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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Projektionsabbildungssysteme
im Allgemeinen und auf Zellklassifizierung und genauer auf automatisierte
Systeme mit hohem Durchsatz, die Projektionsabbildung, wie beispielsweise
optische Durchflusstomographie (Flow Optical Tomography = FOT),
verwenden, um Krebs bei Individuen mit hohem Risiko basierend auf
hoch quantitativen Messungen von Molekularmarkerkompartimentierung
im Kern oder Cytoplasma, die mit Malignität und Krankheit verbunden ist,
zu detektieren.
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Hintergrund der Erfindung
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Die üblichste
Methode der Krebsdiagnose bei Patienten ist es, eine Probe des verdächtigen
Gewebes zu entnehmen und sie unter einem Mikroskop auf die Anwesenheit
von offensichtlich malignen Zellen zu untersuchen. Während dieser
Prozess relativ einfach ist, wenn der anatomische Ort des verdächtigen
Gewebes bekannt ist und vollständig
mit Stichproben erfasst werden kann (z. B. der Gebärmutterhals),
ist er nicht so einfach, wenn es keine(n) leicht identifizierbaren
Tumor oder Läsion
gibt und der bei der Probenentnahme zu berücksichtigende Bereich sehr
groß ist.
Zum Beispiel ist es bezüglich
der Detektion von Lungenkrebs nicht möglich, den gesamten Luftweg
der Lungen abzutupfen. Eine Probe, wie beispielsweise Sputum, muss
verwendet werden, da sie Zellen enthält, die von den Luftwegen in
den Lungen abgetragen wurden. Dies erzeugt ein Verdünnungsproblem,
weil ein früher
Lungenkrebs verglichen mit der gesamten inneren Oberfläche der
Lungen sehr klein ist, und als Resultat die Anzahl der Zellen, die
von dem Tumor ausgeschieden werden, verglichen mit derjenigen von
normalen Zellen ebenfalls sehr klein ist. Das Problem wird verschlimmert,
weil nur ein kleiner Anteil der Sputumprobe tatsächlich untersucht wird. So
erfordert die Detektion von Lungenkrebs mit traditioneller Sputumcytologie,
dass eine oder mehrere relativ seltene Krebszellen in dem Teil der
Probe vorliegt/vorliegen, der untersucht wird. Deshalb mögen Patienten
mit Lungenkrebs nicht ordnungsgemäß diagnostiziert werden, falls
die Probe den Zustand der Lunge nicht vollständig und genau widerspiegelt.
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Ein
Beispiel für
ein Mikroskop-basiertes System und Verfahren zum Detektieren von
Zellproben und Zellen mit Veränderungen,
die mit Malignitäten verbunden
sind, ist bei Palcic et al.,
US-Patent 6,026,174 offenbart.
Das System von Palcic et al. umfasst einen automatisierten Klassifizierer
mit einem konventionellen Mikroskop, einer Kamera, einem Bilddigitalisierer,
einem Computersystem zum Steuern und Vernetzen dieser Komponenten,
einem primären
Klassifizierer für
die anfängliche
Zellklassifizierung und einem sekundären Klassifizierer für die nachfolgende
Zellklassifizierung. Das Verfahren verwendet den automatisierten
Klassifizierer, um automatisch diagnostische Zellen und Zellen mit
mit Malignitäten
verbundenen Veränderungen
zu detektieren. Dieses Verfahren verbessert traditionelle Cytologie
durch Detektieren von Zellen, die mit Malignitäten verbundene Veränderungen
aufweisen, die viel häufiger
sind als Krebszellen. Jedoch ist die Qualität des diagnostischen Ergebnisses
durch die Verwendung eines konventionellen Mikroskops begrenzt,
das keine genaue Messung der Färbungsdichten
erlaubt. Weiterhin beschäftigt
sich das Verfahren von Palcic et al. weder mit der Verwendung von
spezifischen Molekularsonden noch mit der Kompartimentierung von
Molekularmarkern.
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Mit
dem Aufkommen von spezifischen Molekularsonden, wie beispielsweise
Antikörpern
und Nukleinsäuresonden,
können
neue mit Krankheiten verbundene Fragen angegangen werden, indem
diese Molekularsonden angehängt
werden und dann ihr Ort und ihre Konzentration innerhalb biologischer Zellen
und Gewebe gemessen werden. Die Verwendung von angehängten spezifischen
Molekularsonden ermöglicht
die indirekte Quantifizierung und Kompartimentierung von Molekularmarkern,
wie beispielsweise pRb, p53/p53-bindendes Protein 1 (53BP1), Sam68,
PTEN, E2F und 5-Methylcytosin-Guanin (Methyl-CpG), was informativ über Krankheitsprozesse,
wie beispielsweise Krebs, sein kann. (Siehe zum Beispiel Pasquale,
D., "Retinoblastoma Protein
Tethered to Promoter DNA Regresses TBP-Mediated Transcription", Journal of Cellular
Biochemistry, 70: 281–287,
1998, Rappold I, "Tumor Suppressor
p53 Binding Protein 1 (53BP1) Is Involved in DNA Damage-signaling
Pathways", The Journal
of Cell Biology, 153 (3): 613–620,
2001, Chen, T., "A
Role for the GSG Domain in Localizing Sam68 to Novel Nuclear Structures
in Cancer Cell Lines",
Molecular Biology of the Cell 10: 3015–3033, 1999, Perren, A., "Mutation and Expression
Analyses Reveal Differential Subcellular Compartmentalization of PTEN
in Endocrine Pancreatic Tumors Compared to Normal Islet Cells", American Journal
of Pathology, 157 (4): 1097–1103,
2000, Gil, R., "Subcellular
Compartmentalization of E2F Family Members Is Required for Maintenance
of the Postmitotic State in Terminally Differentiated Muscle", The Journal of
Cell Biology, 148 (6): 1187–1201,
2000, Rountree, M., "DNA
methylation, chromatin inheritance, and cancer", Oncogene, 20:3156:3165, 2001). Da
das Bedürfnis,
diese Sonden genauer zu lokalisieren und zu quantifizieren, auftritt,
gibt es ein gleichzeitiges Bedürfnis
nach verbesserten Techniken, Sondendichten mit Submikrometerauflösung in
zwei Dimensionen (2D) und drei Dimensionen (3D) zu messen. Konventionelle
Lichtmikroskopie, die Zellen montiert auf Glasprobenträgern verwendet,
kann wegen der Beschränkungen
bei der Tiefe der Fokalebene, den Abtastwinkeln und Problemen mit
der Zellpräparation, die
typischerweise dazu führen,
dass sich Zellen in der Bildebene überlagern, 2D-Dichtemessungen
nur annähern.
Ein anderer Nachteil von Lichtmikroskopie ist die inhärente Beschränkung des
Betrachtens durch eine Objektivlinse, wobei nur der Bereich innerhalb
der engen Fokalebene genaue Daten für die Analyse bereitstellt.
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Durchflusscytometrieverfahren überwinden das
Zellüberlappungsproblem
grundsätzlich,
indem die Zellen dazu gebracht werden, einzeln in einem Fluidstrom
zu fließen.
Unglücklicherweise
erzeugen Durchflusscytometriesysteme keine Zellbilder derselben
Qualität
wie traditionelle Lichtmikroskopie, und in jedem Fall sind die Bilder
nicht dreidimensional. Bezüglich
des Hintergrunds werden die Fachleute auf Shapiro, HM, Practical
Flow Cytrometry, 3. Aufl., Wiley-Liss,
1995 verwiesen.
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Konfokale
Mikroskopie bietet 3D-Abbildung von Proben, indem aufeinanderfolgende
dünne Schichten
der Probe abgebildet werden, um einen Stapel von 2D-Bildern zu erzeugen,
der dann in 3D betrachtet werden kann. Das Abbilden wird durch Führen eines
engen Lichtspots über
die Probe auf einem Glasprobenträger
bewirkt. Fluoreszenz- oder reflektiertes Licht wird durch eine Lochblende
auf einen Detektor fokussiert, was Licht außerhalb des Fokus daran hindert,
auf den Detektor zu treffen. So bestimmt die Größe der Lochblende die Auflösung in vertikaler
Richtung, und die Größe des Spots
bestimmt die Auflösung
in den horizontalen Richtungen. Unglücklicherweise ist konfokale
Mikroskopie eine sehr langsame Prozedur, weil das Bild durch Führen eines
kleinen Lichtspots in einem Raster über die Probe aufgebaut wird,
und die Probe erneut abgetastet werden muss, um jeden zusätzlichen
Schnitt zu erzeugen. Ein anderer Nachteil ist, dass die auf Probenträgern angeordneten
Zellen plattgedrückt
sind, was Verzerrungen bei den Zellstrukturen verursacht.
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Auf
dem Gebiet der computergestützten
Tomographie offenbart das
US-Patent
Nr. 5,402,460 , herausgegeben am 28. März 1995 für Johnson, et al. mit dem Titel "Three-dimensional
Microtomographic Analysis System" ein
Mikrotomographiesystem zum Erzeugen von hoch aufgelösten dreidimensionalen Bildern
einer Probe unter Verwendung eines Röntgenstrahlengenerators und
eines Röntgenstrahlendetektors,
der die Abschwächung
des Röntgenstrahls durch
die Probe misst. Zwei Projektionen, die jeweils einen Röntgenstrahl
unterschiedlicher Energie verwenden, werden von jeder Ansicht der
Probe mit dem Mikrotomographiesystem von Johnson, et al. erstellt.
Nachdem die beiden Projektionen einer Ansicht der Probe erstellt
sind, wird die Probe auf dem Probenhalter verdreht, und ein anderer
Satz von Projektionen wird erstellt. Die Projektionen von jeder Ansicht
der Probe werden zusammen analysiert, um einen quantitativen Hinweis
auf den Phasenanteil des Materials bereitzustellen, das die Probe
ausmacht. Die Projektionen der unterschiedlichen Ansichten werden
kombiniert, um ein dreidimensionales Bild der Probe bereit zu stellen.
Obwohl die Röntgentechnologie,
wie sie durch das
US-Patent Nr. 5,402,460 gelehrt
wird, für
einige Anwendungen nützlich
ist, stellt sie keine optische Lösung
bereit, die für
Durchflusscytometrie nützlich
wäre, so
dass man die 3D-Verteilung
der molekularen Dichte innerhalb einer biologischen Zelle messen
könnte.
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Die
WO-A-0 235 474 beschreibt
ein Verfahren zum Durchführen
eines Translokationstests, bei dem die Emission von zwei oder mehr
fluoreszent markierten Spezies gleichzeitig detektiert wird, die von
einer oder mehreren Beleuchtungswellenlängen angeregt wird. Die interessierende
Translokation ist diejenige einer oder mehrerer Spezies, wobei es
sich um Proteine, Lipide oder andere molekulare Komplexe oder subzelluläre Strukturen,
wie beispielsweise Vesikel, handeln kann, aus einem wohl definierten Bereich
einer Zelle zu einem anderen – Beispiele sind
unter anderem Transkriptionsfaktoren (NF-KB, NFAT, AP-1). In einer
Analyseroutine, um Translokationsbilddaten zu verarbeiten, ist der
markierte Ort der Zellkern, wobei die Markierung ein für DNS-spezifischer
Fluorophor ist, wie beispielsweise Hoechst 33342. Die zweite Spezies
ist ein Transkriptionsfaktor, dessen Migration aus dem Cytoplasma
zum Kern der Gegenstand des Tests ist. Dieses Protein kann durch
eine Vielzahl von Verfahren markiert werden, einschließlich Expression
als Fusion mit GFP, und Kontaktieren der Probe mit einem fluoreszent
markierten Antikörper
spezifisch für
das Transkriptionsfaktorprotein. Die Routine bestimmt die Menge
einer ersten fluoreszent markierten Spezies, die in einer korrelierten
oder antikorrelierten Weise bezüglich
einer zweiten fluoreszent markierten Spezies verteilt ist. In einer
Ausführungsform
wird die Analyse verwendet, um die Aktivität einer chemischen Verbindung
zu testen, und eine XY-Probentischabtastvorrichtung wird verwendet.
Das Verfahren führt
die Diagnose von pathologischen Zuständen von Zellzuständen, wie
beispielsweise Neuroblastomen, Nervenzellen, Blutzellen beispielsweise
in der Krebsforschung durch – die
fluoreszent markierten Spezies werden in zwei oder drei Dimensionen
lokalisiert.
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Um
die vorgenannten Beschränkungen
und andere, die bei solchen Systemen gefunden werden, zu überwinden,
ist es eine Motivation dieser Erfindung, die Einzelzellendarstellung
bei Durchflusscytometrie mit optischer Computertomographie auf der Basis
von Mehrpunktquellenprojektionen zu kombinieren, um die Dichteinformationen
innerhalb einer Zelle aus einer Mehrzahl von Projektionen zu rekonstruieren.
Die rekonstruierten Dichteinformationen ermöglichen die genaue Quantifizierung
von spezifisch markierten Markern und die Kompartimentierung solcher
Marker.
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Die
Dichteinformationen, auf die hier Bezug genommen wird, sind einmalig
für Projektionsabbildungssystem,
die nicht die Verwendung von Linsen und Fokalebenen mit ihren inhärenten unerwünschten
Unschärfeartefakten
aufgrund nicht fokussierter Strukturen außerhalb der schmalen Fokalebene
erfordern. Weil Projektionsabbildungssysteme keine Linsen und Fokalebenen
erfordern, sondern stattdessen Schattenbilder erzeugen, wobei alle
Strukturen gleichzeitig im scharfen Fokus sind, wird die Messung
von Dichtemerkmalen quantitativer und genauer als bei konventionellen
Mikroskopiesystemen. Darüber
hinaus ermöglicht
die 3D-Rekontruktion
aus den Projektionsbildern die Trennung von Merkmalen, die in einer
einzelnen 2D-Ansicht überlappen
mögen. Diese
Dichtemerkmale werden direkt den Orten und Mengen der Molekularsonden
zugeordnet, die verwendet worden, um die Zellen zu färben.
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Die
vorliegende Erfindung überwindet
Defizite des Stands der Technik, wo die Messung von subzellulärer und
subnuklearer Kompartimentierung von Molekularmarkern in der Diagnostik
nicht verwendet wurde, weil bislang kein wirksames Verfahren zur Durchführung dieser
Messungen existierte.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Detektieren von Zellen
bereit, wie es in den angehängten
Patentansprüchen
1 bis 21 definiert ist.
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Um
Molekularmarkerkompartimentierung zu bestimmen, wird eine Probe
genommen und in Suspension gefärbt
und dann durch die FOT abgebildet. Die gefärbte oder markierte Sonde ist
spezifisch für interessierende
Molekularmarker, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf pRb, p53/536P1, E2F, PTEN, SAM68 und Methyl-CpG. Die Molekularsonde kann
mit Chromophoren, Fluorochromen oder Enzymen markiert werden, die
Chromophore oder Fluorochrome erzeugen können. Das Computersystem analysiert
dann die Projektionsbilder direkt und/oder berechnet die 3D-Rekosntruktion,
die ebenfalls analysiert wird. Die Bilder werden hinsichtlich nicht gleichförmiger Beleuchtung
und anderen Unvollkommenheiten des Bildaufnahmesystems korrigiert. Nachdem
alle Bilder korrigiert sind, werden die Kanten, Oberflächen und
Volumen und Dichten des interessierenden Objekts berechnet, d. h.,
die Grenze, die bestimmt, welche Pixel oder Voxel (dreidimensionale
Pixel) zu dem Objekt oder der Struktur von Interesse gehören und
welche zu dem Hintergrund gehören.
Diese Objekte von Interesse umfassen Aggregate von markierten Sonden
und gefärbten
Zellstrukturen.
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Das
Computersystem berechnet dann einen Satz von 1D-, 2D- und 3D-Merkmalswerten
für jedes Objekt
der Struktur. Für
einige Merkmalsberechnungen wird die Grenze entlang des höchsten Gradientenwerts
durch entweder Ausdehnen oder Verkleinern der Kante (oder Oberfläche) um
einen oder mehrere Pixel (oder Voxel) korrigiert. Dies wird so gemacht,
dass jedes Merkmal eine größere Diskriminierungsstärke zwischen
Klassen von Objekten erreicht und dadurch objektspezifisch ist.
Diese Merkmalswerte werden dann durch einen Klassifizierer analysiert,
der die Merkmalswerte verwendet, um zu bestimmen, ob das Objekt
ein Artefakt oder ein Objekt oder eine Struktur von Interesse innerhalb
einer Zelle oder eines Kerns ist, die/der spezifisch gefärbt oder markiert
wurde. Wenn das Objekt ein Objekt oder eine Struktur von Interesse
zu sein scheint, dann werden die Merkmalswerte von dem Klassifizierer weiter
analysiert, um zu bestimmen, ob das Objekt von dem Typ und in einem
Zell- oder Kernkompartiment ist, der/das auf eine Krankheit hinweist.
Nachdem ein Objekt oder eine Struktur von Interesse identifiziert
worden ist, wird die Molekularsondendichte dem konkreten Objekt
zugeordnet, wodurch die Kompartimentierung der Sonde erhalten wird.
Basierend auf der Anzahl von Zellen, die in der Probe gefunden wurden
und die signifikante krankheitsbezogene Änderungen bei der Markerkompartimentierung aufzuweisen
scheinen, kann eine statistische Bestimmung durchgeführt werden,
ob der Patient, von dem die Zellprobe erhalten wurde, gesund ist,
oder ein malignes Wachstum beherbergt.
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In
anderen Ausführungsformen
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Detektieren von
Epithelzellen in einer Zellprobe und ein Verfahren zum Detektieren
von Zellen mit Molekularkompartimentierung bereit, die mit Krankheit
unter den Epithelialzellen korreliert ist. In einer anderen Ausführungsform
wird ein Verfahren zum Vorhersagen bereitgestellt, ob ein Patient
Krebs bekommen wird.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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1 zeigt
schematisch ein Beispiel eines Durchflusscytometriesystems, das
bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
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2 zeigt
schematisch ein Beispiel eines Durchflussprozesses für eine einzelne
Zelle, der bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden
kann.
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3A und 3B zeigen
schematisch ein Beispiel einer Zelle in einer Querschnittrekonstruktion,
wie sie zur Verwendung bei einer Ausführungsform des Verfahrens der
vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird.
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4 zeigt
schematisch ein Beispiel eines Rekonstruktionszylinders, wie er
zur Verwendung bei einer Ausführungsform
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird.
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5 zeigt
schematisch ein Beispiel eines optischen Durchflusstomographie-(FOT-)Systems, wie
es zur Verwendung bei einer Ausführungsform des
Verfahrens der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird.
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6 zeigt
schematisch ein Beispiel von Projektionsstrahlen innerhalb eines
Rekonstruktionszylinders, wie er zur Verwendung bei einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird.
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7 zeigt
schematisch ein Beispiel einer Ansicht von oben auf einen Rekonstruktionszylinder, wie
er zur Verwendung bei einer Ausführungsform des
Verfahrens der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird.
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8 zeigt
schematisch ein Beispiel der Geometrie einer Quellen-/Lineararraykonfiguration,
die bei einer Zellrekonstruktion verwendet wird, wie sie zur Verwendung
bei einer Ausführungsform
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird.
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9 zeigt
schematisch ein Beispiel eines Klassifizierungsmodells, das bei
der Analyse von Markerquantifizierung und -kompartimentierung aus Projektionsbildern
und tomographischer Rekonstruktion verwendet wird, wie es zur Verwendung
bei einer Ausführungsform
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird.
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10 zeigt
schematisch ein Beispiel des Prozesses der Kompartimentierung einer
Molekularsonde, wie er zur Verwendung bei einer Ausführungsform
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird.
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11 zeigt
schematisch Beispiele für
Kompartimente innerhalb einer Zelle.
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12 zeigt
schematisch ein Blockdiagramm eines Verfahrens zur Detektion von
Zellen mit Molekularmarkerkompartimentierung, die mit Malignität und/oder
Krankheit einschließlich
Krebs verbunden ist.
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Detaillierte Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
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Die
Erfindung wird hier bezüglich
konkreter Beispiele beschrieben, die sich auf biologische Zellen
beziehen; jedoch wird verstanden werden, dass diese Beispiele nur
dem Zweck des Illustrierens der Prinzipien der Erfindung dienen
und dass die Erfindung hierauf nicht beschränkt ist. In einem Beispiel erlaubt
das Konstruieren einer dreidimensionalen Verteilung von Punktdichten
und Emissionsintensitäten
innerhalb eines mikroskopischen Volumens die Messung von Dichte
und Fluoreszenz an jedem Ort innerhalb des subzellulären Volumens
und bestimmt den Ort von Strukturen oder Molekularmarkern, die mit
angehängten
Molekularsonden markiert worden sind. Durch Verwenden von angehängten Molekularsonden
kann die Quantität
von Sonden, die sich in dem mikroskopischen Objekt an bestimmte
Strukturen oder Molekularmarker anhängen, gemessen werden, was
eine Messung der Kompartimentierung des mit der Struktur verbundenen
Markers ergibt. Zu Zwecken der Illustration kann ein Objekt, wie
beispielsweise eine biologische Zelle, mit mindestens einer angehängten Molekularsonde,
wie beispielsweise Antikörpern,
spezifisch bindenden Proteinen, Lektinen oder Nukleinsäuresonden
markiert werden, und die gemessene Kompartimentierung dieser Sonden
kann wichtige Informationen über
den Krankheitszustand der Zelle ergeben, einschließlich aber nicht
beschränkt
auf verschiedene Krebsarten, wie beispielsweise Lungen-, Brust-,
Prostata-, Gebärmutterhals-,
Blasen- und Eierstockkrebs. Die Molekularsonde kann ein Antikörper gegen
pRb, p53, 53BP1, Sam68, PTEN, E2F oder Methyl-CpG sein.
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Biologische
Zellen, die in Suspension hergestellt und mit angehängten Molekularsonden
zur spezifischen Krankheitsdiagnose gefärbt oder markiert wurden, werden
dazu gebracht, durch eine Vorrichtung zu fließen oder zu wandern, die für das Aufnehmen
von Projektionsbildern sorgt und die Rekonstruktion von 2D- und
3D-Dichteinformationen aus optischen Projektionsstrahlengängen erlaubt,
die ungefähr
senkrecht zu dem Bewegungsvektor der Zelle verlaufen. Durch Steuern
der Geschwindigkeit der Zellbewegung längs einer Achse können die
senkrechten 2D-Rekonstruktionsebenen korrekt längs der Achse der Zelle angeordnet
(oder gestapelt) werden, um ein 3D-Bild der gesamten Zelle zu erzeugen,
oder ein 3D-Bild der Zelle kann direkt aus optischen 2D-Transmissions-
oder Emissionsprojektionen berechnet werden.
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Durchflusscytometrie
ist wegen der folgenden Eigenschaften hochgradig zur Bildrekonstruktion geeignet:
- • die
Zellen fließen
in einer einzigen Reihe durch das Kapillarröhrchen, so dass Zellüberlappung und
Verdeckung minimiert sind,
- • die
Geschwindigkeit der durch das Kapillarröhrchen fließenden Zellen kann direkt gemessen werden
und ist konstant,
- • die
Zellen neigen dazu, der Mittelachse des Kapillarröhrchens
zu folgen,
- • das
Analysieren von Zellen in Suspension minimiert Strukturverzerrungen.
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Die
vorliegende Erfindung nutzt die vorgenannten Merkmale zum Vorteil,
aber sie ist nicht auf diese Merkmale beschränkt, um ein System zur Punktquellenprojektionsabbildung
und tomographischen Bildrekonstruktion bereitzustellen.
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Bezug
nehmend jetzt auf 1 ist schematisch ein Beispiel
eines Durchflusscytometriesystems gezeigt, wie es zur Verwendung
bei einer Ausführungsform
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird.
Das System ist bezüglich
eines Koordinatensystems 11 mit Koordinaten in der x-,
y- und z-Richtung orientiert. Im Betrieb werden Zellen 1 unter
Verwendung einer bekannten Injektionseinrichtung 4 in ein
Injektionsrohr 3 injiziert, Das Kapillarröhrchen ist
an einem Injektionsende 5 weiter und umfasst eine Presskappe 6.
Ein umhüllendes
Fluid 7 wird an einem Rohr 8 eingeleitet, um eine Laminarströmung innerhalb
des Kapillarröhrchens 2 zu
erzeugen. Es ist charakteristisch für traditionelle Durchflusscytometrie,
dass sich die in Lösung
präparierten
und suspendierten Zellen 1 derart durch ein Kapillarröhrchen 2 bewegen
können,
dass sie sich leicht zur Durchflussachse strecken und sich ungefähr die Mittelachse
des Kapillarröhrchens 2 herunter bewegen,
wie sie durch die gestrichelte Linie 9 wiedergegeben wird.
Die Zellen können
vorteilhafter Weise dazu gebracht werden, mit axialer Symmetrie und
mit konstanter Geschwindigkeit 10 in einer einzelnen Reihe
längs der
Mittelachse eines zylindrischen Kapillarröhrchens zu fließen.
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Jetzt
Bezug nehmend auf 2 wird schematisch ein Beispiel
eines Durchflussprozesses für eine
einzelne Zelle gezeigt, wie er zur Verwendung bei einer Ausführungsform
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird.
Eine Zelle 1 bewegt sich mit einer konstanten Geschwindigkeit
(V), die durch einen Geschwindigkeitsvektor 10 angezeigt
wird, durch ein Kapillarröhrchen 2.
Die Zelle 1 weist eine Cytoplasmamembran 12 und
eine Kernmembran 13 auf. Während des Vorgangs des Fließens durch
das Kapillarröhrchen 2 tritt
die Zelle 1 durch eine Mehrzahl von Rekonstruktionsebenen hindurch,
die zu Illustrations zwecken als erste, zweite und dritte Rekonstruktionsebene 14a, 14b bzw. 14c wiedergegeben
sind. Ein erster ebener Schnitt 15a durch das Cytoplasma
liegt innerhalb der Rekonstruktionsebene 14a. In gleicher
Weise liegt ein zweiter ebener Schnitt 15b durch das Cytoplasma
und den Kern innerhalb der zweiten Rekonstruktionsebene 14b,
und ein dritter ebener Schnitt 15c liegt innerhalb der
dritten Rekonstruktionsebene 14c. Ein zentrales Merkmal
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist, dass eine Anzahl von optischen Punktquellen
von wählbarer
Wellenlänge
um das und konzentrisch zu dem Kapillarröhrchen angeordnet ist. Die
optischen Punktquellen arbeiten in Verbindung mit gegenüberliegenden
optischen Sensorarrays, die für
auswählbare
Anteile des Lichtspektrums empfindlich sind und somit die Aufnahme
von Projektionen des durch die Zelle transmittierten Lichts erlauben.
Die aufgenommenen Projektionsbilder werden dann direkt analysiert
oder unter Verwendung von tomographischen Bildrekonstruktionsalgorithmen
verarbeitet, um räumliche
Karten oder Bilder der Verteilung von Dichten und/oder Emissionsintensitäten innerhalb
der Zelle bereitzustellen. Es wird verstanden werden, dass die Anzahl
von Rekonstruktionsebenen in der Praxis zwischen einigen bis einigen hundert
oder mehr variieren kann, abhängig
von der benötigten
Bildauflösung
des Objekts, das dem System dargeboten wird. Die Gruppe von rekonstruierten parallelen
planaren Schnittebenen kann in Software kombiniert oder gestapelt
werden, um ein dreidimensionales (3D-)Bild der Dichten und Emissionsintensitäten innerhalb
der Zelle zu erzeugen. Zusätzlich können durch
Verwenden von planaren (2D-)anstelle von linearen (1D-)Lichtsensorarrays
und eines kegelförmigen
anstelle eines fächerförmigen Beleuchtungsstrahlenmusters
Projektionen einer Mehrzahl von zusammenhängenden ebenen Schnitten durch die
fließenden
Zellen gleichzeitig aufgenommen werden. Als Resultat können unter
Verwendung von Kegelstrahlrekonstruktionsalgorithmen dreidimensionale
(3D-)Bilder der Verteilung der Dichten und Emissionsintensitäten innerhalb
des Zellvolumens direkt aus den zweidimensionalen (2D-)Projektionen
berechnet werden. Alternativ können
die 2D-Punktquellenprojektionsbilder,
die unendliche Schärfentiefe aufweisen,
direkt analysiert werden.
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Im
Falle einer biologischen Zelle kann ein Abstand (d) zwischen den
Rekonstruktionsebenen wenige Mikrometer oder weniger betragen. Ein
Punkt innerhalb der Zelle 1 wird mit jeder Rekonstruktionsebene
in Zeitintervallen zusammenfallen, wobei die Zeitintervalle (t)
gemäß der folgenden
Relativbeziehung beschrieben werden können: t = d ÷ V (Gleichung 1)
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Bezug
nehmend jetzt gemeinsam auf die 3A und 3B ist
schematisch ein Beispiel eines Rekonstruktionsquerschnitts 16 gezeigt,
wie er zur Verwendung bei einer Ausführungsform des Verfahrens der
vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird. Rekonstruktion
von Punktdichten innerhalb einer Zelle aus optischen Projektionen
durch sie profitiert von der axialen Symmetrie und der Zentrierung der
strömenden
Zelle. Zusätzlich
kann der durch Projektionen abgetastete Raum als aus drei Hauptkompartimenten
bestehend modelliert werden:
- 1. dem Fluid außerhalb
der Zelle 17 (d. h. dem umhüllenden Fluid oder Zellsuspensionsmedium),
- 2. dem Zellcytoplasma 18 und
- 3. dem Zellkern 19.
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Die
quantitative Kenntnis der Verteilung der optischen Dichte oder der
Molekularsonden in diesen drei Kompartimenten kann ausreichend sein,
um verschiedene wichtige Probleme bei der Zellbiologie und der Krankheitsdiagnose
anzugehen. Zusätzlich
kann es nützlich
sein, zwei Grenzflächen
zu berechnen, einschließlich
der Cytoplasmamembran 12 und der Kernmembran 13,
wenn bestimmte Molekularsonden präferentiell an diese Oberflächen anbinden.
Andererseits kann es ausreichend sein, diese Membranen als die Übergangsoberflächen zwischen
den drei unterschiedlichen Kompartimenten zu charakterisieren.
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In
anderen Fällen
kann es vorteilhaft sein, Kompartimente innerhalb des Cytoplasmas
und des Kerns, wie beispielsweise den Golgi-Apparat bzw. den Nukleolus,
zu rekonstruieren und zu definieren und spezifische Molekularmarker
in diesen Kompartimenten zu lokalisieren.
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Durch
Kombinieren der rekonstruierten Schnitte der Zelle oder durch Rekonstruieren
in einer helikalen volumetrischen Weise können die 3D-Morphologie- und
Volumeninformationen erzeugt werden, aber die absoluten (im Gegensatz
zu den relativen) Volumina hängen
von genauen Informationen des Zellorts ab. Der Zellort ist eine
Funktion der Fließgeschwindigkeit.
Jedoch sind in einigen Fällen die
relativen Konzentrationen oder Dichten der Färbung oder der Molekularsonden
ausreichend, um die diagnostische Frage anzugehen: Wieviel Sonde
ist verglichen mit anderen Kompartimenten in einem bestimmten subzellulären oder
subnuklearen Kompartiment? Die unangemessene Kompartimentierung
bestimmter Molekularmarker, wie sie durch relative optische Dichten
der spezifischen Sonden in den verschiedenen Kompartimenten gemessen
wird, kann für
die Diagnose eines Krankheitszustands ausreichend sein. Die Zugehörigkeit
von angehängten
Sonden zu bestimmten subzellulären
Kompartimenten, Strukturen oder Organellen innerhalb des Cytoplasmas
oder Kerns wird durch räumliche
Auflösung
im Submikrometerbereich erleichtert.
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Bezug
nehmend jetzt auf 4 ist schematisch ein Beispiel
eines Rekonstruktionszylinders gezeigt, der das Durchflussröhrchen 2,
welches die strömenden
Zellen 1 enthält,
umgibt und wie er zur Verwendung bei einer Ausführungsform des Verfahrens der
vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird. Ein Rekonstruktionszylinder 20 umfasst
zum Beispiel eine Helix 24 von Punktquellen 21,
die mit einer bestimmten Helixsteigung mit einem Steigungswinkel θ angeordnet
sind. Jede Punktquelle 21 erzeugt einen Strahl aus Photonen 22,
wobei der Strahl aus Photonen typischerweise kegel- oder fächerförmig ist.
Während
die Anordnung der Quellen, die in dem Beispiel von 4 dargestellt
ist, helikal ist, kann das Array von Punktquellen eine große Vielzahl von
geometrischen Mustern annehmen, teilweise abhängig von der Geschwindigkeit
der Elektronik, der Zellgeschwindigkeit und der Geometrie, mit der
nicht überlappende
Projektionssignale an den Sensor (Detektor) erreicht werden. Sensorelemente 23 sind
angeordnet, um Licht von den Punktquellen zu empfangen.
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Die
festen optischen Punktquellen 21 in Verbindung mit gegenüberliegenden
Detektoren 23, die um einen Umfang des Rohr herum gelagert
sind, können
mehrere Projektionswinkel durch die gesamte Zelle 1 abtasten,
während
diese an den Quellen vorbeifließt.
Durch zeitliche Steuerung der Emission oder des Auslesens oder von
beiden wird jedes detektierte Signal mit einer bestimmten bekannten
Position längs
der Achse in der z-Richtung der strömenden Zelle zusammenfallen.
Auf diese Weise kann eine Zelle 1, die mit bekannter Geschwindigkeit
längs einer
bekannten Achse senkrecht zu einer Lichtquelle fließt, welche
dazu gebracht wird, in synchronisierter Weise zu emittieren oder
detektiert zu werden, optisch mit Projektionen durch die Zelle in
Schnitte zerlegt werden, die rekonstruiert werden können, um
einen 2D-Schnitt in der x-y-Ebene auszubilden. Durch Stapeln oder
mathematisch Kombinieren sequenzieller Schnitte wird ein 3D-Bild
der Zelle hervortreten. Es ist auch möglich, die Zellbewegung mit
der Positionierung der Lichtquelle (oder der Lichtquellen) um die
Durchflussachse zu kombinieren, um Daten zu erzeugen, die zum Beispiel
in einer helikalen Weise rekonstruiert werden können, um ein 3D-Bild der Zelle
zu erzeugen. Rekonstruktion kann entweder durch Stapeln zusammenhängender
ebener Bilder, die aus linearen (1D-)Projektionen unter Verwendung
von Fächerstrahlkonstruktionsalgorithmen
rekonstruiert wurden oder aus planaren (2D-)Projektionen direkt unter
Verwendung von Kegelstrahlkonstruktionsalgorithmen durchgeführt werden.
Das 3D-Bild der Zelle kann quantitative Messungen von subzellulären Strukturen
und die Kompartimentierung oder Lokalisierung und Menge von markierten
Molekularsonden ergeben, die diagnostische Informationen bereitstellen.
-
Wie
erwähnt
wurde, ist mehr als eine Projektion durch einen Zellschnitt erforderlich,
um die 2D- oder
3D-Dichtestruktur in dem Schnitt oder Volumen zu rekonstruieren.
In traditioneller schnittweiser medizinischer Röntgencomputertomographie werden mehrfache
Projektionen durch Stillhalten des humanen Patienten erstellt, während die
Röntgenquelle und
die gegenüberliegenden
Detektoren längs
eines Umfangs bewegt werden, um mehrere Projektionswinkel durch
den Patienten zu erzeugen. Analog bewegt das optische Durchflusstomographiesystem, das
bei einer Ausführungsform
des Verfahrens dieser Erfindung verwendet wird, die Zelle mit einer
vorgegebenen Geschwindigkeit (V) längs mehrerer Quellen, die unter
unterschiedlichen Winkeln längs
des Umfangs des Kapillarröhrchens
positioniert sind, um mehrere Projektionen durch die Zelle zu erzeugen, während sie
an den Punktquellen vorbeifließt.
Diese Punktquellen emittieren Photonen, die durch die Zelle hindurch
treten und durch ein Array von Sensoren gegenüber der Quelle detektiert werden.
Die Punktquellen können
vorteilhafter Weise längs
einer Helix 24 oder in anderen geeigneten geometrischen
Mustern am Umfang des Kapillarröhrchens
angeordnet sein, so dass jeder Punkt in der Zelle aus einer Mehrzahl
von Winkeln abgetastet wird, während
sie durch das Array von Punktquellen hindurch tritt. Zwecks guter
Abtastgeometrie können
die Punktquellen mindestens 180 Grad des Umfangs abdecken. Weniger Winkelabdeckung
(d. h. Winkelunterabtastung) kann praktikabel sein, während zusätzliche
radiale Abdeckung die Genauigkeit und das Signal-Rausch-Verhältnis der
berechneten Rekonstruktion verbessert. Abhängig von der Geometrie kann
es vorteilhaft sein, traditionelle analytische, iterative oder statistische
Algorithmen zur Kegelstrahl- oder Fächerstrahlenbildrekonstruktion
anzuwenden. (Siehe zum Beispiel Gilbert, P., "Iterative Methods for the Threedimensional
Reconstruction of an Object from Projections, "Journal of Theoretical Biology 36: 105–17, 1972, Oppenheim,
B. E., 'More Accurate
Algorithms for Iterative 3 dimensional Reconstruction, "IEEE Transactions
an Nuclear Science NS-21: 72–7,
1974, Singer, J. R., Grunbaum, F. A., Kohn, P. und Zubelli, J. P., "Image Reconstruction
of the Interior of Bodies that Diffuse Radiation", Science 248 (4958): 990–3, 1990, Mueller,
K. und Yage, R., "Rapid
3-D Cone-beam Reconstruction with the Simultaneous Algebraic Reconstruction
Technique (SART) Using 2-D Texture Mapping Hardware", IEEE Transactions
an Medical imaging 19 (12): 1227–37, 2001.) Verwandte Verfahren
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf ART (algebraische Rekonstruktionstechnik, wie bei Bellman, S.
H., Bender, R., Gordon, R. und Rowe, J. E., "ART is Science being A Defense of Algebraic
Reconstruction Techniques for Three-dimensional Electron Microscopy", Journal of Theoretical Biology
32: 205–16,
1971, diskutiert), SIRT (simultane iterative Rekonstruktionstechnik,
wie zum Beispiel von Gilbert, Id. Nr. 1493 diskutiert), ML-EM ("Maximum Likelihood
Expectation Maximization",
wie zum Beispiel von Manglos, S. H., Jaszcak, R. J. und Floyd, C.
E., "Maximum Likelihood
Reconstruction for Cone Beam SPECT: Development and Initial Tests", Physics in Medicine
and Biology 34 (12): 1947–57,
1989, Nr. 1382 diskutiert) und OSEM ("Ordered Subsets Expectation Maximization", wie zum Beispiel
bei Manglos, S. H., Gagne, G. M., Krol, A. Thomas, F. D und Narayanaswamy,
R., "Transmission
Maximum-likelihood Reconstruction with Ordered Subsets for Crone Beam
CT", Physics in
Medicine and Biology 40 (7): 1225–41, 1995, Nr. 4389 diskutiert).
-
VERFAHREN:
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Durchflusscytometer.
-
Bezug
nehmend jetzt auf 5 ist schematisch am Beispiel
eines optischen Durchflusstomographiesystems (FOT) gezeigt, wie
es zur Verwendung bei einer Ausführungsform
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird. Das
optische Durchflusstomographiesystem umfasst ein Durchflusscytometer
mit einem Rekonstruktionszylinder 20, der um das Kapillarröhrchen 2 herum
angeordnet ist. Eine Quelle für
Photonen 25 und ein Photonsensor 26 arbeiten mit
einem Pulshöhenanalysator 27 zusammen,
um als Triggereinrichtung zu dienen. Der Pulshöhenanalysator 27 arbeitet
gemäß bekannten
Prinzipien, um einen ersten Triggerpunkt 26 für den Anfang
einer Zelle und einen zweiten Triggerpunkt 29 für das Ende
der Zelle bereitzustellen. Der Pulshöhenanalysator 27 gibt
ein Triggersignal 30 entsprechend dem Anfang und Ende jeder
Zelle aus, wobei das Triggersignal von dem Rekonstruktionszylinder 20 empfangen
wird.
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Ein
Computer 40 ist angeschlossen, um Daten, Steuersignale
und Zeittaktsignale über
Signalleitungen 41–43 an
die Punktquellen 21, die Sensorelemente 23 und
den Pulshöhenanalysator 27 zu übertragen.
Der Computer kann einen bekannten Computer oder eine Mehrzahl von
Computern und ein Array von Prozessoren aufweisen, der/die zur Bildaufnahme-
und Bildrekonstruktionsverarbeitung geeignet ist/sind.
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Kommerzielle
Durchflusscytometer gibt es in drei Durchflussgrundkonfigurationen:
nämlich
das zylindrische Durchflussröhrchen,
das rechteckige Durchflussröhrchen
und das Strömung-in-Luft-System. (Siehe
Shapiro, H. M., Practical Flow Cytometry, 3. Aufl., Wiley-Liss,
1995.) Die bevorzugte Konfiguration ist das zylindrische Durchflussröhrchen,
weil es wichtig ist, eine optimale zylindrische Geometrie für den Rekonstruktionsalgorithmus
zu erhalten, um jegliche radiale Abhängigkeit aufgrund der Durchflusshardware
(siehe 1) zu minimieren. Darüber hinaus kann das zylindrische
Durchflussröhrchen gleichmäßig dünne Wandungen
relativ zu der Querschnittsfläche
des Kapillarröhrchens
aufweisen.
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Zusätzlich kann
die Triggereinrichtung stromauf des Rekonstruktionsmoduls angeordnet sein,
um ein Zeittaktsignal bereitzustellen, um die Datensammlung zu beginnen
und dann zu beenden, wenn die Zelle optimal eintritt und dann aus
dem Rekonstruktionszylinder austritt. Die Triggereinrichtung kann
vorteilhafter Weise eine Laserdiode, CCD, PMT, eine Photodetektorkombination,
ein Festkörperphotodetektor
und Kombinationen der vorgenannten Elemente umfassen. Die Triggereinrichtung
weist eine Schwellwertfestlegung auf, die die Anwesenheit einer
strömenden
Zelle erfass, und somit ein Triggersignal generiert, das in Verbindung
mit einer bekannten Zellgeschwindigkeit verwendet werden kann, um
zu berechnen, wann der stromab liegende Rekonstruktionszylinder
die Datensammlung für
die spezielle Zelle von Interesse beginnen kann. Weiterhin kann das
Zeitintervall zwischen dem ersten und zweiten Triggerpunkt entsprechend
dem Eintritt und dem Austritt der Zelle in den und aus dem Rekonstruktionszylinder
in gleiche oder ungleich Inkremente aufgeteilt werden, wobei jeweils
zusätzliche
Projektionsdaten durch Abtasten der Lichtquelle(n) 21 und
Auslesen des/der Sensor Array(s) 23 gewonnen werden können.
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Die
Durchflussgeschwindigkeit muss präzise gesteuert und gemessen
werden. Für
diese Fähigkeit wird
bei kommerziellen High-End-Systemen gesorgt, die Geschwindigkeiten
im Bereich von 1 Meter/s bis 10 Meter/s verwenden. Die beste Zellgeschwindigkeit
wird durch die Geschwindigkeit der Datensammlung und Signal-Rauschen-Betrachtungen
bestimmt, wie sie nachfolgend diskutiert werden.
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Das Rekonstruktionsmodul.
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Bezug
nehmend jetzt auf 6 ist ein Beispiel eines Fächerstrahlenprojektionsstrahls
innerhalb eines Rekonstruktionszylinders 20 gezeigt, wie er
zur Verwendung bei einer Ausführungsform
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird.
Der Zweck des Rekonstruktionszylinders ist es, ein Mittel zum Projizieren
von Licht aus einer Vielzahl von festen Punktquellen 21a–21c längs eines
kleinen Umfangs in das zylindrische Kapillarröhrchen bereitzustellen. Die
von den Punktquellen emittierten Photonen weisen eine bekannte Projektionsgeometrie
auf, wie beispielsweise eine Fächer- oder
Kegelform, und treten durch das Kapillarröhrchen hindurch, um fallweise
durch ein Array von Sensorelementen 23a, 23b oder 23c detektiert
zu werden, die längs
eines größeren Umfangs
gegenüber einer
entsprechenden Punktquelle angeordnet sind. Während gekrümmte lineare (1D-)Sensorarrays,
die für
eine Fächerstrahlendurchleuchtung
geeignet sind, zum Zwecke der Illustration dargestellt sind, ist zu
verstehen, dass geradlinige (1D-)Sensorarrays oder ebene (2D-)Sensorarrays,
die für
Kegelstrahlenbeleuchtung geeignet sind, in gleicher Weise verwendet
werden können.
Auf diese Weise kann ein Satz von Projektionsstrahlen erzeugt werden,
wobei die Projektionsstrahlen als die gerade Linie beschrieben werden
können,
die die Punktquelle mit einem einzelnen Sensorelement verbindet.
Der Unterschied zwischen der Anzahl an Photonen, die die Punktquelle
längs eines
bestimmten Projektionsstrahls, wie beispielsweise des Projektionsstrahls 31,
verlassen, und der Anzahl an Photonen, die an dem bestimmten Sensorelement
empfangen werden, wird zu der Anzahl an Photonen in Beziehung gesetzt,
die aufgrund von Wechselwirkungen mit der Zelle und zugehörigen angehängten Molekularsonden
und anderen Inhalten des Durchflussröhrchens längs des Projektionsstrahlengangs
verloren gehen oder gedämpft werden.
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Es
können
jedoch aufgrund von Lichtstreuung, Photonenenergieverschiebungen,
nicht perfekter Geometrie und schlechter Kollimation Komplikationen
auftreten und Photonen aus unterschiedlichen Quellen an einem bestimmten
Sensorelement ankommen, wenn mehrere Punktquellen gleichzeitig energetisiert
werden. Durch sorgfältige
Konstruktion des Rekonstruktionszylinders, zum Beispiel durch vernünftige Wahl
der Geometrie für
das Muster der Punktquellen und ihrer gegenüberliegenden Detektoren, wie
sie hier beschrieben wird, und durch geeignetes Zeittakten oder
Multiplexen der Aktivierung der mehreren Punktquellen und des Auslesens
des Sensorarrays kann die Photonenkontamination aufgrund dieser
Aspekte minimiert, aber nicht eliminiert werden.
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Die
Photonenkontamination kann bei der Kalibrierung des Systems zum
Beispiel ohne vorliegende Zellen berücksichtigt werden. Das heißt, jede Lichtquelle
kann abwechselnd eingeschaltet werden, und ihre Effekte auf jeden
der Sensoren können
gemessen werden, wodurch Offset-Daten zur Verwendung beim Normalisieren
des Systems bereitgestellt werden. Ein zusätzlicher Kalibrierungsschritt
kann zum Beispiel das Abbilden von Latexpolymerkügelchen oder anderen Mikrosphären oder
abgeflachte Sphäroiden
einbeziehen, deren optische Eigenschaften bekannt sind und die den
interessierenden Dichtebereich für
das Zellabbilden überspannen.
Photonen, die von fluoreszierenden Sonden emittiert werden, können von
solchen unterschieden werden, die an den Punktquellen austreten,
indem spektrale Bandpassfilter an den Detektoren verwendet werden, wie
nachfolgend diskutiert wird.
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Lichtquelle.
-
Jede
Quelle kann dieselben Grundeigenschaften aufweisen, vorzugsweise:
- • sie
kann angenähert
eine kleine kreisförmige Punktquelle
sein,
- • sie
kann bei bekannter spektraler Zusammensetzung hell sein,
- • die
von der Quelle emittierten Photonen können eine bekannte Geometrie
aufweisen, wie beispielsweise Kegelstrahl oder Fächerstrahl.
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Jede
Quelle erzeugt Daten für
einen Projektionswinkel. Eine Mehrzahl von Quellen, die längs einer
Helix angeordnet sind, deren Achse die Mittelachse des Durchflussröhrchens
ist, erzeugt Daten für mehrere
Projektionswinkel durch jede aufeinanderfolgende Ebene (oder jeden
Rekonstruktionsschnitt), wenn die Zelle durch das Modul strömt. Abhängig von
der Sensorgeometrie könnten
verschiedene Punktquellen co-linear an demselben Umfang angeordnet
werden, so dass sich die Projektionen an dem Sensor nicht überlappen.
Eine gute Abtastgeometrie kann durch äquidistantes Anordnen von Quellen längs einer
Helix von 180 Grad erreicht werden, obwohl weniger Winkelabdeckung
in einigen Fällen
tolerabel sein kann, und 360 Grad können verwendet werden, um das
Signal-Rausch-Verhältnis
zu verbessern. Die gewünschte
Anzahl an Quellen ist eine Funktion der benötigen Auflösung innerhalb jeder ebenen
Rekonstruktion (der x-y-Ebene) oder volumetrischen Rekonstruktion.
Während
eine helikale Anordnung von Punktquellen zur Illustration verwendet
wird, ist zu verstehen, dass eine Vielzahl von geometrischen Mustern
für das
Punktquellenarray verwendet werden kann. Weiterhin ist die Wellenlänge der
Quelle entweder durch Verwendung von verschiedenen Dioden- und anderen
Lasern oder durch Bandpassfiltern einer weißen oder anderen breitbandigen
Quelle, zum Beispiel einer Quecksilber- oder Xenonbogenlampe, wählbar.
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Bezug
nehmend jetzt auf 7 ist dort schematisch ein Beispiel
einer Ansicht von oben auf einen Rekonstruktionszylinder gezeigt,
wie er in 6 gezeigt ist und wie er zur
Verwendung bei einer Ausführungsform
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird.
Eine erste Punktquelle 21a und ein Sensorarray 23a sind
gezeigt, wobei eine Zelle mit einem Kern 19 senkrecht zu
der Zeichenebene in einer Projektion der Quellentrajektorie strömt, die
in zwei Dimensionen einen Rekonstruktionskreis 32 ausbildet,
bei dem alle Projektionen, obwohl sie in einer zeitlich gestuften
Weise aufgenommen wurden, als überlappend
dargestellt sind, und wobei die gesamte Zelle enthalten ist. Eine
zweite Punktquelle 21b und ein zweites Sensorarray 23b sind
ungefähr
30° um die
Helix herum angeordnet. Eine dritte Punktquelle 21c und
ein drittes Sensorarray 23c sind ungefähr 90° um die Helix herum angeordnet.
-
Die
Datensammlung wird synchron mit der Zellgeschwindigkeit innerhalb
eines "dicken" ebenen axialen Querschnitts
der Zelle gesteuert. Die gewünschte
Ebenendicke ist eine Funktion der benötigen Auflösung in z-Richtung. Typischerweise
wird die Auflösung
in der axialen Richtung (z-Richtung) kleiner sein als in der ebenen
transaxialen Richtung. Außerdem
kann der beste Rekonstruktionskreis durch das überlappende Schneiden der Projektionsfächer definiert
werden, die die Punktquellen an ihrer Spitze und die Breite der
Sensorarrays an ihrer Grundseite aufweisen. Es ist wünschenswert,
dass die Geometrie des Rekonstruktionszylinders sicherstellt, dass der
Querschnitt der strömenden
Zellen vollständig
in den Rekonstruktionskreis fällt.
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Es
gibt verschiedene Optionen, die angewandt werden können, um
optische Punktquellen zu erzeugen, wie beispielsweise:
- • eine
Lochblende vor einem Laser oder einer anderen Photonenquelle hoher
Intensität,
- • eine
optische Faser mit einem kleinen Querschnitt,
- • eine
Linse kurzer Brennweite vor einer Photonenquelle,
- • ein
Elektronenstrahl, der einen Punkt auf einer Phosphoroberfläche bestrahlt
(eine Form von CRT), und
- • verschiedene
Kombinationen der obigen.
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Die
Geometrie ist derart, dass je näher
die Punktquelle an dem interessierenden Objekt (der Zelle) liegt,
desto höher
die Vergrößerung aufgrund des
weiteren geometrischen Winkels ist, der von einem Objekt näher an der
Quelle abgedeckt wird. Umgekehrt kann, wenn die erforderliche Auflösung vor der
Auslegung des Systems bekannt ist, die Geometrie für diese
spezielle Auflösung
optimiert werden. Bezüglich
des Hintergrunds werden die Fachleute auf Blass, M., leitender Herausgeber,
Handbook of Optics: Fiber Optics and Nonlinear Optics, 2. Aufl., Bd.
IV, Mcgraw-Hill, 2001 hingewiesen.
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Bezug
nehmend jetzt auf 8 zeigt Fig. schematisch ein
Beispiel eines geraden linearen Arrays, das bei Zellrekonstruktion
verwendet wird, wie sie zur Verwendung bei einer Ausführungsform
des Verfahrens der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird.
Zum Beispiel diktiert Nyquist-Abtasten (d. h. Überabtasten um einen Faktor
von zwei), wenn ein Zellquerschnitt 12 und ein Kern 19,
die innerhalb eines Rekonstruktionskreises von 30 Mikrometer Durchmesser
enthalten sind, und eine gewünschte Auflösung von
0,5 Mikrometer angenommen werden, dass mindesten 120 Sensorelemente 33 für jede Punktquelle 21 erforderlich
sind. Die Punktquelle 21 an der Spitze und die Länge des
linearen Arrays 34 an der Grundseite formen ein Dreieck 35,
so dass die Beispielszelle von 30 Mikrometern Durchmesser in das
Dreieck 35 so dicht wie möglich an der Punktquelle 21 passt.
In diesem Beispiel kann, falls jedes Element des (beispielsweise
CCD-)Arrays 20 Mikrometer breit ist und die Arraylänge 2400
Mikrometer beträgt,
der Mittelpunkt der Zelle ungefähr
100 Mikrometer (halber Durchmesser des Kapillarröhrchens) von der Punktquelle
entfernt sein, wenn der Abstand zwischen der Punktquelle und dem
linearen Array 8 Millimeter beträgt,
wodurch eine 80-fache Vergrößerung bereitgestellt
wird.
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Als
zweites Beispiel betrachte einen Rekonstruktionskreis von 30 Mikrometer
Durchmesser und ein komplementäres
Metalloxidhalbleiter-(CMOS-)Sensorarray, in dem die Pixelelementgröße 4 Mikrometer
beträgt.
In diesem Fall kann das Array 120 Elemente auf einer Breite von
180 Mikrometern enthalten, und es kann 1,6 mm von der Punktquelle
entfernt sein, wenn der Abstand zwischen der Punktquelle und der
Zelle 100 Mikrometer beträgt,
was eine 16-fache Vergrößerung bereitstellt.
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Sensorelemente
-
Jede
Punktquelle sollte ein entsprechendes Array von Sensorelementen,
wie beispielsweise CCDs, in irgendeiner geradlinigen oder gekrümmten geometrischen
Anordnung gegenüber
der Punktquelle aufweisen, um Photonenstrahlen zu empfangen, die
durch den Rekonstruktionskreis transmittiert werden. Typischerweise
kann das lineare Array sein Array von Sensorelementen zentriert
auf der Linie zwischen der Punktquelle und der zentralen Fließachse aufweisen,
und senkrecht zu der Fließachse ausgerichtet
sein. Es ist möglich,
2D-Arrays zu verwenden, wobei nur ein Untersatz von jeder Linie
von Elementen innerhalb des 2D-Arrays für die Rekonstruktionseingabe
ausgelesen wird. In einem 2D-Array kann jeder aufeinanderfolgende
Untersatz von Elementen um eine geeignete Anzahl von Elementen versetzt
sein, um ordnungsgemäß auf jede
unterschiedliche Punktquelle längs
der helikalen Anordnung von Punktquellen ausgerichtet zu sein.
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Für eine schnittweise
Fächerstrahlenrekonstruktion
unter Verwendung des Beispiels des Rekonstruktionskreises von 30
Mikrometern mit 120 Sensorelementen pro Fächer, um eine Auflösung von
0,5 Mikrometern zu erhalten, ist ein 2D-Array mit 2000 × 2000 20
Mikrometer Elementen ausreichend, um 136 Punktquellen zu erfassen,
die in Inkrementen von 1 Grad in radialer Richtung angeordnet sind,
wobei der mittlere Versatz zwischen aufeinanderfolgenden Ansichten
300 Mikrometer beträgt,
wobei dies äquivalent
zu 15 Sensorelementen ist. (In der Mitte des Arrays kann der Versatz
140 Mikrometer oder 7 Elemente betragen, während eine Verschiebung von
1 Grad in radialer Richtung zwischen den Ansichten an den Kanten
des Arrays einen wesentlich größeren Versatz
bedeuten kann.) Wenn eine Gruppe von 15 Reihen des Sensorarrays
gemittelt würde,
um die Projektionsdaten für
einen Schnitt bereitzustellen, könnte
die z-Auflösung
innerhalb des Zellbildes 3,75 Mikrometer betragen, während dann,
wenn für
jede Projektion 2 Reihen gemittelt werden, die axiale Auflösung im
Objektraum 0,5 Mikrometer betragen kann, was zu der transaxialen
Auflösung äquivalent
ist.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
zur Verwendung bei dem Verfahren der Erfindung ist das 2D-Array
längs eines
zylindrischen Umfangs gekrümmt,
der konzentrisch zu dem Rekonstruktionszylinder liegen kann, so
dass die Strahlengänge
alle von gleicher Länge
sind. Für
den Fall eines Rekonstruktionskreise von 30 Mikrometern kann ein
gekrümmtes
2D-Array, das nur die Elemente aufweist, die erforderlich sind,
um einem helikalen Ort von Punktquellen gegenüberzuliegen, ein helikaler
Streifen sein, der für
das oben beschriebene Beispiel 120 Elemente breit mal ein Mehrfaches
von 136 Elementen hoch (lang) ist.
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Obwohl
ebene oder "dicke" Fächerbeleuchtung
zum Zwecke der Illustration oben beschrieben wird, ist es zu verstehen,
dass wahre unkollimierte Kegelstrahlenbeleuchtung in Verbindung
mit planaren 2D-Detektoren verwendet werden kann, die unter Verwendung
von Kegelstrahlenalgorithmen für
eine 3D-Rekonstruktion sorgt. Die 2D-Projektionsbilder können direkt
analysiert werden, um zum Beispiel Informationen über den
Krankheitsstatus oder den Transformationsstatus der Zelle zu erhalten.
Für eine direkte
volumetrische Kegelstrahlenrekonstruktion wird die Beleuchtung von
einer Mehrzahl von Punktquellen in solcher Weise gemultiplext, dass
bei der gegebenen geometrischen Anordnung der Punktquellen und Detektoren
die Beleuchtungskegel von den unterschiedlichen Punktquellen auf
dem Sensorarray nicht überlappen.
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Darüber hinaus
könnte
dann, wenn die Zellen mit einer Geschwindigkeit von 1 Meter/s (oder 1.000.000
Mikrometer/s) strömten
und jedes Element in dem 2D-Array 20 Mikrometer breit wäre, eine
Linienauslesung alle 20 Mikrosekunden schnell Daten innerhalb eines
0,25- Mikrometerschnitts
der Zelle aufnehmen. Für
den Fall, dass 15 Sensorreihen gemittelt werden, um die Daten für einen
3,75-Mikrometerschnitt bereitzustellen, würden die Auslesungen alle 300
Mikrosekunden zu erfolgen haben. Durch Verwendung eines größeren 2D-Arrays
wird eine signifikante Verbesserung bei der Rekonstruktionsbildqualität erreicht.
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Eine
Ausführungsform
zur Verwendung bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, die
zum multispektralen Abbilden einer Anzahl von transmittierten oder
emittierten Wellenlängenbänder besonders
geeignet ist, kann vorteilhafter Weise zwei oder mehr Rekonstruktionsmodule
umfassen, die in Reihe angeordnet sind. Solche mehrfachen Rekonstruktionszylinder
können
durch dazwischen liegende Abschnitte des Kapillarröhrchens
getrennt sein, und jedes Modul stellt Projektionsdaten zur Verfügung, die zum
Produzieren eines vollständigen
rekonstruierten Bilds des durchfließenden Objekts geeignet sind.
Die Punktquellen und/oder Sensorarrays für jedes der verschiedenen Rekonstruktionsmodule
können
für ein
bestimmtes spektrales Band optimiert sein. Zum Beispiel kann ein
erstes Rekonstruktionsmodul intensive weiße Beleuchtung und ungefilterte
Detektion anwenden, um einen vollständigen Projektionsdatensatz
bereitzustellen, um eine Karte der optischen Objektdichte, der Absorptions-
oder Streukoeffizienten zu rekonstruieren, während ein zweites Rekonstruktionsmodul
Beleuchtung, wie beispielsweise einen Argonionenlaser (488 nm) in
einem schmalen spektralen Band zentriert um 495 nm verwenden kann, um
eine fluoreszente Sonde anzuregen, die Proteine für eine Immunfluoreszenzstudie
markiert, mit gefilterten Sensorarrays, die für die 520 nm Emission empfindlich
sind, um einen zweiten vollständigen Projektionsdatensatz
bereitzustellen, der ausreichend ist, um unter Verwendung von Emissionsrekonstruktionsalgorithmen
die Konzentrationsverteilung der markierten Proteine zu kartieren,
wie sie nachfolgend beschrieben werden. Noch ein drittes Rekonstruktionsmodul
kann schmalbandige Beleuchtung zentriert um 535 und/oder 342 nm
verwenden, um Propidiumiodid anzuregen, das stöchiometrisch an DNS gebunden
ist, und gefilterte Sensorarrays, um die roten (617 nm) Emissionen
für Ploidiestudien
optimal zu detektieren. Es wird verstanden werden, dass die vorgenannten
Beispiele illustrativen Zwecken dienen, und dass das Verfahren allgemein auf
jegliche Wellenlängenkombinationen
zum Beleuchten und Abtasten zutrifft.
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Bildrekonstruktion.
-
Die üblichsten
und einfach umzusetzenden Rekonstruktionsalgorithmen, die als gefilterte
Rückprojektionsverfahren
bekannt sind, werden von einem ähnlichen
Modell bei Röntgencomputertomographie
(CT) unter Verwendung von Kegelstrahlen- und Fächerstrahlengeometrie abgeleitet.
(Siehe die folgenden Quellen, zum Beispiel Kak, A. C. und Slaney,
M., Principles of Computerized Tomographic Imaging, IEEE Press,
New York, 1988, und Herman, G., Image Reconstruction from Projections:
The Fundamentals of Computerized Tomogaphy, Academic Press, New
York, 1980.) Diese Verfahren basieren auf Theoremen für die Radon-Transformationen
mit Modifikationen, die die besondere Geometrie der Quellen-/Detektorkonfiguration
und die Strahlengänge
bei dem beleuchtenden Strahl widerspiegeln. Im Fall von klinischer
Röntgen-CT
wird das humane Subjekt jedoch für
die schnittweise Aufnahme stillgehalten, während sich die Röntgenquelle
und die Detektorarrays längs
eines Bogens um den Patienten herum bewegen können, um die Daten aus mehreren Projektionswinkeln
innerhalb eines gegebenen Schnitts zu sammeln. Dann wird das humane
Subjekt längs
der z-Achse neue
positioniert, und ein anderer Datenschnitt wird aufgenommen, und
so weiter. Alternativ wird bei der moderneren klinischen helikalen CT
der Patient kontinuierlich in der z-Richtung verschoben, während die
Quellen-/Detektoranordnung kontinuierlich rotiert, um helikale Projektionsdaten bereitzustellen,
die dann interpoliert werden, um Projektionen orthogonal zu der
z-Achse des Patienten bereitzustellen. Bei optischer Durchflusstomographie wird
das Subjekt (eine Zelle) mit konstanter Geschwindigkeit relativ
zu den stationären
Quellen und Detektorarrays bewegt, wobei die Mehrzahl von Quellen-/Detektorsystemen
Daten synchron zu bestimmten gesteuerten Zeitpunkten längs des
Zellgeschwindigkeitsvektors in einer Weise aufnimmt, die mehrfache
Projektionswinkeldaten innerhalb eines gegebenen Schnitts oder Volumen
erzeugt. Für
ein schnittweises Abtasten wird der Rekonstruktionsalgorithmus ein
2D-Bild einer Ebene senkrecht zu der Bewegungsachse berechnen, und
das serielle Stapeln der mehrfachen Schnitte wird das 3D-Bild des Subjekts
erzeugen, wobei Kontrast eine Funktion der Variationen bei dem Röntgendämpfungskoeffizienten oder
der optischen Dichte innerhalb des Subjekts für CT beziehungsweise optische
Durchflusstomographie ist. Für
das volumetrische Kegelstrahlenabtasten berechnet der Rekonstruktionsalgorithmus
ein 3D-Bild eines Volumens innerhalb der Zelle oder eines anderen
Objekts direkt aus den ebenen optischen Transmissions- oder Emissionsprojektionen, wobei
der Kontrast jeweils eine Funktion der optischen Dichte und/oder
der Dichteverteilung der angehängten
fluoreszenten Sonde in dem abgebildeten Objekt ist.
-
Es
mag sowohl für
die Transmissionsdaten, um die Zelldichterekonstruktion zu produzieren,
als auch für
die Emissionsdaten, um die Verteilung der angehängten fluoreszenten Sonde zu
rekonstruieren, oder für
beide wünschenswert
sein, andere Bildrekonstruktionsalgorithmen als gefilterte Rückprojektion
zu verwenden. Die als iterative Rekonstruktionsalgorithmen bekannte Grundklasse
ist in einigen Fällen
wirksamer, insbesondere für
Emissionstomographie oder wenn es wie in dem Fall des Verfahrens
der vorliegenden Erfindung, wo die axiale Symmetrie und die dreifache
kompartimentierte Natur des Objekts bekannt sind, möglich ist,
eine a priori-Information
in den Rekonstruktionsalgorithmus einzubauen, um die Qualität der Rekonstruktion
zu verbessern (Siehe zum Beispiel Gilbert, P., "Iterative Methods for the Three-dimensional
Reconstruction of an Object from Projections", Journal of Theoretical Biology 36: 105–17, 1972
und andere Literaturquellen, die oben angemerkt wurden).
-
In
gleicher Weise kann ein Verfahren vorteilhafter Weise statistische
Rekonstruktionsalgorithmen verwenden, die auf finite Elemente-Modellen (FEM)
basieren. FEM-Algorithmen werden von linearer Transporttheorie abgeleitet,
wobei die Photonendiffusions-/Migrationsgleichung
an allen Grenzen des Elements aufgelöst wird, um eine zwei- oder
dreidimensionale Karte von einigen Kombinationen der Absorptions-,
Streu-, Brechungsindex- und
Anisotropiefaktoreigenschaften des abgebildeten Objekts zu erstellen.
Beispiele für
solche Verfahren werden gelehrt bei Paulsen, K. D. und Jiang, H., "Spatially Varying
Optical Property Reconstruction Using a Finite Element Diffusion
Equation Approximation",
Medical Physics 22 (691–701)
1995, Hampel, U. und Freyer, R., "Fast Image Reconstruction for Optical
Absorption Tomography in Media with Radially Symmetric Boundaries", Medical Physics
25 (1): 92–101,
1998 und Jiang, H., Paulsen, K. D. und Osterberg, U. L., "Frequency-domain
Nearinfrared Photo Diffusion Imaging: Initial Evaluation in Multitarget
Tissuelike Phantoms",
Medical Physics 25 (2): 183–93,
1998.
-
Chromatische Trennung.
-
Wenn
eine polychromatische Punktquelle verwendet wird (z. B. weißes Licht),
dann können
unterschiedliche chromatische Farbstoffe (z. B. Chromophore) verwendet
werden, um eine Anzahl von Molekularsonden und Strukturmerkmalen
innerhalb einer gegebenen Zelle zu unterscheiden. Hierbei trennen
serielle Bandpassfilter an der Quelle oder dem Sensorarray (oder
beidem) die Wellenlängendaten
und erlauben die Rekonstruktion und die räumliche Lokalisierung der individuell
gefärbten
Moleküle, Ein
robusteres Verfahren zum Abbilden mehrerer Sonden umfasst eine intensive
weiße
Lichtquelle und die simultane Sammlung von mehrfach gefilterten Bandbreiten
in den Sensorarrays, womit es den Bildrekonstruktionsalgorithmen
erlaubt wird, räumliche
Bildschnitte für
jeden Chromophor zu berechnen. Diese können als farbige Bilder dargestellt
werden.
-
Fluoreszenz-, Phosphoreszenz-, Chemilumineszenz-
und Nanopartikelemission
-
Als
spezieller Fall des optischen Durchflusstomographiesystems können bestimmte
Molekularsonden mit einem "Reporter" ausgezeichnet werden, der
Licht einer unterschiedlichen (längeren)
Wellenlänge
emittiert, wenn er durch die primäre Photonenquelle stimuliert
wird. Diese sekundäre
Emission von dem Reporter kann mit optischen Standardfiltern gefiltert
werden, um die Photonen der primären
Quelle von den sekundären
Emissionsphotonen zu trennen. Der Rekonstruktionsalgorithmus für sekundäre Emissionsphotonenbilder
ist jedoch weiter verkompliziert, weil die sekundären Photonen
nicht notwendigerweise in einem direkten Strahlengang von der Punktquelle
auftreten. Falls angenommen wird, dass die sekundären Photonen
von der sekundären
Punktquelle in einem gleichmäßigen sphärischen
Muster abgestrahlt werden, dann wird die Intensität der sekundären Photonen,
die eines der Sensorelemente erreichen, eine einfache Funktion des
Abstands zu dem Sensorelement sein. Eine weitere Verfeinerung kann
der nichtsphärischen
Verteilung von Photonen von der sekundären Quelle Rechnung tragen,
indem ein Modell der räumlichen
Verteilung der sekundären Photonen
relativ zu der Punktquelle und innerhalb des Rekonstruktionsschnitts
bereitgestellt wird. Jedes Verfahren wird ein Mittel bereitstellen,
um den Ort der sekundären
Quelle in dem Rekonstruktionsschnitt oder -volumen zu berechnen.
Kollimation zwischen dem abgebildeten Objekt und dem Detektorarray/den
Detektorarrays wird die Bildrekonstruktion verbessern.
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Wenn
die primären
Photonenintensitäten und
die sekundären
Photonenintensitäten
gleichzeitig durch optische Filtration gemessen werden, kann die
hoch auflösende
Dichterekonstruktion von den primären Photonenintensitäten mit
der sekundären Quellenrekonstruktion
derart überlagert
oder verschmolzen werden, dass die Bildmorphologie zusammen mit
der lokalisierten Sondenkonzentration in einem einzigen rekonstruierten
Bild verfügbar
ist. Abhängig
von der Intensität,
dem Signal-Rausch-Verhältnis
und der Fähigkeit,
schmale Bandbreiten von Photonen an der Quelle und/oder den Sensoren
zu filtern oder zu produzieren, mag es vorteilhaft sein, mehrere
sekundäre
Quellen zu verwenden, wobei jede einer unterschiedlich ausgezeichneten
Molekularsonde entspricht.
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Wie
oben beschrieben wurde, ist die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zum automatischen Detektieren und Kompartimentieren von Molekularmarkern,
die spezifisch gefärbt
oder mit Molekularsonden markiert sind, aus optischen Projektionen und
tomographischen Rekonstruktionen von Zellen, die von einem Patienten
erhalten wurden, wie in den angehängten Ansprüchen 1–21 definiert ist. Aufgrund
der Anwesenheit oder Abwesenheit von unpassender Molekularmarkerexpression
und/oder Kompartimentierung kann eine Bestimmung durchgeführt werden,
ob der Patient einen malignen Krebs hat.
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Bezug
nehmend jetzt auf 9 ist schematisch ein Beispiel
eines Klassifizierungsverfahrens mit Zellrekonstruktionsdaten gezeigt,
wie es von einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird. Das System
kann verschiedene Klassifizierer umfassen, die zusammenarbeiten können, um
zu bestimmen, ob eine bestimmte Zellprobe Zellen von Interesse enthält und ob
diese Zellen unpassende Molekularmarkerexpression und/oder -kompartimentierung
zeigen, die mit Krankheit verbunden sind. Ein Klassifizierer ist
ein Computerprogramm, das ein Objekt basierend auf bestimmten Merkmalswerten 91 analysiert.
Das automatisierte Klassifizierersystem zur Verwendung bei dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel einen primären Klassifizierer 90 umfassen,
der eine Grundscreeningfunktion ausführt und Objekte von Interesse
selektiert. Ein sekundärer
Klassifizierer 92 klassifiziert Zellobjekte als morphologisch
abnormal oder morphologisch normal und eine unpassende Molekularmarkerexpression
und/oder -kompartimentierung aufweisend, die mit Krankheit verbunden
ist, oder normal und keine mit Krankheit verbundene unpassende Molekularmarkerexpression
und/oder -kompartimentierung zeigend. Ein Bericht 93 kann bereitgestellt
werden, der Details der Klassifizierungsergebnisse von irgendeinem
oder allen der Klassifizierer angibt. Es wird verstanden werden, dass
viele und verschiedene Klassifizierer verwendet werden können, abhängig von
der Anwendung.
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Wie
oben angemerkt wurde, kann, während das
automatisierte System zur Verwendung bei dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung einen primären und
einen sekundären
Klassifizierer aufweisen kann, ein einzelner Klassifizierer verwendet
werden, um die Klassifizierungen der Reihe nach zu erreichen, die durch
das Verfahren der vorliegenden Erfindung erreicht werden. Die Softwarepakete,
die zum Erzeugen der Klassifizierungsfunktionen verwendet werden,
basieren auf statistischen Verfahren und sind allgemein kommerziell
erhältlich.
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Der
automatisierte Klassifizierer, der bei dem Verfahren dieser Erfindung
verwendet wird, umfasst vorzugsweise Klassifizierer, die binäre Fuzzy-Entscheidungen
oder Bayesische statistische Entscheidungen basierend auf Molekularmarkermerkmalen bei
der Durchführung
ihrer klassischen Funktion verwenden. Dieser Klassifizierer kann
aufgebaut werden, um eine große
Anzahl von Merkmalswerten zu umfassen, zum Beispiel einschließlich Molekularmarkerkompartimentierungsmerkmalen,
morphologischen Merkmalen, photometri schen Merkmalen, diskreten
Texturmerkmalen, Markowschen Texturmerkmale, nicht-Markowsche Texturmerkmalen,
Fraktaltexturmerkmalen und Lauflängentexturmerkmalen.
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Der
primäre
Klassifizierer kann typischerweise dazu dienen, Objekte von Interesse
in drei Klassen aufzuteilen: (1) Zellen, die diagnostische Informationen
enthalten, einschließlich
Molekularmarker und deren Kompartimentierung, die mit Krankheit verbunden
sind; (2) entzündete
Zellen und (3) Artefakte. Der primäre Klassifizierer kann die
zellenweise Klassifizierung durch einen binären Entscheidungsbaum bewirken,
der eine Selektion von Merkmalswerten einschließt.
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Wie
oben angegeben wurde, hängt
die Fähigkeit
des Systems, das bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet
wird, Zellen und Zellkerne von Artefakten und Zellen mit Molekularmarkerkompartimentierung,
die mit Krankheit verbunden ist, von anderen normalen Zellen zu
unterscheiden, von der Fähigkeit
des Klassifizierers ab, Unterscheidungen basierend auf den Werten
der berechneten Merkmale zu treffen. Zum Beispiel kann das Verfahren
der vorliegenden Erfindung verschiedene unterschiedliche diskriminierende
Funktionen anwenden, von denen jede trainiert ist, um bestimmte
Typen von Objekten und bestimmte Änderungen bei Molekularmarkerexpression
und/oder -kompartimentierung zu identifizieren, um normale Zellen
von abnormalen Zellen (d. h. diagnostischen Zellen) zu unterscheiden.
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Der
sekundäre
Klassifizierer klassifiziert die Zellen in der Zellprobe, die von
dem primären
Klassifizierer selektiert wurden, und verwendet auch einen binären Entscheidungsbaum
und Merkmalswerte beim Ausführen
seine Klassifizierungsfunktion. Der sekundäre Klassifizierer, der als
ein probenweiser Klassifizierer betrachtet werden kann, analysiert
die Zellen, die durch den primären
Klassifizierer klassifiziert wurden, und klassifiziert die Probe
als Merkmale aufweisend, die mit Krebs verbunden sind, oder als keine
mit Krebs verbundenen Merkmale aufweisend. Wie bei dem primären Klassifizierer
ist der sekundäre Klassifizierer
aufgebaut, um Zellen basierend auf einem Satz von bevorzugter Molekularmarkerkompartimentierung
zu unterscheiden.
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Der
Klassifizierer kann mindestens eine diskriminierende Funktion umfassen,
wobei die diskriminierende Funktion Merkmale aus Schattenbildern verwendet,
um Zellen von Interesse in der Probe zu klassifizieren, einschließlich aber
nicht beschränkt auf
Molekularmarkerexpression und -kompartimentierung und Merkmale ausgewählt aus
der Gruppe, die aus Fläche,
mittlerem Radius, optischer Dichte-(OD-)Varianz, OD-Schiefe, OD-Bereich,
OD-Mittelwert, OD-Maximum, Dichte von Lichtpunkten, oberem mittlerem
Abstand, mittlerem/oberem mittleren Abstand, Korrelation, Homogenität, Entropie,
Fraktaldimension, Textur, Punktiertheit, verbundenen Komponenten,
nächster
Nachbaranalyse und den verschiedenen Harmonischen im Frequenzraum
der räumlichen
Dichte besteht.
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Bezug
nehmend jetzt auf 10 ist schematisch ein Beispielsprozess
zum Bestimmen der Kompartimentierung einer Molekularsonde gezeigt.
In einem ersten Schritt 94 werden Merkmale aus den Projektionsbildern
oder den rekonstruierten 3D-Bildern extrahiert. Beim Schritt 95 werden
Kanten, Grenzen, Flächen,
Oberflächen
und Volumen innerhalb des interessierenden Objekts unter Verwendung
beispielsweise von bekannten Kantenfindungstechniken identifiziert.
Nachdem Merkmale aus den Projektionsbildern oder rekonstruierten
3D-Bildern extrahiert
sind, werden die Merkmale verwendet, um im Schritt 96 interessierende
Objekte zu finden, was unter dem Klassifizierungssystem, das in 9,
oben, beschrieben wurde, bewirkt werden kann. Im Schritt 97 werden,
nachdem die Objekte von Interesse bestimmt wurden, Molekularsondendichte/Molekularsondendichten,
die mit dem interessierenden Objekt verbunden sind, im Schritt 98 auf
die entsprechenden Objekte als das Maß der Kompartimentierung der Sonde(n) übertragen.
Zum Beispiel wird die Konzentration einer Sonde A, die mit einem
Objekt von Interesse X verbunden ist, ein Maß der Konzentration von Zielmolekülen sein,
die mit dem Objekt verbunden sind, und ist als solche die Kompartimentierung des
Targets innerhalb der Zelle.
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Bezug
nehmend jetzt auf 11 sind dort schematisch Beispiele
für Kompartimente
gezeigt, die von Interesse sein können. Im einfachsten Fall kann
eine Zelle 1 in zwei Kompartimente aufgeteilt werden, das
Cytoplasmakompartiment 18 und das Kernkompartiment 19.
Molekularmarker können
innerhalb der Cytoplasma- oder Kernkompartimente einer Zelle kompartimentiert
sein. In einem anderen Beispiel kann das Cytoplasmakompartiment
weiter in andere Kompartimente, wie beispielsweise Mitochondrien,
endoplasmisches Retikulum und Lysosome aufgeteilt sein. In noch
einem anderen Beispiel können
Organellen, wie beispielsweise Nukleoli als Kompartimente innerhalb
des Kernkompartiments definiert werden. In noch einem anderen Beispiel können Übergangsstrukturen,
wie beispielsweise kondensierte Chromosome 36 als Kompartimente definiert
werden. Ein Fachmann wird erkennen, dass jede Molekularstruktur,
die im intrazellulären
Raum lokalisiert werden kann, als Kompartiment definiert werden
kann.
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Bezug
nehmend jetzt auf 12 ist schematisch ein Blockdiagramm
eines Verfahrens für
die Detektion von Zellen mit Molekularmarkerkompartimentierung gezeigt,
die mit Malignität
und/oder Krankheit einschließlich
Krebs verbunden ist. Das Verfahren weist auf:
Nehmen einer
Zellprobe mit einer Mehrzahl von Zellen und Suspendieren der Mehrzahl
von Zellen in einer Lösung
im Schritt 100;
falls erforderlich, Fixieren der Mehrzahl
von Zellen der Zellprobe im Schritt 102;
Markieren
mindestens eines Molekularmarkers in der Mehrzahl von Zellen mit
angehängten
Molekularsonden oder Farben im Schritt 103;
Beleuchten
mindestens einer Zelle der Mehrzahl von Zellen mit mindestens einer
Punktlichtquelle im Schritt 104;
Erhalten mindestens
zweier unterschiedlicher Projektionsbilder durch die mindestens
eine Zelle mit einem digitalen Arraydetektor im Schritt 105;
Kompensieren
der mindestens zwei Projektionsbilder hinsichtlich Variationen bei
der Beleuchtung im Schritt 106;
Analysieren der mindestens
zwei Projektionsbilder, um mindestens einen markierten Molekularmarker mit
densitometrischen und Lokalisationsmerkmalen zu detektieren, im
Schritt 107;
Analysieren des Orts des mindestens einen
Molekularmarkers innerhalb der mindestens einen Zelle im Schritt 108;
Messen
der Kompartimentierung des mindestens einen markierten Molekularmarkers
durch Verwenden der densitometrischen und Lokalisationsmerkmale im
Schritt 109; und
Analysieren der Kompartimentierung
des mindestens einen markierten Molekularmarkers mit mindestens einem
Klassifizierer zur Detektion von Malignität und/oder Krankheit, die mit
Molekularmarkerkompartimentierung verbunden sind, im Schritt 110.
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In
einem Ausführungsbeispiel
kann der Schritt
106 des Kompensierens der mindestens zwei Projektionsbilder
hinsichtlich Variationen bei der Beleuchtung unter Verwendung von
konventionellen optischen und Bildverarbeitungstechniken durchgeführt werden.
Analysieren der mindestens zwei Projektionsbilder, um mindestens
einen markierten Molekularmarker mit densitometrischen und Lokalisationsmerkmalen
im Schritt
107 zu detektieren, kann unter Anwendung von
Techniken ausgeführt
werden, die in dem erteilten
US-Patent
6,519,355 von Alan C. Nelson, herausgegeben am 11. Februar
2003 und betitelt "OPTICAL
PROJECTION IMAGING SYSTEM AND METHOD FOR AUTOMATICALLY DETECTING
CELLS HAVING NUCLEAR AND CYTOPLASMIC DENSITOMETRIC FEATURES ASSOCIATED WITH
DISEASE" beschrieben
sind.
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Schritt 108,
der den Ort des mindestens einen Molekularmarkers innerhalb der
mindestens einen Zelle analysiert, kann unter Anwendung von Techniken
durchgeführt
werden, die in der parallel anhängigen
US-Anmeldung Nr. 10/147,154 von Alan C. Nelson, eingereicht am 13.
Mai 2002 und betitelt "METHOD
AND APPARATUS FOR EMISSION COMPUTED TOMOGRAPHY USING TEMPORAL SIGNATURES" beschrieben sind.
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Schritt 109,
der die Kompartimentierung misst, kann vorteilhafter Weise das Analysieren
der Textur von Dichtemerkmalen umfassen, die durch den mindestens
einen markierten Molekularmarker ausgebildet werden, der innerhalb
zusammenfallender Begrenzungsoberflächen angeordnet ist, welche innerhalb
der mindestens zwei Projektionsbilder angeordnet sind. Weiterhin
kann der Schritt des Messens von Kompartimentierung vorteilhafter
Weise das Vergleichen von Grenzflächen innerhalb der mindestens
zwei Projektionsbilder umfassen, um einen Satz von zusammenfallenden
Grenzflächen
innerhalb der nächsten
zwei Projektionsbilder zu bestimmen. Der Schritt des Messens der
Kompartimentierung kann weiterhin vorteilhafter Weise das Bestimmen
der Co-Lokalisierung von mindestens zwei markierten Markern im rekonstruierten
3D-Raum umfassen. Der Schritt des Messens der Kompartimentierung
kann in noch weiter vorteilhafter Weise das Bestimmen von Co-Lokalisierung
von mindestens zwei markierten Marken im 2D-Raum umfassen. Der Schritt
des Messens der Kompartimentierung kann in noch weiter vorteilhafter
Weise das Analysieren von Textur von Dichtemerkmalen von mindestens
zwei markierten Markern relativ zueinander umfassen, zum Beispiel
unter Anwendung der Techniken der vorgenannten Nelson-US-Patentanmeldung
Nr. 10/147,154.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
kann ein Kompartiment jeder 3-dimensionale Raum mit Grenzen innerhalb
einer Zelle sein, wie sie durch die FOT unterschieden werden. Die
Zellprobe kann eine humane Lungenprobe, eine humane Gebärmutterhalsprobe,
eine Blutprobe sein oder seltene Zellen enthalten. In einem Fall
weist das Färben
einer Probe, um Molekularmarkerkompartimentierung zu identifizieren,
das Reagieren der Zelle mit einem Anti-pRb-Antikörper auf. In einem anderen
Beispiel kann ein bindendes Protein spezifisch für Methyl-CpG verwendet werden,
um methylisierte DNS zu färben.
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Das
System, das bei dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, ist
nützlich
zum Analysieren verschiedener Typen von biologischen Zellen. In
einem Fall kann die Zelle von Interesse ausgewählt sein, um diagnostisch für Krebs
zu sein, und/oder die Zelle von Interesse kann vorteilhafter Weise
eine präinvasive
Krebszelle sein. Die Zelle von Interesse kann eine invasive Krebszelle
sein, wobei die Zellen von Interesse beim Screenen eines Patienten
nach Krebs verwendet werden. Die Zellen von Interesse können auch
beim Bestimmen verwendet werden, ob ein Patient Krebs entwickeln
wird. Die Krebszelle kann von einem Epithelkrebs erhalten sein.
Alternativ oder zusätzlich
kann die präinvasive
Krebszelle von einem epithelialen Ursprung sein. Der Epithelkrebs kann
vorteilhafter Weise aus der Gruppe ausgewählt sein, die besteht aus Lungen-
und Kehlkopfkrebs, Gebärmutterhals-
und Eierstockkrebs, Brustkrebs, Prostatakrebs, Blasenkrebs, Hautkrebs
und Krebs des Magen-Darm-Trakts.
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In
einer anderen Ausführungsform
wird die mit Molekularmarkerkompartimentierung verbundene Krankheit
durch Messen der Kompartimentierung von Markern einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf pRb, p53/53BP1, SAM68, PTEN, E2F und c-myc in einer signifikanten
Anzahl von Sputumproben, die von Individuen mit Lungenkrebs genommen
wurden, und durch Vergleichen der Kompartimentierung dieser Molekularmarker
bei normalen Individuen und Bestimmen, welche Molekularmarker Kompartimentierung
aufweisen, die unterscheidbar zwischen den beiden Gruppen ist, bestimmt.
Andere Molekularmarker können
ebenfalls in derselben Weise auf mit Krankheit verbundene Kompartimentierung
gescreent werden.
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Die
Erfindung ist hier in erheblichem Detail beschrieben worden, um
den Patentgesetzen zu genügen
und um die Fachleute mit den Informationen zu versorgen, die notwendig
sind, um die neuen Prinzipien der vorliegenden Erfindung anzuwenden
und um derartige beispielhafte und spezialisierte Komponenten zu
konstruieren und zu verwenden, wie es erforderlich ist. Jedoch ist
zu verstehen, dass die Erfindung mit grundsätzlich unterschiedlicher Ausrüstung und
Vorrichtungen und Rekonstruktionsalgorithmen ausgeführt werden
kann, und dass verschiedene Modifikationen, sowohl bezüglich der
Ausrüstungsdetails
als auch der Betriebsbedingungen durchgeführt werden können, ohne
von dem Bereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen.