WO2022167521A1 - Verfahren zur analyse von veränderungen von signaturen von schlüsselmetaboliten in biologischen proben - Google Patents

Verfahren zur analyse von veränderungen von signaturen von schlüsselmetaboliten in biologischen proben Download PDF

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WO2022167521A1
WO2022167521A1 PCT/EP2022/052577 EP2022052577W WO2022167521A1 WO 2022167521 A1 WO2022167521 A1 WO 2022167521A1 EP 2022052577 W EP2022052577 W EP 2022052577W WO 2022167521 A1 WO2022167521 A1 WO 2022167521A1
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WO
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sample
disease
spectroscopy
key metabolites
biological sample
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PCT/EP2022/052577
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Anuradha Ramoji
Adrian Tibor Press
Jürgen Popp
Michael Bauer
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Universitätsklinikum Jena
Leibniz-Institut Für Photonische Technologien E.V.
Friedrich-Schiller-Universität Jena
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    • G01N21/65—Raman scattering
    • G01N2021/653—Coherent methods [CARS]

Definitions

  • the invention relates to a method for analyzing a biological sample for changes in signatures of key metabolites in a disease, comprising
  • step (b) an image-based screening of the desired measurement areas determined in step (a) using at least one spectroscopic method, comprising o the identification and quantification of key metabolites of the metabolic disease, o the detection of changes in the key metabolites of the metabolic disease, and
  • the method according to the invention is particularly suitable for diagnosing metabolic diseases and proliferative diseases.
  • the invention is in the field of individualized medicine. This plays a particularly important role in complex disease processes.
  • the concept of "individualized” or “personalized” care which implies stratification of the patient based on better understanding of the complex course of the disease, is challenging but promising for the critically ill.
  • a more comprehensive monitoring of the metabolism using mass spectrometry to assess the "metabolome”, ie the "metaboi omics", is currently finding its way into clinical routine. 1
  • This technique can be performed in a "non-targeted” approach or to monitor specific groups of analytes.
  • the metabolome as a complex reaction network summarizes all characteristic metabolic properties of a cell, tissue or organism.
  • the metabolome includes:
  • Another aspect is the influence of the nutrient supply and the effect of active substances on the metabolism and the various functions of the cells, such as cell proliferation, differentiation and apoptosis.
  • metabolomics in English metabolomics or metabonomics. This includes the interaction of the metabolites contained therein, their identification and quantification (cf. proteome and genome).
  • the main analytical methods used in metabolomics are GC/MS and LC/MS, as well as NMR spectroscopy and ion mobility spectrometers. The methods can be broken down into separation techniques, ionization techniques and detection techniques. Since the metabolites can vary greatly in terms of their chemical composition and structure, it is often not sufficient to use just one analytical method to completely elucidate the metabolome of an organism. In addition, it is still not known how many metabolites there are.
  • the most common sample types are body fluids such as plasma or serum, but also urine, cerebrospinal fluid, synovial fluid, sputum or lavage. In addition, tissue hornogenate or cells or supernatants from cell cultures can be considered.
  • analytes such as the unconjugated and glycine/taurine-conjugated primary bile acids are detected using mass spectrometry, as in the study by Vanwijngarden et al. 4
  • bilirubin has traditionally been used exclusively to monitor outgoing liver function in the ICU, e.g., in the most widely used scoring system for multiple organ dysfunction, the Sepsis-related (sometimes sequential) organ failure assessment (SOFA) score, 2 recent evidence suggests this that bile acids could indicate liver dysfunction with higher sensitivity and specificity, 3 or at least increased largely independently of bilirubin could be.
  • SOFA organ failure assessment
  • clinically exogenous clearance assays are used. These include: the indocyanine green test (fluorescence-based measurement of excretory function); the galactose load test (injecting galactose and measuring the amount that is excreted by the kidneys); the C 14 -aminopyrine or 14 C-galactose breath test; and caffeine clearance.
  • Biochemical assays often require complex sample preparation and pre-analysis. The transport of the mostly sensitive biological samples is critical. Breath analysis is very complex. Mass spectrometric investigations (also in combination with exogenous clearance) are very time-consuming and place high demands on sample preparation and pre-analytics. There are also numerous clinical disadvantages. Biochemical assays are often imprecise, ie have low specificity, and do not provide accurate information about the status of the dysfunction. The assessment is often also based on liver damage parameters, which only partially indicate the loss of function and the type of loss of function. Differentiation of liver damage is not possible with these assays. Breath gas analysis is usually time-consuming and brings little More profit. Only individual analytes are examined.
  • US5615673 A describes a Raman (handheld) device for blood gas analysis in general.
  • the analysis method is based on Raman scattering without special resolution.
  • US7524671 B2 describes a Raman (handheld) device for the analysis of blood analytes in general.
  • the analysis method is based on Raman scattering without special resolution.
  • US6031233 B2 describes an infrared device for blood analysis in general.
  • the analysis method is based on IR absorption with no special resolution.
  • US20070178067 A1 describes a technical approach for identifying different cells/cell types in a cytological biopsy.
  • US 20080117416 A1 exclusively describes the use of coherent Raman techniques for medical, diagnostic and therapeutic purposes and calibration techniques for this.
  • the coherent Raman techniques are only used for the determination of a single analyte.
  • the described coherent Raman Techniques do not appear to be amenable to the determination or analysis of a combination of multiple analytes or the metabolome of cells or tissues.
  • the object of the invention was to provide methods for a more comprehensive assessment of the metabolism and the metabolome which do not have the disadvantages of the prior art.
  • the invention provides a method for analyzing biological samples for changes in signatures of key metabolites in a disease according to claim 1.
  • a biological sample means any type of biological material, including but not limited to blood and blood components (e.g. whole blood, blood plasma, blood serum), liquor, urine, saliva, (eu- and prokaryotic) cells (e.g. fibroblasts, bacteria ), infectious organic structures (e.g. viruses), tissues or any other sample containing key metabolites.
  • blood and blood components e.g. whole blood, blood plasma, blood serum
  • liquor e.g. whole blood, blood plasma, blood serum
  • liquor e.g. whole blood, blood plasma, blood serum
  • urine eu- and prokaryotic cells
  • cells e.g. fibroblasts, bacteria
  • infectious organic structures e.g. viruses
  • the level of key metabolites is detected in a body fluid sample derived from a mammal, most preferably a human.
  • body fluid refers to all fluids present in the human body, including but not limited to blood and blood components, lymph, urine, and cerebrospinal fluid (CSF), which contain key metabolites.
  • the blood sample may comprise whole blood or a plasma sample or a serum sample or fractions derived from these samples.
  • the sample can be treated before use, e.g. B. by preparation of plasma from blood, dilution of viscous liquids and the like.
  • the plasma sample is treated with an anticoagulant, such as. B. EDTA treated.
  • the biological sample can also be a tissue sample or a biopsy.
  • the biological sample is a sample selected from the group consisting of blood and blood components (e.g. whole blood, blood plasma, blood serum), cerebrospinal fluid (CSF), urine, saliva, a tissue sample, a biopsy, cells and a cell culture.
  • blood and blood components e.g. whole blood, blood plasma, blood serum
  • cerebrospinal fluid (CSF) urine
  • saliva a tissue sample, a biopsy, cells and a cell culture.
  • tissue sample e.g. whole blood, blood plasma, blood serum
  • CSF cerebrospinal fluid
  • the method of analyzing biological samples for changes in signatures of key metabolites in a disease includes the step of obtaining the biological sample from a subject.
  • the method according to the invention is carried out on a biological sample which has previously been taken from a subject.
  • subject refers to a mammal suffering from or suspected of suffering from a disease such as a metabolic disease or a cancer.
  • a disease such as a metabolic disease or a cancer.
  • subject refers to a human.
  • an optical image of the biological sample is generated by means of optical methods. This optical image is used to determine desired measurement areas in a biological sample.
  • Target areas of interest are, for example, certain cell types in a liquid biological sample, such as blood and blood components (e.g. whole blood, blood plasma, blood serum), cerebrospinal fluid (CSF), urine and saliva, in which key metabolites are suspected.
  • blood and blood components e.g. whole blood, blood plasma, blood serum
  • cerebrospinal fluid (CSF) cerebrospinal fluid
  • saliva in which key metabolites are suspected.
  • tissues sample “desired measurement areas” are, for example, those areas in which diseased cells that could have key metabolites are suspected.
  • a particular advantage of the invention is that the method provided can be used to analyze a combination of a large number of different analytes or even the metabolome of cells or tissues. With this, changes in signatures of key metabolites in a disease can be detected in biological samples and used to diagnose a metabolic disease, metabolic disorder or a proliferative disease. This is not yet known from the prior art.
  • Microscopic overview images can be generated using various methods, for example using bright field microscopy, dark field microscopy, phase contrast microscopy, differential interference contrast microscopy,
  • Fluorescence microscopy, polarization microscopy, confocal microscopy and multiphoton microscopy A white light image is usually generated first. Normal white light contains all colors. When it hits a tissue surface or biological sample, all colors are absorbed. As a result, however, there is often a lack of contrast. In another method known in the prior art, no white light is used to generate the optical image, but rather light that has only selected colors of the light spectrum. For example, a mixture of blue and green light is used in endoscopy. When blue and green light hits the tissue surface, it is strongly absorbed by the hemoglobin in the blood vessels.
  • the blue light is absorbed by the capillaries in the mucosa, while the green light penetrates deeper into the submucosal area, where it is reflected by the blood vessels. In this way, a significantly higher contrast can be generated between the blood vessels and the surrounding tissue than with white light. This is why such optical images are richer in contrast than white-light images.
  • the microscopic overview image is preferably generated using bright field microscopy, dark field microscopy, phase contrast microscopy, differential interference contrast microscopy, fluorescence microscopy, polarization microscopy, confocal microscopy or multiphoton microscopy
  • white light is sufficient for the purposes of the present invention, since the optical images for the selection of desired measurement areas are generated very quickly and without special requirements for the evaluation technology at high magnifications of the biological sample in the microscopic range are not intended to improve contrast above the microscopic range, such as in endoscopy. Consequently, preferably white light images are taken with a microscope, particularly preferably generated with a light microscope, very particularly preferably a bright field microscope.
  • the desired measurement areas determined in the first step are then examined for the presence of key metabolites.
  • the desired measurement areas determined in the white light image are subjected to an image-based screening, whereby a measurement method is used with which the key metabolites can be made visible in the submicroscopic range.
  • spectroscopic methods have proven to be particularly useful. In principle, this step can be performed with any light source and excitation wavelength suitable for spectral imaging.
  • Spectroscopic methods suitable for the purposes of the invention are selected, for example, from the group consisting of multiscale spectroscopy, multimodal imaging methods, hyperspectral imaging, Raman and resonance Raman spectroscopy, surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS), plasmon-enhanced Raman spectroscopy (PERS), shell-isolated Nanoparticle Enhanced Raman Spectroscopy (SINERS), Spatially Displaced Raman Spectroscopy (SORS), Fiber Enhanced Raman Spectroscopy (FERS), Shifted Excitation Raman Difference Spectroscopy (SERDS), Tip Enhanced Raman Spectroscopy (TERS), and Coherent Raman Spectroscopy (coherent anti-Stokes Raman scattering, CARS), infrared spectroscopy, such as near infrared spectroscopy (NIR); Ultraviolet spectroscopy (UV), visible spectroscopy (VIS), terahertz spectroscopy (TR
  • At least one spectrum of the biological sample is measured using at least one spectroscopic method.
  • more than one spectrum is measured with the at least one spectroscopic method of the biological sample. Between two and ten spectra, particularly preferably between two and five spectra, are preferably measured using the at least one spectroscopic method.
  • a spectrum of the biological sample is measured, but a multiple of spectra, each spectrum with another spectroscopic method is measured. Since the physical background of the various spectroscopic methods is fundamentally different, the information contained in the spectra of different spectroscopic methods also differs. The physical background of the spectroscopic method used according to the invention is well known to the person skilled in the art and will not be explained further in this context. Accordingly, the spectra obtained with different spectroscopic methods often contain information about the biological sample that complements each other. The combination of spectra obtained with different spectroscopic methods therefore significantly increases the quality of the determination of the signatures of key metabolites.
  • non-coherent spectroscopic methods which is selected, for example, from the group consisting of multiscale spectroscopy, multimodal imaging methods, hyperspectral imaging, Raman and resonance Raman spectroscopy, surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS), plasmon-enhanced Raman spectroscopy (PERS ), Shell-Isolated Nanoparticle Enhanced Raman Spectroscopy (SINERS), Spatially Displaced Raman Spectroscopy (SORS), Fiber Enhanced Raman Spectroscopy (FERS), Shifted Excitation Raman Differential Spectroscopy (SERDS), and Tip Enhanced Raman Spectroscopy (TERS), Infrared - spectroscopy, such as near-infrared spectroscopy (NIR); Ultraviolet spectroscopy (UV), visible spectroscopy (VIS), terahertz spectroscopy (TR), magnetic resonance spectroscopy (MR) and mass spectroscopy
  • NIR near-in
  • the method also includes the step of measuring at least one spectrum of the biological sample with 1 to 7 additional spectroscopic methods, preferably with 1 to 4 additional spectroscopic methods.
  • Raman spectroscopy, IR spectroscopy and mass spectroscopy are used in combination to measure spectra of the biological sample.
  • Raman spectroscopy and IR spectroscopy are used in combination to measure spectra of the biological sample.
  • at least two spectra are measured with the same spectroscopic method using different measurement settings.
  • measurement settings are understood to mean settings that are specific to a specific method and can influence the information obtained in the spectra. So e.g. B. in Raman spectroscopy spectra with different Raman excitation frequencies and different optical settings or in nuclear magnetic resonance spectroscopy spectra for different nuclei, z. B. or 13 C or different experimental setups. Similar to the use of different spectroscopic methods, the information contained in the spectra can complement each other and thus increase the quality of the determination of the signature of the key metabolites.
  • Raman spectroscopy is used as a spectroscopic method. In a further preferred embodiment, Raman spectroscopy is used with two different Raman excitation frequencies.
  • the image-based screening of the desired measurement areas determined in the white-light image is particularly preferably carried out using non-linear Raman spectroscopy.
  • This is a group of spectroscopic investigation methods based on the non-linear Raman scattering of light on solids or gases.
  • narrow-band lasers are used for excitation. These methods therefore belong to laser spectroscopy.
  • the difference to linear Raman spectroscopy is the special type of excitation. Either two laser beams of different frequencies (pump and Stokes laser) with suitable frequencies are required (e.g. with CARS) or several photons of a single laser beam (e.g. with SRS).
  • the photons are superimposed in the so-called Raman medium (depending on the application, a solid or atoms or molecules in the gaseous state).
  • the interaction of the photons with the matter of the medium creates a laser-like output beam.
  • the emitted beam is resonantly amplified precisely when the superimposition of the frequencies of the input photons corresponds to a Raman resonance.
  • the signal appears shifted to lower or higher frequencies relative to the frequency of the input photons by the amount of the Raman resonance.
  • These rays are called Stokes or anti-Stokes rays.
  • the group of non-linear Raman spectroscopies can be divided into three main methods according to the effect used:
  • CARS Coherent anti-Stokes Raman scattering
  • Coherent Raman spectroscopy is used, among other things, to investigate material properties, thermodynamic properties (e.g. temperature) or for species-selective microscopy. It is used, among other things, in molecular spectroscopy, plasma and combustion diagnostics, in microscopy and for quality assurance of diamonds. In addition, it can be used when examining biological systems to visualize almost any selectable type of molecule by exciting characteristic vibrational modes (CH2 vibration for lipids, amide vibration for proteins, phosphate vibration for DNA), which therefore do not first have to be labeled with fluorescent dyes.
  • characteristic vibrational modes CH2 vibration for lipids, amide vibration for proteins, phosphate vibration for DNA
  • the image-based screening of the desired measurement areas determined in the white-light image is therefore carried out using coherent Raman spectroscopy (CARS) or, also particularly preferably, in combination with non-coherent spectroscopy methods, as described above.
  • CARS coherent Raman spectroscopy
  • most spectroscopic methods require only small amounts of samples to perform. Accordingly, in one embodiment of the invention, between 11 and 150 pl, preferably between 3 opi and 100 pl, most preferably 50 pl of the biological sample are used to measure all spectra used in the method according to the invention. Since biological samples from the field of medical diagnostics have a limited volume, it is of great advantage that only a small part of the biological sample is required to carry out the method according to the invention. This enables a general untargeted screening diagnostics for all samples before or parallel to a targeted conventional laboratory diagnostics. Nevertheless, the majority of a biological sample is available for further diagnostics, e.g. B. the medical routine diagnostics in the laboratory.
  • key metabolites for a specific disease are identified and quantified.
  • changes in the key metabolites are recorded. This involves either comparing the amount of key metabolites quantified in the biological sample to the amount of the same key metabolites in a control sample, or comparing the biological sample to a control sample for the presence of certain key metabolites in the biological sample and the control sample or for the pattern of the key metabolites differs in both samples.
  • samples are taken regularly at time intervals, in which the identity and quantity of the key metabolites are determined and compared with the identity and quantity of the key metabolites in previous samples, such as the starting sample and/or a control sample.
  • suitable sampling intervals are, for example, one or more hours (e.g. over a period of 24 hours), one or more days (e.g. over a period of 1 week), one or more weeks (e.g. over a period of 1, 2 or 3 months) or one or more months (e.g. over a period of 3 months, 6 months, 9 months or 12 months).
  • Control sample means a biological sample from a healthy subject.
  • a correlating the nature or amount of one or more key metabolites with a probable diagnosis of a disease is sufficiently predictive that the subject has a disease specific to that key metabolite or pattern of key metabolites.
  • a normal level or pattern of key metabolite(s) as determined for a control sample isolated from a normal population indicates that the patient does not have a disease typical of the key metabolite(s) or pattern of key metabolites.
  • Positive evidence of disease based on an increased or decreased level of one or more key metabolites, or an altered pattern of key metabolites, compared to a normal control is generally considered along with other factors in the final determination of a particular disease. Therefore, the elevated or decreased levels of one or more key metabolites, or an altered pattern of key metabolites, in the subject being tested will typically be considered along with other accepted clinical symptoms of the particular disease in making a definitive diagnosis of such disease.
  • the method according to the invention can also be used to determine the distribution of the key metabolites in the biological sample, e.g. by visualizing the key metabolites in the biological sample.
  • the determination of the distribution of the key metabolites in the biological sample is preferably carried out in a tissue sample or a biopsy.
  • the image-based screening of the desired measurement areas determined in the white-light image using spectroscopic methods is preferably carried out in a device, such as a microscope, which is technically equipped to carry out spectroscopic analyzes at the microscopic level.
  • a device such as a microscope, with which both a white light image of the biological sample can be generated and an analysis of the biological sample can be carried out using a spectroscopic method, is particularly preferred.
  • the method for analyzing a biological sample for changes in signatures of key metabolites in a disease comprises the following steps:
  • step (a) the determination of desired measurement areas in the biological sample using an image of the biological sample generated using optical methods, (b) an image-based screening of the desired measurement areas determined in step (a) using at least one spectroscopic method, comprising a. the identification and quantification of key metabolites of the metabolic disease, b. detecting changes in key metabolites of the metabolic disease, and
  • the method according to the invention can also contain standard sample preparation steps familiar to a person skilled in the art for generating the optical image and/or the at least one spectrometric method.
  • the invention further relates to the use of the method for analyzing a biological sample for changes in signatures of key metabolites in a disease to diagnose a metabolic disease, metabolic disorder or a proliferative disease.
  • the "diagnosis of the disease” step of the method according to the invention then also includes the following steps:
  • the method according to the invention is based on the examination of body fluid samples which still contain cells, cell fragments or tissue fragments after the sampling. As a rule, this applies to the body fluids already mentioned: blood and blood components (eg whole blood, blood plasma, blood serum), cerebrospinal fluid (CSF), urine and saliva.
  • blood and blood components eg whole blood, blood plasma, blood serum
  • cerebrospinal fluid (CSF) cerebrospinal fluid
  • Blood samples e.g. whole blood, blood plasma, blood serum
  • Samples of the cerebrospinal fluid can contain, for example, myeloid and lymphoid cells, the occurrence of which is often disease-associated, cells of pathogens and tissue cells, e.g. tumor cells, and cell fragments of the aforementioned cells, which are required for carrying out the inventive procedures are suitable.
  • Urine samples can contain e.g. epithelial cells, disease-related cells of the myeolide and lymphoid lineages, cells of pathogens and tissue cells e.g. tumor cells and cell fragments of the aforementioned cells which are suitable for carrying out the method according to the invention.
  • Saliva samples can contain, for example, cells of the myeloid and lymphoid lineages, epithelial cells, disease-related cells of pathogens, and tissue cells, for example tumor cells, and cell fragments of the aforementioned cells, which are suitable for carrying out the method according to the invention.
  • the method of analyzing a biological sample for changes in key metabolite signatures in a disease comprises the steps i. Sample preparation of a body fluid sample for spectroscopic detection methods ii. Optional: Taking a microscopic overview image of the body fluid sample, iii. Identification of cells, cell fragments or tissue fragments in the body fluid sample or optionally in the microscopic overview image, iv. Definition of the desired measurement areas in the cells, cell fragments or
  • tissue fragments v. Generating images of the cells, cell fragments or tissue fragments, preferably around 200 pieces, with spectral information using the at least one spectroscopic method, vi. Analysis of the metabolic signature using statistical methods and by correlation with a spectral reference library of pure substances, vii. evaluating the metabolite signatures in the cells, cell fragments or tissue fragments, viii. diagnosis of the disease.
  • the method according to the invention is based on the examination of blood samples, with the analysis of the signatures of key metabolites of individual blood cells being carried out.
  • Erythrocytes are particularly suitable blood cells for the analysis of changes in signatures of key metabolites in disease.
  • Various diseases and special forms occur in the erythrocytes.
  • the number and appearance of erythrocytes and their signature of key metabolites change as a result of metabolic disorders, diseases and vitamin and iron deficiencies.
  • anemias One speaks of so-called anemias.
  • Erythrocytes are therefore particularly suitable for the method according to the invention.
  • the erythrocytes represent the desired measurement areas in the method according to the invention, in which the signature of key metabolites is to be analyzed.
  • the method for analyzing a biological sample for changes in signatures of key metabolites in a disease comprises the steps of i. Sample preparation of a blood sample for spectroscopic detection methods ii. Optional: recording of a microscopic overview image of the blood sample, iii. Identification of erythrocytes in the blood sample or optionally in the microscopic overview image, iv. Definition of the desired measurement areas in the erythrocytes, v. Generating images of the erythrocytes, preferably around 200, with spectral information using the at least one spectroscopic method, vi. Analysis of the metabolic signature using statistical methods and by correlation with a spectral reference library of pure substances, vii. evaluation of metabolite signatures in erythrocytes, viii. diagnosis of the disease.
  • a blood smear is usually prepared for microscopic examination. Any other method of sample preparation that enables blood cells to be detected and measured using spectroscopic methods (e.g. capillaries or flow cytometric methods) is just as suitable.
  • the method comprises the steps: i. sample preparation, ii. Optional: generation of a microscopic overview image of the histological specimen, iii. Selection of the desired measurement areas of the histological specimen, optionally from the microscopic overview image, iv. Generating an image using the at least one spectroscopic method, v. Analysis of the metabolic signature using statistical methods and by correlation with a spectral reference library of pure substances, vi. Evaluation of the metabolite signatures in the selected measurement areas, vii. Determination of the distribution of metabolites in the tissue sample.
  • the sample preparation according to step i. typically includes the production of a histological specimen, eg a frozen section, and the mounting of the histological specimen on a CaF2 foil for the microscopic examination.
  • tissue can be examined with the method according to the invention.
  • Tissue from the liver or tissue or biopsies with suspected proliferative diseases are preferably examined.
  • the key metabolites are preferably identified by correlation with a spectral reference library of pure substances. Such a procedure is known to the person skilled in the art.
  • the step of analyzing and evaluating the metabolic signature is preferably carried out using statistical methods.
  • the spectroscopy data can be analyzed by purely visual comparison to extract the information relevant to the disease, or by using appropriate statistical methods known and selected by those skilled in the art. All unsupervised and monitored statistical methods are suitable for this.
  • the statistical methods monitored include, for example, principal component analysis. Examples of supervised statistical models include linear discriminant analysis, support vector machine, partial least squares regression, random forest, neural network analysis, and machine learning.
  • methods for sample classification and visualization of component distribution can be used. Suitable methods for sample classification and visualization are, for example: abundance analysis and cluster analysis methods. These include, for example: vector component analysis, NFINDR and k-means clustering.
  • the method according to the invention is particularly suitable for diagnosing metabolic diseases, metabolic disorders and/or proliferative diseases.
  • a metabolic disease that can be diagnosed using the method according to the invention is, for example, a disease selected from the group consisting of diabetes mellitus (diabetes), erythropoietic protoporphyria, hypertriglyceridemia, phenylketonuria, porphyria and thesaurismosis.
  • the method according to the invention is particularly suitable for diagnosing a liver disease or liver dysfunction, which is preferably selected from the group containing inflammatory (e.g. autoimmune diseases, tumors), infectious (e.g. viral, bacterial), acute-toxic (e.g. poisoning by drugs), chronic -toxic (e.g. fibrotic/cirrhotic in chronic alcohol abuse).
  • inflammatory e.g. autoimmune diseases, tumors
  • infectious e.g. viral, bacterial
  • acute-toxic e.g. poisoning by drugs
  • chronic -toxic e.g. fibrotic/cirrhotic in chronic alcohol abuse.
  • restricted liver functions which lead to bil
  • Typical key metabolites for liver disease are taurine or glycine conjugated and unconjugated bile acids (such as lithocholic acid, cholic acid, chenodeoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, obeticholic acid, dehydrocholic acid), glucose, low-density lipoprotein, high-density lipoprotein, albumin , heme and hemaa building products (protoporphyrins).
  • bile acids such as lithocholic acid, cholic acid, chenodeoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, obeticholic acid, dehydrocholic acid
  • glucose low-density lipoprotein
  • high-density lipoprotein albumin
  • albumin heme and hemaa building products
  • Typical key metabolites for obstructive cholestasis are taurine or glycine conjugated and unconjugated bile acids (e.g. lithocholic acid, cholic acid, chenodeoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, obeticholic acid, dehydrocholic acid).
  • bile acids e.g. lithocholic acid, cholic acid, chenodeoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, obeticholic acid, dehydrocholic acid.
  • a proliferative disease that can be diagnosed using the method according to the invention is selected, for example, from cancer, tumor metastasis or tumor recurrence.
  • the method according to the invention is particularly suitable for diagnosing a cancer disease, which is preferably selected from the group consisting of (1) malignant tumors: carcinoma, fibrosarcoma, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, angiomyosarcoma, angiosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, osteosarcoma, malignant melanoma, meningeosarcoma, myeloid Leukemia, or Malignant lymphoma and lymphocytic leukemia and (2) benign tumors: adenoma, papilloma, fibroma, leiomyoma, rhabdomyoma, angiomyoma, hemangioma, lymphangioma, lipoma, chondroma, osteo, melanocyte nevus, meningioma, teratoma, or blastoma.
  • malignant tumors carcinoma, fibrosarcoma, lei
  • the invention has numerous advantages. This makes it possible to identify metabolites in erythrocytes using statistical methods such as abundance mapping and cluster analyses.
  • the erythrocytes can thus be used as "metabolic marker cells" for the identification of pathophysiological metabolic changes.
  • the method according to the invention now allows targeted metabolomics in cells and tissues based on spectroscopic imaging with a resolution in the (sub)micrometer range. Furthermore, the method allows the analysis of metabolite distributions in the tissue or in cells, as a result of which statements can be made about the severity of the course of a disease or about the stage of a disease.
  • metabolic fingerprints can be created and used to identify diseases. Due to the much larger amount of information that is processed in the method according to the invention, a more precise diagnosis is possible.
  • the method according to the invention can be used very widely - starting with liver diseases/liver dysfunction, through metabolic diseases in general, to tumor diagnostics and the diagnostics of congenital metabolic disorders.
  • the method can be used in miniaturized form in small benchtop laboratory devices. This is possible with already existing devices. Even without intensive optimization, short measurement times of ⁇ 20 minutes can be achieved.
  • the pre-analysis and the material costs are very low, if necessary only a drop of blood is necessary for the examinations.
  • the method can also be automated.
  • the method according to the invention also has advantages in the field of research, where the imaging of metabolites in particular plays a role.
  • Sample preparation is much easier than with MALDI imaging methods.
  • Correlative imaging e.g. hematoxylin and eosin staining (routine histopathological staining), and Raman spectroscopy) on the same tissue section is possible.
  • the tissue samples, in particular the tissue sections are not destroyed by the imaging.
  • desired regions i.e. desired measurement areas, can be defined in advance on standard preparations and then examined more closely for metabolic signatures using spectroscopic methods such as Raman spectroscopy.
  • spectral information allows for a "post-analysis" of existing data with spectra of new metabolites.
  • FIG. 1 shows an overview of the method for analyzing a biological sample for changes in signatures of key metabolites in the event of a disease; in particular, the acquisition of spectral images of erythrocytes and the analysis of the concentration and distribution of metabolites using statistical methods;
  • FIG. 2 shows the diagnosis of a liver dysfunction in the case of obstructive cholestasis in the mouse model
  • FIG. 3 the identification of selected metabolites (targeted metabolomics) in spectral data sets and their quantification by means of statistical methods
  • FIG. 4 Representation of the distribution of selected metabolites (“targeted metabolomics”) in histological preparations, e.g. of the liver.
  • Embodiment 1 Diagnosis of a liver dysfunction in obstructive cholestasis in the mouse model.
  • Hepatic dysfunction was diagnosed in mouse models of obstructive cholestasis based on an image-based screening of erythrocytes using Raman spectroscopy and the identification of key metabolites and their changes in the disease.
  • a definitive obstructive cholestasis is produced during abdominal surgery by double ligature of the bile duct. This prevents the outflow and excretion/metabolization of bile acid via the intestine and leads to a backlog of this in the liver and the organism.
  • control animals also underwent abdominal surgery without biliary duct ligation. In this way, the influence of bile stasis on metabolite changes in the plasma can be examined in more detail.
  • a drop of blood is taken from the animals from the tail vein (the tail vein is a peripheral medium-sized vessel in the animal, and corresponds to a small vein in humans).
  • the drop of blood is freshly applied to a CaF substrate glass and smeared like a blood smear ( Figure la, b).
  • Single erythrocytes are examined with a Raman spectrometer (inViaTM Qontor® confocal Raman microscope) equipped with a 1800 g/mm grating and a 532 nm excitation wavelength laser driven by a 50x/0.85NA Leica -Lens with a laser power of ⁇ 3 mW was focused on the object plane.
  • a Raman spectrometer inViaTM Qontor® confocal Raman microscope
  • the Raman spectra of the cells were recorded with a laser exposure of 1s/spectrum and at least 200 cells/mouse are examined.
  • the cleaned spectral data of individual Erythrocytes are evaluated and compared using Principle Component Analysis (PCA).
  • PCA Principle Component Analysis
  • Embodiment 2 Representation of the distribution of selected metabolites (“targeted metabolomics”) in histological preparations of the liver.
  • FIG. 3 further molecular characteristics can be identified (FIG. 3). This is done by comparing and then assigning the characteristic Raman peaks observed in the Raman spectra to a Raman spectral library of pure substances. Comparison with a library of bile acids allows the identification of key metabolites (bile acids): glycine dexocycholic acid (GDCA), tauro-chenodeoxycholic acid (TCDCA) and chenodeoxycholic acid (CDCA).
  • GDCA glycine dexocycholic acid
  • TCDCA tauro-chenodeoxycholic acid
  • CDCA chenodeoxycholic acid
  • the comparison of reference spectra with a Raman microspectroscopy image of the liver allows the representation of the distribution of these metabolites in the tissue.
  • This comparison is done using clustering methods (e.g. kmeans, NFINDR, hierarchical/partitional clustering, fuzzy clustering, model/density/distance/distribution based clustering,
  • Raman spectra of one or more reference substances can also be fed into the algorithms. This improves in some situations the identification of distinct spectral components and the visualization of the tissue distribution of these metabolites. By feeding reference spectra in this way, local changes such as the accumulation of CDCA in vesicles in this example (FIG. 4) can also be made visible.
  • the Raman spectroscopy image of the liver tissue was recorded with another commercial Raman device (CRM 300, WITec GmbH).
  • a cryosection of liver tissue (0.01 mm thick) is prepared on a CaF2 slide.
  • the Raman spectrometer is equipped with a 600 g/mm grating and an excitation wavelength of 532 nm with a power of 35 mW.
  • Raman spectra were recorded in scanning mode (scanned area 0.2 mm x 0.2 mm) with 0.0005 mm step size and 0.5s laser exposure/spectrum.
  • the laser light was focused onto the tissue with a 100x/0.75NA Zeiss objective and a 0.1mm fiber was used to collect the Raman signal.
  • the tissue Raman spectra are analyzed using the k-means clustering method to generate a Raman image and three prominent cluster spectra were extracted.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüssel-Metaboliten bei einer Erkrankung, umfassend (a) die Ermittlung gewünschter Messareale in der biologischen Probe anhand eines, mittels optischer Methoden erzeugten Bildes der biologischen Probe, (b) ein bild-basiertes Screening der in Schritt (a) ermittelten gewünschten Messareale mittels mindestens einer spektroskopischen Methode, umfassend - die Identifikation und Quantifizierung von Schlüssel-Metaboliten der Stoffwechselerkrankung, - die Erfassung von Änderungen der Schlüssel-Metaboliten der Stoffwechselerkrankung, und (c) die Diagnose einer Erkrankung oder die Bestimmung der Verteilung der Schlüssel-Metaboliten in der biologischen Probe. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders für die Diagnose von Stoffwechselerkrankungen und proliferativen Erkrankungen.

Description

Verfahren zur Analyse von Veränderungen von Signaturen von Schüsselmetaboliten in biologischen Proben
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüssel-Metaboliten bei einer Erkrankung, umfassend
(a) die Ermittlung gewünschter Messareale in der biologischen Probe anhand eines, mittels optischer Methoden erzeugten Bildes der biologischen Probe,
(b) ein bild-basiertes Screening der in Schritt (a) ermittelten gewünschten Messareale mittels mindestens einer spektroskopischen Methode, umfassend o die Identifikation und Quantifizierung von Schlüssel-Metaboliten der Stoffwechselerkrankung, o die Erfassung von Änderungen der Schlüssel-Metaboliten der Stoffwechselerkrankung, und
(c) die Diagnose einer Erkrankung oder die Bestimmung der Verteilung der Schlüssel-Metaboliten in der biologischen Probe.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders für die Diagnose von Stoffwechselerkrankungen und proliferativen Erkrankungen.
Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der individualisierten Medizin. Diese spielt insbesondere bei komplexen Krankheitsverläufen eine Rolle. Das Konzept der "individualisierten" oder "personalisierten" Versorgung, das eine Stratifizierung des Patienten auf der Grundlage einer besseren Einschätzung des komplexen Krankheitsverlaufs impliziert, ist eine Herausforderung, die für Schwerkranke jedoch viel versprechend ist. Eine umfassendere Überwachung des Stoffwechsels mit Hilfe der Massenspektrometrie zur Beurteilung des "Metaboloms", d.h. der "Metaboi omik", hält derzeit Einzug in die klinische Routine.1 Diese Technik kann in einem "ungezielten" Ansatz oder zur Überwachung spezifischer Gruppen von Analyten durchgeführt werden. Das Metabolom als komplexes Reaktionsnetzwerk fasst alle charakteristischen Stoffwechsel-Eigenschaften einer Zelle bzw. eines Gewebes oder Organismus zusammen. Der Begriff Metabolom wurde als „Summe aller Stoffwechselprodukte (Metabolite)“ in Analogie zu den Begriffen Genom, Transkriptom und Proteom geprägt und entsprechend benannt. Das Wort leitet sich von Metabolismus (= Stoffwechsel) ab. Gelegentlich wird für Metabolom auch die Bezeichnung Metabonom verwendet, besonders im Zusammenhang mit der Toxizitätsbeurteilung von Wirkstoffen.
Das Metabolom umfasst:
• die Durchflussraten (= Umsatzraten), Metabolit-Spiegel und Enzym-aktivitäten der einzelnen Stoffwechselwege,
• die Interaktionen zwischen den verschiedenen Stoffwechselwegen sowie
• die Kompartimentierung der verschiedenen Stoffwechselwege innerhalb der Zellen.
Ein weiterer Gesichtspunkt ist der Einfluss des Nährstoff-Angebotes sowie der Effekt von Wirksubstanzen auf den Stoffwechsel und die verschiedenen Funktionen der Zellen, wie Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose.
Die Erforschung des Metaboloms wird als Metabolomik bezeichnet (im Englischen metabolomics oder metabonomics). Diese umfasst die Wechselwirkung der darin enthaltenen Metabolite, deren Identifizierung und Quantifizierung (vgl. Proteom und Genom). Als wesentliche Analysenmethoden werden in der Metabolomik GC/MS und LC/MS sowie NMR- Spektroskopie und lonen-Mobilitäts-Spektrometer eingesetzt. Dabei kann man die Methoden aufspalten in Separationstechniken, lonisationstechniken und Detektionstechniken. Da die Metaboliten von ihrer chemischen Zusammensetzung und Struktur sehr unterschiedlich sein können, reicht es oft nicht aus, nur eine Analysemethode zu benutzen, um das Metabolom eines Organismus komplett aufzuklären. Dazu kommt, dass es bis heute nicht bekannt ist, wie viele Stoffwechselprodukte es überhaupt gibt. Die häufigsten Probentypen sind Körperflüssigkeiten wie Plasma oder Serum, aber auch Harn, Liquor cerebrospinalis, Synovialflüssigkeit, Sputum oder Lavagen. Daneben kommen Geweb shorn ogenate bzw. Zellen oder Überstände von Zellkulturen in Betracht.
Im Bereich der Lebererkrankungen werden mit Hilfe der Massenspektrometrie Analyten wie z.B. die unkonjugierten und Glycin/Taurin-konjugierten primären Gallensäuren erfasst, wie in der Studie von Vanwijngarden et al. 4 Während Bilirubin traditionell ausschließlich zur Überwachung der ausscheidenden Leberfunktion auf der Intensivstation dient, z.B., im am weitesten verbreiteten Scoringsystem für multiple Organdysfunktionen, dem Sepsis-related (manchmal auch Sequential) organ failure assessment (SOFA)-Score,2 deuten neuere Erkenntnisse darauf hin, dass Gallensäuren eine Leberfunktionsstörung mit höherer Sensitivität und Spezifität anzeigen könnten,3 oder zumindest weitgehend unabhängig von Bilirubin erhöht sein könnten.4 In jedem Fall können diese bescheidenen Erhöhungen des Bilirubins, selbst unter Berücksichtigung der Ungenauigkeit der gegenwärtigen klinischen Methoden zur Beurteilung kleinster Veränderungen, mit einer ausgeprägten Beeinträchtigung des Metabolismus der Phasen I und II in Verbindung gebracht werden, was bei diesen Patienten mit einer negativen Prognose assoziiert ist.5Neben der Analyse von Metaboliten aus dem Plasma und Serum mit der Massenspektrometrie werden in der klinischen Funktionsdiagnostik bislang zahlreiche verschiedene Methoden eingesetzt, um Stoffwechselstörungen zu diagnostizieren. Dazu gehören biochemische Assays (die sogenannte klinische Chemie), die Atemgasanalytik und die Pulsdensitometrie. Stoffwechselstörungen der Leber werden zum einen mit Hilfe von endogenen Clearance-Assays untersucht. Die biochemische Messung von Enzymaktivitaten (Transaminasen, alkaline Phosphatase) werden zur Beurteilung des Leberschadens herangezogen, und zusammen mit Leberfunktion assoziierten Metaboliten (Cholesterin, Bilirubin, Albumin) zur Untersuchung der Leberfunktion kombiniert. .
Des Weiteren kommen klinisch exogene Clearance-Assays zum Einsatz. Dazu gehören unter anderem: der Indocyaningrün-Test (fluoreszenzbasierte Messung der exkretori sehen Funktion); der Galaktosebelastungstest (Injektion von Galaktose und Messung des Anteils, der über die Niere ausgeschieden wird); der C14-Aminopyrin oder 14C-Galaktose Atemtest; und die Koffein-Clearance.
Unterstützt werden diese Assays im experimentellen Bereich mit bildgebenden Untersuchungsmethoden, die auf dem Matrix- Assistierten Laser-Desorption-Ionisierungs (MALDI) Imaging beruhen.
Die konventionell eingesetzten Methoden weisen jedoch zahlreiche Nachteile auf. Biochemische Assays bedürfen oft einer aufwändigen Probenvorbereitung und Präanalytik. Kritisch ist der Transport der meist empfindlichen biologischen Proben. Atemgasanalytik ist sehr aufwändig. Massenspektrometrische Untersuchungen (auch in Kombination mit exogener Clearance) sind sehr zeitaufwändig und stellen hohe Anforderungen an die Probenvorbereitung und Präanalytik. Dazu kommen zahlreiche klinische Nachteile. Biochemische Assays sind oft unpräzise, d.h. besitzen eine geringe Spezifität, und geben keinen genauen Aufschluss über den Stand der Dysfunktion. Oftmals basiert die Einschätzung auch auf Leberschädigungsparametern, die nur teilweise auf den Funktionsverlust und die Art des Funktionsverlusts hinweisen. Eine Differenzierung des Leberschadens ist mit diesen Assays nicht möglich. Die Atemgasanalytik ist in der Regel zeitaufwändig und bringt wenig Mehrgewinn. Es werden nur einzelne Analyte untersucht. Die Aussagekraft beschränkt sich hier, genauso wie bei der Fluoreszenzangiographie (Indocyanin Clearance Test) auf die Aussage der Leberfunktion. Die Art der Funktionsstörung kann nur indirekt beurteilt werden. Bei der Bildgebung von Metaboliten (Forschung) mittels MALDI gestaltet sich die Probenpräparation sehr aufwendig: Es werden spezielle beschichtete (Matrix) Objektträger verwendet. Für verschiedene Metabolitengruppen müssen verschiedene Beschichtungen verwendet werden. Bestimmte Metabolitengruppen können nicht gleichzeitig an einer Probe vermessen werden. Durch die Bildgebung wird die Probe in der Regel zerstört, eine Analytik im Anschluss ist nicht möglich. Die maximale erzielbare Auflösung ist relativ gering (Mikrometer-Maßstab) .
Es besteht deshalb der Bedarf, verbesserte Methoden für eine umfassendere Beurteilung des Stoffwechsels und des Metaboloms bereitzustellen. Im Bereich der Lebererkrankungen werden solche verbesserten Methoden wahrscheinlich die vorgefasste Vorstellung einer Leberfunktionsstörung, die ein eher spätes und seltenes Ereignis auf der Intensivstation widerspiegelt, in Frage stellen und könnten geeignete Instrumente sein, um die hepatobiliäre Funktion besser zu überwachen sowie die metabolischen Bedürfnisse und die Emährungsunterstützung bei Schwerkranken zu personalisieren6.
US5615673 A beschreibt ein Raman-(Hand)Gerät für die Blutgasanalyse im Allgemeinen. Die Analysemethode basiert auf Raman-Streuung ohne spezielle Auflösung.
US7524671 B2 beschreibt ein Raman-(Hand)Gerät für die Analyse von Blutanalyten im Allgemeinen. Die Analysemethode basiert auf Raman-Streuung ohne spezielle Auflösung.
US6031233 B2 beschreibt ein Infrarot-Gerät für die Blutanalyse im Allgemeinen. Die Analysemethode basiert auf IR- Absorption ohne spezielle Auflösung.
US20070178067 Al beschreibt einen technischen Ansatz zur Identifizierung verschiedener Zellen/Zelltypen in einer zytologischen Biopsie.
US 20080117416 Al beschreibt ausschließlich die Verwendung von kohärenten Raman- Techniken für medizinische, diagnostische und therapeutische Zwecke und Kalibrierungstechniken dafür. Die kohärenten Raman-Techniken werden dabei lediglich für die Bestimmung eines einzelnen Analyten verwendet. Die beschriebenen kohärenten Raman- Techniken scheinen für die Bestimmung bzw. Analyse einer Kombination aus einer Vielzahl verschiedener Analyten oder des Metaboloms von Zellen oder Geweben nicht geeignet zu sein.
Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, Methoden für eine umfassendere Beurteilung des Stoffwechsels und des Metaboloms bereitzustellen, die die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen.
Zur Lösung dieser Aufgabe stellt die Erfindung ein Verfahren zur Analyse von biologischen Proben nach Veränderungen von Signaturen von Schüsselmetaboliten bei einer Erkrankung gemäß Anspruch 1 bereit.
Erfindungsgemäß wird unter einer „biologischen Probe“ jede Art biologischen Materials verstanden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Blut und Blutbestandteile (z.B. Vollblut, Blutplasma, Blutserum), Liquor, Urin, Speichel, (eu- und prokaryotische) Zellen (z.B. Fibroblasten, Bakterien), infektiöse organische Strukturen (z.B. Viren), Gewebe oder jede andere Probe, die Schlüsselmetaboliten enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Menge an Schlüsselmetaboliten in einer Körperflüssigkeitsprobe nachgewiesen, die von einem Säugetier, am meisten bevorzugt einem Menschen, stammt. Der Begriff "Körperflüssigkeit" bezieht sich auf alle Flüssigkeiten, die im menschlichen Körper vorhanden sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Blut und Blutbestandteile, Lymphe, Urin und Zerebrospinalflüssigkeit (CSF), die Schlüsselmetabolite enthalten. Die Blutprobe kann z.B. Vollblut oder eine Plasmaprobe oder eine Serumprobe oder von diesen Proben abgeleitete Fraktionen umfassen. Die Probe kann vor der Verwendung behandelt werden, z. B. durch Aufbereitung von Plasma aus Blut, Verdünnung viskoser Flüssigkeiten und dergleichen. Vorzugsweise wird die Plasmaprobe mit einem Antikoagulans, wie z. B. EDTA, behandelt.
Die biologische Probe kann auch eine Gewebeprobe oder eine Biopsie sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die biologische Probe eine Probe, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Blut und Blutbestandteile (z.B. Vollblut, Blutplasma, Blutserum), Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (cerebrospinal fluid, CSF), Urin, Speichel, eine Gewebeprobe, eine Biopsie, Zellen und eine Zellkultur. Besonders bevorzugt sind solche Körperflüssigkeitsproben, in denen nach der Probenahme noch Zellen, Zellfragmente oder Gewebefragmente enthalten sind. Dies trifft in der Regel auf die bereits genannten Körperflüssigkeiten Blut und Blutbestandteile (z.B. Vollblut, Blutplasma, Blutserum), Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (cerebrospinal fluid, CSF), Urin und Speichel zu.
In einer Ausführungsform der Erfindung schließt das Verfahren zur Analyse von biologischen Proben nach Veränderungen von Signaturen von Schüsselmetaboliten bei einer Erkrankung den Schritt der Entnahme der biologischen Probe von einem Probanden ein. Besonders bevorzugt ist es jedoch, wenn das erfindungsgemäße Verfahren an einer biologischen Probe durchgeführt, die zuvor von einem Probanden entnommen worden ist.
Der Begriff "Proband" bezieht sich auf ein Säugetier, das an einer Erkrankung, wie beispielsweise einer Stoffwechselerkrankung oder einer Krebserkrankung leidet oder bei dem der Verdacht besteht, dass es daran leidet. Vorzugsweise bezieht sich der Begriff "Proband" auf einen Menschen.
Dabei hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn optische Methoden mit spektroskopischen Methoden in einer einfachen Art und Weise kombiniert werden. Mittels optischer Methoden wird zunächst ein optisches Bild der biologischen Probe erzeugt. Dieses optische Bild wird dazu verwendet, gewünschte Messareale in einer biologischen Probe zu ermitteln. „Gewünschte Messareale“ sind in einer flüssigen biologischen Probe, wie Blut und Blutbestandteilen ( z.B. Vollblut, Blutplasma, Blutserum), Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (cerebrospinal fluid, CSF), Urin und Speichel, beispielsweise bestimmte Zelltypen, in denen Schlüsselmetabolite vermutet werden. In einer Gewebeprobe sind „gewünschte Messareale“ beispielsweise solche Bereiche, in den erkrankte Zellen vermutet werden, die Schlüsselmetabolite aufweisen könnten.
Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass mit dem bereitgestellten Verfahren die Analyse einer Kombination aus einer Vielzahl verschiedener Analyten oder gar des Metaboloms von Zellen oder Geweben durchgeführt werden kann. Damit können in biologischen Proben Veränderungen von Signaturen von Schüsselmetaboliten bei einer Erkrankung erkannt werden und zur Diagnose einer Stoffwechselerkrankung, Stoffwechselstörung oder einer proliferativen Erkrankung genutzt werden. Dies ist so aus dem Stand der Technik noch nicht bekannt.
Konventionell wird bei Untersuchungen in der Medizin zunächst ein mikroskopisches Übersichtsbild erzeugt. Mikroskopische Übersichtsbilder können mit verschiedenen Methoden erzeugt werden, zum Beispiel mittels Hellfeldmikroskopie, Dunkelfeldmikroskopie, Phasenkontrastmikroskopie, Differentialinterferenzkontrastmikroskopie,
Fluoreszenzmikroskopie, Polarisationsmikroskopie, Konfokalmikroskopie und Multiphotonenmikroskopie. Üblicherweise wird zunächst ein Weißlichtbild erzeugt. Normales Weißlicht enthält alle Farben. Wenn es auf eine Gewebeoberfläche oder eine biologische Probe trifft, werden alle Farben absorbiert. Dadurch mangelt es dem allerdings oft an Kontrast. Bei einer anderen, im Stand der Technik bekannten Methode, wird zur Erzeugung des optischen Bildes kein Weißlicht, sondern Licht verwendet, dass nur ausgewählte Farben des Lichtspektrums aufweist. So wird beispielsweise in der Endoskopie eine Mischung aus blauem und grünem Licht verwendet. Wenn blaues und grünes Licht auf die Gewebeoberfläche trifft, wird es vom Hämoglobin in den Blutgefäßen stark absorbiert. Das blaue Licht wird dabei von den Kapillargefäßen in der Schleimhaut absorbiert, wohingegen das grüne Licht tiefer in den submukösen Bereich eindringt, wo es von den Blutgefäßen reflektiert wird. Auf diese Weise kann ein wesentlich höherer Kontrast zwischen den Blutgefäßen und dem umgebenden Gewebe erzeugt werden als mit Weißlicht. Deshalb sind derartige optische Bilder kontrastreicher als Weißlichtbilder.
Sofern im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ein mikroskopisches Übersichtsbild erzeugt wird, wird das mikroskopische Übersichtsbild vorzugsweise mittels Hellfeldmikroskopie, Dunkelfeldmikroskopie, Phasenkontrastmikroskopie, Differentialinterferenzkontrastmikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie, Polarisationsmikroskopie, Konfokalmikroskopie oder Multiphotonenmikroskopie erzeugt
Es hat sich allerdings erwiesen, dass die Nutzung von Weißlicht für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ausreichend ist, da die optischen Bilder für die Auswahl gewünschter Messareale bei hohen Vergrößerungen der biologischen Probe im mikroskopischen Bereich sehr schnell und ohne besondere Anforderungen an die Auswertetechnik erzeugt werden und nicht der Kontrastverbesserung oberhalb des mikroskopischen Bereichs, wie beispielsweise in der Endoskopie, dienen. Folglich werden vorzugsweise Weißlichtbilder mit einem Mikroskop, besonders bevorzugt mit einem Lichtmikroskop, ganz besonders bevorzugt einem Hellfeldmikroskop erzeugt.
Erfindungsgemäß werden danach die im ersten Schritt ermittelten gewünschten Messareale auf das Vorhandensein von Schlüsselmetaboliten untersucht. Hierzu werden die im Weißlichtbild ermittelten gewünschten Messareale einem bild-basierten Screening unterzogen, wobei eine Messmethode zum Einsatz kommt, mit der die Schlüsselmetaboliten im submikroskopischen Bereich sichtbar gemacht werden können. Hierfür haben sich spektroskopische Methoden als besonders zweckmäßig erwiesen. Dieser Schritt kann prinzipiell mit jeder Lichtquelle und Anregungswellenlänge, die sich für die spektrale Bildgebung eignet, durchgeführt werden.
Für die Zwecke der Erfindung geeignete spektroskopische Methoden sind beispielsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus multiskaliger Spektroskopie, multimodalen Bildgebungsverfahren, hyperspektraler Bildgebung, Raman- und Resonance Raman Spektroskopie, oberflächenverstärkter Raman-Spektroskopie (SERS), plasmonenverstärkter Raman-Spektroskopie (PERS), schalenisolierter Nanopartikel-verstärkte Raman- Spektroskopie (SINERS), Räumlich versetzte Raman-Spektroskopie (SORS), Faserverstärkte Raman-Spektroskopie (FERS), Shifted-Excitation-Raman-Differenzspektroskopie (SERDS), spitzenverstärkter Raman-Spektroskopie (TERS) und kohärente Raman-Spektroskopie (coherent anti-Stokes Raman scattering, CARS), Infrarot-Spektroskopie, wie Nah-Infrarot- Spektroskopie (NIR); Ultraviolett-Spektroskopie (UV), sichtbares Spektroskopie (VIS), Terahertz-Spektroskopie (TR), Magnetresonanz-Spektroskopie (MR) und Massenspektroskopie.
Erfindungsgemäß wird mindestens ein Spektrum der biologischen Probe mit mindestens einer spektroskopischen Methode gemessen.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird mehr als ein Spektrum mit der mindestens einen spektroskopischen Methode der biologischen Probe gemessen. Vorzugsweise werden zwischen zwei bis zehn Spektren, besonders bevorzugt zwischen zwei bis fünf Spektren mit der mindestens einen spektroskopischen Methode gemessen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird nicht nur ein Spektrum der biologischen Probe gemessen, sondern ein Vielfaches von Spektren, wobei jedes Spektrum mit einer anderen spektroskopischen Methode gemessen wird. Da der physikalische Hintergrund der verschiedenen spektroskopischen Methoden grundsätzlich unterschiedlich ist, unterscheidet sich auch die in den Spektren verschiedener spektroskopischer Methoden enthaltene Information. Die physikalischen Hintergründe der erfindungsgemäß verwendeten spektroskopischen Methode sind dem Fachmann gut bekannt und werden in diesem Zusammenhang nicht weiter erläutert. Dementsprechend enthalten die mit unterschiedlichen spektroskopischen Methoden gewonnenen Spektren oft Informationen über die biologische Probe, die sich gegenseitig ergänzen. Die Kombination von Spektren, die mit unterschiedlichen spektroskopischen Methoden gewonnen werden, erhöht daher die Qualität der Bestimmung der Signaturen von Schlüsselmetaboliten erheblich.
Besonders bevorzugt ist die Kombination von nicht kohärenten spektroskopische Methoden, die beispielsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus multiskaliger Spektroskopie, multimodalen Bildgebungsverfahren, hyperspektraler Bildgebung, Raman- und Resonance Raman Spektroskopie, oberflächenverstärkter Raman-Spektroskopie (SERS), plasmonenverstärkter Raman-Spektroskopie (PERS), schalenisolierter Nanopartikel-verstärkte Raman-Spektroskopie (SINERS), Räumlich versetzte Raman-Spektroskopie (SORS), Faserverstärkte Raman-Spektroskopie (FERS), Shifted-Excitation-Raman- Differenzspektroskopie (SERDS) und spitzenverstärkter Raman-Spektroskopie (TERS), Infrarot-Spektroskopie, wie Nah-Infrarot-Spektroskopie (NIR); Ultraviolett-Spektroskopie (UV), sichtbares Spektroskopie (VIS), Terahertz-Spektroskopie (TR), Magnetresonanz- Spektroskopie (MR) und Massenspektroskopie, da gerade diese Methoden es erlauben, die Analyse einer Kombination aus einer Vielzahl verschiedener Analyten oder gar des Metaboloms von Zellen oder Geweben durchzuführen.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren ferner den Schritt, jeweils mindestens ein Spektrum der biologischen Probe mit 1 bis 7 weiteren spektroskopischen Methoden, vorzugsweise mit 1 bis 4 weiteren spektroskopischen Methoden zu messen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Raman-Spektroskopie, IR- Spektroskopie und Massenspektroskopie in Kombination verwendet, um Spektren der biologischen Probe zu messen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Raman-Spektroskopie und IR-Spektroskopie in Kombination verwendet, um Spektren der biologischen Probe zu messen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden mindestens zwei Spektren mit der gleichen spektroskopischen Methode unter Verwendung unterschiedlicher Messeinstellungen gemessen. Unter Messeinstellungen werden erfindungsgemäß Einstellungen verstanden, die für ein bestimmtes Verfahren spezifisch sind und die in den Spektren gewonnenen Informationen beeinflussen können. So können z. B. in der Raman- Spektroskopie Spektren mit unterschiedlichen Raman-Anregungsfrequenzen und unterschiedlichen optischen Einstellungen oder in der Kernspinresonanz-Spektroskopie Spektren für unterschiedliche Kerne, z. B.
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oder 13C oder unterschiedliche Versuchsaufbauten, gewonnen werden. Analog zur Verwendung unterschiedlicher spektroskopischer Methoden können sich die in den Spektren enthaltenen Informationen gegenseitig ergänzen und somit die Qualität der Bestimmung der Signatur der Schlüsselmetabolite erhöhen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Raman-Spektroskopie als eine spektroskopische Methode verwendet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Raman-Spektroskopie mit zwei unterschiedlichen Raman-Anregungsfrequenzen eingesetzt.
Besonders bevorzugt erfolgt das bild-basierte Screening der im Weißlichtbild ermittelten gewünschten Messareale mit der nichtlinearen Raman-Spektroskopie. Darunter versteht man eine Gruppe von spektroskopischen Untersuchungsverfahren, die auf der nichtlinearen Raman- Streuung von Licht an Festkörpern oder Gasen basiert. Zur Anregung werden, in der Regel schmalbandige, Laser eingesetzt. Diese Verfahren gehören deshalb zur Laserspektroskopie. Der Unterschied zur linearen Raman-Spektroskopie besteht in der besonderen Anregungsart. Dabei sind entweder zwei Laserstrahlen unterschiedlicher Frequenz (Pump- und Stokes-Laser) mit geeigneten Frequenzen erforderlich (z. B. bei CARS) oder mehrere Photonen eines einzelnen Laserstrahls (z. B. bei SRS). Die Photonen werden in dem so genannten Raman- Medium (je nach Anwendung ein Festkörper oder Atome bzw. Moleküle im gasförmigen Zustand) überlagert. Durch die Wechselwirkung der Photonen mit der Materie des Mediums entsteht dabei ein laser-ähnlicher Ausgangsstrahl. Der ausgesendete Strahl wird genau dann resonant verstärkt, wenn die Überlagerung der Frequenzen der Eingangs-Photonen einer Raman-Resonanz entspricht. Das Signal erscheint um den Betrag der Raman-Resonanz zu niedrigeren bzw. höheren Frequenzen relativ zur Frequenz der Eingangs-Photonen verschoben. Diese Strahlen werden Stokes- bzw. Anti-Stokes-Strahlen genannt. Die Gruppe der nichtlinearen Raman-Spektroskopien lässt sich nach dem ausgenutzten Effekt in drei Hauptverfahren unterteilen:
• Induzierte Raman-Streuung, auch stimulierte Raman-Streuung genannt (engl. stimulated Raman scattering, SRS);
• Kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (engl. coherent anti-Stokes Raman scattering, CARS);
• Hyper-Raman -Effekte (engl.: Hyper-Raman Effects)
Die kohärente Raman-Spektroskopie (CARS) dient unter anderem zur Untersuchung von Materialeigenschaften, thermodynamischen Eigenschaften (z. B. Temperatur) oder auch zur spezies-selektiven Mikroskopie. Sie wird unter anderem in der Molekülspektroskopie, der Plasma- und Verbrennungsdiagnostik, in der Mikroskopie und zur Qualitätssicherung von Diamanten eingesetzt. Außerdem kann sie bei der Untersuchung biologischer Systeme zur Sichtbarmachung von fast beliebigen wählbaren Molekülarten durch Anregung charakteristischer Schwingungsmodi (CH2-Schwingung für Lipide, Amidschwingung für Proteine, Phosphatschwingung für DNA) genutzt werden, die deshalb nicht erst durch Fluoreszenzfarbstoffe markiert werden müssen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt das bild-basierte Screening der im Weißlichtbild ermittelten gewünschten Messareale deshalb mittels kohärenter Raman-Spektroskopie (CARS), oder, ebenfalls besonders bevorzugt, in Kombination mit nicht kohärenten Spektroskopiemethoden, wie oben beschrieben.
Vorteilhafterweise benötigen die meisten spektroskopischen Methoden nur geringe Mengen an Proben zur Durchführung. Dementsprechend werden in einer Ausführungsform der Erfindung zwischen I l und 150pl, bevorzugt zwischen 3 Opi und lOOpl, am meisten bevorzugt 50pl der biologischen Probe verwendet, um alle im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Spektren zu messen. Da biologische Proben aus dem Bereich der medizinischen Diagnostik ein begrenztes Volumen haben, ist es von großem Vorteil, dass nur ein kleiner Teil der biolgischen Probe zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens notwendig ist. Dies ermöglicht eine allgemeine ungezielte Screening-Diagnostik für alle Proben vor oder parallel zu einer gezielten konventionellen Labordiagnostik. Dennoch steht ein überwiegender Teil einer biologischen Probe zur Durchführung weiterer Diagnostik, wie z. B. der medizinischen Routinediagnostik im Labor, zur Verfügung. Während des bild-basierten Screenings der im Weißlichtbild ermittelten gewünschten Messareale mittels spektroskopischen Methoden werden Schlüsselmetaboliten für eine bestimmte Erkrankung identifiziert und quantifiziert. In einem weiteren Schritt werden Änderungen der Schlüsselmetaboliten erfasst. Dabei wird entweder die Menge der in der biologischen Probe quantifizierten Schlüsselmetabolite mit der Menge der gleichen Schlüsselmetabolite in einer Kontrollprobe verglichen, oder die biologische Probe wird dahingehend mit einer Kontrollprobe verglichen, ob bestimmte Schlüsselmetabolite in der biologischen Probe und der Kontrollprobe vorhanden sind oder ob das Muster der Schlüsselmetaboliten in beiden Proben voneinander abweicht. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es auch möglich, zeitliche Änderungen des Auftretens und der Menge bzw. Konzentration von Schlüsselmetaboliten zu untersuchen. Solche zeitlichen Änderungen von Schlüsselmetaboliten treten häufig im Verlauf der Entwicklung von Krankheiten auf. Hierzu werden in zeitlichen Abständen regelmäßig Proben entnommen, in denen die Identität und Quantität der Schlüsselmetaboliten bestimmt und mit der Identität und Quantität der Schlüsselmetaboliten in vorherigen Proben, wie beispielsweise der Ausgansprobe und/oder einer Kontrollprobe verglichen werden. Je nach Erkrankung sind geeignete Probenahmeintervalle beispielsweise ein oder mehrere Stunden (beispielsweise über einen Zeitraum von 24 h), ein oder mehrere Tage (beispielsweise über einen Zeitraum von 1 Woche), ein oder mehrere Wochen (beispielsweise über einen Zeitraum von 1, 2 oder 3 Monaten) oder ein oder mehrere Monate (beispielsweise über einen Zeitraum von 3 Monaten, 6 Monaten, 9 Monaten oder 12 Monaten). Unter „Kontrollprobe“ wird eine biologische Probe aus einem gesunden Probanden verstanden.
Basierend auf den ermittelten Unterschieden in der Art, der Menge bzw. dem Muster an Schlüsselmetaboliten (hierin zusammenfassend auch als „Signatur“ der Schlüsselmetabolite bezeichnet), die in einer von einem Probanden gewonnenen biologischen Probe im Vergleich zu einer normalen Kontrollprobe vorhanden ist, kann eine Korrelation der Art oder Menge eines oder mehrerer Schlüsselmetaboliten mit einer wahrscheinlichen Diagnose einer Erkrankung hergestellt werden. Ein statistisch signifikanter Anstieg der Menge eines oder mehrerer Schlüsselmetaboliten im Vergleich zu den Kontrollproben ist hinreichend prädiktiv dafür, dass der Proband an einer für den oder die Schlüsselmetaboliten oder ein bestimmtes Muster an Schlüsselmetaboliten typischen Erkrankung leidet. Eine normale Menge eines oder mehrerer Schlüsselmetaboliten oder ein normales Muster an Schlüsselmetaboliten, wie sie für eine Kontrollprobe, die aus einer normalen Population isoliert wurde, charakteristisch ist, zeigt an, dass der Patient keine für den oder die Schlüsselmetaboliten oder ein bestimmtes Muster an Schlüsselmetaboliten typische Erkrankung hat. Ein positiver Hinweis auf eine Erkrankung, der auf einer erhöhten oder reduzierten Menge eines oder mehrerer Schlüsselmetaboliten oder einem veränderten Muster an Schlüsselmetaboliten im Vergleich zu einer normalen Kontrolle basiert, wird im Allgemeinen zusammen mit anderen Faktoren bei der endgültigen Bestimmung einer bestimmten Erkrankung berücksichtigt. Daher werden die erhöhten oder verringerten Mengen eines oder mehrerer Schlüsselmetaboliten oder ein verändertes Muster an Schlüsselmetaboliten des getesteten Probanden in der Regel zusammen mit anderen akzeptierten klinischen Symptomen der jeweiligen Krankheit bei der Erstellung einer bestimmenden Diagnose solch einer Erkrankung berücksichtigt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin dazu genutzt werden, die Verteilung der Schlüsselmetaboliten in der biologischen Probe zu bestimmen, z.B. durch Sichtbarmachen der Schlüsselmetaboliten in der biologischen Probe. Vorzugsweise wird die Bestimmung der Verteilung der Schlüsselmetaboliten in der biologischen Probe in einer Gewebeprobe oder einer Biopsie vorgenommen.
Das bild-basierte Screening der im Weißlichtbild ermittelten gewünschten Messareale mittels spektroskopischen Methoden erfolgt vorzugsweise in einer Vorrichtung, wie einem Mikroskop, die technisch dafür ausgerüstet ist, spektroskopische Analysen auf mikroskopischer Ebene durchzuführen. Besonders bevorzugt ist eine Vorrichtung, wie ein Mikroskop, mit der sowohl ein Weißlichtbild der biologischen Probe erzeugt werden kann, als auch eine Analyse der biologischen Probe mit einer spektroskopischen Methode vorgenommen werden kann.
Schlüsselmetabolite sind krankheitsspezifisch und werden ggf. erst mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert und detektiert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüsselmetaboliten bei einer Erkrankung die folgenden Schritte:
(a) die Ermittlung gewünschter Messareale in der biologischen Probe anhand eines, mittels optischer Methoden erzeugten Bildes der biologischen Probe, (b) ein bild-basiertes Screening der in Schritt (a) ermittelten gewünschten Messareale mittels mindestens einer spektroskopischen Methode, umfassend a. die Identifikation und Quantifizierung von Schlüsselmetaboliten der Stoffwechselerkrankung, b. die Erfassung von Änderungen der Schlüsselmetaboliten der Stoffwechselerkrankung, und
(c) die Diagnose einer Erkrankung oder die Bestimmung der Verteilung der Schlüsselmetaboliten in der biologischen Probe.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin übliche, dem Fachmann geläufige Schritte zur Probenvorbereitung für die Erzeugung des optischen Bilds und/oder die mindestens eine spektrometrische Methode enthalten.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des Verfahrens zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüsselmetaboliten bei einer Erkrankung zur Diagnose einer Stoffwechselerkrankung, Stoffwechselstörung oder einer proliferativen Erkrankung.
Der Schritt „Diagnose der Erkrankung“ des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst dann weiterhin die Schritte:
• Vergleichen der nachgewiesenen Menge eines oder mehrerer Schlüsselmetabolite in der biologischen Probe mit einer für eine normale Kontrollprobe charakteristischen Menge der Schlüsselmetabolite (Referenzbereich); und/oder
• Vergleichen der Identität eines oder mehrerer Schlüsselmetabolite in der biologischen Probe mit den in einer normalen Kontrollprobe bzw. Referenzbereich vorhandenen Schlüsselmetaboliten; wobei die Anwesenheit zusätzlicher Schlüsselmetabolite oder die Abwesenheit von Schlüsselmetaboliten, vorzugsweise die Anwesenheit zusätzlicher Schlüsselmetabolite in der biologischen Probe im Vergleich zur normalen Kontrollprobe ein positiver Indikator für die Erkrankung ist; und/oder
• Vergleichen des Musters an Schlüsselmetaboliten in der biologischen Probe mit dem Muster an Schlüsselmetaboliten in einer normalen Kontrollprobe bzw. mit einem Referenzbereich; wobei die Änderungen des Musters an Schlüsselmetaboliten in der biologischen Probe im Vergleich zur normalen Kontrollprobe ein positiver Indikator für die Erkrankung ist. In einer bevorzugten Variante stützt sich das erfindungsgemäße Verfahren auf die Untersuchung von Körperflüssigkeitsproben, in denen nach der Probenahme noch Zellen, Zellfragmente oder Gewebefragmente enthalten sind. Dies trifft in der Regel auf die bereits genannten Körperflüssigkeiten Blut und Blutbestandteile (z.B. Vollblut, Blutplasma, Blutserum), Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (cerebrospinal fluid, CSF), Urin und Speichel zu. Bei den Untersuchungen dieser Körperflüssigkeiten stellen die darin enthaltenen Zellen, Zellfragmente oder Gewebefragmente in dem erfindungsgemäßen Verfahren die gewünschten Messareale dar, in denen die Signatur von Schlüsselmetaboliten analysiert werden soll.
In Blutproben (z.B. Vollblut, Blutplasma, Blutserum) können z.B. Zellen oder Zellfragmente der lymphoiden und myeoliden Linien, Zellen oder Zellfragmente von Pathogenen wie Pilzen, Bakterien oder Viren bei Infektionen, sowie zirkulierende Gewebezellen und deren Fragmente, wie z.B. Tumorzellen enthalten sein, die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind.
In Proben der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (cerebrospinal fluid, CSF) können z.B. myeolide und lymphoide Zellen, deren Auftreten oftmals krankheitsassoziiert ist, Zellen von Pathogenen und Gewebezellen, z.B. Tumorzellen, sowie Zellfragmente der vorgenannten Zellen enthalten sein, die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind.
In Urinproben können z.B. Epithelzellen, krankheitsbedingt Zellen der myeoliden und lymphoiden Linien, Zellen von Pathogenen und Gewebezellen z.B. Tumorzellen sowie Zellfragmente der vorgenannten Zellen enthalten sein, die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind.
In Speichelproben können z.B. Zellen der myeloiden und lymphoiden Linien, Epithelzellen, krankheitsbedingt Zellen von Pathogenen, und Gewebezellen z.B. Tumorzellen sowie Zellfragmente der vorgenannten Zellen enthalten sein, die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind.
In diesem Falle umfasst das Verfahren zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüssel-Metaboliten bei einer Erkrankung die Schritte i. Probenvorbereitung einer Körperflüssigkeitsprobe für spektroskopische Detektionsverfahren ii. Optional: Aufnahme eines mikroskopischen Übersichtsbildes der Körperflüssigkeitsprobe, iii. Identifikation von Zellen, Zellfragmenten oder Gewebefragmenten in der Körperflüssigkeitsprobe oder optional in dem mikroskopischen Übersichtsbild, iv. Definition der gewünschten Messareale in den Zellen, Zellfragmenten oder
Gewebefragmenten, v. Erzeugen von Bildern der Zellen, Zellfragmente oder Gewebefragmente, vorzugsweise etwa 200 Stück, mit spektralen Informationen mittels der mindestens einen spektroskopischen Methode, vi. Analyse der metabolischen Signatur mittels statistischer Methoden und durch Korrelation mit einer spektralen Referenzbibliothek von Reinsubstanzen, vii. Auswertung der Metaboliten-Signaturen in den Zellen, Zellfragmenten oder Gewebefragmenten, viii. Diagnose der Erkrankung.
In einer besonders bevorzugten Variante stützt sich das erfindungsgemäße Verfahren auf die Untersuchung von Blutproben, wobei die Analyse der Signaturen von Schlüsselmetaboliten einzelnen Blutzellen durchgeführt wird. Besonders geeignete Blutzellen für die Analyse von Veränderungen von Signaturen von Schüssel-Metaboliten bei einer Erkrankung sind Erythrozyten. Bei den Erythrozyten kommt es zu verschiedenen Krankheiten und Sonderformen. Durch Störungen des Stoffwechsels, Krankheiten sowie durch Vitamin- und Eisenmangel verändern sich die Zahl und das Aussehen der Erythrozyten und auch deren Signatur von Schlüsselmetaboliten. Man spricht von sogenannten Anämien. Erythrozyten sind deshalb besonders geeignet für das erfindungsgemäße Verfahren. Bei Blutuntersuchungen stellen die Erythrozyten in dem erfindungsgemäßen Verfahren die gewünschten Messareale dar, in denen die Signatur von Schlüsselmetaboliten analysiert werden soll. In diesem Falle umfasst das Verfahren zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüssel-Metaboliten bei einer Erkrankung die Schritte i. Probenvorbereitung einer Blutprobe für spektroskopische Detektionsverfahren ii. Optional: Aufnahme eines mikroskopischen Übersichtsbildes der Blutprobe, iii. Identifikation von Erythrozyten in der Blutprobe oder optional in dem mikroskopischen Übersichtsbild, iv. Definition der gewünschten Messareale in den Erythrozyten, v. Erzeugen von Bildern der Erythozyten, vorzugsweise etwa 200 Stück, mit spektralen Informationen mittels der mindestens einen spektroskopischen Methode, vi. Analyse der metabolischen Signatur mittels statistischer Methoden und durch Korrelation mit einer spektralen Referenzbibliothek von Reinsubstanzen, vii. Auswertung der Metaboliten-Signaturen in den Erythrozyten, viii. Diagnose der Erkrankung.
Zur Probenvorbereitung in Schritt i. wird üblicherweise ein Blutausstrich für eine mikroskopische Untersuchung hergestellt. Genauso geeignet ist jede andere Methode der Probenvorbereitung, die es ermöglicht, Blutzellen mittels spektroskopischen Verfahren zu detektieren und zu vermessen (z.B. Kapillaren oder durchflusszytometrische Verfahren).
Sofern das erfindungsgemäße Verfahren an einer Gewebeprobe oder Biopsie durchgeführt wird, umfasst das Verfahren die Schritte: i . Prob envorb ereitung, ii. Optional: Erzeugung eines mikroskopischen Übersichtsbildes des histologischen Präparats, iii. Auswahl der gewünschten Messareale des histologischen Präparats, optional aus dem mikroskopischen Übersichtsbild, iv. Erzeugen eines Bildes mittels der mindestens einen spektroskopischen Methode, v. Analyse der metabolischen Signatur mittels statistischer Methoden und durch Korrelation mit einer spektralen Referenzbibliothek von Reinsubstanzen, vi. Auswertung der Metaboliten-Signaturen in den ausgewählten Messarealen, vii. Bestimmung der Metabolitenverteilung in der Gewebeprobe.
Dadurch kann anhand der Signatur der Metaboliten festgestellt werden, ob das untersuchte Gewebe, und damit der Proband, erkrankt ist oder nicht. Die Probenvorbereitung gemäß Schritt i. umfasst typischerweise die Herstellung eines histologischen Präparats, z.B. eines Gefrierschnitts, und für die mikroskopische Untersuchung das Aufziehen des histologischen Präparats auf eine CaF2-Folie.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann so jede Art von Gewebe untersucht werden. Bevorzugt wird Gewebe aus der Leber bzw. Gewebe oder Biopsien mit Verdacht auf proliferative Erkrankungen untersucht.
Die Identifikation der Schlüsselmetabolite erfolgt vorzugsweise durch Korrelation mit einer spektralen Referenzbibliothek von Reinsubstanzen. Eine solche Vorgehensweise ist dem Fachmann bekannt. Der Schritt der Analyse und Auswertung der metabolischen Signatur erfolgt vorzugsweise mittels statistischer Methoden. Die Spektroskopie Daten können durch rein visuellen Vergleich analysiert werden, um die krankheitsrelevanten Informationen zu extrahieren, oder durch Anwendung geeigneter statistischer Methoden, die dem Fachmann bekannt sind und ausgewählt werden. Hierzu eigenen sich sämtliche unüberwachte und überwachte statistische Methoden. Zu den überwachten statistischen Methoden gehören die zum Beispiel die Hauptkomponentenanalyse. Zu den überwachten statistischen Modellen gehören zum Beispiel die lineare Diskriminanzanalyse, Support- Vektor-Maschine, Partielle Kleinste-Quadrate-Regression, Random -Forest, neuronale Netzwerkanalyse und Machinelles Lernen. Weiterhin können Verfahren für die Probenklassifizierung und Visualisierung der Komponentenverteilung (alleine oder in Kombination mit überwachten und unüberwachten statistischen Methoden) eingesetzt werden. Geeignete Verfahren zur Probenklassifizierung und Visualisierung sind zum Beispiel: Abundanz Analysen und Clusteranalysemethoden. Zu diesen gehören zum Beispiel: Vektorkomponentenanalyse, NFINDR und k-means-Clustering.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet für die Diagnose von Stoffwechselerkrankungen, Stoffwechselstörungen und/oder proliferativen Erkrankungen.
Eine Stoffwechselerkrankung, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren diagnostiziert werden kann ist, ist beispielsweise eine Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Diabetes mellitus (Zuckerkrankheit), Erythropoetische Protoporphyrie, Hypertriglyceridämie, Phenylketonurie, Porphyrien und Thesaurismose. Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren für die Diagnose einer Lebererkrankung oder einer Leberdysfunkti on, die vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltendentzündlichen (z.B. Autoimmunerkrankungen, Tumore), infektiösen (z.B. viral, bakteriell), akut-toxisch (z.B. Vergiftung durch Arzneimittel), chronisch-toxisch (z.B. fibrotisch/ zirrhotisch bei chronischem Alkoholabusus). Besonders bevorzugt sind eingeschränkte Leberfunktionen die zu einem Gallenstau (Cholestase) führen (z.B. Verlegung des Gallengangs, Infektionen, Tumore, toxische Einschränkung der Leberfunktion).
Typische Schlüsselmetabolite für Lebererkrankungen sind Taurin- oder Glyzin-konjugierte und unkonjugierte Gallensäuren (wie z.B. Li tochol säure, Cholsäure, Chenodeoxychol säure, Ursodeoxychol säure, Ob eti cholsäure, Dehydrochol säure), Glukose, Low-density lipoprotein, high-density lipoprotein, Albumin, Häm- und Hämaabauprodukte (Protoporphyrine).
Typische Schlüsselmetabolite für obstruktive Cholestase sind Taurin- oder Glyzin-konjugierte und unkonjugierte Gallensäuren (wie z.B. Li tochol säure, Cholsäure, Chenodeoxychol säure, Ursodeoxychol säure, Ob eti cholsäure, Dehydrochol säure).
Eine proliferative Erkrankung, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren diagnostiziert werden kann ist, ist beispielsweise ausgewählt ist aus Krebs, Tumormetastasierung oder Tumorrezidiv.
Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren für die Diagnose einer Krebserkrankung, die vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend (1) bösartige Tumore: Karzinom, Fibrosarkom, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Angiomyosarkom, Angiosarkom, Liposarkom, Chondrosarkom, Osteosarkom, Malignes Melanom, Meningeosarkom, Myeloische Leukämie, oder Maligne Lymphome und lymphatische Leukämie und (2) gutartige Tumore: Adenom, Papillom, Fibrom, Leiomyom, Rhabdomyom, Angiomyom, Hämangiom, Lymphangiom, Lipom, Chondrom, Osteo, Melanozyten-Nävus, Meningeom, Teratom, oder Blastom.
Die Erfindung hat zahlreiche Vorteile. So wird es ermöglicht, Metaboliten in Erythrozyten mit Hilfe statistischer Methoden, wie z.B. Abundanz-Mapping und Cluster-Analysen, zu identifizieren. Die Erythrozyten können so als „Metabolische Markerzelle" für die Identifikation von pathophysiologischen metabolischen Veränderungen verwendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt nunmehr die gezielte Metabolomik (targeted metabolomics) in Zellen und Geweben basierend auf der spektroskopischen Bildgebung mit einer Auflösung im (Sub)mikrometer-Bereich. Weiterhin erlaubt das Verfahren die Analyse von Metabolitenverteilungen im Gewebe oder in Zellen, wodurch Aussagen über die Schwere eines Krankheitsverlaufs bzw. über das Stadium einer Erkrankung getroffen werden können.
Als Bestandteil der Funktionsdiagnostik im klinischen Alltag können sogenannte metabolische Fingerabdrücke erstellt und zur Identifikation von Erkrankungen eingesetzt werden. Aufgrund der viel größeren Informationsmenge, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verarbeitet wird, ist eine präzisere Diagnostik möglich. Das erfindungsgemäße Verfahren ist sehr breit anwendbar - beginnend bei Lebererkrankungen/Leberdysfunktion über metabolische Erkrankungen insgesamt bis hin zur Tumordiagnostik und der Diagnostik angeborener Stoffwechselstörungen. Das Verfahren kann in kleinen Tischlaborgeräten miniaturisiert angewendet werden. Dies ist mit bereits existierenden Geräten möglich. Bereist ohne intensive Optimierung sind kurze Messzeiten von < 20 min realisierbar. Die Präanalytik und der Materialaufwand sind sehr gering, ggf. ist nur ein Blutstropfen für die Untersuchungen nötig. Das Verfahren ist darüber hinaus automatisierbar.
Im Bereich der Forschung, wo insbesondere die Bildgebung von Metaboliten eine Rolle spielt, hat das erfindungsgemäße Verfahren ebenfalls Vorteile. Die Probenvorbereitung gestaltet sich wesentlich einfacher als bei MALDI-Imaging - Verfahren. Es ist ein korrelatives Imaging (z.B. Hematoxylin and Eosin Färbung (histopathologische routine-Färbung), und Raman Spektroskopie) am gleichen Gewebeschnitt möglich. Die Gewebeproben, insbesondere die Gewebeschnitte werden durch die Bildgebung nicht zerstört. Dadurch können gewünschte Regionen, d.h. gewünschte Messareale, vorab an Standardpräparaten definiert werden, und im Anschluss mit spektroskopischen Methoden, wie der Raman Spektroskopie, auf die metabolischen Signaturen näher untersucht werden. Spektrale Informationen lassen drüber hinaus eine „Nachanalyse" vorhandener Daten mit Spektren neuer Metaboliten zu.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von 4 Zeichnungen und 2 Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Es zeigen: Figur 1 ein Übersichtsschema des Verfahrens zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüssel-Metaboliten bei einer Erkrankung; insbesondere die Aufnahme von Spektralbildern von Erythrozyten und die Analyse der Konzentration und Verteilung von Metaboliten mit statistischen Methoden;
Figur 2 die Diagnose einer Leberfunktionsstörung bei obstruktiver Cholestase im Maus- Modell;
Figur 3 die Identifikation von ausgewählten Metaboliten (targeted metabolomics) in spektralen Datensätzen und deren Quantifizierung mittels statistischen Verfahren; und
Figur 4 Darstellung der Verteilung ausgewählter Metaboliten („targeted metabolomics") in histologischen Präparaten, z.B. der Leber.
Ausführungsbeispiel 1: Diagnose einer Leberfunktionsstörung bei obstruktiver Cholestase im Maus-Modell.
Eine Leberfunktionsstörung wurde bei obstruktiver Cholestase im Mausmodell auf Grundlage einem bild-basierten Screenings von Erythrozyten mittels Raman-Spektroskopie und der Identifikation von Schlüsselmetaboliten sowie deren Änderung bei der Erkrankung diagnostiziert. In dem Mausmodell wird im Rahmen einer Bauchoperation eine definitive obstruktive Cholestase durch die zweifache Ligatur des Gallengangs erzeugt. Dies verhindert den Abfluss und Ausscheidung/Metabolisierung der Gallsäure über den Darm und führt zu einem Rückstau dieser in die Leber und den Organismus. In diesem Experimentellen Setting, wurden Kontrolltiere ebenfalls einer Bauchoperation ohne Ligatur des Gallengangs unterzogen. So können die Einflüsse des Gallenstaus auf die Metabolitenänderungen im Plasma näher untersucht werden. 3 und 6 Tage nach der Ligatur werden den Tieren ein Blutstropfen aus der Schwanzvene entnommen (die Schwanzvene ist im Tier ein peripheres mittelgroßes Gefäß, und entspricht einer kleinen Vene beim Menschen). Der Blutstropfen wird frisch auf ein CaF Substratglas aufgebracht und wie ein Blutausstrich ausgestrichen (Figure la, b). Einzelne Erythrozyten werden mit einem Raman-Spektrometer (inVia™ Qontor® konfokales Raman- Mikroskop) untersucht, das mit einem 1800 g/mm-Gitter und einem Laser mit einer Anregungswellenlänge von 532 nm ausgestattet ist, der durch ein 50x/0,85NA Leica-Objektiv mit einer Laserleistung von ~3 mW auf die Objektebene fokussiert wurde. Die Raman-Spektren der Zellen wurden mit einer Laserbelichtung von ls/Spektrum aufgenommen und es werden mindestens 200 Zellen/Maus untersucht. Die bereinigten spektralen Daten von einzelnen Erythrozyten werden mittels Principle Component Analyse (PCA) ausgewertet und miteinander verglichen. Es zeigt sich eine deutliche Unterscheidung in den spektralen Profilen zwischen Tieren mit obstruktiver Cholestase und Kontrollen (operierte Tiere ohne obstruktive Cholestase), mit charakteristischen Peaks, die eine Diagnose einer hepatozellulären Veränderung nachweisbar machen.
Ausführungsbeispiel 2: Darstellung der Verteilung ausgewählter Metaboliten („targeted metabolomics") in histologischen Präparaten der Leber.
In dem in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Experiment, lassen sich weiterhin Molekülcharakteristika identifizieren (Figur 3). Dies geschieht durch den Vergleich und die anschließende Zuordnung der in den Raman-Spektren beobachteten charakteristischen Raman- Peaks mit einer Raman-Spektralbibliothek von Reinsubstanzen. Der Vergleich mit einer Bibliothek aus Gallensäuren, erlaubt die Identifikation von Schlüsselmetaboliten (Gallensäuren): Glyzin-dexocychol säure (GDCA), Tauro-chenodeoxychol säure (TCDCA) und Chenodeoxychol säure (CDCA).
Der Abgleich von Referenzspektren mit einem Raman-Mikrospektroskopie Bild der Leber erlaubt die Darstellung der Verteilung dieser Metabolite im Gewebe. Dieser Vergleich erfolgt durch Clustering-Methoden (z. B. kmeans, NFINDR, hierarchisches/partitionelles Clustering, Fuzzy-Clustering, modell-/dichte-/distanz-/verteilungsbasiertes Clustering,
Vektorkomponentenanalyse usw.), um eindeutige spektrale Merkmale zu extrahieren. Hierzu kommen Verfahren in Frage die Mustererkennung, Bildanalyse und Methoden des maschinellen Lernens integrieren. Um die Präzision dieser Verfahren zu erhöhen können zusätzlich Raman-Spektren einer oder mehrere Referenzsubstanzen in die Algorithmen eingespeist werden. Dies verbessert in manchen Situationen die Identifizierung eindeutiger spektraler Komponenten und die Visualisierung der Verteilung dieser Metaboliten im Gewebe. Durch diese Einspeisung von Referenzspektren können auch lokale Veränderungen wie in diesem Beispiel die Anhäufung von CDCA in Vesikel (Figur 4) sichtbar gemacht werden.
Das Raman-Spektroskopiebild des Lebergewebes wurde mit einem weiteren kommerziellen Raman-Gerät (CRM 300, WITec GmbH) aufgenommen. Eine Kryosektion des Lebergewebes (0.01 mm dick) wird auf einen CaF2-Objektträger präpariert. Das Raman-Spektrometer ist mit einem 600 g/mm-Gitter und einer Anregungswellenlänge von 532 nm bei einer Leistung von 35mW ausgestattet. Raman-Spektren wurden im Scanning-Modus (gescannter Bereich 0.2 mm x 0.2 mm) mit 0,0005 mm Schrittweite und 0,5s Laserbelichtung/Spektrum aufgenommen. Das Laserlicht wurde mit einem 100x/0,75NA Zeiss-Objektiv auf das Gewebe fokussiert und eine 0.1 mm Glasfaser wurde zur Sammlung des Raman-Signals verwendet. Die Raman-Spektren des Gewebes werden durch Anwendung der k-means Clustering-Methode analysiert, um ein Raman-Bild zu erzeugen, und drei markante Cluster-Spektren wurden extrahiert.
Liste der Bezugszeichen
1 Auflichtquelle
2 Lichtsammlung nach Streuung/ Absorption
3 Blutausstrich (mit Antikoagulans)
4 Spektroskopie geeignete Substrate
5 Kapillarblut mit geeignetem Substrat
6 Auslesen
7 Blut
8 Ausfluss
9 Bil dgebung/Z eil ob erfl ächenkarti erung
10 Flüssigprobenhalter aus geeignetem Material
11 Geeignetes flüssiges Medium
12 Erythrozyten in geeigneter Form
13 Erythrozyten in geeigneter Form in geeignetem Medium
14 Flüssigprobenhalter
15 Einzelspektren/hyperspektrale Bildgebung/Mapping-Erfassungsmodus/multimodale
Erkennung c) Kapillar-Detektion d) Dermale Erfassung e) Kapillarsimulation im Chip
Referenzen
1 Kiehntopf M, Nin N, Bauer M. Metabolism, metabolome, and metabolomics in intensive care: is it time to move beyond monitoring of glucose and lactate? Am J Respir Crit Care MedZQCy 187: 906- 907.
2 Vincent JL, Moreno R, Takala J, Willatts S, De Mendonca A, Braining H, et al. The SOFA (Sepsis-related Organ Failure Assessment) score to describe organ dysfunction/failure. On behalf of the Working Group on Sepsis-Related Problems of the European Society of Intensive Care Medicine. Intensive Care Med 1996; 22: 707- 710.
3 Recknagel P, Gonnert FA, Westermann M, Lambeck S, Lupp A, Rudiger A, et al. Liver dysfunction and phosphatidylinositol-3 -kinase signalling in early sepsis: experimental studies in rodent models of peritonitis. PLoSMed 2012; 9: el001338.
4 Vanwijngaerden YM, Langouche L, Brunner R, Debayeve Y, Gielen M, Casaer M, et al. Withholding parenteral nutrition during critical illness increases plasma bilirubin but lowers the incidence of biliary sludge. Hepatology 2014; 60: 202- 210.
5 Kruger PS, Freir NM, Venkatesh B, Robertson TA, Roberts MS, Jones M. A preliminary study of atorvastatin plasma concentrations in critically ill patients with sepsis. Intensive Care Med 2009; 35: 717- 721.
6 Bauer M., Kiehntopf M. Shades of yellow: Monitoring nutritional needs and hepatobiliary function in the critically ill. Hepatology 2014; 60: 26-29

Claims

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Patentansprüche
1. Verfahren zur Analyse einer biologischen Probe nach Veränderungen von Signaturen von Schüssel-Metaboliten bei einer Erkrankung, umfassend
(a) die Ermittlung gewünschter Messareale in der biologischen Probe anhand eines, mittels optischer Methoden erzeugten Bildes der biologischen Probe,
(b) ein bild-basiertes Screening der in Schritt (a) ermittelten gewünschten Messareale mittels mindestens einer spektroskopischen Methode, umfassend o die Identifikation und Quantifizierung von Schlüsselmetaboliten der Stoffwechselerkrankung, o die Erfassung von Änderungen der Schlüsselmetaboliten der Stoffwechselerkrankung, und
(c) die Diagnose einer Erkrankung oder die Bestimmung der Verteilung der Schlüsselmetaboliten in der biologischen Probe.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine spektroskopische Methode ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus multiskaliger Spektroskopie, multimodalen Bildgebungsverfahren, hyperspektraler Bildgebung, Raman- und Resonance Raman Spektroskopie, oberflächenverstärkter Raman- Spektroskopie (SERS), plasmonenverstärkter Raman-Spektroskopie (PERS), schalenisolierter Nanopartikel-verstärkte Raman-Spektroskopie (SINERS), Räumlich versetzte Raman-Spektroskopie (SORS), Faserverstärkte Raman-Spektroskopie (FERS), Shifted-Excitation-Raman-Differenzspektroskopie (SERDS), spitzenverstärkter Raman- Spektroskopie (TERS) und kohärente Raman-Spektroskopie (coherent anti-Stokes Raman scattering, CARS), Infrarot-Spektroskopie, wie Nah-Infrarot-Spektroskopie (NIR); Ultraviolett-Spektroskopie (UV), sichtbares Spektroskopie (VIS), Terahertz- Spektroskopie (TR), Magnetresonanz-Spektroskopie (MR) und Massenspektroskopie.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (a) ein Weißlichtbild, Fluoreszenzbild, biophotonisches Spektroskopiebild oder eine digitale holografische Abbildung erzeugt wird.
4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe ausgewählt ist aus Blut, Blutplasma, Blutserum, Gehirn- Rückenmarks-Flüssigkeit (cerebrospinal fluid, CSF), Urin, Speichel, einer Gewebeprobe, einer Biopsie, Zellen oder einer Zellkultur. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe eine Körperflüssigkeitsprobe ist und das Verfahren die Schritte umfasst: i. Probenvorbereitung einer Körperflüssigkeitsprobe für spektroskopische Detektionsverfahren ii. Optional: Aufnahme eines mikroskopischen Übersichtsbildes der Körperflüssigkeitsprobe, iii. Identifikation von Zellen, Zellfragmenten oder Gewebefragmenten in der Körperflüssigkeitsprobe, optional im mikroskopischen Übersichtsbilds der Kösperflüssigkeitsprobe, iv. Definition der gewünschten Messareale in den Zellen, Zellfragmenten oder Gewebefragmenten, v. Erzeugen von Bildern der Zellen, Zellfragmente oder Gewebefragmente (etwa 200 Stück) mit spektralen Informationen mittels der mindestens einen spektroskopischen Methode, vi. Analyse der metabolischen Signatur mittels statistischer Methoden und durch Korrelation mit einer spektralen Referenzbibliothek von Reinsubstanzen, vii. Auswertung der Metaboliten-Signaturen in den Zellen, Zellfragmenten oder Gewebefragmenten, viii. Diagnose der Erkrankung. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Körperflüssigkeitsprobe eine Blutprobe ist und zur Probenvorbereitung der Blutprobe ein Blutausstrich hergestellt wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe eine Gewebeprobe oder eine Biopsie ist und das Verfahren die Schritte umfasst: i. Probenvorbereitung; ii. Optional: Erzeugung eines mikroskopischen Übersichtsbilds des histologischen Präparats, iii. Auswahl der gewünschten Messareale des histologischen Präparats, optional aus dem mikroskopischen Übersichtsbild, iv. Erzeugen eines Bildes mittels mindestens einer spektroskopischen Methode, v. Analyse der metabolischen Signatur mittels statistischer Methoden und durch Korrelation mit einer spektralen Referenzbibliothek von Reinsubstanzen, vi. Auswertung der Metaboliten-Signaturen in den ausgewählten Messarealen, vii. Bestimmung der Metabolitenverteilung in der Gewebeprobe. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebeprobe eine Gewebeprobe der Leber ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die statistischen Methoden ausgewählt sind aus
• unüb erwachten und üb erwachten stati sti sehen Methoden, wi e b ei spi el swei se statistische Methoden, die ausgewählt sind aus der Gruppe, enthaltend die Hauptkomponentenanalyse, die lineare Diskriminanzanalyse, Support- Vektor- Maschine, Partielle Kleinste-Quadrate-Regression, Random -Forest, neuronale Netzwerkanalyse, Machinelles Lernen;
• und/oder Verfahren für die Probenklassifizierung und Visualisierung der Komponentenverteilung, entweder alleine oder in Kombination mit überwachten und unüberwachten statistischen Methoden, die ausgewählt sind aus der Gruppe enthaltend Abundanz Analysen und Clusteranalysemethoden, wie beispielsweise Vektorkomponentenanalyse, NFINDR und k-means-Clustering. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine spektroskopische Methode Raman-Spektroskopie, insbesondere kohärente Raman-Spektroskopie ist. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankung ausgewählt ist aus einer Stoffwechselerkrankung, Stoffwechselstörung oder einer proliferativen Erkrankung. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankung eine Stoffwechselerkrankung ist und aus der Gruppe ausgewählt wird, die Diabetes mellitus 29
(Zuckerkrankheit), Erythropoetische Protoporphyrie, Hypertriglyceridämie, Phenylketonurie, Porphyrien, und Thesaurismose enthält. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankung eine Lebererkrankung oder eine Leberdysfunktion ist und aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus (aber nicht ausschließlich) Taurin- oder Glyzin-konjugierte und unkonjugierte Gallensäuren (wie z.B. Li tochol säure, Cholsäure, Chenodeoxychol säure, Ursodeoxy cholsäure, Ob eti cholsäure, Dehydrochol säure), Glukose, Low-density lipoprotein, high-density lipoprotein, Albumin, Häm- und Hämaabauprodukte (Protoporphyrine). besteht. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die proliferative Erkrankung ausgewählt ist aus Krebs, Tumormetastasierung oder Tumorrezidiv. rfahren zur Diagnose von Erkrankungen, umfassend das Verfahren nach einem der
Ansprüche 1 bis 14 und zusätzlich die Schritte:
• Vergleichen der nachgewiesenen Menge eines oder mehrerer Schlüsselmetabolite in der biologischen Probe mit einer für eine normale Kontrollprobe charakteristischen Menge der Schlüsselmetabolite (Referenzbereich); und/oder
• Vergleichen der Identität eines oder mehrerer Schlüsselmetabolite in der biologischen Probe mit den in einer normalen Kontrollprobe bzw. Referenzbereich vorhandenen Schlüsselmetaboliten; wobei die Anwesenheit zusätzlicher Schlüsselmetabolite oder die Abwesenheit von Schlüsselmetaboliten, vorzugsweise die Anwesenheit zusätzlicher Schlüsselmetabolite in der biologischen Probe im Vergleich zur normalen Kontrollprobe ein positiver Indikator für die Erkrankung ist; und/oder
• Vergleichen des Musters an Schlüsselmetaboliten in der biologischen Probe mit dem Muster an Schlüsselmetaboliten in einer normalen Kontrollprobe bzw. mit einem Referenzbereich; wobei die Änderungen des Musters an Schlüsselmetaboliten in der biologischen Probe im Vergleich zur normalen Kontrollprobe ein positiver Indikator für die Erkrankung ist. 30
16. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Diagnose einer Stoffwechselerkrankung, Stoffwechselstörung oder einer proliferativen Erkrankung.
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