JP2000500322A - 初期癌検出への使用のための上皮タンパク質及びそのｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は上皮細胞におけるその高められた存在が前癌の表示である精製され、そして単離された上皮タンパク質、そのペプチド及び変異体に関する。肺癌のために特徴づけられる初期検出である１つの上皮タンパク質が、２種のヒト肺癌細胞系、NCI-H720及びNCI-H157から精製される。６段階方法を用いて、上皮タンパク質を、非還元及び還元条件下でウェスターンブロット検出システムにより精製される。精製段階は、アニオン交換クロマトグラフィー、分離用等電点、電気泳動、ポリマーに基づくC₁₈HPLC及び分析用 C₄HPLCを包含した。約25,000倍の精製の後、免疫染色タンパクは、還元SDS-PAGEの後、クーマシーブルー染色により判断される場合、90％以上の純度を有した。一次上皮タンパク質は、異種核リボヌクレオタンパク質(hnRNA)A2といくらかの配列相同性を共有する。マイナーな同時精製上皮細胞は、スプライス変異体hnRNP-B1といくらかの配列相同性を共有する。一次正常気管支上皮細胞培養物の分子分析は、臨床サンプルの免疫組織化学染色と一致する低レベルの上皮タンパク質発現、及びほとんどの肺癌細胞における高レベルの実現を示した。上皮タンパク質は、肺、乳、骨、卵巣、前立腺、腎臓、黒色腫及び骨髄腫における上皮形質転換のマーカーであり、そして癌形成の工程において原因となることができる。哺乳類における前癌及び癌のためのスクリーンとして分子及び免疫学的技法を用いて、上皮タンパク質、そのペプチド及び変異体の発現をモニターするための方法が提供される。hnRNP mRNAのレベルを検出する、癌及び前癌のコンピュータ処理された診断方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 初期癌検出への使用のための上皮タンパク質及びその DNA 発明の分野 本発明は、癌診断及び治療の分野に関する。より特定には、本発明は、上皮細 胞の初期癌検出マーカータンパク質の単離及び精製、及び前記タンパク質をコー ドする DNA配列のクローニングに関する。さらに、本発明は、癌にかかりやすい 個人を検出し、そして診断するためのタンパク質及び DNA配列にも関する。本発 明は癌を予測する識別機能を生成するためのコンピューター化された方法に関す る。本発明はまた、遺伝子生成物の発現を調節するための治療介入にも関する。 発明の背景 肺癌は、３種の癌死亡の１つを考慮する場合、アメリカ合衆国における男性及 び女性の両者の癌死亡の最とも頻繁な原因である⁽¹⁾。過去30年、この疾病の癌 関連生存率は最小限ではあるがわずかに改良されて来た。手術による切除及び薬 物化学療法によるこの疾病の好結果をもたらす処置は、初期段階腫瘍の同定に強 く依存している。概念的に魅力ある初期検出アプローチは、分離された気管支上 皮細胞の評価による癌の存在を確立することである。1960年代の後期、Saccoman noなどは、肺癌の初期検出を増強するための技法として剥脱された気管支上皮に おける細胞形態学的変化を評価するためへの痰細胞学の使用を提案している⁽²⁾ 。しかしながら、胸部Ｘ線及び痰細胞学の組合せを用いる臨床試験は、癌関連死 亡率のいづれの低下をも示さなかった⁽³⁾。 1988年、Tockmanなどは、２種の肺癌関連のモノクローナル抗体による痰サン プル内に含まれる細胞を免疫染色することによる初期肺癌検出のための敏感な方 法を報告している⁽⁴⁾。このアプローチのための基本は、気管支上皮から分離さ れた細胞における初期の予備−腫瘍性変化を同定することであった。その研究に 使用される抗体は、アメリカ特許第 4,569,788号に開示される 703D4、及び624H 12と称するマウスモノクローナル IgGであった。肺癌の初期検出への個々のモノ クローナル抗体の寄与の分析においては、703D4のみが、21の検出された真の陽 性患者のうち20を同定した（４；1995年10月に発行された特許証第 5,455,159号 であるアメリカ特許出願第08／152,881 号）。624H12は、細胞表面糖タンパク質 のルイス^X関連部分である腫瘍胎児性抗原を検出することが示された(Mulshine／ Magnani)。703D4のための抗原は未知であった。 703D4は、キーホールリンペットヘモシアニンに結合される完全な腫瘍細胞抽 出物を用いての免疫化により開発され、そして選択はサブタイプの中で、肺癌組 織学的サブタイプの識別に基づかれた。予備研究は、703D4抗体がほとんどの小 さくない細胞肺癌細胞により発現されるタンパク質を認識したことを示した⁽⁵⁾ 。免疫沈殿法は、31kDa以上のMrのタンパク質を定義した。703D4は隣接する気管 からの分離された気管支上皮における癌の進行に関連する変化を選択的に検出す る能力を示したので、703D4により認識される抗原がその同一性を決定し、そし て初期肺癌検出へのその関連性を診査するために本発明において精製された。本 発明は、小さくない細胞肺腫瘍細胞からの上皮タンパク質の同定のために生化学 的アプローチを使用する。 タバコ喫煙により、全体のヒト呼吸器官が可能性ある発癌物質に暴露され、そ して癌の進行のために高められた危険性の状態で存在 する。この現象は、“フィールド癌化”と呼ばれて来た（８）。種々の上皮の変 化は、“フィールド”効果の部分であり得る、喫煙者及び肺癌患者の両者の呼吸 器管を通して観察されて来た（８，９）。Saccomannoなど（６）は、肺の中心に 位置する鱗状癌が一連の同定できる段階、すなわち扁平化生、異型性を有する扁 平化生（弱い、中ぐらい、著しい）、本来の位置での癌、及び侵入性癌を通して 進行することを示している。それらの発見は、後での動物及びヒト研究により確 かめられた（７）。この細胞形態学的分類は、肺癌“フィールド”の近位領域に おける予備腫瘍性変化を定義する際に有用である。しかしながら、他の主要な肺 癌組織学の前に起こる相当の出来事、特に周辺肺（終末細気管支、呼吸細気管支 、肺胞上皮）に生じる出来事は十分には定義されない。 遠位ヒト肺の腫瘍性及び非腫瘍性領域の両者における上皮タンパク質の発現が 研究された。 発明の要約 本発明は、癌の初期マーカーである上皮タンパク質の単離及び同定を記載する 。肺癌のための初期マーカーである、単離され、そして精製された上皮タンパク 質、そのペプチド又は変異体を供給することが本発明の目的である。 癌のための初期マーカーである、上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体の ためのコード配列を含んで成る、単離され、精製された DNA分子又はその一部を 供給することが本発明の目的である。 組織及び細胞における遺伝子及びその変更を検出し、そして診断するために癌 のための初期マーカーである上皮タンパク質をコードする、単離された DNA又は RNA分子、又はその一部を利用することが本発明のもう１つの目的である。 癌のための初期マーカーである上皮タンパク質をコードする遺伝子又はその一 部の検出のための核酸プローブを供給することが本発明のもう１つの目的である 。 ヒト腫瘍発生前及び腫瘍性細胞及び組織を診断するための方法を提供すること が本発明のさらなる目的である。本発明によれば、前記方法は、ヒトから細胞、 組織又はそれらの抽出物を単離し、そして癌のための初期マーカーである上皮タ ンパク質をコードする遺伝子又はその一部、又は細胞、組織又はその抽出物から のそれらの発現生成物を検出することを含んで成り、ここで前記遺伝子又は発現 生成物における量の上昇の検出が前腫瘍及び腫瘍を示す。 本発明のもう１つの目的は、癌細胞から回収された遺伝子を発現するクローン 内に含まれる、癌のための初期マーカーである上皮タンパク質をコードする遺伝 子の突然変異を検出するための方法である。 ヒト前腫瘍及び腫瘍細胞及び組織を診断するためのもう１つの方法は、上皮タ ンパク質と反応性である抗体を用いてのイムノアッセイ、たとえばウェスターン ブロット又は免疫電気泳動により、二次元電気泳動により又は逆相HPLCにより、 前腫瘍及び腫瘍細胞における上皮タンパク質の後−翻訳変性を検出することによ ってである。 癌進行を阻止するために治療的介在の効率をモニターするための方法を提供す ることが本発明のさらなる目的である。 癌及び初期癌の診断方法への使用のために及び癌処置の効率をモニターするた めの方法への使用のために、癌のための初期マーカーである上皮タンパク質をコ ードするDNA，RNA又はそれらの一部からの核酸配列を含んで成るオリゴヌクレオ チドを含んで成るキットを提供することが本発明のさらにもう１つの目的である 。 本発明のさらなる目的は、診断及び検出アッセイ、特にイムノア ッセイへの使用のために、少なくとも１つの異種核リボヌクレオチドタンパク質 の一部に対して実質的に相同の、上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体を提 供することである。 本発明の１つの目的は、RNA上の上皮タンパク質により認識される同じ結合部 位に結合することができる上皮タンパク質の阻害タンパク質類似体である。その ような類似体は、上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体の機能をインビトロ 及びインビボで競争阻害することができる。 哺乳類細胞及び組織における癌に対する感受性を検出し、そして初期−開始腫 瘍形成を診断するための方法を提供することが本発明のさらなるもう１つの目的 である。本発明によれば、前記方法は、哺乳類生物サンプルを単離し、そして癌 のための初期マーカーである上皮タンパク質又はその一部をコードする核酸配列 を検出することを含んで成る。 本発明はまた、哺乳類における癌及び前癌のコンピューター助力の決定方法、 及びそのために有用なアルゴリズムを提供する。 本発明のもう１つの観点は、生物学的サンプルにおけるhnRNP mRNAのコンピュ ーター化された検出方法である。 哺乳類における癌及び前癌のコンピューター化された診断方法を提供すること が本発明のもう１つの観点である。 本発明のもう１つの観点は、像分析に基づいて哺乳類における癌のコンピュー ター助力の予測方法である。 本発明のさらなる観点は、コンピューター化された像分析に基づいて異型細胞 を同定し、そして癌を予測することに有用な識別機能を生成するための方法であ る。 本発明のもう１つの観点は、二重波長像濃度学を含んで成る、哺乳類における 癌及び前癌のコンピューター化された診断方法である 。 本発明のもう１つの観点は、正常又は典型的な細胞から異型細胞を決定するた めのシステムであり、ここで前記システムは、光学的像発生機、光学的像を獲得 するための装置、異型細胞に対して独得の細胞パラメーターのための光学的像を 分析するためのプロセッサー、及び識別機能を決定するためのプログラムを含ん で成る。前記識別機能は、異型又は異常細胞と典型的又は正常細胞との間を識別 する。前記システムは特に、個人における癌の進行を予測することにおいて有用 である。 本発明のさらなるもう１つの目的は、上皮細胞における遺伝子に対して実質的 に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入を含んで成る、上皮細胞 の癌のための初期マーカーである上皮タンパク質又はその一部をコードする遺伝 子又はその一部の発現を変更し、又はダウンレギュレートするための方法を提供 することである。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上皮細胞の非腫瘍増 殖を可能にする。 本発明のもう１つの目的は、化学療法薬物についてスクリーニングし、そして 化学療法及び介在薬物の効率をモニターするための方法を提供することである。 癌のための初期マーカーである上皮タンパク質をコードする核酸配列の１又は 複数のコピーをそのゲノム中に組込んでいるトランスジェニック動物を提供する ことが、本発明のさらなる目的である。前記核酸配列の組込みは、上皮細胞の複 数形又は変異体の過剰発現又は発現をもたらす。得られるトランスジェニック動 物は、癌をより進行せしめる傾向があり、そして身体における１又は複数の位置 で促進された速度で癌を進行せしめる。そのようなトランスジェニック動物は、 癌を処理し又は阻害するために有用な治療薬物をスク リーニングするために有用である。 上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体に対して反応性の抗体を供給するこ とが本発明のさらなるもう１つの目的である。そのような抗体は、癌の診断及び 処置において有用である。 図面の簡単な説明 本発明のそれらの及び他の目的、特徴及び多くの利点は、添付される図面に関 して考慮される場合、次の特定の記載を読むことにより、良好に理解されるであ ろう。 図１は、異種リボヌクレオタンパク質Ａ１（hnRNP）及びhnRNP A2の DNAコー ド配列を示す。 図２は、Burd，C.G.など、Proc.Nat'l Acad.Sci ．USA 86，9788-9792（1989） により開示されるヒトhnRNP A2の完全な DNA配列を示す。 図３は、Burd，C.G.など、Proc.Nat'l Acad.Sci ．USA 86，9788-9792（1989） により開示されるヒトhnRNP B1完全な DNA配列を示す。 図４は、hnRNP-A2／B1と共に整列された、精製された 703D4抗原のCNBr消化物 から配列決定されたペプチドのアミノ酸配列を示す。精製された 703D4抗原のCN Br−生成されたフラグメントの配列はhnRNP-A2／B1の予測される配列を有する（ hnRNP-B1について番号づけしている）。下部の文字（アミノ酸３〜14）は、hnRN P-A2においてミッシグする交互にスプライスされたエキソンを示す。CNBr切断を 受けやすいメチオニンは、●又は★により示される。★メチオニンの後で開始す るペプチドは、トリシンSDS-PAGEによる可視化のためには小さ過ぎる(＜２kDa) 。同一のデータが、703D4抗原の３種の別々の精製から得られた。個々の場合、 ２つのバンドが配列AARPHS IDGRVV（配列番号１）を生成し、そしていくつかの見えるマイナーなバンドが見 出され、これはたぶん、酸化されたメチオニンによる部分的CNBr切断を示す。 図５ａ〜５ｅは、703D4抗原のポリマー逆相HPLC精製を示す。10mm×10cmの Po ros灌流ポリマーＣ₁₈カラムが、５％アセトニトリル／ 0.1％ TFA（５ａ）及び ５％メタノール／ 0.1％ HFBA(５ｄ)により平衡化された。タンパク質が、10ml ／分の流速で、５〜100 ％アニトニトリル（５Ａ）及び５〜100 ％メタノール（ ５ｄ）のグラジエントにより溶出された。画分を２つの同一のSDS-PAGEゲル上で 試験し、そして１つをクーマシーブルにより染色し（５ｃ，５ｆ）、他は 703D4 抗体との反応のためにPVDFに移された（５ｂ，５ｅ）。タンパク質標準の位置は 右側に示されている(43，29，18及び６kDa)。パネルにおいては、両性電解質、 尿素及び興味あるタンパク質からの主要タンパク質の分離を注目すること（５ｂ における画分15，16、及び５ｅにおける画分34，35）。免疫反応性陽性画分が追 加の精製のためにプールされた。 図６ａ〜６ｃは、703D4抗原のＣ₄逆相HPLC精製を示す。６ａ、Ｃ₄カラムは、0 .1％ TFA中、33〜48％アセトニトリルのグラジエントにより溶出される。６ｂ及 び６ｃは、それぞれ、溶出された画分のウェスターンブロット及びクーマシーブ ル分析を示す（49，32及び 18kDaのタンパク質標準が右側に存在する）。 図７ａは、異種核リボヌクレオタンパク質Ｂ２（hnRNP-A2は∧スキップされた 部分により示される）●、★メチオニンと共に、本発明のペプチドのアミノ酸配 列を示し；★、トリシンSDS-PAGEのためには小さ過ぎるこの MetでCNBrにより生 成されたペプチド。 図７ｂは、精製された 703D4主要（hnRNP-A2）及びマイナー(hn-RNP-B1)抗原 のCNBr切断フラグメントのＮ−末端アミノ酸配列及び おおよそのMrを示す。矢印はタンパク質内のメチオニンの位置を示し、そしてキ ャロット（carrot）は、hnRNP-A2とB2とを区別する交互にスプライスされたエキ ソンの部位を示す。15kDa及び 27kDaのペプチドが終結する位置での正確なメチ オニンは、SDS-PAGE分析により決定され得ない。回収され得なかったすべてのペ プチドは、トリシンSDS-PAGEゲルの前からの移動から解明するためには小さ過ぎ る（＜2.5kDa）。 図８は、精製された 703D4主要抗原のCNBr消化の16％トリシンSDS-PAGE分析を 示す。左のレーンは消化の前の抗原であり、矢印はアミノ末端配列決定にゆだね られる４種の可視バンドを示すことを注目すること。 図９ａは、肺由来の細胞培養物におけるhnRNP-A2／B1 mRNA の発現を示す。９ ａ： NSCLC細胞系（NCI-H720，H157，HTB58，H520，H672，H1437，H549，H820， H4670，H1155）及びSCLC細胞系（NCI-H889，H417，H209，H345）のノザン分析。 すべての細胞は定常相において収穫され、そして材料及び方法に記載されるよう にして分析された。UV照射下で可視化される28S rRNAが定量化のために使用され る。 図９ｂは、細胞系NCI-H720，H1355，H157，H1155、正常な肺及び正常な気管支 上皮一次培養物からのmRNAのRT-PCRを示す。生成物の予測される大きさは、280b p(hnRNP-A2)及び316bp(hnRNP-B1)である。RT-PCRは、材料及び方法に記載される ようにして行なわれた。生成物は、２％アガロース TBE−ゲル上で分析され、ニ トロセルロースに移され、そしてhnRNP-A2及び -B1の両者に共通する末端ラベル 化された20ntのプライマーによりプローブされた。 図10は、hnRNP-A2／B1発現の増殖依存性制御を示す。NSCLC(H157，HTB58H23) からの全RNA 10μｇへのhnRNP A2／B1に対して特異的 なプローブによるノザンブロットハイブリダイゼーション；形質転換された気管 支上皮細胞系(IB3-1)及び正常な気管支上皮一次培養物(NBEPC)対数相及び常状相 。負荷された RNAの定量化は、28s rRNAの臭化エチジウム染色（EtBr）により得 られた。 図11Ａ〜11Ｃは、一次 NSCLCにおけるＰ31発現パターンを示す。６Ａ）鱗状細 胞癌における集中性細胞質ｐ31染色（免疫組織化学的染色、X360）。WP）肺性腺 癌での隣接する部分における粒状染色による拡散ｐ31発現。核周囲染色パターン 、昆虫を示す。（イムノペルオキシダーゼ、X360）。11Ｃ）膜発現パターンを有 する肺性腺癌（イムノペルオキシダーゼ、X270）。 図12Ａ〜12Ｄは、非癌性肺（組織学的異常性を欠いている）におけるＰ31発現 パターンを示す。12Ａ）線毛及び非線毛性気管支上皮の先端部分に対してのｐ31 の拡散粒状局在化。基礎をなす基部細胞の弱い染色を注目すること(矢印)(免疫 組織化学的染色、X225)。12Ｂ）気管支腺における強いｐ31発現（イムノペルオ キシダーゼ、X225）。12Ｃ）気管支におけるｐ31発現（免疫組織化学的染色、X2 70）。12Ｄ）正常タイプII細胞におけるｐ31の局在化。こわれやすい（正常な） 肺胞間にそっての正常なタイプII細胞の中ぐらいの染色強度及び分布を注目する こと。（イムノペルオキシダーゼ、X360）。 図13Ａ〜13Ｂは、タイプII細胞過形成におけるｐ31発現の可視局在化を示す。 13Ａ）強い拡散細胞質ｐ31免疫反応性を示すタイプII過形成。図12Ｄにおける正 常な肺胞上皮に比較してのタイプII細胞の高められた数及び線維増多の存在を注 目すること（タイプII細胞過形成におけるｐ31の免疫組織化学）。（免疫組織化 学的染色、X360）。13Ｂは、タイプII肺胞細胞による陽性発現の肺パターンを示 す。 図14は、二重波長像濃度学のための標準化及び検量方法を示す。 図15は、Calu-3細胞及び正常な痰細胞の対照混合物における hnRNP A2 mRNA／ タンパク質を示す。 図16は、臨床学的痰細胞における hnRNP A2 mRNA／タンパク質の発現を示す。 図17は、成長するマウス肺における hnRNPの発現を示す。 発明の特定の記載 本発明は、癌のための初期検出マーカーである、単離され、そして精製された タンパク質、そのペプチド及び誘導体、並びにそれらの変異体である。前記タン パク質、ペプチド及びそれらの変異体は、特徴的には、正常細胞には低レベルで 存在し、そして前癌及びほとんどの癌細胞には高レベルで存在する。本明細書で 使用される場合、変異体とは、DNA突然変異、交互のエキソンスプライシング及 び後翻訳変性から生じる変更されたタンパク質を包含する。そのような変異体タ ンパク質の発現は、前癌又は癌細胞への正常細胞の形質転換に相互関連する。 肺、結腸、腎臓、骨、乳房、前立腺、黒色腫、骨髄腫、及び同様のものの前腫 瘍及び腫瘍細胞から単離され、そして精製された、約 31kDa〜約 35kDaの分子量 を有する31のタンパク質、及びそれらのペプチド及び変異体が特に興味の対象で ある。本発明のタンパク質、及びそのペプチド及び変異体は、肺癌の進行を導び く形質転換の経路にゆだねられる上皮細胞のためのマーカーである。好ましいタ ンパク質及びその変異体は、ヒト肺癌細胞、特に非−小細胞癌細胞から単離され る。 本発明の単離され、そして精製されたタンパク質及びその変異体は、次のアミ ノ酸配列の少なくとも１つ、好ましくは１つよりも多 くの下記配列を含んで成る： AARPHSIDGRVV （配列番号１）； QEVQSSRSGRGG （配列番号２）； REKEQFRKLFI （配列番号３）； EKTKETVPLERKKRE （配列番号４）； AARPSDGRVV （配列番号５）； EREKEQFRKLFI （配列番号６）。 １つの態様において、タンパク質、そのペプチド及び変異体は、約４kDa の分 子量により特徴づけられ、そして配列番号３のアミノ酸配列を含んで成る。もう １つの態様においては、タンパク質、そのペプチド及び変異体は、約 27kDaの分 子量により特徴づけられており、そして配列番号１のアミノ酸配列を含んで成る 。さらにもう１つの態様において、タンパク質、そのペプチド及び変異体は、約 13kDaの分子量により特徴づけられ、そして配列番号１のアミノ酸配列を含んで 成る。さらに本発明のもう１つの態様においては、タンパク質、そのペプチド及 び変異体は、15kDaの分子量により特徴づけられ、そして配列番号２のアミノ酸 配列を含んで成る。 １つの態様において、タンパク質、そのペプチド及び変異体は、少なくとも１ つ又は複数の異種核リボヌクレオチドタンパク質（hn-RNP）と部分的なアミノ酸 配列相同性を共有する。本発明のタンパク質、そのペプチド及び変異体は、hn-R NP A1，hn-RNP A2，hn-RNP-B1，hn-RNP B2，hn-RNP C1，hn-RNP C2及び hn-RNP C3から成る群から選択された１又は複数のhn-RNPと部分的アミノ酸相同性を共有 することができる。特定の態様においては、タンパク質は、hn-RNP A2と部分的 アミノ酸配列相同性を共有する。もう１つの態様においては、タンパク質は hn- RNP B1と部分的アミノ酸配列相同性を共有する。本発明の好ましい態様において は、タンパク質は、hn-RN P A2及び hn-RNP B1と部分的アミノ酸配列相同性を共有する。部分的アミノ酸配 列相同性とは、タンパク質、そのペプチド又は変異体が少なくとも１つのhn-RNP と少なくとも70％の配列相同性、好ましくは少なくとも約90％の配列相同性、よ り好ましくは少なくとも１又は複数のhn-RNPと少なくとも約95％の配列相同性を 有することを意味する。 １つの態様において、タンパク質、そのペプチド又は変異体は、下記アミノ酸 配列又はその一部と配列相同性を共有する： 1 MEktletvplerkkREKEQFRKLFIGGLSFETTEESLRNYYEQWGKLTDCVVMRDPASKR 61 SRGFGFVTFSSMAEVDAAMAARPHSIDGRVVEPKRAVAREESGKPGAHVTVKKLFVGGIK 121 EDTEEHHLRDYFEEYGKIDTIEDTDRQSGKKRGFGFVTFDDHDPVDKIVLQKYHTINGH 181 NAEVRKALSRQEMQEVQSSRSGRGGNFGFGDSRGGGGNFGPGPGSNFRGGSDGYGSGRGF 241 GDGYNGYGGGPGGGNFGGSPGYGGGRGGYGGGGPGYGNQGGGYGGGYDNYGGGNYGSGNY 301 NDFGNYNQQPSNYGPMKSGNFGGSRNMGGPYGGGNYGPGGSGGSGGYGGRSRY(配列番号7) もう１つの態様においては、タンパク質、そのペプチド又は変異体は、下記ア ミノ酸配列又はその一部と配列相同性を共有する： 1 MEREKEQFRKLFIGGLSFETTEESLRNYYEQWGKLTDCVVMRDPASKR 49 SRGFGFVTFSSMAEVDAAMAARPHSIDGRVVEPKRAVAREESGKPGAHVTVKKLFVGGIK 109 EDTEEHHLRDYFEEYGKIDTIEDTDRQSGKKRGFGFVTFDDHDPVDKIVLQKYHTINGH 169 NAEVRKALSRQEMQEVQSSRSGRGGNFGFGDSRGGGGNFGPGPGSNFRGGSDGYGSGRGF 229 GDGYNGYGGGPGGGNFGGSPGYGGGRGGYGGGGPGYGNQGGGYGGGYDNYGGGNYGSGNY 289 NDFGNYNQQPSNYGPMKSGNFGGSRNMGGPYGGGNYGPGGSGGSGGYGGRSRY(配列番号8) 変異体は、１又は１よりも多くのアミノ酸によりアミノ酸配列が変化好ましく は10個よりも多くのアミノ酸により変化せず、好ましくは５個よりも多くないア ミノ酸により変化し、より好ましくは１〜３個のアミノ酸により変化するタンパ ク質及びペプチドを包含するが、但しそれらだけには限定されない。アミノ酸変 化は、保存性 置換、欠失及び同様のものであり得る。それらのアミノ酸変化の例は、DNA／RNA 結合部位を変更するための芳香族アミノ酸の変更；アルギニン、リシン又はヒ スチジン、たとえばCOOH末端近くのＮ^G，Ｎ^G−ジメチル−アルギニンのメチル化 ；ホスホセリン又はホスホトレオニンのメチル化；ブロックされたＮ−末端グリ コシル化；及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。変 異体はまた、タンパク質又はペプチドの交互のmRNAフプライス形を包含する。 アミノ酸の１又は複数の後−翻訳変性を有するタンパク質及びペプチドもまた 、変異体として包含される。後−翻訳変性の例は、グリコシル化、リン酸化、メ チル化、ADPリボシル化及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定 されない。１つの態様においては、変異体は、Ｎ−末端アミノ酸に対するメチル 化、又はセリン及びトレオニンのリン酸化の後−翻訳変性を有する。もう１つの 態様においては、変異体は、タンパク質結合に影響を及ぼすためのＣ−末端グリ シンの後−翻訳変性を有する。 用語変異体とはまた、タンパク質、ペプチド、及びそれに結合される他の構成 成分、たとえば放射性ラベル、ビオチン、フルオレセイン及び化学ルミネセント ラベル及び同様のものを有することができる後−翻訳変性されたタンパク質及び ペプチドを包含する。 阻害タンパク質又はペプチド類似体もまた、本発明に包含される。そのような 阻害タンパク質又はペプチド類似体は、RNA上のその結合部位に対する上皮タン パク質の結合を競争的に阻害することができる。 hnRNP A2／B1とアミノ酸配列相同性を共有するものとしての 703D4初期肺癌検 出抗原の同定は、タンパク質の hnRNPグループについての新しい知識の点から刺 激的である(Burd and Dreyfuss，Scienc e ，Vol.265（July 29）pp.615-621，1994)。hnRNPのファミリーは、プレーmRNA エキソンスプライシング及びスプライス部位選択を包含する RNAプロセッシング において、及びまた、転写、DNA複製及び組換えにおいて役割を有する(Dreyfuss など.， Ann Rev Biochem.，Vol.62，pp289-321，1993)。いくつかの hnRNPは 、前に報告された免疫組織化学的局在化及び非細胞分別の両者と一致する、核か らシトソールへのmRNAのシャトルに包含される。種々の後−翻訳変性は、hnRNP ファミリーのメンバーのために報告されている。 本発明の上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体は、当業界において知られ ている方法、たとえば二次元電気泳動、逆相HPLCにより同定される(Karn，J.な ど．J.Biol.Chem. 252，No.20，pp7307-7322，1977; Anderson，N.L.Electrophr oesis 12，pp.907-930，1991; Boffa，L.C.など．Biochemical and Biophys.Re s.Commun ． ，74，No.3，1977; Williams，K.R.など．Proc.Natl.Acad.Sci USA,v ol.82，pp.5666-5670，1985; Kumar，A．など．J.Biol.Chem.，vol.261，No.24 ，pp.11266-11273，1986; Medzihradsky，K.F.など．Am.Soc.Mass.Spectrom，vo l.5，pp.350-358，1994)。１つの方法は、二次元ゲル分析を使用する。酵素処理 による及びそれによらない精製された上皮タンパク質、ペプチド又は変異体は、 一次元において電気泳動される。二次元分析は、約pH８〜約 9.5のpHグラジエン ト下で行なわれる（Anderson，Electrophoresis 12: 907，1991）。タンパク質 、ペプチド又は変異体は、当業界において知られている方法、たとえばタンパク 質染色、放射性ラベルされた代謝ラベル、抗体及び同様のものにより検出され得 る。移動パターンの変動は、後−翻訳変性を表示する。 後−翻訳変性はまた、二次元ゲル電気泳動又はエレクトロスプレイ API−マス スペクトロメトリーにより分離されたサンプルを処理 するために特定の酵素、たとえばホスファターゼ、グルコシダーゼ及び同様のも のを用いて決定され（Medzihradsky，Am.Soc.Mass.Spec ．，5: 350，1994）、そ して処理されたサンプルの分子量が非処理のサンプルと比較される。 １つの態様において、本発明は、短期の正常な一次気管支上皮培養物に比較し て、癌細胞系における及び形質転換された気管支上皮細胞における初期肺癌上皮 タンパク質の調節解除及び過剰発現を示す。このデータは、線維芽細胞を包含す る形質転換された細胞における発現の調節解除を示した密接に関連する分子hnRN P-A1に対するこれまでの研究に匹敵する(Biamonti，J.Mol.Biol.，Vol.230，pp7 7-89，1993)。腫瘍細胞系を包含する、形質転換された細胞系においては、高レ ベルのhnRNP-A1発現が定常相に達した培養物において維持され、そして正常な一 次線維芽細胞培養物は細胞増殖の対数相の間でのみ、hnRNP-A1を発現する（図10 ）。 タンパク質及びその変異体は、天然源から単離され得、又は当業界において知 られている技法により化学的に合成され又は組換え的に生成され得る。化学的合 成のための技法は、J.M.Steward and J.D.Young,“Solid Phase Peptide Synthe sis”，W.H.Freeman & Co.， San Francisco，1969; M.Bodansky，など.，“Pep tide Synthesis”，John Wiley & Sons，Second Edition，1976、及びJ.Meienho fer,“Hormonal Proteins and Peptides”Vol.2，p.46，Academic Press，New Y ork，1983及びE.Schroder and K.Kubke,“The Peptides”，Vol.1，Academic Pr ess，New York，1965 に記載されている。 タンパク質、そのペプチド及び変異体は、少なくとも約90％の純度、好ましく は少なくとも約95％の純度、より好ましくは95％以上の純度のものである。 本発明はまた、前癌及び癌のための初期マーカーである、上皮タ ンパク質、そのペプチド及び変異体を、それぞれ別々の分子種として又は複合体 の形で含んで成る組成物を包含する。組成物は、配列番号１〜６により定義され る少なくとも１つのアミノ酸配列又はその一部を有する１又は複数のタンパク質 、そのペプチド及び変異体を含んで成る。１つの態様において、組成物は、少な くとも１つの異種核リボヌクレオタンパク質とアミノ酸配列相同性を共有する１ 又は複数のタンパク質、そのペプチド及び変異体を含んで成る。複合体の場合、 タンパク質、そのペプチド及び変異体の複合体は、共有又は非共有結合により一 緒に維持され得る。１又は複数のタンパク質及びその変異体が、複合体を形成す ることができる。１つの態様において、複合体は、hnRNP A2とアミノ酸配列相同 性を共有する少なくとも１つのタンパク質、そのペプチド又は変異体を含んで成 る。もう１つの態様において、複合体は、hnRNP B1とアミノ酸配列相同性を共有 する少なくとも１つのタンパク質、そのペプチド又は変異体を含んで成る。さら にもう１つの態様において、複合体は、hnRNP A2とアミノ酸配列相同性を共有す るタンパク質、そのペプチド又は変異体、及びhnRNP B1とアミノ酸配列相同性を 共有する第２のタンパク質、そのペプチド又は変異体を含んで成る。 本発明は、癌のための初期マーカーである上皮癌タンパク質、そのペプチド、 又は変異体を高レベルで精製するための方法を提供する。本明細書に記載される 方法は、出発材料に比較して、少なくとも20,000倍の精製率、好ましくは25,000 倍の精製率、より好ましくは25,000倍以上の精製率を達成する。 精製方法は、精製工程の間、タンパク質、そのペプチド又は変異体の分解を妨 げ又は阻止するための段階を取る。上皮タンパク質、ペプチド又は変異体の好結 果をもたらす精製のためには、多量の出発材料が好ましい。１つの態様において は、精製は、約 2.5×10¹¹ 個の細胞以上に腫瘍細胞を発現する模大な数のｐ31の使用により可能にされた。 本発明のタンパク質、そのペプチド及び変異体は、生物学的サンプルに存在す る類似するタンパク質、そのペプチド及び変異体を検出するために診断方法及び インビトロアッセイに使用され得る。前記アッセイは、前腫瘍及び腫瘍細胞の初 期検出及び発癌工程の定義を可能にする。 １つの態様において、単離され、そして精製されたタンパク質、そのペプチド 又は変異体は、その対応するタンパク質又はその変異体の検出のためのイムノア ッセイにおいて有用である。イムノアッセイは定性的であり且つ定量的である。 イムノアッセイは、上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体の量の上昇が前癌 及び癌の表示である、前癌及び癌細胞の検出において有用である。逆に言えば、 イムノアッセイは、処置又は介在を受ける患者から回収された上皮タンパク質、 そのペプチド又は変異体の量の不在又は低下が効果的処置の表示である、癌処置 又は介入の効率をモニターすることにおいて有用である。 本発明のイムノアッセイは、ラジオイムノアッセイ、ウェスターンブロットア ッセイ、免疫螢光アッセイ、酵素イムノアッセイ、化学ルミネセンスアッセイ、 免疫組織化学的アッセイ及び同様のものであり得、そしてインビトロ、インビボ 又は現場で実施され得る。ELISAについて当業界において知られている標準の技 法は、“Methods in Immunodiagnosis”，2nd Edition，Rose and Bigazzi，eds . John Wiley & Sons，1980; Campbellなど.,“Methods and Immunology”，W.A .Benjamin，Inc.，1964; 及びOellerich，M．1984，J.Clin.Chem.Clin.Biochem ． 22: 895-904に記載されている。そのような検出アッセイのために適切な生物 学的サンプルは、細胞、組織 生検抽出物、完全な血液、血漿、血清、痰、脳脊髄液、胸膜液、尿及び同様のも のを包含するが、但しこれらだけには限定されない。 競争イムノアッセイを用いての検出のための１つの態様においては、上皮タン パク質、そのペプチド又は変異体を含むと思われる試験サンプルが、抗原−抗体 複合体を形成するために、前記タンパク質、そのペプチド又は変異体と反応する ことが知られている抗体と流体相において反応せしめられる。次に、この流体相 が、本発明の表面結合されたタンパク質、ペプチド又は変異体を有する固相試薬 上に置かれる。複合体の形で存在しない抗体は、その表面結合されたタンパク質 、そのペプチド又は変異体に結合しない。前記表面に結合される抗体の量は、当 業界において知られている方法により決定される。固体表面試薬は、固体支持体 材料にタンパク質を結合するために、既知の技法により調製され得る。それらの 結合方法は、支持体へのタンパク質又は変異体の非特異的吸着、又は固体支持体 へのタンパク質又は変異体の共有結合を包含するが、但しそれらだけには限定さ れない。１つの態様においては、抗体は、アメリカ特許第 4,569,788号に記載さ れる 703D4である。 ラベルは、適切な螢光分析又は比色分析試薬の存在下で固体支持体をインキュ ベートすることによって検出される酵素であり得る。他の検出できるラベル、た とえば放射性ラベル又はコロイド状金及び同様のものが使用され得る。 本発明のタンパク質、そのペプチド及び変異体は、単独で、又は他の試薬、た とえば抗体と組合して、イムノアッセイへの使用のためには、キットの形で調製 され得る。 本発明のタンパク質、そのペプチド及び変異体は、上皮タンパク質、そのペプ チド又は変異体と免疫反応性である特異的抗体及びその抗原結合フラグメントを 誘発するために使用され得る。正常細胞 の前癌細胞への形質転換に関連するエピトープを認識する抗体又はその抗原結合 フラグメントは、特に重要なものである。エピトープは、正常細胞には存在しな いか又は低量で存在し、そして前癌及び癌細胞においては、ひじょうに発現され る。１つの態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、後−翻訳変性 を有する上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体と反応し、ここで前記後−翻 訳変性は前癌又は癌細胞の表示である。抗体は、アメリカ特許第 4,569,788号に 開示される方法により、又は当業界において知られている他の方法により生成さ れ得る。そのような抗体は、上皮タンパク質を検出するために、及びタンパク質 の後−翻訳変性を検出するために、イムノアッセイにおいて有用である。抗体又 はその抗原結合フラグメントは、癌処置又は介入の効能を決定することにおいて 中間エンドポイントマーカーとして有用である。 本発明は、上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体（その発現又は過剰発現 が前癌又は癌細胞の表示である）をコードする核酸配列のすべて又は一部を含ん で成る精製され、そして単離された DNA分子を提供する。 増幅は、抗原ｐ31を精製するために使用される２種の肺癌細胞系、HCI-H157及 びNCI-H720を包含する３種の源からの遺伝子ライブラリーにより行なわれた。対 照として、正常な気管支上皮細胞の短時間培養物からの遺伝子がまた、増幅され た(Clonetics NHBE2129細胞、San Diego，CA)。次に、それらの遺伝子が、Invit rogen Corp No.411208を用いて、pCRIIベクター中に挿入され、そしてＥ．コリにおいて増 殖された。hnRNP遺伝子を含むプラスミドを有する、hnRNP遺伝子A2／B1の３種の 異なった源からのＥ．コリ形質転換培養物が、受託番号ATCC 69906（Ｅ．コリ N BER NP1C、正常）、ATCC 69907（Ｅ．コリ157RNPc 1B）及びATCC 69908（Ｅ．コリ720RNPc1A）として、1 995年10月２日、American Type Calture Collection，12301 Parklawn Dr.，Roc kville，MD にブダペスト条約に基づいて寄託された。完全な hnRNP遺伝子を増 幅するために使用されるプライマーのための配列は、次の通りであった： CTA CAG CGC CAG GAC GAG T （センス） CCC ATG GCA AAT AGG AAG AA（アンチセンス） それらのプライマーは、両A2／B1遺伝子の十分な長さの増幅を可能にした。 １つの態様において、上皮タンパク質をコードする単離された DNA又はその一 部は、図１〜３に開示される配列の部分と実質的に相同である。本発明の核酸配 列は図１〜３上に示される程度からある一定の程度に変化することが予期される 。図１〜３上の配列は、悪性ヒト骨肉腫細胞系からのcDNAクローンに由来した。 本発明は、正常細胞及び前悪性細胞から単離された DNA又はその一部を包含する 。 遺伝子コードの縮重により、本発明の上皮タンパク質、そのペプチド及び変異 体の生成を指図することができる DNA配列を導びくであろうヌクレオチドの多く の選択が行なわれ得ることが理解されるべきである。本明細書に示される配列に 対して機能的に同等であり、又は上皮タンパク質の類似体の生成を指図すること ができる配列に対して機能的に同等である DNA配列は、本発明内に包含される。 本発明はまた、原核又は真核宿主細胞において増殖され、そして発現され得る 、組換え DNA分子及びベクターを提供する。本発明への使用のために適切な発現 ベクターは、核酸配列又はその一部に操作可能的に連結される少なくとも１つの 発現制御要素を含んで成る。発現制御要素は、核酸配列の発現を制御し、そして 調節するため にベクターに挿入される。発現制御要素の例は、lac システム、ファージλのオ ペレーター及びプロモーター領域、酵母プロモーター、及びワクシニアウィルス 、アデノウィルス、レトロウィルス、又はSV40に由来するプロモーターを包含す るが、但しそれらだけには限定されない。他の操作コドン、ポリアデニル化シグ ナル、及び与えられた宿主システムにおける核酸配列の適切な転写及び続く翻訳 のために必要とされる他の配列が存在する。さらに、発現ベクターは、宿主シス テムにおける核酸含有発現ベクターのトランスファー及び続く複製のために必要 ないづれかの追加の要素を含むことが理解される。そのような要素の例は、複製 の起点及び選択マーカーを包含するが、但しそれらだけには限定されない。その ような発現ベクターは、市販されており、又は当業者に知られている方法を用い て容易に構成される(たとえば、F.Ausubelなど、1987,“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley & Sons，New York，NY)。例としては、ワク シリアウィルスベクター、アデノウィルスベクター、ヘルペスウィルスベクター 及びバキュロウィルスベクターを挙げることができるが、但しそれらだけには限 定されない。上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体をコードする核酸配列の すべて又は一部を含む組換え発現ベクターが、宿主生物又は細胞中に形質転換さ れ、トランスフェクトされ、又は他方では挿入される。本発明の上皮タンパク質 をコードする核酸配列により形質転換された宿主細胞は、真核細胞、たとえば動 物、植物、昆虫、藻類及び酵母細胞、及び原核細胞、たとえばＥ．コリ、Ｂ．サ ブチラス及び同様のものを包含する。好ましい真核細胞は、COS細胞、CHO細胞、 昆虫細胞、気管支上皮細胞、特に発現された上皮タンパク質、そのペプチド又は 変異体の後−翻訳変性を可能にする真核細胞を包含するが、但しそれらだけには 限定されない。核酸配列を担持するベ クターが細胞中に導入され得る手段は、マイクロインジェクション、エレクトロ ポレーション、DEAE−デキストランを用いてのトランスダクション又はトランス フェクション、リポフェクション、リン酸カルシウム、又は当業者に知られてい る他の方法を包含するが、但しそれらだけには限定されない（Sambrookなど、19 89,“Molecular Cloning．A Laboratory Mannal”，Cold Springs Harbor Press , Plainview，New York）。 発現された組換え上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体、当業界において 知られている方法、たとえばクーマシーブルー染色、銀染色、及び本明細書に記 載されるような上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体に対して特異的な抗体 を用いてのウェスターンブロット分析に検出され得るが、但しそれらだけには限 定されない。 本発明の組換え上皮タンパク質、そのペプチド及び変異体は、本明細書に記載 されるプロトコール、たとえばアニオン交換クロマトグラフィー、分離用等電点 電気泳動、ポリマー基材のC₁₈HPLC及び分析用 C₄HPLCを用いて単離され、そして 精製され得る。 上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体の遺伝子又は遺伝子生成物は、哺乳 類生物学的サンプル、たとえば血液、血清、糞、羊水、痰、骨組織生検検体及び 同様のものにおいて検出され得る。少なくとも１つの hnRNP遺伝子又は遺伝子生 成物と配列相同性を有する上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体の検出が、 特に興味あることである。身体サンプルをスクリーニングすることによって、前 癌細胞の初期検出が達成され得、そして初期処置が前癌細胞の癌細胞への形質転 換を阻害し、又は妨げるために哺乳類に提供され得る。さらに、化学療法及び／ 又は放射性療法の効率が、遺伝子又は遺伝子生成物の変更された発現又は過剰発 現について身体サンプルの試験によりモニターされ得る。 癌への素因が、上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体をコードする遺伝子 の変更された発現及び／又は過剰発現について哺乳類生物学的サンプルを試験す ることによって確かめられ得る。この素因は、上皮タンパク質、そのペプチド又 は変異体の過剰発現及び／又は種々の発現生成物を検出するために哺乳類からの いづれかの組織又は流体から除去される細胞からの DNA又は RNAを試験すること によって決定され得る。本発明の診断方法は、上皮タンパク質、そのペプチド又 は変異体が腫瘍形成において役割を有するいづれかの癌に適用できる。肺癌、骨 癌、腎癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、結腸癌、黒色腫、骨髄腫、頭部癌、首部癌 及び同様のものが、特に興味あるものである。 診断方法においては、哺乳類から採取された生物学的サンプルから単離された ゲノム核酸配列が、癌のための初期マーカーである上皮タンパク質をコードする 核酸配列又はその一部と、前記配列間のハイブリダイゼーション及びハイブリダ イズされた配列の検出を可能にする条件下で接触せしめられる。正常な核酸配列 に比較しての、ゲノム核酸配列の存在又は変更されたゲノム核酸配列の存在は、 哺乳類における前癌又は癌の徴候である。生物学的サンプルにおける DNA，mRNA 、及び／又はmRNAの交互のスプライス形の高められた存在は、哺乳類における前 癌及び癌の徴候である。 本発明のオリゴヌクレオチドは、上皮タンパク質をコードする遺伝子の検出及 び前記遺伝子における変更又は突然変異の検出において有用である。オリゴヌク レオチドは、癌処置及び介入に対する上皮細胞の応答をモニターするためにも使 用され得、そしてそれ自体、重要な中間エンドポイントマーカーである。 本発明のもう１つの観点においては、オリゴヌクレオチドプライマーが、ポリ メラーゼ鎖反応を用いて、上皮タンパク質、そのペプ チド又は変異体をコードする遺伝子のすべて又は一部の合成のために有用である 。一対の一本鎖 DNAプライマーは、遺伝子の DNA合成を増幅するために遺伝子内 又はそれを取り囲む配列にアニールされ得る。ポリメラーゼ鎖反応は、Saikiな ど., 1988，Science 239: 487-491; アメリカ特許第 4,683,202号及び第 4,6 83,195号、及びMethods in Enzymology ，155: 335-350，1987により記載される ように、当業界において知られている。遺伝子を増幅するために使用され得る特 定のプライマーは、下記配列及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには 限定されない： 5′GAGTCCGGTTCGTGTTCGTC3 ′ （配列番号11）； 5′TGGGCTCTCATCCTCTCCTATTA3′（配列番号12）； 5′CTACAGCGCCAGGACGAGT3′ （配列番号13）； 5′CCCATGGCAATAGGAACAA3′ （配列番号14）； TGTTCTGTTACCTCTGGGCTCTCA （配列番号15） 特定対のプライマーが、本発明の上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体を コードするcDNAをクローン化するために使用され得る。PCRを用いてcDNAをクロ ーン化するために使用され得るプライマー対の例は、配列番号11及び12；配列番 号13及び14；配列番号11及び15；及び同様のものを包含するが、但しそれらだけ には限定されない。 hnRNP A2のための遺伝子、及びB1のための遺伝子は、細胞系NCI-H157，NCI-H7 20、及び気管支上皮細胞の短時間培養物から創造された遺伝子のライブラリーと の PCR反応から回収されて来た。適切な遺伝子生成物の存在は、一組の保存され た hnRNPプライマーによる PCRにより確かめられた（センスプライマー５′−３ ′、GCTCGGCTGCGGGAAATC（配列番号23）及びアンチセンスプライマー、TAAGCTTT CCCCATTGTTCGTAGT（配列番号20）を、予測された 146bpの PCR生成 物と共に使用した）。それらの遺伝子を含むプラスミドは、ブダペスト条約に基 づいてATCCに寄託される。正常な気管支細胞から得られた遺伝子に関して癌細胞 系との遺伝子配列における差異が決定された。すべての源からの遺伝子はひじょ うに相同であることが見出された。 さらに、タンパク質生成物は、遺伝子生成物における後翻訳変化をプロセッシ ングするための代謝機構を有する発現システムにおける癌細胞系NCI-H157及びNC I-H720からのhnRNP A2／B1遺伝子から発現され得る。最終タンパク質が、正常な 気管支細胞系からのhnRNPA2／B1遺伝子生成物の生成物と比較される。前記タン パク質はそれらの異なった細胞源から精製され、臭化シアン消化が行なわれ、そ して次に、生成物が二次元電気泳動又はマススペクトロメトリーを用いて分析さ れる。hnRNPの正常源に比較してのNCI-H157又はH720からの遺伝子生成物におけ るいづれかの差異は、決定的な突然変異によるものである。 また、上皮タンパク質又はその一部をコードする核酸配列に基づいてのオリゴ ヌクレオチド対の組合せは、本明細書及び Ausubelなど、1987,“Current Proto cols In Molecular Biology”Chapter 15，John Wiley & Sons，New York，New Yorkに記載されるように、選択された RNA核酸配列を増幅するために逆転写酵素 ポリメラーゼ鎖反応（RT-PCR）を用いて生物学的サンプルにおけるmRNAを検出す るための PCRプライマーとして使用され得る。前記オリゴヌクレオチドは、種々 の製造業者により市販されている自動装置により合成され得る。 本発明はまた、上皮タンパク質、そのペプチド及び変異体をコードする DNA及 び RNAの検出のための現場 RCR及び現場RT-PCRを包含する。その技法は、標的核 酸のコピー数がひじょうに少ない場合、 又は異なった形の核酸が識別されるべきである場合に好ましい。前記方法は、正 常な細胞から前癌及び癌細胞を検出し、そして区別することにおいて特に重要で ある。その方法はまた、癌細胞になる予定である上皮細胞のサブセットを検出す ることにおいても有用である。現場 PCR生成物の同一性の確認は、収容された³² Ｐ−ラベルされたプローブによる現場ハイブリダイゼーションにより、又は予測 される塩基対サイズを確証するためにサザンブロット分析を用いて生成物を試験 することにより達成される。同等の転写／翻訳発現が、一連の組織断片に対する 連続した現場RT-PCR／免疫組織化学分析により示される。 いくつかの組のプローブが、組織及び細胞における hnRNPの発現分析のために 使用され、そて hnRNPプローブがいかにして生成されるかにかかわらず、すべて のアンチセンス対センスプローブについて類似する結果が示された。第１組のプ ローブは、pCRIIベクター（Invitrogen）中にhnRNP A2-PCR生成物（肺癌細胞系N CI-H720から生成される）を挿入することによって構成された。アンチセンスプ ローブを生成するためには、Sp６プロモーターにより駆動される 1.1kbの生成物 を生成するEcoRＶ消化が行なわれた。センスプローブのためには、同じ構成体が 用いられたが、しかし Rpn１により消化され、そしてＴ７生成物により駆動され る 1.1kb生成物を生成した。 追加の構成体が、Ｔ７プロモーターにより駆動される 0.8kbのセンスプローブ を生成するために、十分な長さのhnRNP A2構成体を DraIIIにより消化すること によって生成された。アンチセンスプローブは、十分な長さのhnRNP A2アンチセ ンス構成体を NdeＩにより消化することにより生成され、Ｔ７プロモーターによ り駆動される 0.7kbのアンチセンスプローブが生成された。 肺癌細胞系のために誘導された PCR配列を用いるもう１つの組のプローブが、 DraIII消化を用いて生成された。これは、Ｔ７プロモーターにより駆動される 0 .7kbのセンスプローブを生成するために、ゲル精製され、次にインビボ転写シス テム(DIG RNAラベリングキット、Boehringer Mannheim)においてインビトロ転写 される２種のヌクレオチド生成物(1.2kbのＴ７及び 3.8kbのSp６)を生成した。 他のゲル生成物がまた、転写され、そしてSp６プロモーターにより駆動される 0 .4kbのアンチセンスプローブを生成した。 もう１つの組のプローブのためには、Gen Bankと称する十分な長さのhnRNP A2 挿入体が使用された。この十分な長さのhnRNP A2遺伝子配列が、pcDNA３ベクタ ー（Invitrogen）中に挿入された。センスプローブのためには、前記構成体がEc oRＶにより消化され、Ｔ７プロモーターにより駆動される 1.8kbの生成物が生成 された。アンチセンスプローブのためには、同じ構成体がBamH１により消化され 、Sp６プロモーターにより駆動される 1.6kbの生成物が生成された。 前記すべてのプローブは、アッセイ、たとえば現場ハイブリダイゼーション及 び同様のものにより細胞、組織及び抽出物におけるhnRNP mRNAを検出するために 有用である。 本発明は、癌の進行を予測する識別機能を生成するためのコンピューター処理 された方法を包含する。前記方法は、正常又は典型的な細胞に比較して、an64異 型又は異常細胞、たとえば癌又は前癌細胞に対してユニークな１又は複数のパラ メーターを同定するために像分析を利用する。コンピューター分析を用いて、識 別機能が由来するそのユニークなパラメーターが同定される。その識別機能は、 究極的に癌を進行するであろう個人の予測において有用である。その方法は、生 物学的サンプルからの像がコンピューター助力の像分 析のために獲得され得るいづれかのアッセイにおいて有用であるので、いづれか 特定のアッセイに限定されない。１つの態様においては、像はデンシトメトリー 像である。もう１つの態様においては、像は螢光像である。 本発明はまた、哺乳類、好ましくはヒトにおける癌及び前癌のコンピューター 助力の決定方法を提供する。前記方法は、生物学的サンプル、たとえば細胞、抽 出物及び組織における hn-RNP mRNAの発現の定性的且つ定量的差異を検出する。 １つの態様においては、癌及び前癌のコンピューター助力決定方法は、hn-RNP mRNAに対して陽性の細胞、抽出物又は組織を決定するために、像デンシトメト リー、好ましくは二重波長像デンシトメトリーを利用する。その方法においては 、少なくとも１つのラベルされたプローブが、細胞、抽出物、又は組織に存在す る hn-RNP mRNAとハイブリダイズするために使用される。細胞、抽出物又は組織 は、使用されるラベルのために適切な光の波長により照射される。 第２のラベルは、前記方法において任意に使用され得る。その第２ラベルは、 hn-RNP mRNAとハイブリダイズしない。その第２ラベルは、細胞、抽出物又は組 織内の構造体を区別するために使用され得る。１つのそのようなラベルは、クロ モゲン、たとえばヘマトキシリンブルー及び同様のものであるが、但しそれらだ けには限定されない。２種のラベルが使用される場合、個々のラベルのための適 切な波長が使用される。 １つの態様においては、適切な波長は、光源、たとえば Koehler照明により供 給される。その光源は、光学像獲得手段が生物学的サンプルのビデオ像を収集で きるよう、生物学的サンプルを照射するために使用される。ビデオ像収集手段は 、像の代表的なアナログ電子シグナル中に生物学的サンプルのビデオ像を連結す る。 ビデオ像手段、たとえばビデオカメラは、入力として光を受動し、そして標準 のアラログTVビデオフレームフォーマット化された出力シグナルを供給するいづ れかの適切な技法である。１つの態様において、そのビデオ像手段は、Hamamats u Photonic Systems(Japan)からの高解像度ビデオカメラである。そのビデオ像 収集手段からの標準のアナログTVビデオフレームフォーマットシグナルは、当業 界において知られているように、プログラムできるアナログ−デジタル変換器の 入力に供給される。その変換器は、ビデオ像収集手段からのアナログビデオシグ ナルをデジタル値に変換する。１つの態様において、変換器は、デジタル像処理 器、すなわち Universal Imaging，West Chester，PAからのMetamorph v2.0であ る。 hn-RNP mRNAに対して陽性の細胞、抽出物又は組織は、オペレーターによる像 の直接的な調査により、又はコンピューター検出により可視化に決定され得る。 hn-RNP mRNAに対しての陽性細胞のコンピューター助力決定の場合、識別機能が 陽性細胞、抽出物又は組織を計算するために使用される。コンピューター処理さ れる決定は、対象が癌のいづれか臨床学的明示を有する前、その対象における前 癌を決定するためのアッセイを可能にする。１つの態様においては、癌の臨床学 的明示を有さない個人から採取された生物学的試験サンプルの約ゼロの識別機能 値又はゼロ以下の値は、その個人が癌を進行せしめるであろう予測である。本発 明のhnRNP mRNAのコンピューター助力検出方法は、対象が癌を進行せしめるであ ろう確立を予測する上で高い精度を可能にする。その方法は、癌を進行せしめる であろうそれらの対象を予測する際、少なくとも約80％又はそれ以上の精度を付 与する。１つの態様においては、その精度のレベルは約 100％である。この方法 は、癌を進行する危険な状態での個人の初期検出を可能にし、そして癌を妨げ又 は阻止するために個人の連 続したモニターリング及び初期処置のための機会を提供する。 遺伝子の過剰発現及び遺伝子生成物のその得られる過剰活性は、細胞増殖及び 腫瘍形成の調節解除に寄与することができる。従って、本発明はまた、上皮タン パク質をコードする遺伝子の発現を特異的に調節することにおいて特に有用であ り得るアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。 本明細書で使用される場合、アンチセンス療法とは、標的核酸配列に対して特 異的に結合する DNA又は RNAオリゴマー又はそれらの誘導体の投与又は現場生成 を意味する。前記結合は、従来の塩基対相補的によってであり、又はたとえば、 結合 DNA複合体の場合、二重ヘリックスの主要溝における特異的な相互作用を通 してであり得る。その標的 DNA又は RNAに特異的に結合することによって、DNA 又は RNAの機能が阻害され又は抑制される。 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド残基の数で変化す ることができ、そして約３〜約 100個のヌクレオチド残基、好ましくは約３〜約 50個のヌクレオチド残基、より好ましくは約３〜約25個のヌクレオチド残基の範 囲であり得る。１つの態様において、オリゴヌクレオチドは、約20個よりも少な いヌクレオチド残基を有する。もう１つの態様において、オリゴヌクレオチドは 、約15〜約20個のヌクレオチド残基を有する。 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、癌の初期検出のためのマーカー である上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体の発現を妨げるために構成され る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上皮タンパク質をコードする 核酸に結合し、そしてその転写及び／又は翻訳妨げ、又は阻害するヌクレオチド である。Burd，C.G.など、Science ，Vol.265，pp.615-621，1994 により定義さ れるようなhn-RNPの構造体、すなわちhn-RNPのアルギニンに富んで いるモチーフ、RGGbx，α２，TI及びβ４領域の構造体に類似する１又は複数の 二次構造体に結合し、そしてその転写及び／又は翻訳を妨げ又は阻害するアンチ センスオリゴヌクレオチドが特に興味の対象である。 hnRNP A2／B1は、癌形成の工程において重要である種々の細胞機能に関与され て来た。それらの機能は、相互のスプライス部位スイッチ活性の調節、RNA（DNA ）−タンパク質相互作用、及びRNA（DNA）アニーリングを包含する。特に、hnRN P A／B タンパク質は、テロメア DNA反復体(TTAGGG)_n及び RNA同等物(UUAGG)_nに 対して高い親和性で結合する主要な核タンパク質である。スプライス部位調節又 はテロメア結合との相互作用に関与する hnRNP A／B タンパク質の部位のための 遺伝子コード領域を変性するアンチセンス方策は、進行性癌形成における hnRNP A／B タンパク質の役割を阻害するための段階である。アンチセンス方策のため の標的物は、Ｇドメインが hnRNP機能に対して主要な効果を有するので、それを 含む。この領域は、モチーフの反復性の不安定反復体(GN^F _Y GG^S _G RG)(ｎ＝12) から多くは構成される。hnRNP分子のこのグリシンに富んでいる領域は、テロメ ア領域との相互作用を包含するヌクレオチド結合のようなタンパク質機能をもた らす（Ishikawa，F.など、Mol.Cell.Biol. Vol.13，4301，4310，1993; McKay， S.J.など、Nucleic Acids Res. Vol.20: 6461-64，1992）。癌を阻害するための アンチセンス方策は、それらの hnRNP領域の翻訳を阻害するであろう。 発癌へのhnRNP A2／B1遺伝子の役割に対して決定的であるそれらの同じ領域は また、それらの２種の遺伝子生成物の機能をブロックするペプチドアンタゴニス トを開発するための適切な標的物でもあり得る。ペプチドアンタゴニストは、hn RNP遺伝子についてちょうど論じられた hnRNPタンパク質の匹適できる領域を標 的決定するで あろう。 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アミノ酸配列： ATVEEVDAAMNARPHKVDGRVVEPKRAVS （配列番号16）又はその一部： DDHDSVDKIVIQKYHTVNGHNCEVRKALS （配列番号17）をコードする核酸配列に対して 相補的である核酸配列、又はその一部、及び同様の物を含んで成る。 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、図１〜３の hn-RNP A1，A2 ，B1の配列又はその一部に対して相補的な核酸配列を包含するが、但しそれだけ には限定されない。 本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１又は複数の変性された結合基、 糖残基及び／又は塩基を含むことができる。本発明の変性されたオリゴヌクレオ チドは、生理学的及び組織培養条件下での分解に対して耐性であり、そして特に 、エキソヌクレアーゼによる分解に対して耐性である。そのような変性は、メチ ルホスホロチオエートヌクレオチド間連鎖、ホスホロチオエート連鎖、ホスホラ ミデートヌクレオチド間連鎖、３′末端キャップ及び３′ヘアピンループ構造を 包含するが、但しそれらだけには限定されない。そのような変性されたオリゴヌ クレオチド及びその生成方法は、アメリカ特許第 5,264,562号、第 5,194,599号 及び第 5,256,775号、Padmapriya and Agrawal，Bio.Org ．& Med.Chem.Lett．， 3，761(1993)，Temsamaniなど.，Ann.N.Y.Acad.Sci ． 660，318(1992)，Tangな ど.，Nucleic Acids Res.，21，2729（1993）に記載される。そのような変性さ れたオリゴヌクレオチドの例は、オリゴヌクレオチドメチルホスホロチオエート 、３′端−キャップされたオリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエート、及 びそれらの３′端でヘアピンループ構造を有するオリゴヌクレオチドホスホロチ オエートを包含するが、但しそれらだけには限定されない。 本発明のオリゴヌクレオチドはまた、細胞中へのそれらの侵入を促進するため に基の付加により変性され得る。そのような基は、非ポリペプチドポリマー、ポ リペプチド、親油性基及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定さ れない。親油性基とは、オリゴヌクレオチドの細胞膜への結合、それとの併合及 びそれの通過を可能にするために、外部細胞表面と化学的に適合できる成分を言 及する。そのような親油性基の例は、脂肪酸及び脂肪アルコール、並びに長鎖の ヒドロカルビル基である。そのような変性されたオリゴヌクレオチド及び製造方 法は、アメリカ特許第 5,256,775号に開示される。 オリゴヌクレオチド又はその混合物を用いて処理され得る癌は、黒色腫、転移 、腺癌、胸腺腫、リンパ腫、肺癌、肝癌、結腸癌、腎癌、膵臓癌、脳癌及び同様 のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない。本発明のオリゴヌクレ オチドを用いての特に興味あることは、hn-RNP遺伝子生成物の過剰発現又は変更 された遺伝子生成物の発現に関連する癌を包含する。 処理方法においては、本発明のオリゴヌクレオチドは、予防的に又は治療的に 提供され得る。オリゴヌクレオチド又はその混合物は、単位投与形で提供され、 個々の投与形は、医薬組成物を形成するために、医薬的に許容できる希釈剤又は キャリヤー、たとえばリン酸緩衝溶液と共に、所望する効果を生成するよう計算 された。予定された量のオリゴヌクレオチドを含む。さらに、オリゴヌクレオチ ドは、固形で配合され、そして使用の前、再溶解され又は懸濁され得る。医薬組 成物は任意には、他の化学療法剤、抗体、抗ウィルス剤、外因性イムノモデュレ ーター又は同様のものを含むことができる。 投与路は、静脈内、筋肉内、皮下、経皮内、腹腔内、クモ膜下腔 、エクソビボ、及び同様の路であり得る。投与はまた、粘膜又は経皮手段によっ てであり、又は化合物は経口投与され得る。粘膜又は経皮投与のためには、浸透 剤は、配合に使用されるように、浸透されるべきバリヤーに対して適切である。 そのような浸透剤は、一般的に当業界において知られており、そしてたとえば、 経皮投与のためには、胆汁塩及びフシジン酸誘導体を包含する。さらに、界面活 性剤が浸透を促進するために使用され得る。経皮投与は、鼻腔噴霧を通してであ り得、又は坐剤を用いてであり得る。経口投与ためには、オリゴヌクレオチドは 、従来の経口投与形、たとえばカプセル、錠剤又は強状剤中に配合される。局所 投与のためには、本発明のオリゴヌクレオチドは、一般的に当業界において知ら れているように、軟膏、膏薬、ゲル又はクリーム中に配合され得る。 哺乳類、好ましくはヒトに本発明のオリゴヌクレオチドを供給する場合、投与 されるオリゴヌクレオチドの用量は、哺乳類の年齢、体重、身長、性別、一般的 な医学的状態、これまでの病歴、疾病の進行、腫瘍重症度、及び同様のもののよ うな要因に依存して変化するであろう。他の治療薬物が本発明のオリゴヌクレオ チドと一緒に投与され得る。 オリゴヌクレオチドを用いての処置の効能は、上皮タンパク質、そのペプチド 又は変異体のDNA，RNA又は遺伝子生成物の濃度又は活性、腫瘍症候の緩解、又は 癌に関連する病理学又は徴候の低下における変更の決定により評価され得る。 さらに、治療剤として使用するためには、本発明のオリゴヌクレオチドは、そ のオリゴヌクレオチドが相補的である上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体 のDNA，RNA又はその一部の存在又は不在を検出するための診断試薬として使用さ れ得る。少なくとも１つのhn-RNP又はその一部の検出が特に興味あることである 。そのような 診断試験は、オリゴヌクレオチドを、次に従来の手段により検出されるその特異 的標的分子に結合することによって行なわれる。たとえば、オリゴヌクレオチド は、放射性ラベル、螢光ラベル、化学ルミネセンスラベル及び同様のものを用い てラベルされ得、そしてラベルの存在が検出され得る。標的分子の存在は、イン ビトロ又はインビボで検出され得る。 本発明のもう１つの観点は、低発現細胞系、たとえば正常な気管支、乳、結腸 細胞、NIH 3T3細胞、及び同様のものの短時間培養物中への、上皮タンパク質、 そのペプチド又は変異体をコードする遺伝子又はその遺伝子の複数のコピーの導 入により前記遺伝子を過剰発するための方法である。特に興味あるものは、肺、 乳、腎臓、皮膚、骨、前立腺、卵巣及び同様のものから得られた、遺伝子の導入 のための正常な低発現細胞系である。遺伝子の導入は、発現ベクター、たとえば PCRIIに遺伝子を配置し、そしてそのベクターを低発現細胞系中にトランスフェ クトすることによって達成される。ヌードマウスにおける形質転換された表現型 、たとえば接触阻害及び腫瘍形成性のクローン原性的欠失に関連する特徴が評価 される。前癌又は癌表現型を示す過剰発現細胞系は、上皮タンパク質の発現をダ ウンレギュレートする治療剤についてのスクリーニングにおいて有用である。 本発明はまた、癌のための初期マーカーである上皮タンパク質、そのペプチド 又は変異体をコードする遺伝子の１又は複数のコピーをそのゲノム中に組込んで いるトランスジェニック動物を提供する。トランスジェニック動物を生成するた めの一般的な方法は、アメリカ特許第 5,175,384号(Krimpenforなど.)、第 5,17 5,383号(Lederなど.)、第 5,175,385号(Wagnerなど.)、第 4,870,009号(Eransな ど.)、及び第 5,174,986号(Berns)に記載される。遺伝子の組込 みは、上皮タンパク質の複数形又は変異体の過剰発現、変更された発現又は発現 をもたらす。得られるトランスジェニック動物は、癌の進行を受けやすく、そし て身体の１又は複数の位置で、促進された速度で癌を進行せしめることができる 。このモデルは、hnRNP、及び少なくとも１又は複数の hnRNPと配列相同性を共 有する上皮タンパク質のアップ及びダウンストリーム生物学の解明を可能にする であろう。それらの実験は、初期検出のための追加の確認バイオマーカー、及び 形質転換された細胞を再調節するための追加の標的を提供することができた。動 物モデルはまた、癌処置のための化学療法薬物のスクリーニングにおいても有用 である。 特定態様の前述の記載は、本発明の一般的な性質を十分に表わすので、他のこ とは、現在の知識を適用することによって、一般的な概念からそれることなしに 、そのような特定の態様を種々の適用のために容易に変性し、そして／又は採用 することができ、そして従って、そのような適合性及び変性は、開示される態様 の同等物の意味及び範囲内で理解されるべきである。 言及されるすべての引例及び特許は、引用により本明細書に組込まれる。 例 １ 材料及び方法 電気泳動及びウェスターンブロット： 703D4は、IgG2b_kモノクローナル抗体である⁽⁶⁾。抗体を、プロテインＡセファ ロースカラム及び不連続グリシンNaCl／クエン酸塩グラジエントを用いてマウス 腹水から親和性精製した。抗原精製を分析するために、出発材料及び下記個々の 精製段階（イオン交換、IEF及びHPLC）のアリコートを、トリス−トリシン又は トリス−グリシン−SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）のい づれかによりアッセイした。アリコートを凍結乾燥し、そして５％メルカプトエ タノール又はトリシンを含むトリス−グリシンサンプル緩衝液又はトリシンサン プル緩衝液のいづれかにおいて再構成し、又は直接的に希釈し、そして10〜20％ トリシン又は４〜20％トリス−グリシンゲル(NOVEX)上で電気泳動した。複数ゲ ル上のタンパク質を30Ｖで 1.5〜2.0 時間、PVDF膜に電気泳動的に移し、クーマ シーブリリアントブルーにより染色し、又はリン酸緩衝溶液中、１％ウシ血清ア ルブミンにより４℃で一晩ブロックし、そしてマウスモノクローナル抗体 703D4 を用いてイムノブロットした⁽⁶⁾。ウェスターントランスファーFVDF膜上の結合 された抗体を、放射性ヨー素化されたスタフィロコーカル（staphylococcal）プ ロテインＡの直接的な結合を用いて検出した。ブロットを、Phosphorimager（Mo lecular Dynamics，CA）及び Kodak XAR及び XRPフィルム上で像化した。 細胞副画分の調製： ヒト腫瘍細胞系、たとえば抗原精製のために使用される NSCLC細胞系NCI-H720 （類癌腫）及びNCI-H157(鱗状ATCC CRL-5802)を、５％ウシ胎児血清により補充 された RPMI-1640培地(Gibco)において、37℃及び５％ CO₂で増殖せしめた。細 胞を収穫し、そして氷冷却されたダルベッコリン酸緩衝溶液（pH 7.4）により２ 度洗浄し、そして MES緩衝液〔17mMのモルホリノエタンスルホン酸、20mMのEDTA 、250mMのスクロース〕に再懸濁し、そして手で保持されたホモジナイザーにお いて均質化した。トリパンブルー排除を使用し、均質化に続いて、90％以上の細 胞溶解を確かめた。その溶解物を、Beckman polyallomer遠心分離管に移し、そ してBeckman XL90遠心分離機及びSW41ローターを用いて、150,000×ｇで60分間 、遠心分離した。膜及び核画分を含むペレットを保持し、そして細胞質ゾル上清 液を捨てた〔Krajewski，1993, Concer Res. 53: 4701-4714〕。 ペレット画分を、１％ Tween-20 を含む抽出緩衝液(0.015ＭのNaCl、10mMのト リス、pH 7.4、５mMのEDTA)に再懸濁した。サンプルを、時おり撹拌しながら、 １時間、氷上でインキュベートし、そして16,000×ｇで20分間、遠心分離した。 次に、上清液をDI水により３倍に希釈し、そしてpH 6.5に調節した。 イオン交換クロマトグラフィー及び液相等電点電気泳動： トリス−HCl、pH 6.5により平衡化されたDupont Bio Series WAX(弱アニオン 交換)カラム（MacMod，Chads Ford，PA）を用いた。界面活性剤により溶解され たタンパク質を、2.0ml／分でカラムに送り、そして画分をプールし、そして凍 結乾燥せしめた。703D4免疫反応性材料は、50mMのNaClの存在下で樹脂に対して 弱く結合し、そしてこのカラムから結合されなかった材料を溶出した。 抗原陽性画分を、３％の CHAPS、10％のグリセロール、及び 0.8％のampholin es，pH３〜10(Bio Rad，Richmond，CA)を含む、45mlの最終体積の４Ｍ尿素に再 懸濁した。このタンパク質−両性電解質カクテルを、急冷された Rotofor分離用 等電点電気泳動(IEF)装置(Bio-RAD，Richmond，CA)(一定の12ワットで操作され る)に負荷した。最大電圧、通常1200Ｖに達した後、１時間で、画分を真空収集 により収穫した。操作時間は約４時間であった。pH値を、収穫された20の画分に ついて決定した。703D4抗原を、pH８〜９の画分において濃縮した。３種の IEF 操作（３種の細胞バッチ）の個々からの２種の最とも陽性の画分を、HPLC精製の ためにプールした。 HPLC： 使用されるすべての有機溶媒は、HPLCグレードであった(Burdick & Jackson， Muskegon，WI)。抗原に対して陽性の等電点電気泳動画分を、18Mohm水により２ 倍に希釈し、１％のトリフルオロ酢酸( TFA)(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)により酸性化し、そして５％アセト ニトリル／0.1％ TFAにより平衡化された10mm×10cmの多孔性灌流ポリマーＣ₁₈ カラム（Per Septive Biosystems，Framingham，MA）に適用した。タンパク質を 、15ml／分の流速で（ポンピングシステムの限界）、５％アセトニトリル／ 0.1 ％ TFA〜 100％アセトニトリル／ 0.1％ TFAで進行する20分の線状グラジエント を用いて溶出した。2.5ml(15秒)の画分を、2.0分の洗浄の後に収集した。次に、 陽性画分(2.5〜5.0ml、約40％のアセトニトリル)を、水／ 0.1％ヘプタフルオロ 酪酸(HFBA)(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)により５倍に希釈し、そして ５％メタノール／ 0.1％ヘプタフルオロ酪酸(HFBA)(Pierce Chemical Co.，Rock ford，IL)により平衡化されたもう１つの多孔性ポリマーＣ₁₈カラムに適用した 。タンパク質を、15ml／分の流速で、５％メタノール／ 0.1％ HFBA 〜 100％メ タノール／ 0.1％ HFBA の20分線状グラジエントにより溶出した。703D4抗原は 、約80％メタノールで溶出した。 精製における最後の段階として、陽性画分を、20％アセトニトリル／ 0.1％ T FAにより平衡化された 2.1mm×25cmの Vydac分析用Ｃ₄カラム(Vydac，Hesperia ，CA)に適用し、そしてタンパク質を、0.2ml／分の流速で、20％アセトニトリル 〜70％アセトニトリルの線状グラジエントにより 150分(0.3％／分)、溶出した 。 消化及びタンパク質配合決定： SDS-PAGEブロットされた材料及び最後の C₄HPLC段階での画分からの直接的な 材料に対するＮ−末端アミノ酸配列情報を得ることに関するいくつかの失敗した 試みは、精製されたタンパク質のＮ−末端がブロックされたことを示した。従っ て、臭化シアン（CNBr）消化を用いて、内部配列を得た。C₄HPLC分別の後に凍結 乾燥された、精製されたタンパク質を、室温で24時間、70％蟻酸中、0.15Ｍの CNBr(Fluka)により窒素下で分解した〔Gross，1974, Biochem.Biophys.Res.Com mun ． 59，1145-50〕。得られるペプチドを、16％トリシンSDS-PAGE及びPVDF膜 上での電気ブロットにより分離した。ペプチドを、Ponceau Sを用いて可視化し 、そして代表的なバンドを Applied Biosystemモデル477A上での Edman分解配列 分析のために切出した。得られるアミノ酸配列を、Pep Scan（PE／SCIEX，Thorn hill，Ont.，Canada）を用いて、Swiss Protデータベースにおける既知の配列に 比較した。 全細胞 RNAの単離及びノザン分析： RNAを、グアニジウムイソチオシアネート／２−メルカプトエタノールにより 抽出し、そして記載のようにして超遠心分離により精製した〔Davisなど、1986 ，Preparation and analysis of RNA from eukaryotic cells．Basic methods i n molecular biology，New York，Elsevier，Science Publishing Co.，Inc．12 9-156〕。超遠心分離の後、RNAペレットを水に再懸濁し、0.3Ｍの酢酸ナトリウ ムの存在下でエタノール沈殿せしめ、そして遠心分離によりペレット化した。乾 燥されたペレットを水に再溶解し、そして腫瘍細胞系、正常肺及び正常気管支上 皮一次培養物の個々からの全細胞RNA10μｇを、ノザンブロット分析のために使 用した。RNAを、運転緩衝液としての 0.3Ｍの３−Ｎ−モルホリノ−プロパン硫 酸／0.05Ｍの酢酸ナトリウム／0.01ＭのEDTAと共に１％アガロース−ホルムアル デヒドゲルを用いて分解した。次に、RNAをニトロセルロース膜に移し、ハイブ リダイズし、洗浄し、そしてオートラジオグラフィー処理を標準技法に従って行 なった。 ノザン分析を、hnRNP-A2及び -A1のための十分な長さのcDNAを含むプラスミド の制限エンドヌクレアーゼ消化物からゲル精製された挿入体のランダムプライミ ングにより調製されたプローブを用いて 行なった。約１×10⁶cpm／mlのプローブを、個々のノザン分析のために使用した 。 RT-PCR及びサザンブロット分析： 逆転写を、製造業者のプロトコール(Gibco)に従って Superscriptを用いて、0 .2μｇのDNアーゼ−処理された全 RNAにより行なった。得られるcDNAを、Perkin Elmer GeneAmp PCR Systen 9600上で35サイクルのポリメラーゼ鎖反応(PCR)に ゆだねた。増幅のために企画されたプライマーは、次のものであった：５′−GA GTCCGGTTCGTGTTCGTC−３′（配列番号11）及び５′−TGGCAGCATCAACCTCAGC −３ ′（配列番号18）。それらのプライマーを、DNA-Starを用いて選択し、そして h nRNPスプライス形 -A2及びB1を生成する交互のエキソン利用の部位（36nt）を拡 張するために選択した（図７ａを参照のこと）。得られる増幅された DNAを、2. 0％ NuSieveアガロースゲル上での電気泳動により分析した。ニトロセルロース フィルターへの移行及びハイブリダイゼーション、洗浄及びオートグラフィー処 理を、前記のようにして行なった〔Davisなど、1986 前記〕。サザンブロット 分析を、hnRNP-A2及び -B1の両者に存在する³²Ｐ−末端ラベルされた20ntのアン チセンスオリゴヌクレオチドにより行なった。この22ntのアンチセンスオリゴヌ クレオチドは、次の配列を有する：GAGAGAGAAAAGGAACAGTTCC（配列番号19）。表 １〜３は、本発明の1164bp，1145bp及び1178bpのcDNA生成物の特徴、及びcDNA生 成物を生成するために使用されるプライマーを提供する。 例 ２ 703D4抗原の生化学的特徴化 予備データは、固相放射結合アッセイにより判断されるように、非−小細胞肺 癌細胞系における 703D4抗原の広範囲の発現を示した。示されるすべての結果は 、高い細胞密度を可能にする、５％ウシ胎児血清を含む培養培地における細胞の 浮遊凝集物として急速に増殖するNCI-H720細胞を用いての精製段階のためである 。前記方法が開発された後、同一のプロトコールに従って、元の免疫原細胞系NC I-H157から抗原を精製した。精製のすべての段階での 703D4免疫反応性は、前に 報告された免疫沈殿技法を拡大する予備試みが不成功であったので、SDS-PAGE、 続いてイムノブロット分析により検出された。 還元及び非還元条件下での粗抽出物のウェスターンブロット分析は、還元され たトリスーグリシン及びトリシンゲルの両者上で約 31kDaの移動度を有する主要 特異的バンドを示した（図５ｂ及び５ｅ）。本発明者の最初の分析は、異なった PAGE条件下でのNovex 10−20％トリシンゲル上でわずかに小さな分子（Mrが約 3 1kDaである）及び Novex ８−16％トリス−グリシンゲル上で 35kDaの分子を示 し た。すべての条件下で、単一の主要免疫反応性タンパク質のみが同定されたが、 但し、精製の後の段階においては、高められた還元により除去され得た明らかな ジスルフィド−結合されたホモダイマーが出現し、そして最終HPLC段階で、わず かに高いMrのマイナーなバンドがまた、見出された（図６ｂ−６ｃ）。 Krejewskiなど.,〔Krejewski，1993, Cancer Res ． 53，4701，4714〕の方法 に従っての 703D4抗原分布の単純な非細胞分別分析は、細胞質ゾル上清液に関し てを除いて、核ペレットを包含するすべての膜結合画分は免疫反応性タンパク質 を有したことを示した（データは示されていない）。このデータは、核周辺及び 細胞質ゾル部位に対する結合を示す、固定された細胞における 703D4抗原発現の 免疫組織化学的特徴化に匹適する。核及び膜結合タンパク質を含むNCI-H720非細 胞画分における抗原は、非イオン性界面活性剤、たとえば Tween-20，NP-40及び Triton X-100、又はイオン性界面活性剤、たとえば１％ SDSのいづれかによる弱 い抽出により溶解され得た。 pH6.5，7.5及び 8.5での界面活性−溶解された粗タンパク質の弱いアニオン交 換クロマトグラフィー処理は、粗腫瘍細胞抽出物のすべての免疫反応性が低（50 mM）い塩の存在下で、結合されていない画分に溶出されたことを示した。粗抗原 が変性条件(4.0Ｍの尿素)下で分離用 IEFにゆだねられる場合、その免疫反応性 は、pH８〜９の画分に出現した。 例 ３ 703D4抗原の精製 703D4により同定されるタンパク質を、６段階方法によりNCI-H720及び -H157 細胞から単離した。最初の段階を、種々のプロテアーゼインヒビター又は還元剤 による標的分子の分解を妨げるために急 速に行なった。本発明者は、分子の損失を完全には妨げることができなかった。 個々の分別段階のSDS-PAGE及びウェスターンブロット分析の間、分解を妨げるた めに、多量の材料を、分析の間−30℃で凍結貯蔵した。個々の段階での正確な回 収の決定がウェスターンブロット分析法を用いて行なわれず、従って、全体の収 量は、精製のために使用される合計のタンパク質及び精製された抗原の最終収量 から評価された。 典型的な精製は、細胞培養培地に存在する血清タンパク質を除去するためにリ ン酸緩衝溶液により洗浄された７〜10mlのパックされた細胞により開始した。初 期段階は、細胞質ゾルタンパク質を除去するための非細胞分別、及び膜結合され た画分の弱い界面活性剤溶解であった。次に、界面活性剤−溶解された画分を希 釈し、塩濃度を低め、そして弱いアニオン交換カラムに注入した。弱い及び強い アニオン及びカチオン交換樹脂に関する研究は、酸性〜中性のpHでカチオン及び 強いアニオン交換マトリックスへの強い結合性、及び免疫反応性材料の良好でな い回収率を示した。従って、弱いアニオン交換樹脂を用いて、不適切なタンパク 質の有意な部分（約75％）を除去した。これは、IEF段階での同時沈殿を通して の免疫反応性タンパク質の損失を妨げた。結合されていない材料を収集し、凍結 乾燥し、そして分離用 IEFのために変性緩衝液に再溶解した。IEFは、pHグラジ エントの塩基性領域中に免疫反応性タンパク質を濃縮した。細胞のいくつかのバ ッチを、HPLC精製のためにこの時点でプールした。 この方法の次の段階からのHPLCクロマトグラムを、図５ａに示す。分子篩クロ マトグラフィー又はシリカ基材の逆相HPLCマトリックス上への直接的な注入によ る、分離用 IEFの後の両性電解質及び尿素を除去するための試みは、標的タンパ ク質の沈殿及びカラムマト リックス内の損失をもたらした。Porosマクロー多孔性ポリマーＣ₁₈カラムは、 尿素／両性電解質カクテルからの抗原を急速且つ効果的に脱塩し、そして同時に 、前記混合物における多量の他のタンパク質から 703D4免疫反応性を分離した（ 図５ａ，５ｂ）。本発明のHPLC方法は、ペプチド分析及び／又は精製に通常適用 されるが、しかしこのタンパク質の精製のためにひじょうに効果的であることが わかっている移動相を利用する。より親油性のイオン−対合剤（HFBA）と共にク ロマトグラフィー的に“弱い”有機変性剤（メタノール）の使用は、アセトニト リル／ TFA移動相における 703D4抗原の明確に異なった移動度をもたらし、そし てまた、サンプルに存在する他のタンパク質の除去のための選択性を提供する。 それらの２種の溶媒システムの使用は、単一の溶媒システムよりも標的分子の有 意に高い精製をもたらした。 0.1％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルグラジエントによる分析用 C₄ HPLCを、最終精製段階として使用した。メタノール／ヘプタフルオロ酪酸ポリマ ーＣ₁₈カラムからの陽性画分 2.5mlを、水／ 0.1％ TFAにより５倍に希釈し、Vy dac C₄カラム上に注入し、そして 0.1％トリフルオロ酢酸中、遅いグラジエント (0.3％／分)のアセトニトリルにより溶出した。Ｃ₄ 画分のイムノブロット分析 は、SDS-PAGEにより決定される場合、明確なサイズの２種の免疫反応性タンパク 質を示した（図６ｂ及び６ｃ）。低部の及び遅い溶出タンパク質は、主要免疫反 応性タンパク質であり、そしてSDS-PAGEゲルのクーマシー染色により決定される 場合、95％以上の純度のものであった。 アミノ酸分析及びＮ−末端 Edman配列収量により決定される、典型的な精製か らの主要免疫反応性タンパク質の全体の収量は、200ｐモルであった。この収量 は、約25,000倍の精製度を意味するが、 但し上記で指摘されたように、この検出システムは、前記方法におけるいくつか の段階での損失の正確な評価を可能にしなかった。 例 ４ 703D4タンパク質のアミノ末端配列決定 C₄HPLC画分からの直接的な配列決定を包含する、精製された 703D4抗原のアミ ノ末端配列を得るためのいくつかの試みは、成功ではなかった。従って、主要免 疫反応性タンパク質、すなわち分析用Ｃ₄精製段階のSDS-PAGEに基づく、後で溶 出する低Mrバンドは、ピーク画分の凍結乾燥により濃縮され、そしてCNBr／蟻酸 により分解された。４種のバンドが、16％線状ゲル上でのトリシンSDS-PAGE、PV DF膜上への電気ブロット、及び Ponceau S又はクーマシーブルーによる染色の後 に分離され、そして認識され得た（図８）。すべての４種のバンドは、ブロット されたタンパク質のための標準の ABIプロトコールを用いてABI 477A上での12サ イクルのエドマン分解を受けやすかった。示される配列は次の通りであった：AA RPHSIDGRVV（配列番号１）(27kDa及び 13kDaのバンド)、QEVQSSRSGRGG（配列番 号２）(15kDaのバンド)及びEREKEQFRKLFI(配列番号６)(４kDaのバンド)。それら の個々の配列のSwiss Protタンパク質配列データベースの研究は、単一の遺伝子 生成物を同定した。臭化シアン消化生成物の配列及びサイズは、異種核リボヌク レオタンパク質(hnRNP)A2に対して実質的に相同である主要 703D4抗原と一致す る。図７ａは、hnRNP A2と同一であるが、しかしそのタンパク質アミノ末端に隣 接する、前に報告された36ヌクレオチド（12個のアミノ酸）のエキソンを包含す る、hnRNP B1の翻訳されたcDNA配列と並べられたそれらの配列を示す。４kDa の CNBrフラグメント配列は、交互のエキソンスプライシングのこの部位を交差し、 このことは主要抗原がhnRNP A2に対して実質的に相同であることを示す。CNBr− 生成さ れたフラグメントについて予測されるように、個々の配列は予測される配列にお けるメチオニン残基のＣ−末端すぐ近くに存在する。 703D4抗原の精製における最後の段階は、わずかに大きな分子サイズ及び相等 の免疫反応性の第２免疫反応バンドを分解した（クーマシー及び免疫染色強度の 比較により判断される）。CNBr消化を、hnRNP-A2の前、わずかに溶出されたマイ ナーな免疫反応バンドを含むプールされた C₄HPLC画分に対して行なった（３種 の別々の精製からプールされた）。CNBr消化物は、トリシンSDS-PAGEの後、２種 の主要なクーマシー染色されたバンドを生成した。約５kDa のバンドを、Applie d Biosystems 494A上でエドマン配列決定し、そして配列EKTKEtVPlerKKrE(配列 番号４)を生成した（上部の場合におけるアミノ酸は個々のサイクルにおける一 次アミノ酸を表わし、そして低部の場合の文字は二次細胞として同定されるアミ ノ酸を示す）。この配列は、hnRNP-A2に存在しない12個のアミノ酸挿入を包含す る hnRNP-B1 CNBrフラグメントの配列と同一である。同じサンプルに存在する低 レベルの配列は、 C₄HPLCによりhnRNP-B1から完全には分解されなかったhnRNP-A 2と一致した（図６ａ）。同じ消化物からの 13kDaのバンドは、hnRNP-A2／B1の1 3kDa CNBrフラグメントのために予測される配列と一致する配列AaRp-s-DGRvv（ 配列番号５）を生成した。 例 ５ hnRNP A2／B1発現の分析 図９ａは、正常及び腫瘍細胞系の両者におけるhnRNP A2／B1の広範囲の発現を 示し、そして一般的には、本発明者の放射性結合アッセイと一致する（結果は示 されていない）。 hnRNP-A2／B1 mRNA はまた、試験される単一の形質転換された正常気管支上皮 細胞系において、及びいくつかの正常気管支上皮細胞 一次培養物においても発現される。ノザンブロットのデジタル化されたシグナル 強度を、UV光下で写真を取られた28S rRNAバンドの定量化により負荷差異につい て調節し、そしてレーザーデンシトメトリー（Molecular Dynamics Personal De nsitomefer）により走査した。ほとんどの腫瘍細胞系におけるhnRNP-A2／B1の発 現は、分析された正常な肺細胞一次培養物におけるよりも高い、NSCLC及びSCLC の両細胞系は、hnRNP-A2／B1 mRNA を発現する。十分な長さのcDNAプローブを用 いてのノザン分析は、hnRNP-A2と -B1とを区別することができず、従って、Rt-P CRを用いて、遺伝子生成物の両形が発現されることを確かめた。結果は、すべて の試験された細胞系及び正常肺細胞が両スプライス形を発現し、そしてhnRNP-A2 がすべての場合において主要形であると思われることを示す（図９ｂ）。 Biamontiなどは、hnRNP-A1 mRNA、すなわち密接に関連するが、しかし異なっ た遺伝子の生成物の発現は、正常な線維芽細胞及びリンパ球において増殖−依存 性調節を受けやすいが、しかし形質転換された細胞系においては増殖依存性では ないことを報告している。hnRNP-A2／B1 mRNA の発現を、細胞増殖の異なった段 階で分析した。細胞を、集密性に達した後１〜４日で、対数相又は定常相のいづ れかにおいて収穫した。そのデータは、mRNAのレベルが、試験される肺由来のす べての細胞において増殖依存性であることを示す（図10）。６／６の正常気管支 上皮細胞一次培養物、１／１の形質転換された気管支上皮細胞系及び３／３の肺 腫瘍細胞系においては、hnRNP-A2／B1 mRNA のレベルは、細胞の対数相増殖の後 、低下する（図10）。 データは、短時間の正常気管支上皮細胞一次培養物に比較して、癌細胞系及び 形質転換された気管支上皮細胞においてhnRNP-A2／B1の過剰発現を示す（図９ａ ，９ｂ及び10）。hnRNP-A2／B1について の予備出来事は、正常な乳上皮細胞一次培養物に比較して、乳腫瘍細胞及び形質 転換された乳上皮細胞における過剰発現を示した（データは示されていない）。 それらの発見は、いくつかの不滅化された又は形質転換された細胞系、たとえば 上皮癌細胞、前骨髄細胞、SV40形質転換されたヒト線維芽細胞及び奇形癌細胞に おける過剰発現を示した。ラット神経細胞はまた、生前及び生後すぐに高レベル の hnRNP-A1 mRNAの発現を示し、そして正常な線維芽細胞一次培養物は細胞増殖 の対数相の間においてのみ、hnRNP-A1を過剰発現する（Biamonti，G.など、J.Mo l.Biol ． ，230，77-89，1993）。そのデータは、hnRNP-A2／B1は肺上皮腫瘍細胞 において過剰発現されるけれども、それは明らかに増殖依存性制御を受けやすい ことを示す。形質転換及び腫瘍形成に対する hnRNP過剰発現又はノックアウトの 効果の研究は、進行している。 hnRNP-A2／B1としての 703D4初期肺癌検出抗原の本発明者の同定は、タンパク 質の hnRNPグループについての現われる知識の点から刺激的である(Burd，C.G. など、Science ，29，615-621，1994)。hnRNPのファミリーは、プレ−mRNAエク ソンスプライシング及びスプライス部位選択を包含する RNAプロセッシングにお いて、及びまた、転写、DNA複製及び組換えにおいて役割を有する（Dreyfuss， など.，Annu.Res.Biochem ．，62，289-321，1993; Spector，D.L.Curr.Opin.Cel l.Biol. ，5，442-447，1993）。hnRNPは、本明細書に記載される非細胞分別及び 前に報告された免疫組織化学的局在化に一致する、核から細胞質ゾルへのmRNAの 輸送に関与する(Katz，D.など、Nucleic Acid Res ． 22，238-246，1994; Pinol -Romaなど、Nature 355，730-732，1992)。hnRNPについてのそれらの役割は、そ れのタンパク質が細胞増殖に対して不可欠であるが、但しhnRNP-A2／B1が癌形成 に関与している正確な機構はまだ不明であること を示唆する。増殖マーカーは、通常、創傷に対して又は胎児成長の間に応答する 細胞において増加し、そしてその結果、前腫瘍性癌形成された細胞に対して選択 的ではない(Risio，M.J.J.Cell.Biochem ．Suppl．166，79-87，1992; Ganju，R. K.J.Clin.Invest. 94，1784-1791，1994)。しかしながら、肺が癌形成の前悪性 相にある患者からの剥離された気管支細胞における高められたレベルのhnRNP-A2 ／B1の本発明者の臨床学的発見は、癌形成の工程におけるhnRNP-A2／B1について の原因的な役割を示す。いくつかの異なったシステムからのそれらのデータは、 形質転換表現型の発現におけるhnRNP-A2／B1及びA1／B2、又はそれらのタンパク 質に密接に関連する分子のための役割を支持し、そしてそれにより、初期肺腫瘍 検出抗体としての 703D4の同定のための合理性を提供する。 例 ６ ネズミシステムにおける上皮タンパク質発現及び腫瘍増殖 速度のインビボ阻害 １つの態様において、上皮タンパク質発現及び腫瘍増殖速度を、次の態様で示 すことができる。高レベルの上皮タンパク質を発現することが知られている H-1 57又はH720腫瘍細胞系を、Balb／c(株)マウスの側腹部中に皮下注入する。アン チセンスオリゴヌクレオチド（配列番号20）(5′TAAGCTTTCCCCATTGTTCGTAGT 3′ )を、2.5mg／kg体重の濃度で、１つのグループのマウス中への静脈内注射により 投与する。対照マウスは、対照のオリゴヌクレオチドにより注射される。30日後 、肺を除去し、そして上皮タンパク質の発現をイムノアッセイにより、又はノザ ン又はサザンブロット分析によりモニターする。hnRNP発現及び腫瘍増殖速度は 、対照のオリゴヌクレオチドの注射を受けるマウスよりも、アンチセンスオリゴ ヌクレオチドの注射を受けるそれらのマウスにおいて低いことが予測される。例 ７ ヒト細胞における上皮タンパク質発現の阻害 ヒト細胞における上皮タンパク質発現の阻害を次のようにして示すことができ る。NCI-H720ヒト肺癌細胞を、Ｒ５培地において増殖せしめる。核酸配列 5′TA AGCTTTCCCCATTGTTCGTAGT 3′を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、リン 酸緩衝溶液に再懸濁し、そしてDOTAP（Boehringer Mannheim）、すなわちリポフ ェクション試薬（培養培地の 2.5μｇ／ml）と共に所望する濃度で混合する。DO TAPの不在下での新鮮なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、16〜20時間のイン キュベーションの後に添加する。26〜40時間後、細胞を、メチオニン及びシステ インの両者を欠いている血清フリーの培地によりすすぎ、そしてラベルを、150 〜200 μCi ³⁵S−トランスラベル(ICN)を含む培地１mlに４時間にわたって添加 する。 免疫沈殿物を、703D4抗体と共にインキュベートした後に回収し、電気泳動し 、そしてオートラジオグラフ処理する。上皮タンパク質発現は、対照のオリゴヌ クレオチドにより処理されたヒト細胞よりも、アンチセンスオリゴヌクレオチド により処理されたヒト細胞からが低いことが予測される。 例 ８ 腫瘍性及び非腫瘍性呼吸上皮における初期肺癌検出 マーカーＰ31の発現 材料及び方法 組織 28人の患者からの28個のパラフィン−包埋された、段階Ｉの NSCLC切除検体及 びその対応する病理学的報告を、許容される臨床学的プロトコールの一部として 、Department of Pathology，Naval Hospital，Bethesda，M.D．から得た（22） 。すべての材料は研究の対 照病理学者（R.I.L.）によりレビューされ、そして腫瘍は WHO分類に従って診断 された（23）。個々の患者に関しては、１つの代表的な組織ブロックが選択され 、そして３種の肺区画（気管支、細気管支、肺胞）における呼吸上皮の形態学的 状態が記録された。Ｐ31状態を、パラフィンブロックに含まれる一次腫瘍に隣接 する気道における領域変化に関して評価した。 免疫組織化学 703D4(５)を、プロテインＡカラム及び不連続グリシンNaCl／クエン酸塩グラ ジエント（Pierce，Rockford，IL）を用いて、マウス腹水から精製した。10μｇ ／mlのプロテインＡ精製されたマウスモノクローナル抗体を用いて、ｐ31発現の 領域を同定した。免疫組織化学的染色を、前に報告された変法によりVendorの説 明に従って、Vectastian ABCキット(Vector Laboratories，Burlingame，CA)を 用いて行なった。すべての実験は、陽性対照としてｐ31を発現することが知られ ている腫瘍スライド、及び陰性対照としての同位体(IgG2b)骨髄腫タンパク質（S igma Chemical Co.，St.Lonis，MO）を組込んだ。 スライド分析のための工程 ３種の明確な肺区画（気管支、細気管支、及び肺胞）を、対応するヘマトオキ シリン及びエオキシ染色された断片において光顕微鏡を用いて、個々の場合のた めに位置決定した。それらの区画を、前に記載したようにして、それらの上皮及 び取り囲む組織により識別した（12）。すべてのスライドを、次の組織学的異常 性の存在についてスクリーンした：基底細胞過形成(BCH)；杯状細胞過形成(GCH) ；扁平化生(SQM)；形質異常(DYS)；タイプII細胞過形成(T2H)；線維増多(FIB)及 び肺胞の細気管支化(BOA)(表１)。それらの形態学的表示を、公開された基準を 用いて３人の論評家（J.Z.，S.M. I.，R.I.L.）の一致により決定した（９，13，14）。 個々の区画における異常性を定量化するために、異常性を含む HPFの数を、分 析される領域の合計数により割り算した。個々のセクションに含まれる気管支及 び／又は細気管支区画のすべての個々の標本を分析した。個々のスライドは、１ つの肺胞領域を有するものとして企画された。異常性を含む肺胞においては、顕 微鏡の40倍対物レンズを用いて、スライド当たり合計10の高い力の領域(HPF)を サンプリングし、そして数を数えた。気管支及び細気管支においては、10HPFの 異常性を評価することは必ずしも可能ではなく、従ってできるだけ多くの HPFが 含まれた。たとえば、１つの気管支においては、合計の HPFにおける3HPFのBCH( 表２)が数えられた。領域間の比較のために、関連する組織学の領域(ARH)につい ての染色指数（SI、下記参照のこと）が、個々の肺区画における個々の組織学的 異常性及び正常上皮のために平均化された。 ｐ31発現レベルを、２人の独立したリーダー（J.Z.，S.M.J.）により、正常及 び異型肺区画及び対応する腫瘍組織において評点を付けた。不一致性が、臨床学 的相互関係分析の前、ジョイント論評の後に決定された。染色分布評点（０＝陽 性細胞なし；１＝１〜10％；２＝11〜50％；３＝51〜100 ％(陽性細胞のために は))及び染色強度評点(０＝陰性；１＝＋；２＝++；３＝+++)を、個人の患者の ために得た。それらの値の合計を用いて、SI（SI＝分布評点＋強度評点、可能な 値：０，２〜６）を、以前に公開されたようにして、個々の肺区画のために確立 した(15)(表４)。 １：染色指数（SL）＝分布及び強度評点の合成は、高い力の 領域における陽性上皮細胞の％に等しい分布評点（０＝ 陽性細胞なし；１＝１〜10％；２＝11〜50％；３＝51〜 100(陽性細胞)及び染色の強度(０＝陰性；１＝＋；２ ＝++；３＝+++)であった。 臨床病理学的分析 データは28人の患者から得られた。試験されるすべての区画についてのSIデー タが、１つの値／患者・区画を得るために平均化された。SIの比較を、Wilcoxon ランク合計試験を用いて種々のサブグループ間で行なった。すべてのｐ−値は両 側を有した。 例 ９ 結果 正常 vs 異常肺区画の分布 試験される28人の NSCLC患者から、６の検体に11の気管支、21の検体に40の細 気管支及び24の検体に24の肺胞領域が同定された。28の検体の27は分析に含まれ た。なぜならば、それらは腫瘍及び非腫瘍性肺組織の両者を含むからであった（ １つの検体は認識できる非腫瘍組織を有さない腫瘍のみを含んだ）。次に、肺区 画における組織学的異常性の存在をスクリーンした。BCH，GCH及び DYSがそれぞ れ３，２及び１の気管支に検出されたが、しかしながら、SQMの領域は試験され る検体のいづれにおいても検出されなかった。細気管支においては、40のうちわ ずか７つが、組織学的異常性を含むことが見出された。肺胞組織を有する24の検 体のうち７つが、組織学的に正常な肺胞を含み、そして17が１又は複数の異常性 を含んだ。T2Hは観察される最とも共通する組織学的異常性であり（15／24）、 そして BOAは24の患者のうちわずか３人において検出され（この２人はまた、T2 Hを含んだ）、そして１つの肺胞区画は FIBを含んだ。種々の肺区画に検出され る組織学的異常性の要約が表５に示される。 略語：BCH＝基底細胞過形成、GCH＝杯状細胞過形成、SQM＝扁平化生、DYS＝形 成異常、T2H−タイプII細胞過形成、BOA＝肺胞の細気管支化 １：患者検体の数、28のスライドのうち１つは非腫瘍性肺組織を欠いていた ２：分析される関連する組織学の領域(ARH)の数 ３：ARH＝関連する組織学の領域 ４：いくつかの区画は、１つよりも多くの異常性を含んだ NSCLCにおけるｐ31の発現 広範囲の NSCLCサブタイプにおけるｐ31発現を表６に示す。28の一次肺腫瘍の うち、16（57％）が、ｐ31免疫反応性を示した。試験 される単一のカルシノイドを除くすべての組織学的サブタイプにおけるｐ31発現 が観察された。病巣（単独の細胞又は小グループの腫瘍細胞に検出された）及び 拡散（陽性腫瘍細胞の50％以上）染色の両者が観察された。有力な染色パターン は、図11ａ及び11ｂに示されるように、拡散性及び細胞質性であった。有力な細 胞質染色パターンの他に、膜染色が、９の腺癌のうち１つに（図11ｃ）及び１つ の肺芽腫に観察された。染色パターン、平均染色指数及び腫瘍組織学間での相互 関係は明らかでなかった。 １：２以上の染色指数を有する腫瘍は陽性と呼ばれる ２：略語、Ｄ＝拡散、Ｆ＝病巣、Ｃ＝細胞質、Ｍ＝膜、Ｐ＝核周囲 、いくつかの腫瘍は１つよりも多くの染色パターンを示した ３：包含される腺癌サブタイプ：乳頭及び気管支肺胞（11）、適度 に識別される（３）及び十分には識別されない（２）。腺癌の １つは、陰性であった乳頭区画に続いて小さな細胞肺癌区画を 有した。 ４：肺芽腫 非腫瘍性肺におけるｐ31の発現 正常及び異型肺区画におけるｐ31染色の結果は、表７に要約されている。ｐ31 染色は組織学的に異常な気管支及び細気管支に検出されなかったが、拡散及び／ 又は病巣細胞質ｐ31染色のパターンは形質学的に正常な気管支及び細気管支の１ ／３に発現された。より特定には、ｐ31発現は、線毛のある及び線毛のない上皮 細胞、及び基底細胞上皮に検出された（図12ａ，12ｂ）。27の患者のうちわずか ２人が十分に保存された気管支腺を示すと共に、それらの両者はｐ31のための強 い顆粒状染色を示した（図12ｃ）。 １：２以上の染色指数を有するすべてのARHは陽性であることが評価された。 ２：略語：Ｄ＝拡散、Ｆ＝病巣、Ｃ＝細胞質、Ｍ＝膜。 ３：（Ｎ）＝患者検体の数。 ４：（ｎ）＝肺区画の数。 ５：基底細胞過形成、杯状細胞過形成、形成異常。 ６：線維増多、タイプII細胞過形成、肺胞の細気管支化。 ７：肺芽腫 肺胞上皮におけるｐ31発現がタイプII細胞に制限され（図12ｄ）、そして時お り、線維増多により達成される、T2Hを含む領域において最とも著しかった（図1 3ａ及び13ｂ）。対照的に、BOAを含む領域は陰性であった（示されていない）。 ｐ31染色は肺胞において最とも著しかったので、２種の患者グループにおけるｐ 31免疫反応性を比較し、ここで１つは組織学的に正常な肺胞領域を有し（ｎ＝５ ）、そして他の１つは T2Hを有した（ｎ＝15）。５人の患者のうちわずか１人が 、T2Hを含む領域に陽性のｐ31染色を有する15人の患者のうち５人に比較して、 正常な肺胞を有するグループにおいてｐ31染色を示した。強い染色強度が、正常 な肺胞領域（図12ｄ）に比較される場合、T2Hを含む肺胞領域に観察された（図1 3ａ及び13ｂ）。T2H(1.09±0.45)に対する正常肺胞上皮の平均SI（0.36±0.36） が比較される場合、統計学的に有意な差異（ｐ＝0.37、Wilcoxonランク合計）が 見出された。拡散及び病巣細胞質染色が肺胞に見出されたが、しかしながら、膜 染色は時おり、T2Hを含む肺胞において観察された（図13ｂ）。 腫瘍 vs 非腫瘍性肺におけるｐ31発現の比較 腫瘍 vs そのまわりの非腫瘍性肺におけるｐ31免疫反応性が比較が表８に示さ れる。分析された27の検体のうち、15がｐ31陽性腫瘍組織を含み、それらの７つ の検体（47％）がまた、そのまわりの非腫瘍性肺におけるｐ31染色を示し（最と も頻繁には、肺胞領域において）、そして残る８つの検体（53％）は非腫瘍性肺 において抗原発現を示さなかった。他方、腫瘍組織がｐ31を発現しなかった12の 検体のうち３においては、そのまわりの非腫瘍性組織はｐ31発現のために陽性で あった（25％）。腫瘍及び非腫瘍性肺におけるｐ31発現間の有意な関係は存在し なかった（ｐ２＝0.42、Fishersの正確な試験）。 １：28のスライドのうち１つは非腫瘍性肺組織を欠いていた。 臨床病理学的相互関係 種々の肺区画におけるｐ31発現を、臨床病理学的特徴、たとえば喫煙歴史（喫 煙年数）、性別及び年齢との関係について評価した。ｐ31発現と性別との間には 、相互関係は見出されなかった（表９）。 喫煙歴史及び年齢とｐ31発現状態との統計学的に有意な関係は存在しなかった 。ｐ31発現における有意な上昇は、重度の喫煙者（50以上の喫煙年数）における 細気管支に観察され(Ｐ₂＝0.005)。年を取った患者の細気管支(Ｐ₂＝0.005)及び 肺胞(Ｐ₂＝0.017)におけるｐ31発現の統計学的に有意な上昇が見出された（表10 ）。喫煙歴史及び年齢とｐ31発現の関係のこの上昇度は、男性及び女性が一緒の グループにある場合、単に有意性（ｐ＜0.05）に達するが、しかし個々の性別に 関しては、有意な上昇度（傾向）として見なされなかった。 １：平均染色指数は、患者当たりの副区画当たり１つの値を得るために計算され た。 それらの研究は、腫瘍のすべての主要な組織学的サブタイプにおいてｐ31免疫 反応性の存在を示した。ｐ31発現はまた、呼吸上皮のすべての３種の区画（気管 支、細気管支、肺胞）に見出された。それらの発見は、NSCLC及び非腫瘍性肺に おけるｐ31発現パターンが 可変性であることを示した。ほとんど細胞質における及び時おり、細胞質上での 拡散及び病巣染色が観察された。この分析においては、ｐ31免疫反応性が、55才 以上の患者及び長期間の喫煙歴史を有する個人においてより頻繁に見出された。 ｐ31発現が潜在的に重要な前腫瘍細胞集団を同定するかどうかを決定するため に、非腫瘍性肺におけるｐ31免疫反応性に対して集中した。ｐ31は、T2Hの領域 において最っとも通常には発現され、これは、T2Hが前腫瘍変化の候補体である ことを示唆する、この共通する細胞型の生物学的における変化に影響を及ぼすこ とができる。これは、肺癌の組織病理学が、アメリカ合衆国における腺癌の上昇 と共に、最近、変化しているので、特に適切であり得る。乳頭鱗状特徴を通常示 す肺腺癌は、周囲気道における先視細胞、すなわち Clara細胞及びタイプII肺胞 細胞から生じると思われる。さらに、周囲気道（細気管支及び／又は肺胞）に見 出される前腫瘍組織学的異常性はまだ十分には定義されていない。正常に見える タイプII細胞がｐ31初期肺癌検出マーカーを発現することができる事実は、前癌 状態への初期形質転換の徴候であり得る。 対照的に、十分に定義された組織学的異常性、たとえば BCH，GCH，SQMは時お り、気道（気管支及び細気管支）に見出されるが、しかしながら、それらの組織 学的変化のすべては潜在的に可逆的である（14）。SQMはこの研究において分析 されたいづれの検体にも検出されなかった。これは、最っともありそうな事には 、研究のために入手できる材料の限定された量によるものであった。SQMの不在 、及び一般的に、気道の組織学的異常性におけるｐ31染色の欠失がそれらの病変 の可逆的性質に影響を及ぼすことができる。本発明者は、ｐ31発現が若い非喫煙 者の外傷犠牲者から得られたヒト肺組織において不在であることを以前に示して いる。従って、組織学的に 正常な上皮におけるｐ31免疫反応性の存在は、気道における細胞形態学的変化の 前の初期出来事を実際的に示すことができる。 幹細胞仮説によれば、単一の細胞が正常な肺及び主要な組織学的タイプの肺癌 を生ぜしめるために３種の経路にそって分化することができる（24）。ｐ31はす べての腫瘍タイプの肺癌に検出され得るので、ｐ31の発現は肺癌形成における初 期出来事であり得る。表５に報告されるように、ｐ31を発現しなかった３つの検 体が存在したが、しかしｐ31はまだ、周囲の非腫瘍性上皮に発現された。 ｐ31発現は、治療目的での段階Ｉの NSCLC切除を有する患者からの両非腫瘍性 及び腫瘍性組織からヒト肺じゅうに生じる。明確な発現パターンは、潜在的に腫 瘍性の出来事、たとえばヒト肺の肺胞領域から始まる周囲腺癌のための情報マー カーにｐ31をする。高められたｐ31発現、T2H、年齢の上昇及び拡散された喫煙 歴史に関与することが見出された。例 10 症状発現前肺癌の hnRNP予測検出 通常の痰形態と剥離された痰上皮細胞による hnRNP過剰発現の正確さとを比較 する、初期肺癌の症状発現前検出に対する２種の予測研究を行なった。それらの 研究は、次の問題を取り組むために開始された：(ａ)hnRNPが上皮細胞における 形成異常変化の不在下で肺癌を予測的に検出するか、及び(ｂ)hnRNP発現がこれ まで肺癌を有さない高い危険性の人において予測的に検出され得るか。最初の問 題は、SPLCの１年の発生率が１％〜５％である患者における肺癌初期検出作業グ ループ(LCEDWG)²¹により行なわれるイレブン−センター研究、すなわち“痰免疫 染色による第２の一次肺癌（SPLC）の初期検出”により抜かれる（25）。 第２の研究においては、hnRNP発現が、１次肺癌（１°LC）の平 均的な１年の発生率が１％であるYunnan Tin Corp（YTC）鉱夫、すなわちラドン 及び砒素に対して産業的に暴露される喫煙者の地域に住んでいる中国人集団にお いて評価された（26）。それらの研究は、比較処理研究ではなく、予測観察企画 を必要とする。初期スクーニング及び初年度追従データは、個々の研究のために 別々に提供される。本発明者は、それらの前腫瘍痰検体における hnRNPのアップ レギュレーションにより前もって同定されたそれらのうち67％が肺癌を進行せし めたことを観察しており、これは収容された材料において前もって観察された発 見と一致した。 SPLC集団及び研究企画 National Cancer Institute's Lung Cancer Study Group(LCSG)^27-30において 以前参加している機関、及び活動的な外科腫瘍学プログラムを有する他の機関の 研究者が、協力的なLCEDWGを形成した。研究患者は、非−小細胞肺癌(NSCLC)の 完全な切除の後にそれらの研究者により同定された。患者は、年齢、性別、倫理 的背景、Karnofsky評点又は喫煙状態に基づいて排除されなかった。スクリーニ ング³¹及び細胞タイプでの癌の程度に基づかれるような TNMステージングが、WH O基準³²に従って割り当てられた。少なくとも１つの縦隔節の生検をうけた患者 が提供され、そしてすべての生検された縦隔節は陰性であり、再発又はSPLCのい づれかを６週で又は手術切除の後６週以上で進行せしめなかったT1N0又はT2N0疾 病を有するいづれかが好適であり得た。節サンプリングが行なわれない場合、包 含されるべき患者のためには、縦隔を越えての既知の又は疑わしい転移が見られ ないよう手術以来、２年が経過すべきである。LCSG基準に従って、SPLCは、それ が一次癌の特徴を有し、そして異なった葉（lobe）において生じる条件下で、一 次切除の後２年以下で出現する場合、異なった組織学的細胞型であり、そして切 除の後２年 以上で出現する場合、同じ細胞型のものであり得る肺癌として定義された²⁵。 患者を記録する前、個々のLCEDWG機関は、地方のHuman Volunteers Committee の許可を受け、その痰誘導施設を確立し、そしてJohns Hopkins University Sch ool of Hygieneからの細胞技術者による現場訪問の間、検体採取訓練及び許可を 受けた。検体生成及び取扱いのための技法は次の通りであった：適切な検体の確 保を助けるために、個々の患者は、15分間の高張塩溶液誘導を毎年、行なった。 新鮮な痰をPapanicolaou染色のためにガラススライド上に塗り付け、そして残り の痰は、均質化され、濃縮され、そしてSaccomanno's保存剤（50％エタノール中 、２％ポリエチレングリコール1450）に配置された。続く３日間にわたって、患 者はSacoomannos保存剤に後誘導痰を採取され、次いでそれがプールされた検体 で郵送された。受容機関での通常の細胞学的試験が腫瘍細胞の存在を示す場合、 患者は、治療医者によりSPLC（又は再発）のための従来の評価を受けた。すべて のスクリーニング検体は、分析のためにJohns Hopkinsに送付された。 中国人集団及び研究企画 活動的であり且つ退職した中国人錫鉱夫（すなわち毎年の１°LCスクリーニン グのためのボランティアー）は、彼らが40才以上である場合、10年以上の間、地 下で働いており、これまで悪性腫瘍を有さず（非黒色腫皮膚癌を除く）、そして 通知された同意を与えた。登録で、標準化されたインタビューにより、年齢、性 別、人種背景及び喫煙、職業及び栄養上の歴史を記録した。高張塩溶液誘導の間 に生成された個々の毎年の痰検体が試験され、そして個々の鉱夫は毎年の胸部レ ントゲンを受けた。肺癌が検出された鉱夫は、Geiju Cityの YTC Worker's Geme ral Hospitalでの診断検査を受けるよう に勧められた。細胞タイプ及び病気段階分けのために使用される基準は、SPLCに ついて前で述べた基準に類似した。予期される症例−コホート研究企画を用いて 、肺癌症例の予測される分布により年齢−分類された、ランダムに選択された対 照のサブコホートを、登録で同定した。追跡調査の最初の年の結論では、１°LC を進行せしめた鉱夫のスクリーニング痰検体、及び年齢適合されたサブコホート の検体が、分析のためにJohn Hopkinsに送付された。 中央実験室／実験工程 痰形態学：使用される検体採取、調製、染色及び定量化方法は、Johns Hopkin s Lung Project（JHLP）収容の検体⁴の以前の評価の間に記載されており、そし て両研究のために類似していた。１人の細胞病理学者(YSE)が、適度な異型化生 を示すすべてのスライド、及び陰性のサンプルを再考した。 免疫細胞化学及び細胞培養物対照：単一ロットの hnRNPのモノクローナル抗体 (703D4と称する)を、プロテインＡカラム及び不連続グリシンNaCl／クエン酸塩 グラジエント（Pierce，Rockford，IL）を用いて、マウス腹水から精製した⁵。 この精製された抗体（10μｇ／ml）を、個々の患者の検体のサイトスピンスライ ド(Shandon，Pittsburgh，PA)及び陽性対照のスライドに適用した。負の対照の ためには、一次抗体を、類似するタンパク質濃度のマウス IgG_2b非免疫血清によ り置換した。免疫染色のコンシステンシーは、Guptaの方法³³に従って、半自動 化された細管−ギャップ技法（Bioteck Instruments，Chicago，IL）によりVect astain Elite ABCキット試薬(Vector Laboratories，Burlingame，CA)を適用す ることによって達成された。スライドは、自動測定の前、研究免疫細胞病理学者 により解釈された(PKC又は WHZ、図２ａ及び２ｂ)。軽い異型化生を示し、そし てモノクローナル抗体 703D4により検出され、そして ジアミノベンジジン及びヘマトキシリンにより染色されるような hnRNPを発現す る痰上皮細胞の像は、SPLCに先んじて、痰検体からの上皮細胞における hnRNP過 剰発現を示す。ATCCヒト気管支原性癌細胞系HTB58(鱗状細胞癌)及びCalu-3（腺 癌）を、正常な痰と共に混合し、Saccomannosに保存し、そして対照として使用 した。 像血球計算法 規則的な化生を有する痰上皮細胞が、患者の臨床状態の知識のない細胞技術者 により可視的に選択された。患者当たり２個のスライドが走査された後、５〜10 の特徴的な領域を個々の対象のために選択した。ケーラー照明、続く、光透過の 中性密度フィルター標準化を確立した。免疫染色されたスライドを、Zeiss Axio mat顕微鏡(Carl Zeiss，Oberkochen，Germany)上で映像化した。hnRNP発現をラ ベルするカッ色ジアミノベンジジン及び青色（ヘマトキシリン）対比染色のため の透過された光を最適化するために、それぞれ600nm（590〜610nm の範囲）及び 510nm（500〜520nm の範囲）のオメガ製の狭いバンドのフィルターを使用した³⁴ 。透過を、デジタル像処理機（Metamorph v.2.0，Universal Imaging，West Che ster，PA）に連結される高解像ビデオカメラ(Hamamatsu Photonic Systems，Jap an)により検出した。次に、両波長での個々の領域のバックグラウンド−引き算 された、シューデング−校正された像を、光学的駆動装置(Panasonic／Matsushi ta Co.，Osaka)に記録した。Pananicolaou染色され、そして免疫染色されたスラ イドの解釈、及び光学的／電子定量化を、Johns Hopkins Oncology Biostatisti cs Coordinating Centerにより維持されるデータベース中にエントリーした。 統計学的な考慮 この研究のための第１の統計学的エンドポイントは、癌、すなわちSPLC集団に おける第２の一次肺癌（再発は計数されなかった）及 び YTC集団における一次肺癌の発生であった。スチューデントＴ及びカイスクエ アーテストを用いて、癌を有する集団と癌を有さない集団との間の差異の有意性 を評価し、そして複数のロジスティック回帰を用いて、複数の因子の同時関与を 決定した。もちろん、それらの有意性レベルは、それらの研究の最後までには変 化することができるが、しかしこれが同様の研究企画の間での一致した発見の報 告を単純にするので、変更はサンプルサイズ又はタイプＩ誤差計算に必要とされ ない。 JHLPサンプルを用いて、二重−波長デンシトメトリーアルゴリズム及び線状識 別機能を開発した³⁵。このアルゴリズムの細かに区別されたバージョンを、SPLC 及び１°LC研究からの試験検体に盲目的に適用した。上皮細胞の光学密度測定値 を、個々の波長で平均化し、そしてそれを用いて、次の線状識別関数に基づいて 検体を腫瘍として分類した(SPSS-Win v6.0，SPSS Inc.，Chicago，IL)：Ｄ＝β₀ ＋β₁(光学密度₆₀₀)^1/2−β₂(光学密度₅₁₀)^1/2。 Ｄのカットポイント値（腫瘍を指摘する）及び重量β₀，β₁及びβ₂を、鱗状 細胞、腺癌又は小細胞肺癌を進行せしめ、又は肺癌をまったく進行せしめないJH LP関与者の対照痰検体から、前もって決定した。次に、試験検体間の予測された 識別評点分類の感度及び特異性、及びそれらの正確な95％二項信頼限界を計算し た。 SPLC検出 切除された段階Ｉの NSCLCを有する患者の累増を、３年で 1,000人の目標患者 のために1992年１月に開始した。41カ月後、660人の患者(638人が好適である、 目標の２／３)を、登録した。最初の試験のための満足する検体を有する 595人 の患者は主に白人であり、そしてほぼ60％が男性であった（表11）。前記患者の 90％が過去に喫煙していたが、それらの３／４は登録でそれら自体、以前の喫煙 者として見なされた。一次切除の 3.6年後、登録でのそれらの平均年齢は、66.5 才であった。良好な健康は、それらの平均 Karnofsky評点（95.2）により影響さ れた。一次腫瘍のための最っとも通常の切除された細胞型は、腺癌であり（43.8 ％）；そして気管支肺胞サブタイプ（11.5％）と共に組合される場合、腺癌は、 切除された一次腫瘍の55.3％を構成した。 598の入手できる初期痰検体のうち582(98％)の検体の細胞学的レビューは、68 3％が正常な形態学のみを含み、13.8％がわずかな異型（規則的）化生を示し、1 .1％が中ぐらいの異型化生を示し、そして１つの検体(0.1％)が重度の異型化生 を示したことを示した。検体のいづれも腫瘍形態を示さず、そして一次腫瘍の細 胞学的異常性の程度とその細胞型との間に有意な関係は存在しなかった。 435人の個人−追跡調査の年数に基づいて初年度間で予測される個人のうち13 人と一致する、13のSPLC及び16の再発性肺癌が認識された。他の27人の患者は、 他の原因で死亡し、又は研究からおろされ、56人の追跡調査が完結された。腺癌 は最とも通常のSPLCであった（13のうち４、又は31％）。鱗状細胞、混合された 腺鱗状細胞、大細胞及び小細胞はそれぞれ13人の患者のうち２人（15％）を占め 、そして１つのSPLCは組織学的な確認の前に死亡した（表11）。癌を有さなかっ た人と比較する場合、後にSPLCを進行せしめた人は、600nmでの有意に高い光学 密度により示されるように、hnRNPを過剰発現した（表12）。肺癌が再発した人 からの検体は、中間の光学密度を有した。 明細書 初期癌検出への使用のための上皮タンパク質及びその DNA 発明の分野 本発明は、癌診断及び治療の分野に関する。より特定には、本発明は、上皮細 胞の初期癌検出マーカータンパク質の単離及び精製、及び前記タンパク質をコー ドする DNA配列のクローニングに関する。さらに、本発明は、癌にかかりやすい 個人を検出し、そして診断 するためのタンパク質及び DNA配列にも関する。本発明は癌を予測する識別機能 を生成するためのコンピューター化された方法に関する。本発明はまた、遺伝子 生成物の発現を調節するための治療介入にも関する。 発明の背景 肺癌は、３種の癌死亡の１つを考慮する場合、アメリカ合衆国における男性及 び女性の両者の癌死亡の最とも頻繁な原因である⁽¹⁾。過去30年、この疾病の癌 関連生存率は最小限ではあるがわずかに改良されて来た。手術による切除及び薬 物化学療法によるこの疾病の好結果をもたらす処置は、初期段階腫瘍の同定に強 く依存している。概念的に魅力ある初期検出アプローチは、分離された気管支上 皮細胞の評価による癌の存在を確立することである。1960年代の後期、Saccoman noなどは、肺癌の初期検出を増強するための技法として剥脱された気管支上皮に おける細胞形態学的変化を評価するためへの痰細胞学の使用を提案している⁽²⁾ 。しかしながら、胸部Ｘ線及び痰細胞学の組合せを用いる臨床試験は、癌関連死 亡率のいづれの低下をも示さなかった⁽³⁾。 1988年、Tockmanなどは、２種の肺癌関連のモノクローナル抗体による痰サン プル内に含まれる細胞を免疫染色することによる初期肺癌検出のための敏感な方 法を報告している⁽⁴⁾。このアプローチのための基本は、気管支上皮から分離さ れた細胞における初期の予備−腫瘍性変化を同定することであった。その研究に 使用される抗体は、アメリカ特許第 4,569,788号に開示される 703D4、及び624H 12と称するマウスモノクローナル IgGであった。肺癌の初期検出への個々のモノ クローナル抗体の寄与の分析においては、703D4のみが、21の検出された真の陽 性患者のうち20を同定した（４；1995年 10月に発行された特許証第 5,455,159号であるアメリカ特許出願第08／152,881 号）。624H12は、細胞表面糖タンパク質のルイス^X関連部分である腫瘍胎児性抗 原を検出することが示された(Mulshine／Magnani)。703D4のための抗原は未知で あった。 703D4は、キーホールリンペットヘモシアニンに結合される完全な腫瘍細胞抽 出物を用いての免疫化により開発され、そして選択はサブタイプの中で、肺癌組 織学的サブタイプの識別に基づかれた。予備研究は、703D4抗体がほとんどの小 さくない細胞肺癌細胞により発現されるタンパク質を認識したことを示した⁽⁵⁾ 。免疫沈殿法は、31kDa以上のMrのタンパク質を定義した。703D4は隣接する気管 からの分離された気管支上皮における癌の進行に関連する変化を選択的に検出す る能力を示したので、703D4により認識される抗原がその同一性を決定し、そし て初期肺癌検出へのその関連性を診査するために本発明において精製された。本 発明は、小さくない細胞肺腫瘍細胞からの上皮タンパク質の同定のために生化学 的アプローチを使用する。 タバコ喫煙により、全体のヒト呼吸器官が可能性ある発癌物質に暴露され、そ して癌の進行のために高められた危険性の状態で存在する。この現象は、“フィ ールド癌化”と呼ばれて来た（８）。種々の上皮の変化は、“フィールド”効果 の部分であり得る、喫煙者及び肺癌患者の両者の呼吸器管を通して観察されて来 た（８，９）。Saccomannoなど（６）は、肺の中心に位置する鱗状癌が一連の同 定できる段階、すなわち扁平化生、異型性を有する扁平化生（弱い、中ぐらい、 著しい）、本来の位置での癌、及び侵入性癌を通して進行することを示している 。それらの発見は、後での動物及びヒト研究により確かめられた（７）。この細 胞形態学的分類は、肺癌“フィールド”の近位領域における予備腫瘍性変化を定 義する際に有 用である。しかしながら、他の主要な肺癌組織学の前に起こる相当の出来事、特 に周辺肺（終末細気管支、呼吸細気管支、肺胞上皮）に生じる出来事は十分には 定義されない。 遠位ヒト肺の腫瘍性及び非腫瘍性領域の両者における上皮タンパク質の発現が 研究された。 発明の要約 本発明は、癌の初期マーカーである上皮タンパク質の単離及び同定を記載する 。肺癌のための初期マーカーである、単離され、そして精製された上皮タンパク 質、そのペプチド又は変異体を供給することが本発明の目的である。 癌のための初期マーカーである、上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体の ためのコード配列を含んで成る、単離され、精製された DNA分子又はその一部を 供給することが本発明の目的である。 組織及び細胞における遺伝子及びその変更を検出し、そして診断するために癌 のための初期マーカーである上皮タンパク質をコードする、単離された DNA又は RNA分子、又はその一部を利用することが本発明のもう１つの目的である。 癌のための初期マーカーである上皮タンパク質をコードする遺伝子又はその一 部の検出のための核酸プローブを供給することが本発明のもう１つの目的である 。 ヒト腫瘍発生前及び腫瘍性細胞及び組織を診断するための方法を提供すること が本発明のさらなる目的である。本発明によれば、前記方法は、ヒトから細胞、 組織又はそれらの抽出物を単離し、そして癌のための初期マーカーである上皮タ ンパク質をコードする遺伝子又はその一部、又は細胞、組織又はその抽出物から のそれらの発現生成物を検出することを含んで成り、ここで前記遺伝子又は発現 生成物における量の上昇の検出が前腫瘍及び腫瘍を示す。 本発明のもう１つの目的は、癌細胞から回収された遺伝子を発現するクローン 内に含まれる、癌のための初期マーカーである上皮タンパク質をコードする遺伝 子の突然変異を検出するための方法である。 ヒト前腫瘍及び腫瘍細胞及び組織を診断するためのもう１つの方法は、上皮タ ンパク質と反応性である抗体を用いてのイムノアッセイ、たとえばウェスターン ブロット又は免疫電気泳動により、二次元電気泳動により又は逆相HPLCにより、 前腫瘍及び腫瘍細胞における上皮タンパク質の後−翻訳変性を検出することによ ってである。 癌進行を阻止するために治療的介在の効率をモニターするための方法を提供す ることが本発明のさらなる目的である。 癌及び初期癌の診断方法への使用のために及び癌処置の効率をモニターするた めの方法への使用のために、癌のための初期マーカーである上皮タンパク質をコ ードするDNA，RNA又はそれらの一部からの核酸配列を含んで成るオリゴヌクレオ チドを含んで成るキットを提供することが本発明のさらにもう１つの目的である 。 本発明のさらなる目的は、診断及び検出アッセイ、特にイムノアッセイへの使 用のために、少なくとも１つの異種核リボヌクレオチドタンパク質の一部に対し て実質的に相同の、上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体を提供することで ある。 本発明の１つの目的は、RNA上の上皮タンパク質により認識される同じ結合部 位に結合することができる上皮タンパク質の阻害タンパク質類似体である。その ような類似体は、上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体の機能をインビトロ 及びインビボで競争阻害することができる。 哺乳類細胞及び組織における癌に対する感受性を検出し、そして 初期−開始腫瘍形成を診断するための方法を提供することが本発明のさらなるも う１つの目的である。本発明によれば、前記方法は、哺乳類生物サンプルを単離 し、そして癌のための初期マーカーである上皮タンパク質又はその一部をコード する核酸配列を検出することを含んで成る。 本発明はまた、哺乳類における癌及び前癌のコンピューター助力の決定方法、 及びそのために有用なアルゴリズムを提供する。 本発明のもう１つの観点は、生物学的サンプルにおけるhnRNP mRNAのコンピュ ーター化された検出方法である。 哺乳類における癌及び前癌のコンピューター化された診断方法を提供すること が本発明のもう１つの観点である。 本発明のもう１つの観点は、像分析に基づいて哺乳類における癌のコンピュー ター助力の予測方法である。 本発明のさらなる観点は、コンピューター化された像分析に基づいて異型細胞 を同定し、そして癌を予測することに有用な識別機能を生成するための方法であ る。 本発明のもう１つの観点は、二重波長像濃度学を含んで成る、哺乳類における 癌及び前癌のコンピューター化された診断方法である。 本発明のもう１つの観点は、正常又は典型的な細胞から異型細胞を決定するた めのシステムであり、ここで前記システムは、光学的像発生機、光学的像を獲得 するための装置、異型細胞に対して独得の細胞パラメーターのための光学的像を 分析するためのプロセッサー、及び識別機能を決定するためのプログラムを含ん で成る。前記識別機能は、異型又は異常細胞と典型的又は正常細胞との間を識別 する。前記システムは特に、個人における癌の進行を予測することにおいて有用 である。 本発明のさらなるもう１つの目的は、上皮細胞における遺伝子に対して実質的 に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入を含んで成る、上皮細胞 の癌のための初期マーカーである上皮タンパク質又はその一部をコードする遺伝 子又はその一部の発現を変更し、又はダウンレギュレートするための方法を提供 することである。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上皮細胞の非腫瘍増 殖を可能にする。 本発明のもう１つの目的は、化学療法薬物についてスクリーニングし、そして 化学療法及び介在薬物の効率をモニターするための方法を提供することである。 癌のための初期マーカーである上皮タンパク質をコードする核酸配列の１又は 複数のコピーをそのゲノム中に組込んでいるトランスジェニック動物を提供する ことが、本発明のさらなる目的である。前記核酸配列の組込みは、上皮細胞の複 数形又は変異体の過剰発現又は発現をもたらす。得られるトランスジェニック動 物は、癌をより進行せしめる傾向があり、そして身体における１又は複数の位置 で促進された速度で癌を進行せしめる。そのようなトランスジェニック動物は、 癌を処理し又は阻害するために有用な治療薬物をスクリーニングするために有用 である。 上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体に対して反応性の抗体を供給するこ とが本発明のさらなるもう１つの目的である。そのような抗体は、癌の診断及び 処置において有用である。 図面の簡単な説明 本発明のそれらの及び他の目的、特徴及び多くの利点は、添付される図面に関 して考慮される場合、次の特定の記載を読むことにより、良好に理解されるであ ろう。 図１は、異種リボヌクレオタンパク質Ａ１(hnRNP)及びhnRNP A2の DNAコード 配列を示す。 図２は、Burd，C.G.など、Proc.Nat'l Acad.Sci ．USA 86，9788-9792（1989） により開示されるヒトhnRNP A2の完全な DNA配列を示す。 図３は、Burd，C.G.など、Proc.Nat'l Acad.Sci ．USA 86，9788-9792（1989） により開示されるヒトhnRNP B1の完全な DNA配列を示す。 図４は、hnRNP-A2／B1と共に整列された、精製された 703D4抗原のCNBr消化物 から配列決定されたペプチドのアミノ酸配列を示す。精製された 703D4抗原のCN Br−生成されたフラグメントの配列はhnRNP-A2／B1の予測される配列を有する（ hnRNP-B1について番号づけしている）。下部の文字（アミノ酸３〜14）は、hnRN P-A2においてミッシグする交互にスプライスされたエキソンを示す。CNBr切断を 受けやすいメチオニンは、●又は★により示される。★メチオニンの後で開始す るペプチドは、トリシンSDS-PAGEによる可視化のためには小さ過ぎる(＜２kDa) 。同一のデータが、703D4抗原の３種の別々の精製から得られた。個々の場合、 ２つのバンドが配列AAPOHSIDGRVV（配列番号１）を生成し、そしていくつかの見 えるマイナーなバンドが見出され、これはたぶん、酸化されたメチオニンによる 部分的CNBr切断を示す。 図５ａ〜５ｅは、703D4抗原のポリマー逆相HPLC精製を示す。10mm×10cmの Po ros灌流ポリマーＣ₁₈カラムが、５％アセトニトリル／ 0.1％ TFA（５ａ）及び ５％メタノール／ 0.1％ HFBA(５ｄ)により平衡化された。タンパク質が、10ml ／分の流速で、５〜100 ％アセトニトリル（５Ａ）及び５〜100 ％メタノール（ ５ｄ）のグラジエントにより溶出された。画分を２つの同一のSDS-PAGEゲル上で 試験し、そして１つをクーマシーブルにより染色し（５ｃ，５ｆ）、他は 703D4 抗体との反応のためにPVDFに移された（５ｂ，５ｅ）。タンパク質標準の位置は 右側に示されている(43，29，18及び６kDa)。パネルにおいては、両性電解質、 尿素及び興味あるタンパク質からの主要タンパク質の分離を注目すること（５ｂ における画分15，16、及び５ｅにおける画分34，35）。免疫反応性陽性画分が追 加の精製のためにプールされた。 図６ａ〜６ｃは、703D4抗原のＣ₄逆相HPLC精製を示す。６ａ、Ｃ₄カラムは、0 .1％ TFA中、33〜48％アセトニトリルのグラジエントにより溶出される。６ｂ及 び６ｃは、それぞれ、溶出された画分のウェスターンブロット及びクーマシーブ ル分析を示す（49，32及び 18kDaのタンパク質標準が右側に存在する）。 図７ａは、異種核リボヌクレオタンパク質Ｂ２（hnRNP-A2は∧スキップされた 部分により示される）●、★メチオニンと共に、本発明のペプチドのアミノ酸配 列を示し；★、トリシンSDS-PAGEのためには小さ過ぎるこの MetでCNBrにより生 成されたペプチド。 図７ｂは、精製された 703D4主要（hnRNP-A2）及びマイナー(hn-RNP-B1)抗原 のCNBr切断フラグメントのＮ−末端アミノ酸配列及びおおよそのMrを示す。矢印 はタンパク質内のメチオニンの位置を示し、そしてキャロット（carrot）は、hn RNP-A2とB2とを区別する交互にスプライスされたエキソンの部位を示す。15kDa 及び 27kDaのペプチドが終結する位置での正確なメチオニンは、SDS-PAGE分析に より決定され得ない。回収され得なかったすべてのペプチドは、トリシンSDS-PA GEゲルの前からの移動から解明するためには小さ過ぎる（＜2.5kDa）。 図８は、精製された 703D4主要抗原のCNBr消化の16％トリシンSDS-PAGE分析を 示す。左のレーンは消化の前の抗原であり、矢印はア ミノ末端配列決定にゆだねられる４種の可視バンドを示すことを注目すること。 図９ａは、肺由来の細胞培養物におけるhnRNP-A2／B1 mRNA の発現を示す。９ ａ： NSCLC細胞系（NCI-H720，H157，HTB58，H520，H672，H1437，H549，H820， H4670，H1155）及びSCLC細胞系（NCI-H889，H417，H209，H345）のノザン分析。 すべての細胞は定常相において収穫され、そして材料及び方法に記載されるよう にして分析された。UV照射下で可視化される28S rRNAが定量化のために使用され る。 図９ｂは、細胞系NCI-H720，H1355，H157，H1155、正常な肺及び正常な気管支 上皮一次培養物からのmRNAのRT-PCRを示す。生成物の予測される大きさは、280b p(hnRNP-A2)及び316bp(hnRNP-B1)である。RT-PCRは、材料及び方法に記載される ようにして行なわれた。生成物は、２％アガロース TBE−ゲル上で分析され、ニ トロセルロースに移され、そしてhnRNP-A2及び -B1の両者に共通する末端ラベル 化された20ntのプライマーによりプローブされた。 図10は、hnRNP-A2／B1発現の増殖依存性制御を示す。NSCLC(H157，HTB58H23) からの全RNA 10μｇへのhnRNP A2／B1に対して特異的なプローブによるノザンブ ロットハイブリダイゼーション；形質転換された気管支上皮細胞系(IB3-1)及び 正常な気管支上皮一次培養物(NBEPC)対数相及び常状相。負荷された RNAの定量 化は、28s rRNAの臭化エチジウム染色（EtBr）により得られた。 図11Ａ〜11Ｃは、一次 NSCLCにおけるＰ31発現パターンを示す。６Ａ）鱗状細 胞癌における集中性細胞質ｐ31染色（免疫組織化学的染色、X360）。WP）肺性腺 癌での隣接する部分における粒状染色による拡散ｐ31発現。核周囲染色パターン 、昆虫を示す。（イムノペルオキシダーゼ、X360）。11Ｃ）膜発現パターンを有 する肺性腺癌 （イムノペルオキシダーゼ、X270）。 図12Ａ〜12Ｄは、非癌性肺（組織学的異常性を欠いている）におけるＰ31発現 パターンを示す。12Ａ）線毛及び非線毛性気管支上皮の先端部分に対してのｐ31 の拡散粒状局在化。基礎をなす基部細胞の弱い染色を注目すること(矢印)(免疫 組織化学的染色、X225)。12Ｂ）気管支腺における強いｐ31発現（イムノペルオ キシダーゼ、X225）。12Ｃ）気管支におけるｐ31発現（免疫組織化学的染色、X2 70）。12Ｄ）正常タイプII細胞におけるｐ31の局在化。こわれやすい（正常な） 肺胞間にそっての正常なタイプII細胞の中ぐらいの染色強度及び分布を注目する こと。（イムノペルオキシダーゼ、X360）。 図13Ａ〜13Ｂは、タイプII細胞過形成におけるｐ31発現の可視局在化を示す。 13Ａ）強い拡散細胞質ｐ31免疫反応性を示すタイプII過形成。図12Ｄにおける正 常な肺胞上皮に比較してのタイプII細胞の高められた数及び線維増多の存在を注 目すること（タイプII細胞過形成におけるｐ31の免疫組織化学）。（免疫組織化 学的染色、X360）。13Ｂは、タイプII肺胞細胞による陽性発現の肺パターンを示 す。 図14は、二重波長像濃度学のための標準化及び検量方法を示す。 図15は、Calu-3細胞及び正常な痰細胞の対照混合物における hnRNP A2 mRNA／ タンパク質を示す。 図16は、臨床学的痰細胞における hnRNP A2 mRNA／タンパク質の発現を示す。 図17は、成長するマウス肺における hnRNPの発現を示す。 発明の特定の記載 本発明は、癌のための初期検出マーカーである、単離され、そし て精製されたタンパク質、そのペプチド及び誘導体、並びにそれらの変異体であ る。前記タンパク質、ペプチド及びそれらの変異体は、特徴的には、正常細胞に は低レベルで存在し、そして前癌及びほとんどの癌細胞には高レベルで存在する 。本明細書で使用される場合、変異体とは、DNA突然変異、交互のエキソンスプ ライシング及び後翻訳変性から生じる変更されたタンパク質を包含する。そのよ うな変異体タンパク質の発現は、前癌又は癌細胞への正常細胞の形質転換に相互 関連する。 肺、結腸、腎臓、骨、乳房、前立腺、黒色腫、骨髄腫、及び同様のものの前腫 瘍及び腫瘍細胞から単離され、そして精製された、約 31kDa〜約 35kDaの分子量 を有する31のタンパク質、及びそれらのペプチド及び変異体が特に興味の対象で ある。本発明のタンパク質、及びそのペプチド及び変異体は、肺癌の進行を導び く形質転換の経路にゆだねられる上皮細胞のためのマーカーである。好ましいタ ンパク質及びその変異体は、ヒト肺癌細胞、特に非−小細胞癌細胞から単離され る。 本発明の単離され、そして精製されたタンパク質及びその変異体は、次のアミ ノ酸配列の少なくとも１つ、好ましくは１つよりも多くの下記配列を含んで成る ： AARPHSIDGRVV （配列番号１）； QEVQSSRSGRGG （配列番号２）； REKEQFRKLFI （配列番号３）； EKTKETVPLERKKRE （配列番号４）； AARPSDGRVV （配列番号５）； EREKEQFRKLFI （配列番号６）。 １つの態様において、タンパク質、そのペプチド及び変異体は、約４kDa の分 子量により特徴づけられ、そして配列番号３のアミノ 酸配列を含んで成る。もう１つの態様においては、タンパク質、そのペプチド及 び変異体は、約 27kDaの分子量により特徴づけられており、そして配列番号１の アミノ酸配列を含んで成る。さらにもう１つの態様において、タンパク質、その ペプチド及び変異体は、約 13kDaの分子量により特徴づけられ、そして配列番号 １のアミノ酸配列を含んで成る。さらに本発明のもう１つの態様においては、タ ンパク質、そのペプチド及び変異体は、15kDaの分子量により特徴づけられ、そ して配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る。 １つの態様において、タンパク質、そのペプチド及び変異体は、少なくとも１ つ又は複数の異種核リボヌクレオチドタンパク質（hn-RNP）と部分的なアミノ酸 配列相同性を共有する。本発明のタンパク質、そのペプチド及び変異体は、hn-R NP A1，hn-RNP A2，hn-RNP-B1，hn-RNP B2，hn-RNP C1，hn-RNP C2及び hn-RNP C3から成る群から選択された１又は複数のhn-RNPと部分的アミノ酸相同性を共有 することができる。特定の態様においては、タンパク質は、hn-RNP A2と部分的 アミノ酸配列相同性を共有する。もう１つの態様においては、タンパク質は hn- RNP B1と部分的アミノ酸配列相同性を共有する。本発明の好ましい態様において は、タンパク質は、hn-RNP A2及び hn-RNP B1と部分的アミノ酸配列相同性を共 有する。部分的アミノ酸配列相同性とは、タンパク質、そのペプチド又は変異体 が少なくとも１つのhn-RNPと少なくとも70％の配列相同性、好ましくは少なくと も約90％の配列相同性、より好ましくは少なくとも１又は複数のhn-RNPと少なく とも約95％の配列相同性を有することを意味する。 １つの態様において、タンパク質、そのペプチド又は変異体は、下記アミノ酸 配列又はその一部と配列相同性を共有する： 1 MEktletvplerkkREKEQFRKLFIGGLSFETTEESLRNYYEQWGKLTDCVVMRDPASKR 61 SRGFGFVTFSSMAEVDAAMAARPHSIDGRVVEPKRAVAREESGKPGAHVTVKKLFVGGIK 121 EDTEEHHLRDYFEEYGKIDTIEDTDRQSGKKRGFGFVTFDDHDPVDKIVLQKYHTINGH 181 NAEVRKALSRQEMQEVQSSRSGRGGNFGFGDSRGGGGNFGPGPGSNFRGGSDGYGSGRGF 241 GDGYNGYGGGPGGGNFGGSPGYGGGRGGYGGGGPGYGNQGGGYGGGYDNYGGGNYGSGNY 301 NDFGNYNQQPSNYGPMKSGNFGGSRNMGGPYGGGNYGPGGSGGSGGYGGRSRY(配列番号7) もう１つの態様においては、タンパク質、そのペプチド又は変異体は、下記ア ミノ酸配列又はその一部と配列相同性を共有する： 1 MEREKEQFRKLFIGGLSFETTEESLRNYYEQWGKLTDCVVMRDPASKR 49 SRGFGFVTFSSMAEVDAAMAARPHSIDGRVVEPKRAVAREESGKPGAHVTVKKLFVGGIK 109 EDTEEHHLRDYFEEYGKIDTIEDTDRQSGKKRGFGFVTFDDHDPVDKIVLQKYHTINGH 169 NAEVRKALSRQEMQEVQSSRSGRGGNFGFGDSRGGGGNFGPGPGSNFRGGSDGYGSGRGF 229 GDGYNGYGGGPGGGNFGGSPGYGGGRGGYGGGGPGYGNQGGGYGGGYDNYGGGNYGSGNY 289 NDFGNYNQQPSNYGPMKSGNFGGSRNMGGPYGGGNYGPGGSGGSGGYGGRSRY(配列番号8) 変異体は、１又は１よりも多くのアミノ酸によりアミノ酸配列が変化好ましく は10個よりも多くのアミノ酸により変化せず、好ましくは５個よりも多くないア ミノ酸により変化し、より好ましくは１〜３個のアミノ酸により変化するタンパ ク質及びペプチドを包含するが、但しそれらだけには限定されない。アミノ酸変 化は、保存性置換、欠失及び同様のものであり得る。それらのアミノ酸変化の例 は、DNA／RNA 結合部位を変更するための芳香族アミノ酸の変更；アルギニン、 リシン又はヒスチジン、たとえばCOOH末端近くのＮ^G，Ｎ^G−ジメチル−アルギニ ンのメチル化；ホスホセリン又はホスホトレオニンのメチル化；ブロックされた Ｎ−末端グリコシル化；及び同様のものを包含するが、但しそれらだけには限定 されない。変異体はまた、タンパク質又はペプチドの交互のmRNAフプライス形を 包含する。 アミノ酸の１又は複数の後−翻訳変性を有するタンパク質及びペ プチドもまた、変異体として包含される。後−翻訳変性の例は、グリコシル化、 リン酸化、メチル化、ADPリボシル化及び同様のものを包含するが、但しそれら だけには限定されない。１つの態様においては、変異体は、Ｎ−末端アミノ酸に 対するメチル化、又はセリン及びトレオニンのリン酸化の後−翻訳変性を有する 。もう１つの態様においては、変異体は、タンパク質結合に影響を及ぼすための Ｃ−末端グリシンの後−翻訳変性を有する。 用語変異体とはまた、タンパク質、ペプチド、及びそれに結合される他の構成 成分、たとえば放射性ラベル、ビオチン、フルオレセイン及び化学ルミネセント ラベル及び同様のものを有することができる後−翻訳変性されたタンパク質及び ペプチドを包含する。 阻害タンパク質又はペプチド類似体もまた、本発明に包含される。そのような 阻害タンパク質又はペプチド類似体は、RNA上のその結合部位に対する上皮タン パク質の結合を競争的に阻害することができる。 hnRNP A2／B1とアミノ酸配列相同性を共有するものとしての 703D4初期肺癌検 出抗原の同定は、タンパク質の hnRNPグループについての新しい知識の点から刺 激的である(Burd and Dreyfuss，Science ，Vol.265（July 29）pp.615-621，19 94)。hnRNPのファミリーは、プレーmRNAエキソンスプライシング及びスプライス 部位選択を包含する RNAプロセッシングにおいて、及びまた、転写、DNA複製及 び組換えにおいて役割を有する(Dreyfussなど., Ann Rev Biochem.，Vol.62，p p289-321，1993)。いくつかの hnRNPは、前に報告された免疫組織化学的局在化 及び非細胞分別の両者と一致する、核からシトソールへのmRNAのシャトルに包含 される。種々の後−翻訳変性は、hnRNPのファミリーのメンバーのために報告さ れている。 本発明の上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体は、当業界に おいて知られている方法、たとえば二次元電気泳動、逆相HPLCにより同定される (Karn，J.など．J.Biol.Chem. 252，No.20，pp7307-7322，1977; Anderson，N.L .Electrophroesis 12，pp.907-930，1991; Boffa，L.C.など．Biochemical an d Biophys.Res.Commun ． ，74，No.3，1977; Williams，K.R.など．Proc.Natl.Ac ad.Sci USA ，vol.82，pp.5666-5670，1985; Kumar，A．など．J.Biol.Chem.，vo l.261，No.24，pp.11266-11273，1986; Medzihradsky，K.F.など．Am.Soc.Mass. Spectrom ，vol.5，pp.350-358，1994)。１つの方法は、二次元ゲル分析を使用す る。酵素処理による及びそれによらない精製された上皮タンパク質、ペプチド又 は変異体は、一次元において電気泳動される。二次元分析は、約pH８〜約 9.5の pHグラジエント下で行なわれる（Anderson，Electrophoresis 12: 907，1991） 。タンパク質、ペプチド又は変異体は、当業界において知られている方法、たと えばタンパク質染色、放射性ラベルされた代謝ラベル、抗体及び同様のものによ り検出され得る。移動パターンの変動は、後−翻訳変性を表示する。 後−翻訳変性はまた、二次元ゲル電気泳動又はエレクトロスプレイ API−マス スペクトロメトリーにより分離されたサンプルを処理するために特定の酵素、た とえばホスファターゼ、グルコシダーゼ及び同様のものを用いて決定され（Medz ihradsky，Am.Soc.Mass.Spec ．，5: 350，1994）、そして処理されたサンプルの 分子量が非処理のサンプルと比較される。 １つの態様において、本発明は、短期の正常な一次気管支上皮培養物に比較し て、癌細胞系における及び形質転換された気管支上皮細胞における初期肺癌上皮 タンパク質の調節解除及び過剰発現を示す。このデータは、線維芽細胞を包含す る形質転換された細胞における発現の調節解除を示した密接に関連する分子hnRN P-A1に対する これまでの研究に匹敵する(Biamonti，J.Mol.Biol.，Vol.230，pp77-89，1993) 。腫瘍細胞系を包含する、形質転換された細胞系においては、高レベルのhnRNP- A1発現が定常相に達した培養物において維持され、そして正常な一次線維芽細胞 培養物は細胞増殖の対数相の間でのみ、hnRNP-A1を発現する（図10）。 タンパク質及びその変異体は、天然源から単離され得、又は当業界において知 られている技法により化学的に合成され又は組換え的に生成され得る。化学的合 成のための技法は、J.M.Steward and J.D.Young,“Solid Phase Peptide Synthe sis”，W.H.Freeman & Co., San Francisco，1969; M.Bodansky，など.,“Pepti de Synthesis”，John Wiley & Sons，Second Edition，1976、及びJ.Meienhofe r,“Hormonal Proteins and Peptides”Vol.2，p.46，Academic Press，New Yor k，1983及びE.Schroder and K.Kubke,“The Peptides”，Vol.1，Academic Pres s，New York，1965 に記載されている。 タンパク質、そのペプチド及び変異体は、少なくとも約90％の純度、好ましく は少なくとも約95％の純度、より好ましくは95％以上の純度のものである。 本発明はまた、前癌及び癌のための初期マーカーである、上皮タンパク質、そ のペプチド及び変異体を、それぞれ別々の分子種として又は複合体の形で含んで 成る組成物を包含する。組成物は、配列番号１〜６により定義される少なくとも １つのアミノ酸配列又はその一部を有する１又は複数のタンパク質、そのペプチ ド及び変異体を含んで成る。＊：第２の一次肺癌の患者は、非癌患者（ｐ＜0.05）又は非エンド ポイント患者（ｐ＜0.05）のいづれかよりも有意に高い光学密 度を有する。 †：すべての94人の一次肺癌患者は中国人男性である。注 ：生物学的組織において、光学密度は、0.0(透明)〜1.2(光を透 過できない)の理論的範囲に及ぶ。それらのサンプルのために は、光学密度は、hnRNP免疫染色によりブロックされたバック グラウンド光の割合であるとおおまかには思われる。 全体的に、初年度、SPLCを進行せしめる危険性は、595のうち13 であった(2.2％、表13を参照のこと)。hnRNPを過剰発現した患者の15人のうち10 人（67％の陽性の予測値）が、それらの初期試験の10〜12カ月後、SPLCを進行せ しめた。陰性であると予測された25人のうちわずか３人（12％）が、SPLCを進行 せしめ（相対的危険性 5.6％、感度77％、特異性82％）、これは80％の全体の精 度であった。形態学的基準のための13のSPLCの痰の評価は、腫瘍を示す前臨床学 的形跡を有するわずか１人の患者を検出した（重度の異型化生、感度８％）。そ れらのデータは、hnRNP A2／B1過剰発現のための免疫染色が、SPLCを９倍、検出 することにおいて通常の痰細胞形態学の感度を高めた（８％から77％に）ことを 示唆する。 全体の第２の一次肺癌危険度：13／595，2.2％ 陽性の予測値： 10／15， 67％ 予測された陰性間の危険度： 3／25， 12％ 陽性試験の相対的危険度： 250／45， 5.6 感 度：77％ 正確な95％二項信頼区間、46％〜95％。 特異性：82％ 正確な95％二項信頼区間、62％〜94％。 １°LC検出 スクリーニングのために登録されたすべての 6,285人の適切な YTC鉱夫は、中 国人男性であった。全体的には、初年度間で１°LCを進行せしめる危険性は、62 85中58であった(0.9％)。すべての１°LC患者は、YTC及び Johns Hopkinsのパネ ル臨床医による一致した“最良の情報”診断により確認された。最っとも通常に 切除される一次腫瘍の細胞型は鱗状細胞癌（48.9％）であり、そして腺癌は一次 腫瘍の 4.2％を占め、そして大細胞及び小細胞癌は１つの症例に関して、それぞ れ 2.1％であった。組織学的診断を有さない残る１°LC患者は、従来の治療を受 ける。スクリーニングで１°LCを有さない患者は、続けられ、そして２年までの 間、癌を有さないことがわかった。 症例／非症例状態に対して隠された Johns Hopkinsでの研究者は、57人の１° LC患者及び76人の非患者についての痰検体を評価した。検体は、登録で63才の平 均年齢の94人の鉱夫のために満足のいくものであると思われた（45人の患者及び 49人の年齢−適合された対照、表14）。90％以上が過去に喫煙していたが、研究 のために登録する時点では、わずか２／３が喫煙していた。 ＊：すべての患者の人種は中国人であり、そしてすべては男性で あった †：適用されない。 対照と比較される場合、この研究の間、肺癌を進行せしめた患者 は、痰上皮細胞の有意に高い光学密度により明らかなように hnRNPの過剰発現を 示した（表12）。hnRNPの過剰発現により陽性であることが予測される54人のう ち、39人（69％）は肺癌を進行せしめ、ところが陰性であることが予測された40 人のうち、わずか８人（20％）が、73％の全体の精度を伴って肺癌を進行せしめ た。１°LCを進行せしめた患者及び対照の類似する割合がそれらの痰において中 ぐらいの異型を発現した（それぞれ、４／45及び４／49、又は９％及び８％）。 45人の癌患者のうち10人（22％）は、それらの痰に腫瘍細胞を示したが、ところ が対照は示さなかった。それらのデータは、hnRNP過剰発現が、１°LCを検出す るために通常の（Papanicolaon−染色された）痰細胞形態学の感度を、約３倍（ 22％から72％に）、高めたことを示す。 全体の一次肺癌危険度： 56／6285， 0.9％ 陽性の予測値： 37／54， 69％ 予測された陰性間の危険度： 8／40， 20％ 陽性試験の相対的危険度：1480／432， 3.4 感 度：82％ 正確な95％二項信頼区間、68％〜92％。 特異性：65％ 正確な95％二項信頼区間、50％〜78％。 結論 痰検体における hnRNPのアップ−レギュレーションは、たとえ肺癌を示す細胞 学的変化がわずか１人の患者に見出されたとしても、12カ月以内での第２の一次 肺癌の検出においては、80％の精度であった。一次肺癌研究においては、過剰発 現された hnRNPは前臨床学的一次肺癌の同一定において73％の精度であり、そし て一次肺癌のわずか22％が細胞学的に診断された。 ２種の予測研究は、それらの痰における hnRNPアップ−レギュレーションを有 する患者の67％及び69％が、それぞれ 2.2％及び 0.9％のバックグラウンド肺癌 危険性と比較して、追跡調査の初年度で肺癌を進行せしめることを正確に予測し た。従って、hnRNP発現をモニターするためへの癌細胞の使用は、前臨床学的癌 検出の精度をひじょうに改良する。 例 11 上皮タンパク質mRNAの発現の検出のために生成ヨウ化物対比 染色を用いての螢光現場ハイブリダイゼーション ヨウ化プロピジュウム（PI）対比染色と組合しての螢光現場ハイブリダイゼー ション（FISH）を用いて、Wulf，M.など、Biotechniques ，Vol.19，No.3，pp36 8-372，1995 により記載されるようにして、骨断片における上皮タンパク質、そ のペプチド又は変異体のmRNA発現を示した。 手術による切除の後、組織サンプルを10％ホルムアルデヒド（pH 7.0）におい てすぐに固定し、そして非脱灰化し、パラフィンにより包埋された検体をFISHの ために使用した。ハイブリダイゼーションの前での断片の前処理は、Sandberg， M.など、J.Bone Joint Surg.，71: 69-71，1989 により記載されるように行なわ れる。予備ハイブリダイゼーションのためには、断片を、300μｌの予備ハイブ リダイゼーション緩衝液（50％脱イオン化されたホルムアミド、0.3ＭのNaCl、1 0mMのトリス−HCl、pH 7.5；10mMのNaHPO₄、pH 6.8；５mMのEDTA； 0.1×Denhar dt'sの10mMジチオトレイトール；0.25mg／mlの酵母tRNA〔Sigma Chemical，St.L ouis，MO〕；12.5％の硫酸デキストラン； 0.5mg／mlのサケ精子 DNA〔Sigma Ch emical〕）により被覆し、そして保湿チャンバーにおいて42℃で２時間インキュ ベートする。ハイブリダイゼーションのためには、次の配列：５′-GAGTCCGGTTC GTGTTCGTC-3 ′（配列番号11）及び５′-TGGCAGCATCAACCTCAGC-3′（配列番号18 ）を有する上皮タンパク質のためのジゴキシデニン−ラベルされた二本鎖cDNAプ ローブを使用する。このプローブは、Dig-Labeling Kit（Boehringer Mannheim ，Mannheim, Germany）のプロトコールに従って、ジゴキシゲニンによりラベル される。ハイブリダイゼーションの前、ラベルされたプローブを、１μｇ／mlの 濃度にプレハイブリダイゼーション緩衝液と共に混合し、95℃で10分間、加熱し 、そしてすばやく、氷上で急冷する。過剰のプレハイブリダイゼーション緩衝液 をスライドから除去し、そして約30μｌのハイブリダイゼーション溶液を断片に 適用する。断片をカバーガラスにより被覆し、ラバーセメントにより密封し、そ して湿潤チャンバーにおいて42℃で18時間ハイブリダイズせしめる。後−ハイブ リダイゼーション洗浄段階を、Weithege，T.，など．Pathd.Res.Pract.，187: 9 12-915，1991により記載されるようにして行なう。 プローブ検出を、FITC(フルオレセインイソチオシアネート；Boehringer Mann heim)に接合される抗−ジゴキシゲニン抗体を用いて行なう。結合しなかった接 合体を、リン酸緩衝溶液(PBS)(3.8mMのNaH₂PO₄; 7.8mMのNa₂HPO₄；0.13ＭのNaCl )により10分間２度洗浄することによって除去した。断片を、PBS（500ng／ml） 中、PI(Boe hringer Mannheim)により室温で５分間、対比染色する（断片当たり30μｌ）。 過剰のPIを、PBSによる洗浄、続く脱水（70％、96％、100％エタノール）により 除去する。断片を空気乾燥せしめ、そしてグリセロール／ PBS溶液に固定する。 分析のために、螢光顕微鏡(Leitz Diaplan，Wetzlar，Germany)を用いる。 FISHを用いて、前癌及び癌細胞における上皮タンパク質、ペプチド又は変異体 mRNAの示差発現を、正常細胞に比較して決定する。 例 12 細胞特徴のコンピューター処理された像分析に基づいて癌 を予測するための予測識別機能を生成するためのコンピュ ーター処理方法 この方法は、正常細胞と異型細胞との区別、及び個人が癌を進行せしめるよう になるかどうかの決定又は予測を可能にする。本明細書で使用される場合、異型 細胞とは、機能的に及び／又は形態学的に変更された細胞、たとえば前癌細胞及 び癌細胞を意味する。そのような予測は、個人における癌のいづれかの臨床学的 徴候よりもかなり先に行なわれ得る。予測は、癌のいづれかの臨床学的徴候の２ 年又はそれ以上早く行なわれ得る。そのような方法は、癌の危険性があるそれら の個人を同定する場合、不変であり、そして癌の進行を阻害し、又は妨げるため の処置の初期介入を可能にする。 前記方法は、典型的又は正常細胞に比較して、発現が異なる細胞特徴又はラベ ルの測定に依存する。それらの特徴又はラベルは、下記に列挙される１又は複数 のものを包含する。適切な統計学的ソフトウェアと組合しての像分析は、癌の進 行の予測である細胞特徴の同定を可能にする。像分析は、癌及び前癌との区別を 示す細胞特徴又はラベルの差異又は変更を検出する。種々のパラメーターが、ラ ベルされ、そして癌のインジケーター又は、予測体として、たとえ ば形態学の変更、高められた又は変更されたmRNA発現、高められた又は変更され た癌タンパク質、細胞レセプターの発現又は一方では細胞レセプターの低下、前 癌又は癌細胞に対してユニークであるアポプトシス又は他の細胞出来事に関連す る因子（但し、それらだけには限定されない）として測定され得る。 痰を予測する本発明の方法は、それがコンピュータアシストされ、そして癌の 進行を予測する場合、ひじょうに正確であることにおいて明確な利点を有する。 既知の陽性癌患者、癌を進行することが知られている患者及び陰性のまま存続 することが知られている陰性個人から採取された、保管された組織又は細胞は、 癌及び前癌細胞に対してユニークなパラメーターを決定するための像分析方法の ための検体を付与するために使用される。測定された細胞ラベル又は特徴に基づ けば、識別機能は、癌を有さない個人と比較して、癌を進行せしめる個人の検体 を区別するパラメーターの最良な線状組合せから誘導され得る。この識別機能は 、未知のサンプルにおける癌の予測のために有用である。 多くの場合、癌及び前癌に対してユニークな細胞特徴の検出への使用のための 追加のパラメーターを同定するためにラベルされたプローブ又はクロモゲンを添 加することは好都合である。たとえば、ラベルされたプローブは、正常なものに 比較して、癌又は前癌においていくらかの態様で変性される、mRNA，DNA、タン パク質、糖タンパク質、細胞レセプター、炭水化物及び同様のものを特異的に同 定することができる。１つの態様において、そのラベルされたプローブは、hn-R NP mRNAを検出する。 像分析は、いづれかの立体電子アレイ、たとえばビデオ顕微鏡処理の間に記録 されるものから、透過された、反射された、又は螢光 の照射を記録する、充電連結装置(CCD)のアナログ又はデジタルカメラにより行 なわれ得る。正常細胞、組織又は抽出物から癌又は前癌を区別するいづれかの像 が、癌又は前癌を予測する識別機能を決定するために本発明に使用され得る。 市販の装置、たとえばMeta Morph 2.x(Universal Imaging Corporation，West Chester，PA)は、細胞の 100以上の特徴を自動的に測定するために利用できる 。“測定”メニューを参照し、そして“物体測定値の形状化”を選択することに よって、使用者はデータファイルを計算し、そして登録するために測定値を選択 することができる。たとえば、Meta Morphの“物体分類機セット(Object Classi fer Set)”、Version 21における 108の可能な測定値は、下記に示される： “合計領域(Total area)”、“画素領域(Pixel area)”、“領域(Area)”、“ 孔領域(Hole area)”、“相対的孔領域(Relative hole area)”、“標準領域計 数(Standard area count)”、“周囲(Perimeter)”、“面心Ｘ(Centroid X)”、 “面心Ｙ(Centroid Y)”、“幅(Width)”、“高さ(Hight)”、“配向(Orientati on)”、“長さ(Length)”、“幅(Breadth)”、“繊維の長さ(Fiber length)”、 “繊維の幅(Fiber breadth)”、“形状因子(Shape factor)”、“楕円形因子(El l.form factor)”、“内径(Inner radius)”、“外径(Outer radius)”、“平均 半径(Mean radius)”、“等価半径(Equiv．radius)”、“等価球体積(Equiv．sh erevol.)”、“等価扁長体積(Equiv．prolate vol.)”、“等価扁円体積(Equiv ．oblate vol.)”、“等価球表面積(Equiv．shere surface area)”、“平均グ レー値(Average gray ralue)”、“合計グレー値(Total gray value)”、“光学 密度(Optical density)”、“統合されたOD(Integrated OD)”、“強さの中心Ｘ (Intensity center X)” 、“強さの中心Ｙ(Intensity center Y)”、“ラジアル分散(Radial dispersion )”、“表面差異モーメント(Texture Difference Moment)”、“表面逆差異モー メント(Texture Inverse Difference Moment)”、“OD分散(OD Variance)”、“ OD相対的低領域(OD Relative Low Area)”、“OD相対的中間領域(OD Relative M edium Area)”、“OD相対的高領域(OD Relative High Area)”、“OD相対的低量 (OD Relative Low Amount)”、“OD相対的中間量(OD Relative Medium Amount) ”、“OD相対的高い量(OD Relative High Amount)”、“OD相対的低い距離(OD R elative Low Distance)”、“OD相対的中間距離(OD Relative Medium Distance) ”、“OD相対的高い距離(OD Relative High Distance)”、“EFA調和A0(EFA Har monic A0)”、“EFA調和C0(EFA Harmonic C0)”、“EFA調和２、半−主要軸(EFA Harmonic 2，Semi-Major Axis)”、“EFA調和２、半−マイナー軸(EFA Harmoni c 2，Semi-Minor Axis)”、“EFA調和２、半−主要軸角度(EFA Harmonic 2，Sem i-Major Axis Angle)”、“EFA調和２、楕円領域(EFA Harmonic 2，Ellipse Are a)”、“EFA調和２、軸比(EFA Harmonic 2，Axial Ratio)”、“EFA調和３、半 −主要軸(EFA Harmonic 3，Semi-Major Axis)”、“EFA調和３、半−マイナー軸 (EFA Harmonic 3，Semi-Minor Axis)”、“EFA調和３、半−主要軸角度(EFA Har monic 3，Semi-Major Axis Angle)”、“EFA調和３、楕円領域(EFA Harmonic 3 ，Ellipse Area)”、“EFA調和３、軸比(EFA Harmonic 3，Axial Ratio)”、“E FA調和４、半−主要軸(EFA Harmonic 4，Semi-Major Axis)”、“EFA調和４、半 −マイナー軸(EFA Harmonic 4，Semi-Minor Axis)”、“EFA調和４、半−主要軸 角度(EFA Harmonic 4，Semi-Major Axis Angle)”、“EFA調和４、楕円領域(EFA Harmonic 4，Ellipse Area)”、“EFA調和４、軸比(EFA Harmonic 4，Axial Ra tio)”、“EFA調和５、半−主要軸( EFA Harmonic 5，Semi-Major Axis)”、“EFA調和５、半−マイナー軸(EFA Harm onic 5，Semi-Minor Axis)”、“EFA調和５、半−主要軸角度(EFA Harmonic 5， Semi-Major Axis Angle)”、“EFA調和５、楕円領域(EFA Harmonic 5，Ellipse Area)”、“EFA調和５、軸比(EFA Harmonic 5，Axial Ratio)”、“EFA調和６、 半−主要軸(EFA Harmonic 6，Semi-Major Axis)”、“EFA調和６、半−主要軸角 度(EFA Harmonic 6，Semi-Major Axis Angle)”、“EFA調和６、楕円領域(EFA H armonic 6，Ellipse Area)”、“EFA調和６、軸比(EFA Harmonic 6，Axial Rati o)”、“EFA調和７、半−主要軸(EFA Harmonic 7，Semi-Major Axis)”、“EFA 調和７、半−マイナー軸(EFA Harmonic 7，Semi-Minor Axis)”、“EFA調和７、 半−主要軸角度(EFA Harmonic 7，Semi-Major Axis Angle)”、“EFA調和７、楕 円領域(EFA Harmonic 7，Ellipse Area)”、“EFA調和７、軸比(EFA Harmonic 7 ，Axial Ratio)”、“EFA調和８、半−主要軸(EFA Harmonic 8，Semi-Major Axi s)”、“EFA調和８、半−マイナー軸(EFA Harmonic 8，Semi-Minor Axis)”、“ EFA調和８、半−主要軸角度(EFA Harmonic 8，Semi-Major Axis Angle)”、“EF A調和８、楕円領域(EFA Harmonic 8，Ellipse Area)”、“EFA調和８、軸比(EFA Harmonic 8，Axial Ratio)”、“EFA調和９、半−主要軸(EFA Harmonic 9，Sem i-Major Axis)”、“EFA調和９、半−マイナー軸(EFA Harmonic 9，Semi-Minor Axis)”、“EFA調和９、半−主要軸角度(EFA Harmonic 9，Semi-Major Axis Ang le)”、“EFA調和９、楕円領域(EFA Harmonic 9，Ellipse Area)”、“EFA調和 ９、軸比(EFA Harmonic 9，Axial Ratio)”、“EFA調和10、半−主要軸(EFA Har monic 10，Semi-Major Axis)”、“EFA調和10、半−マイナー軸(EFA Harmonic 1 0，Semi-Minor Axis)”、“EFA調和10、半−主要軸角度(EFA Harmonic 10，Semi -Major Axis Angle)”、“EFA調和10、楕円領域(EF A Harmonic 10，Ellipse Area)”、“EFA調和10、軸比(EFA Harmonic 10，Axial Ratio)”、“EFA調和11、半−主要軸(EFA Harmonic 11，Semi-Major Axis)”、 “EFA調和11、半−マイナー軸(EFA Harmonic 11，Semi-Minor Axis)”、“EFA調 和11、半−主要軸角度(EFA Harmonic 11，Semi-Major Axis Angle)”、“EFA調 和11、楕円領域(EFA Harmonic 11，Ellipse Area)”、“EFA調和11、軸比(EFA H armonic 11，Axial Ratio)”、“EFA調和12、半−主要軸(EFA Harmonic 12，Sem i-Major Axis)”、“EFA調和12、半−マイナー軸(EFA Harmonic 12，Semi-Minor Axis)”、“EFA調和12、半−主要軸角度(EFA Harmonic 12，Semi-Major Axis A ngle)”、“EFA調和12、楕円領域(EFA Harmonic 12，Ellipse Area)”、“EFA調 和12、軸比(EFA Harmonic 12，Axial Ratio)”、“EFA調和13、半−主要軸(EFA Harmonic 13，Semi-Major Axis)”、“EFA調和13、半−マイナー軸(EFA Harmoni c 13，Semi-Minor Axis)”、“EFA調和13、半−主要軸角度(EFA Harmonic 13，S emi-Major Axis Angle)”、“EFA調和13、楕円領域(EFA Harmonic 13，Ellipse Area)”、“EFA調和13、軸比(EFA Harmonic 13，Axial Ratio)”。 強力な市販の統計学的装置、たとえば WindowsのためのSPSS 7.0(SPSS，Inc. ，Chicago，IL)が、マイクロコンピューターデータ管理及び分析のために利用で きる。そのアルゴリズムは、メインフレームコンピューターに基づくSPSSソフト ウェアに使用されるアルゴリズムと同一であり、そしてその統計学的結果は、メ インフレーム上で計算された結果と同じほど正確であろう。 SPSS装置は、グループメンバーシップの直接的な予測を提供する識別分析を包 含する。この方法においては、変数の最良の線状組合せが、いくつかのグループ 間を区別するために自動的に選択される。前記変数のための係数が、できるだけ 大きな合計の平方和に対す るグループ間の平方和の比を得るためにコンピューターにより選択される。 本発明は、グループメンバーシップ（前癌又は癌症例、又は対照）の直接的な 予測を付与するための細胞測定値（市販の像形成装置により作られた）の最適な 組合せを選択するために市販の統計学的装置を用いて、識別機能アルゴリズムを 決定するための方法を提供する。 １つの態様においては、肺癌を予測するための識別機能は、癌を進行せしめる であろうそれらの個人を予測することにおいて約 100％の精度を提供する、光学 密度、核表面差異モーメント及び楕円形フーリエ調和(elliptical Fourier harm onic)の核領域のパラメーターを利用する。低い精度で満足する場合、その識別 機能は、核パラメーターを伴わないで光学密度にのみ基づかれ得る。 異なった位置からの異なった組織又は上皮細胞は、前記同じ識別機能又は代り の識別機能を利用することができる。識別機能を決定するための方法は、組織、 細胞型、及び所望する精度の程度に依存して、対応する異なった係数と共に、他 の組の変数の選択を導びくことができる。既知の臨床結果を有する患者の収容さ れた検体の見込みある採取から計算される識別機能による像分析の方法は、予測 識別機能等式の決定を可能にする。従って、この方法は、見込みある検体が得ら れるいづれかの癌、たとえば肺、乳、肝臓、前立腺、子宮、卵巣、胃腸管、食道 及び同様のものの癌（但し、それらだけには限定されない）のための予測識別機 能等式の決定において有用である。像分析に使用されるそのような識別機能は、 癌を進行せしめるであろう個人の予測を可能にする。 例 13 ラベルされたhnRNP mRNAを有する収容された痰細胞の二重 −波長像濃度学に基づいて肺癌を予測する識別機能を開発 するための方法 アップ−レギュレートされたhnRNP mRNAを、ビオチン−11−UTPによりラベル され、そしてペルオキシダーゼ−DAB により免疫染色された上皮細胞の強さ及び 頻度により視覚的に認識することができる。視覚的な解釈は、バックグラウンド （成熟）上皮細胞に対しての免疫ラベルされた情報的な（弱い異型の）上皮細胞 の“示差表示”を比較する。精度は、ビデオ顕微鏡を用いて、免疫ラベルされた 上皮細胞を通して透過された光の強さの客観的な測定により改良されて来た。染 色クロモゲンに対して最適化された光の２つの波長、600nm及び 510nmで行なわ れるこの技法は、二重−波長像濃度学（dual-wavelength image densitometry） と呼ばれ、そして測定は次のようにして行なわれる： １．Koehler 照明（標準実験の実施） 最とも明るく、均等に照明された領域を達成するための Koehler照明のために 顕微鏡を調節することによって開始する。この調節は、光源からの光線（光源及 びアパーチュアダイアグラムを包含する接合“アパーチュア”面に焦点が合って いる）が、その接合“領域”面（検体、現場ダイアグラム及び網膜を包含する） を通過する場合、平行であることを付与する。 ａ．検体を適切な目的物に焦点を合わせる。本研究においては、検体は50倍で 映像化された。 ｂ．アパーチュア及び現場ダイアグラムを減じ、そして現場ダイアグラムの鋭 い像が検体上に重ねられるまで、コンデンサーの焦点を合わす。 ｃ．可視領域すぐ向こうに現場ダイアグラム開放する。 ｄ．飽和を伴わないでCCD(充電結合装置)ビデオカメラの力学的 範囲を最大にするようアパーチュアダイアグラムを調節する。 次の段階は、“Tockman．out”落と込みとしてファイル構造に同定される、Me ta Morph Image Analysis Program，Universal Imaging Corp，West Chester，P A の測定メニュー“光学密度適用”中にプログラムされている。 ２．CCD の検量及び対照像の獲得（11の対照像を得る） ａ．濃度測定のために使用されるべき暗対照像（dark reference image）を調 製する。この暗対照像は、ブロックされた光源を有する16のフレームの平均によ り獲得される。 ｂ．白対照像(white reference image)を調製する。この白対照像は、600nmの フィルターを適所に有する検体スライドのブランク部分の16のフレームの平均に より獲得される。第２の白対照像は、510nmのフィルターを適所に有する検体ス ライドから得られる。暗対照像は、貯蔵の前、白対照像から画素ごとに引き算さ れる（バックグラウンド引き算）。 ｃ．第１の中性密度像の獲得。0.2の中性密度フィルターを光路に配置し、検 体スライドのブランク部分の16のフレームを 600nmで平均化する。貯蔵の前、こ の像は、光学及び照明不規則性を修正するために、バックグラウンド引き算され た白対照像により割り算される(画素ごとに)(色相修正)。この工程を、510nmで 反復する。 ｄ．第２の中性密度像の獲得。0.4の中性密度フィルターを光路に配置した後 、（ｃ）の工程を反復する。 ｅ．密度検量のプロット。暗、白、第１及び第２の中性密度像について CCDに より記録された、透過された光の平均を取った後、コンピューターは光学密度（ 横座標）に対するグレースケールの光の強さ（８−ビット、256間隔の縦座標上 に）の４つの点の検量曲線を構成する。１つの検量曲線が個々の波長のために構 成される。初 日のための検量曲線は、標準曲線として任意に選択され、そして続く測定セッシ ョンからの検量曲線は、実験の間、測定値の適合性を確かめながら、それらに対 して標準化される。 ｆ．陽性の対照像の獲得。mRNAアンチセンスプローブによりハイブリダイズさ れた、免疫染色されたCalu-3培養肺癌細胞を選択する。600nmでの細胞像を、16 のフレーム、バックグラウンド引き算及び色相修正を平均化した後に獲得する。 第２の像を、フィルターホイールを自動的に回転することによって、細胞位置（ 位置合せ）のいづれの変化も伴わないで 510nmで獲得する。 ｇ．陰性の対照像を、センスプローブがハイブリダイズされている同一の対照 スライドから類似する態様で獲得する。 ３．像対の獲得 個々の試験スライドは、映像化のための上皮細胞領域を選択する細胞技術者に より走査される。個々の像を、16のフレーム、バックグラウンド引き算及び色相 修正を、位置合せの変更を伴わないで平均化することによって、まず 600nmで及 び次に、510nmで獲得する。個々の像対を、同じ患者のために像の“スタック” にセーブする。個々のスタックを、11の対照像のスタックを包含する光学ディス クファイルにセーブする。 ４．像対の測定 （測定の前、コンピューターが対照スタックの結合性を調べ、密度計測検量を 標準化し、患者の像のスタックを回収し、そしてコンピュータースクリーン上に 第１の領域の像を配置する。） ａ．測定されるべき核の選択。マウスクリックは、カーソルが測定されるべき 第１の細胞の核をおおう場合、細胞の 400倍への拡大及びその領域の中央へのそ の配置をコンピューターに引き起こす。 ｂ．興味ある核領域の概略。マウスの急速な引っ張りは、像にお ける他の構造体から核を分離するために核の外形を描く。 ｃ．核酸の限界。核の実際の端を、透過された光の画素値により決定する。包 含される値の限界は、最良の適合性が達成されるまで、技術者による高められ、 そして低められる。 ｄ．核の測定。100以上の別々の測定を行ない、そして力学的データ登録(DDE) リンクにより Excelスプレッドシートに電子的に記録する。１つの態様において は、癌結果による細胞の分離に最とも寄与する測定は、次のものである： 核表面差異モーメント。この測定は、核を通して画素から画素に進行する徴候 変化の数に基づかれる。０の表面差異モーメントは、均等なグレーを示す。高い 値は、荒い凝集塊を示す。 楕円形フーリエ調和＃９の領域。早いフーリエ変換(FFT)のこの適用は、隣接 する輪郭における定期的なデータを分析する。Kuhl and Giardina（Computer Gr aphic Image Proc．1982; 18: 236-58）の研究に基づけば、この方法は、高いオ ーダーのフーリエ調和として微妙な変動を認識する。ここで、９点の形状として それらの領域（画素における）の小さな割合を有する核は、識別的であると思わ れる。大きな値は、大きな領域を示す。 ｅ．600nmでの興味ある細胞質領域の概略。マウスの急速な引っ張りは、600nm での細胞質の像を概略する。 ｆ．細胞質の限界。細胞質の実際の端を、透過された光の画系値により決定す る。包含される値の限界は、最初の適合性が達成されるまで、技術者により高め られ、そして低められる。 ｇ．600nmでの細胞質の測定。核を、細胞質像から減じられる二元マスク中に 転換する。核に類似して、100以上の別々の測定を行ない、そして力学的データ 登録(DDE)リンクにより Excelスプレッドシートに電子的に記録する。１つの態 様においては、癌結果によ る細胞の分離に最っとも寄与する測定は、次のものである： 600nm での平均細胞質密度。600nmでの細胞質の光学密度を、測定された平均の 画素グレーレベル及び標準化された検量表により決定する。 ｈ．500nmでの興味ある細胞質領域の概略。マウスの急速な引っ張りは、510nm での細胞質の像を概略する。 ｉ．細胞質の限界。細胞質の実際の端を、上記のようにして限界により決定す る。 ｊ．510nmでの細胞質の測定。現在、癌結果による細胞の分離に最っとも寄与 する測定は、次のものである： 510nm での平均細胞質密度。510nmでの細胞質の光学密度を、測定された平均の 画素グレーレベル及び標準化された検量表により決定する。 ５．線状識別機能データ分析（これは、SPSS Inc.，Chicago，ILによるPCのた めの商業的に入手できるルーチンである）。 ａ．Excel測定データが、癌を有さない個人の検体から、癌を後に進行せしめ る個人からの検体を良好に分離する依存性変数の線状組合せを見出すためにSPSS プログラム中に登録する。 ｂ．癌又は癌ではないものとして設定された結果グループ、及び 510nmでの平 均細胞質光学密度としての依存性変数により、600nmでの平均細胞質光学密度、 核表面差異モーメント、及び楕円形フーリエ表面差異モーメントにより説明され る核の領域並びに楕円形フーリエ調和９により説明される核の領域が、癌を有さ ない個人と比較して、癌を進行せしめるJohns Hopkins Lung Project（JHLP）参 加者からの痰検体の完全な識別を生成した。 それらの測定は、新規の次識別機能中に組合される： Ｄ＝β₀＋β₁(光学密度₆₀₀)＋β₂(光学密度₅₁₀)＋β₃(核表面差異 )＋β₄(フーリエ調和９での核楕円形領域)。 それらのJHLP重量についての標準化されていない値は、次の通りである： β₂＝CYAVOD51 -8.1834331 β₁＝CYAVOD60 -16.7053961 β₃＝NUCTXDIF 5.5935067 β₄＝NUCTXDIF 58.8520016 β₀＝（定数） -5.5977584 例 14 (hnRNP)A2／B1のmRNAに対する現場ハイブリダイゼーション による肺癌の初期検出 肺癌をのちに進行せしめる個人の痰におけるわずか少数の細胞が、hnRNP抗原 を過剰発現する。hnRNPアップ−レギュレーションについての一時的な経過及び 原因を理解するために、組織現場ハイブリダイゼーションアッセイを、剥離され た痰細胞への使用のために改良した。 痰検体の免疫細胞化学アッセイは、正常な痰細胞における低レベルのバックグ ラウンド発現を示し（アメリカ特許第 5,455,159号）、そして初期肺癌検出のた めの増強された抗原存在を定量化するために二重−波長像密度測定技法を開発す るための刺激を提供した(Tockman，など．1993，Diagnostic Cytopathol ，vol. 9(6): 615-22)。二重−波長像密度測定法は、600nm及び 510nmでの細胞質光学密 度の信頼できる測定を確保するために一連の注意して標準化され、そして検量さ れた方法（図14を参照のこと）に依存する。タンパク質抗原密度測定のコンピュ ーター処理された解釈は、それらの光学密度を識別機能に組合す。 Ｄ＝β₀＋β₁(光学密度₆₀₀)^1/2−β₂(光学密度₅₁₀)^1/2 核膜を通しての hnRNPの変更された核分布及び損なわれた移動度についての可能 性は、追加の細胞特徴の測定及び新しい識別機能の開発を導びいた。像密度測定 のための変性されたアルゴリズムは、hnRNPタンパク質の発現を有効にするため に使用される同じJHLP検体におけるhnRNP mRNA発現を正確に定量化し、初期肺癌 のより正確な検出をもたらす。 方法 臨床学的材料。前に記載したように、Johns Hopkins Lung Project（JHLP）が 、1976〜1984年の間、5,226人の中年の男性喫煙者からの誘導された痰検体に対 する細胞学的スクリーニングを行なった（アメリカ特許第 5,455,159号；Tockma n, など．1989，J.Clin.Oncol ．，Vol.6: 1685-93）。８年までの毎年のスクリ ーニングの間、それら参加者の 626人（12％）が、１又は複数のそれらの癌検体 上に中ぐらい又は高い異型性を有した。すべてのそのような検体及び追跡調査材 料を、Saccomanno's保存剤溶液(SPS、50％エタノール中、２％ポリエチレングリ コール)に個々に配置し、そして貯蔵した(Saccomanno，など．1963 Acta Cytol ． ，vol.7; 305-10)。それらの個人の86人は、追跡調査の間、肺癌を進行せしめ た。個々の主要肺癌細胞型の例（腺癌、鱗状細胞癌、未分化の大きな細胞及び未 分化の小さな細胞）を包含するよう分類された、それらの検体のランダム選択は 、臨床学的肺癌の進行の平均２年前に採取された22の痰検体を提供する。癌を進 行しなかった個人からの形態学的に類似する検体は、対照として使用された。収 容された材料は、それらの個人の13人に対して利用でき、それらの８人は癌を進 行せしめ（３人の鱗状細胞癌、３人の未分化小細胞、２人の腺癌）、そして５人 癌が存在しなかった。 現場ハイブリダイゼーション。SP６及びＴ７プロモーターを含む プラスミドからファージポリメラーゼにより転写された、1.6kb及び 1.8kbの一 本鎖 RNAプローブを、本明細書に記載のようにして、使用し、そして製造した。 SPSに前もって固定された細胞学的検体及び対照材料を、唾液分泌されたRNアー ゼフリーのガラススライド（American Histo）上に、細胞回転せしめた(Shandon ，Pittsburg，PA)。Calu-3（ATCCヒト気管支原性腺癌細胞系）を、正常な痰と共 に混合し、そして対照として使用した。前処理最適化は、次の工程を包含した。 室温で１時間、４％パラホルムアルデヒド(Sigma)により後−固定した後、10μ ｇ／mlのプロティナーゼＫ(Gibco BRL)を含む、37℃に前もって暖められた 0.1 Ｍのトリス／50mMのEDTA（pH 8.0）により10分間、スライドを処理し、過剰の接 近性を高めた。0.25％の無水酢酸及び 0.1Ｍのトリエタノールアミン溶液(pH 8. 0、Sigma)による10分間のアセチル化により、バックグラウンド結合を低める。 プローブを、10ｎモル／μｌのジゴキシゲニン−11−UTP（Boehringer Mannheim ）によりラベルする。 現場ハイブリダイゼーション工程は、Coxなど.(Dev.Biol ． 1984; 101: 485-5 02)の方法に従がう。一組のスライドのハイブリダイゼーションを、特異的ハイ ブリダイゼーションを検出するためにアンチセンス一本鎖リボプローブに対して 行なった。平行して、同一の条件下で、第２組のスライドをセンスリボプローブ に対してハイブリダイズし、非特異的バックグラウンドハイブリダイゼーション を検出した。第２の対照として、第３組のスライドを、アンチセンスハイブリダ イゼーションの前、RNアーゼにより処理し、非− RNA細胞成分への結合に起因す るいづれかのシグナルを検出した。免疫細胞化学を用いて、ジゴキシゲニン−ラ ベルされ、ハイブリダイズされたプローブを検出した。後−ハイブリダイゼーシ ョン緊縮洗浄及びRNアーゼすすぎの後、スライドは、ヘマトキシリン対比染色に よるペルオキシダーセジアミノベンジジン(DAB)染色(Vector Laboratories，Bur lingame，CA)を受ける。 二重−波長像血球計算法。規則的な化生を有する痰上皮細胞を、患者の臨床学 的状態の知識のない細胞技術者により可視的に選択した。患者当たり２つのスラ イドを走査した後、５〜10の特徴的な領域を、個々の患者のために選択した。Ko ehler照明、続く、光透過の中性密度フィルター標準化を確立した。スライドを 、Zeiss Axiomat顕微鏡(Carl Zeiss，Oberkochen，Germany)上で映像化した。カ ッ色のジアミノベンジジン−ラベルされたジゴキシゲニン及び青色の（ヘマトキ シリン）対比染色のための透過される光を最適化するために、それぞれ600nm（5 90〜610nm の範囲）及び510nm（500〜520nm の範囲）の Omega製の狭いバンドフ ィルターを用いた(Tockman，など．1992 Cancer Res.，vol.52(Suppl); 27115- 85)。透過を、デジタル像プロセッサー（Metamorph v 2.0，Universal Imaging ，West Chester，PA）に連結される高解像度ビデオカメラ(Hamamatsu Photonic Systems，Japan)により検出した。次に、両波長での個々の領域の、バックグラ ウンドを減じられた、色相−修正された像を、光学装置(Panasonic／Matsushita Co.，Osaka)に記録した。 照明及びカメラセンサーの非均等性を処理するために色相修正した後、光学密 度値を、クロモゲンラベルの透過率スペクトルから以前に決定されたように、60 0nm及び 510nmで測定する。核表面分析は、画素から画素の比較における徴候の 変化の数（核表面差異モーメント）に基づかれており、ここで大きな値は荒い凝 集塊を示す。核膜の形状は、種々の周波数範囲でフーリエ力の評価により決定さ れる。より高い不規則性は、高められた細胞質領域の高いフーリエ調和として表 わされる。それらの測定値は、下記の新規識別機能中 に組合される： Ｄ＝β₀＋β₁(光学密度₆₀₀)＋β₂(光学密度₅₁₀)＋β₃(核表面差 異)＋β₃(フーリエ調和９での核楕円形領域)。 結果 陽性及び陰性対照検体における hnRNP A2 mRNA及びタンパク質の発現は、図15 ａ−ｄに示される。ラベルされた“免疫細胞化学”の図15ａは、培養されたCalu -3腺癌細胞と共に混合された、正常な痰における成熟鱗状上皮細胞を示す。正常 な上皮細胞は、広範な細胞質と共に小さな核を示し、モノクローナル抗体 703D4 により検出され、そして DABにより弱く染色される通常（バックグラウンド）レ ベルの hnRNPを発現する。培養された腫瘍細胞は、hnRNPアップ−レギュレーシ ョンを示す濃く染色する細胞質の小さな縁と共に、大きな核を有する。図15ｂ（ ラベルされた“アンチセンス”）は、DABによりラベルされた特異的mRNAハイブ リダイゼーションを発現する類似する陽性対照材料を示す。hnRNPタンパク質に 対する局在発現の類似性を注目すること（図15ａ）。図15ｃ（“センス”）及び 15ｄ（“RNアーゼ”）は、現場ハイブリダイゼーションの負の対照を示す。 図16ａ−ｄにおいては、hnRNP A2 mRNA及びタンパク質の発現は、陽性の場合 （図16ａ，16ｂ）と陰性の場合（図16ｃ，16ｄ）との間で対比される。上部列に おいては、鱗状肺癌をのちに進行せしめた患者からの検体の２つのアリコートは 、hnRNPタンパク質（図16ａ）及びhnRNP mRNA（図16ｂ）の弱い形態学的異型及 び陽性発現を示す。下部列においては、肺癌を進行せしめなかった患者の痰の類 似するアッセイは、類似する細胞形態学にもかかわらず、タンパク質又はmRNAの 過剰発現を示さない。 表16は、癌をのちに進行せしめた個人及び癌を有さない個人のハ イブリダイズされた痰細胞に対して測定された特定変数のためのグループ平均及 び標準偏差を示す。サンプルは小さいけれども、注意して行なわれた測定は、癌 をのちに進行せしめる患者の細胞の有意に高い光学密度（情報発現）、核膜の有 意に低い好適な折りたたみ、及び荒い核凝集塊（統計学的有意性に達していない 、表17）を示す。特定の変数の他は強く示唆的であるが、それぞれ、それらは癌 の続く進行を好結果をもって予測しない。 −識別分析− TWOUTCM により定義されるグループに基づく： 分析数：１ 直接的な方法： 許容試験をパスするすべての変数を登録する。 最小許容レベル ……………………………… 0.00100 規範的な識別機能 機能の最大数 ……………………………… 分散の最小累積％ …………………………… 100.00 Wilks’Lambda の最大有意性 ……………… 1.0000 個々のグループのための前の確立は、0.50000である。 分類機能系数 （Fisher's線状識別機能） 規範的識別機能 ＊：これは、分析において残存する１の規範的識別機能を示す。 標準化された規範的な識別機能係数 機能１ CYAVOD51 -.45504 CYAVOD60 -.96039 NUCTXDIF 1.70686 NEFAHAR9 1.66169 構造マトリックス： 識別変数と規範的な識別機能との間のプールされたグループ内相互関係 （機能内の相互関係のサイズにより指図される変数） 機能１ CYAVOD51 -.65573 CYAVOD60 -.63200 NEFAHAR9 .32067 NUCTXDIF -.25673 標準化されていない規範的な識別機能係数 機能１ CYAVOD51 -8.1834331 CYAVOD60 -16.6053961 NUCTXDIF 5.5935067 NEFAHAR9 58.8520016 （定数） -5.5977584 グループ平均（グループ中心）で評価される規範的な識別機能 グループ 機能１ １ 2.91348 ２ -1.82092 計算された識別機能は、表18においてヒストグラムで示される。癌を進行せし める個人の痰細胞の識別機能は、癌を有さない個人の識別機能から明確に分離さ れる。この結論は、分類表（表19）により支持される。この表は、二重波長像血 球測定によるhnRNP mRNA発現の決定が、癌を有さない個人の痰検体と肺癌を進行 せしめるであろう個人の臨床的癌の２年前に採取された痰検体とを区別すること ができることを示す。 正しく分類された“グループ”ケースの％：100.00％ 分類方法の要約： 13（重視されていない）のケースが処理された。 ０のケースが欠測又は範囲外グループコードのために排除された。 ０のケースが少なくとも１つの欠測識別変数を有した。 13（重視されていない）のケースがプリントされる出力のために使用された。 比較のために、同じ13の痰検体における hnRNPタンパク質を、類似する識別機 能分析において評価する（表20〜24）。表20は、癌をのちに進行せしめる個人及 び癌を有さない個人の免疫染色された痰細胞に対して測定されたグループ平均及 び標準偏差を示す。傾向は明らかであるが、測定変動性及び小サンプルサイズは 、有意な差異を排除する（表21）。 hnRNPタンパク質発現の密度測定法における高い変動性は、表22におけるヒス トグラムで示されるオーバーラップする識別機能評点により示される。タンパク 質発現のためにのみ測定される痰細胞の識別機能は、誤った陽性結果及び誤った 陰性結果の両者を示す。この結論は、分類表により支持される（表23）。この表 は、hnRNPタンパク質発現が癌を有さない個人の痰検体と肺癌を進行せしめるで あろう個人の臨床的癌の２年前に採取された痰検体の77％とを区別することを示 す。 正しく分類された“グループ”ケースの％： 76.92％ 分類方法の要約： 13（重視されていない）のケースが処理された。 ０のケースが欠測又は範囲外グループコードのために排除された。 ０のケースが少なくとも１つの欠測識別変数を有した。 13（重視されていない）のケースがプリントされる出力のために使用された。 この結果は、現在の臨床学的実施に対して前進したすぐれた段階を表わすが， 同じ検体におけるタンパク質発現に対するhnRNP mRNAによる初期検出の精度にお いてさらなる改良点が明白である（表24）。 例 14 上皮タンパク質の核酸の局在化のためのパラフィン− 包埋された肺断片の現場 PCR及び現場RT-PCR Martinez，A.，など．J.Histochem ．and Cytochem.，Vol.43，No.8，pp.739-7 47，1995により記載されるような次のプロトコールを 用いて、前癌及び癌細胞における、前癌及び癌に関連する上皮タンパク質、その ペプチド又は変異体の核酸を検出する。前記方法はまた、Saccone，S．などGeno mics 1992，Jan: 12(1): 171-174; Biamonti，G．などNucleic Acid Res ． 1994 ，Jun 22(11): 1996-2002 により報告されたように、核酸の染色体位置、又はそ の位置での染色体異常性を検出するためにも有用である。 材料及び方法 細胞系 NCH720及びNCH157細胞系をこの研究に使用する。それらの細胞系を、30nMのセ レン及び10mMのＬ−グルタミンを含むフェノールレッドフリーの RPMI-1640を用 いて、タンパク質フリー及びホルモンフリー条件下で増殖せしめた(Siegfriedな ど.，J.Biol.Chem. 269: 8596，1994)。約５×10⁶個の細胞のペレットを、PBSに より洗浄し、２％ NuSieve低融点アガロース(カタログ 50082、ロッド626592；F MC BioProducts，Rockland，ME)１ml中に再懸濁し、固形化し、４％パラホルム アルデヒド又は10％ホルマリンにおいて２時間、固定化し、そして通常の組織病 理学技法によりパラフィンに包埋する。 公文書 正常な肺及び代表的な症例の前癌及び肺腫瘍を含むホルマリン固定化され、パ ラフィン包埋されたブロックを、NCI-Navy Medical Oncology BranchでのBPRB， NCIのファイルから得る。 免疫組織化学 モノクローナル抗体 703D4を使用する（アメリカ特許第 4,569,788号）。アビ ジン−ビオチン組織化学的染色方法(Hsuなど、J.Histochem.Cytochem ． 29: 577 ，1981)が、酵素基質としての３，３′−ジアミノベンジジン（カタログD-5637 、ロッド122H3642；Sigma, St.Louis，MO)及び 0.006％のH₂O₂の0.03％溶液と共に、Vectastrain ABCキッ ト（カタログPK-4001; Vector Laboratories，Burlingame，CA）を用いて、肺組 織及び細胞系における 703D4免疫活性を局在化するために使用される。 RNA抽出 Glisinなど(Biochemistry Vol.13; 2633，1974)のグアニジンイソチオシアネ ート−塩化セシウム法を用いて、前記細胞系から生 RNAを抽出する。正常なヒト 脳(カタログ6516-2、ロッド2Y081)、肺臓(カタログ6510-2、ロッド39076)、肺( カタログ6524-2、ロッド34401)、胃(カタログ6548-2、ロッド38131)、及び子宮( カタログ6537-2、ロッド29100)からのポリＡ＋RNA を、Clontech Laboratories （Palo Alto，CA）から購入する。 ノザンブロット 標準のホルムアルデヒドゲルを、120 v．100mAmpで、３時間、全RNA(10μｇ／ ウエル)により試験した。その試験の最後で、ゲルを、20×SSC により15分間、 洗浄し、そして次に、0.45μｍのニトロセルロースフィルター上に毛管流トラン スファーにより一晩ブロットする(Davisなど、Basic Methods in Molecular Bio logy，Norwalk，CT，Appleton & Large，1986)。ブロットを1200ジュールでUV架 橋し、そして４時間プレハイブリダイズする。Stratagene Prime-Itキット（Str atagene; La Jolla，CA）を用いて、プローブをラベルする。前記プローブは、h nRNP-A2及びA1のための十分な長さのcDNAを含むプラスミドの制限エンドヌクレ アーゼ消化物からゲル精製された挿入体の³²P-dCTPによるランダムプライミング により調製された。プローブ（１×10⁶cpm）を個々のハイブリダイジング緩衝液 １mlに添加する。一晩のハイブリダイゼーションの後、ブロットを室温で２×SS C／ 0.1％ SDSにより１回洗浄し、ブロットを室温（ RT; 30分）で２×SSC ／ 0.1％ SDSにより１回洗浄し、そして60℃（30分）で、 0.1％ SSC／ 0.1％ SDSにより１回洗浄する。次に、ブロットを空気乾燥せしめ 、そしてKodak XAR5フィルム上で−80℃で１〜２日間、オートラジオグラフ処理 する。 標準のPCR 上皮タンパク質のためのオリゴヌクレオチドプライマーを、MilliGen 8700 DN A合成機（Millipore; Marlborough，MA）を用いて製造する。配列は、５′-GAGT CCGGTTCGTGTTCGTC-3 ′（配列番号11）及び５′-TGGCAGCATCAACCTCAGC-3′（配 列番号18）である。使用されるすべての緩衝液、酵素及びヌクレオチドは、Appl ied Biosystems(Perkin-Elmer Cetus; Norwald，CT)から得られる。Perkin-Elme r 9600 Thermocyclerを用いて、サンプルを増幅する。PCR生成物を、１％アガロ ースゲルを用いて電気泳動分析し（80Ｖ、３時）、そして臭化エチジウム染色を 、UV光下で、続いて³²Ｐ−ラベルされたプローブを用いてのサザン分析により観 察される。 サザン分析 ゲルを、1.5ＭのNaCl／ 0.6ＭのNaOH及び 1.5ＭのNaCl／２Ｍのトリスにおい て変性し、そして毛管流トランスファーにより20×SSC における 0.2μｍのニト ロセルロースフィルター上に一晩ブロットする。フィルターを真空下で80℃で架 橋し、そしてハイブリダイゼーション緩衝液に置く。アンチセンスプローブを、 標準の³²Ｐ方法により末端ラベルする（Sambrookなど、Molecular Cloning:A La boratory Manual ，Vol．II，Cold Spring Harbor，NY，Cold Spring Harbor Lab oratory Press，8.3，1989）。RTでの緊縮洗浄を、５×SSC ／ 0.1％ SDS（30分 間、２度）、次に１×SSC ／ 0.1％ SDS（30分、２度）において行なう。フィル ターを空気乾燥せしめ、そしてKodak XAR5フィルム上に−80℃で２〜４時間オー トラジオグラ フ処理する。 現場 PCR 特定 DNAを局在化するための現場 PCR技法を、Nuovo(PCR現場ハイブリダイゼ ーション、Nuove，GJ，ed．PCR In Situ Hybridization: Protocols and Applic ations，New York，Raven Press，157，1992a)により記載されるような３段階プ ロトコールにより行なう。組織断片をワックス除去した後、タンパク質消化を行 ない、細胞中への試薬の浸入を促進する。第２段階は、PCR生成物の同時ラベリ ングを伴っての PCR自体から成り、続きて第３段階においては、ラベルされた生 成物が可視化される。RNA検出のための現場増幅技法は、類似するプロトコール を用いる。しかしながら、それは２つの追加の段階を組込んでいる。プロティナ ーゼ消化の後、組織をRNアーゼフリーDNアーゼに暴露し、ゲノム DNAの増幅を回 避する。第２に、残るmRNAを逆転写し、cDNA鋳型を形成し、これを PCRにより増 幅する。現場 PCR技法の効率を最大にするために、それらのプロトコール段階の すべてを個々の実験のために最適化すべきである。逆転写及び PCR段階は、加熱 された洗浄モジュールを備えたOmni Slideサーモサイクラー（20−スライド能力 ）を用いて行なわれる(National Labnet; Woodbridge，NJ)。 プロテアーゼ消化 組織の固定化及び性質に依存して、標的核酸への試薬の接近性は変化すること ができる。最適の透過方法を同定するために、本発明者は、１〜100 μｇ／mlの プロティナーゼＫ(カタログP-0390、ロット 93H0603；Sigma)の濃度及びインキ ュベーション時間（５〜45分）により変更され得る酵素消化方法を分析した。 DNアーゼ消化 スライド当たり10ＵのDeoxyribonuclease I Amplification Grad e(カタログ 18068-015、ロットED2409; Gibro BRL，Gaithersburg，MD)を用いて 、製造業者の規格に従って、DNAを分解する。染色の性質に対する異なった消化 時間の影響を試験する。 逆転写 この段階のためには、Super Script Preamplification System(カタログ 1808 9-011、ロットEDT001; Gibco)が、製造業者の規格に従って使用される。要約す れば、断片をランダムプライマーを含む溶液に含浸し、パラフィンカバースリプ により被覆し、そしてターモサイクラーにおいて、70℃で10分間インキュベート する。カバースリップを取り除いた後、逆転写酵素(100Ｕ／断片)を含む他の溶 液を添加し、そして新しいパラフィン片により被覆する。次に、スライドを、RT で10分間、45℃で45分間、及び70℃で10分間、維持する。 PCR 現場 PCR実験の前、MgCl₂濃度、pH及びアニーリング濃度を包含する、PCR反応 のためのすべてのパラメーターを、標準 PCRにより最適化する。この時点で、PC R生成物をクローン化し、そして配列決定し、同一性を確かめる。生成物を pCRI Iベクター（カタログ2000-01; Invitrogen，San Diego，CA）中にクローン化し 、そしてdsDNA Cycle Sequencing Kit(カタログ81965A、ロットCAC108；Gibco) により配列決定する。単一バンドの生成のために好ましい条件の最適化が、組織 断片における異なった分子量の PCR生成物を区別することが不可能であるので、 考慮される。ゲノム DNAから PCR生成物を生成する可能性を評価するためには、 生成物サイズに基づいて鋳型源を区別するようイントロンを架橋するプライマー を企画することが重要である。 同調された“ホットスタート(hot start)”PCR（Nuovo，The ho t start polymerase chain reation，In Nuovo，GJ，ed．PCR In Situ Hybridiz ation Protocols and Applications，New York，Raven Press，63，1992b）を、 Taq中和抗体技法(Kelloggなど、Bio Techniques 6: 1134，1994)を用いて達成す る。Taq−ブロッキングモノクローナル抗体は、Clontech(Taq Start antibody; カタログ5400-1、ロット47656)から購入された。 本明細書に記載される分析のためには、次の PCR混合物を使用する： 2.5mMの MgCl₂、200μＭの dNTP2、100μＭのジゴキシゲニン−11−２′−デオキシウリ ジン−５′−三リン酸（カタログ 1558706、ロット13945241-12; Boehringer Ma nnheim，Indianapolis，IN）、１ng／μｌのプライマー、50mMの KCl、10mMのト リス−HCl、pH 8.3。溶液の80μｌアリコートを個々のスライドに適用し、そし て次に、個々のスライドをシラン化されたカバースリップにより被覆し、ラバー セメントにより密封し、そしてサーモサイクラーに配置する。標的物を15〜20サ イクル増幅し、パリパリした染色物を得る。DNA増幅の後、0.1×SSC により、そ れぞれ45℃で20分間、２回の洗浄を行ない、未結合ヌクレオチドを排除する。 ジゴキシゲニンの展開 ジゴキシゲニン−標識された PCR生成物の検出を、Boehringer Mannheimから のキット(カタログ 1210220、ロット14101420-13)により行なう。それは、アル カリホスファターゼに結合される抗−ジコキシゲニン抗体との２時間のインキュ ベーションを包含する。十分な上昇の後、適切な基質（ニトロブルーテトラゾリ ウム及び５−ブロモ−クロロ−３−インドリル−ホスフェート）を、暗青色沈殿 物に酵素的に転換する。着色は、顕微鏡下で調べられた。 最近、ポリビニルアルコールがアルカリホスファターゼ−ニトロブルテトラゾ リウム反応の強度を増強し、そして沈殿物の拡散を妨 げることが観察された(Barth and Ivarie，Bio Techniques 17: 324，1994; De Block and Debrouwer，Anal.Biochem ． 25: 86，1993)。この技法の利点を取る ために、抗−ジゴキシゲニン抗体の希釈度を１：2000に高め（製造業者により推 薦される通常の１：500の代わりに）、相当のバックグラウンドの低下を得る。 対照 PCR技法は、汚染物を含むサンプルにおいて DNAの単一のコピーさえ増幅する その能力について良く知られている。従って、清潔な徹底した配慮に関する通常 の PCRのために推薦される用心、専用組のピペットの使用、及び増幅領域から離 れての PCR混合物の調製(Orrego，Organizing a laboratory for PCR work，Inn is MA，Gelfand DH，Sninskyy JJ，White，TJ，eds．PCR Protocols: A Guide t o Methods and Applications，New York，Academic Press，447，1990)がまた、 現場 PCRのために適用できる。さらに、組織断片に関する研究は新規の関心、た とえば試薬の不均質適用、気泡、境界部の乾燥、及びサンプルの調製の間の核酸 の安定性に関する関心を付与する。 少なくとも３種のタイプの対照が、誤った陽性又はあやった陰性を回避するた めにあらゆる実験において推薦される。 陽性対照 同じ組のプライマーに対して前に陽性であるブロックからの断片が関与する。 これが、それらのプライマーを使用する最初である場合、他の技術（たとえば、 ノザン分析、標準の PCR、現場ハイブリダイゼーション）により決定されるよう な標的核酸の高い発現を有することが知られている十分に固定された組織又は細 胞系の断片が関与する。 陰性対照 逆転写及び／又はRNアーゼ処理の排除は、残る核又はミトコンドリア DNAの非 特異的増幅についての情報を生成するであろう。 陰性対照 PCR混合物におけるプライマーの排除は、次の内因性プライミングによる非特 異的染色を示すであろう： DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性（Kommin oth and Long，Virchows Arch［B］64: 67，1993）により、又はアポプトシス(G oldなど、J.Histo.Chem.Cytochem. 41: 1993)及び他の人工物、たとえば固有の アルカリホスファターゼ活性により生成される DNAフラグメント。 追加の対照は、転写／翻訳生成物間での存在する関係の確立から成る。これは 、現場 PCRによる核酸のための１つの断片、及びポリペプチドに対する特異的抗 体を有する一連の断片を染色することによって行なわれ得る。同じ細胞内でのmR NA及びそのタンパク質の同時局在化が観察の有効性を強化するであろう。 現場 PCR生成物の確認は、２種の手段により達成され得る：(ａ)DNAを抽出し （TRIzol試薬、カタログ5596UA、ロットDPU 201; Gibco）、そしてアガロース電 気泳動、及び適切な放射性プローブによるサザンブロットにより分析するために 、現場 PCRの後、ガラススライドの組織を削り取ることが可能である。この生成 物のクローニング及び配列決定はまた、変性された塩基を伴わないで生成物を得 るために、いくつかの追加の PCRサイクルの後にも可能である。（ｂ）生成物の 同一性を、増幅の後、³²Ｐ−ラベルされたプローブによる現場ハイブリダイゼー ションを行なうことによって試験される。この方法は、間接的な現場 PCRのため に通常使用される(Pattersonなど、Science 260: 976，1994; Walter など、An n NY Acad.Sci. 724: 404，1994) 例 15 hnRNP A2／B1の有意な後翻訳変性を同定するための方法は、少なくとも２種の 手段で行なわれ得る。前で記載した臭化シアン消化物フラグメントを、後翻訳活 性の特異的部位のために組織的に評価する。特異的後翻訳変性の部位でタンパク 質を攻撃する一連の特殊化された酵素を用いて、特定の変性の存在が、酵素的に 処理された臭化シアン−処理された消化物フラグメントと、元の臭化シアン−処 理された材料（酵素にゆだねられていない）とを比較することで示される。たと えば、ホスファターゼによる消化物の処理は、２Ｄ−ゲル電気泳動又は質量分光 計のいづれかにより酵素による処理の後、分子量の変化を現わす。それらは、後 翻訳変化の特徴化のための標準のアプローチである。 例 16 胎児肺における異種核リボヌクレオタンパク質(HnRNP) A2／B1の発現 胎児組織における免疫細胞化学及び現場ハイブリダイゼーションによるhnRNP A2／B1の発現を評価し、それらの分子が潜在的に、初期器官形成に関与している かどうかを決定した。これは、腫瘍胎児性抗原としてhnRNP A2／B1を確立し、そ してhnRNP A2／B1が癌形成及び胎児成長の工程において中心的な役割を演じてい る仮説についての追加の支持を付与する。評価された組織は、胚進化の種々の段 階からのマウス及びラット肺組織及び成熟したゲッ歯動物の肺組織からの複数の 断片を包含した。 断片（４μｍの厚さ）を、Vectabond(SP-1800; Vector Laboratories，Burlin game，CA)により被覆されたスライド上に固定し、ワックス除去し、そしてGibso n and Polakにより記載されるようにして、RNAプローブとのハイブリダイゼーシ ョンのために調製した。ヒト hnRNP遺伝子を含むプラスミド 72ORNPc1Aを用いて 、リボプロ ーブを生成した。要約すれば、その DNAフラグメントを pCRIIベクター（Invitr ogen）中にサブクローン化し、そして適切な制限酵素により線状化した。ラベル されたプローブを、ジゴキシゲニン−11−UTP（1277073; Boehringer，Barcelon a，Spain）及びＴ７（881767; Boehringer）又はT3 RNAポリメラーゼ(1031163; Boehringer)を用いて調製し、それぞれセンス及びアンチセンス RNA転写体を合 成した。ハイブリダイゼーション、個々の断片のために 0.5ng／mlのプローブを 含む15μｌの溶液を有する湿潤チャンバーにおいて46℃で20時間、行なった。緊 縮洗浄は、150ｍモル／ＬのNaCl、15ｍモル／Ｌのクエン酸ナトリウム、pH 7.0( SSC)及びドデシル硫酸ナトリウム(SDS)による次のような処理を包含した：２×S SC ／ 0.1％ SDSによる４回の洗浄、0.1×SSC ／ 0.1％ SDSによる46℃での２回 の洗浄、２×SSC による短いすすぎ、10μｇ／mlのRNアーゼを含む２×SSC にお ける37℃で15分間のインキュベーション、及び２×SSC での追加のすすぎ。 ジゴキシゲニンの可視化を、１：500 に希釈されたアルカリホスファターゼ(1 093274; Boehringer)に結合されたモノクローナル抗体により室温で２時間、行 なった。ニトロブルーテトラゾリウムクロリド(N-5514; Sigma)及び５−ブロモ −４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート(B-8503; Sigma)を、アルカリホ スファターゼのための基質として使用した。対照は、ハイブリダイゼーションの 前、プローブの使用及びRNアーゼによる断片の処理を包含した。 この分析の結果は、次の通りである。肺におけるhnRNP A2／B1発現は、胚進化 の10日目に主流気管支の間葉細胞で開始する。免疫反応性は、未分化上皮におけ る強い発現を伴って、13及び14日目で前記主流から進化する気管支に移動する。 図17ａ−17ｄは、胎児マウス肺における力学的な変化を示す。抗原の中心的発現 は制限され、 そしてその活性が16日目までに、周囲気道の未分化上皮において陽性になる。そ の結果、hnRNP A2／B1の発現のパターンが、ピークの器管進化活性に正確に対応 する時間の枠において中央から遠位に移動する肺進化の既知配列を映す。タイミ ング及び発現のこのパターンは、マウス、ラット及びヒト間で一致する。上記３ 種のすべてにおいて、正常な成熟肺におけるこのマーカーの発現は、著しく制限 された。タンパク質及びmRNAでの発現のパターン及び強さはまた、類似した。 hnRNP A2／B1発現の一時的及び空間的な相互関係は、胎児進化における成長調 節においてこの分子のための決定的な役割を高く示唆し、そしてhnRNP A2／B1が 癌の進化において重要な役割を演じる本発明者の仮説と一致する。 この研究のさらなる発見は、他の部位におけるhnRNP A2／B1の発現であった。 初期発現は、特に心臓の間葉において存在した。控えめな発現が脳、及び脊髄の 神経節において明白であった。進化の間に変調される他の上皮部位においてこの 抗原の広い表示が存在した。この結果は、hnRNP A2／B1が他のタイプの癌につい ての診断価値を有することを示唆する。 参考文献 １．Boring，C.，Squires，T.，Tong，T．and Montgomery，S.Cancer statist ics．Ca-A Cancer J．for Clinicians，44: 7-26，1994． ２．Saccomanno，G.，Saunders，R．and Klein，M.Cytology of the lung in reference to irritant，individual sensitivity and healing．Acta Cytol，1 4: 377-381，1970． ３．Frost，J.，Fontana，R．and Melamed，M.Early lung cancer detection: Summary and conclusions．Am.Res.Respir.Dis.，103: 565-570，1984． ４．Tockman，M.，Gupta，P.，Myers，J.，Frost，J.Baylin，S.，Gold，E.， Chase，A.，Wilkinson，P．and Mulshine，J.Sensitive and specific monoclon al antibody recognition of human lung cancer antigen on preserved sputum cell: A new approach to early lung cancer detection．J.Clin.Oncol.，6: 1685-1693，1988． ５．Mulshine，J.，Cuttitta，F.，Bibro，M.，Fedorko，J.，Fargion，S.，L 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【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年１２月１４日（１９９７．１２．１４） 【補正内容】 請求の範囲 １．約 34kDaの分子量を含んで成り、そして正常細胞において発現される量に 比較して、癌細胞及び前癌細胞において高い量で発現される、精製され、そして 単離されたhnRNP A1／B1又はhnRNP C2ではない上皮タンパク質、そのペプチド又 は変異体。 ２．前記タンパク質、そのペプチド又は変異体が、下記配列： AARPHSIDGRVV （配列番号１） QEVQSSRSGRGG （配列番号２） REKEQFRKLFI （配列番号３） EKTKETVPLERKKRE （配列番号４） AARPSDGRVV （配列番号５）及び EREKEQFRKLFI （配列番号６） から成る群から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列を含んで成る請求の範 囲第１項記載の精製され、そして単離された上皮タンパク質、そのペプチド又は 変異体。 ３．前記タンパク質、そのペプチド又は変異体が、少なくとも１つの異種核リ ボヌクレオチドタンパク質のアミノ酸配列の一部と実質的なアミノ酸配列相同性 を共有する請求の範囲第１項記載の精製され、そして単離された上皮タンパク質 、そのペプチド又は変異体。 ４．前記異種核リボヌクレオチドタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号７又 は配列番号８の一部である請求の範囲第３項記載の精製され、そして単離された 上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体。 ５．前記上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体が後−翻訳修飾を含んで成 る請求の範囲第１項記載の精製され、そして単離され た上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体。 ６．前記後−翻訳修飾が、芳香族アミノ酸の変更、アルギニンのメチル化、リ シンのメチル化、ヒスチジンのメチル化、セリンのリン酸化、トレオニンのリン 酸化、ブロックされたＮ−末端又はグリコシル化を含んで成る請求の範囲第５項 記載の精製され、そして単離された上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体。 ７．その発現が前癌又は癌の表示である、請求の範囲第１項記載の上皮タンパ ク質、そのペプチド又は変異体をコードする核酸配列を含んで成る、精製され、 そして単離された DNA又はそのタンパク質。 ８．前記核酸配列が、少なくとも１つの異種核リボヌクレオチドタンパク質を コードする核酸配列の一部と実質的な核酸配列を共有する請求の範囲第７項記載 の精製され、そして単離された DNA。 ９．請求の範囲第７項記載の DNA又はその一部を含んで成る組換え発現ベクタ ー。 10．請求の範囲第９項記載の組換え発現ベクターにより形質転換された宿主生 物。 11．後−翻訳修飾の領域に存在する、請求の範囲第５項記載の上皮タンパク質 、そのペプチド又は変異体上に存在するエピトープに対して特異的に結合する、 単離された抗原−結合フラグメント。 12．前癌及び癌のための診断スクリーニング方法であって、 （Ａ）哺乳類から得られた核酸配列と少なくとも１つの相補的核酸配列プロー ブとを、ハイブリダイゼーション生成物の形成を可能にする条件下で接触せしめ 、ここで前記相補的核酸配列プローブが癌及び前癌において高い量で発現される 上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体をコードする核酸配列又はの一部に対 して特異的にハイブリダイズし；そして （Ｂ）前記ハイブリダイゼーション生成物を検出し、ここで前記ハイブリダイ ゼーション生成物の存在が哺乳類における前癌又は癌の表示であり、そしてハイ ブリダイゼーション生成物の不在が哺乳類における前癌及び癌の不在の表示であ ることを含んで成る方法。 13．前記哺乳類から得られた核酸配列が、痰、気管支流体、肺、肝臓、骨、乳 房、腎臓、卵巣、子宮、頭、首又は前立腺から単離される請求の範囲第12項記載 の方法。 14．前記癌が、肺癌、肝臓癌、腎癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、頭部癌、首癌 又は骨髄腫である請求の範囲第12項記載の方法。 15．前記癌が肺癌である請求の範囲第14項記載の方法。 16．正常細胞において発現される量に比較して、癌及び前癌細胞において高い 量で発現される上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体をコードする遺伝子を 検出するための有用なキットであって、前記遺伝子のヌクレオチドのすべて又は 一部に対して十分に相補的であり、そして前記遺伝子と特異的にハイブリダイズ する、請求の範囲第15項記載の少なくとも１つの核酸プローブを含んで成るキッ ト。 17．生物学的サンプルにおける後−翻訳的に修飾された上皮タンパク質、その ペプチド又は変異体の検出方法であって、ここで生物学的サンプルにおける前記 後−翻訳的に修飾された上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体の存在が前癌 及び癌の表示であり、 （Ａ）前記後−翻訳的に修飾された上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体 を単離し、そして （Ｂ）非修飾上皮タンパク質と比較して、後−翻訳修飾を検出することを含ん で成る方法。 18．前記段階（Ａ）の方法が、二次元電気泳動又はHPLCである請求の範囲第17 項記載の方法。 19．前記後−翻訳修飾が抗体又は放射性ラベルされたアミノ酸を用いて検出さ れる請求の範囲第17項記載の方法。 20．前癌及び癌についての診断スクリーニング方法であって、 （Ａ）哺乳類から得られた核酸配列を、１よりも多くの相補的核酸配列プロー ブにより、増幅された生成物の形成をもたらす条件下で増幅し、ここで前記相補 的核酸配列プローブが癌及び前癌において高い量で発現される上皮タンパク質、 そのペプチド又は変異体をコードする核酸配列又はその一部に特異的にハイブリ ダイズし、そして （Ｂ）前記増幅された生成物を検出し、ここで前記生成物の存在が癌又は前癌 の表示であることを含んで成る方法。 21．前記増幅が PCR又はRT-PCRによるものである請求の範囲第20項記載の方法 。 22．前記哺乳類から得られた核酸配列が DNA又はmRNAである請求の範囲第20項 記載の方法。 23．前記方法が現場又はインビトロで行なわれる請求の範囲第20項記載の方法 。 24．前記相補的核酸配列プローブが、異種核リボヌクレオタンパク質をコード する少なくとも１つの核酸配列に対して実質的に相同である請求の範囲第20項記 載の方法。 25．前記哺乳類から得られた核酸配列が、痰、気管支流体、肺、肝臓、骨、乳 房、腎臓、卵巣、子宮、頭部、首又は前立腺からである請求の範囲第20項記載の 方法。 26．前記癌が、肺癌、腎癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、又は骨髄腫である請求 の範囲第20項記載の方法。 27．哺乳類における癌又は前癌のコンピュータ助力診断方法であって、 （Ａ）生物学的サンプルに対して像密度測定を行ない、 （Ｂ）既知の陽性及び陰性対照の光学密度に比較しての前記生物学的サンプル の光学密度に基づいて識別機能を処理し、そして （Ｃ）hnRNP mRNAと特異的にハイブリダイズすることができるプローブを用い ることを含んで成る方法。 28．前記光学密度が２種の異なった波長で決定される請求の範囲第27項記載の 方法。 29．hnRNP mRNAと特異的にハイブリダイズすることができるラベルされたプロ ーブが、前記像密度測定を実施する前、前記生物学的サンプルに添加される請求 の範囲第27項記載の方法。 30．哺乳類における癌又は前癌の診断方法であって、 Ａ．生物学的サンプルにおいてhnRNP mRNAと特異的にハイブリダイズするラベ ルされたプローブを、生物学的サンプルに添加し、 Ｂ．予定された波長で、生物学的サンプルからの像の光学密度を得るために生 物学的サンプルを照射し、そして Ｃ．癌又は前癌についての生物学的陽性を決定するために生物学的サンプルの 光学密度及び検量された光学密度測定値に基づいて識別機能を処理することを含 んで成る方法。 31．前記像がデジタル像プロセッサーに記憶される請求の範囲第30項記載の方 法。 32．前記段階（Ａ）が現場ハイブリダイゼーションアッセイである請求の範囲 第30項記載の方法。 33．前記像の光学密度が１以上の予定された波長に対して得られる請求の範囲 第30項記載の方法。 34．前記識別機能がさらに、核表面差異モーメント及び核上皮フーリエ楕円領 域に基づいている請求の範囲第30項記載の方法。 35．第１波長が約 600nmであり、そして第２波長が約 510nmであ る請求の範囲第33項記載の方法。 36．前記生物学的サンプルが細胞、抽出物又は組織である請求の範囲第30項記 載の方法。 37．前記識別機能についての約ゼロ又はそれ以下の値が、癌又は前癌の表示で ある請求の範囲第30項記載の方法。 38．前記識別機能が、下記式： Ｄ＝β₀＋β₁(光学密度₆₀₀)＋β₂(光学密度₅₁₀)＋β₃ （核表面差異）＋β₃(フーリエ調和での核楕円領域) 〔式中、β₀，β₁，β₂及びβ₃は、検量された光学密度測定値である〕により表 わされる請求の範囲第30項記載の方法。 39．前記フーリエ調和が約７〜約９の範囲で存在する請求の範囲第38項記載の 方法。 40．前記フーリエ調和が約９である請求の範囲第38項記載の方法。 41．前記方法が個人における癌の進行を予測することにおいて、約80％以上の 精度を提供する請求の範囲第30項記載の方法。 42．二重波長像密度測定法を用いてhnRNP mRNAを発現する細胞のコンピュータ ー助力検出方法であって、 （Ａ）細胞におけるhnRNP mRNAと特異的にハイブリダイズするラベルされたプ ローブを細胞に添加し、 （Ｂ）第１の予定された波長で細胞の第１のバックグラウンド−控除され、色 相修正された像を得るために細胞を照射し、 （Ｃ）第２の予定された波長で細胞の第２のバックグラウンド−控除され、色 相修正された像を得るために細胞を照射し、そして （Ｄ）hnRNP mRNAを発現する細胞を決定するために一組の既知対照像と前記像 とを比較することを含んで成る方法。 43．hnRNP mRNAと特異的にハイブリダイズすることができる配列 を含んで成るヌクレオチドプローブ。 44．異型細胞を決定するための方法であって、 （Ａ）細胞から光学像を生成するための手段を用い、 （Ｂ）光像を得るための手段を用い、 （Ｃ）異型細胞に対してユニークな細胞パラメーターのための光学像を分析す るための手段を用い、 （Ｄ）異型細胞の表示である識別機能を決定するための手段を用い、そして （Ｅ）hnRNP mRNAを検出するための手段を用いることを含んで成る方法。 45．前記分析手段が光学密度及び形態計測を決定する請求の範囲第44項記載の 方法。 46．前記分析手段が核表面差異モーメントを決定する請求の範囲第44項記載の 方法。 47．前記分析手段が、高いフーリエ調和で核フーリエ楕円領域を測定する請求 の範囲第44項記載の方法。 48．前記光学密度が２種の異なった波長で分析される請求の範囲第44項記載の 方法。 49．前記細胞が光学像を生成する前、ラベルにより処理される請求の範囲第44 項記載の方法。 50．前記ラベルがプローブに結合され、前記プローブが細胞内でhnRNP mRNAと 特異的にハイブリダイズすることができる請求の範囲第49項記載の方法。 51．前記識別機能が、600nmでの光学密度、510nmでの光学密度、核表面差異及 び高いフーリエ調和での核楕円領域から決定される請求の範囲第44項記載の方法 。 52．前記異型細胞が癌細胞又は前癌細胞である請求の範囲第44項 記載の方法。 53．正常細胞から異型細胞を区別するために識別機能を決定するための方法で あって、 （Ａ）hnRNP mRNAについて検出し、 （Ｂ）既知正常細胞及び既知異型細胞の光学像を獲得し、 （Ｃ）多数の細胞特徴パラメーターを分析し、 （Ｄ）異型細胞に対してユニークなパラメーターを決定し、そして （Ｅ）異型細胞に対してユニークなパラメーターに基づいて識別機能を計算す ることを含んで成る方法。 54．前記光学像が立体電子アレイである請求の範囲第53項記載の方法。 55．前記像が２種の異なった波長で得られる請求の範囲第53項記載の方法。 56．前記異型細胞に対してユニークなパラメーターが、核表面、核楕円領域、 光学密度、hnRNP mRNA及びそれらの組合せから成る群から選択される請求の範囲 第53項記載の方法。 57．前記細胞が、hnRNP mRNAにより特異的にハイブリダイズされている、ラベ ルされたプローブにより処理される請求の範囲第53項記載の方法。 58．前記既知の陰性細胞及び既知の異型細胞が、正常ヒト及び癌又は前癌を有 するヒトから採取された細胞の保管銀行からのものである請求の範囲第53項記載 の方法。 【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年１２月１７日（１９９７．１２．１７） 【補正内容】 ＊：第２の一次肺癌の患者は、非癌患者（ｐ＜0.05）又は非エンド ポイント患者（ｐ＜0.05）のいづれかよりも有意に高い光学密 度を有する。 †：すべての94人の一次肺癌患者は中国人男性である。注 ：生物学的組織において、光学密度は、0.0(透明)〜1.2(光を透 過できない)の理論的範囲に及ぶ。それらのサンプルのために は、光学密度は、hnRNP免疫染色によりブロックされたバック グラウンド光の割合であるとおおまかには思われる。 全体的に、初年度、SPLCを進行せしめる危険性は、595のうち13 であった(2.2％、表13を参照のこと)。hnRNPを過剰発現した患者の15人のうち10 人（67％の陽性の予測値）が、それらの初期試験の10〜12カ月後、SPLCを進行せ しめた。陰性であると予測された25人のうちわずか３人（12％）が、SPLCを進行 せしめ（相対的危険性 5.6％、感度77％、特異性82％）、これは80％の全体の精 度であった。形態学的基準のための13のSPLCの痰の評価は、腫瘍を示す前臨床学 的形跡を有するわずか１人の患者を検出した（重度の異型化生、感度８％）。そ れらのデータは、hnRNP A2／B1過剰発現のための免疫染色が、SPLCを９倍、検出 することにおいて通常の痰細胞形態学の感度を高めた（８％から77％に）ことを 示唆する。 全体の第２の一次肺癌危険度：13／595，2.2％ 陽性の予測値： 10／15， 67％ 予測された陰性間の危険度： 3／25， 12％ 陽性試験の相対的危険度： 250／45， 5.6 感 度：77％ 正確な95％二項信頼区間、46％〜95％。 特異性：82％ 正確な95％二項信頼区間、62％〜94％。 １°LC検出 スクリーニングのために登録されたすべての 6,285人の適切な YTC鉱夫は、中 国人男性であった。全体的には、初年度間で１°LCを進行せしめる危険性は、62 85中58であった(0.9％)。すべての１°LC患者は、YTC及び Johns Hopkinsのパネ ル臨床医による一致した“最良の情報”診断により確認された。最っとも通常に 切除される一次腫瘍の細胞型は鱗状細胞癌（48.9％）であり、そして腺癌は一次 腫瘍の 4.2％を占め、そして大細胞及び小細胞癌は１つの症例に関して、それぞ れ 2.1％であった。組織学的診断を有さない残る１°LC患者は、従来の治療を受 ける。スクリーニングで１°LCを有さない患者は、続けられ、そして２年までの 間、癌を有さないことがわかった。 症例／非症例状態に対して隠された Johns Hopkinsでの研究者は、57人の１° LC患者及び76人の非患者についての痰検体を評価した。検体は、登録で63才の平 均年齢の94人の鉱夫のために満足のいくものであると思われた（45人の患者及び 49人の年齢−適合された対照、表14）。90％以上が過去に喫煙していたが、研究 のために登録する時点では、わずか２／３が喫煙していた。 ＊：すべての患者の人種は中国人であり、そしてすべては男性で あった †：適用されない。 対照と比較される場合、この研究の間、肺癌を進行せしめた患者 は、痰上皮細胞の有意に高い光学密度により明らかなように hnRNPの過剰発現を 示した（表12）。hnRNPの過剰発現により陽性であることが予測される54人のう ち、39人（69％）は肺癌を進行せしめ、ところが陰性であることが予測された40 人のうち、わずか８人（20％）が、73％の全体の精度を伴って肺癌を進行せしめ た。１°LCを進行せしめた患者及び対照の類似する割合がそれらの痰において中 ぐらいの異型を発現した（それぞれ、４／45及び４／49、又は９％及び８％）。 45人の癌患者のうち10人（22％）は、それらの痰に腫瘍細胞を示したが、ところ が対照は示さなかった。それらのデータは、hnRNP過剰発現が、１°LCを検出す るために通常の（Papanicolaon−染色された）痰細胞形態学の感度を、約３倍（ 22％から72％に）、高めたことを示す。 全体の一次肺癌危険度： 56／6285， 0.9％ 陽性の予測値： 37／54， 69％ 予測された陰性間の危険度： 8／40， 20％ 陽性試験の相対的危険度：1480／432， 3.4 感 度：82％ 正確な95％二項信頼区間、68％〜92％。 特異性：65％ 正確な95％二項信頼区間、50％〜78％。 結論 痰検体における hnRNPのアップ−レギュレーションは、たとえ肺癌を示す細胞 学的変化がわずか１人の患者に見出されたとしても、12カ月以内での第２の一次 肺癌の検出においては、80％の精度であった。一次肺癌研究においては、過剰発 現された hnRNPは前臨床学的一次肺癌の同一定において73％の精度であり、そし て一次肺癌のわずか22％が細胞学的に診断された。 ２種の予測研究は、それらの痰における hnRNPアップ−レギュレーションを有 する患者の67％及び69％が、それぞれ 2.2％及び 0.9％のバックグラウンド肺癌 危険性と比較して、追跡調査の初年度で肺癌を進行せしめることを正確に予測し た。従って、hnRNP発現をモニターするためへの癌細胞の使用は、前臨床学的癌 検出の精度をひじょうに改良する。 例 11 上皮タンパク質mRNAの発現の検出のために生成ヨウ化物対比 染色を用いての螢光現場ハイブリダイゼーション ヨウ化プロピジュウム（PI）対比染色と組合しての螢光現場ハイブリダイゼー ション（FISH）を用いて、Wulf，M.など、Biotechniques，Vol.19，No.3，pp368 -372，1995 により記載されるようにして、骨断片における上皮タンパク質、そ のペプチド又は変異体のmRNA発現を示した。 手術による切除の後、組織サンプルを10％ホルムアルデヒド（pH 7.0）におい てすぐに固定し、そして非脱灰化し、パラフィンにより包埋された検体をFISHの ために使用した。ハイブリダイゼーションの前での断片の前処理は、Sandberg， M.など、J.Bone Joint Surg.，71: 69-71，1989 により記載されるように行なわ れる。予備ハイブリダイゼーションのためには、断片を、300μｌの予備ハイブ リダイゼーション緩衝液（50％脱イオン化されたホルムアミド、0.3ＭのNaCl、1 0mMのトリス−HCl、pH 7.5；10mMのNaHPO₄、pH 6.8；５mMのEDTA； 0.1×Denhar dt'sの10mMジチオトレイトール；0.25mg／mlの酵母tRNA〔Sigma Chemical，St.L ouis，MO〕；12.5％の硫酸デキストラン； 0.5mg／mlのサケ精子 DNA〔Sigma Ch emical〕）により被覆し、そして保湿チャンバーにおいて42℃で２時間インキュ ベートする。ハイブリダイゼーションのためには、次の配列：５′-GAGTCCGGTTC GTGTTCGTC-3 ′（配列番号11）及び５′-TGGCAGCATCAACCTCAGC-3′（配列番号18 ）を有する上皮タンパク質のためのジゴキシデニン−ラベルされた二本鎖cDNAプ ローブを使用する。このプローブは、Dig-Labeling Kit（Boehringer Mannheim ，Mannheim, Germany）のプロトコールに従って、ジゴキシゲニンによりラベル される。ハイブリダイゼーションの前、ラベルされたプローブを、１μｇ／mlの 濃度にプレハイブリダイゼーション緩衝液と共に混合し、95℃で10分間、加熱し 、そしてすばやく、氷上で急冷する。過剰のプレハイブリダイゼーション緩衝液 をスライドから除去し、そして約30μｌのハイブリダイゼーション溶液を断片に 適用する。断片をカバーガラスにより被覆し、ラバーセメントにより密封し、そ して湿潤チャンバーにおいて42℃で18時間ハイブリダイズせしめる。後−ハイブ リダイゼーション洗浄段階を、Weithege，T.，など．Pathd.Res.Pract.，187: 9 12-915，1991により記載されるようにして行なう。 プローブ検出を、FITC(フルオレセインイソチオシアネート；Boehringer Mann heim)に接合される抗−ジゴキシゲニン抗体を用いて行なう。結合しなかった接 合体を、リン酸緩衝溶液(PBS)(3.8mMのNaH₂PO₄; 7.8mMのNa₂HPO₄；0.13ＭのNaCl )により10分間２度洗浄することによって除去した。断片を、PBS（500ng／ml） 中、PI(Boe hringer Mannheim)により室温で５分間、対比染色する（断片当たり30μｌ）。 過剰のPIを、PBSによる洗浄、続く脱水（70％、96％、100％エタノール）により 除去する。断片を空気乾燥せしめ、そしてグリセロール／ PBS溶液に固定する。 分析のために、螢光顕微鏡(Leitz Diaplan，Wetzlar，Germany)を用いる。 FISHを用いて、前癌及び癌細胞における上皮タンパク質、ペプチド又は変異体 mRNAの示差発現を、正常細胞に比較して決定する。 例 12 細胞特徴のコンピューター処理された像分析に基づいて癌 を予測するための予測識別機能を生成するためのコンピュ ーター処理方法 この方法は、正常細胞と異型細胞との区別、及び個人が癌を進行せしめるよう になるかどうかの決定又は予測を可能にする。本明細書で使用される場合、異型 細胞とは、機能的に及び／又は形態学的に変更された細胞、たとえば前癌細胞及 び癌細胞を意味する。そのような予測は、個人における癌のいづれかの臨床学的 徴候よりもかなり先に行なわれ得る。予測は、癌のいづれかの臨床学的徴候の２ 年又はそれ以上早く行なわれ得る。そのような方法は、癌の危険性があるそれら の個人を同定する場合、不変であり、そして癌の進行を阻害し、又は妨げるため の処置の初期介入を可能にする。 前記方法は、典型的又は正常細胞に比較して、発現が異なる細胞特徴又はラベ ルの測定に依存する。それらの特徴又はラベルは、下記に列挙される１又は複数 のものを包含する。適切な統計学的ソフトウェアと組合しての像分析は、癌の進 行の予測である細胞特徴の同定を可能にする。像分析は、癌及び前癌との区別を 示す細胞特徴又はラベルの差異又は変更を検出する。種々のパラメーターが、ラ ベルされ、そして癌のインジケーター又は、予測体として、たとえ ば形態学の変更、高められた又は変更されたmRNA発現、高められた又は変更され た癌タンパク質、細胞レセプターの発現又は一方では細胞レセプターの低下、前 癌又は癌細胞に対してユニークであるアポプトシス又は他の細胞出来事に関連す る因子（但し、それらだけには限定されない）として測定され得る。 痰を予測する本発明の方法は、それがコンピュータアシストされ、そして癌の 進行を予測する場合、ひじょうに正確であることにおいて明確な利点を有する。 既知の陽性癌患者、癌を進行することが知られている患者及び陰性のまま存続 することが知られている陰性個人から採取された、保管された組織又は細胞は、 癌及び前癌細胞に対してユニークなパラメーターを決定するための像分析方法の ための検体を付与するために使用される。測定された細胞ラベル又は特徴に基づ けば、識別機能は、癌を有さない個人と比較して、癌を進行せしめる個人の検体 を区別するパラメーターの最良な線状組合せから誘導され得る。この識別機能は 、未知のサンプルにおける癌の予測のために有用である。 多くの場合、癌及び前癌に対してユニークな細胞特徴の検出への使用のための 追加のパラメーターを同定するためにラベルされたプローブ又はクロモゲンを添 加することは好都合である。たとえば、ラベルされたプローブは、正常なものに 比較して、癌又は前癌においていくらかの態様で変性される、mRNA，DNA、タン パク質、糖タンパク質、細胞レセプター、炭水化物及び同様のものを特異的に同 定することができる。１つの態様において、そのラベルされたプローブは、hn-R NP mRNAを検出する。 像分析は、いづれかの立体電子アレイ、たとえばビデオ顕微鏡処理の間に記録 されるものから、透過された、反射された、又は螢光 の照射を記録する、充電連結装置(CCD)のアナログ又はデジタルカメラにより行 なわれ得る。正常細胞、組織又は抽出物から癌又は前癌を区別するいづれかの像 が、癌又は前癌を予測する識別機能を決定するために本発明に使用され得る。 市販の装置、たとえばMeta Morph 2.x(Universal Imaging Corporation，West Chester，PA)は、細胞の 100以上の特徴を自動的に測定するために利用できる 。“測定”メニューを参照し、そして“物体測定値の形状化”を選択することに よって、使用者はデータファイルを計算し、そして登録するために測定値を選択 することができる。たとえば、Meta Morphの“物体分類機セット(Object Classi fer Set)”、Version 21における 108の可能な測定値は、下記に示される： “合計領域(Total area)”、“画素領域(Pixel area)”、“領域(Area)”、“ 孔領域(Hole area)”、“相対的孔領域(Relative hole area)”、“標準領域計 数(Standard area count)”、“周囲(Perimeter)”、“面心Ｘ(Centroid X)”、 “面心Ｙ(Centroid Y)”、“幅(Width)”、“高さ(Hight)”、“配向(Orientati on)”、“長さ(Length)”、“幅(Breadth)”、“繊維の長さ(Fiber length)”、 “繊維の幅(Fiber breadth)”、“形状因子(Shape factor)”、“楕円形因子(El l.form factor)”、“内径(Inner radius)”、“外径(Outer radius)”、“平均 半径(Mean radius)”、“等価半径(Equiv．radius)”、“等価球体積(Equiv．sh er evol.)”、“等価扁長体積(Equiv．prolate vol.)”、“等価扁円体積(Equiv ．oblate vol.)”、“等価球表面積(Equiv．shere surface area)”、“平均グ レー値(Average gray ralue)”、“合計グレー値(Total gray value)”、“光学 密度(Optical density)”、“統合されたOD(Integrated OD)”、“強さの中心Ｘ (Intensity center X)” 、“強さの中心Ｙ(Intensity center Y)”、“ラジアル分散(Radial dispersion )”、“表面差異モーメント(Texture Difference Moment)”、“表面逆差異モー メント(Texture Inverse Difference Moment)”、“OD分散(OD Variance)”、“ OD相対的低領域(OD Relative Low Area)”、“OD相対的中間領域(OD Relative M edium Area)”、“OD相対的高領域(OD Relative High Area)”、“OD相対的低量 (OD Relative Low Amount)”、“OD相対的中間量(OD Relative Medium Amount) ”、“OD相対的高い量(OD Relative High Amount)”、“OD相対的低い距離(OD R elative Low Distance)”、“OD相対的中間距離(OD Relative Medium Distance) ”、“OD相対的高い距離(OD Relative High Distance)”、“EFA調和A0(EFA Har monic A0)”、“EFA調和C0(EFA Harmonic C0)”、“EFA調和２、半−主要軸(EFA Harmonic 2，Semi-Major Axis)”、“EFA調和２、半−マイナー軸(EFA Harmoni c 2，Semi-Minor Axis)”、“EFA調和２、半−主要軸角度(EFA Harmonic 2，Sem i-Major Axis Angle)”、“EFA調和２、楕円領域(EFA Harmonic 2，Ellipse Are a)”、“EFA調和２、軸比(EFA Harmonic 2，Axial Ratio)”、“EFA調和３、半 −主要軸(EFA Harmonic 3，Semi-Major Axis)”、“EFA調和３、半−マイナー軸 (EFA Harmonic 3，Semi-Minor Axis)”、“EFA調和３、半−主要軸角度(EFA Har monic 3，Semi-Major Axis Angle)”、“EFA調和３、楕円領域(EFA Harmonic 3 ，Ellipse Area)”、“EFA調和３、軸比(EFA Harmonic 3，Axial Ratio)”、“E FA調和４、半−主要軸(EFA Harmonic 4，Semi-Major Axis)”、“EFA調和４、半 −マイナー軸(EFA Harmonic 4，Semi-Minor Axis)”、“EFA調和４、半−主要軸 角度(EFA Harmonic 4，Semi-Major Axis Angle)”、“EFA調和４、楕円領域(EFA Harmonic 4，Ellipse Area)”、“EFA調和４、軸比(EFA Harmonic 4，Axial Ra tio)”、“EFA調和５、半−主要軸( EFA Harmonic 5，Semi-Major Axis)”、“EFA調和５、半−マイナー軸(EFA Harm onic 5，Semi-Minor Axis)”、“EFA調和５、半−主要軸角度(EFA Harmonic 5， Semi-Major Axis Angle)”、“EFA調和５、楕円領域(EFA Harmonic 5，Ellipse Area)”、“EFA調和５、軸比(EFA Harmonic 5，Axial Ratio)”、“EFA調和６、 半−主要軸(EFA Harmonic 6，Semi-Major Axis)”、“EFA調和６、半−主要軸角 度(EFA Harmonic 6，Semi-Major Axis Angle)”、“EFA調和６、楕円領域(EFA H armonic 6，Ellipse Area)”、“EFA調和６、軸比(EFA Harmonic 6，Axial Rati o)”、“EFA調和７、半−主要軸(EFA Harmonic 7，Semi-Major Axis)”、“EFA 調和７、半−マイナー軸(EFA Harmonic 7，Semi-Minor Axis)”、“EFA調和７、 半−主要軸角度(EFA Harmonic 7，Semi-Major Axis Angle)”、“EFA調和７、楕 円領域(EFA Harmonic 7，Ellipse Area)”、“EFA調和７、軸比(EFA Harmonic 7 ，Axial Ratio)”、“EFA調和８、半−主要軸(EFA Harmonic 8，Semi-Major Axi s)”、“EFA調和８、半−マイナー軸(EFA Harmonic 8，Semi-Minor Axis)”、“ EFA調和８、半−主要軸角度(EFA Harmonic 8，Semi-Major Axis Angle)”、“EF A調和８、楕円領域(EFA Harmonic 8，Ellipse Area)”、“EFA調和８、軸比(EFA Harmonic 8，Axial Ratio)”、“EFA調和９、半−主要軸(EFA Harmonic 9，Sem i-Major Axis)”、“EFA調和９、半−マイナー軸(EFA Harmonic 9，Semi-Minor Axis)”、“EFA調和９、半−主要軸角度(EFA Harmonic 9，Semi-Major Axis Ang le)”、“EFA調和９、楕円領域(EFA Harmonic 9，Ellipse Area)”、“EFA調和 ９、軸比(EFA Harmonic 9，Axial Ratio)”、“EFA調和10、半−主要軸(EFA Har monic 10，Semi-Major Axis)”、“EFA調和10、半−マイナー軸(EFA Harmonic 1 0，Semi-Minor Axis)”、“EFA調和10、半−主要軸角度(EFA Harmonic 10，Semi -Major Axis Angle)”、“EFA調和10、楕円領域(EF A Harmonic 10，Ellipse Area)”、“EFA調和10、軸比(EFA Harmonic 10，Axial Ratio)”、“EFA調和11、半−主要軸(EFA Harmonic 11，Semi-Major Axis)”、 “EFA調和11、半−マイナー軸(EFA Harmonic 11，Semi-Minor Axis)”、“EFA調 和11、半−主要軸角度(EFA Harmonic 11，Semi-Major Axis Angle)”、“EFA調 和11、楕円領域(EFA Harmonic 11，Ellipse Area)”、“EFA調和11、軸比(EFA H armonic 11，Axial Ratio)”、“EFA調和12、半−主要軸(EFA Harmonic 12，Sem i-Major Axis)”、“EFA調和12、半−マイナー軸(EFA Harmonic 12，Semi-Minor Axis)”、“EFA調和12、半−主要軸角度(EFA Harmonic 12，Semi-Major Axis A ngle)”、“EFA調和12、楕円領域(EFA Harmonic 12，Ellipse Area)”、“EFA調 和12、軸比(EFA Harmonic 12，Axial Ratio)”、“EFA調和13、半−主要軸(EFA Harmonic 13，Semi-Major Axis)”、“EFA調和13、半−マイナー軸(EFA Harmoni c 13，Semi-Minor Axis)”、“EFA調和13、半−主要軸角度(EFA Harmonic 13，S emi-Major Axis Angle)”、“EFA調和13、楕円領域(EFA Harmonic 13，Ellipse Area)”、“EFA調和13、軸比(EFA Harmonic 13，Axial Ratio)”。 強力な市販の統計学的装置、たとえば WindowsのためのSPSS 7.0(SPSS，Inc. ，Chicago，IL)が、マイクロコンピューターデータ管理及び分析のために利用で きる。そのアルゴリズムは、メインフレームコンピューターに基づくSPSSソフト ウェアに使用されるアルゴリズムと同一であり、そしてその統計学的結果は、メ インフレーム上で計算された結果と同じほど正確であろう。 SPSS装置は、グループメンバーシップの直接的な予測を提供する識別分析を包 含する。この方法においては、変数の最良の線状組合せが、いくつかのグループ 間を区別するために自動的に選択される。前記変数のための係数が、できるだけ 大きな合計の平方和に対す るグループ間の平方和の比を得るためにコンピューターにより選択される。 本発明は、グループメンバーシップ（前癌又は癌症例、又は対照）の直接的な 予測を付与するための細胞測定値（市販の像形成装置により作られた）の最適な 組合せを選択するために市販の統計学的装置を用いて、識別機能アルゴリズムを 決定するための方法を提供する。 １つの態様においては、肺癌を予測するための識別機能は、癌を進行せしめる であろうそれらの個人を予測することにおいて約 100％の精度を提供する、光学 密度、核表面差異モーメント及び楕円形フーリエ調和(elliptical Fourier harm onic)の核領域のパラメーターを利用する。低い精度で満足する場合、その識別 機能は、核パラメーターを伴わないで光学密度にのみ基づかれ得る。 異なった位置からの異なった組織又は上皮細胞は、前記同じ識別機能又は代り の識別機能を利用することができる。識別機能を決定するための方法は、組織、 細胞型、及び所望する精度の程度に依存して、対応する異なった係数と共に、他 の組の変数の選択を導びくことができる。既知の臨床結果を有する患者の収容さ れた検体の見込みある採取から計算される識別機能による像分析の方法は、予測 識別機能等式の決定を可能にする。従って、この方法は、見込みある検体が得ら れるいづれかの癌、たとえば肺、乳、肝臓、前立腺、子宮、卵巣、胃腸管、食道 及び同様のものの癌（但し、それらだけには限定されない）のための予測識別機 能等式の決定において有用である。像分析に使用されるそのような識別機能は、 癌を進行せしめるであろう個人の予測を可能にする。 例 13 ラベルされたhnRNP mRNAを有する収容された痰細胞の二重 −波長像濃度学に基づいて肺癌を予測する識別機能を開発 するための方法 アップ−レギュレートされたhnRNP mRNAを、ビオチン−11−UTPによりラベル され、そしてペルオキシダーゼ−DAB により免疫染色された上皮細胞の強さ及び 頻度により視覚的に認識することができる。視覚的な解釈は、バックグラウンド （成熟）上皮細胞に対しての免疫ラベルされた情報的な（弱い異型の）上皮細胞 の“示差表示”を比較する。精度は、ビデオ顕微鏡を用いて、免疫ラベルされた 上皮細胞を通して透過された光の強さの客観的な測定により改良されて来た。染 色クロモゲンに対して最適化された光の２つの波長、600nm及び 510nmで行なわ れるこの技法は、二重−波長像濃度学（dual-wavelength image densitometry） と呼ばれ、そして測定は次のようにして行なわれる： １．Koehler 照明（標準実験の実施） 最とも明るく、均等に照明された領域を達成するための Koehler照明のために 顕微鏡を調節することによって開始する。この調節は、光源からの光線（光源及 びアパーチュアダイアグラムを包含する接合“アパーチュア”面に焦点が合って いる）が、その接合“領域”面（検体、現場ダイアグラム及び網膜を包含する） を通過する場合、平行であることを付与する。 ａ．検体を適切な目的物に焦点を合わせる。本研究においては、検体は50倍で 映像化された。 ｂ．アパーチュア及び現場ダイアグラムを減じ、そして現場ダイアグラムの鋭 い像が検体上に重ねられるまで、コンデンサーの焦点を合わす。 ｃ．可視領域すぐ向こうに現場ダイアグラム開放する。 ｄ．飽和を伴わないでCCD(充電結合装置)ビデオカメラの力学的 範囲を最大にするようアパーチュアダイアグラムを調節する。 次の段階は、“Tockman．out”落と込みとしてファイル構造に同定される、Me ta Morph Image Analysis Program，Universal Imaging Corp，West Chester，P A の測定メニュー“光学密度適用”中にプログラムされている。 ２．CCD の検量及び対照像の獲得（11の対照像を得る） ａ．濃度測定のために使用されるべき暗対照像（dark reference image）を調 製する。この暗対照像は、ブロックされた光源を有する16のフレームの平均によ り獲得される。 ｂ．白対照像(white reference image)を調製する。この白対照像は、600nmの フィルターを適所に有する検体スライドのブランク部分の16のフレームの平均に より獲得される。第２の白対照像は、510nmのフィルターを適所に有する検体ス ライドから得られる。暗対照像は、貯蔵の前、白対照像から画素ごとに引き算さ れる（バックグラウンド引き算）。 ｃ．第１の中性密度像の獲得。0.2の中性密度フィルターを光路に配置し、検 体スライドのブランク部分の16のフレームを 600nmで平均化する。貯蔵の前、こ の像は、光学及び照明不規則性を修正するために、バックグラウンド引き算され た白対照像により割り算される(画素ごとに)(色相修正)。この工程を、510nmで 反復する。 ｄ．第２の中性密度像の獲得。0.4の中性密度フィルターを光路に配置した後 、（ｃ）の工程を反復する。 ｅ．密度検量のプロット。暗、白、第１及び第２の中性密度像について CCDに より記録された、透過された光の平均を取った後、コンピューターは光学密度（ 横座標）に対するグレースケールの光の強さ（８−ビット、256間隔の縦座標上 に）の４つの点の検量曲線を構成する。１つの検量曲線が個々の波長のために構 成される。初 日のための検量曲線は、標準曲線として任意に選択され、そして続く測定セッシ ョンからの検量曲線は、実験の間、測定値の適合性を確かめながら、それらに対 して標準化される。 ｆ．陽性の対照像の獲得。mRNAアンチセンスプローブによりハイブリダイズさ れた、免疫染色されたCalu-3培養肺癌細胞を選択する。600nmでの細胞像を、16 のフレーム、バックグラウンド引き算及び色相修正を平均化した後に獲得する。 第２の像を、フィルターホイールを自動的に回転することによって、細胞位置（ 位置合せ）のいづれの変化も伴わないで 510nmで獲得する。 ｇ．陰性の対照像を、センスプローブがハイブリダイズされている同一の対照 スライドから類似する態様で獲得する。 ３．像対の獲得 個々の試験スライドは、映像化のための上皮細胞領域を選択する細胞技術者に より走査される。個々の像を、16のフレーム、バックグラウンド引き算及び色相 修正を、位置合せの変更を伴わないで平均化することによって、まず 600nmで及 び次に、510nmで獲得する。個々の像対を、同じ患者のために像の“スタック” にセーブする。個々のスタックを、11の対照像のスタックを包含する光学ディス クファイルにセーブする。 ４．像対の測定 （測定の前、コンピューターが対照スタックの結合性を調べ、密度計測検量を 標準化し、患者の像のスタックを回収し、そしてコンピュータースクリーン上に 第１の領域の像を配置する。） ａ．測定されるべき核の選択。マウスクリックは、カーソルが測定されるべき 第１の細胞の核をおおう場合、細胞の 400倍への拡大及びその領域の中央へのそ の配置をコンピューターに引き起こす。 ｂ．興味ある核領域の概略。マウスの急速な引っ張りは、像にお ける他の構造体から核を分離するために核の外形を描く。 ｃ．核酸の限界。核の実際の端を、透過された光の画素値により決定する。包 含される値の限界は、最良の適合性が達成されるまで、技術者による高められ、 そして低められる。 ｄ．核の測定。100以上の別々の測定を行ない、そして力学的データ登録(DDE) リンクにより Excelスプレッドシートに電子的に記録する。１つの態様において は、癌結果による細胞の分離に最とも寄与する測定は、次のものである： 核表面差異モーメント。この測定は、核を通して画素から画素に進行する徴候 変化の数に基づかれる。０の表面差異モーメントは、均等なグレーを示す。高い 値は、荒い凝集塊を示す。 楕円形フーリエ調和＃９の領域。早いフーリエ変換(FFT)のこの適用は、隣接 する輪郭における定期的なデータを分析する。Kuhl and Giardina（Computer Gr aphic Image Proc．1982; 18: 236-58）の研究に基づけば、この方法は、高いオ ーダーのフーリエ調和として微妙な変動を認識する。ここで、９点の形状として それらの領域（画素における）の小さな割合を有する核は、識別的であると思わ れる。大きな値は、大きな領域を示す。 ｅ．600nmでの興味ある細胞質領域の概略。マウスの急速な引っ張りは、600nm での細胞質の像を概略する。 ｆ．細胞質の限界。細胞質の実際の端を、透過された光の画系値により決定す る。包含される値の限界は、最初の適合性が達成されるまで、技術者により高め られ、そして低められる。 ｇ．600nmでの細胞質の測定。核を、細胞質像から減じられる二元マスク中に 転換する。核に類似して、100以上の別々の測定を行ない、そして力学的データ 登録(DDE)リンクにより Excelスプレッドシートに電子的に記録する。１つの態 様においては、癌結果によ る細胞の分離に最っとも寄与する測定は、次のものである： 600nm での平均細胞質密度。600nmでの細胞質の光学密度を、測定された平均の 画素グレーレベル及び標準化された検量表により決定する。 ｈ．500nmでの興味ある細胞質領域の概略。マウスの急速な引っ張りは、510nm での細胞質の像を概略する。 ｉ．細胞質の限界。細胞質の実際の端を、上記のようにして限界により決定す る。 ｊ．510nmでの細胞質の測定。現在、癌結果による細胞の分離に最っとも寄与 する測定は、次のものである： 510nm での平均細胞質密度。510nmでの細胞質の光学密度を、測定された平均の 画素グレーレベル及び標準化された検量表により決定する。 ５．線状識別機能データ分析（これは、SPSS Inc.，Chicago，ILによるPCのた めの商業的に入手できるルーチンである）。 ａ．Excel測定データが、癌を有さない個人の検体から、癌を後に進行せしめ る個人からの検体を良好に分離する依存性変数の線状組合せを見出すためにSPSS プログラム中に登録する。 ｂ．癌又は癌ではないものとして設定された結果グループ、及び 510nmでの平 均細胞質光学密度としての依存性変数により、600nmでの平均細胞質光学密度、 核表面差異モーメント、及び楕円形フーリエ表面差異モーメントにより説明され る核の領域並びに楕円形フーリエ調和９により説明される核の領域が、癌を有さ ない個人と比較して、癌を進行せしめるJohns Hopkins Lung Project（JHLP）参 加者からの痰検体の完全な識別を生成した。 それらの測定は、新規の次識別機能中に組合される： Ｄ＝β₀＋β₁(光学密度₆₀₀)＋β₂(光学密度₅₁₀)＋β₃(核表面差異 )＋β₄(フーリエ調和９での核楕円形領域)。 それらのJHLP重量についての標準化されていない値は、次の通りである： β₂＝CYAVOD51 -8.1834331 β₁＝CYAVOD60 -16.7053961 β₃＝NUCTXDIF 5.5935067 β₄＝NUCTXDIF 58.8520016 β₀＝（定数） -5.5977584 例 14 (hnRNP)A2／B1のmRNAに対する現場ハイブリダイゼーション による肺癌の初期検出 肺癌をのちに進行せしめる個人の痰におけるわずか少数の細胞が、hnRNP抗原 を過剰発現する。hnRNPアップ−レギュレーションについての一時的な経過及び 原因を理解するために、組織現場ハイブリダイゼーションアッセイを、剥離され た痰細胞への使用のために改良した。 痰検体の免疫細胞化学アッセイは、正常な痰細胞における低レベルのバックグ ラウンド発現を示し（アメリカ特許第 5,455,159号）、そして初期肺癌検出のた めの増強された抗原存在を定量化するために二重−波長像密度測定技法を開発す るための刺激を提供した(Tockman，など．1993，Diagnostic Cytopathol ，vol. 9(6): 615-22)。二重−波長像密度測定法は、600nm及び 510nmでの細胞質光学密 度の信頼できる測定を確保するために一連の注意して標準化され、そして検量さ れた方法（図14を参照のこと）に依存する。タンパク質抗原密度測定のコンピュ ーター処理された解釈は、それらの光学密度を識別機能に組合す。 Ｄ＝β₀＋β₁(光学密度₆₀₀)^1/2−β₂(光学密度₅₁₀)^1/2 核膜を通しての hnRNPの変更された核分布及び損なわれた移動度についての可能 性は、追加の細胞特徴の測定及び新しい識別機能の開発を導びいた。像密度測定 のための変性されたアルゴリズムは、hnRNPタンパク質の発現を有効にするため に使用される同じJHLP検体におけるhnRNP mRNA発現を正確に定量化し、初期肺癌 のより正確な検出をもたらす。 方法 臨床学的材料。前に記載したように、Johns Hopkins Lung Project（JHLP）が 、1976〜1984年の間、5,226人の中年の男性喫煙者からの誘導された痰検体に対 する細胞学的スクリーニングを行なった（アメリカ特許第 5,455,159号；Tockma n, など．1989，J.Clin.Oncol ．，Vol.6: 1685-93）。８年までの毎年のスクリ ーニングの間、それら参加者の 626人（12％）が、１又は複数のそれらの癌検体 上に中ぐらい又は高い異型性を有した。すべてのそのような検体及び追跡調査材 料を、Saccomanno's保存剤溶液(SPS、50％エタノール中、２％ポリエチレングリ コール)に個々に配置し、そして貯蔵した(Saccomanno，など．1963 Acta Cytol ． ，vol.7; 305-10)。それらの個人の86人は、追跡調査の間、肺癌を進行せしめ た。個々の主要肺癌細胞型の例（腺癌、鱗状細胞癌、未分化の大きな細胞及び未 分化の小さな細胞）を包含するよう分類された、それらの検体のランダム選択は 、臨床学的肺癌の進行の平均２年前に採取された22の痰検体を提供する。癌を進 行しなかった個人からの形態学的に類似する検体は、対照として使用された。収 容された材料は、それらの個人の13人に対して利用でき、それらの８人は癌を進 行せしめ（３人の鱗状細胞癌、３人の未分化小細胞、２人の腺癌）、そして５人 癌が存在しなかった。 現場ハイブリダイゼーション。SP６及びＴ７プロモーターを含む プラスミドからファージポリメラーゼにより転写された、1.6kb及び 1.8kbの一 本鎖 RNAプローブを、本明細書に記載のようにして、使用し、そして製造した。 SPSに前もって固定された細胞学的検体及び対照材料を、唾液分泌されたRNアー ゼフリーのガラススライド（American Histo）上に、細胞回転せしめた（Shando n，Pittsburg，PA）。Calu-3（ATCCヒト気管支原性腺癌細胞系）を、正常な痰と 共に混合し、そして対照として使用した。前処理最適化は、次の工程を包含した 。室温で１時間、４％パラホルムアルデヒド(Sigma)により後−固定した後、10 μｇ／mlのプロティナーゼＫ(Gibco BRL)を含む、37℃に前もって暖められた 0. 1Ｍのトリス／50mMのEDTA（pH 8.0）により10分間、スライドを処理し、過剰の 接近性を高めた。0.25％の無水酢酸及び 0.1Ｍのトリエタノールアミン溶液(pH 8.0、Sigma)による10分間のアセチル化により、バックグラウンド結合を低める 。プローブを、10ｎモル／μｌのジゴキシゲニン−11−UTP（Boehringer Mannhe im）によりラベルする。 現場ハイブリダイゼーション工程は、Coxなど.(Dev.Biol ． 1984; 101: 485-5 02)の方法に従がう。一組のスライドのハイブリダイゼーションを、特異的ハイ ブリダイゼーションを検出するためにアンチセンス一本鎖リボプローブに対して 行なった。平行して、同一の条件下で、第２組のスライドをセンスリボプローブ に対してハイブリダイズし、非特異的バックグラウンドハイブリダイゼーション を検出した。第２の対照として、第３組のスライドを、アンチセンスハイブリダ イゼーションの前、RNアーゼにより処理し、非− RNA細胞成分への結合に起因す るいづれかのシグナルを検出した。免疫細胞化学を用いて、ジゴキシゲニン−ラ ベルされ、ハイブリダイズされたプローブを検出した。後−ハイブリダイゼーシ ョン緊縮洗浄及びRNアーゼすすぎの後、スライドは、ヘマトキシリン対比染色に よるペルオキシダーセジアミノベンジジン(DAB)染色(Vector Laboratories，Bur lingame，CA)を受ける。 二重−波長像血球計算法。規則的な化生を有する痰上皮細胞を、患者の臨床学 的状態の知識のない細胞技術者により可視的に選択した。患者当たり２つのスラ イドを走査した後、５〜10の特徴的な領域を、個々の患者のために選択した。Ko ehler照明、続く、光透過の中性密度フィルター標準化を確立した。スライドを 、Zeiss Axiomat顕微鏡(Carl Zeiss，Oberkochen，Germany)上で映像化した。カ ッ色のジアミノベンジジン−ラベルされたジゴキシゲニン及び青色の（ヘマトキ シリン）対比染色のための透過される光を最適化するために、それぞれ600nm（5 90〜610nm の範囲）及び510nm（500〜520nm の範囲）の Omega製の狭いバンドフ ィルターを用いた(Tockman，など．1992 Cancer Res.，vol.52(Suppl); 27115- 85)。透過を、デジタル像プロセッサー（Metamorph v 2.0，Universal Imaging ，West Chester，PA）に連結される高解像度ビデオカメラ(Hamamatsu Photonic Systems，Japan)により検出した。次に、両波長での個々の領域の、バックグラ ウンドを減じられた、色相−修正された像を、光学装置(Panasonic／Matsushita Co.，Osaka)に記録した。 照明及びカメラセンサーの非均等性を処理するために色相修正した後、光学密 度値を、クロモゲンラベルの透過率スペクトルから以前に決定されたように、60 0nm及び 510nmで測定する。核表面分析は、画素から画素の比較における徴候の 変化の数（核表面差異モーメント）に基づかれており、ここで大きな値は荒い凝 集塊を示す。核膜の形状は、種々の周波数範囲でフーリエ力の評価により決定さ れる。より高い不規則性は、高められた細胞質領域の高いフーリエ調和として表 わされる。それらの測定値は、下記の新規識別機能中 に組合される： Ｄ＝β₀＋β₁(光学密度₆₀₀)＋β₂(光学密度₅₁₀)＋β₃(核表面差 異)＋β₃(フーリエ調和９での核楕円形領域)。 結果 陽性及び陰性対照検体における hnRNP A2 mRNA及びタンパク質の発現は、図15 ａ−ｄに示される。ラベルされた“免疫細胞化学”の図15ａは、培養されたCalu -3腺癌細胞と共に混合された、正常な痰における成熟鱗状上皮細胞を示す。正常 な上皮細胞は、広範な細胞質と共に小さな核を示し、モノクローナル抗体 703D4 により検出され、そして DABにより弱く染色される通常（バックグラウンド）レ ベルの hnRNPを発現する。培養された腫瘍細胞は、hnRNPアップ−レギュレーシ ョンを示す濃く染色する細胞質の小さな縁と共に、大きな核を有する。図15ｂ（ ラベルされた“アンチセンス”）は、DABによりラベルされた特異的mRNAハイブ リダイゼーションを発現する類似する陽性対照材料を示す。hnRNPタンパク質に 対する局在発現の類似性を注目すること（図15ａ）。図15ｃ（“センス”）及び 15ｄ（“RNアーゼ”）は、現場ハイブリダイゼーションの負の対照を示す。 図16ａ−ｄにおいては、hnRNP A2 mRNA及びタンパク質の発現は、陽性の場合 （図16ａ，16ｂ）と陰性の場合（図16ｃ，16ｄ）との間で対比される。上部列に おいては、鱗状肺癌をのちに進行せしめた患者からの検体の２つのアリコートは 、hnRNPタンパク質（図16ａ）及びhnRNP mRNA（図16ｂ）の弱い形態学的異型及 び陽性発現を示す。下部列においては、肺癌を進行せしめなかった患者の痰の類 似するアッセイは、類似する細胞形態学にもかかわらず、タンパク質又はmRNAの 過剰発現を示さない。 表16は、癌をのちに進行せしめた個人及び癌を有さない個人のハ イブリダイズされた痰細胞に対して測定された特定変数のためのグループ平均及 び標準偏差を示す。サンプルは小さいけれども、注意して行なわれた測定は、癌 をのちに進行せしめる患者の細胞の有意に高い光学密度（情報発現）、核膜の有 意に低い好適な折りたたみ、及び荒い核凝集塊（統計学的有意性に達していない 、表17）を示す。特定の変数の他は強く示唆的であるが、それぞれ、それらは癌 の続く進行を好結果をもって予測しない。 −識別分析− TWOUTCM により定義されるグループに基づく： 分析数：１ 直接的な方法： 許容試験をパスするすべての変数を登録する。 最小許容レベル ……………………………… 0.00100 規範的な識別機能 機能の最大数 ……………………………… 分散の最小累積％ …………………………… 100.00 Wilks’Lambda の最大有意性 ……………… 1.0000 個々のグループのための前の確立は、0.50000である。 分類機能系数 （Fisher’s線状識別機能） 規範的識別機能 ＊：これは、分析において残存する１の規範的識別機能を示す。 標準化された規範的な識別機能係数 機能１ CYAVOD51 -.45504 CYAVOD60 -.96039 NUCTXDIF 1.70686 NEFAHAR9 1.66169 構造マトリックス： 識別変数と規範的な識別機能との間のプールされたグループ内相互関係 （機能内の相互関係のサイズにより指図される変数） 機能１ CYAVOD51 -.65573 CYAVOD60 -.63200 NEFAHAR9 .32067 NUCTXDIF -.25673 標準化されていない規範的な識別機能係数 機能１ CYAVOD51 -8.1834331 CYAVOD60 -16.6053961 NUCTXDIF 5.5935067 NEFAHAR9 58.8520016 （定数） -5.5977584 グループ平均（グループ中心）で評価される規範的な識別機能 グループ 機能１ １ 2.91348 ２ -1.82092 計算された識別機能は、表18においてヒストグラムで示される。癌を進行せし める個人の痰細胞の識別機能は、癌を有さない個人の識別機能から明確に分離さ れる。この結論は、分類表（表19）により支持される。この表は、二重波長像血 球測定によるhnRNP mRNA発現の決定が、癌を有さない個人の痰検体と肺癌を進行 せしめるであろう個人の臨床的癌の２年前に採取された痰検体とを区別すること ができることを示す。 正しく分類された“グループ”ケースの％：100.00％ 分類方法の要約： 13（重視されていない）のケースが処理された。 ０のケースが欠測又は範囲外グループコードのために排除された。 ０のケースが少なくとも１つの欠測識別変数を有した。 13（重視されていない）のケースがプリントされる出力のために使用された。 比較のために、同じ13の痰検体における hnRNPタンパク質を、類似する識別機 能分析において評価する（表20〜24）。表20は、癌をのちに進行せしめる個人及 び癌を有さない個人の免疫染色された痰細胞に対して測定されたグループ平均及 び標準偏差を示す。傾向は明らかであるが、測定変動性及び小サンプルサイズは 、有意な差異を排除する（表21）。 hnRNPタンパク質発現の密度測定法における高い変動性は、表22におけるヒス トグラムで示されるオーバーラップする識別機能評点により示される。タンパク 質発現のためにのみ測定される痰細胞の識別機能は、誤った陽性結果及び誤った 陰性結果の両者を示す。この結論は、分類表により支持される（表23）。この表 は、hnRNPタンパク質発現が癌を有さない個人の痰検体と肺癌を進行せしめるで あろう個人の臨床的癌の２年前に採取された痰検体の77％とを区別することを示 す。 正しく分類された“グループ”ケースの％： 76.92％ 分類方法の要約： 13（重視されていない）のケースが処理された。 ０のケースが欠測又は範囲外グループコードのために排除された。 ０のケースが少なくとも１つの欠測識別変数を有した。 13（重視されていない）のケースがプリントされる出力のために使用された。 この結果は、現在の臨床学的実施に対して前進したすぐれた段階を表わすが， 同じ検体におけるタンパク質発現に対するhnRNP mRNAによる初期検出の精度にお いてさらなる改良点が明白である（表24）。 例 14 上皮タンパク質の核酸の局在化のためのパラフィン− 包埋された肺断片の現場 PCR及び現場RT-PCR Martinez，A.，など．J.Histochem ．and Cytochem.，Vol.43，No.8，pp.739-7 47，1995により記載されるような次のプロトコールを 用いて、前癌及び癌細胞における、前癌及び癌に関連する上皮タンパク質、その ペプチド又は変異体の核酸を検出する。前記方法はまた、Saccone，S．などGeno mics 1992，Jan: 12(1): 171-174; Biamonti，G．などNucleic Acid Res ． 1994 ，Jun 22(11): 1996-2002 により報告されたように、核酸の染色体位置、又はそ の位置での染色体異常性を検出するためにも有用である。 材料及び方法 細胞系 NCH720及びNCH157細胞系をこの研究に使用する。それらの細胞系を、30nMのセ レン及び10mMのＬ−グルタミンを含むフェノールレッドフリーの RPMI-1640を用 いて、タンパク質フリー及びホルモンフリー条件下で増殖せしめた(Siegfriedな ど.，J.Biol.Chem. 269: 8596，1994)。約５×10⁶個の細胞のペレットを、PBSに より洗浄し、２％ NuSieve低融点アガロース(カタログ 50082、ロッド626592；F MC BioProducts，Rockland，ME)１ml中に再懸濁し、固形化し、４％パラホルム アルデヒド又は10％ホルマリンにおいて２時間、固定化し、そして通常の組織病 理学技法によりパラフィンに包埋する。 公文書 正常な肺及び代表的な症例の前癌及び肺腫瘍を含むホルマリン固定化され、パ ラフィン包埋されたブロックを、NCI-Navy Medical Oncology Branchでの BPRB ，NCIのファイルから得る。 免疫組織化学 モノクローナル抗体 703D4を使用する（アメリカ特許第 4,569,788号）。アビ ジン−ビオチン組織化学的染色方法(Hsuなど、J.Histochem.Cytochem ． 29: 577 ，1981)が、酵素基質としての３，３′−ジアミノベンジジン(カタログD-5637、 ロッド122H3642；Sigma, St.Louis，MO)及び 0.006％のH₂O₂の0.03％溶液と共に、Vectastrain ABCキッ ト（カタログPK-4001; Vector Laboratories，Burlingame，CA）を用いて、肺組 織及び細胞系における 703D4免疫活性を局在化するために使用される。 RNA抽出 Glisinなど(Biochemistry Vol.13; 2633，1974)のグアニジンイソチオシアネ ート−塩化セシウム法を用いて、前記細胞系から生 RNAを抽出する。正常なヒト 脳(カタログ6516-2、ロッド2Y081)、肺臓(カタログ6510-2、ロッド39076)、肺( カタログ6524-2、ロッド34401)、胃(カタログ6548-2、ロッド38131)、及び子宮( カタログ6537-2、ロッド29100)からのポリＡ＋RNA を、Clontech Laboratories （Palo Alto，CA）から購入する。 ノザンブロット 標準のホルムアルデヒドゲルを、120 v．100mAmpで、３時間、全RNA(10μｇ／ ウエル)により試験した。その試験の最後で、ゲルを、20×SSC により15分間、 洗浄し、そして次に、0.45μｍのニトロセルロースフィルター上に毛管流トラン スファーにより一晩ブロットする(Davisなど、Basic Methods in Molecular Bio logy，Norwalk，CT，Appleton & Large，1986)。ブロットを1200ジュールでUV架 橋し、そして４時間プレハイブリダイズする。Stratagene Prime-Itキット（Str atagene; La Jolla，CA）を用いて、プローブをラベルする。前記プローブは、h nRNP-A2及びA1のための十分な長さのcDNAを含むプラスミドの制限エンドヌクレ アーゼ消化物からゲル精製された挿入体の³²P-dCTPによるランダムプライミング により調製された。プローブ（１×10⁶cpm）を個々のハイブリダイジング緩衝液 １mlに添加する。一晩のハイブリダイゼーションの後、ブロットを室温で２×SS C ／ 0.1％ SDSにより１回洗浄し、ブロットを室温（ RT; 30分）で２×SSC ／ 0.1％ SDSにより１回洗浄し、そして60℃（30分）で、 0.1％ SSC／ 0.1％ SDSにより１回洗浄する。次に、ブロットを空気乾燥せしめ 、そしてKodak XAR5フィルム上で−80℃で１〜２日間、オートラジオグラフ処理 する。 標準のPCR 上皮タンパク質のためのオリゴヌクレオチドプライマーを、MilliGen 8700 DN A合成機（Millipore; Marlborough，MA）を用いて製造する。配列は、５′-GAGT CCGGTTCGTGTTCGTC-3 ′（配列番号11）及び５′-TGGCAGCATCAACCTCAGC-3′（配 列番号18）である。使用されるすべての緩衝液、酵素及びヌクレオチドは、Appl ied Biosystems(Perkin-Elmer Cetus; Norwald，CT)から得られる。Perkin-Elme r 9600 Thermocyclerを用いて、サンプルを増幅する。PCR生成物を、１％アガロ ースゲルを用いて電気泳動分析し（80Ｖ、３時）、そして臭化エチジウム染色を 、UV光下で、続いて³²Ｐ−ラベルされたプローブを用いてのサザン分析により観 察される。 サザン分析 ゲルを、1.5ＭのNaCl／ 0.6ＭのNaOH及び 1.5ＭのNaCl／２Ｍのトリスにおい て変性し、そして毛管流トランスファーにより20×SSC における 0.2μｍのニト ロセルロースフィルター上に一晩ブロットする。フィルターを真空下で80℃で架 橋し、そしてハイブリダイゼーション緩衝液に置く。アンチセンスプローブを、 標準の³²Ｐ方法により末端ラベルする（Sambrookなど、Molecular Cloning:A La boratory Manual ，Vol．II，Cold Spring Harbor，NY，Cold Spring Harbor Lab oratory Press，8.3，1989）。RTでの緊縮洗浄を、５×SSC ／ 0.1％ SDS（30分 間、２度）、次に１×SSC ／ 0.1％ SDS（30分、２度）において行なう。フィル ターを空気乾燥せしめ、そしてKodak XAR5フィルム上に−80℃で２〜４時間オー トラジオグラ フ処理する。 現場 PCR 特定 DNAを局在化するための現場 PCR技法を、Nuovo(PCR現場ハイブリダイゼ ーション、Nuove，GJ，ed．PCR In Situ Hybridization: Protocols and Applic ations，New York，Raven Press，157，1992a)により記載されるような３段階プ ロトコールにより行なう。組織断片をワックス除去した後、タンパク質消化を行 ない、細胞中への試薬の浸入を促進する。第２段階は、PCR生成物の同時ラベリ ングを伴っての PCR自体から成り、続きて第３段階においては、ラベルされた生 成物が可視化される。RNA検出のための現場増幅技法は、類似するプロトコール を用いる。しかしながら、それは２つの追加の段階を組込んでいる。プロティナ ーゼ消化の後、組織をRNアーゼフリーDNアーゼに暴露し、ゲノムDNAの増幅を回 避する。第２に、残るmRNAを逆転写し、cDNA鋳型を形成し、これを PCRにより増 幅する。現場 PCR技法の効率を最大にするために、それらのプロトコール段階の すべてを個々の実験のために最適化すべきである。逆転写及び PCR段階は、加熱 された洗浄モジュールを備えたOmni Slideサーモサイクラー（20−スライド能力 ）を用いて行なわれる(National Labnet; Woodbridge，NJ)。 プロテアーゼ消化 組織の固定化及び性質に依存して、標的核酸への試薬の接近性は変化すること ができる。最適の透過方法を同定するために、本発明者は、１〜100 μｇ／mlの プロティナーゼＫ(カタログP-0390、ロット 93H0603；Sigma)の濃度及びインキ ュベーション時間（５〜45分）により変更され得る酵素消化方法を分析した。 DNアーゼ消化 スライド当たり10ＵのDeoxyribonuclease I Amplification Grad e(カタログ 18068-015、ロットED2409; Gibro BRL，Gaithersburg, MD)を用いて 、製造業者の規格に従って、DNAを分解する。染色の性質に対する異なった消化 時間の影響を試験する。 逆転写 この段階のためには、Super Script Preamplification System(カタログ 1808 9-011、ロットEDT001; Gibco)が、製造業者の規格に従って使用される。要約す れば、断片をランダムプライマーを含む溶液に含浸し、パラフィンカバースリプ により被覆し、そしてターモサイクラーにおいて、70℃で10分間インキュベート する。カバースリップを取り除いた後、逆転写酵素(100Ｕ／断片)を含む他の溶 液を添加し、そして新しいパラフィン片により被覆する。次に、スライドを、RT で10分間、45℃で45分間、及び70℃で10分間、維持する。 PCR 現場 PCR実験の前、MgCl₂濃度、pH及びアニーリング濃度を包含する、PCR反応 のためのすべてのパラメーターを、標準 PCRにより最適化する。この時点で、PC R生成物をクローン化し、そして配列決定し、同一性を確かめる。生成物を pCRI Iベクター（カタログ2000-01; Invitrogen，San Diego，CA）中にクローン化し 、そしてdsDNA Cycle Sequencing Kit(カタログ81965A、ロットCAC108；Gibco) により配列決定する。単一バンドの生成のために好ましい条件の最適化が、組織 断片における異なった分子量の PCR生成物を区別することが不可能であるので、 考慮される。ゲノム DNAから PCR生成物を生成する可能性を評価するためには、 生成物サイズに基づいて鋳型源を区別するようイントロンを架橋するプライマー を企画することが重要である。 同調された“ホットスタート(hot start)”PCR（Nuovo，The ho t start polymerase chain reation，In Nuovo，GJ，ed．PCR In Situ Hybridiz ation Protocols and Applications，New York，Raven Press，63，1992b）を、 Taq中和抗体技法(Kelloggなど、Bio Techniques 6: 1134，1994)を用いて達成す る。Taq−ブロッキングモノクローナル抗体は、Clontech(Taq Startantibody; カタログ5400-1、ロット47656)から購入された。 本明細書に記載される分析のためには、次の PCR混合物を使用する： 2.5mMの MgCl₂、200μＭの dNTP2、100μＭのジゴキシゲニン−11−２′−デオキシウリ ジン−５′−三リン酸（カタログ 1558706、ロット13945241-12; Boehringer Ma nnheim，Indianapolis，IN）、１ng／μｌのプライマー、50mMの KCl、10mMのト リス−HCl、pH 8.3。溶液の80μｌアリコートを個々のスライドに適用し、そし て次に、個々のスライドをシラン化されたカバースリップにより被覆し、ラバー セメントにより密封し、そしてサーモサイクラーに配置する。標的物を15〜20サ イクル増幅し、パリパリした染色物を得る。DNA増幅の後、0.1×SSC により、そ れぞれ45℃で20分間、２回の洗浄を行ない、未結合ヌクレオチドを排除する。 ジゴキシゲニンの展開 ジゴキシゲニン−標識された PCR生成物の検出を、Boehringer Mannheimから のキット(カタログ 1210220、ロット14101420-13)により行なう。それは、アル カリホスファターゼに結合される抗−ジコキシゲニン抗体との２時間のインキュ ベーションを包含する。十分な上昇の後、適切な基質（ニトロブルーテトラゾリ ウム及び５−ブロモ−クロロ−３−インドリル−ホスフェート）を、暗青色沈殿 物に酵素的に転換する。着色は、顕微鏡下で調べられた。 最近、ポリビニルアルコールがアルカリホスファターゼ−ニトロブルテトラゾ リウム反応の強度を増強し、そして沈殿物の拡散を妨 げることが観察された(Barth and Ivarie，Bio Techniques 17: 324，1994; De Block and Debrouwer，Anal.Biochem ． 25: 86，1993)。この技法の利点を取る ために、抗−ジゴキシゲニン抗体の希釈度を１：2000に高め（製造業者により推 薦される通常の１：500 の代わりに）、相当のバックグラウンドの低下を得る。 対照 PCR技法は、汚染物を含むサンプルにおいて DNAの単一のコピーさえ増幅する その能力について良く知られている。従って、清潔な徹底した配慮に関する通常 の PCRのために推薦される用心、専用組のピペットの使用、及び増幅領域から離 れての PCR混合物の調製(Orrego，Organizing a laboratory for PCR work，Inn is MA，Gelfand DH，Sninsky JJ，White，TJ，eds．PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications，New York，Academic Press，447，1990)がまた、 現場 PCRのために適用できる。さらに、組織断片に関する研究は新規の関心、た とえば試薬の不均質適用、気泡、境界部の乾燥、及びサンプルの調製の間の核酸 の安定性に関する関心を付与する。 少なくとも３種のタイプの対照が、誤った陽性又はあやった陰性を回避するた めにあらゆる実験において推薦される。 陽性対照 同じ組のプライマーに対して前に陽性であるブロックからの断片が関与する。 これが、それらのプライマーを使用する最初である場合、他の技術（たとえば、 ノザン分析、標準の PCR、現場ハイブリダイゼーション）により決定されるよう な標的核酸の高い発現を有することが知られている十分に固定された組織又は細 胞系の断片が関与する。 陰性対照 逆転写及び／又はRNアーゼ処理の排除は、残る核又はミトコンドリア DNAの非 特異的増幅についての情報を生成するであろう。 陰性対照 PCR混合物におけるプライマーの排除は、次の内因性プライミングによる非特 異的染色を示すであろう： DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性（Kommin oth and Long，Virchows Arch［B］64: 67，1993）により、又はアポプトシス(G oldなど、J.Histo.Chem.Cytochem. 41: 1993)及び他の人工物、たとえば固有の アルカリホスファターゼ活性により生成される DNAフラグメント。 追加の対照は、転写／翻訳生成物間での存在する関係の確立から成る。これは 、現場 PCRによる核酸のための１つの断片、及びポリペプチドに対する特異的抗 体を有する一連の断片を染色することによって行なわれ得る。同じ細胞内でのmR NA及びそのタンパク質の同時局在化が観察の有効性を強化するであろう。 現場 PCR生成物の確認は、２種の手段により達成され得る：(ａ)DNAを抽出し （TRIzol試薬、カタログ5596UA、ロットDPU 201; Gibco）、そしてアガロース電 気泳動、及び適切な放射性プローブによるサザンブロットにより分析するために 、現場 PCRの後、ガラススライドの組織を削り取ることが可能である。この生成 物のクローニング及び配列決定はまた、変性された塩基を伴わないで生成物を得 るために、いくつかの追加の PCRサイクルの後にも可能である。（ｂ）生成物の 同一性を、増幅の後、³²Ｐ−ラベルされたプローブによる現場ハイブリダイゼー ションを行なうことによって試験される。この方法は、間接的な現場 PCRのため に通常使用される(Patters onなど、Science 260: 976，1994; Walter など、A nn NY Acad.Sci. 724: 404，1994) 例 15 hnRNP A2／B1の有意な後翻訳変性を同定するための方法は、少なくとも２種の 手段で行なわれ得る。前で記載した臭化シアン消化物フラグメントを、後翻訳活 性の特異的部位のために組織的に評価する。特異的後翻訳変性の部位でタンパク 質を攻撃する一連の特殊化された酵素を用いて、特定の変性の存在が、酵素的に 処理された臭化シアン−処理された消化物フラグメントと、元の臭化シアン−処 理された材料（酵素にゆだねられていない）とを比較することで示される。たと えば、ホスファターゼによる消化物の処理は、２Ｄ−ゲル電気泳動又は質量分光 計のいづれかにより酵素による処理の後、分子量の変化を現わす。それらは、後 翻訳変化の特徴化のための標準のアプローチである。 例 16 胎児肺における異種核リボヌクレオタンパク質(HnRNP) A2／B1の発現 胎児組織における免疫細胞化学及び現場ハイブリダイゼーションによるhnRNP A2／B1の発現を評価し、それらの分子が潜在的に、初期器官形成に関与している かどうかを決定した。これは、腫瘍胎児性抗原としてhnRNP A2／B1を確立し、そ してhnRNP A2／B1が癌形成及び胎児成長の工程において中心的な役割を演じてい る仮説についての追加の支持を付与する。評価された組織は、胚進化の種々の段 階からのマウス及びラット肺組織及び成熟したゲッ歯動物の肺組織からの複数の 断片を包含した。 断片（４μｍの厚さ）を、Vectabond(SP-1800; Vector Laboratories，Burlin game，CA)により被覆されたスライド上に固定し、ワックス除去し、そしてGibso n and Polakにより記載されるようにして、RNAプローブとのハイブリダイゼーシ ョンのために調製した。ヒト hnRNP遺伝子を含むプラスミド 72ORNPc1Aを用いて 、リボプロ ーブを生成した。要約すれば、その DNAフラグメントを pCRIIベクター（Invitr ogen）中にサブクローン化し、そして適切な制限酵素により線状化した。ラベル されたプローブを、ジゴキシゲニン−11−UTP（1277073; Boehringer，Barcelon a，Spain）及びＴ７（881767; Boehringer）又はT3 RNAポリメラーゼ(1031163; Boehringer)を用いて調製し、それぞれセンス及びアンチセンス RNA転写体を合 成した。ハイブリダイゼーション、個々の断片のために 0.5ng／mlのプローブを 含む15μｌの溶液を有する湿潤チャンバーにおいて46℃で20時間、行なった。緊 縮洗浄は、150ｍモル／ＬのNaCl、15ｍモル／Ｌのクエン酸ナトリウム、pH 7.0( SSC)及びドデシル硫酸ナトリウム(SDS)による次のような処理を包含した：２×S SC ／ 0.1％ SDSによる４回の洗浄、0.1×SSC ／ 0.1％ SDSによる46℃での２回 の洗浄、２×SSC による短いすすぎ、10μｇ／mlのRNアーゼを含む２×SSC にお ける37℃で15分間のインキュベーション、及び２×SSC での追加のすすぎ。 ジゴキシゲニンの可視化を、１：500 に希釈されたアルカリホスファターゼ(1 093274; Boehringer)に結合されたモノクローナル抗体により室温で２時間、行 なった。ニトロブルーテトラゾリウムクロリド(N-5514; Sigma)及び５−ブロモ −４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート(B-8503; Sigma)を、アルカリホ スファターゼのための基質として使用した。対照は、ハイブリダイゼーションの 前、プローブの使用及びRNアーゼによる断片の処理を包含した。 この分析の結果は、次の通りである。肺におけるhnRNP A2／B1発現は、胚進化 の10日目に主流気管支の間葉細胞で開始する。免疫反応性は、未分化上皮におけ る強い発現を伴って、13及び14日目で前記主流から進化する気管支に移動する。 図17ａ−17ｄは、胎児マウス肺における力学的な変化を示す。抗原の中心的発現 は制限され、 そしてその活性が16日目までに、周囲気道の未分化上皮において陽性になる。そ の結果、hnRNP A2／B1の発現のパターンが、ピークの器管進化活性に正確に対応 する時間の枠において中央から遠位に移動する肺進化の既知配列を映す。タイミ ング及び発現のこのパターンは、マウス、ラット及びヒト間で一致する。上記３ 種のすべてにおいて、正常な成熟肺におけるこのマーカーの発現は、著しく制限 された。タンパク質及びmRNAでの発現のパターン及び強さはまた、類似した。 hnRNP A2／B1発現の一時的及び空間的な相互関係は、胎児進化における成長調 節においてこの分子のための決定的な役割を高く示唆し、そしてhnRNP A2／B1が 癌の進化において重要な役割を演じる本発明者の仮説と一致する。 この研究のさらなる発見は、他の部位におけるhnRNP A2／B1の発現であった。 初期発現は、特に心臓の間葉において存在した。控えめな発現が脳、及び脊髄の 神経節において明白であった。進化の間に変調される他の上皮部位においてこの 抗原の広い表示が存在した。この結果は、hnRNP A2／B1が他のタイプの癌につい ての診断価値を有することを示唆する。 参考文献 １．Boring，C.，Squires，T.，Tong，T．and Montgomery，S.Cancer statist ics．Ca-A Cancer J．for Clinicians，44: 7-26，1994． ２．Saccomanno，G.，Saunders，R．and Klein，M.Cytology of the lung in reference to irritant，individual sensitivity and healing．Acta Cytol，1 4: 377-381，1970． ３．Frost，J.，Fontana，R．and Melamed，M.Early lung cancer detection: Summary and conclusions．Am.Res.Respir.Dis.，103: 565-570，1984． ４．Tockman，M.，Gupta，P.，Myers，J.，Frost，J.Baylin，S.，Gold，E.， Chase，A.，Wilkinson，P．and Mulshine，J.Sensitive and specific monoclon al antibody recognition of human lung cancer antigen on preserved sputum cell: A new approach to early lung cancer detection．J.Clin.Oncol.，6: 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observations in developing lung cancer． Diagnostic Cytopahtol 1993; 9(6): 615-22． 【手続補正書】 【提出日】１９９８年４月８日（１９９８．４．８） 【補正内容】 請求の範囲 １．hnRNP A2／B1又はhnRNP C2ではない約 34kDaの分子量を含んで成り、そし て正常細胞において発現される量に比較して、癌細胞及び前癌細胞において高い 量で発現される、精製され、かつ、単離された上皮タンパク質、そのペプチド又 は変異体。 ２．前記タンパク質、そのペプチド又は変異体が、下記配列： AARPHSIDGRVV （配列番号１） QEVQSSRSGRGG （配列番号２） REKEQFRKLFI （配列番号３） EKTKETVPLERKKRE （配列番号４） AARPSDGRVV （配列番号５）及び EREKEQFRKLFI （配列番号６） から成る群から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列を含んで成る、請求の 範囲第１項記載の精製され、かつ、単離された上皮タンパク質、そのペプチド又 は変異体。 ３．前記タンパク質、そのペプチド又は変異体が、少なくとも１つのヘテロ核 リボヌクレオチドタンパク質のアミノ酸配列の一部と実質的なアミノ酸配列ホモ ロジーを共有する、請求の範囲第１項記載の精製され、かつ、単離された上皮タ ンパク質、そのペプチド又は変異体。 ４．前記ヘテロ核リボヌクレオチドタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号７ 又は配列番号８の一部である、請求の範囲第３項記載の精製され、かつ、単離さ れた上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体。 ５．前記上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体が翻訳後修飾を含んで成る 、請求の範囲第１項記載の精製され、かつ、単離された上皮タンパク質、そのペ プチド又は変異体。 ６．前記翻訳後修飾が、芳香族アミノ酸の変更、アルギニンのメチル化、リジ ンのメチル化、ヒスチジンのメチル化、セリンのリン酸化、トレオニンのリン酸 化、ブロックされたＮ−末端又はグリコシル化を含んで成る、請求の範囲第５項 記載の精製され、かつ、単離された上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体。 ７．その発現が前癌又は癌の表示である、請求の範囲第１項記載の上皮タンパ ク質、そのペプチド又は変異体をコードする核酸配列を含んで成る、精製され、 かつ、単離された DNA又はその一部。 ８．前記核酸配列が、少なくとも１つのヘテロ核リボヌクレオチドタンパク質 をコードする核酸配列の一部と実質的な核酸配列ホモロジーを共有する、請求の 範囲第７項記載の精製され、かつ、単離された DNA。 ９．請求の範囲第７項記載の DNA又はその一部を含んで成る組換え発現ベクタ ー。 10．請求の範囲第９項記載の組換え発現ベクターにより形質転換された宿主生 物。 11．翻訳後修飾の領域内に存在する、請求の範囲第５項記載の上皮タンパク質 、そのペプチド又は変異体上に存在するエピトープに対して特異的に結合する、 単離された抗原−結合フラグメント。 12．前癌及び癌のための診断スクリーニング方法であって： （Ａ）哺乳類から得られた核酸配列と少なくとも１つの相補的核酸配列プロー ブとを、ハイブリダイゼーション生成物の形成を可能にする条件下で接触せしめ 、ここで前記相補的核酸配列プローブが癌及び前癌において高い量で発現される 上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体をコードする核酸配列又はの一部に対 して特異的にハイブリダイズし；そして （Ｂ）前記ハイブリダイゼーション生成物を検出し、ここで前記ハイブリダイ ゼーション生成物の存在が哺乳類における前癌又は癌の表示であり、そしてハイ ブリダイゼーション生成物の不在が哺乳類における前癌及び癌の不在の表示であ ることを含んで成る方法。 13．前記哺乳類から得られた核酸配列が、痰、気管支液、肺、肝臓、骨、乳房 、腎臓、卵巣、子宮、頭、首又は前立腺から単離される、請求の範囲第12項記載 の方法。 14．前記癌が、肺癌、肝臓癌、腎癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、頭部癌、首癌 又は骨髄腫である、請求の範囲第12項記載の方法。 15．前記癌が肺癌である、請求の範囲第14項記載の方法。 16．正常細胞において発現される量に比較して、癌及び前癌細胞において高い 量で発現される上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体をコードする遺伝子を 検出するために有用なキットであって、前記遺伝子のヌクレオチドのすべて又は 一部に対して十分に相補的であり、そして前記遺伝子と特異的にハイブリダイズ する、請求の範囲第15項記載の少なくとも１つの核酸プローブを含んで成るキッ ト。 17．生物学的サンプル中の翻訳後修飾された上皮タンパク質、そのペプチド又 は変異体の検出方法であって、ここで生物学的サンプル中の前記翻訳後修飾され た上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体の存在が前癌及び癌の表示であり、 （Ａ）前記翻訳後修飾された上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体を単離 し、そして （Ｂ）非修飾上皮タンパク質と比較して、翻訳後修飾を検出することを含んで 成る方法。 18．前記段階（Ａ）の方法が、二次元電気泳動又はHPLCである、請求の範囲第 17項記載の方法。 19．前記翻訳後修飾が抗体又は放射ラベルされたアミノ酸を用いて検出される 、請求の範囲第17項記載の方法。 20．前癌及び癌についての診断スクリーニング方法であって、 （Ａ）哺乳類から得られた核酸配列を、１よりも多くの相補的核酸配列プロー ブにより、増幅された生成物の形成をもたらす条件下で増幅し、ここで前記相補 的核酸配列プローブが癌及び前癌において高い量で発現される上皮タンパク質、 そのペプチド又は変異体をコードする核酸配列又はその一部に特異的にハイブリ ダイズし、そして （Ｂ）前記増幅された生成物を検出し、ここで前記生成物の存在が癌又は前癌 の表示であることを含んで成る方法。 21．前記増幅が PCR又はRT-PCRによるものである、請求の範囲第20項記載の方 法。 22．前記哺乳類から得られた核酸配列が DNA又はmRNAである、請求の範囲第20 項記載の方法。 23．前記方法が現場又はインビトロで行なわれる、請求の範囲第20項記載の方 法。 24．前記相補的核酸配列プローブが、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質をコー ドする少なくとも１つの核酸配列に対して実質的に相同である、請求の範囲第20 項記載の方法。 25．前記哺乳類から得られた核酸配列が、痰、気管支液、肺、肝臓、骨、乳房 、腎臓、卵巣、子宮、頭部、首又は前立腺由来である、請求の範囲第20項記載の 方法。 26．前記癌が、肺癌、腎癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、又は骨髄腫である、請 求の範囲第20項記載の方法。 27．哺乳類における癌又は前癌のコンピュータ支援診断方法であって： （Ａ）生物学的サンプルに対して像密度測定を行ない、 （Ｂ）既知の陽性及び陰性対照の光学密度に比較しての前記生物学的サンプル の光学密度に基づいて識別機能を処理し、そして （Ｃ）hnRNP mRNAと特異的にハイブリダイズすることができるプローブを用い る、 を含む方法。 28．前記光学密度が２種の異なった波長で決定される、請求の範囲第27項記載 の方法。 29．hnRNP mRNAと特異的にハイブリダイズすることができるラベルされたプロ ーブが、前記像密度測定を実施する前、前記生物学的サンプルに添加される、請 求の範囲第27項記載の方法。 30．哺乳類における癌又は前癌の診断方法であって： Ａ．生物学的サンプル中でhnRNP mRNAと特異的にハイブリダイズするラベルさ れたプローブを、その生物学的サンプルに添加し、 Ｂ．所定の波長で、生物学的サンプルからの画像の光学密度を得るために生物 学的サンプルを照射し、そして Ｃ．癌又は前癌について生物学的陽性を決定するために生物学的サンプルの光 学密度及び換算された光学密度測定値に基づいて識別機能を処理する、 を含む方法。 31．前記画像がデジタル画像プロセッサー内に記憶される、請求の範囲第30項 記載の方法。 32．前記段階（Ａ）が現場(in situ)ハイブリダイゼーション・アッセイであ る、請求の範囲第30項記載の方法。 33．前記の画像の光学密度が１よりも多くの所定の波長について得られる、請 求の範囲第30項記載の方法。 34．前記識別機能が、さらに、核表面差異モーメント及び核上皮フーリエ楕円 領域に基づいている、請求の範囲第30項記載の方法。 35．第１波長が約 600nmであり、そして第２波長が約 510nmである、請求の範 囲第33項記載の方法。 36．前記生物学的サンプルが細胞、抽出物又は組織である、請求の範囲第30項 記載の方法。 37．前記識別機能についての約ゼロ又はそれ以下の値が、癌又は前癌の表示で ある、請求の範囲第30項記載の方法。 38．前記識別機能が、下記式： Ｄ＝β₀＋β₁(光学密度₆₀₀)＋β₂(光学密度₅₁₀)＋β₃ （核表面差異）＋β₃(フーリエ調和での核楕円領域) 〔式中、β₀、β₁、β₂及びβ₃は、換算された光学密度測定値である。〕により 表わされる、請求の範囲第30項記載の方法。 39．前記フーリエ調和が約７〜約９の範囲内にある、請求の範囲第38項記載の 方法。 40．前記フーリエ調和が約９である、請求の範囲第38項記載の方法。 41．前記方法が個体における癌の進行を予測において、約80％以上の精度を提 供する、請求の範囲第30項記載の方法。 42．二重波長像密度測定法を用いてhnRNP mRNAを発現する細胞のコンピュータ ー支援検出方法であって： （Ａ）細胞内のhnRNP mRNAと特異的にハイブリダイズするラベルされたプロー ブを細胞に添加し、 （Ｂ）第１の所定の波長で細胞の第１のバックグラウンド−控除され、色相修 正された画像を得るために前記細胞を照射し、 （Ｃ）第２の所定の波長で細胞の第２のバックグラウンド−控除され、色相修 正された画像を得るために前記細胞を照射し、そして （Ｄ）hnRNP mRNAを発現する細胞を決定するために一セットの既知対照画像と 前記画像とを比較する、 を含む方法。 43．hnRNP mRNAと特異的にハイブリダイズすることができる配列を含んで成る ヌクレオチド・プローブ。 44．異型細胞を決定するための方法であって： （Ａ）細胞から光学画像を生成するための手段を用い、 （Ｂ）光学画像を得るための手段を用い、 （Ｃ）異型細胞に対してユニークな細胞パラメーターのための光学画像を分析 するための手段を用い、 （Ｄ）異型細胞の表示である識別機能を測定するための手段を用い、そして （Ｅ）hnRNP mRNAを検出するための手段を用いる、 を含む方法。 45．前記分析手段が光学密度及び形態計測を測定する、請求の範囲第44項記載 の方法。 46．前記分析手段が核表面差異モーメントを測定する、請求の範囲第44項記載 の方法。 47．前記分析手段が、高フーリエ調和で核フーリエ楕円領域を測定する、請求 の範囲第44項記載の方法。 48．前記光学密度が２種の異なった波長で分析される、請求の範囲第44項記載 の方法。 49．前記細胞が光学画像を生成する前、ラベルにより処理される、請求の範囲 第44項記載の方法。 50．前記ラベルがプローブに結合され、前記プローブが細胞内でhnRNP mRNAと 特異的にハイブリダイズすることができる、請求の範囲第49項記載の方法。 51．前記識別機能が、600nmでの光学密度、510nmでの光学密度、核表面差異及 び高フーリエ調和での核楕円領域から測定される、請求の範囲第44項記載の方法 。 52．前記異型細胞が癌細胞又は前癌細胞である、請求の範囲第44項記載の方法 。 53．正常細胞から異型細胞を区別するために識別機能を測定する方法であって ： （Ａ）hnRNP mRNAについて検出し、 （Ｂ）既知正常細胞及び既知異型細胞の光学画像を得て、 （Ｃ）多数の細胞特徴パラメーターを分析し、 （Ｄ）異型細胞にユニークなパラメーターを決定し、そして （Ｅ）異型細胞に対するユニークなパラメーターに基づいて識別機能を計算す る、 を含む方法。 54．前記光学画像が立体電子アレイである、請求の範囲第53項記載の方法。 55．前記画像が２種の異なった波長で得られる、請求の範囲第53項記載の方法 。 56．前記異型細胞にユニークなパラメーターが、核表面、核楕円領域、光学密 度、hnRNP mRNA及びそれらの組合せから成る群から選択される、請求の範囲第53 項記載の方法。 57．前記細胞が、hnRNP mRNAにより特異的にハイブリダイズされている、ラベ ルされたプローブにより処理される、請求の範囲第53項記載の方法。 58．前記既知の陰性細胞及び既知の異型細胞が、正常ヒト及び癌又は前癌を有 するヒトから採取された細胞の保管銀行からのものである、請求の範囲第53項記 載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｈ Ｕ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 マルシャイン，ジェームズ エル. アメリカ合衆国，メリーランド 20817, ベゼセダ，サバンナ ドライブ 7719 (72)発明者 トックマン，メルビン エス. アメリカ合衆国，メリーランド 21218, バルティモア，ケンプル ロード 202

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．約 34kDaの分子量を含んで成り、そして正常細胞において発現される量に 比較して、癌細胞及び前癌細胞において高い量で発現される、精製され、そして 単離された上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体。 ２．前記タンパク質、そのペプチド又は変異体が、下記配列： AARPHSIDGRVV （配列番号１） QEVQSSRSGRGG （配列番号２） REKEQFRKLFI （配列番号３） EKTKETVPLERKKRE （配列番号４） AARPSDGRVV （配列番号５）及び EREKEQFRKLFI （配列番号６） から成る群から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列を含んで成る請求の範 囲第１項記載の精製され、そして単離された上皮タンパク質、そのペプチド又は 変異体。 ３．前記タンパク質、そのペプチド又は変異体が、少なくとも１つの異種核リ ボヌクレオチドタンパク質のアミノ酸配列の一部と実質的なアミノ酸配列相同性 を共有する請求の範囲第１項記載の精製され、そして単離された上皮タンパク質 、そのペプチド又は変異体。 ４．前記異種核リボヌクレオチドタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号７又 は配列番号８である請求の範囲第３項記載の精製され、そして単離された上皮タ ンパク質、そのペプチド又は変異体。 ５．前記上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体が後−翻訳修飾を含んで成 る請求の範囲第１項記載の精製され、そして単離された上皮タンパク質、そのペ プチド又は変異体。 ６．前記後−翻訳修飾が、芳香族アミノ酸の変更、アルギニンのメチル化、リ シンのメチル化、ヒスチジンのメチル化、セリンのリン酸化、トレオニンのリン 酸化、ブロックされたＮ−末端又はグリコシル化を含んで成る請求の範囲第５項 記載の精製され、そして単離された上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体。 ７．その発現が前癌又は癌の表示である、請求の範囲第１項記載の上皮タンパ ク質、そのペプチド又は変異体をコードする核酸配列を含んで成る、精製され、 そして単離された DNA又はそのタンパク質。 ８．前記核酸配列が、少なくとも１つの異種核リボヌクレオチドタンパク質を コードする核酸配列の一部と実質的な核酸配列を共有する請求の範囲第７項記載 の精製され、そして単離された DNA。 ９．請求の範囲第７項記載の DNA又はその一部を含んで成る組換え発現ベクタ ー。 10．請求の範囲第９項記載の組換え発現ベクターにより形質転換された宿主生 物。 11．後−翻訳修飾の領域に存在する、請求の範囲第５項記載の上皮タンパク質 、そのペプチド又は変異体上に存在するエピトープに対して特異的に結合する、 単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。 12．前癌及び癌のための診断スクリーンであって、 （Ａ）哺乳類から得られた核酸配列と少なくとも１つの相補的核酸配列プロー ブとを、ハイブリダイゼーション生成物の形成を可能にする条件下で接触せしめ 、ここで前記相補的核酸配列プローブが癌及び前癌において高い量で発現される 上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体をコードする核酸配列又はの一部に対 して特異的にハイブリダイズし；そして （Ｂ）前記ハイブリダイゼーション生成物を検出し、ここで前記ハイブリダイ ゼーション生成物の存在が哺乳類における前癌又は癌の表示であり、そしてハイ ブリダイゼーション生成物の不在が哺乳類における前癌及び癌の不在の表示であ ることを含んで成る診断スクリーン。 13．前記哺乳類から得られた核酸配列が、痰、気管支流体、肺、肝臓、骨、乳 房、腎臓、卵巣、子宮、頭、首又は前立腺から単離される請求の範囲第12項記載 の診断スクリーン。 14．前記癌が、肺癌、肝臓癌、腎癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、頭部癌、首癌 又は骨髄腫である請求の範囲第12項記載の診断スクーン。 15．請求の範囲第12項記載の方法への使用のための核酸配列プローブ。 16．正常細胞において発現される量に比較して、癌及び前癌細胞において高い 量で発現される上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体をコードする遺伝子を 検出するための有用なキットであって、前記遺伝子のヌクレオチドのすべて又は 一部に対して十分に相補的であり、そして前記遺伝子と特異的にハイブリダイズ する、請求の範囲第15項記載の少なくとも１つの核酸プローブを含んで成るキッ ト。 17．生物学的サンプルにおける後−翻訳的に修飾された上皮タンパク質、その ペプチド又は変異体の検出方法であって、ここで生物学的サンプルにおける前記 後−翻訳的に修飾された上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体の存在が前癌 及び癌の表示であり、 （Ａ）前記後−翻訳的に修飾された上皮タンパク質、そのペプチド又は変異体 を単離し、そして （Ｂ）非修飾上皮タンパク質と比較して、後−翻訳修飾を検出す ることを含んで成る方法。 18．前記段階（Ａ）の方法が、二次元電気泳動又はHPLCである請求の範囲第17 項記載の方法。 19．前記後−翻訳修飾が抗体又は放射性ラベルされたアミノ酸を用いて検出さ れる請求の範囲第17項記載の方法。 20．前癌及び癌についての診断スクリーンであって、 （Ａ）哺乳類から得られた核酸配列を、１よりも多くの相補的核酸配列プロー ブにより、増幅された生成物の形成をもたらす条件下で増幅し、ここで前記相補 的核酸配列プローブが癌及び前癌において高い量で発現される上皮タンパク質、 そのペプチド又は変異体をコードする核酸配列又はその一部に特異的にハイブリ ダイズし、そして （Ｂ）前記増幅された生成物を検出し、ここで前記生成物の存在が癌又は前癌 の表示であることを含んで成る診断スクリーン。 21．前記増幅が PCR又はRT-PCRによるものである請求の範囲第20項記載の方法 。 22．前記哺乳類から得られた核酸配列が DNA又はmRNAである請求の範囲第20項 記載の方法。 23．前記方法が現場又はインビトロで行なわれる請求の範囲第20項記載の方法 。 24．前記相補的核酸配列プローブが、異種核リボヌクレオタンパク質をコード する少なくとも１つの核酸配列に対して実質的に相同である請求の範囲第20項記 載の方法。 25．前記哺乳類から得られた核酸配列が、痰、気管支流体、肺、肝臓、骨、乳 房、腎臓、卵巣、子宮、頭部、首又は前立腺からである請求の範囲第20項記載の 方法。 26．前記癌が、肺癌、腎癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、又は骨髄 腫である請求の範囲第20項記載の方法。 27．哺乳類における癌又は前癌のコンピュータ助力診断方法であって、 （Ａ）生物学的サンプルに対して像密度測定を行ない、そして （Ｂ）既知の陽性及び陰性対照の光学密度に比較しての前記生物学的サンプル の光学密度に基づいて識別機能を処理することを含んで成る方法。 28．前記光学密度が２種の異なった波長で決定される請求の範囲第27項記載の 方法。 29．hnRNP mRNAと特異的にハイブリダイズすることができるラベルされたプロ ーブが、前記像密度測定を実施する前、前記生物学的サンプルに添加される請求 の範囲第27項記載の方法。 30．哺乳類における癌又は前癌の診断方法であって、 Ａ．生物学的サンプルにおいてhnRNP mRNAと特異的にハイブリダイズするラベ ルされたプローブを、生物学的サンプルに添加し、 Ｂ．予定された波長で、生物学的サンプルからの像の光学密度を得るために生 物学的サンプルを照射し、そして Ｃ．癌又は前癌についての生物学的陽性を決定するために生物学的サンプルの 光学密度及び検量された光学密度測定値に基づいて識別機能を処理することを含 んで成る方法。 31．前記像がデジタル像プロセッサーに記憶される請求の範囲第30項記載の方 法。 32．前記段階（Ａ）が現場ハイブリダイゼーションアッセイである請求の範囲 第30項記載の方法。 33．前記像の光学密度が１以上の予定された波長に対して得られる請求の範囲 第30項記載の方法。 34．前記識別機能がさらに、核表面差異モーメント及び核上皮フ ーリエ楕円領域に基づいている請求の範囲第30項記載の方法。 35．第１波長が約 600nmであり、そして第２波長が約 510nmである請求の範囲 第33項記載の方法。 36．前記生物学的サンプルが細胞、抽出物又は組織である請求の範囲第30項記 載の方法。 37．前記識別機能についての約ゼロ又はそれ以下の値が、癌又は前癌の表示で ある請求の範囲第30項記載の方法。 38．前記識別機能が、下記式： Ｄ＝β₀＋β₁(光学密度₆₀₀)＋β₂(光学密度₅₁₀)＋β₃ （核表面差異）＋β₃(フーリエ調和での核楕円領域) 〔式中、β₀，β₁，β₂及びβ₃は、検量された光学密度測定値である〕により表 わされる請求の範囲第30項記載の方法。 39．前記フーリエ調和が約７〜約９の範囲で存在する請求の範囲第38項記載の 方法。 40．前記フーリエ調和が約９である請求の範囲第38項記載の方法。 41．前記方法が個人における癌の進行を予測することにおいて、約80％以上の 精度を提供する請求の範囲第30項記載の方法。 42．二重波長像密度測定法を用いてhnRNP mRNAを発現する細胞のコンピュータ ー助力検出方法であって、 （Ａ）細胞におけるhnRNP mRNAと特異的にハイブリダイズするラベルされたプ ローブを細胞に添加し、 （Ｂ）第１の予定された波長で細胞の第１のバックグラウンド−控除され、色 相修正された像を得るために細胞を照射し、 （Ｃ）第２の予定された波長で細胞の第２のバックグラウンド−控除され、色 相修正された像を得るために細胞を照射し、そして （Ｄ）hnRNP mRNAを発現する細胞を決定するために一組の既知対 照像と前記像とを比較することを含んで成る方法。 43．hnRNP又は RNAと特異的にハイブリダイズすることができる配列を含んで 成るヌクレオチドプローブ。 44．異型細胞を決定するための方法であって、 （Ａ）細胞から光学像を生成するための手段、 （Ｂ）光学像を得るための手段、 （Ｃ）異型細胞に対してユニークな細胞パラメーターのための光学像を分析す るための手段、及び （Ｄ）異型細胞の表示である識別機能を決定するための手段を含んで成る方法 。 45．前記分析手段が光学密度及び形態計測を決定する請求の範囲第44項記載の 方法。 46．前記分析手段が核表面差異モーメントを決定する請求の範囲第44項記載の 方法。 47．前記分析手段が、高いフーリエ調和で核フーリエ楕円領域を測定する請求 の範囲第44項記載の方法。 48．前記光学密度が２種の異なった波長で分析される請求の範囲第44項記載の 方法。 49．前記細胞が光学像を生成する前、ラベルにより処理される請求の範囲第44 項記載の方法。 50．前記ラベルがプローブに結合され、前記プローブが細胞内でhnRNP mRNAと 特異的にハイブリダイズすることができる請求の範囲第49項記載の方法。 51．前記識別機能が、600nmでの光学密度、510nmでの光学密度、高いフーリエ 調和での核表面差異及び核楕円領域から決定される請求の範囲第44項記載の方法 。 52．前記異型細胞が癌細胞又は前癌細胞である請求の範囲第44項 記載の方法。 53．正常細胞から異型細胞を区別するために識別機能を決定するための方法で あって、 （Ａ）既知正常細胞及び既知異型細胞の光学像を獲得し、 （Ｂ）多数の細胞特徴パラメーターを分析し、 （Ｃ）異型細胞に対してユニークなパラメーターを決定し、そして （Ｄ）異型細胞に対してユニークなパラメーターに基づいて識別機能を計算す ることを含んで成る方法。 54．前記光学像が立体電子アレイである請求の範囲第53項記載の方法。 55．前記像が２種の異なった波長で得られる請求の範囲第53項記載の方法。 56．前記異型細胞に対してユニークなパラメーターが、核表面、核楕円領域、 光学密度、hnRNP mRNA及びそれらの組合せから成る群から選択される請求の範囲 第53項記載の方法。 57．前記細胞が、hnRNP mRNAにより特異的にハイブリダイズされている、ラベ ルされたプローブにより処理される請求の範囲第53項記載の方法。 58．前記既知の陰性細胞及び既知の異型細胞が、正常ヒト及び癌又は前癌を有 するヒトから採取された細胞の保管銀行からのものである請求の範囲第53項記載 の方法。 59．請求の範囲第12項記載の方法への使用のために適切なラベルされた核酸配 列プローブ。 60．hnRNP又は RNAと特異的にハイブリダイズすることができる配列を含んで 成る請求の範囲第59項記載のラベルされたヌクレオチドプローブ。 61．前記プローブがジゴキシゲニンによりラベルされる請求の範囲第59又は60 項記載のプローブ。 62．前記ラベルされたプローブに対して相補的な核酸配列により複合体化され る請求の範囲第59又は60項記載のラベルされたプローブ。 63．前記ラベルされたプローブに対して相補的な核酸配列により使用される請 求の範囲第61項記載のラベルされたプローブ。 64．前記ラベルされたプローブに対して相補的な核酸配列により複合体化され 、そしてさらに、前記プローブ上のラベルに複合体化される抗体を含んで成る請 求の範囲第62項記載のラベルされたプローブ。 65．前記抗体が抗ジオキシゲニン抗体である請求の範囲第64項記載のラベルさ れたプローブ。 66．前記プローブに対して相補的な核酸配列により複合体化される請求の範囲 第12又は43項記載の核酸配列プローブ。 67．配列番号11又は配列番号18に供給される配列を有する請求の範囲第59，60 及び66項記載の核酸プローブ。