DE69030733T2

DE69030733T2 - Zweifarben Kamera Mikroskop sowie Methodologie zur Anfärben von Zellen sowie Analyse

Info

Publication number: DE69030733T2
Application number: DE69030733T
Authority: DE
Inventors: James Bacus; Ralph Hernicz
Original assignee: Cell Analysis Systems Inc
Current assignee: Cell Analysis Systems Inc
Priority date: 1989-02-24
Filing date: 1990-02-23
Publication date: 1998-01-22
Anticipated expiration: 2010-02-24
Also published as: EP0709667A3; EP0534948A1; EP0709667A2; CA2045172C; ATE153154T1; EP0534948A4; EP0534948B1; ES2100882T3; US4998284A; JPH05501151A; CA2045172A1; DE69030733D1; WO1990010276A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen eine Vorrichtung zum Messen von Zelleigenschaften wie Morphologie und Masse, und ein Verfahren zur Verbesserung der Zellstrukturen für quantitative Messverfahren, welche diese Vorrichtung verwenden. Die vorliegende Vorrichtung findet insbesondere Anwendung im Bereich der Untersuchung von Zellstrukturen auf dem Gebiet der Pathologie, die menschliches Gewebe für die Krebsforschung oder -diagnose einschließen kann.
In Pathologielaboratorien ist die visuelle Beobachtung die gegenwärtig verwendete Methode der Untersuchung von Zellen und Gewebe. Die Form und Beschaffenheit von krebsverdächtigen Zellen werden, nach dem Anfärben zum Kontrastieren und Verbessern der Sichtbarkeit der Zellen, von einem Laborfacharzt vorwiegend durch ein Mikroskop begutachtet, welcher anschließend diese Zellen in eine Normal-Kategorie, oder eine von mehreren Abnormal- oder Krebsverdacht-Kategorien klassifiziert. Solche Auswertungen sind sehr subjektiv und nicht immer unterscheiden oder quantifizieren sie genau kleine Veränderungen der DNA, von Proteinen oder anderen Substanzen in einzelnen Zellen oder in sehr kleinen Populationen abnormaler Zellen. Beispielsweise können diese kleinen Veränderungen ein Anfangsstadium von Krebs oder eine Veränderung der Zellstruktur aufgrund der Behandlung von Krebs durch Chemotherapie oder Bestrahlung wiederspiegeln. Daher sind kleine Veränderungen bei der Diagnose und der Prognose dieser Art von Krankheiten wichtig.
Der Laborfacharzt, der eine angefärbte Probe unter einem Mikroskop betrachtet, verfügt über die Erkennungsfähigkeiten eines Fachmanns auf dem Gebiet des Klassifizierens von Zellen als normal oder abnormal, der somit eine Diagnose und/oder Prognose stellen kann. Der erfahrene Laborfacharzt ist in der Lage relativ schnelle infinite Abstufüngen der Klassifizierungen als "beinahe normal", "geringfügig abnormal", etc. vorzunehmen. Jedoch ist die Klassifizierung und die Messung von Zelleigenschaften und -parametern von Hand durch einen Laborfacharzt Zelle für Zelle extrem langwierig und zeitraubend. Statistische Analysen von manuell erstellten Zelldaten sind relativ schwierig, da jede Aufzeichnung einzeln eingegeben und verarbeitet werden muß. Weit gefaßte statistische Einteilungen können bei verschiedenen Aufzeichnungen oder Analysen, die zu verschiedenen Zeiten sowie unter variierenden Bedingungen erstellt wurden, unzuverlässig sein.
Alternativ bietet die automatische Zellanalyse dem Laborfacharzt spezialisierte Geräte zur Durchffihrung einer Analyse. Bei der automatischen Zellanalyse, beispielsweise mit einem Durchflußzytometer, werden grobe Massentests an eine Probenzellenpopulation ohne Einschluß oder Ausschluß unterscheidender Populationsdaten derselben durchgeführt. Die Probe wird gemessen "wie sie ist", ohne Kenntnis der Art oder der Zahl der zu messenden Zellen. Wesentliche Einzelzellendaten oder Daten über relativ kleine Gruppen von Zellen gehen bei der Durchschniffswertbildung einer solchen Probe verloren. Ferner erfordern solche Tests oft relativ große Proben, und die Probe wird oft beschädigt oder verbraucht.
Im Handel sind Allzweck-Durchflußzytometer erhältlich. Diese sind jedoch extrem teuer und können lediglich flüssige Blutproben oder Gewebedesegregation verarbeiten. Diese Zytometer sind nicht in der Lage, Standard-Gewebeschnitte zu verarbeiten oder herkömmliche Mikroskop-Objektträger zu verwenden, welche die bevorzugten Probenformate in Pathologielaboratorien sind. Darüber hinaus erlaubt ein Durchflußzytometer nicht die Analyse der Zellmorphologie, wie die Beschaffenheit, die Größe und die Form von Zellkernen.
Die optische Verbesserung von Zellzytoplasma für verschiedene Zelltypen ist in manchen Fällen mit den gegenwärtigen DNA-Anfärbeverfahren nicht kompatibel. Das heißt, daß der Faktor der optischen Verbesserung oder das Anlärbeverfahren für das Zytoplasma mit dem Abbildungsverfahren für die Computeranalyse der optischen Dichte kompatibel sein sollte, während gleichzeitig eine Beeinträchtigung der Empfindlichkeit der Abbildungsverfahren für die Kernanfärbung vermieden werden sollte. Bei dem Beispiel der Feulgen-Anfärbung ist die optische Verbesserung des Zytoplasmas nach der Feulgen-Anfärbung der DNA nicht durchführbar, da das Feulgen-Verfahren stark säurebildende Reagenzien verwendet, die andere Faktoren der optischen Verbesserung oder Anfärbungen zerstören können. Ein weiterer einschränkender Faktor oder eine Anforderung besteht darin, daß jede vor einer Feulgen- oder DNA- Anfärbung erfolgte Anfärbung das Kerrnnaterial nicht zertrennen oder negativ beeinflussen kann, was zu nachteiligen Auswirkungen auf die nachfolgende Kernmarkierungsanfärbung führen könnte.
Eines der Hauptmotive der fortdauernden Forschung ist daher die Entwicklung von Anfärbungen und Anfärbeverfahren, die eine unterscheidbare optische Verbesserung oder Markierung der separaten Zellbestandteile, beispielsweise des Zytoplasma und der Kern-DNA, ermöglichen, ohne die Bildanalyse der anderen Bestandteile zu stören. In der Praxis sind jedoch die unterscheidbaren Bestandteile der Zellen ohne die Mittel zur Analyse der verschiedenen Eigenschaften nur von minimalem Wert, obwohl dies sicherlich einen Vorteil darstellen würde. Es ist daher erforderlich, die chemischen Zusammensetzungen und Komponenten bereitzustellen, um die Eigenschaften der verschiedenen Zellbestandteile zu unterscheiden, und die mechanischen Geräte und elektronischen Netze für die Analyse der unterschiedenen Zellbestandteile bereitzustellen. In der Vergangenheit offenbarte Strukturen waren zum Liefern und Übertragen des Bildes an das Verarbeitungsnetz geeignet, jedoch ist es erwünscht, die physische Struktur oder wenigstens die Gerätegröße zum Zwecke einer verbesserten Herstellung und eines verbesserten ästhetischen Erscheinungsbildes zu minimieren und die Mittel zum Kalibrieren und Verwenden der verfügbaren Lichtenergie des Bildes zu verbessern.
In US-A-5 016 283 ist ein System offenbart, das ein Zwei-Farben-Assay, beispielsweise eine Immunoperoxidase-Anfärbung von Kern-Antigenen, unter Verwendung zweier optischer Filter durchführt, welche manuell verschoben werden, um eine serielle Analyse jedes der beiden angefärbten Materialien vorzunehmen.
Die vorliegende Erfindung ist auf das Eliminieren der Notwendigkeit des Wechselns von Filtern gerichtet, welches ein relativ langsames Verfahren darstellt und für Bedienerfehler anfällig ist. Sollte der Bediener beispielsweise vergessen, vom ersten zum nächsten Filter zu wechseln, oder wenn er die Filter nicht in der korrekten Reihenfolge benutzt, sind die sich ergebenden Messungen falsch. Die zum manuellen verschieben der Filter erforderliche Zeit verlangsamt das Verfahren im Vergleich zu einer Zwei- Farben-Simultan-Analyse. Genauer gesagt wird die Verarbeitungs- und Analyserate erhöht, wenn die beiden Farben gleichzeitig anstatt aufeinanderfolgend analysiert werden, wie dies bei dem manuellen Zwei-Farben-Filtersystem der Fall ist. Durch die Verwendung eines Zwei-Farben-Simultan-Analyseverfahrens sind die Ergebnisse der Analyse für den Betrachter schneller verfügbar und die Software-Programme sind einfacher anwendbar.
Unter den gegenwartig zur Verwendung bei der Zwei-Farben-Analyse verfügbaren Programmen findet sich die Zellpopulationsidentifizierung und die DNA-Messung von Zellkernen, die als Ploidie-Analyse bezeichnet wird. Ein anderes Programm wertet durch Immunoperoxidase-Verfahren, wie Östrogen- oder Progesteron-Rezeptorassays, angefärbte Antigene aus, um eine quantitative Kern-Antigen-Messung zu liefern. Ein drittes Programm schafft einen quantitativen Proliferationsindex zum Messen der Proliferation in Zellen oder Geweben, indem Immunoperoxidase-Anfärbeverfahren mit einem Antikörper gegen proliferierte Zellen verwendet werden. Dieser Proliferationsindex ist in der am gleichen Tage angemeldeten mitanhängigen Anmeldung mit dem Titel "Method of and Apparatus for Measuring Proliferation", James Bacus et al., ausführlich beschrieben. Das Zwei-Farben-System der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls zur Durchführung der in den zuvor genannten Patentanmeldungen beschriebenen Zellmessungen verwendet.
US-A-3 999 047 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Analysieren einer vollständigen Blutprobe, wobei jeder räumliche Punkt der Probe nacheinander und einzeln gemessen wird. Auf diese Weise wird das gesamte von jedem Punkt kommende Licht zu einer Zahl zusammengefügt und sämtliche die Probe bildenden Punkte werden nacheinander gemessen. Das t einem unteren Raum 41, der den unteren Teil einer Gaseinlaßkammer 31 (Fig. 8) bildet, einem unteren Raum 42, der den unteren Teil einer Rückflußkammer 32 (Fig. 8 bildet, und einem untern Raum 43 ausgebildet, der den unteren Teil einer Durchlaßkammer 33 (Fig. 8) bildet. erfahren und die Vorrichtung nach US-A-3 999 047 klassifiziert die gemessenen Zellen automatisch, wodurch Probenbereichsklassifizierungssignale geliefert werden.
Die Vorrichtung nach US-A-3 999 047 weist eine Lichtquelle auf, die eine auf einem standardmäßigen Objektträger aus Glas vorgesehene Blutprobe beleuchtet. Die Blutprobe wird von einem optischen Scanner in Rasterart abgetastet. Der Abtastausgangsstrahl des Scanners wird durch ein Strahlteilerprisma geleitet, welches den Ausgangsstrahl in drei separate Strahlen teilt. Jeder Strahl durchläufi ein jeweiliges Farbfilter und trifft auf eine Photoröhre. Anstelle von Farbfiltem können dichroitische Beschichtungen auf dem Strahlteilerprisma verwendet werden, um die gewünschte Farbtrennung zu erreichen. Die elektrischen Signais der Photoröhren reprasentieren in elektrischer Form die optische Transmission jedes Segments der abgetasteten Blutprobe. Die elektrischen Signale werden in digitale Datensignale umgewandelt und algebraisch mit Schwellenwertbildung kombiniert, um die jeweiligen Bereiche der Blutprobe in wenigstens eine aus einer vorbestimmten Anzahl von Kategorien einzuteilen.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein kostengunstiges und leicht einstellbares Zwei-Farben-Sensorsystem zu schaffen, das die Klassifizierung von Zellobjekten erleichtert.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß mit den Merkmalen der Patentansprüche 1 bzw. 9 gelöst.
Die beim Anfarben verwendeten Chromogene sind eher Breitbandspektrenemitter als Schmalbandspektrenemitter, weshalb Überschneidungen zwischen den jeweiligen Spektren ein zu überwindendes Problem darstellen. Glanz liegt ebenfalls vor, der zusätzliches Licht verursacht, das genaue optische Dichtemessungen stört, und auch dieses Problem muß gelöst werden. Ein guter Spektralkontrast in einer angefärbten Zelle verbessert die Möglichkeit der Quantifizierung geringer Veränderungen in DNA- Proteinen oder anderen Substanzen, wodurch es möglich wird, die erforderlichen genauen quantitativen Messungen durchzuführen. Ferner enthalten Signalmessungen ein erhebliches elektrisches Rauschen, das während der elektronischen Verarbeitung entfernt werden muß. Diese Rauschentfernung ist besonders dann erforderlich, wenn die Signalstärke nicht durch das Vornehmen optischer Dichtemessungen mit einer gemessenen Wellenlänge maximiert ist. Es ist daher erwünscht, Schmalbandwellenlängenmessungen für die jeweiligen optischen Dichten mit jeder von zwei deutlich verschiedenen Schmalbandwellenlängen durchzuführen, die einander nicht überlappen oder stören.
Die vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren und eine Vorrichtung, die eine erfolgreiche Durchführung einer Zwei-Farben-Analyse ermöglichen. Es existiert beispielsweise das Feulgen-Anfärbeverfahren, das ein erstes Anfärbeverfahren für die Immunoploidie-Analyse darstellt, bei dem Zellen auf der Basis einer blauen Farbe für DNA im Zellkern und eines roten Chromogens für monoklonale Antikörper klassifiziert werden. Bei einem ionischen Anfärbeverfahren, das ein zweites Anfärbeverfahren darstellt, wird ein Methylgrün-Farbstoff verwendet, der eine Verbindung mit einem Zellbestandteil im Kern eingeht, und ein Diaminobenziden (Peroxidase-Monoklonal- Antikörper) geht eine Verbindung mit einem Bestandteil des Zytoplasma ein. Bei einem dritten Anfärbeverfahren wird das Methylgrün zur Verbindung mit einem Zellenbestandteil im Kern verwendet, und ein rotes Chromogen mit Alkali-Phosphatase verbindet sich mit einem Zellbeständteil im Zytoplasma. Bei onkogenen Produkten ist es ferner möglich, Östrogen- oder Progesteron-Rezeptoren für die Kemanalyse sowie Antikörper zur Messung von Materialien im Zytoplasma zu messen. Es können andere Kombinationen von Anfürbematerialien zum Markieren der Zellbestandteile, d.h. Zellkern oder Zytoplasma, verwendet werden. In jedem Fall besteht die Notwendigkeit, die Emissions- oder Transmissionsspektren der jeweiligen Anpärbungen zu trennen und, wie im folgenden erläutert, die Filter für dieselben anzupassen.
Die vorliegende Erfindung schafft Verfahren und Vorrichtungen zum Messen ausgewahlter Merkmale und Parameter von Zellen in einer Zellpopulation durch die optische Bestimmung ihres Typs sowie ihrer Morphologie. Bekannte Vorrichtungen messen den DNA-Gehalt ausgewählter Zellen einer aus einer Zellenprobe ausgewählten Subpopulation, wobei die Subpopulation auf der optischen Markierung bestimmter Zellen in derselben basiert.
Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen und Verfahren begünstigen und verbessern bekannte Verfahren und Vorrichtungen, da sie folgendes bieten: 1) alternative Anfarbeund Analyseverfahren für verschiedene Zellen, Zytoplasmen und Zellpopulationen; 2) verbesserte Bild- oder Farbtrennung zur besseren Unterscheidbarkeit durch die Bildverarbeitungsgeräte; 3) eine kompakte, effiziente und leicht einstellbare Bilderfassungsvorrichtung zur weiteren Verbesserung der Bildqualität und der Genauigkeit der Bildverarbeitungsverfahren; und 4) eine Vorrichtung zur parallelen Bildverarbeitung im Gegensatz zu gegenwartig verfügbaren seriellen Bildverarbeitungsvorrichtungen. Diese Eigenschaften schaffen ein verbessertes Kalibrierungs- und Bildverarbeitungsverfahren für die Analyse von Zellen oder anderen Materialien, seien sie biologisch oder anorganisch, durch Bildanalyseverfahren; sie verbessern sowohl das Verfahren, als auch die Vorrichtung zur quantitativen Ploidie-Analyse von Zellen durch verbesserte Bildmustererkennungsgeräte; und sie schaffen ein verbessertes Gerätepaket, das sowohl optisch ansprechender und weniger störend ist, als auch eine technisch genauere und effiziente Verwendung verfügbarer Lichtenergie schafft.
Ferner verwendet die verbesserte Vorrichtung Schmalbandpaßfilterung zur Verringerung von Glanzlicht sowie spezifische Schmalbandpaßfilter zur Unterscheidung der Spektren für die monochromatische Kamera, anstelle der Standard-RGB-Festzustand- Televisionssensoren, die in diesen Geräten oftmals verwendet werden. Dieser Aufbau eliminiert die Notwendigkeit des mechanischen Verschiebens entweder der Filter- oder der Probenposition zur Betrachtung verschiedener Zellbestandteile und sie ist einfach an Zellbestandteilanfärbungen oder An£arbeverfahren anpaßbar oder für diese verwendbar.
Diese und andere Merkmale und Aufgaben der Erfindung ergeben sich deutlicher aus der nachfolgenden Beschreibung der Zeichnungen und des bevorzugten Ausführungsbeispiels.
In den Figuren bezeichnen gleiche Bezugszeichen gleichartige Teile und es zeigen:
Fig. 1 - eine bildliche Darstellung eines erfindungsgemäß aufgebauten Bildanalysesystems;
Fign. 1A - 1D - verschiedene Histograrnme für die Aneuploidie-Analyse;
Fig. 2 - ein Funktions-Blockschaltbild des Bildanalysesystems nach Fig. 1, das zur Durchführung der erfindungsgemäßen Quantisierungsverfahren für Kern-DNA geeignet ist;
Fig. 3 - ein schematisches Blockschaltbild der Bilderfassungsvorrichtung von Fig. 2;
Fig. 4 - ein Funktions-Systemdiagramm zur Darstellung der Hauptoperationen der Systemsteuerung von Fig. 2;
Fign. 5 und 6 - eine perspektivische Draufsicht bzw. eine Schnittdarstellung eines Objektträgers, der besonders für die Verwendung in dem Bildanalysesystem von Fig. 1 ausgebildet ist und separate Bereiche für Kalibrierungszellenobjekte und Probenzellenobjekte aufweist;
Fig. 7 - eine bildliche Darstellung einer Mikroskopansicht der Bindeeffekte eines monoklonalen Antikörpers;
Fig. 8 - eine graphische Darstellung des Prozentsatzes der Lichtdurchlässigkeit als Funktion der Lichtwellenlänge für zwei Anfärbungen und die beiden erfindungsgemäß verwendeten Filter;
Fign. 9, 10 und 11 - bildliche Darstellungen von Abbildungen einer Zellpopulation, welche ein ungefiltertes Bild, ein rot-gefiltertes Bild und ein blau -gefiltertes Bild;
Fig. 12 - ein Funktionsablaufdiagramm eines bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahrens der Quantifizierung von DNA für menschliche Karzinome;
Fig. 13 - eine bildliche Darstellung der Bildmonitoranzeige während des Wählvorgangs und der markierten Zellen;
Fig. 14 - eine bildliche Darstellung der mehreren optischen Felder des in den Fign. 5 und 6 dargestellten Objektträgers;
Fig. 15 - eine bildliche Darstellung eines auf dem in Fig. 1 dargestellten Befehlsmonitor erscheinenden Kalibrierungsbildschirms;
Fig. 16 - eine bildliche Darstellung eines auf dem in Fig. 1 dargestellten Befehismonitor erscheinenden Analysebildschirrns;
Fig. 17 - ein System-Ablaufdiagramm der Analysesystembildschirmarchitektur des in Fig. 1 dargestellten Bildanalysesystems;
Fig. 18 - ein Funktionsablaufdiagramm des Hauptmenüs des Hauptbildschirms von Fig.
Fig. 19 - ein Funktionsablaufdiagramm des Kalibrierungsmenüs des Kalibrierungsbildschirms von Fig. 17;
Fig. 20 - ein Funktionsablaufdiagramm des Blaugrenzeneinstellungsmenüs des Blaugrenzenbildschirms von Fig. 17;
Fig. 21 - ein Funktionsablaufdiagramm des Rotgrenzeneinstellungsmenüs des Rotgrenzenbildschirms von Fig. 17;
Fig. 22 - ein Funktionsablaufdiagramm des Analysemenüs des Analysebildschirms von Fig. 17;
Fig. 23 - eine Draufsicht auf eine schematische Darstellung eines alternativen Ausführungsbeispiels der Bilderfassungsvorrichtung von Fig. 3;
Fig. 24 - eine Draufsicht auf eine schematische Darstellung der Bilderfassungsvorrichtung von Fig. 23;
Fig. 25 - eine erste Seitenansicht einer Seite der in Fig. 24 dargestellten Vorrichtung;
Fig. 26 - eine zweite Seitenansicht der Vorrichtung von Fig. 24;
Fig. 27 - eine Explosionsdarstellung der Bilderfassungsvorrichtung von Fig. 23; und
Fig. 28 - ein zweites altematives Ausfürungsbeispiel der Vorrichtung von Fig. 23; und
Fig. 29 - eine graphische Darstellung eines Kemantigenmeßspektrums; und
Fig. 30 - eine graphische Darstellung einer Zwei-Farben-Zellspektrentransmission.

Aufbau der Vorrichtung

Die insbesondere in den Fign. 3 und 23-28 dargestellte Vorrichtung und die hierin beschriebenen Verfahren können zur Erstellung von Histogrammen und anderer statistischer Daten von Zellpopulationen verwendet werden, die bei der Diagnose und Prognose von Krankheiten besondere Anwendung finden können. Ein spezifisches Beispiel für diese Analysefähigkeit ist die Menge und Verteilung der Kern-DNA, einschließlich der Unterscheidung zwischen bestimmten Proteinen an Proteinstellen und dem DNA-Kern.
Die Vorrichtung der Fign. 23-28 weist weniger reflektierende oder brechende Flächen für einfallendes Licht auf als vorherige Konstruktionen, wodurch die Lichtstrahldämpfung minimiert ist. Die Einfachheit der Einstellung des Lichtstrahls oder des Lichtstrahlwegs unterstützt das Fokussieren der Videokameras, während gleichzeitig eine effizientere Nutzung des verfügbaren Lichts erfolgt.
Die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung 11 weist ein digitales Bildanalyse: und Verarbeitungssystem 13 auf, das in Fig. 2 ausführlicher dargestellt ist. Die Vorrichtung 11 weist ein hochauflösendes Mikroskop 15 zum Betrachten vergrößerter Proben auf einer Stütze oder einer Auflage auf, die mit einem Objektträger 14 aus Glas versehen sein kann. Das Mikroskop 15 weist eine Einstell- oder Positioniereinrichtung 70 zum Fokussieren von Optiken, beispielsweise eine Sammellinse, auf einen Objektträger 14 auf, und sie ist ferner mit einer Plattform 51 versehen, die durch Positioniereinrichtungen 12 und 17 schrittweise in X- und Y-Richtung bewegbar ist, um die gesamte Fläche des Objektträgers 14 betrachten zu können. Die Positioniereinrichtungen 12, 17 und 70 können mechanische Feinstelleinrichtungen für Mikroskope sein.
Die Probe, bei der es sich um auf dem Objektträger vorgesehene Zellen handeln kann, liegen im Sichtfeld des Vergrößerungsmikroskops und sind über ein Abbildungssystem 13 mit einer Bilderfassungsvorrichtung 18 sowie zur Analyse in der Sichtoptik oder der Okularlinse 24 sichtbar. Die Vorrichtung kann das Lichtbild mit der von dem Probenbetrachtungsbereich projizierten Stärke empfangen. Anschließend wandelt die Vorrichtung 18 das einzelne Lichtstrahlbild in zwei analoge Signale (rot, blau) um, die durch das Bildanalysesystem 13 einzeln überwacht, abgetastet und digital verarbeitet werden können. Das Bildanalysesystem 13 wird durch eine Systemsteuerung 22 in Form eines Digitalprozessors, beispielsweise einen PC, gesteuert.
Ein Bediener, beispielsweise ein Laborfacharzt oder ein Labortechniker, kommuniziert interaktiv mit der Systemsteuerung 22 über eine Tastatur 36. Der Bediener arbeitet mit dem System um Kern-DNA zu quantifizieren sowie Zellobjekte zu klassifizieren, indem er zwei Anzeigen oder Monitore 37 und 62 beobachtet. Der Bildmonitor 37, welcher die erste Anzeige ist, ist ein herkömmlicher RG-Strahl-Videomonitor, der eine Anzeige über die Systemsteuerung 22 und eine Bilderfassungsvorrichtung 18, liefert, welches das gleiche Bild ist, das durch in einem Sichtbereich durch die Okularlinse 24 geliefert wird. Die zweite Anzeige wird über einen Befehlsmonitor 62 geliefert, der ein zweiter herkömmlicher RG-Strahl-Videomonitor ist, welcher den Bediener mit interaktiven Eingabeaufforderungen, Bildern, Informationen und Befehlen aus einem von der Systemsteuerung 22 abgearbeiteten Systemprogramm versorgt.
Die Tastatur 36 ist als herkömmliche AT-Tastatur dargestellt und weist auf: mehrere Funktionstasten F1-F10; mehrere alphanumerische Tasten, einschließlich spezieller Funktionstasten wie ENTER, SHIFT, CONTROL und ALTERNATE; und Cursorsteuertasten mit einer Auf/Ab-Links/Rechts-Pfeiltaste, ein Zahlentastenfeld, eine Zahlenblockiertaste und eine Escape-Taste. Das Tastatur-Interface 35 setzt die Tastenanschläge des Bedieners in numerische Codes für die Systemsteuerung 22 um. Bs ist ein Drucker 38 zum Liefern einer zuverlässigen gedruckten Ausgabe von durch die Vorrichtung 11 erstellten statistischen Daten und Berichten vorgesehen.
Das Bildanalyse- und Verarbeitungssystem 13 ist in Fig. 2 dargestellt, welche eine schematische Funktionsdarstellung der Vorrichtung 11 ist. Das Verarbeitungssystem 13 kann mehrere Probenzellobjekte oder -bestandteile anhand des durch das Mikroskop 15 gelieferte Bild der mehreren Zellen auf dem Träger oder der Stütze 14 analysieren. Das über das Mikroskop 15 gelieferte Bild enthält Licht, das von einer Quelle 19 mit regelbarer oder fester Intensität durch den Objektträger 14 hindurch transmittiert und anschließend durch die Mikroskopoptik oder die Objektivlinse 16 aufgelöst wird. Wie in Fig. 1 dargestellt, ist das Mikroskop 15 ein zusannnengesetztes Mikroskop mit einer Objektivlinse 16 und einer Okularlinse 24, die durch bekannte Einrichtungen einstellbar sind.
Die Lichtquelle 19 sendet Licht mit einem relativ breitbandigen Spektrum im sichtbaren Bereich oder Band des Lichtes durch die Zellenobjekte oder mehreren Zellen auf dem Objektträger 14. Die optische Dichte des Bildes wandelt das Licht der Quelle 19 in einen Ausgangsstrahl mit anderer Stärke, der zur Objektivlinse 16 geleitet wird, wobei die Stärkedifferenz von dem Prozentsatz des durchgelassenen Lichts oder, umgekehrt, von dem Prozentsatz des von dem Zellobjekt absorbierten Lichts abhängt. Die sichtbare Anzeige dieses pHänomens erfolgt durch die Flächen des Objektträgers 14, in denen keine Zellobjekte vorhanden sind, weshalb diese Flächen Licht mit hoher Intensität durchlassen (transparent sind), während Flächen mit nicht durchlassigen oder weniger durchlässigen Objekten dunkler erscheinen. Im allgemeinen ist eine nicht modifizierte Zelle oder ein solches Zelloijekt relativ transparent und die Konturen dieser Zellen oder Zellobjekte sind beinahe nicht erkennbar. Deshalb werden durch die Praxis des Anfarbens von Zellobjekten die Konturen oder Objekte der Zellen in den einzelnen Zellen optisch verbessert, um diese gegenüber umliegenden Konturen und/oder Hintergründe herauszuheben oder abzudunkeln. Bei der vorliegenden Erfindung können die Anfärbungen durch jeden beliebigen Mechanismus an der Zelle angebracht werden, sei es durch Absorption, Adsorption, lonenbindung, kovalente Bindung oder ein anderes Verfahren.
Das Bild jeder der Zellen oder Zellobjekte auf dem Objektträger 14 wird über einen optischen Bildteiler 25 zur Bilderfassungsvorrichtung 18 projiziert oder übertragen. Der Teiler 25 reflektiert das übertragene Bild teilweise zur Bilderfassungsvorrichtung 18 oder einem anderen Detektor, beispielsweise die Okularlinse 24. Der Teiler 25 überträgt, bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel, etwa 90% des transmittierten Lichts vom Objektträger 14 zur Bilderfassungvorrichtung 18 für die nachfolgende Umwandlung in das optische Bild der beiden elektronischen Abtastsignals (z.B., rot, blau) mittels einer punktweisen elektronischen Analyse, die ein monochromatisches Bild der optischen Intensität jedes dieser Punkte in dem an den Teiler 25 übertragenen Bild repräsentiert, d.h. ein farbechtes Bild des dem Analysierenden an der Betrachtungsoptik 24 vorliegenden Bereichs.
Fig. 3 zeigt ein Ausführungsbeispiel der mehreren Elemente der Bilderfassungsvorrichtung 18, die Reflektierspiegel, einen Bildteiler, Filter und Videokameras, einschließlich einem Digitalisierungsnetzwerk aulweist. Wie bereits erwähnt, wird das von der Quelle 19 mit regelbarer Wellenlänge ausgehende Licht durch den eine Zelle oder mehrere Zellen aufweisenden Objektträger 14 geleitet und ein Bild wird an 4en Strahlteiler 25 übertragen, der in einem Halter 53 befestigt ist. Ein erstes farbgetreues Bild wird vom Strahlteiler 25 and die Sichtoptik oder die Okularlinse 24 zum Fokussieren oder manuellen Betrachten geleitet. Zusätzlich wird ein zweites farbgetreues Bild durch den Strahlteiler 25 senkrecht zum vertikalen Weg vom Objektträger 14 zu einer Fokussierlinse 154 und zur Bilderfassungsvorrichtung 18 geleitet. Die Linse 154 liefert ein fokussiertes Bild, d.h. ein reales Bild, an die Bilderfassungsvorrichtung 18.
Die Bilderfassungsvorrichtung 18 weist auf mehrere optische Elemente, einschließlich einem zweiten Strahl- oder Bildteiler 156; reflektierende Spiegel 158, 160 und 162; und zwei monochromatische optische Filter 164 und 166. Die Bilderfassungsvorrichtung 18 weist ferner eine erste Videokamera 168 und eine zweite Videokamera 170 auf, die separate Teile des von dem zweiten Bild- oder Strahlteiler 156 projizierten Bildes empfangen.
Der von der Objektivlinse 16 und dem ersten Strahlteiler 25 projizierte Bildstrahl wird sowohl an die Mikroskopoptik oder die Okularlinsen 24, als auch an den zweiten Strahlteiler 156 übertragen. Nach einem bevorzugten Ausfiiluungsbeispiel überträgt der zweite Strahlteiler 156 nahezu das gesamte Licht oberhalb einer vorbestimmten Wellenlänge zur Reflektion durch den Spiegel 158 durch das optische Filter 164 hindurch zur ersten Kamera 168. In ähnlicher Weise werden die Lichtstrahlwellenlängen unterhalb der vorbestimmten Wellenlänge an die reflektierenden Spiegel 160 und 162 zur Reflektion durch das zweite Filter 166 an die zweite Kamera 170 übertragen. Die Filter 164 und 166 sind Schmalbandpaßfilter, die die durch sie hindurchgeleiteten Lichtstrahlen filtern, um im wesentlichen eine Lichtfrequenz mit einer bestimmten Wellenlänge zu liefern. Die Filter 164 und 166 arbeiten innerhalb enger spezifizierter Grenzen und bewirken eine optische Sperre für Wellenlängen außerhalb dieses engen Wellenlängenbandes. Somit sind die an die erste und die zweite Kamera 168, 170 gelieferten Lichtstrahlen im wesentlichen monochromatische Abbildungen des Sichtfeldes auf dem Objektträger 14. Die Filter 164 und 166 können gewechselt und entweder für Farboder Wellenlängenbetrieb ausgewählt werden, so daß das zweite Filter 166 beispielsweise ein Blaufilter mit einer schmalen Bandbreite ist, die von der Bandbreite des Filters 164 verschieden ist. Das heißt, das erste Filter 164 kann mit einer Wellenlänge von beispielsweise 620 ±10 Nanometer arbeiten, und das zweite Filter 166 kann als Blaufilter mit Wellenlängen nahe 500 ± 10 Nanometer arbeiten.
Jede Videokamera oder jeder Sensor 168, 170 kann das monochromatische, optische, durch das Licht übertragene Bild des Objektträgers 14 auf einem punktweisen, d.h. digitalen, Bereich in ein abgetastetes elektronisches Signal umwandeln, das die optische Intensität oder Dichte jedes Punktpixels in diesem Lichtbild wiedergibt. Das Ausgangssignal der ersten und der zweiten Kamera 168, 170, das als Standard-NTSC- Analog-Videosignal vorliegt, wird an einen Anlog- oder Digitalwandler eines Paars von Verarbeitungsinterfaces 21, 23 (siehe Fig. 2) zur Umwandlung in ein Digitalsignal übertragen, das von der Systemsteuerung 22 empfangen und gespeichert wird. Mit dem kontinuierlichen Abtasten des betrachteten Bildes auf dem Objektträger 14 wird durch die Bildanzeige 37 ein Echtzeitbild der betrachteten Fläche erstellt. Bei dem zuvor erwähnten Beispiel zur Feulgen-Antärbung liefert die Doppelkameraanordnung 168, 170 gleichzeitig ein Rotfarbbild und ein Blaufarbbild an das Steuersystem, wobei die Bilder gemischt werden können, um ein kombiniertes oder fokussiertes Bild des untersuchten Bereichs zu erhalten. Jedes monochromatische digitale Bild wird als ein Array von 512 x 512 Pixeln gespeichert, wobei jedes Pixel eine gemessene Lichtstärke von 0 bis 255 (8 Bit) hat.
Die abgeglichene Anordnung aufjeder Seite des ersten Bildteilers 25 ermöglicht es, das selbe Bild durch die Okularlinse 24 oder auf der Anzeige 37 zu betrachten. Die Plattform 51 kann durch die manuellen X/Y-Positionseinstelleinrichtungen 12 und 17 positioniert werden, während der Bediener ein Feld betrachtet oder einen Objektträger prüft, um ein gewünschtes Feld bereitzustellen. Anschließend wird das durch den Computer aufbereitete, digitalisierte Bild des gewählten Felds auf der Bildanzeige 37 zur weiteren Analyse angezeigt. Ein X-Positionssensor 26 und ein Y-Positionssensor 27, die in Fig. 2 dargestellt sind, erzeugen Orts- oder Positionssignale an das Positionsinterface 34 auf den Leitungen 26a und 27a, welches diese Signale digitalisiert, um der Vorrichtung 11 eine genaue Koordinatenwiedergabe des untersuchten Feldes zu liefern. Danach kann das betrachtete Feld zu einem späteren Zeitpunkt für weitere Untersuchungen erneut gewählt werden, ohne den gesamten Objektträger in der Brwartung, das selbe oder ein ähnliches Betrachtungsfeld möglicherweise wiederzufinden, durchsuchen zu müssen.
Die Anzeigen 37 und 62 werden von der Systemsteuerung 22 durch standardmäßige Videomonitorinterfaceschaltungen 39 und 61 gesteuert. In ähnlicher Weise sind die Tastatur 36 und der Drucker 38 mit der Systemsteuerung 22 durch herkömmliche Interfaceschaltungen 35, 41 verbunden. Die Systemsteuerung 22 steuert einen Direktzugriffsspeicher und andere Großraumspeichervorrichtungen, entweder in Forrn von Disketten oder Festplattenanordnungen oder -laufwerken 75, über ein Speichersteuerungsinterface 71.
Die Interfaceschaltungen 21, 23, 34, 35, 39, 41, 61 und 71 können wahlweise auf einer oder mehreren Platinen, die in der Rückseite oder im Kartensteckplatz eines herkömmlichen PC angebracht sind, der mit der Systemsteuerung 22 einstückig ausgebildet ist oder diese bildet. Der PC kann beispielsweise ein von IBM unter der Typenbezeichnung AT hergestellter PC oder ein ähnliches, damit kompatibles Gerat sein. Das Steuersystem 22 kann ein Betriebssystem wie PC DOS Version 3.1 oder ein späteres Programm sein. Die Systemsoftware für die Bildanalyse kann auf einer beliebigen Speicher- und/oder Betreibseinrichtung, beispielsweise einem Diskettenlaufwerk 75 oder einer Festplatte vorgesehen sein, und kann daher über eine Einrichtung wie eine Diskette 77 in das Betriebssystem des Computers eingebracht werden. Die Systemsoftware wird von der Diskette 77 gelesen und in den RAM 73 geladen. Anschließend wird die Programmsteuerung von dem Betriebssystem auf die Systemsoftware übertragen, um die zuvor eingestellten, verschiedenen Hardware-Elemente der Vorrichtung 11 zu regulieren.
Das Bildanalysesystem 13 bietet eine interaktive Programmsteuerung, die eine Anzahl von Befehlsbildschirmen oder -anzeigen auf den Befehismonitor 62 projiziert, um den Bediener bei der Quantifizierung von Kern-DNA zu unterstützen, die in einer oder mehreren auf dem Bildmonitor 37 dargestellten Zellen oder Subpopulationen gefünden wurden. Interaktive Antworten durch den Bediener und die Menüauswahlen für die verschiedenen Befehlsbildschirme dienen somit der Durchführung der Bildanalyse des auf dem Monitor 37 vorhandenen projizierten Bildes.
Die Systemfünktionen sind in Fig. 4 deutlicher dargestellt, wobei Sofiwaresteuerungslogikfiinktionen für die Hardware des Blocks 80 mit Systemsoftwarefünktionen für die Sofiwareanalyse und das Messen gemäß den Blöcken 82-96 zusammenwirken. Die Software führt einen Initialisierungsvorgang, die Herstellung eines Interface für die Betriebssystemfünktion und die gesamte Steuerung der Vorrichtung durch Instrumentensteuerlogik durch. Eine Bild- und Befehlsmonitorsteuerlogik führt Bildschirm- Handlervorgänge für die Befehlsbildschirme und die digitale Anzeige digitaler Bilder der Probe für beide Monitore 37 und 62 durch. Speicher- und Plattenspeicherfunktionen werden durch die Software- und Speichersteuerlogik ausgeführt oder gesteuert. Die Eingabe und Ausgabe für die interaktiven Antworten sowie die Berichtserstellung werden von der Tastatur- und Druckersteuerlogik gehandhabt. Daten von den Kameras 168 und 170 sowie den Positionssensoren 26 und 27 werden von der Bilderfassungs steuerlogik bzw. der Positionserfassungssteuerlogik gehandhabt.
Die Steuerlogik der Software bildet eine Betriebsoberfläche, die von den Analyse- und Meßfunktionen der Blöcke 82-86 zur Steuerung der Hardware einer Vorrichtung 11 zum Ausführen einer bestimmten Funktion genutzt wird. Dieses System sieht folgendes vor: eine Patienten- oder Zellbenennungsfünktion 82 zum Identifizieren der jeweiligen untersuchten Gewebeproben; Lichtkalibrierungs- und Posiüonskalibrierungsfunktionen 84 und 86, die zum Liefern einer genauen optischen Referenzdichte für ein bestimmtes Feld und der Position dieses Feldes in bezug zu einem Koordinatenursprung dient; eine Kontroll-Zellenkalibrierung 88, die ein Datenelement oder eine Referenz für die verschiedenartigen Ilintergrundanfärbungen liefert, DNA-Indexkalibrierung, oder eine andere Funktion; eine Grenzbildung 90, die es dem Bediener ermöglicht, einen Referenzpegel für den Grauskalenwert zum Vergleich mit dem Rot- oder dem Blaufarbbild zu bestirmuen; eine Funktion zum Markieren einer ausgewählten Zelle, die das Markieren der durch optische Zytoplasmaverbesserung in der Datenerfassungsfunktion identifizierten Zellen ermöglicht; eine Zellendatenfunktion 92 zum Speichern von Grauskalenwerten der Probenbildmessung; eine Zellklassifizierungsfunktion 93, die dem Bediener das Klassifizieren der erfaßten Zellen erlaubt, und eine Zellanalysefunktion 94, die unterschiedliche statistische Analysen kategorisierter Daten liefert; eine Utility-Funktion 95, die das erforderliche Hilfsprogramm für die Unterstützung der Primärfunktionen der Bildanalyse liefert; und eine Berichterstellungslünktion 96 zum Liefern eines Ausdrucks der analysierten und kompilierten Daten vom System an den oder durch den Drucker 38.
Der Probentrager ist vorzugsweise ein transparenter Objektträger 14 aus Glas, wie in den Fign. 5 und 6 dargestellt, der in genormten Größen vorliegt, beispielsweise 1 Inch x 3 Inch. Im vorliegenden Fall kann der Objektträger 14 mit zwei Bereichen versehen oder in solche unterteilt sein, wobei ein erster Kontrollbereich 56 Kontrollzellenobjekte 40 enthält, und ein zweiter oder Probenbereich 58 zum Aufnehmen der Zellprobe 52 vorgesehen ist, die auf den DNA-Gehalt oder andere Bestandteile hin analysiert und gemessen wird. Der Objektträger 14 kann zur schnellen Identifizierung des Kontrollbereichs 56 eine Begrenzung 54 um denselben herum aulweisen, und an einer geeigneten Stelle des Objektträgers 14 kann eine Identifizierungsmarkierung 53, die als Kreuz in Fig. 4 dargestellt ist, als Markierung oder Koordinatenursprung für das Objektträgerfeld vorgesehen werden.
Die Vorrichtung 11 kann in verschiedenen Räumen durch Personen unterschiedlichen Fertigkeitsgrades in der Bildanalyse verwendet werden. Die Mikroskoplichtquelle 19 kann durch verschiedene Bediener eingestellt werden, um die Lichtintensität zu verändern, und darüber hinaus kann die Art der Lampe selbst von Gerät zu Gerät variieren und vom Alter einer solchen Lampe abhängen. Es ist daher erforderlich, eine Kalibrierungsfunktion für die Lichtintensität vorzusehen, um Fehler zu eliminieren oder zu minimieren, oder die Unterschiede der Lichtintensität auszugleichen. Darüber hinaus kann die Anfärberate oder das verwendete Ausmaß der Anfärbung eine Schwankung im Anfärbefaktor bewirken, der eine Funktion des verwendeten Volumens der jeweiligen Anfärbung sein kann. Solche Schwankungen des Anfärbegrades verursachen eine Schwankung in der Ausgabe der von den Kameras 168 und 170 durch das Mikroskop 15 gesehenen Graustufe, die zum Analysieren der jeweiligen Bestandteile, beispielsweise des DNA-Gehalts, verwendet wird. Dementsprechend muß die Vorrichtung 11 zum Eliminieren der veränderlichen Unterschiede kalibriert werden, um eine wahrheitsgetreue Anzeige der tatsächlichen Bestandteilmenge zu liefern.

Anfärben

Die Verfahren zum Anfärben von Zellen können grob in wenigstens drei Kategorien unterteilt werden:
1) immunohistochemisches Anfärben, die auf monklonale Antikörper-Anziehung oder -Reaktion basieren kann;
2) starke chemische Bindung, beispielsweise das Faulgen-Anfärben, gekennzeichnet durch hohe Anfärbungsaffinität und/oder kovalente Bindung, die durch die Säurehydrolyse von DNA angezeigt werden kann; und
3) ionisches Anfärben in Verbindung mit starken Coulomb-Kräften und elektrostatischer Interaktion, die durch eine Farbstoff-Gewebereaktion angezeigt werden kann.
Beispiele für den ersten Typ des Anfärbens sind rotes Chromogen oder enzymatische alkalische Peroxidase oder alkalische Diaminobenzidenperoxidase. Beim zweiten Typ ist das Thionin für das Feulgen-Verfahren zum Anfärben von Kern-DNA beispielhaft für das Verfahren der starken chemischen Bindung. Schließlich ist der dritte Anfärbungstyp zum Beispiel durch Ethylgrün-Anfärbung, Hämatoxylin, Methylblau oder Eosin repräsentiert. Ein onkogener Typ einer Anfärbung kann die Eigenschaften des ersten und zweiten genannten Typs haben, oder ist durch die Typen eins und drei reprasentiert. Eine scharfe oder klar erkennbare Charakterisierung ist üblicherweise nicht so offensichtlich wie im vorligenden Fall.
Die Quellen der zuvor erwähnten Anfärbungsaffinität werden als Anziehkräfte zwischen Anfärbung und Zelle bezeichnet. Die Kräfte können als anziehende Coulomb- Kräfte, VanderWaal-Anziehkräfte (besonders relevant bei polarisierbaren Materialien mit großen elektrischen Dipolen), oder Anfärbung-Anfärbung-Anziehkräfte mit einer komplexen Ausbildung und Entropie-Effekten vorliegen. Andere Faktoren, die das Anfärben und die Anfärbungsselektivität beeinflussen, sind Schwankungen der Gewebesubstratmenge; unterschiedliche Anfärbung-Zellenbindung, die durch unterschiedliche Raten des Eindringens der Anfärbung in Zellstrukturen bewirkt werden kann; und selektives Kolorieren von gebundener Antärbung. Ferner existieren wenigstens die folgenden technischen Variablen, die das Anfarben beeinflussen: die Struktur des Antärbereagens; die Art des Lösemittels; das Vorhandensein anderer gelöster Stoffe; Temperatur, und Zeit. Eine ausführlichere Erörterung des Anfärbens und von Anfärbemechanismen ist in "Standardization and Quantitation of Diagnostic Staining in Cytology", herausgegeben von M.E. Boon und L. P. Kok, enthalten.
Das Kalibriermaterial 40 ist auf dem Objektträger 14 zur Betrachtung durch den Bediener oder Analytiker vorgesehen, so daß dieser eine Kalibrierungs- oder Referenzposition vor der Analyse der unbekannten Zelle oder Probe 52 erstellen kann. Wie in Fig. 5 dargestellt, weist der Objektträger 14 auf diesem angeordnete Kontrollzellobjekte 40 und Probenzellobjekte 52 zum gleichzeitigen Anfärben von Zellansammlungen auf. Dieses gleichzeitige Anfärben sowohl des Kalibrierungsmaterials 40, als auch der zu analysierenden Zellen 52 ermöglicht einen Vergleich der beiden Klassen oder Gruppen von Zellen mit einer vorbestimmten und gespeicherten Referenzlichtintensität, einer Graustufe oder optischen Dichte der Kontrollzellobjekte nach dem Anfärben. Sind die Zellobjekte entweder zu leicht oder zu stark angefärbt, kann die Differenz während der quantitativen Analyse ausgeglichen werden.
Bei dieser als Beispiel dargestellten Ausführungsform sind die Kontrollzellen 40 Rattenleberzellen mit bekannter Größe, Form und DNA-Gehalt. Die Kontrollzellobjekte können verschiedene andere Zellen mit dunklen Zentren oder Kernen sein, die sich gut anfärben lassen, beispielsweise Hühnerblutzellen oder Forellenzellen. Alternativ können die Zellobjekte Artefakte sein, die auf den Objektträger aufgedruckt sind oder Zellform aufweisen; oder die Zellobjekte sind herkömmliche Kunststoffperlen einer vorbestimmten Größe, die mit einem bestimmten Fluoreszenz- oder Enzymfärbemittel reagieren, wenn sie gleichzeitig mit Probenzellobjekten, beispielsweise monoklonalen Antikörpern, behandelt werden. Die Referenzzellobjekte variieren zwischen den Tests und die vorliegende Erfindung ist nicht auf einen bestimmten Test oder ein bestimmtes Zellobjekt beschränkt.
Bei dem zuvor erwähnten Beispiel, das das Feulgen-Anfärbeverfahren verwendet, werden die auf dem Objektträger 14 befindlichen Zellobjekte unter Verwendung eines Dual-Anfärbeverfahrens angefärbt. Bei diesem Beispiel wird bei einem alkalischen Phosphatase-Anfärbeverfahren ein primäres Antikörperreagens, ein biotinalatiertes sekundäres Antikörperreagens, ein Avidin-Biotin, ein alkalisches Phosphatasereagens und ein Chromogen-Substrat (vorzugsweise Echtrot) verwendet. Gleichermaßen verwendet das Feulgen-Anfärbeverfahren eine Thionin-Reagenslösung und ein Spülmittel. Bei diesem Verfahren wird der Objektträger, der Kontroll- und Probezellen in den Bereichen 54, 58 aufweist, zuerst durch den alkalische Phosphatase-Vorgang angefärbt, um ein bestimmtes zytoplasmatisches Antigen optisch hervorzuheben.
In Fig. 7 ist die bildliche Darstellung einer mit AR bezeichneten bestimmten Antigenstelle 180 als markiert und verstärkt dargestellt. Die Stelle wirkt antigenisch gegen einen damit verbundenen primären Antikörper 182. Ein Brückenantikörper 184 gegen den primären Antikörper dient der Verbindung mit dem primären Antikörper und weist ein anhängendes Biotin-Molekül 188 auf Ein Avidin-Biotin-Komplex, der ein Avidin- Molekül 186 und drei Biotin-Moleküle 188 umfaßt, wird dem primären Antikörper und dem damit verbundenen Brückenantikörper hinzugefügt. Die Biotin-Moleküle 188 werden mit Molekülen von alkalischem Phosphatase(AP)-Enzym 190 konjugiert. Die vierte Biotinmolekülstelle ist offen zum Binden des Komplexes an den Brückenantikörper 184. Wenn ein Farbstoff, beispielsweise Echtrotmoleküle 192 in einer Lösung, dieser Mischung zugesetzt wird, reagiert die alkalische Phosphatase mit den Farbstoffmolekülen zur Bildung nicht löslicher Echtrotmoleküle 194, die die Antigenstelle markieren. Zwar ist der Avidin-Biotin-Komplex als Beispiel ausgeführt, jedoch kann jede Anzahl von Markierungsverfahren und Anfärbungen verwendet werden, wie im folgenden erwähnt. Alternativ kann ein Brückenantikörper oder primärer Antikörper, der anti-alkalische Phosphatase ist, verwendet und auf die zuvor beschriebene Art und Weise durch Echtrotfarbstoff verstärkt werden.
Bei den zuvor erwähnten Feulgen-Anfärbeverfahren mit alkalischer Phosphatase, sieht die Vorrichtung für das vorliegende Verfahren ein Dual-Filterverfahren vor, um die durch das rote Chromogen (Zytoplasma) und durch das blaue Thionin (DNA) angefärbten Bereiche zu unterscheiden. Diese unterschiedlichen Bilder, von denen das eine von dem Rot-Filter und das andere von dem Blau-Filter geliefert wird, trennen die angefärbte DNA-Fläche von der Zytoplasmafläche, welche das spezifische Antigen enthält, und trennt ferner beide Flächen von anderen Zell- oder Feldmerkmalen. Das Verfahren verwendet selektives Filtern sowohl oberhalb, als auch unterhalb einer Wellenlänge durch einen Strahlteiler 156 und das anschließende Filtern der selektiven Wellenlängenbilder mittels eines Farbfilterverfahrens mit einem schmalen Bandpaß, wodurch die maximale Nutzung der verfügbaren Lichtintensität erreicht wird und die an jedes der separaten Filterelemente 164, 166 übertragene Lichtintensität zum Filtern minimiert wird, um deren Wirksamkeit zu verbessern.
Illustrativ für das Verfahren ist das in Fig. 8 dargestellte Ergebnis, welches sich auf ein DNA-Gating-Verfahren bezieht. Der Prozentsatz an durch die mit Thionin angefärbten Nuklei transmiffiertem Licht ist durch die Kurve A angegeben, welche eine Funktion der Lichtwellenlänge ist. Der Prozentsatz des durch den Echtrotfarbstoff hindurchgehenden Lichts ist als Kurve B dargestellt, die ebenfalls eine Funktion der Lichtwellenlänge ist. Die Bandbreite der Lichtwellenlängen, die vom Blau-Filter 166 durchgelassen werden, ist im Band C dargestellt, und die Bandbreite der vom Rot-Filter 164 transmittierten oder durchgelassenen Wellenlängen ist als Band D dargestellt.
Es ist ersichtlich, daß die Kurve A, die Thionin-Farbstoftkurve, ungefähr die minimale Transmission zeigt, oder bei einer Wellenlänge von ungefähr 480 Nanometer eine relative Undurchlässigkeit angibt, während die Echtrot-Kurve B in diesem Bandbereich eine relative Durchlässigkeit zeigt. Spätere Arbeiten haben erwiesen, daß bei der vorliegenden Erfindung eine Analyse bei ungefähr 500 nm durchgeführt werden sollte, was mit anderen im folgenden erwähnten Analyseverfahren übereinstimmt. Wenn das Bild der Zellpopulation durch das Blau-Filter 166 gefiltert wird, ist im wesentlichen der gesamte mit Echtrot-Farbstoff angefärbte Bereich im wesentlichen transparent und im wesentlichen der gesamte nit Thionin angefärbte Bereich ist sichtbar. Daher können die mit einer Feulgen-Anfärbung versehenen Bereiche von den zytoplasmisch angefärbten Bereichen getrennt werden. Bei ungefähr einer Bandwellenlänge um das Band D des Rot-Filters 164, ergibt sich der umgekehrte Vorgang. Das heißt, die Thionin-Kurve A zeigt bei dieser Bandbreite eine relative Durchlässigkeit, während die Echtrot-Kurve B eine relative Undurchlässigkeit wiedergibt. Somit sind die Echtrot-Farbstoff enthaltenden Zytoplasmabereiche erkennbar und leicht von den DNA-Kernbereichen unterscheidbar, die die Feulgen-Anfärbung aufweisen.
Die zuvor erwahnte Darstellung in Fig. 8 zeigt, daß das Maximum-Minimum-Verhältnis der Kurven A und B nicht genau überlappend ist. Es besteht jedoch eine ausreichend große Trennung zwischen den Kurven d.h. dem Prozentsatz der Transmissionsdifferenz, um es den Systemgeräten zu ermöglichen, eine deutliche analytische Darstellung an den Monitor zur Untersuchung, Analyse und zum Quantifizieren der Zelle oder der Zellen zu liefern.
Es ist ersichtlich, daß entgegengesetzte relative Differenzen in der Lichtdurchlässigkeit der beiden Anlärbungen mit ihren reaktiven Bestandteilen selektive Bereiche zum Filtern bereitstellen. Somit wird ein einfaches und vorteilhaftes Verfahren zum Unterscheiden zwischen diesen Flächen mit verschiedenen Anfärbungen zur Verfügung gestellt, und es ergibt sich hieraus, daß verschiedene andere Anfärbungspaarungen oder -umstände für andere Zellen und/oder Zellbestandteile verwendet werden können, um ähnliche Ergebnisse für das Erkennen und Unterscheiden verschiedener Zellmerkmale zu liefern.
Die Systemsoftware für die DNA-Analyse im obigen Beispiel kann nunmehr die Masse der Zell-DNA durch optische Dichtemessung der Probenzellen aus der Thionin-Anfärbung mittels des Instruments 11 ermitteln. Die Masse der DNA eines angefärbten Zellobjekts kann im allgemeinen aus ihrer optischen Dichte mit Hilfe des auf dem Gebiet der Mikrospektrophotometrie bekannten Beer-Lambert-Gesetzes bestimmt werden. Dieses Verfahren liefert die Masseverteilung einer Zelle oder einer Anzahl von Zellobjekten, die anschließend zur Analyse mittels statistischer Basen, Histogramme oder andere analytische Formate verfügbar ist. Die Punktgröße A, die für das genannte Beer-Lambert-Gesetz aufgezeichnet wird, wird aus der Zahl der Pixel bestimmt, die durch eine der Kameras 168, 170 gemessen wird. Die optische Dichte jedes Pixels wird durch Einstellen des Lichtpegels und des Brennpunkts sowie durch lesen einer optischen Referenzdichte für die Kalibrierzellen 40 auf dem Objektträger kalibriert. Diese Kalibrierung erlaubt die Umwandlung der gemessenen Lichtpegel jedes Pixels in eine optische Dichte, eine dimensionslose Menge. Die Kalibrierung de Extinktionskoeffizienten der zuvor genannten Gleichung erfolgt durch Messen der optischen Dichte mehrerer Kontrollzellen 40 zum Liefern eines Spitzenwerts der Verteilung in relativen Masseeinheiten. Da der Spitzen-DNA-Gehalt für die Kontrollzellenverteilung bekannt ist, können die Zellen im Bereich der unbekannten Probe unter Verwendung der relativen optischen Dichteeinheiten gemessen werden, und diese werden anschließend durch Vergleich mit der Kontrollzellenkalibrierung direkt ein Picogramme umgewandelt.
Im einzelnen zeigen die bildlichen Darstellungen der Fign. 9 - 11:1) Fig. 9 ist das Normalfarbenbild eines Feldes auf dem Objektträger 14; 2) Fig. 10 zeigt ein mit dem Rot-Filter gefiltertes Bild; und 3) Fig. 11 zeigt ein mit dem Blau-Filter gefiltertes Bild.
Fig. 12 ist ein Ablaufdiagramm der Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Quantifizieren der Kern-DNA.
Fig. 9 zeigt mehrere Zellen einer Subpopulation aus einem der Felder des Mikroskop- Objektträgers 14. Diese Subpopulation enthält verschiedene Typen, von denen insbesondere die Zellen 202 und 204 durch das erwahnte alkalische Phosphatase-Anfärben optisch hervorgehoben wurden. Die DNA in den Kernen sämtlicher Zellen 200, 202, 204, 206 und 210 wurden durch Feulgen-Anfärbung mit Thionin-Farbstoff optisch hervorgehoben. Es sei darauf hingewiesen, daß es sich bei diesem Verfahren lediglich um ein Beispiel und nicht um eine Beschränkung handelt. Der Lichtstrahl, der das Bild vom Strahlteiler 156 trägt, wird durch das Rot-Filter 164 projiziert. Das Bild ist in Fig. 10 dargestellt und zeigt, daß nur die Echtrot-Farbstoff enthaltenden Bereiche sichtbar sind. Dies sind die Zytoplasmabereiche 212, 214 der Zellen 202, 204, welche durch die Anfärbeverfahren optische hervorgehoben wurden, da sie ein spezifisches Antigen enthalten, das eine Verbindung mit dem monoklonalen Antikörper des alkalischen Phosphatase-Anfärbeverfahrens eingeht. Die Zellen 202, 204 sind von den Zellen 200, 206, 208 und 210 verschieden, die nicht in diesem Bild erkennbar sind. Ferner sind die Kerne sämtlicher Zellen 200, 202, 204, 206, 208 und 210 von dem Hintergrund nicht abgesetzt oder in diesem erkennbar, da die optische Trennung des Thionin-Farbstoffs und des Echtrot-Farbstoffs diese im wesentlichen transparent machen.
Umgekehrt zeigt Fig. 11 das Ergebnis des Projizierens des Bildes vom Strahlteiler 156 durch das Blau-Filter 166, in dem sämtliche Kerne der mehreren Zellen, z.B. 216, 26, der Zellpopulation sichtbar sind. Bei diesem Bild bewirkt das Blau-Filter einen Ausschluß der angefärbten Zytoplasmabereiche, die nicht kernmäßig angefärbt und somit, trotz der Anfärbung, optisch verschieden und damit transparent sind.
Die über dem für jedes gefilterte Bild eingestellten Schwellenwert angefärbten Bereiche können anschließend durch digitales Überlagern des DNA-Bildes und des Zytoplasmabildes kombiniert werden, wodurch sich ein deutliches Bild der DNA-Kernbereiche ergibt, das zum Typisieren und Analysieren betrachtet werden kann, wobei bestimmte Zellen 302, 304 nach dem jeweiligen Typ durch einen kennzeichnenden Zytoplasmaring oder -halbmond auf dem Kern markiert sind. Wie in Fig. 13 gezeigt. Die DNA-Analyse setzt sich sodann durch interaktives Klassifizieren jeder Zelle in dem auf dem Monitor 37 angezeigten Bild fort. Speziell markierte Zellen 302, 204 können in jede beliebige Klasse eingeschlossen, aus diesen ausgeschlossen oder getrennt von diesen klassifiziert werden. Es ist ferner ersichtlich, daß unterschiedliche optische Hervorhebungen und Filterungen unterschiedliche Zelltypisierungen und eine erhöhte Genauigkeit des Klassifizierungsvorgangs bewirken.
Das Verfahren zum Messen und Analysieren von DNA unter Verwendung des erfindungsgemäßen Markierungsverfahrens ist in Fig. 12 deutlicher dargestellt. In einem ersten Schritt in Block 250 wird der Objektträger, der die Kontrollzellobjekte und die Probenzellobjekte enthält, mittels dem zuvor genannten alkalischen Phosphatase- Verfahren unter Verwendung von Echtrot-Farbstoff angefärbt. Der monoklonale Antikörper ist spezifisch gegen das zytoplasmische Antigen, beispielsweise gewöhnliche Leukozyt-Antigene oder Cytokeratine. Der nächste Schritt im Verfahren besteht in der Anfärbung des Objektträgers 14 nach dem genannten Feulgen-Verfahren unter Verwendung von Thionin-Farbstoff, wie im Block 252 angegeben. Nach dem Anbringen wird der Objektträger 14 auf die Plattform 51 des Instruments 11 verbracht und derart angeordnet, daß sich ein klares Bild auf dem Bildmonitor 37 ergibt. Danach wird der Lichtpegel eingestellt, wie im Schritt oder Block 254 des Ablaufdiagramms dargestellt.
Die Plattform 51 wird auf die Kontrollzellen 40 eingestellt oder dorthin bewegt, oder es erscheint ein Bild einer Subpopulation der Kontrollzelle oder -zellen auf dem Monitor 37 (Block 256 der Fig. 12). Das Bild ist das gefilterte Bild (rot), das nur die Feulgen-Anfärbungsbereiche zeigt. Der Grad der Anfärbung zum Bestimmen des DNA-Index für die Bestimmung der Masse durch die optische Dichte, ergibt sich durch Messen der optischen Dichte der Kontrollzellen (Block 260). Im allgemeinen wird die Kalibrierung wiederholt, um eine genaue Messung und eine Bestatigung der Kalibrierung zu erhalten, und der Vorgang wird anschließend durch einfaches Wiederholen der Schritte in den Blöcken 260 und 262 wiederholt. In Block 262 kann die Plattform 51 manuell auf eine andere Position eingestellt werden, um ein zweites Feld von Kontrollzellen zu liefern.
Der Spitzenwert der optischen Dichteeinheiten wird gemessen, in einen DNA-Index umgewandelt, der in dem Computerspeicher gespeichert wird. Die DNA der unbekannten Zellenprobe wird anschließend aus dem Probenbereich 58 des Objektträgers 14 heraus analysiert, der durch manuelle Einstellung der Plattform 51 unter die Linse des Mikroskops bewegt wurde.
Ein Zytoplasmabild des Probenbereichs kann unter Verwendung des Blau-Filters (Block 266) und seiner Grenze (Block 268) erhalten werden. In ähnlicher Weise wird ein DNA-Bild des Probenbereichs durch das Rot-Filter (Block 270) geliefert und seine Grenze eingestellt (Block 272). Diese gefilterten Bilder sind Echtzeitbilder des Feldes und können durch Bilderfassungeinrichtungen 18 des Systems 11 kontinuierlich aufdatiert werden. Die Vorrichtung 11 kombiniert die beiden gefilterten Bilder (Block 274), um die ausgewählten Zellen auf dem Bildmonitor 37 zu markieren, während der Kern-DNA-Bereich angezeigt wird. Das Analyseprogramm geht sodann zum Klassifizierungsschritt (Block 276) über. Im Klassifizierungsmodus endet die Bilderfassung und -kombination (Markierung) und ein sattisches oder festes Bild wird auf dem Bildmonitor 37 gezeigt.
Die Zellen im Bild des Monitors 37 werden typmäßig durch einen interaktiven Vorgang mit dem Bediener klassifiziert. Jede Zelle wird durch die Vorrichtung angegeben und der Bediener wählt eine Klassifizierung für die separate Zelle unter Verwendung der Kernmorphologie und Zytoplasmamarkierungen des kombinierten Bildes. Klassifizierte Zellen werden sodann auf den jeweiligen Zellbestandteil hin vermessen, beispielsweise den DNA-Gehalt, (Block 278) und die Ergebnisse der Messung können angezeigt werden (Block 289). Diese Meßanzeige kann in verschiedenen Formen und mit statistischen Analysen der verschiedenen Klassifizierungen oder Kombinationen solcher Klassifizierungen erfolgen.
Der Meßschritt kann mehr als die Zellen in einem einzelnen Feld umfassen, indem einfach die in Den Blöcken 280-284 der Fig. 12 angeführten Schritte abgearbeitet werden. Der Bediener kann die Plattform 51 manuell zu einem anderen Probenbereich bewegen, und die Markierungs- und Abbildungsschritte können wie zuvor beschrieben wiederholt werden. Die in den Meßschritten für die neuen Zellpopulationen akkumulierten Daten werden mit den zuvor erstellten Zellpopulationsdaten kompiliert. Der in der vorhergehenden Beschreibung erwähnte Anzeigeschritt kann verzögert werden, bis eine bedeutende oder erforderliche Datenmenge akkumuliert ist, oder es kann durch Bedienerwinsch jede Iteration angezeigt werden. Zusätzlich kann der Bediener wählen, die Einstellung der Zytoplasmagrenzen und der DNA-Grenzen zu übergehen, nachdem sie zuerst für ein Probenbild eingestellt wurden.
Fig. 17 zeigt den Bildschirmaufbau des Systems und die alternativen Wege, die das System zwischen den Bildschirmen benutzt. In Fig. 15 und Fig. 16 sind Beispiele für zwei Systembildschirme, den Kalibrierungsbildschirm A14 und den Analysebildschirm A16, dargestellt, die auf dem Befehlsmonitor 62 erscheinen.
Gemäß Fig. 17 kann das Systemprogramm durch ein Anwendungsprogramm des Betriebssystems A10 betrieben werden. Die Wahl des Systemprogramms aus dem Betriebssystem A10 erzeugt das Menü A12 auf dem Monitor 62. Aus dem Hauptbildschirm A12 kann der Bediener einen Kalibrierungsschrim A14, einen Analyseschirm A16 oder die Rückkehr zum Betriebssystem A10 wählen. Die Vorrichtung 11 kann derart kalibriert werden, daß sie die Hintergrund- oder referenaartigen Einstellungen für die Messung im Assay während der Anzeige des Kalibrierungsbildschirms A14 auf dem Monitor 62 liefert. Nach Abschluß des Kalibrierungsvorgangs kann der Bediener den Analysebildschirm A16 aus dem Menu wählen, wobei diese Subroutine A16 zum Messen und Klassifizieren der Zellobjekte des Assays verwendet wird.
Das Kalibrierungsmenü in Fig. 19 bietet Mittel zur Einstellung der gegenwärtigen Bildoder Bereichsposition als den Ursprung, indem zwei Positionsregister in der Software auf Null gesetzt werden.
Die Meßfunktion A42 steuert die Kontrollzellen- oder Kontrollobjektkalibrierung zum Normalisieren des Anfärbungsfaktors. Während der Kontrollzellenkalibrierung bewegt der Bediener die Mikroskop-Auflage durch Verstellen der X- und Y-Drehknöpfe 12, 17, um die Zellobjekte 40 in das Sichtfeld auf dem Bildmonitor 37 zu bewegen.
Zusätzliche Funktionen sind in den verschiedenen Bildschirmen für verschiedene Operationen des Vorgangs vorgesehen. Diese umfassen unter anderem: die X-Y- Funktion zur Unterstützung des Positionierens der Plattform 51; die Fokus- 1 -Funkton A40 zur Farbverbesserung des Bildes; die Analysefünktion, die eine in Fig. 22 dargestellte Menüfunktion bereitstellt, um DNA-Messungen am Zellmaterial durchführen zu können; die Lichtprüf-2-Funktion A82 berechnet den Lichtpegel des gegenwärtigen Bildes; die Zweit-Wahl-Funktion A84 ermöglicht es dem Bediener, den zweiten Spitzenwert eines auf einem Analysebildschirm angezeigten Histogramms zu wählen; die Klassifizierungsfunktion A78 ermöglicht es dem Benutzer die Zellen oder Objekte auf dem Bildmonitor 37 zu klassifizieren; die Anzeige-X/Y-Funktion A88 wechselt die Anzeige vom Analysebildschirm zum X/Y-Bereichskoordinatenbildschirm; die Lösch-2-Funktion A90 löscht alle analysebezogenen Datenbereiche; die Fokus-2-Funktion A80 bewirkt Farbverbesserung; die Bereich-1-2-Funktion A86 ermöglicht es dem Benutzer zwei Bereiche in dem auf dem Analysebildschirm angezeigten Histogramm auszuwählen.
Es ist offensichtlich, daß die verschiedenen Kalibrierungsschritte für die angefärbten Zellen eliminiert oder kombiniert und gleichzeitig, anstatt in der zuvor beschriebenen Reihenfolge, Abfolge und Weise durchgeführt werden können.

Optik- und Geräteausrichtung

Die in Fig. 3 dargestellte Bilderfassungsvorrichtung 18 weist einen Strahlteiler 25 auf, der in einem Halter 53 befestigt und angebracht ist, welcher ebenfalls die Fokussierlinse 154 hält. Das von der Lichtquelle 19 und dem Mikroskop 15 gelieferte fokussierte und vergrößerte Bild tritt in den im Halter 53 angebrachten Strahlteiler 25 ein. Der Strahlteiler 25 liefert ein Bild für die Manuelle Betrachtung der zu analysierenden Zelle durch die Sichtoptik oder Okularlinse 24 sowie die Vorrichtung 18. Nach Fig. 3 sind der Halter 53 und der Strahlteiler 25 im allgemeinen mittig angeordnet, um einen das vergrößerte Bild enthaltenden Lichtstrahl entlang der Längsachse der Bilderfassungsvorrichtung 18 zu projizieren, und weist einen ebenfalls entlang dieser Längsachse ausgerichteten zweiten Strahlteiler 156 auf. Das System nach Fig. 3 schafft einen Lichtweg zu den Kameras, der länger als erwünscht ist, da er das Reflektieren eines Lichtstrahls mit geringerer Intensität als der Strahl vom ersten Strahlteiler 25 erfordert. Daher ist ein alternativer Pfad vorgesehen, wie in Fig. 23 vorgesehen, um den polychromatischen Strahl mit höherer Intensität zu Anfang zu reflektieren, wodurch eine gleichmäßigere Strahlintensität an beide Videokameras geliefert wird. Das heißt, der zweite Strahlteiler 156, der ein dichroitischer Strahlteiler sein kann, teilt den ersten Lichtstrahl mit höherer Intensität in zwei Lichtstrahlen ungefähr gleicher Intensität. Diese Anordnung schafft enger aufeinander abgestimmte Strahlen an den Videokameras, wodurch die erforderlichen Einstellungen zum Abgleichen des gesamten Bildsystems reduziert werden können. Bin weiterer Vorteil dieser Struktur besteht in einem kompakteren Aufbau mit leicht einstellbaren Teilen im optischen System.
In Fig. 23 ist die Bilderfassungsvorrichtung 18 im allgemeinen rechteckig dargestellt, wobei eine Längsachse 19 parallel oder im wesentlichen parallel zur Längsachse 169 der ersten Videokamera 168 und zur Achse 171 der zweiten Videokamera 170 verläuft. Bei diesem alternativen Ausführungsbeispiel ist die Fokuslinse 154 in dem Halter 53 an einer zur Längsachse 19 senkrechten Stelle angebracht, um den das vergrößerte Bild vom Strahlteiler 25 tragenden Lichtstrahl 153 zu empfangen. Dieser Bild- oder Lichtstrahl 153 wird durch die Fokuslinse 154 an einen ersten Spiegel 160 zum Reflektieren zum zweiten Spiegel 162 und zum zweiten Strahlteiler 156 projiziert. Bei dieser Ausbildung wird der Bild- oder Lichtstrahl 1534 senkrecht zur Achse 19 projiziert, in einem ungefähr rechten Winkel vom ersten Spiegel 160 zum zweiten Spiegel 162 reflektiert und erneut in einem rechten Winkel zur Übertragung des vergrößerten Bildes an den zweiten Strahlteiler 156 reflektiert, wobei die zweite Reflektion vom zweiten Spiegel 162 entlang einer parallel zur Bildlinie des ersten Lichtstrahls 153 verlaufenden Richtung dargestellt ist. Anschließend teilt der zweite Strahlteiler 156 den ersten Lichtstrahl 153, der durch das Reflektieren lediglich gedärnpft wurde, in einen zweiten Lichtstrahl 157 und einen dritten Lichtstrahl 159.
Wie bereits erwähnt, kann der Strahlteiler 156 ein dichroitischer Strahlteiler sein, das heißt er kann zum Teilen eines ersten oder aufireffenden Lichtstrahls in einen zweiten und einen dritten Lichtstrahl betrieben werden. Der zweite Lichtstrahl kann transmittiertes Licht oberhalb einer vorbestimmten Wellenlänge und der dritte Lichtstrahl kann Licht sein, das unterhalb der vorbestimmten Wellenlänge reflektiert wird. Die Reihenfolge der Transmission-Reflektion durch den Strahlteiler ist nicht auf die zuvor genannte beschränkt, sondern diese dient lediglich als Beispiel. Eine umfassendere Darlegung dieses pHänomens kann in einer thematischen Darstellung von Lichtpolarisierung und Nicol-Prismen in einem standardmäßigen oder die Optik betreffenden Physiktext nachgesehen werden. Dichroitische Filter oder Strahlteiler können derart gewählt werden, daß sie mit unterschiedlichen vorbestimmten Wellenlängen betreibbar sind.
Als Beispiel, nicht jedoch als Einschränkung, sei angenommen, daß der Lichtstrahl 157 unterhalb einer vorbestimmten Wellenlänge liegt und durch ein erstes monochromatisches optisches Filter 164 zum Übertragen an und Reflektieren von einem dritten reflektierenden Spiegel 158 geleitet wird, der den Lichtstrahl 157 ungefähr unter einem rechten Winkel, der im wesentlichen parallel zur Längsachse 19 verläuft, zur ersten Videokamera oder zum ersten Sensor 168 an der Frontscheibe 173 der ersten Kamera reflektiert. Der dritte Lichtstrahl 159 wird von dem Teiler 156 durch das zweite optische Filter 166 für monochromatisches Licht an die zweite Video- oder Sensorkamera 170 an deren Frontscheibe 175 reflektiert. Es sei bei dieser Ausbildung darauf hingewiesen, daß die Lichtstrahlen unter rechten Winkeln oder im wesentlichen rechten Winkeln zu den schneidenden oder reflektierenden Ebenen reflektiert werden, derart, daß der Strahl im wesentlichen entweder parallel oder senkrecht zur Längsachse 19 der Bilderfassungsvorrichtung 18 verläuft. Das erste monochromatische optische Filter 164 und das zweite monochromatische optische Filter 166 befinden sich in der Nähe des zweiten Bildstrahlteilers 156, wodurch die maximale Intensität der geteilten Bildlichtstrahlen erreicht wird und die mögliche Dämpfüng durch das Übertragen solcher Strahlen mittels reflektierender oder filternder Einrichtungen minimiert wird.
Wie zuvor erwähnt, teilt der zweite Bildstrahlteiler 156 den ersten Lichtstrahl 153 in ein kontinuierliches Spektrum mit einer Bandbreite unterhalb einer vorbestimmten Wellenlänge, nämlich den zweiten Lichtstrahl 157, und ein anderes kontinuierliches Bandbreitenspektrum oberhalb der vorbestimmten Wellenlänge, nämlich den dritten Lichtstrahl 159. Diese Lichtstrahlen werden an die erste 168 bzw. die zweite Videokamera 170 projiziert oder ubertragen. Der erste Lichtstrahl 157 wird an die erste Kamera 168 an deren Frontscheibe 173 über das erste monochromatische optische Filter 164 und den Spiegel 158 geliefert. Das erste Filter 164 ist besonders dafür ausgewählt, ein annähernd monochromatisches optisches Bild mit einer vorbestimmten Wellenlänge zu liefern, das heißt, es filtert Wellenlängen außerhalb der ersten vorbestimmten Wellenlänge aus. In ähnlicher Weise filtert oder wählt das zweite monochromatische optische Filter 166 einen Bereich einer Lichtstrahlbandbreite mit einer vorbestimmten Wellenlänge zur Übertragung zur zweiten Videokamera 170 an deren Frontscheibe 175 aus. Da die Bandbreiten der Lichtstrahlen durch den zweiten Teiler 156 verringert wurden, sind die Filter bei der Lieferung des Lichts ausgewählter Wellenlänge an die Kameras 168, 170 effizienter.
In Fig. 23 ist die Entfernung vom zweiten Strahlteiler 126 zum dritten reflektierenden Spiegel 158 mit X bezeichnet; die Entfernung von dritten Spiegel 158 zur Frontscheibe 173 der ersten Videokamera 168 ist Y, und die Entfernung vom zweiten Bildstrahlteiler 156 zur Frontscheibe 175 der zweiten Videokamera 170 ist mit Z bezeichnet. Bei dieser Ausbildung ist die Summe der Strahlwege oder Entfernungen X+Y gleich der Entfernung Z.
Das Bild vom zweiten Strahlteiler 156 an die zweite Kamera 170 wird in diesem Ausführungsbeispiel nur durch das zweite optische Filter 166 projiziert und somit werden die Bild- oder besser gesagt die durch Reflektion oder Interferenz bewirkten Intensitätsverluste zur zweiten Videokamera 170 minimiert. Ferner ist das optische Filter 164 näher an dem zweiten Bildstrahlteiler 156 angeordnet, um das Bild an die erste Kamera 168 durch Filtern eines Lichtstrahls, der nicht durch Entfernung oder im Weg erfolgende Reflektion oder Brechung gedämpft ist, zu verbessern.
Bei diesem Ausführungsbeispiel, das in den Fign. 24-27 im einzelnen dargestellt ist, weist die Bilderfassungsvorrichtung 18 ein Gehäuse 402 auf, das eine Bodenplatte 404, eine Deckelplatte 406, eine Vorderplatte 412, eine hintere Platte 413 und eine erste sowie eine zweite Seitenwand 408, 409 aufweist. In Fig. 27, die eine Explosionsdarstellung der Vorrichtung 18 zeigt, wirken die Gehäuseteile 404, 406, 408, 409, 412 und 413 zur Bildung einer Hülle oder Kammer 410 zusammen, in der die Bestandteile der Bilderfassungsvorrichtung 18 angebracht und betätigbar sind. Die Bodenplatte 404 wird im wesentlichen als Montagebasis zum Anbringen oder Halten der verschiedenen Betatigungselemente der Bilderfassungsvorrichtung 18 verwendet. In dieser Darstellung weist die Bodenpiaffe 404 eine Vorderplatte 412 mit einer Basis 414 zum Aufnehmen des Halters 53 für den ersten Strahlteiler 25 und die Fokussierlinse 154 auf Die Montagebasis 414 ist mit mehreren Gewindelöchern 416 versehen, die mit Durchgangsbohrungen 418 des Halters 53 zur Aufnahme von als Gewindeschrauben dargestellten Befestigungseinrichtungen 420 fluchten, welche in die Gewindelöcher 416 zum Befestigen des Halters 53 an der Bodenplatte 404 eingreifen.
Die Bodenplatte 404 weist einen ersten Schwenksockel 422 und einen zweiten Schwenksockel 424 sowie eine erste Gewindebefestigungsöffnung 426 und eine zweite Gewindebefestigungsöffnung 428 (s. Fig. 25) auf, die mit dem ersten und dem zweiten Schwenksockel 422 und 426 in Verbindung stehen. Der erste reflektierende Spiegel 160 ist an der ersten Montagebasis 432 angebracht, die einen ersten Drehbolzen 436 aufweist. Der zweite Spiegel 162 ist auf ähnliche Weise an der zweiten Montagebasis 434 angebracht, wobei der zweite Drehbolzen 438 daran befestigt ist. Der erste Drehbolzen 436 und der zweite Drehbolzen 438 sind in dem ersten und dem zweiten Schwenksockel 422 bzw. 424 angeordnet und der erste und der zweite Spiegel 160 und 162 sind durch Drehen in dem Sockeln zum Positionieren der Reflektion des von der Fokuslinse 154 her empfangenen vergrößerten Bildes einstellbar. Nach dem Ausrichten der Spiegel 160, 162, greifen Befestigungseinrichtungen 430 in den Ports 426 und 428 an dem ersten und dem zweiten Drehbolzen 436 und 438 an, um die Montagebasen und die Spiegel zu befestigen.
Der zweite Strahlteiler 156 ist in einem Rahmen 472 auf einer kardanischen Basis 450 angebracht und betätigbar Die Bodenplatte 404 weist eine Ausnehmung 440 mit einer Ausnehmungsseitenwand 442 und einer Aufnahme 444 für eine Unterlegscheibe auf, die wenigstens teilweise zur Ausnehmung 440 hin offen ist. Die Unterlegscheibenaufnahme 444 weist eine im wesentlichen mittig angeordnete Gewindeöffnung 446 auf, und die Bodenplatte 404 ist mit einer Gewindeschwenkbohrung 448 in der Ausnehmung 440 versehen. Die kardanische Basis 450 für den Strahlteiler 156 ist in der Ausnehmung 440 angeordnet. Die Basis 450 weist eine im wesentlichen mittig angeordnete Ausnehmung 452 und einen Durchlaß 454 für den Schwenkzapfen der kardanischen Basis auf, der in Flucht mit der Gewindeschwenkbohrung 448 gebracht werden kann. Ferner weist die kardanische Basis 450 ein erstes Gewindeloch 456, ein zweites Gewindeloch 458 und ein drittes Gewindeloch 460 auf. Der Schwenk- und Befestigungsgewindestifi 462 kann durch den Schwenkstiftdurchlaß 454 bewegt und in Eingriff mit dem Gewindeschwenkstift 448 gebracht werden, um die kardanische Basis 450 in der Ausnehmung 440 zu sichern. Der Schwenkstifi 462 wirkt jedoch auch als ein Schwenkstift für die kardanische Basis, wenn diese nicht in der festgelegten Stellung ist. Ein kugelförmiges Lager 464 ist in der mittigen Ausnehmung 452 angeordnet, um eine leichte Dreh- oder Schaukelbewegung des zweiten Strahlteilers zu ermöglichen. Ferner sind eine erste Vertikalvorspannungseinrichtung 466, eine zweite Vertikalvorspannungseinrichtung 469 und eine dritte Vertikalvorspannungseinrichtung 470 zum vertikalen Vorspannen des Strahlteilers 156 vorgesehen. Die Bodenplatte 404 weist eine Verriegelungsgewindeöffnung 491 auf, die zur Aufnahme einer Verriegelungsschraube 493 mit der Ausnehmung 440 in Verbindung steht.
Der zweite Strahlteiler 156 ist in einem Befestigungsrahmen 472 befestigt, der eine erste Durchlaßöffnung 474, eine zweite Durchlaßöffnung 476 und eine dritte Durchlaßöffnung 478 zur Aufnahme einer ersten, einer zweiten und einer dritten Gewindebefestigungseinrichtung 480,482 und 484 aufweist. Die erste, zweite und dritte Durchlaßöffnung 474,476 und 478 können in Flucht mit Gewindebohrungen 456,458 und 560 der kardanischen Basis 450 gebracht werden. Der Befestigungsrahmen 472 ist auf der kardanische Basis 450 unter Zwischenfügung der ersten, zweiten und dritten Vertikalvorspannungseinrichtung 466, 468 und 470 und in Flucht mit den Durchlaßöffnungen 474, 476 und 478 sowie mit den Gewindebohrungen 456, 458 und 460 der kardanischen Basis 450 angebracht. Anschließend werden die erste, zweite und dritte Befestigungseinrichtung 480, 482 und 484 durch die Durchlaßöffnungen 470, 476 und 478 in Eingriff in die Gewindebohrungen 456, 458 und 460 gebracht.
Die kardanische Basis 450 mit dem Rahmen 472 und dem Teiler 156 wird in der Ausnehmung 440 angeordnet, wobei der Schwenkzapfen und die Befestigungseinrichtung 462 durch die Schwenkzapfenöffnung 454 in Eingriff mit der Gewindebohrung 448 sind und die kardanische Basis 450 normalerweise um die Schwenkeinrichtung 462 in der Ausnehmung 440 schwenken kann. Eine Seitenvorspannungseinrichtung 486, die in der Ausnehmung 440 zwischen der Seitenwand 442 und der kardanischen Basis 450 angeordnet ist, spannt die Basis 450 um den Schwenkzapfen 462 vor. Eine Unterlegscheibe 488 mit einer mittigen Durchlaßöffnung 490 ist in der
einem Abschnitt ihres Umfangs an. Wenn die kardanische Basis in einer bevorzugten oder ausgerichteten Position angeordnet ist, wird anschließend die Unterlegscheibe 488 mittels eines Bolzens 492 festgelegt, der durch die Mittelöffnung 490 in die Gewindebohrung 446 eingreift. Die Gewindeschwenkzapfen- und Befestigungseinrichtung 462 wirkt mit der Sicherungsunterlegscheibe 488 und der Verriegelungsschraube 493 zum Verriegeln oder Sichern des zweiten Strahlteilers 156 in der bevorzugten Position entgegen der seitlichen Vorspannungskraft der Vorspannungseinrichtung 486 zusammen.
Der dritte Spiegel 158 ist auf einer zweiten kardanischen Stütze 494 verstellbar befestigt, welche einen Befestigungssockel 496 und ein vertikales Wandteil 498 aulweist, wobei der dritte Spiegel 158 im wesentlichen parallel zu diesem angebracht ist. Das Wandteil 498 weist eine erste Gewindeöffnung 500 und eine zweite gewindeöffnung 502 auf, durch welche sich eine erste und eine zweite Gewindeeinstelleinrichtung 501, 503 zur Anlage am Spiegel 158 erstrecken. Der Befestigungssockel oder das Fußteil 496 weist eine erste und eine zweite Befestigungsdurchgangsöffnung 504 und 506 auf, die auf eine erste und eine zweite Gewindebohrung 508 und 510 der Bodenplatte ausgerichtet werden können. Die kardanische Stütze 494 ist an der Bodenplatte 404 mit zwei sich durch die Öffnungen 504 und 506 erstreckenden Gewindebolzen befestig, welche in die Gewindelöcher 508, 510 eingreifen. Anschließend wird der Spiegel 158 durch das Drehen der Gewindeeinstelleinrichtungen 501 und 503 verstellt.
Das zweite optische Filter 166 ist im zweiten Filterbefestigungsrahmen 514 befestigt, welcher eine erste und eine zweite Durchgangsbohrung 516 und 518 des zweiten Rahmens aufweist. Die Bodenplatte 404 weist zwei Gewindebohrungen 522 und 524 für das zweite Filter auf, die in Flucht mit (nicht dargestellten) Bohrungen des zweiten Rahmens gebracht werden können, die jeweils einen von zwei Befestigungsbolzen 520 zum Befestigen des Rahmens 514 an der Bodenplatte 404 aufnehmen. In ähnlicher Weise ist das erste Filter 164 in einem Befestigungsrahmen 526 für das erste Filter angebracht, der eine erste Durchgangsbohrung 528 und eine zweite Durchgangsbohrung 530 aufweist. Die Bodenplatte 404 weist zwei Gewindebohrungen 534 und 536 für das erste Filter auf, die mit (nicht dargestellten) Gewindebohrungen für das erste Filter in Flucht gebracht werden können, um einen von zwei Befestigungsbolzen 532 zur Befestigung des ersten Befestigungsrahmens 526 an der Bodenplatte 404 aufzunehmen. Die Befestigungsrahmen 514 und 526 sind nominell einstellbar, bevor die Sicherung durch die Bolzen 520 und 532 erfolgt.
Wie in Fig. 27 dargestellt weist die Bodenplatte 404 eine Gruppe oder eine Vielzahl von aufragenden oder aufrecht stehenden Stegen auf, die sich im wesentlichen vertikal von der Bodenplatte 404 in den Mantel 410 erstrecken. Genauer gesagt steht der erste aufragende Steg 538 vertikal in die Kammer 410 entlang oder parallel zur ersten Seitenwand 408 vor, und der zweite Steg 540 sowie der dritte Steg 542 sind im wesentlichen mittig auf der Bodenplatte 404 entlang der Längsachse 19 angeordnet und erstrecken sich in den Mantel 410 hinein. Die Stege 540, 542 sind im wesentlichen entlang der Achse 19 in dem Mantel 410 zentriert. Die Bodenplatte 404 weist ferner zwischen dem ersten Steg 538 und dem zweiten und dritten Steg 540, 542 einen Schlitz 546 für die zweite Videokamera 170 auf Ein vierter, fünfter und sechster Steg oder Träger 548, 550 und 552 erstrecken sich vertikal von der Bodenplatte 404 in die Kammer 410 entlang der zweiten Seitenwand 409. Die Träger 548, 550 und 552 sind im wesentlichen parallel zu den mittig angeordneten zweiten und dritten Stegen 540, 542 und wirken mit der Bodenplatte 404 und den mittigen Stegen 540, 542 zur Bildung eines Kanals 554 für die erste Videokamera 168 zusammen.
Die zweite Videokamera 170 ist im Schlitz 546 betätigbar und einstellbar. Eine Befestigungsanordnung 556 für die erste Kamera mit einer Basis 558 und einem Joch 560 ist auf der Bodenplatte 404 parallel zu und in ungefährer Längsausrichtung mit dem zweiten Filter 166 befestigt. Die Kamerabefestigungsanordnung 556 bildet eine im wesentlichen kreisrunde oder ovale Öffnung 562 zur Aufnahme und Hajterung der gebogenen und vorstehenden Linsenhalterung 564 der Kamera 170. Eine Kamerabefestigungshalterung 566 ist an einer Seitenwand der ersten Kamera 170 befestigt, beispielsweise durch mehrere Schrauben, die in die Seitenwand und die Kamera 170 eingreifen. Die Halterung 566 weist eine Seitenwand 568 und ein sich nach oben erstreckendes Teil 570 auf, das senkrecht zur Seitenwand 568 verläuft und einen oberen gebogenen Bereich 572 und einen unteren gebogenen Bereich 574 aufweist, die sich von dieser erstrecken. Der obere und der untere gebogene Bereich 572, 574 sind in einer hinteren Kamerabefestigungsstütze 576 anbringbar oder positionierbar, welche eine Öffnung 578 zur Befestigung aulweist. Die hintere Befestigungsstütze 576 weist einen mit einem Gewinde versehenen Verriegelungsdurchlaß 580 für eine Gewindeverriegelungseinrichtung oder -schraube 582 auf, die an einem, entweder dem obere oder dem unteren gebogenen Bereich 572, 574 zum Sichern der Stellung oder Position der Seitenwand 568 und der Kamera 170 angreift. Die hintere Stütze 576 weist ferner zwei Durchlässe 584 und 586 auf, die in Übereinstimmung oder in Flucht mit Gewindebohrungen 588 und 590 der Stege 538 bzw. 540 gebracht werden können und die jeweils zur Aufnahme einer von zwei Befestigungseinrichtungen, beispielsweise Bolzen 592, zum Sichern der Kamerabefestigungsstütze 576 und damit der Kamera 170 im Schlitz 546 und in der Kammer 410 offen sind. In dieser Position ist die Kamera 170 sowohl geringfügig drehbar, als auch in Längsrichtung im Schlitz 546 bewegbar, um die Kameraausgabe- oder die Digitalisierungseinrichtung für das Betrachten auf dem Monitor 37 zu fokussieren.
Die erste Videokamera 168 ist in dem Kanal 554 angebracht und in Längsrichtung bewegbar. Die Kamera 168 ist entlang der Achse 109 im Kanal 554 verschiebbar, um das auf den Schirm 37 projizierte Bild zu fokussieren, und sie kann im Kanal 554 durch eine zwischen der Kamera und einem fünften und sechsten Steg 548 und 550 angeordnete Druckplatte 594 gesichert sein, um die Kamera 168 gegen die mittleren oder zentralen Stege 540 und 542 zu sichern. Die Druckplatte 594 ist gegen die Kamera 168 durch zwei Gewindeverriegelungseinrichtungen oder-bolzen 600 gesichert, die sich durch Öffnungen 596, 598 in den fünften und sechsten aufragenden Stegen 548, 554 erstrecken. Darüber hinaus kann der Signalpegel der Kamera 168 über eine Sockelverstelleinrichtung 602 und eine Einrichtung 604 zum Einstellen der elektronischen Verstärkung eingestellt werden.
Nach dem Montieren der genannten Teile der Erfassungsvorrichtung 18 auf der Bodenplatte 404 werden die erste und die zweite Kamera 168, 170 im Gehäuse 402 positioniert und ein vergrößertes Bild wird an die montierten Kameras zur Einstellen der Spiegel 160, 162 und 158 sowie durch Einstellen des zweiten Strahlteilers 156 und der optischen Filter 164, 166 übertragen. Der erste und der zweite reflektierende Spiegel 160, 162 sind auf den Drehbolzen 436 und 438 in den Sockeln 422 und 424 drehend einstellbar, um den ersten Lichtstrahl 153 von dem ersten Strahlteiler 25 an den zweiten Strahlteiler 156 zu übertragen. Der zweite Strahlteiler 156 ist in der Ausnehmung 440 in einer horizontalen Ebene einstellbar, die generell durch die Bodenplatte 404 gebildet ist. Die kardanische Platte 450 kann durch Verschwenken um die Schwenkeinrichtung 462 gegen die Kraft der Seitenvorspannungseinrichtung 486 verstellt werden. Es ist selbstverständlich, daß die verschiedenen Befestigungseinrichtungen zum Sichern der kardanischen Platte in der gewünschten Position während der Einstellung nicht in Eingriff sind. Die vertikale Einstellung des zweiten Strahlteilers 156 erfolgt durch Lösen oder Anziehen der Befestigungseinrichtungen 480,482 und 484, um ein leichtes Schaukeln oder Drehen des Strahlteilers 156 auf dem kugelförmigen Lager 464 gegen die Vorspannungskrafi der Vertikalvorspannungseinrichtungen 466, 468 und 470 zu ermöglichen. Schließlich ist der dritte reflektierende Spiegel 158 durch die Einstelleinrichtungen 501 und 503, die vertikale und horizontale Einstellung ermöglichen, einstellbar, um den Lichtstrahl 157 im wesentlichen auf die Linsenebene 173 der ersten Kamera 168 zu zentrieren. Es ist ferner selbstverständlich, daß die Montagebasis 494 anfangs in geringem Maße verstellbar ist, da die kardanische Anordnung des dritten Spiegels an der Bodenplatte 404 befestigt ist. In Fig. 23 sind die monochromatischen optischen Filter 164 und 166 so nahe an dem zweiten Strahlteiler 156 angeordnet, um die Intensitätsverluste der vom Strahlteiler 156 darauf projizierten Lichtstrahlsignale zu minimieren. Ferner weisen die Lichtstrahlwege 157, 159 vom zweiten Strahlteiler 256 zur ersten Kamera 168 und zur zweiten Kamera 170 ungefähr die selbe Länge auf um gleiche Lichtintensitäten an beide Kameras zu liefern, wodurch die Fokussierung der Kameras unterstützt wird.

Fokussierung der Geräte

Der Einstell- oder Fokussierungsvorgang für die Kameras 168, 170 ist ähnlich dem Vorgang für Kameras früherer Modelle von Analysegeräten. Vom Mikroskop 15 wird durch den ersten Strahlteiler 25 und die Fokussierungslinse 154 ein Kalibrierungsbild zur Reflektierung durch den ersten Spiegel 160 und den zweiten Spiegel 162 an den zweiten Strahlteiler 156 geliefert. Der geteilte Strahl oder die geteilten Strahlen 157, 159 vom Teiler 156 werden an die erste Videokamera 168 und die zweite Videokamera 170 über das erste und das zweite optische Filter 164, 166 übertragen. Die ersten und zweiten Bildausgänge der Videokameras 168 und 170 an die Digitalisierungseinrichtung werden zur Sichtung und Kalibrierung auf den Schirm 37 projiziert. Das Bild der ersten Kamera 168 kann individuell durch gleitende Kamerabewegung entlang der Achse 169 fokussiert werden. Die zweite Kamera 170 und das von dieser an den Schirm 37 projizierte Bild können durch Drehen um oder gleitendes Bewegen entlang der Achse 171 fokussiert und eingestellt werden, wonach die Kamera 170 in ihrer Position festgelegt wird. Nach den Kameraeinstellungen sichern die Klemm- und Befestigungseinrichtungen die Kameras 168, 170. Beispiele für Binstelleinrichtungen sind die vordere Stütze 556 und die rückwärtige oder hintere Stütze 576, wobei die Befestigungseinrichtung 582 gelöst werden kann, um ein Drehen der Kamera 170 um ihre Achse 171 zu ermöglichen.
Die Vorrichtung 11 wird im allgemeinen zum Analysieren biologischer Zellproben verwendet. Das Bild von der Objektivlinse 16 des Mikroskops 15, welches das projizierte und vergrößerte Bild des Kalibrierungs- oder Zellenobjekffrägers ist, wird aufivärts zum Strahlteiler 25 projiziert, um das Bild sowohl an die Okularlinse 24, als auch an die Fokuslinse 154 zu liefern, die eine feste oder veränderbare Brennweite haben können. Der das vergrößerte Bild enthaltende Lichtstrahl 153 nach dem Fokussieren durch die Linse 154, bei dem es sich um ein reales und fokussiertes Bild im Gegensatz zu einem nicht fokussierten und virtuellen Bild handelt, wird vom ersten und zweiten Spiegel 160, 162 an die zweite Strahlteilereinrichtung 156 geliefert. Der erste Strahl 153 wird durch den zweiten Strahlteiler 156 in einen zweiten Lichtstrahl 157 und einen dritten Lichtstrahl 159 geteilt, die ungefähr die selbe Intensität haben, und an sowie durch das erste monochromatische optische Filter 164 und das zweite monochromatische optische Filter 166 projiziert und übertragen werden.
Die offenbarte Vorrichtung ist besonders nützlich bei der Analyse von biologischen Zellstrukturen, obwohl sie nicht darauf beschränkt ist. Bei dieser Anwendungen in Zusammenhang mit biologischen Zellen können Zellen durch ein zusammengesetzten Lichtmikroskop betrachtet werden; jedoch lassen sich nur klare Konturen und minimale Anzahlen von Zellen und Zellbestandteilen erkennen. Die sichtbaren Zellbestandteile sind lediglich solche, die keine wesentliche Vergrößerung erfordern. Es hat sich daher gezeigt, daß Zellstrukturen durch ein oftmals als Anfärben bezeichnetes chemisches Verfahren für eine optische Betrachtung aufbereitet werden können. Die Anfärbung reagiert mit, verbindet sich mit oder haftet an einem spezifischen Zellbestandteil, wodurch der Bestandteil zur Betrachtung und Analyse hervorgehoben oder deutlich gemacht wird. Ein Feulgen-Anfärbeverfahren wurde zuvor beschrieben. Darüber hinaus wurden zuvor alternative Anfärbungen und Typen von Anfärbungen aufgeführt und kurz erörtert.
Es ist bekannt, daß Zellen Einzelzellstkturen sein können, jedoch weisen die meisten wenigstens zwei Zellbestandteile auf, beispielsweise Kern-DNA mit einem DNA-Kern und einem damit verbundenen Protein an einer Proteinstelle. Die Analyse und Untersuchung dieser Zellen und ihrer verschiedenen Bestandteile erfordern somit selektive Anfärbeverfahren zur Analyse, beispielsweise für pathologische Untersuchungen. In einigen Fällen ergeben die Anfärbeverfahren, wie zuvor in dieser Anmeldung erwähnt, Anfärbungs- oder Unterscheidungscharakterisierungen bestimmter Bestandteile von Zellen, das heißt, einen ersten Zellbestandteil, beispielsweise ein DNA-Kern, und einen zweiten Zellbestandteil, beispielsweise ein Protein an einer Proteinstelle. Dies sind lediglich Beispiele für Zellbestandteile, die angefärbt und identifiziert werden können. Unter den bekannten Proteinen befinden sich Rezeptoren, Enzyme, strukturelle Proteine, Glycoproteine und Lypoproteine. Andere potentielle Zellbestandteile sind unter anderem: Nukleinsäuren (z. B. RNA, mRNA, rRNA und DNA), Hormone (z.B., Steroide, Östrogen, Peptidhormone und Progesteron), und Lipide, die als Bestandteile der Zellmembran bekannt sind. Es sei darauf hingewiesen, daß diese nur als Beispiele für Zellbestandteile gelten sollen, die zum Anfärben und Identifizieren durch bestehende oder zukünftige Anfiirbeverfahren verfügbar sind. Zum betrachten und Identifizieren dieser verschiedenartigen Bestandteile und zum anschließenden Verwenden der gesammelten Informationen ist es jedoch zunächst erforderlich, diese auf identifizierbare Weise zu präsentieren. Es werden daher spezifische Färbeverfahren verwendet, um verbesserte optische Kontraste für Kombinationen der verschiedenen Bestandteile zu leifem, wobei jeder Bestandteil auf eine bestimmte Anfärbung oder ein bestimmtes Anfärbeverfahren reagiert. Die folgende Liste gibt Beispiele für Anfärbungskombinationen wider, die zur Lieferung kontrastierender überlappender Kurven mit graphischen Darstellungen der Durchlässigkeit als Funktion der Wellenlänge, wie in Fig. 8 dargestellt, geeignet sind, wobei das Maximum für wenigstens einen Auftrag adäquat von der zweiten Kurve der Analyse beabstandet ist.
Die zuvor genannten Anfärbungen und Anfärbeverfahren schaffen einen verbesserten Kontrast zwischen den verschiedenen zu identifizierenden Bestandteilen und weisen darüber hinaus optische Eigenschaften auf, denen mit monochromatischen optischen Filtern entsprochen oder die durch diese korrigiert werden können, um einen erkennbaren und identifizierbaren Zellbestandteil zu liefern. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel reagieren die ausgewählten Anfärbemittel mit zwei separaten Zellbestandteilen, um ein kontrastierendes Bild mit zwei unterschiedlichen begrenzten Wellenlängenbereichen oder spektralen Bandbreiten zu liefern. So wird der Bilderfassungsvorrichtung die Möglichkeit gegeben, jede bevorzugte Wellenlänge heraus zu trennen und dem Strahlteiler und den monochromatischen optischen Filtern die Bildsignale mit der geringsten Interferenz oder der schmalsten Bandbreite zur Auflösung der Signale in die ausgewählten oder gewünschten Wellenlängen zu liefern, um diese durch eine der Videokameras oder Sensoren analysieren zu lassen.
Zellen, die zum Hervorheben oder Charakterisieren eines einzelnen Zellbestandteils angefärbt wurden, stellen keine so anspruchsvolle analytische Aufgabe dar, wie eine nicht angefärbte Zelle, da der angefärbte Zellbestandteil im allgemeinen durch ein Mikroskop gut zu erkennen ist. Die für diese Analysen oder Erkennung verwendeten optischen Vorrichtungen oder Optiken sind bekannt. Es ist bekannt, daß eine angefärbte Zelle spezifische optische Eigenschaften, beispielsweise Durchlässigkeit, aufweist und daß sie insbesondere eine maximale Durchlässigkeit bei einer ersten Wellenlänge (die relative Transparenz impliziert) und eine minimale Durchlässigkeit bei einer zweiten unterschiedlichen Wellenlänge aufweisen kann. Falls lediglich eine einzelne Anfärbung verwendet wird, kann jeder der Zellbestandteile mit jeder Wellenlänge entlang ihrer Kurve mit einigem vertretbaren Aufwand analysiert werden. Werden jedoch gleichzeitig zwei Anfärbemittel in einer Zelle zum Anfärben oder Kombinieren mit bestimmten Zellbestandteilen verwendet, können ihre überlappenden Spektralemissionen einander stören. Infolgedessen kann aufwendiges Filtern zum Erkennen des spezifischen Parameters, der Eigenschaft oder des Zellbestandteils, die Gegenstand der Untersuchung sind, erforderlich sein. Es ist daher erwünscht, Anfärbemittel vorzusehen, die entgegengesetzte oder umgekehrte Transmissionseigenschaften bei ungefähr der gleichen Wellenlänge aufweisen, was unter idealen Umständen eine minimale Durchlässigkeit einer ersten Anfärbung bei der maximalen Durchlässigkeit der zweiten Anfärbung implizieren würde, wie in Fig. 8 bei ungefähr 500 Nanometer dargestellt. Die Übertragung eines schmalbandigen Strahls sichtbaren Lichts durch ein monochromatisches optisches Filter liefert im allgemeinen einen Lichtstrahl mit einer ungefähr festen Wellenlänge, die derart wählbar ist, daß sie dem genannten Maximum- Minimum-Punkt entspricht. Der Bildkontrast dieser beiden gegensätzlichen Anfärbungen würde einen leichter zu analysierenden Zellbestandteil ergeben, dessen Anfärbungscharakteristik die minimale Durchlässigkeit aufweist. In ähnlicher Weise würde das Übertragen des Lichtstrahls durch ein zweites optisches Filter (ungefähr 650 Nanometer im Beispiel von Fig. 9) eine andere Verteilung der Spektraldurchlässigkeitskurven bewirken.
Bei der Analyse von Zellen existieren verschiedene Abbildungsverfahren, das heißt unterschiedliche Gründe für die Zellanalyse, beispielsweise quantitative Immunoploidie-Untersuchungen (QIP), quantitative Kem-Antigenanalyse (QNA) und der Proliferationsindex. Bei einer Immunoploidie-Analyse wird beispielsweise eine Anfärbung des Typs 2 (Feulgen-DNA-Anfärbung) auf den Kern aufgebracht (s. Fig. 8), und ein Anfärbung des Typs 1, der Rot-Chromagen-Alkalische-Phosphatase-Variante, wird zum Verdeutlichen und Unterscheiden des Zytoplasmas aufgebracht. Nach dem Erfassen und Rekombinieren der separaten Bilder weist der Kern des Zytoplasmas bei 620 nm in Fig. 8 ungefahr 100% Durchlässigkeit auf und es ist im Prinzip eine Maske vorgesehen und die Kern-DNA ist zur Untersuchung optisch verbessert. In einigen Fällen erfolgt die Untersuchung durch Messungen der optischen Dichte, die zuvor erörtert wurden, für die Analyse der DNA-Masse. Alternativ ermöglicht die Trennung der Kurven bei ungefähr 500 nm eine Untersuchung der Proteinstellen des Zytoplasmas, die durch die größere Absorption der Rot-Chromagen-Anfärbung unterscheidbar sind.
Bei quantitativen Kern-Antigen-Messungen kann das Interesse an den Zellbestandteilen auf den Kern und insbesondere auf die Kernbestandteile beschränkt sein. Die Bestandteile können unspezifische Kernproteine und spezifische Proteine sein. Wie in Fig. 29 dargestellt, sind sämtliche nicht spezifischen Proteine oder sämtliche Kerne mit einem Anfärbemittel vom Typ 1 (Säure-Base-Reaktion) angefärbt, beispielsweise Ethylgrün, und die spezifischen Proteine oder Antigene sind mit einem Anfärbemittel vom dritten Typ angefärbt, beispielsweise Diaminobenziden (DAB). Die immunohistochemische Anfärbung (Typ drei) weist ein Antikörper-Anfärbemittel auf, das für ein Antigen einiger der Kerne, beispielsweise einen Östrogen-Rezeptor, einen Progesteron-Rezeptor oder ein Antigen proliferierender Zellen, spezifisch ist. Nach dem Aufbringen der Peroxidase, welche das Antigen färbt, wird durch die angefärbte Zelle transmittiertes Licht mit unterschiedlichen Raten absorbiert oder transmittiert, wie in Fig. 29 an den Bereichen 500 nm und 620 nm angegeben. Wie aus dieser Figur ersichtlich, weist der mit Ethylgrün angefärbte Nukleus im wesentlichen 100% Durchlässigkeit auf, und der DAB-angefärbte Kernbestandteil absorbiert einen hohen Prozentsatz des Lichts. Daher ist der DAB-angefärbte Bestandteil (der rote Kanal) erkennbar. Dieses Verfahren schafft eine Maske für die Kerne und die dunklen Objekte sind unterscheidbar. Im zweiten oder blauen Kanal wird die tatsächliche Intensität oder Anfärbungsdichte der Kembestandteile gemessen, das heißt, der Bereich der Maske, der immunohistochemisch angefärbt ist. Somit wird der rote Kanal unterschieden, da kein Ausgang von dem maskierten Bestandteil mit 100% Durchlässigkeit vorliegt. Frühere analytische Farbkameras verwendeten nicht zwei unterschiedliche Anfärbungen.
In Fig. 30 ist ein spezifischer Fall von angefärbten Bestandteilen dargestellt, bei dem jeder der angefärbten Bestandteile im wesentlichen 100% Durchlässigkeit bei den als Beispiel angeführten Wellenlängen von 500 nm und 620 nm aufweist, wodurch zwei Stellen für die Analyse und damit eine quantitative Analyse jedes Bestandteils gegeben sind.
Die vorgenannten Beispiele sind Verdeutlichungen und Beispiele für Verfahren zur Zellanalyse und insbesondere für die quantitative Analyse von Zellbestandteilen wahrheitsgetreuen Bestimmungen von Optik- und Massewerten. Das erste monochromatische Bild schafft ein Mittel für die quantitative Analyse wenigstens des ersten Bestandteils und das zweite monochromatische Bild ist von großem Wert bei der Identifizierung anderer Zellbestandteile.
Die vorliegende Erfindung schafft sowohl ein Verfahren, als auch eine Vorrichtung zum Korrelieren verschiedener Anfärbungspaare mit den erforderlichen monochromatischen optischen Filtern. Das Zwei-Farben-Kamerasystem wird hauptsächlich bei immunohistochemischen Anfärbeanwendungen verwendet. Dies sind sehr oft Zwei- Farben-Anfärbungen, d.h. der farbige Antigen/Antikörper/Anfärbemittel-Komplex gegen Zellen in Geweber::umen ohne Antigen und mit einer Gegen-Anfärbung. Da es oftmals erwünscht ist, entweder das gegengefärbte Material oder den Antigen/Antikörper-Komplex über eine Messung des Zellanfärbungsgehalts zu quantifizieren, ist es hilfreich, wenn wenigstens eine der Anfärbungsbestandteile keine spektrale Überlappung bei der Abtastwellenlänge eines der Bildsensoren aufweist. Vorzugsweise erfolgen Messungen bei ungefähr dem Transmissionsspitzenwert, vorzugsweise 100% Durchlässigkeit, da dies den größten Kontrast zu den umgebenden Lichtspektren und Zellbestandteilen in der Zellmatrix ergibt. Ferner ist das Spektrum des sichtbaren Lichts kein sehr breiter Bandbereich des gesamten Lichtspektrums und die Analyse von Zellen unter Verwendung einer zweiten Anfärbung kann Störungen der überlappenden Spektren bewirken, da diese Anfärbungen zumeist Breitbandspektren sind oder Breitbandspektrenausgänge haben. Darüber hinaus tragen Breitbandpaß-Spektralfilter von normalen Farbkameras oder Sensoren zum Glanzlichtproblem während der Analyse bei. Somit verringert das Schmalbandpaßfiltem ein inhärentes Problem früherer Strukturen. Ferner begünstigt die Verwendung einer normalen Farbkamera zum Betrachte mehrfach angefärbter Zellen ein inhärentes Problem bei der Ausgabe und dem Betrachten der Zellen, das heißt, eine Pixel-Pixel-Ausrichtung der getrennten Bilder kann nicht erfolgen, da die gleichen Bereiche nicht in jedem Pixel der drei (üblicherweise roten, grünen, blauen) Farbbilder einer Farbkamera projiziert werden. Infolgedessen werden die betrachteten Bilder während der Analyse nicht genau oder konsistent betrachtet, während die erfindungsgemäße Struktur eine Pixel-Pixel-Kalibrierung, -Ausrichtung und -Zellbetrachtung vorsieht.
Die erwahnte Bilderfassungsvorrichtung schafft ein Mittel zum Teilen der an jede der einzelnen Kameras übertragenen Lichtmenge durch die Verwendung eines Strahlteilers, der vorzugsweise ein dichroitischer Strahlteiler ist. Diese Dämpfüng des Lichts oder der Lichtübertragung kann mit einer bestimmten Wellenlänge erfolgen, da der Strahlteiler für ein Wellenlängenband, das entweder über oder unter der gewählten Wellenlänge liegt, durchlässig ist, wodurch dieses Lichtband durch den Teiler hindurch übertragen werden kann; er reflektiert den Lichtstrahl anderer Wellenlängen über oder unter der vorgewählten Wellenlänge und begrenzt somit die Bandbreite des an jeden der monochromatischen optischen Filter übertragenen Lichts. Egal ob der an den Strahlteiler übertragene Lichtstrahl einfach geteilt oder mit einer bestimmten Wellenlänge geteilt wird, die optischen Filter begrenzen selektiv das an die Kameras übertragene Licht auf einen spezifischen oder schmalen Wellenlängenbereich für die Analyse. Das Liefern eines schmalbandigen Lichtstrahls an die optischen Filter verbessert deren Effizienz, indem das aus dem gewünschten Lichtsignal femzuhaltende Hintergrundrauschen verringert wird.
Der zweite Strahlteiler 156 kann als Beispiel für einen dichroitischen Strahlteiler angeführt werden und kann beispielsweise die Übertragung särntlicher Lichtwellenlängen über 550 Nanometer durchlassen und sämtliche Wellenlängen unter 550 Nanometern reflektieren. Das Markieren einer Zelle, beispielsweise solcher Zellen, die von einem Patienten zur Krebsanalyse genommen wurden, durch Verwendung einer der zuvor genannten Anfärbungskombinationen bewirkt, daß das erste Anfärbemittel den Kern markiert und das zweite Anfärbemittel das zugehörige Protein an der Proteinstelle markiert. Einzelne Lichtstrahlen mit unterschiedlichen spezifischen Wellenlängen für die angefärbte Zelle werden entsprechend an die erste und die zweite Kamera geliefert. Somit wird jeder der einzelnen Bestandteile nach geeignetem optischen Filtern an einem, dem ersten oder dem zweiten Kanal analysiert, abhängig davon, ob das Licht eine an diese übertragene oder eine reflektierte Wellenlänge aufweist. Das elektronische Lichtsignal von der Kamera wird an das Computeranaylsesystem zur Umwandlung in ein digitales Signal, zum Speichern und zur Analyse des ersten und des zweiten Kanalsignals und/oder zum Kombinieren der beiden einzelnen Signale oder Figuren zur vergleichende Analyse in einer überlappenden Anordnung übetragen.
Das erfindungsgemäße analytische Zwei-Farben-Kamerasystem ist an die Anfärbungsspektren von leicht verfügbaren, gangigen Säure-Basis-Anfärbemitteln und immunohistochemischen Anfärbemitteln angepaßt. Die gewählten Spektralwellenlängen entsprechen wenigstens einem Bereich von 1 00%-iger Durchlässigkeit eines mit zwei Anfärbungen versehenen Bestandteils. Gleichzeitig verringern die Schmalbandpaßfilter das Glanzlicht. Dies ist für die Zwecke genauer densitometrischer Messungen der angefärbten Substanz wichtig. Die Abtastspektren üblicher Festzustands"Farb"-Kameras verwenden im Vergleich dazu drei Breitbandspektren (diese sind derart gewählt, daß sie des Farbsehrezeptoren des menschlichen Auges angepaßt sind). Sie überlappen sich mit den Breitband-Zellanfarbungsspektren bei zwei Bestandteilen, wie z. B. in den Fign. 8,29 und 30 dargestellt; die Breitbandpaßspektralfilter der Standard-Farbkameras tragen zum Glanzeffekt bei. Darüber hinaus erfolgt die Farbfilterung bei Standard- Farbkameras an getrennten Pixeln (unterschiedlichen Videozeilen) der Festzustands- Sensorchips. Somit stammen die Pixel in den dreifarbigen Bildern einer Farbkamera nicht aus den selben Bereichen.
Wie zuvor erwähnt, ist die einfache optische Verbesserung einer Zelle oder eines Zellbestandteus durch das Anfärben seit einiger Zeit bekannt; ferner ist bekannt, daß die verschiedenen Bestandteile einzelner Zellen auf verschiedene Anfiirbemittel und Anflrbeverfahren reagieren. Frühere Bemühungen zur Zellanalyse waren im allgemeinen auf eine einzelne Kameravorrichtung oder die komplexe Analyse von Breitbandspektren über das gesamte Spektrum des sichtbaren Lichts beschränkt. Die vorliegende Erfindung schafft einen relativen "Ausgleich" zwischen den verfügbaren Anfärbemittels, der Spektren des transmiffierten Lichts, den optischen Filtern und den Strahlteilern, die sämtlich zum Liefern gedämpfter oder leichter analysierbarer Signale zusammenwirken. Es ist somit ein vollständiges System geschaffen, das an das Reagens, die Kamera, den speziellen Analyse-Sofiwarevorgang sowie die mit dem Computernetzwerk einhergehende Hardware angepaßt ist. Die monochromatischen optischen Filter 164, 166 und der zweite Strahlteiler 156 sind zum Austausch durch alternative Filter und Strahlteiler lösbar, um eine einfachere Anpassung an die Wellenlängen für die Analyse spezifischer, durch geeignetes Anfärben und geeignete Spektren markierter Zellbestandteile zu erreichen. Es ist somit ersichtlich, daß das zuvor genannte Zwei- Farben-Anfärbesystem und das Dual-Farben-Sensorsystem, das ein Schmalbandpaßfiltersystem ist, zum Liefern eines Lichtstrahls dient, dessen optische Dichte gemessen wird und der mit bekannten Bedingungen für die quantitative und die qualitative Analyse korreliert wird.
Alle gegenwärtig für die Verwendung beim Anfärben verwendeten Chromogene sind Breitbandpaß-Chromogene und bieten nicht den Schmalbandpaß, der die Analyse, wenn nicht einfacher, so doch wenigstens besser verfügbar macht, weshalb die zum Abschirmen oder Filtern der überlappenden Lichtsignale erforderlich sind. Die Anfärbemittel sind unterscheidbare Markierungen, die derart gewählt sind, daß sie nicht miteinander reagieren, wenn zwei oder mehr Anfärbungen zum gleichzeitigen Anfärben der selben Zelle verwendet werden. Eines der mit der Verwendung von Kameras und elektronischen Geräten einhergehenden Probleme ist der erforderliche Aufwand zum Maximieren der Signalstärke bei der gemessenen Wellenlänge, um das elektrische Rauschen zu minimieren oder zu überwinden. Wird die elektronische Verstärkung für das einzelne elektronische Gerät verstärkt, in diesem Fall die Sensoren oder Kameras, steigt ebenfalls das Rauschverhältnis oder der Rauschpegel. Aus diesem Grunde ist die vorliegende Vorrichtung mit Videokameras versehen, die ein "White Clip" aufweisen, das bekanntermaßen den Pegel der Energie oder Stärke des Ausgangssignals minimiert. Infolgedessen wird die gesamte Lichtstärke und die entsprechende Reaktion durch das optische System an die Kameras der vorliegenden Erfindung übertragen.

Anfängliche Gerätekalibrierung

Vor der Verwendung als Analysegerat ist das Kalibrieren, Einstellen, Ausrichten und/oder Fokussieren der erfindungsgemäßen Zwei-Kamera-Vorrichtung erforderlich. Beim Ausrichtungsvorgang wird ein Kalibrierungs- oder Referenz-Objektträger mit einem Giffermuster auf der Auflage des Mikroskops angeordnet. Das Giffermuster kann die Form sich kreuzender schräger Schraffierungslinien aufweisen, die ungefähr 0,1 mm voneinander beabstandet sind und eine Matrix oder ein Muster aus kleinen Quadraten bilden. Anschließend wird das Fadenkreuz der Strichplatte des Mikroskops, das üblicherweise durch die Okularlinse sichtbar ist, auf die dicken Mittellimen des Gittermusters zentriert oder ausgerichtet, wodurch im allgemeinen das Zentrieren des Objekts im Mikroskop erfolgt. Das Mikroskop wird durch Einstellen der Mikroskopblende fokussiert, wobei sich das Mikroskop im Fokus befindet, zentriert ist und genau am Rand des Sichtfeldes positioniert ist.
Nach den genannten einleitenden Schritten wird das (nicht dargestellte) Okular des Mikroskops von der Vorrichtung 18 genommen. Die auf ihren Montagesockeln 436, 438 befindlichen Spiegel werden in den Ausnehmungen 422,424 gedreht. Der Spiegel 160 wird derart gedreht, daß er den optischen Strahl durch die Fokussierlinse 154 zurück zum oberen Ende der (nicht dargestellten) Objektivblende reflektiert. Das Drehen des Spiegeis 160 bewegt den reflektierten Strahl auf und ab entlang der Objektivblende. Das Einstellen der Schrauben 120 in den Gewindebohrungen 418 der den Strahlteiler 25 haltenden Befestigungseinrichtung führt zur Einsstellung der Position des Strahls zum Übertragen desselben durch die Mitte der Objektivlinse. Ein blockierendes Target oder eine Maske ist zwischen den transmittierten oder reflektierten zweiten oder dritten Lichtstrahl 157 und 159 vor den Kameras 168, 170 angeordnet, wobei die Strahlen 157 und 159 auf diese Target auftreffen. Der erste Spiegel 160 wird derart gedreht, daß er den Strahl zum zweiten Spiegel 162 reflektiert, welcher gleichermaßen derart gedreht wird, daß er den Strahl durch den zweiten Strahlteiler 156 zum dritten Spiegel 158 reflektiert. Anschließend werden die Spiegel 160 und 162 durch die Verriegelungsschrauben in ihren Positionen festgelegt.
Die Strahlen 157 und 159 sollten auf dem genannten Target oder der Maske erkennbar sein. Der erste Spiegel 160 sollte derart gedreht werden, daß der Strahl zur Kamera 170 ein voller Kreis und nicht entweder rechts oder links "beschnitten" ist. Ist der Strahl oben oder unten beschnitte, muß der erste Strahlteiler 25 durch Drehen der Schrauben 420 eingestellt werden, bis der Strahl zentriert ist. Anschließend sollte der erste Spiegel 160 verriegelt oder in seiner Position festgelegt werden. Die optischen Einrichtungen sollten während des Einstellvorgangs nicht mit den Fingern berührt werden. In ähnlicher Weise wird der zweite Speigel 162 gedreht, um ein nicht beschnittenes Bild an die Maske zu senden, und der erste Strahlteiler 25 wird zum korrekten zentrieren des dritten Strahls eingestellt. Anschließend wird auch der zweite Spiegel 162 mittels der Verriegelungsschrauben festgelegt.
Nunmehr kann das Target entfernt werden und das Gitterbild wird zum Zentrieren auf die Frontplatte 175 projiziert. Die Höhe oder die vertikale Ausrichtung des projizierten Bildes auf der Frontplatte 175 der zweiten Kamera 170 kann durch Drehen oder Einstellen der Verriegelungsschrauben 480, 482 und 484 des zweiten Strahlteilers 156 erfolgen. Die Einstellung des Gitterbildes auf der Frontplatte 175 in der horizontalen Ebene, daß heißt von links nach rechts, erfolgt durch das Drehen des zweiten Strahlteilers 156. Die Einstellschraube 192, die die Verriegelungsunterlegscheibe 488 sichert, wird gelöst, und das Drehen der Einstelischraube 493, die am Montagesockel 450 des Strahlteilers angreift, bewegt den Sockel 450 in der Ausnehmung 440. Nach der korrekten Ausrichtung kann die Befestigungsschraube 492 wieder angezogen werden, um die Unterlegscheibe 488 zu sichern. Das auf der Frontplatte 173 der ersten Kamera 168 befindliche Gitterbild, das im allgemeinen rot ist, kann durch Verstellen der Schrauben 501 und 503 auf der abgewandten Seite des dritten Spiegels 158 eingestellt werden. Die untere Schraube 503 bewegt das Bild nach links oder rechts über die Frontplatte 173, wahrend die obere Schraube 501 das Bild vertikal nach oben und unten verstellt und das Bild ferner geringfügig dreht. Somit dienen die Schrauben 501, 503 dem Zentrieren des Bildes auf der Frontplatte 173. Es sei darauf hingewiesen, daß ein Drehen des Bildes eine Wiederholung der vorherigen Einstellung des ersten Strahlteilers 25 und ein Korrigieren der Zentrierung des Gitterbildes auf der Frontplatte 175 der zweiten Kamera 170 erforderlich macht.
Wenn eine feinere Einstellung des Kopplers gewünscht ist, kann eine Einstellabdekkung auf der Vorrichtung angeordnet werden und, nachdem diese entfernt wurde, wird das Okular wieder an dem Koppler angebracht. Der Gitter-Objektträger wird in dem Okular fokussiert und zentriert. Der Zugang zu den vorderen und hinteren drehbaren Verriegelungsschrauben 604 und 582 der zweiten Kamera 170 ist über die Ausrichtungsabdeckung gegeben. Diese Schrauben werden gelöst und das Bild der zweiten Kamera 170 wird auf dem Monitor 37 angezeigt. Anschließend wird die zweite Kamera 170 gleitend entlang ihrer Achse 171 bewegt, bis das Monitorbild korrekt fokussiert ist. Danach werden die Verriegelungsschrauben 600 der ersten Kamera 168 gelöst und das Bild der ersten Kamera 168 wird auf dem Monitor 37 angezeigt. Die erste Kamera 168 wird in ähnlicher Weise gleitend entlang ihrer Längsachse 169 bewegt, um das Bild auf dem Monitor 37 zu fokussieren. Anschließend werden die Verriegelungsschrauben 600 angezogen, und die Kameras 168, 170 sind nunmehr in ihrem Fokus aneinander angeglichen. Das Bild der ersten Kamera 168 auf dem ersten Monitor 37 wird durch Einstellen der Schrauben 501 und 503 am dritten Spiegel 158 zentriert. Bei dieser Einstellung sollte die gleiche Zahl von Linien auf beiden Seiten (sowie von oben nach unten) der Mittellinien des Giffermusters vorhanden sein. Das Bild der zweiten Kamera 170 wird erneut auf dem Monitor 37 angezeigt und dieses Bild durch Drehen der Einstellschrauben 480, 482 und 484 des zweiten Strahlteilers 156 zur links-rechts Einstellung zentriert. Die vertikale Einstellung des Bildes der Kamera 170 wird erneut durch Lösen der Schraube 492 und Drehen der Einstellschraube 493 bewirkt, um den Sockel 450 in der Ausnehmung 440 vor dem erneuten Feststellen der Schraube 492 einzustellen. Das projizierte Gitterbild wird erneut auf korrekte Ausrichtung in der vertikalen und in der horizontalen Richtung geprüfi. Die Bilder von der ersten Kamera 168 und der zweiten Kamera 170 sind nunmehr auf den Monitor 37 projiziert und die Bilder sind derart ausgerichtet, daß nicht mehr als 1/4 einer Linienbreite des Gittermusters an Differenz zwischen den überlagerten Bildern besteht. Die vertikale und die horizontale Ausrichtung erfolgen durch die Einstellschrauben 501 und 503 des dritten Speigels 158, während die Dreheinstellungen durch das physische Drehen der zweiten Kamera 170 erfolgt. Die zweite Kamera 170 wird gedreht, bis die Gitterlinien beider Bilder parallel zueinander liegen, jedoch muß darauf geachtet werden, daß der Fokus der zweiten Kamera 170 nicht verändert wird. Sowohl die vordere, als auch die hintere Drehverriegelungsschraube 604, 582 werden anschließend gesichert, um die zweite Kamera 170 gegen weitere Drehung festzulegen. Der dritte Spiegel 158 ist nunmehr eingestellt, um eine vertikale und horizontale Ausrichtung des Gitters auf dem Monitor zu erreichen. Die Dreh- und die Vertikal-Horizontal-Ausrichtung müssen für eine korrekte Ausrichtung möglicherweise wiederholt werden. Der Gitter-Objektträger auf dem Mikroskop wird nunmehr zu einem klaren Bereich bewegt und die Mikroskopblende wird für einen korrekten Fokus, eine korrekte Größe und Zentrierung eingestellt. Die korrekte Lichtstärke wird durch Einstellen eine Anzeige von ungefähr 200 erreicht, welche eine Vergleichs-Grauskalenanzeige an der zweiten Kamera 170 ist, und die Verstärkungseinstellung 604 der ersten Kamera 168 wird so eingestellt, daß eine ähnliche Lichtanzeige von 200 erhalten wird. Die Geräteabdeckung 492 wird wieder angebracht und die Vorrichtung ist zum Betrieb vorbereitet und bereit.
Es ist gleichermaßen vorgesehen, daß die genannte Vorrichtung gleichermaßen auf eine mit einem fiuoreszenten Antikörper angefärbten Zelle anwendbar ist. Wenn beispielsweise infektiöse Substanzen wie Viren und Bakterien und andere antigene Materialien, die prinzipiell proteiner Natur sind, in Körpergewebe eindringen, werden lösliche Substanzen erzeugt, die spezifisch mit diesen Fremdmaterialien reagieren. Die löslichen Substanzen werden "Antikörper" genannt, und Materialien, die deren Produktion hervorrufen, werden als "Antigene" bezeichnet. Antikörper können mit fiuoreszenten Farbstoffen wie Fluorescin verbunden werden. Mit fluoreszierenden Farbstoffen markierte Antikörper werden als "fluoreszente Antikörper" bezeichnet, und dienen als immunospezifische Anfärbungen für die Erkennung von Antigenen in Zellen und Geweben. Die markierten Bereiche in einer Zelle sind als charakteristische Farbe zu sehen, wenn der Zellabschnitt mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht wird. Dieses Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie wurde für die Beispiele in der vorangegangenen Beschreibung verwendet. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung bei der Fluoreszenzmikroskopieanalyse mit bestimmten Wellenlängen verwendet werden kann. Ein geeignetes Anfarbemittel muß zum Markieren des Kerns und/oder des Proteins an einer ausgewählten Proteinstelle verwendet werden, wenn entweder das Fluoreszenz- oder das Transmissionsmikroskopieverfahren mit der erfindungsgemaßen Vorrichtung und dem erfindungsgemäßen System verwendet wird.

Claims

1. Verfahren zum Analysieren von Zellen mit wenigstens einer ersten Art von zellularen Bestandteilen und einer zweiten Art von zellularen Beständteilen, zum Durchführen einer Analyse der Zellen in einem Merkrnalsanalysator, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:

- chemisch-optisches Verbessern der Zellen mit einem ersten und einem zweiten Spektral-Anfärbematerial,

- wobei sowohl das erste als auch das zweite Spektral-Anfärbematerial sich mit einer, der ersten oder der zweiten Art von zellularen Bestandteilen zur Bildung einer ersten Art von Zellkombinationen und einer zweiten Art von Zellkombinationen kombiniert,

- wobei die erste Art von Zellkombinationen eine maximale optische Durchlässigkeit bei einer ersten vorbestimmten Wellenlänge und eine geringere optische Durchlässigkeit bei einer vorbestimmten zweiten Wellenlänge aufweist,

- wobei die zweite Art von Zellkombinationen eine erhebliche Lichtabsorption bei der ersten vorbestimmten Wellenlänge aufweist,

- Beleuchten eines Zellen-Sichtfelds,

- Übertragen eines optischen Bildes eines Bereichs, der wenigstens die erste und die zweite Art von Zellkombinationen umfaßt, und Übermitteln des Bildes an einen Strahlteiler,

- Teilen des Bildes in ein erstes Bild und ein zweites Bild,

- Filtern des ersten Bildes durch ein erstes Filter zum Liefern eines ersten im wesentlichen monochromatischen Bildes mit der ersten Wellenlänge,

- Filtern des zweiten Bildes durch ein zweites Filter zum Liefern eines zweiten im wesentlichen monochromatischen Bildes mit der zweiten Wellenlänge,

- Abtasten des gefilterten ersten monochromatischen Bildes durch eine erste Abtasteinrichtung, um ein erstes elektrisches Ausgangssignal zu liefern, das das erste monochromatische Bild repräsentiert,

- Abtasten des gefilterten zweiten monochromatischen Bildes durch eine zweite Abtasteinrichtung, um ein zweites elektrisches Ausgangssignal zu liefern, das das zweite monochromatische Bild repräsentiert,

- Bereitstellen der Analyse der Merkmale der Zellen an einem Merkmalsanalysator auf der Basis der elektrischen Ausgangssignale des ersten und des zweiten Abtastvorgangs,

- und Anzeigen des gefilterten ersten oder zweiten Bildes auf einem Bild-Monitor.

2. Verfahren zum Analysieren von Zellen nach Anspruch 1, bei dem die Analyse interaktiv unter Verwendung von Video-Monitoren erfolgt.

3. Verfahren zum Analysieren von Zellen nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Schritt des Teilens des Bildes in ein erstes und ein zweites Bild das Erzeugen des ersten und des zweiten Bildes mit verschiedenen Spektralwellenlängenbandbreiten umfaßt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, bei dem der Schritt des chemisch optischen Verbesserns der Zellen mit ersten und zweiten Materialien das Behandeln der Zellen mit einem monoklonalen Antikörper-Anfärbemittel umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, ferner mit den Schritten des separaten Verarbeitens der elektrischen Signale jeder der Abtasteinrichtungen, um Zellanalyseninformationen zu liefern, und des Kombinierens der Informationen von beiden Abtasteinrichtungen zum Liefern einer quantitativen Analyse der untersuchten Zellen.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, mit dem Schritt des Aussendens von Licht mit Wellenlängen zwischen 400-700 nm und unter Verwendung von Schmalbandfiltern von ungefähr 20 nm zum Filtern.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, bei dem das erste Filter im wesentlichen auf die erste Wellenlänge und das zweite Filter im wesentlichen auf die zweite Wellenlänge abgestimmt ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7 mit dem Schritt des Kombinierens eines fluoreszenten Spektral-Anfärbematerials mit einem ersten zellularen Bestandteil und des Verwendens eines Fluoreszenzmikroskops für die Analyse desselben.

9. Vorrichtung zum Analysieren von Zellen mit wenigstens einer ersten Art von zellularen Bestandteilen und einer zweiten Art von zellularen Bestandteilen, einem ersten Spektralmaterial und einem zweiten Spektralmaterial, wobei eine, die erste oder die zweite Art von zellularen Bestandteilen sich chemisch mit einem, dem ersten oder dem zweiten Spektralmaterial zur Bildung einer ersten Art von Zellkombinationen und der andere der ersten und zweiten zellularen Bestandteile sich chemisch mit dem anderen der ersten und zweiten Spektralmaterialien zur Bildung einer zweiten Art von Zellkombinationen kombiniert, wobei die erste Art von Zellkombinationen ungefähr die maximale optische Durchlässigkeit bei einer ersten vorbestimmten Wellenlänge und eine geringere optische Durchlässigkeit bei einer vorbestimmten zweiten Wellenlänge aufweist, wobei die zweite Art von Zellenkombinationen eine erhebliche Lichtabsorption bei der ersten vorbestimmten Wellenlänge aufweist,

wobei die Vorrichtung aufweist:

- eine Quelle (19) zum Projizieren von Licht auf die Zelle, und

- eine Einrichtung (13) zum Analysieren der Zellen,

- eine Einrichtung (16) zum Erzeugen und Vergrößern eines optischen Bilde eines Bereichs, der die erste und die zweite Art von Zellenkombinationen umfaßt, und zum Übermitteln des Bildes,

- eine Einrichtung (156) zum Teilen des übermittelten Bildes in ein erstes und ein zweites Bild,

- eine erste Filtereinrichtung (164) zum Filtern des ersten Bildes, um ein erstes im wesentlichen monochromatisches Bild mit der ersten Wellenlänge zu liefern,

- eine zweite Filtereinrichtung (166) zum Filtern des zweiten Bildes, um ein zweites im wesentlichen monochromatisches Bild mit der zweiten Wellenlänge zu liefern,

- eine erste Abtasteinrichtung (168) zum Abtasten des ersten monochromatischen Bildes und zum Liefern eines dieses repräsentierenden ersten elektrischen Ausgangssignals,

- eine zweite Abtasteinrichtung (170) zum Abtasten des zweiten monochromatischen Bildes und zum Liefern eines dieses repräsentierenden zweiten elektrischen Ausgangssignais,

- wobei die Einrichtung (13) zum Analysieren der Zellkombinationen, und damit der Zellen, zum Empfangen und Speichern der jeweiligen elektrischen Ausgangssignale der ersten und der zweiten Abtasteinrichtung betreibbar ist, um das erste und das zweite Bild zum Liefern einer Analyse aus diesen zu kombinieren und ein Ausgangssignal über wenigstens ein Zellmerkmal zu liefern, und

- und eine Einrichtung (37, 39) zum Anzeigen des ersten oder des zweiten Bildes.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß

- die Einrichtung (16) ein vergrößertes Bild wenigstens des ersten und des zweiten zellularen Bestandteils in einem Lichtstrahl mit kontinuierlichem Spektrum, der das vergrößerte Bestandteilbild enthält, und durch

- eine Einrichtung (18) zum Erfassen des vergrößerten Bildes,

- wobei die Bilderfassungseinrichtung (18) eine Einrichtung (160, 162) zum Reflektieren des das vergrößerte Bestandteilbild enthaltenden Lichtstrahls, eine Einrichtung (156) zum Teilen des das vergrößerte Bestandteilbild enthaltenden Lichtstrahls in wenigstens einen ersten und einen zweiten Lichtstrahl (157, 159), eine Einrichtung (164, 166) zum monochromatischen Filtern des ersten und des zweiten Lichtstrahls (157, 159), und einen ersten Sensor (168) und einen zweiten Sensor (170) aufweist, die monochromatische Lichtstrahlen empfangen und ein auf den monochromatischen Lichtstrahlen basierendes elektrisches Ausgangssignal liefern,

- wobei die Strahlteilereinrichtung (156) den das Bestandteilbild enthaltenden Lichtstrahl (153) empfängt und einen ersten Lichtstrahl (157) und einen zweiten Lichtstrahl (159) sendet,

- wobei der erste und der zweite Lichtstrahl (157, 159) über die Filtereinrichtungen (164, 166) an den ersten und den zweiten Sensor geleitet werden, wobei die Filtereinrichtungen optisch auf die ersten und die zweiten Zellenkombinationen und die vorbestimmte erste und zweite Wellenlänge abgestimmt sind, um den ersten Strahl (157) zu filtern und um dem ersten Sensor (168) einen ungefähr monochromatischen ersten Lichtstrahl mit ungefähr der ersten vorbestimmten Wellenlänge und dem zweiten Sensor (170) einen monochromatischen zweiten Lichtstrahl (159) mit ungefähr der anderen vorbestimmten Wellenlänge zu liefern,

- wobei der erste und der zweite Sensor (168, 170) jeweils ein elektronisches Signal liefert, das die monochromatischen Bilder angibt, und

- eine Einrichtung (13) zum Digitalisieren und Speichern eines elektrischen Signals für den ersten und den zweiten Lichtstrahl, wobei die Digitalisierungseinrichtung die elektrischen Ausgangssignale des ersten und des zweiten Sensors (168, 170) zum Digitalisieren, Kombinieren, Speichern und Projizieren des ersten und des zweiten Lichtstrahlsignals zur Ansicht und Analyse der Zelle empfängt.

11. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10 zum Analysieren von Zellen mit wenigstens einer nuklearen DNA mit einem Nukleus, der chemisch-optisch mittels einem ersten Spektral-Anfärbematerial verbessert ist, und wenigstens einem Protein mit zugehöriger Proteinstelle, das chemisch-optisch durch ein immunohisto-chemisches Spektral- Anfärbemittel verbessert ist,

- wobei der angefärbte Nukleus ungefähr die maximale optische Durchlässigkeit bei einer ersten vorbestimmten Wellenlänge und eine niedrigere optische Durchlässigkeit bei einer zweiten vorbestimmten Wellenlänge aufweist,

- wobei die angefärbten Proteine an den Proteinstellen eine erhebliche Lichtabsorption bei der ersten vorbestimmten Wellenlänge aufweisen,

dadurch gekennzeichnet, daß

- das Bild von der Vergrößerungseinrichtung mehrere Wellenlängen aufweist, die ein Breitbandspektrum aus dem Bereich des sichtbaren Lichts und des Infrarotlichts umfassen, und

- wobei die Strahlteilereinrichtung (156) den das vergrößerte Bild des Zellbestandteils enthaltenden Lichtstrahl empfängt and einen ersten Lichtstrahl unterhalb einer vorbestimmten Teilungswellenlänge und einen zweiten Lichtstrahl über der Teilungswellenlänge an den ersten bzw. den zweiten Sensor (168, 170) über die monochromatischen Filtereinrichtungen (164, 166) ausgibt, wobei die monochromatischen Filtereinrichtungen (164, 166) den ersten und den zweiten Lichtstrahl bei der ersten und der zweiten vorbestimmten Wellenlänge filtern, um dem Sensor (168, 170) einen monochromatischen ersten Lichtstrahl mit ungefähr der ersten vorbestimmten Wellenlänge und einen monochromatischen zweiten Lichtstrahl mit ungefähr der zweiten vorbestimmten Wellenlänge dem zweiten Sensor (168, 170) zuzuführen.