren an einer Gewebeprobe oder Biopsie durchgeführt wird, umfasst das Verfahren die Schritte:

i. Probenvorbereitung,
ii. Optional: Erzeugung eines mikroskopischen Übersichtsbildes des histologischen Präparats,
iii. Auswahl der gewünschten Messareale des histologischen Präparats, optional aus dem mikroskopischen Übersichtsbild,
iv. Erzeugen eines Bildes mittels der mindestens einen spektroskopischen Methode,
v. Analyse der metabolischen Signatur mittels statistischer Methoden und durch Korrelation mit einer spektralen Referenzbibliothek von Reinsubstanzen,
vi. Auswertung der Metaboliten-Signaturen in den ausgewählten Messarealen,
vii. Bestimmung der Metabolitenverteilung in der Gewebeprobe.

Dadurch kann anhand der Signatur der Metaboliten festgestellt werden, ob das untersuchte Gewebe, und damit der Proband, erkrankt ist oder nicht.
Die Probenvorbereitung gemäß Schritt i. umfasst typischerweise die Herstellung eines histologischen Präparats, z.B. eines Gefrierschnitts, und für die mikroskopische Untersuchung das Aufziehen des histologischen Präparats auf eine CaF2-Folie.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann so jede Art von Gewebe untersucht werden. Bevorzugt wird Gewebe aus der Leber bzw. Gewebe oder Biopsien mit Verdacht auf proliferative Erkrankungen untersucht.
Die Identifikation der Schlüsselmetabolite erfolgt vorzugsweise durch Korrelation mit einer spektralen Referenzbibliothek von Reinsubstanzen. Eine solche Vorgehensweise ist dem Fachmann bekannt. Der Schritt der Analyse und Auswertung der metabolischen Signatur erfolgt vorzugsweise mittels statistischer Methoden. Die Spektroskopie Daten können durch rein visuellen Vergleich analysiert werden, um die krankheitsrelevanten Informationen zu extrahieren, oder durch Anwendung geeigneter statistischer Methoden, die dem Fachmann bekannt sind und ausgewählt werden. Hierzu eigenen sich sämtliche unüberwachte und überwachte statistische Methoden. Zu den überwachten statistischen Methoden gehören die zum Beispiel die Hauptkomponentenanalyse. Zu den überwachten statistische Modelle gehören zum Beispiel die lineare Diskriminanzanalyse, Support-Vektor-Maschine, Partielle Kleinste-Quadrate-Regression, Random-Forest, neuronale Netzwerkanalyse und Machinelles Lernen. Weiterhin können Verfahren für die Probenklassifizierung und Visualisierung der Komponentenverteilung (alleine oder in Kombination mit überwachten und unüberwachten statistischen Methoden) eingesetzt werden. Geeignete Verfahren zur Probenklassifizierung und Visualisierung sind zum Beispiel: Abundanz Analysen und Clusteranalysemethoden. Zu diesen gehören zum Beispiel:Vektorkomponentenanalyse, NFINDR und k-means-Clustering.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet für die Diagnose von Stoffwechselerkrankungen, Stoffwechselstörungen und/oder proliferativen Erkrankungen.
Eine Stoffwechselerkrankung, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren diagnostiziert werden kann ist, ist beispielsweise eine Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Diabetes mellitus (Zuckerkrankheit), Erythropoetische Protoporphyrie, Hypertriglyceridämie, Phenylketonurie, Porphyrien und Thesaurismose.
Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren für die Diagnose einer Lebererkrankung oder einer Leberdysfunktion, die vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltendentzündlichen (z.B. Autoimmunerkrankungen, Tumore), infektiösen (z.B. viral, bakteriell), akut-toxisch (z.B. Vergiftung durch Arzneimittel), chronisch-toxisch (z.B. fibrotisch/ zirrhotisch bei chronischem Alkoholabusus). Besonders bevorzugt sind eingeschränkte Leberfunktionen die zu einem Gallenstau (Cholestase) führen (z.B. Verlegung des Gallengangs, Infektionen, Tumore, toxische Einschränkung der Leberfunktion).
Typische Schlüsselmetabolite für Lebererkrankungen sind Taurin- oder Glyzin-konjugierte und unkonjugierte Gallensäuren (wie z.B. Litocholsäure, Cholsäure, Chenodeoxycholsäure, Ursodeoxycholsäure, Obeticholsäure, Dehydrocholsäure), Glukose, Low-density lipoprotein, high-density lipoprotein, Albumin, Häm- und Hämaabauprodukte (Protoporphyrine).
Typische Schlüsselmetabolite für obstruktive Cholestase sind Taurin- oder Glyzin-konjugierte und unkonjugierte Gallensäuren (wie z.B. Litocholsäure, Cholsäure, Chenodeoxycholsäure, Ursodeoxycholsäure, Obeticholsäure, Dehydrocholsäure).
Eine proliferative Erkrankung, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren diagnostiziert werden kann ist, ist beispielsweise ausgewählt ist aus Krebs, Tumormetastasierung oder Tumorrezidiv.
Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren für die Diagnose einer Krebserkrankung, die vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend (1) bösartige Tumore: Karzinom, Fibrosarkom, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Angiomyosarkom, Angiosarkom, Liposarkom, Chondrosarkom, Osteosarkom, Malignes Melanom, Meningeosarkom, Myeloische Leukämie, oder Maligne Lymphome und lymphatische Leukämie und (2) gutartige Tumore: Adenom, Papillom, Fibrom, Leiomyom, Rhabdomyom, Angiomyom, Hämangiom, Lymphangiom, Lipom, Chondrom, Osteo, Melanozyten-Nävus, Meningeom, Teratom, oder Blastom..
Die Erfindung hat zahlreiche Vorteile. So wird es ermöglicht, Metaboliten in Erythrozyten mit Hilfe statistischer Methoden, wie z.B. Abundanz-Mapping und Cluster-Analysen, zu identifizieren. Die Erythrozyten können so als „Metabolische Markerzelle“ für die Identifikation von pathophysiologischen metabolischen Veränderungen verwendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt nunmehr die gezielte Metabolomik (targeted metabolomics) in Zellen und Geweben basierend auf der spektroskopischen Bildgebung mit einer Auflösung im (Sub)mikrometer-Bereich. Weiterhin erlaubt das Verfahren die Analyse von Metabolitenverteilungen im Gewebe oder in Zellen, wodurch Aussagen über die Schwere eines Krankheitsverlaufs bzw. über das Stadium einer Erkrankung getroffen werden können.
Als Bestandteil der Funktionsdiagnostik im klinischen Alltag können sogenannte metabolische „fingerprints“ erstellt und zur Identifikation von Erkrankungen eingesetzt werden. Aufgrund der viel größeren Informationsmenge, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verarbeitet wird, ist eine präzisere Diagnostik möglich. Das erfindungsgemäße Verfahren ist sehr breit anwendbar - beginnend bei Lebererkrankungen/Leberdysfunktion über metabolische Erkrankungen insgesamt bis hin zur Tumordiagnostik und der Diagnostik angeborener Stoffwechselstörungen. Das Verfahren kann in kleinen Tischlaborgeräten miniaturisiert angewendet werden. Dies ist mit bereits existierenden Geräten möglich. Bereist ohne intensive Optimierung sind kurze Messzeiten von < 20 min realisierbar. Die Präanalytik und der Materialaufwand sind sehr gering, ggf. ist nur ein Blutstropfen für die Untersuchungen nötig. Das Verfahren ist darüber hinaus automatisierbar.
Im Bereich der Forschung, wo insbesondere die Bildgebung von Metaboliten eine Rolle spielt, hat das erfindungsgemäße Verfahren ebenfalls Vorteile. Die Probenvorbereitung gestaltet sich wesentlich einfacher als bei MALDI-Imaging - Verfahren. Es ist ein korrelatives Imaging (z.B. Hematoxylin and Eosin Färbung (histopathologische routine-Färbung), und Raman Spektroskopie) am gleichen Gewebeschnitt möglich. Die Gewebeproben, insbesondere die Gewebeschnitte werden durch die Bildgebung nicht zerstört. Dadurch können gewünschte Regionen, d.h. gewünschte Messareale, vorab an Standardpräparaten definiert werden, und im Anschluss mit spektroskopischen Methoden, wie der Raman Spektroskopie, auf die metabolischen Signaturen näher untersucht werden. Spektrale Informationen lassen drüber hinaus eine „Nachanalyse“ vorhandener Daten mit Spektren neuer Metaboliten zu.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von 4 Zeichnungen und 2 Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Es zeigen:

1 ein Übersichtsschema des Verfahrens zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüssel-Metaboliten bei einer Erkrankung; insbesondere die Aufnahme von Spektralbildern von Erythrozyten und die Analyse der Konzentration und Verteilung von Metaboliten mit statistischen Methoden;
2 die Diagnose einer Leberfunktionsstörung bei obstruktiver Cholestase im Maus-Modell;
3 die Identifikation von ausgewählten Metaboliten (targeted metabolomics) in spektralen Datensätzen und deren Quantifizierung mittels statistischen Verfahren; und
4 Darstellung der Verteilung ausgewählter Metaboliten („targeted metabolomics“) in histologischen Präparaten, z.B. der Leber.

Ausführungsbeispiel 1: Diagnose einer Leberfunktionsstörung bei obstruktiver Cholestase im Maus-Modell.
Eine Leberfunktionsstörung wurde bei obstruktiver Cholestase im Mausmodell auf Grundlage einem bild-basierten Screenings von Erythrozyten mittels Raman-Spektroskopie und der Identifikation von Schlüsselmetaboliten sowie deren Änderung bei der Erkrankung diagnostiziert. In dem Mausmodell wird im Rahmen einer Bauchoperation eine definitive obstruktive Cholestase durch die zweifache Ligatur des Gallengangs erzeugt. Dies verhindert den Abfluss und Ausscheidung/Metabolisierung der Gallsäure über den Darm und führt zu einem Rückstau dieser in die Leber und den Organismus. In diesem Experimentellen Setting, wurden Kontrolltiere ebenfalls einer Bauchoperation ohne Ligatur des Gallengangs unterzogen. So können die Einflüsse des Gallenstaus auf die Metabolitenänderungen im Plasma näher untersucht werden. 3 und 6 Tage nach der Ligatur werden den Tieren ein Blutstropfen aus der Schwanzvene entnommen (die Schwanzvene ist im Tier ein peripheres mittelgroßes Gefäß, und entspricht einer kleinen Vene beim Menschen). Der Blutstropfen wird frisch auf ein CaF Substratglas aufgebracht und wie ein Blutausstrich ausgestrichen (Figure 1a, b). Einzelne Erythrozyten werden mit einem Raman-Spektrometer (inVia™ Qontor® konfokales Raman-Mikroskop) untersucht, das mit einem 1800 g/mm-Gitter und einem Laser mit einer Anregungswellenlänge von 532 nm ausgestattet ist, der durch ein 50x/0,85NA Leica-Objektiv mit einer Laserleistung von ~3 mW auf die Objektebene fokussiert wurde. Die Raman-Spektren der Zellen wurden mit einer Laserbelichtung von 1s/Spektrum aufgenommen und es werden mindestens 200 Zellen/Maus untersucht. Die bereinigten spektralen Daten von einzelnen Erythrozyten werden mittels Principle Component Analyse (PCA) ausgewertet und miteinander verglichen. Es zeigt sich eine deutliche Unterscheidung in den spektralen Profilen zwischen Tieren mit obstruktiver Cholestase und Kontrollen (operierte Tiere ohne obstruktive Cholestase), mit charakteristischen Peaks, die eine Diagnose einer hepatozellulären Veränderung nachweisbar machen.
Ausführungsbeispiel 2: Darstellung der Verteilung ausgewählter Metaboliten („targeted metabolomics“) in histologischen Präparaten der Leber.
In dem in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Experiment, lassen sich weiterhin Molekülcharakteristika identifizieren (3). Dies geschieht durch den Vergleich und die anschließende Zuordnung der in den Raman-Spektren beobachteten charakteristischen Raman-Peaks mit einer Raman-Spektralbibliothek von Reinsubstanzen. Der Vergleich mit einer Bibliothek aus Gallensäuren, erlaubt die Identifikation von Schlüsselmetaboliten (Gallensäuren): Glyzin-dexocycholsäure (GDCA), Tauro-chenodeoxycholsäure (TCDCA) und Chenodeoxycholsäure (CDCA).
Der Abgleich von Referenzspektren mit einem Raman-Mikrospektroskopie Bild der Leber erlaubt die Darstellung der Verteilung dieser Metabolite im Gewebe. Dieser Vergleich erfolgt durch Clustering-Methoden (z. B. kmeans, NFINDR, hierarchisches/partitionelles Clustering, Fuzzy-Clustering, modell-/dichte-/distanz-/verteilungsbasiertes Clustering, Vektorkomponentenanalyse usw.), um eindeutige spektrale Merkmale zu extrahieren. Hierzu kommen Verfahren in Frage die Mustererkennung, Bildanalyse und Methoden des maschinellen Lernens integrieren. Um die Präzision dieser Verfahren zu erhöhen können zusätzlich Raman-Spektren einer oder mehrere Referenzsubstanzen in die Algorithmen eingespeist werden. Dies verbessert in manchen Situationen die Identifizierung eindeutiger spektraler Komponenten und die Visualisierung der Verteilung dieser Metaboliten im Gewebe. Durch diese Einspeisung von Referenzspektren können auch lokale Veränderungen wie in diesem Beispiel die Anhäufung von CDCA in Vesikel (4) sichtbar gemacht werden. Das Raman-Spektroskopiebild des Lebergewebes wurde mit einem weiteren kommerziellen Raman-Gerät (CRM 300, WITec GmbH) aufgenommen. Eine Kryosektion des Lebergewebes (0.01 mm dick) wird auf einen CaF2-Objektträger präpariert. Das Raman-Spektrometer ist mit einem 600 g/mm-Gitter und einer Anregungswellenlänge von 532 nm bei einer Leistung von 35mW ausgestattet. Raman-Spektren wurden im Scanning-Modus (gescannter Bereich 0.2 mm x 0.2 mm) mit 0,0005 mm Schrittweite und 0,5s Laserbelichtung/Spektrum aufgenommen. Das Laserlicht wurde mit einem 100x/0,75NA Zeiss-Objektiv auf das Gewebe fokussiert und eine 0.1 mm Glasfaser wurde zur Sammlung des Raman-Signals verwendet. Die Raman-Spektren des Gewebes werden durch Anwendung der k-means Clustering-Methode analysiert, um ein Raman-Bild zu erzeugen, und drei markante Cluster-Spektren wurden extrahiert.
Referenzen

1 Kiehntopf M, Nin N, Bauer M. Metabolism, metabolome, and metabolomics in intensive care: is it time to move beyond monitoring of glucose and lactate? Am J Respir Crit Care Med 2013; 187: 906- 907.
2 Vincent JL, Moreno R, Takala J, Willatts S, De Mendonça A, Bruining H, et al. The SOFA (Sepsis-related Organ Failure Assessment) score to describe organ dysfunction/failure. On behalf of the Working Group on Sepsis-Related Problems of the European Society of Intensive Care Medicine. Intensive Care Med 1996; 22: 707- 710.
3 Recknagel P, Gonnert FA, Westermann M, Lambeck S, Lupp A, Rudiger A, et al. Liver dysfunction and phosphatidylinositol-3-kinase signalling in early sepsis: experimental studies in rodent models of peritonitis. PLoS Med 2012; 9: e1001338.
4 Vanwijngaerden YM, Langouche L, Brunner R, Debayeve Y, Gielen M, Casaer M, et al. Withholding parenteral nutrition during critical illness increases plasma bilirubin but lowers the incidence of biliary sludge. Hepatology 2014; 60: 202- 210.
5 Kruger PS, Freir NM, Venkatesh B, Robertson TA, Roberts MS, Jones M. A preliminary study of atorvastatin plasma concentrations in critically ill patients with sepsis. Intensive Care Med 2009; 35: 717- 721.
6 Bauer M., Kiehntopf M. Shades of yellow: Monitoring nutritional needs and hepatobiliary function in the critically ill. Hepatology 2014; 60: 26-29

Bezugszeichenliste

1: Auflichtquelle
2: Lichtsammlung nach Streuung/Absorption
3: Blutausstrich (mit Antikoagulans)
4: Spektroskopie geeignete Substrate
5: Kapillarblut mit geeignetem Substrat
6: Auslesen
7: Blut
8: Ausfluss
9: Bildgebung/Zelloberflächenkartierung
10: Flüssigprobenhalter aus geeignetem Material
11: Geeignetes flüssiges Medium
12: Erythrozyten in geeigneter Form
13: Erythrozyten in geeigneter Form in geeignetem Medium
14: Flüssigprobenhalter
15: Einzelspektren/hyperspektrale Bildgebung/Mapping-Erfassungsmodus/multimodale Erkennung
c): Kapillar-Detektion
d): Dermale Erfassung
e): Kapillarsimulation im Chip

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 5615673 A [0012]
US 7524671 B2 [0013]
US 6031233 B2 [0014]
US 20070178067 A1 [0015]

Claims

Verfahren zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüssel-Metaboliten bei einer Erkrankung, umfassend (a) die Ermittlung gewünschter Messareale in der biologischen Probe anhand eines, mittels optischer Methoden erzeugten Bildes der biologischen Probe, (b) ein bild-basiertes Screening der in Schritt (a) ermittelten gewünschten Messareale mittels mindestens einer spektroskopischen Methode, umfassend ◯ die Identifikation und Quantifizierung von Schlüsselmetaboliten der Stoffwechselerkrankung, ◯ die Erfassung von Änderungen der Schlüsselmetaboliten der Stoffwechselerkrankung, und (c) die Diagnose einer Erkrankung oder die Bestimmung der Verteilung der Schlüsselmetaboliten in der biologischen Probe.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine spektroskopische Methode ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus multiskaliger Spektroskopie, multimodalen Bildgebungsverfahren, hyperspektraler Bildgebung, Raman- und Resonance Raman Spektroskopie, oberflächenverstärkter Raman-Spektroskopie (SERS), plasmonenverstärkter Raman-Spektroskopie (PERS), schalenisolierter Nanopartikel-verstärkte Raman-Spektroskopie (SINERS), Räumlich versetzte Raman-Spektroskopie (SORS), Faserverstärkte Raman-Spektroskopie (FERS), Shifted-Excitation-Raman-Differenzspektroskopie (SERDS), spitzenverstärkter Raman-Spektroskopie (TERS) und kohärente Raman-Spektroskopie (coherent anti-Stokes Raman scattering, CARS), Infrarot-Spektroskopie, wie Nah-Infrarot-Spektroskopie (NIR); Ultraviolett-Spektroskopie (UV), sichtbares Spektroskopie (VIS), Terahertz-Spektroskopie (TR), Magnetresonanz-Spektroskopie (MR) und Massenspektroskopie.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (a) ein Weißlichtbild, Fluoreszenzbild, biophotonisches Spektroskopiebild oder eine digitale holografische Abbildung erzeugt wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe ausgewählt ist aus Blut, Blutplasma, Blutserum, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (cerebrospinal fluid, CSF), Urin, Speichel, einer Gewebeprobe, einer Biopsie, Zellen oder einer Zellkultur.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe eine Blutprobe ist und das Verfahren die Schritte umfasst: i. Probenvorbereitung einer Blutprobe für spektroskopische Detektionsverfahren ii. Optional: Aufnahme eines mikroskopischen Übersichtsbildes der Blutprobe, iii. Identifikation von Erythrozyten in der Blutprobe, optional im mikroskopischen Übersichtsbilds der Blutprobe, iv. Definition der gewünschten Messareale in den Erythrozyten, v. Erzeugen von Bildern der Erythozyten (etwa 200 Stück) mit spektralen Informationen mittels der mindestens einen spektroskopischen Methode, vi. Analyse der metabolischen Signatur mittels statistischer Methoden und durch Korrelation mit einer spektralen Referenzbibliothek von Reinsubstanzen, vii. Auswertung der Metaboliten-Signaturen in den Erythrozyten, viii. Diagnose der Erkrankung.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur Probenvorbereitung der Blutprobe ein Blutausstrich hergestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe eine Gewebeprobe oder eine Biopsie ist und das Verfahren die Schritte umfasst: i. Probenvorbereitung; ii. Optional: Erzeugung eines mikroskopischen Übersichtsbilds des histologischen Präparats, iii. Auswahl der gewünschten Messareale des histologischen Präparats, optional aus dem mikroskopischen Übersichtsbild, iv. Erzeugen eines Bildes mittels der mindestens einen spektroskopischen Methode, v. Analyse der metabolischen Signatur mittels statistischer Methoden und durch Korrelation mit einer spektralen Referenzbibliothek von Reinsubstanzen, vi. Auswertung der Metaboliten-Signaturen in den ausgewählten Messarealen, vii. Bestimmung der Metabolitenverteilung in der Gewebeprobe.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebeprobe eine Gewebeprobe der Leber ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die statistischen Methoden ausgewählt sind aus • unüberwachten und überwachten statistischen Methoden, wie beispielsweise statistische Methoden, die ausgewählt sind aus der Gruppe, enthaltend die Hauptkomponentenanalyse, die lineare Diskriminanzanalyse, Support-Vektor-Maschine, Partielle Kleinste-Quadrate-Regression, Random-Forest, neuronale Netzwerkanalyse, Machinelles Lernen; • und/oder Verfahren für die Probenklassifizierung und Visualisierung der Komponentenverteilung, entweder alleine oder in Kombination mit überwachten und unüberwachten statistischen Methoden, die ausgewählt sind aus der Gruppe enthaltend Abundanz Analysen und Clusteranalysemethoden, wie beispielsweise Vektorkomponentenanalyse, NFINDR und k-means-Clustering.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine spektroskopische Methode Raman-Spektroskopie, insbesondere kohärente Raman-Spektroskopie ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankung ausgewählt ist aus einer Stoffwechselerkrankung, Stoffwechselstörung oder einer proliferativen Erkrankung.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankung eine Stoffwechselerkrankung ist und aus der Gruppe ausgewählt wird, die Diabetes mellitus (Zuckerkrankheit), Erythropoetische Protoporphyrie, Hypertriglyceridämie, Phenylketonurie, Porphyrien, und Thesaurismose enthält.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankung eine Lebererkrankung oder eine Leberdysfunktion ist und aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus (aber nicht ausschließlich) Taurin- oder Glyzin-konjugierte und unkonjugierte Gallensäuren (wie z.B. Litocholsäure, Cholsäure, Chenodeoxycholsäure, Ursodeoxycholsäure, Obeticholsäure, Dehydrocholsäure), Glukose, Low-density lipoprotein, high-density lipoprotein, Albumin, Häm- und Hämaabauprodukte (Protoporphyrine).besteht.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die proliferative Erkrankung ausgewählt ist aus Krebs, Tumormetastasierung oder Tumorrezidiv.
Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen, umfassend das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und zusätzlich die Schritte: • Vergleichen der nachgewiesenen Menge eines oder mehrerer Schlüsselmetabolite in der biologischen Probe mit einer für eine normale Kontrollprobe charakteristischen Menge der Schlüsselmetabolite (Referenzbereich); und/oder • Vergleichen der Identität eines oder mehrerer Schlüsselmetabolite in der biologischen Probe mit den in einer normalen Kontrollprobe bzw. Referenzbereich vorhandenen Schlüsselmetaboliten; wobei die Anwesenheit zusätzlicher Schlüsselmetabolite oder die Abwesenheit von Schlüsselmetaboliten, vorzugsweise die Anwesenheit zusätzlicher Schlüsselmetabolite in der biologischen Probe im Vergleich zur normalen Kontrollprobe ein positiver Indikator für die Erkrankung ist; und/oder • Vergleichen des Musters an Schlüsselmetaboliten in der biologischen Probe mit dem Muster an Schlüsselmetaboliten in einer normalen Kontrollprobe bzw. mit einem Referenzbereich; wobei die Änderungen des Musters an Schlüsselmetaboliten in der biologischen Probe im Vergleich zur normalen Kontrollprobe ein positiver Indikator für die Erkrankung ist.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Diagnose einer Stoffwechselerkrankung, Stoffwechselstörung oder einer proliferativen Erkrankung.