JP2002512602A

JP2002512602A - 増殖性疾患の診断および治療のためのｉａｐ類およびｎａｉｐの検出および調節

Info

Publication number: JP2002512602A
Application number: JP53132598A
Authority: JP
Inventors: ロバートコルネラック; アレクサンダーイー．マッケンジー; ピーターリストン; ステファンバード; ベンジャミントゥサン; クリスティンプラット
Original assignee: ユニバーシティーオブオタワ
Priority date: 1997-02-13
Filing date: 1998-02-13
Publication date: 2002-04-23
Also published as: EP1277836A1; US20090142334A1; EP0991421A2; WO1998035693A3; CA2273821A1; US20060189563A1; ES2182297T3; AU7074698A; WO1998035693A2; DE69807878D1; US6107041A; PT991421E; US20070203088A1; EP0991421B1; US20020120121A1; US6300492B1; US6133437A; ATE223727T1; CA2273821C; US7087584B2

Abstract

(57)【要約】癌（例えば、卵巣癌、乳癌およびリンパ腫）などの増殖性疾患の検出および治療のための診断的および予後判定的な方法およびキットについて開示する。IAPおよびNAIPアンチセンス核酸分子、IAPおよびNAIPポリペプチドと特異的に結合する抗体、ならびにIAPおよびNAIPポリペプチドの生物活性を低下させる化合物を用いる、増殖性疾患の治療のための治療法（およびこのような治療法を同定するための方法）も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】増殖性疾患の診断および治療のためのIAP類およびNAIPの検出および調節発明の背景本発明は増殖性疾患、特に癌の診断および治療に関する。細胞が死滅する機序の一つはアポトーシスまたはプログラム細胞死と呼ばれている。アポトーシスはしばしば健康な組織の発生および維持の正常な一部として生じ、胚発生において極めて重要な役割を果たすことが現在知られている。正常なアポトーシス反応の障害は、癌；エリテマトーデスおよび多発性硬化症などの自己免疫疾患；ならびにヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルスを含むウイルス感染症の発症に関与するとみられている。現在までに同定された数多くの増殖促進遺伝子（100種を超える）と比べ、これまでに単離されたアポトーシスを調節する遺伝子の数は比較的少ない。バキュロウイルスは、昆虫細胞がバキュロウイルスに感染した場合に、通常なら起こるはずのアポトーシスを抑制することからアポトーシス蛋白質抑制因子（IAP）と呼ばれている蛋白質をコードする。バキュロウイルスのIAP遺伝子は、DNA結合に直接関与すると推定されているリングジンクフィンガー様モチーフ（RZF）、およびBIRドメインと呼ばれる70アミノ酸反復モチーフ（バキュロウイルスIAP反復配列）からなる2つのN末端ドメインをコードする配列を含む。哺乳動物のIAPファミリーのメンバー、およびこれに関連した抗アポトーシス性ポリペプチドであるNAIPが、最近同定されている。正常な細胞種および癌性の細胞種はいずれも、アポトーシス誘発因子に対して広範囲の感受性を示す。多くの正常な細胞種は亜致死線量の放射線または細胞傷害性化学物質に反応して一時的な増殖停止を生じるが、その近傍の癌細胞はアポトーシスを起こす。このことは、首尾よい抗癌療法を可能とする適切な毒性が得られる極めて重要な治療「窓（window）」をもたらす。このため、癌治療が失敗に終わる重要なカテゴリーとして、腫瘤細胞のアポトーシスへの耐性が新たに浮上しつつあることは驚くには当たらない。この耐性を克服または防止する化合物の発見により、癌の治療法は大きく改善されると思われる。発明の概要本発明者らは、IAPおよびNAIPの過剰発現が、卵巣癌、腺癌、リンパ腫および膵癌を含む広範な種類の癌と明確に相関していることを見いだした。核内の断片化IAPポリペプチドの存在、およびp53変異の存在下でのIAPポリペプチドの過剰発現は、癌の診断、予後不良、および多くの癌化学療法薬に対する耐性と相関する。さらに本発明者らは、IAPポリペプチドの生物活性を低下させる治療薬が、そのポリペプチドを発現している細胞（例えば、増殖性疾患において増殖している細胞）にアポトーシスを誘発させると考えられることを見いだした。これらの所見は、増殖性疾患の検出および治療のための診断および予後判定の方法を提供するとともに、増殖性疾患、特に癌の治療に有用な治療的化合物を提供する。第1の局面において、本発明は、増殖性疾患を有する哺乳動物からの細胞におけるアポトーシスを増強させるための方法であって、細胞へのIAPポリペプチドまたはNAIPポリペプチドの生物活性を抑制する化合物の投与を含み、その化合物が細胞におけるアポトーシスを増強するために十分な量で細胞へ投与される方法を特徴とする。本発明のこの局面の１つの態様において、細胞は増殖性疾患において増殖している。もう1つの態様において、生物活性はポリペプチドの発現レベル（例えば、細胞内に存在するポリペプチドの量を解析することによって測定される）、ポリペプチドをコードするmRNA分子の発現レベル、またはアポトーシス抑制活性である。本発明の第1の局面の種々の態様において、ポリペプチドはHIAP-1、m-HIAP-1 、HIAP-2、m-HIAP-2、XIAP、およびm-XIAPからなる群より選択される。その他の態様において、ポリペプチドはNAIP、XIAP、HIAP-1、またはHIAP-2である。その他の好ましい態様において、哺乳動物はヒトまたはマウスであり、増殖性疾患は癌、例えば卵巣、乳房、膵臓、リンパ節、皮膚、血液、肺、脳、腎臓、肝臓、鼻咽頭腔、甲状腺、中枢神経系、前立腺、結腸、直陽、子宮頸部、および子宮内膜からなる群より選択される組織の癌である。本発明の第1の局面の種々の好ましい態様において、化合物は、IAPもしくはNA IP依存性抗アポトーシス経路の負の調節因子；リングジンクフィンガーを含んでいて2つを上回る数のBIRドメインを持たないIAPポリペプチドの断片；IAPポリペプチドのリングジンクフィンガードメインをコードする核酸分子；IAPポリペプチドもしくはNAIPポリペプチドの切断を阻止する化合物；IAPポリペプチドもしくはNAIPポリペプチドと特異的に結合する精製抗体もしくはその断片；リボザイム；またはIAPポリペプチドもしくはNAIPポリペプチドをコードする核酸配列のコード鎖に相補的な核酸配列を有するアンチセンス核酸分子である。好ましくは、細胞内での切断が少なくとも20％減少しているか；抗体がIAPポリペプチドもしくはNAIPポリペプチドのBIRドメインと結合するか；IAPポリペプチドもしくは NAIPポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7、配列番号：9、配列番号：11、配列番号：13のヌクレオチド配列もしくは NAIPの核酸配列とが約50％もしくはそれ以上の同一性を有するか；アンチセンス核酸分子が細胞の細胞質内で測定されるIAPポリペプチドもしくはNAIPポリペプチドをコードする核酸配列のレベルを少なくとも20％低下させるか；アンチセンス核酸分子がウイルスベクターにコードされるか；またはアンチセンス核酸分子が導入遺伝子によってコードされる。第2の局面において、本発明は、(a)約18ヌクレオチド長を超えるIAPまたはNAI P核酸分子と、その疾患において増殖性であって組織由来の細胞である哺乳動物の細胞からの核酸調製物とを接触させる段階；および(b)対照と比較して該哺乳動物細胞由来の量が増加していることによって該哺乳動物が増殖性疾患を有するか、または発症する可能性が高いことが示されるような、該分子とハイブリダイズする哺乳動物細胞の核酸の量を測定する段階を含む、哺乳動物における増殖性疾患または増殖性疾患の可能性が高いことを検出するための方法を特徴とする。 1つの態様において、本方法はさらに(a)対照が第2の哺乳動物の組織由来の細胞であって、該第2の哺乳動物が増殖性疾患を持たないような、前記分子と対照由来の核酸調製物とを接触させる段階、および(b)該分子とハイブリダイズする哺乳動物細胞由来の核酸の量が対照由来の核酸の量と比較して増加していることによってその哺乳動物が増殖性疾患を有するか、または発症する可能性が高いことが示されるような、対照の核酸の量を測定する段階を含む。本発明の第2の局面の方法の1つの態様において、本方法はさらに(a)IAPまたは NAIP核酸分子のある領域と同一またはそれと相補的である配列を有する一対のオリゴヌクレオチドを提供する段階、(b)ポリメラーゼ連鎖反応を介した核酸増幅に適した条件下で該一対のオリゴヌクレオチドと核酸とを混合する段階、および(c )増幅された核酸またはその断片を単離する段階を含む。好ましくは、増幅は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（例えばRACE）を用いて行われる。本発明の第2の局面の1つの態様では、本方法により、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7、配列番号：9、配列番号：11、配列番号：13のヌクレオチド配列またはNAIPの核酸配列との同一性が約50％またはそれ以上であるヌクレオチド配列を有する核酸の測定が提供される。その他の態様では、本方法により、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7のヌクレオチド配列またはNAIPの核酸配列との同一性が約50％またはそれ以上であるヌクレオチド配列を有する核酸の測定が提供される。第3の局面において、本発明は、哺乳動物における増殖性疾患またはその疾患を発症する可能性が高いことを検出するための方法であって、哺乳動物の試料におけるIAPポリペプチドまたはNAIPポリペプチドの生物活性レベルの測定を含み、対照哺乳動物からの試料と比較してIAPポリペプチドまたはNAIPポリペプチドのレベルが増加していることにより、その哺乳動物が疾患を有するか、または疾患を発症する可能性が高いことが示される方法を特徴とする。種々の態様において、試料はその疾患において増殖性である哺乳動物由来の細胞であって組織由来である細胞を含み、対照哺乳動物からの試料は組織由来であって健常細胞からなる。もう1つの態様において、哺乳動物および対照哺乳動物は同一である。本発明の第3の局面の種々の態様において、生物活性はポリペプチドの発現レベル（例えば、細胞内に存在するポリペプチドの量を解析することによって測定される）であるか、生物活性はポリペプチドをコードするmRNA分子の発現レベルであるか、または生物活性はアポトーシス抑制活性である。もう1つの態様において、ポリペプチドはHIAP-1、m-HIAP-1、HIAP-2、m-HIAP-2、XIAPおよびm-XIAP からなる群より選択される。その他の態様において、ポリペプチドはNAIP、XIAP 、HIAP-1またはHIAP-2である。第4の局面において、本発明は、IAPポリペプチドまたはNAIPポリペプチドを過剰発現する細胞を候補化合物に曝露させることを含んでいて、ポリペプチドの生物活性レベルの低下によって増殖性疾患において増殖性である罹患細胞におけるアポトーシスを増強させる化合物の存在が示されるような、増殖性疾患において増殖性である罹患細胞におけるアポトーシスを増強させる化合物を同定するための方法を特徴とする。第5の局面において、本発明は、(a)IAPポリペプチドをコードする核酸分子またはNAIPポリペプチドをコードする核酸分子を含む細胞であって、その核酸分子が細胞内で発現される細胞を提供する段階、ならひに(b)細胞と候補化合物とを接触させ、細胞内のIAPポリペプチドまたはNAIPポリペプチドの生物活性レベルを観測する段階であって、候補化合物と接触していない細胞と比較して候補化合物と反応した細胞内でのIAPポリペプチドまたはNAIPポリペプチドの生物活性レベルが低下することによって増殖性疾患において増殖性である罹患細胞におけるアポトーシスを増強させる化合物の存在が示される段階を含む、増殖性疾患において増殖性である罹患細胞におけるアポトーシスを増強させる化合物を同定するための方法を特徴とする。好ましくは、細胞は増殖性疾患に関連したp53ポリペプチドをさらに発現する。本発明の第4および第5の局面の種々の態様において、生物活性はポリペプチドの発現レベル（例えば、細胞内に存在するポリペプチドの量を解析することによって測定される）であるか、生物活性はポリペプチドをコードするmRNA分子の発現レベルであるか、または生物活性はアポトーシス抑制活性である。もう1つの態様において、ポリペプチドはHIAP-1、m-HIAP-1、HIAP-2、m-HIAP-2、XIAPおよびm-XIAPからなる群より選択される。その他の態様において、ポリペプチドはNA IP、XIAPNHIAP-1またはHIAP-2である。第6の局面において、本発明は、(a)哺乳動物の組織から試料を単離する段階、および(b)試料におけるレベルの上昇が哺乳動物の予後が不良であることの指標となるような、対照試料と比較して試料のIAPポリペプチドまたはNAIPポリペプチドの生物活性レベルが上昇しているか否かを判定する段階を含む、増殖性疾患と診断された哺乳動物の予後判定のための方法を特徴とする。本発明のこの局面の種々の態様において、試料には増殖性疾患において増殖性である細胞が含まれ、対照試料は組織由来であって健常細胞からなり、試料および対照試料はその哺乳動物からのものである。好ましくは、試料は増殖性疾患に関連したp53ポリペプチドをさらに発現する細胞を含む。本発明の第6の局面の種々の態様において、生物活性はポリペプチドの発現レベル（例えば、細胞内に存在するポリペプチドの量を解析することによって測定される）であり、生物活性はポリペプチドをコードする・RNA分子の発現レベルであり、または生物活性はアポトーシス抑制活性である。もう1つの態様において、ポリペプチドはHIAP-1、m-HIAP-1、HIAP-2、m-HIAP-2、XIAPおよびm-XIAPからなる群より選択される。その他の態様において、ポリペプチドはNAIP、XIAP、 HIAP-1またはHIAP-2である。好ましい態様において、このレベルは試料中に存在する64kDa未満のIAPペプチドの量を測定することによって解析される。第7の局面において、本発明は、(a)哺乳動物から核画分を有する試料を単離する段階、および(b)試料の核画分中のIAPポリペプチドと特異的に結合する抗体またはNAIPポリペプチドと特異的に結合する抗体によって認識されるポリペプチドの量を、対照試料由来の量と対比させて測定する段階であって、該試料由来の量が増加していることによりその哺乳動物の予後が不良であることの指標となる段階を含む、増殖性疾患を有すると診断された哺乳動物の予後判定のための方法を特徴とする。本発明のこの局面の好ましい態様において、試料は哺乳動物の組織由来のものであり、試料には増殖性疾患において増殖性である細胞が含まれ、対照試料は組織由来であって健常細胞からなる。もう1つの態様において、試料および対照試料はその哺乳動物由来のものである。本発明の第7の局面の種々の態様において、生物活性はポリペプチドの発現レベル（例えば、細胞内に存在するポリペプチドの量を解析することによって測定される）であるか、生物活性はポリペプチドをコードするmRNA分子の発現レベルであるか、または生物活性はアポトーシス抑制活性である。もう1つの態様において、ポリペブチドはHIAP-1、m-HIAP-1、HIAP-2、m-HIAP-2、XIAPおよびm-XIAP からなる群より選択される。その他の態様において、ポリペプチドはNAIP、XIAP 、HIAP-1またはHIAP-2である。もう1つの態様において、この量は免疫学的方法によって測定される。第8の局面において、本発明は、(a)増殖性疾患において増殖性である細胞が含まれる、哺乳動物の組織由来の第1の試料におけるIAPまたはNAIPポリペプチドの量を測定する段階、(b)健常細胞からなる、組織由来の第２の試料におけるポリペプチドの量を測定する段階、(c)第2の試料におけるポリペプチドの量と対比させて第1の試料におけるポリペプチドの量の増加を検出する段階、ならびに(d)ポリペプチドの生物活性を低下させる化合物によって哺乳動物を治療する段階を含む、増殖性疾患を有することが診断された哺乳動物の治療のための方法を特徴とする。好ましくは、第1の試料および第2の試料はその哺乳動物由来のものである。本発明の第8の局面の種々の態様において、生物活性はポリペプチドの発現レベル（例えば、細胞内に存在するポリペプチドの量を解析することによって測定される）であるか、生物活性はポリペプチドをコードするmRNA分子の発現レベルであるか、または生物活性はアポトーシス抑制活性である。もう１つの態様において、ポリペプチドはHIAP-1、m-HIAP-1、HIAP-2、m-HIAP-2、XIAPおよびm-XIAP からなる群より選択される。その他の態様において、ポリペプチドはNAIP、XIAP 、HIAP-1またはHIAP-2である。第9の局面において、本発明は、アポトーシス増強のための医薬晶の製造を目的とする、IAPポリペプチドまたはNAIPポリペプチドの生物活性を低下させる化合物の使用を特徴とする。本発明の第9の局面の種々の態様において、生物活性はポリペプチドの発現レベル（例えば、細胞内に存在するポリペプチドの量を解析することによって測定される）であるか、生物活性はポリペプチドをコードするmRNA分子の発現レベルであるか、または生物活性はアポトーシス抑制活性である。もう１つの態様において、ポリペプチドはHIAP-1、m-HIAP-1、HIAP-2、m-HIAP-2、XIAPおよびm-XIAP からなる群より選択される。その他の態様において、ポリペプチドはNAIP、XIAP 、HIAP-1またはHIAP-2である。第10の局面において、本発明は、増殖性疾患の存在または増殖性疾患を発症する可能性が高いことに関して哺乳動物を診断するためのキットであって、IAPポリペプチドまたはNAIPポリペプチドをコードする核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むキットを特徴とする。本発明の第10の局面の種々の態様において、生物活性はポリペプチドの発現レベル（例えば、細胞内に存在するポリペプチドの量を解析することによって測定される）であるか、生物活性はポリペプチドをコードするmRNA分子の発現レベルであるか、または生物活性はアポトーシス抑制活性である。もう1つの態様において、ポリペプチドはHIAP-1、m-HIAP-1、HIAP-2、m-HIAP-2、XIAPおよびm-XIAP からなる群より選択される。その他の態様において、ポリペプチドはNAIP、XIAP 、HIAP-1またはHIAP-2である。第11の局面において、本発明は、IAPポリペプチドまたはNAIPポリペプチドの生物活性レベルが上昇しているトランスジェニック哺乳動物を特徴とする。本発明の第11の局面の種々の態様において、生物活性はポリペプチドの発現レベル（例えば、細胞内に存在するポリペプチドの量を解析することによって測定される）であるか、生物活性はポリペプチドをコードするmRNA分子の発現レベルであるか、または生物活性はアポトーシス抑制活性である。もう1つの態様において、ポリペプチドはHIAP-1、m-HIAP-1、HIAP-2、m-HIAP-2、XIAPおよびm-XIAP からなる群より選択される。その他の態様において、ポリペプチドはNAIP、XIAP 、HIAP-1またはHIAP-2である。「IAP遺伝子」とは、その他の細胞内または細胞外送達法によって提供された場合に細胞または組織においてアポトーシスを調節する（抑制する、または増強する）ことのできる、少なくとも1つのBIRドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子を意味する（例えば米国特許出願第08/511,485号、第08/576,965号、およびPCT/IB96/01022参照）。好ましい態様において、IAP遺伝子は、図1〜6 （配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11および配列番号:13）に示した少なくとも一つのIAPアミノ酸コード配列もしくはその一部とのヌクレオチド配列との同一性が約50％またはそれ以上である遺伝子であるか、またはリングジンクフィンガードメインを有する。好ましくは、同一性を評価する配列の領域は、少なくとも1つのBIRドメインおよびリングジンクフィンガードメインをコードする領域である。哺乳類IAP遺伝子は、任意の哺乳動物の供給源から単離されたヌクレオチド配列を含む。好ましくは、この哺乳動物はヒトである。「IAP遺伝子」という用語は、アポトーシスのインヒビターをコードする遺伝子ファミリーに属する任意の遺伝子を包含することを意味する。IAP遺伝子は、本明細書に記載するIAPのメンバー（すなわち、ヒトもしくはマウスのXIAP、H IAP-1もしくは HIAP-2からのBIRまたはリングジンクフィンガードメイン）の中の１つの保存領域の少なくとも1つとのアミノ酸配列の同一性が少なくとも20％、好ましくは少なくとも30％、最も好ましくは少なくとも50％であるポリペプチドをコードするものであってよい。IAP遺伝子ファミリーの代表的なメンバーには、無制限的にヒトおよびマウスのXIAP、HIAP-1およびHIAP-2の遺伝子が含まれる。「ウイルスベクター」とは、ウイルス感染細胞に核酸分子を送達することのできる機能的または弱毒化されたウイルスを意味する。好ましくは、ウイルスベクターは異種核酸分子を運べるように標準的な分子生物学の技法に従って遺伝子操作されたものである。ウイルスベクターには、アデノウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、およびワクシニアウイルスが非制限的に含まれる。「IAP蛋白質」または「IAPポリペプチド」とは、IAP遺伝子によってコードされるポリペプチドまたはその断片を意味する。「NAIP遺伝子」および「NAIPポリペプチド」とは、1996年1月19日に提出された英国特許第9601108.5号および1997年1月17日に提出されたPCT出願PCT／IB97／ 00142（英国特許第9601108.5号からの優先権を主張するもの）に記載された、NA IP遺伝子、それらの断片、およびその同一物によってコードされるポリペプチドを意味する。「BIRドメイン」とは、以下の共通配列のアミノ酸配列を有するドメインを意味する：Xaa1-Xaa1-Xaa1-Arg-Leu-Xaa1-Thr-Phe-Xaa1-Xaa1-Trp-Pro-Xaa2-Xaa1- Xaa1-Xaa2-Xaa2-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Leu-Ala-Xaa1-Ala-Gly-Phe-Tyr-Tyr-Xaa1 -Gly-Xaa1-Xaa1-Asp-Xaa1-Val-Xaa1-Cys-Phe-Xaa1-Cys-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xa a1-Xaa1-Trp-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Asp-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-His-Xaa1-Xaa1-Xa a1-Xaa1-Pro-Xaa1-Cys-Xaa1-Phe-Val、ここでXaa1は任意のアミノ酸であり、Xaa 2は任意のアミノ酸であっても欠失していてもよい（配列番号：2）。好ましくは、この配列は、本明細書でXIAP、HIAP-1またはHIAP-2に関して提供されるBIRドメインの１つと実質的に同一である。「リングジンクフィンガー」または「RZF」とは、以下の共通配列のアミノ酸配列を有するドメインを意味する：Glu-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa2-X aa 1-Xaa1-Xaa1-Cys-Lys-Xaa3-Cys-Met-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa3-Xaa1-Phe- Xaa1-Pro-Cys-Gly-His-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Cys-Xaa1-Xaa1-Cys-Ala-Xaa1-Xaa1-Xaa1 -Xaa1-Xaa1-Cys-Pro-Xaa1-Cys、ここでXaa1は任意のアミノ酸であり、Xaa2はGlu またはAsp、Xaa3はValまたはIleである（配列番号：1）。好ましくは、この配列は、本明細書中でヒトまたはマウスのXIAP、HIAP-1およびHIAP-2に関して提供されるRZFドメインと実質的に同一である。「アポトーシスを増強させる」とは、任意の細胞集団においてアポトーシスを起こす細胞の数を増やすことを意味する。好ましくは、細胞集団は、卵巣癌細胞、乳癌細胞、膵癌細胞、T細胞、神経細胞、線維芽細胞、または実験室環境で増殖することが知られている任意の他の細胞系を含む群から選択される。任意の解析法においてアポトーシス増強性化合物によって提供されるアポトーシス増強の程度はさまざまであると思われるが、当業者であれば、通常ならばIAPによって制限されるアポトーシスを増強させる化合物を同定しうるアポトーシスの程度に統計的に有意な変化を判定できることは理解されると思われる。好ましくは、「アポトーシスを増強させる」とは、アポトーシスを起こす細胞数の増加が少なくとも25％、より好ましくは増加が50％、最も好ましくは増加が少なくとも1倍(on e fold）である。好ましくは観測される試料は、通常はアポトーシスが十分に起こらない細胞（すなわち癌細胞）の試料である。「増殖性疾患」とは、不適切に高いレベルの細胞分裂、不適切に低いレベルのアポトーシス、もしくはその両方に起因する、またはそれを引き起こす疾患を意味する。例えば、リンパ腫、白血病、黒色腫、卵巣癌、乳癌、膵癌、および肺癌などの癌はすべて増殖性疾患の例である。新生物（すなわち、悪性または良性の別を問わない、あらゆる異常な細胞増殖）も、本発明の増殖性疾患である。「増殖性疾患において増殖性である細胞」とは、その異常な増殖が疾患の一因となっている細胞を意味する。好ましくは、この細胞は抗原PCNAを発現する。「ポリペプチド」とは、グリコシル化またはリン酸化などの翻訳後修飾の有無にかかわらず、２つ以上のアミノ酸からなるあらゆる鎖を意味する。「IAPまたはNAIPの生物活性」とは、NAIPまたはIAPポリペプチドによってインビボまたはインビトロで引き起こされることが知られる任意の活性を意味する。 IAPおよびNAIPポリペプチドの好ましい生物活性は本明細書に記載されているものであり、その細胞種に関して正常なポリペプチドの発現レベル、その細胞種に関して正常なmRNAの発現レベル、アポトーシスを阻止する能力、および切断される能力が非制限的に含まれる。「生物活性を低下させる化合物」とは、NAIPポリペプチドまたはIAPポリペプチドによってインビボまたはインビトロで引き起こされることが知られる任意の活性を低下させる化合物を意味する。好ましい化合物には、IAPまたはNAIPポリペプチドをコードする核酸分子のコード鎖に対して相補的なアンチセンス核酸分子；IAPまたはNAIPポリペプチドと特異的に結合する中和抗体などの抗体；およびIAPポリペプチドのリングジンクフィンガーを含むポリペプチド断片、2つを上回る数のBIRドメインを持たないポリペプチド断片、もしくはこれらのポリペプチド断片をコードする核酸分子などの、IAPまたはNAIPポリペプチドの負の調節因子が非制限的に含まれる。「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列または核酸配列との相同性が少なくとも50％、好ましくは85％、より好ましくは90％、最も好ましくは95％であるポリペプチドまたは核酸を意味する。ポリペプチドについては、比較する配列の長さが一般に、少なくとも16アミノ酸、好ましくは少なくとも20アミノ酸であり、より好ましくは少なくとも25アミノ酸であり、最も好ましくは35アミノ酸である。核酸については、比較する配列の長さが一般に、少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも60ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも75ヌクレオチドであり、最も好ましくは110ヌクレオチドである。配列の同一性は、典型的には配列解析ソフトウェアを用い、デフオルト設定のパラメータにした条件で測定される（例えば、Genetics Computer Group、Unive rsity of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison ，WI 53705のSequence Analysis Software Packageなど）。このソフトウェア・プログラムは、種々の置換、欠失、およびその他の修飾に関する相同性の程度を割り当てることにより、類似した配列を比較するものである。保存的置換には、一般に以下の各群内における置換が含まれる：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。「実質的に純粋なポリペプチド」とは、天然の状態で付随している成分から分離されたポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、天然の状態で伴っている蛋白質および天然の有機分子を除いた割合が重量にして少なくとも60 ％であれば実質的に純粋である。好ましくは、ポリペプチドは、重量にして少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも99％純粋なIAPポリペプチドである。実質的に純粋なIAPポリペプチドは、例えば、天然の供給源（例えば、線維芽細胞、神経細胞、またはリンパ球）からの抽出、IAP ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現、または蛋白質の化学合成によって得ることができる。純度は、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLC解析などの任意の適当な方法を用いて測定することができる。蛋白質は、天然の状態で付随している汚染物質から分離されている場合に、天然の状態で伴う成分を実質的に含まない。このため、化学的に合成された蛋白質、または天然に由来する細胞と異なる無細胞系において産生された蛋白質は、天然の状態で伴う成分を実質的に含まないと考えられる。したがって、実質的に純粋なポリペプチドには、真核生物に由来するが大腸菌またはその他の原核生物において合成されたものも含まれる。「実質的に純粋なDNA」とは、本発明のDNAが由来する生物体の天然のゲノムにおいて、その遺伝子の近傍に位置する遺伝子を含まないDNAを意味する。従って、この用語には、例えば、ベクター、自律複製性プラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれる組換えDNA、またはその他の配列から独立した分離分子（例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されたcDNAまたはゲノムもしくはcDNAの断片）として存在する組換えDNAが含まれる。また、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAもこれに含まれる。「形質転換細胞」とは、その内部（またはその前駆細胞の内部）に、組換えDN A技術の手段によって、（本明細書で用いるように）IAPポリペプチドをコードするDNA分子が導入された細胞を意味する。「導入遺伝子」とは、操作によって細胞内に挿入され、その細胞から発生する生物体のゲノムの一部となる、DNAのあらゆる断片を意味する。このような導入遺伝子には、トランスジェニック生物体に対して、部分的にまたは完全に異種由来（すなわち、外来性）である遺伝子が含まれてもよく、または生物体の内因性道伝子と相同な遺伝子を示していてもよい。「トランスジェニック」とは、操作によって細胞に挿入され、その細胞から発生する生物体のゲノムの一部となったDNA配列を含むあらゆる細胞を意味する。本明細書で用いるように、トランスジェニック生物体は一般にトランスジェニック哺乳動物（例えば、ラットまたはマウスなどの齧歯類）であり、DNA（導入遺伝子）は操作によって核ゲノム内に挿入される。「形質転換」とは、外来分子を細胞に導入するためのあらゆる方法を意味する。リポフェクション、リン酸カルシウム沈澱法、レトロウイルス投与、電気穿孔、および遺伝子銃による形質転換は、用いることができる教示例のごく一部である。例えば、遺伝子銃による形質転換は、高速で射出されたタングステンまたは金の粒子などの微小弾丸を用いて、細胞に外来分子を導入する方法である。このような高速射出法は、本来はヘリウム、圧縮空気、および火薬を原動力とする技術を無制限的に含む圧力性射出に由来する。遺伝子銃による形質転換は、細胞内小器官（例えば、ミトコンドリアおよび葉緑体）、細菌、酵母、真菌、藻類、動物組織、および培養細胞を無制限的に含む非常にさまざまな種類の細胞および完全な組織に対する形質転換またはトランスフェクションに適用することができる。「発現のための位置に置かれた」とは、DNA分子が、その配列の転写および翻訳を指向する（すなわち、例えばIAPポリペプチド、組換え蛋白質またはRNA分子の産生を促進するような）DNA配列と隣接した位置に置かれていることを意味する。「レポーター遺伝子」とは、その発現をアッセイすることができる遺伝子を意味する。このような遺伝子には、グルクロニダーゼ（GUS）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（CAT）およびβ-ガラクトシダーゼが無制限的に含まれる。「プロモーター」とは、転写を指向するのに十分な最小の配列を意味する。また、本発明では、細胞種特異的、組織特異的、または外来性の信号もしくは因子によって誘導可能である点で制御可能であるプロモーター依存的遺伝子発現を引き起こすために十分なそれらのプロモーター要素も含まれる。このような要素は、本来の遺伝子の5'もしくは3'領域に位置していてもよい。「機能的に結合した」とは、ある遺伝子と1つまたはそれ以上の調節配列とが、適当な分子が調節配列に結合した時に遺伝子発現が可能となるような様式で連結していることを意味する（例えば、転写活性化蛋白質は調節配列と結合している）。「保存領域」とは、IAPファミリーのメンバーの2つまたはそれ以上の間（例えば、ヒトHIAP-1、HIAP-2およびXIAPの間）でアミノ酸配列の同一性が少なくとも 30％、好ましくは50％、最も好ましくは70％であるような、6個またはそれ以上の連続したアミノ酸からなるあらゆる連続部分を意味する。好ましい保存領域の例は（枠で囲まれた、または明示された配列として）図5〜7ならびに表1および2 に示し、無制限的にBIRドメインおよびリングジンタフィンガードメインを含む。「検出可能な標識がなされた」とは、例えば、オリゴヌクレオチドプローブもしくはプライマー、遺伝子もしくはその断片、またはcDNA分子などの、ある分子の存在を示したり同定するためのあらゆる手段を意味する。分子に検出可能な標識をする方法は、当業者には周知であり、放射性標識（例えば、³²Pまたは³⁵Sなどの放射性同位元素を用いる）および非放射性標識（例えば、フルオレセイン標識などの化学発光標識）を無制限的に含む。本明細書で核酸に関して用いる「アンチセンス」とは、その長さとは無関係に、IAPまたはNAIPポリペプチドをコードする核酸分子（例えばゲノムDNA、cDNA、またはmRNA）のコード鎖領域に対して相補的な核酸配列を意味する。アンチセンス分子がそれに対して相補的である、IAPまたはNAIPポリペプチドをコードする核酸分子の領域は、コード領域内のある領域でも、コード領域の上流にある領域でも、コード領域の下流にある領域でも、またはイントロン内の領域でもよいが、この核酸分子はゲノムDNAである。好ましくは、このアンチセンス核酸は通常は十分なアポトーシスを起こさない細胞内に存在する際にアポトーシスを増強させる能力を持ち、および／または長さが8から25ヌクレオチドまでの間である。好ましくは、この増加は対照と比べて少なくとも10％、より好ましくは25％、最も好ましくは1倍（1-fold）またはそれ以上である。アンチセンス核酸分子が、アンチセンス化合物の効率を高めるためにアンチセンス設計の分野で知られた化学的修飾を有しうるーとは理解されると思われる。「精製抗体」とは、天然の状態で伴っている蛋白質および天然の有機分子を除いた割合が、重量にして少なくとも60％である抗体を意味する。好ましくは、この調製物は、重量にして少なくとも75％、より好ましくは90％、最も好ましくは少なくとも99％の抗体、例えばIAP特異的抗体である。精製抗体は、例えば、組換えによって産生された蛋白質または保存モチーフのペプチドおよび標準的手法を用いるアフィニティクロマトグラフィーによって得ることができる。「特異的に結合する」とは、ある蛋白質を認識して結合するが、蛋白質が通常含まれる試料、生物試料中のその他の分子は実質的に認識せず結合もしない抗体を意味する。本発明のその他の特徴および利点は、その好ましい態様に関する以下の詳細な説明、および請求の範囲から明らかになると思われる。図面の簡単な説明図1は、ヒトXIAPのcDNA配列（配列番号：3）およびXIAPポリペプチド配列（配列番号：4）である。図2は、ヒトHIAP-1のcDNA配列（配列番号：5）およびHIAP-1ポリペプチド配列（配列番号：6）である。図3は、ヒトHIAP-2のcDNA配列（配列番号：7）およびHIAP-2ポリペプチド配列（配列番号：8）である。図4は、マウスXIAP（「MIAP-3」または「m-XIAP」とも古われる）のcDNA配列（配列番号：9）およびコードされるマウスXIAPポリペプチド配列（配列番号：1 0）である。図5は、マウスHIAP-1（「MIAP-1」または「m-HIAP-1」とも言われる）のcDNA 配列（配列番号：11）およびコードされるマウスHIAP-1ポリペプチド配列（配列番号：12）である。図6は、マウスHIAP-2（「MIAP-2」または「m-HIAP-2」とも言われる）のcDNA 配列（配列番号：13）およびコードされるマウスHIAP-2ポリペプチド配列（配列番号：14）である。図７は、ヒト組織におけるヒトHIAP-1およびHIAP-2のmRNAの発現を示したノーザンブロットの写真である。図8は、ヒト組織におけるヒトHIAP-2のmRNAの発現を示したノーザンブロットの写真である。図9は、ヒト組織におけるヒトXIAPのmRNAの発現を示したノーザンブロットの写真である。図10A〜10Dは、XIAP、HIAP-1、HIAP-2、BCL-2、SMNおよび6-MYCによるアポトーシスの抑制を描いたグラフである。図11は、ラジ（Raji）、ラモス（Ramos）、EB-3、バーキットリンパ腫細胞、およびジヨーエ（Jiyoye）細胞、ならびに正常胎盤由来細胞から得たRNAからのH IAP-1特異的プライマーを用いて増幅したcDNA断片を含むアガロースゲルの写真である。図12は、ジャーカットおよび星状細胞腫細胞から抽出し、抗XIAP抗体を用いて染色した蛋白質を含むウェスタンブロットの写真である。一連のマーカー蛋白質の位置およびサイズを示した。図13は、実施例XIIに記載した処置に続いてジャーカット細胞から抽出した蛋白質を含むウェスタンブロットの写真である。ブロットは、ウサギポリクローナル抗XIAP抗体によって染色した。レーン1は陰性対照、レーン2は抗Fas抗体、レーン3は抗Fas抗体およびシクロヘキシミド、レーン4はTNF-α、レーン5はTNF-α およびシクロヘキシミドを示す。図14は、抗Fas抗体への曝露に続いてヒーラ（Hela）細胞から抽出した蛋白質を含むウェスタンブロットの写真である。ブロットは、ウサギポリクローナル抗 XIAP抗体によって染色した。レーン1は陰性対照、レーン2はシクロヘキシミド、レーン3は抗Fas抗体、レーン4は抗Fas抗体およびシクロヘキシミド、レーン5はT NF-α、レーン6はTNF-αおよびシクロヘキシミドを示す。図15Aおよび15Bは、ウサギポリクローナル抗XIAP抗体によって染色したウェスタンブロットの写真である。蛋白質は、抗Fas抗体への曝露の直後、1、2、3、5 、10および22時間後にヒーラ細胞（図15A）およびジャーカット細胞（図15B）から抽出した。図16Aおよび16Bは、抗CPP32抗体（図16A）またはウサギポリクローナル抗XIAP 抗体（図16B）によって染色したウェスタンブロットの写真である。蛋白質は、抗Fas抗体への曝露の直後、3時間後または7時間後にジャーカット細胞から抽出した。総蛋白のほかに細胞質および核抽出物も示した。図17は、インビトロXIAP切断アッセイの産物に対する電気泳動後のポリアクリルアミドゲルの写真である。図18および19は、p53変異を有する乳癌細胞系（レーン5〜7）における、それぞれHIAP-1およびHIAP-2 mRNAの濃度の上昇を示している。図の下部は対照を示す。図20は、シスプラチン感受性（右）および耐性（左）のヒト卵巣上皮癌細胞におけるDNA断片化に対するタキソールの効果を示している。図21は、感受性（右）および耐性（左）のあるヒト卵巣上皮癌細胞におけるDN A断片化に対するシスプラチンの効果を示している。図22は、シスプラチン感受性（右）および耐性（左）のヒト卵巣上皮癌細胞におけるXIAPおよびHIAP-2蛋白質濃度に対するタキソールの効果を示している。図23Aおよび23Bは、シスプラチン感受性（右）および耐性（左）のヒトＬ皮癌細胞におけるHIAP-2 mRNA濃度に対するタキソールおよびTGFβの影響を示している。図24Aおよび24Bは、シスプラチン感受性（OV2008）およびシスプラチン耐性（ C13）細胞におけるXIAP蛋白質発現（図24A）およびDNA断片化（図24B）に対する TGFβの効果を示している。図25は、卵巣上皮癌細胞の生存度および数に対するXIAPおよびHIAP-2のダウンレギュレーションの効果を示す一連の棒グラフである。上方の2つの図面では、全細胞集団に占める率として死細胞を示している。下方の2つの図面には、感染期間が終了した時点の全細胞数を示している。データは4回の実験の平均+/-SEM で表す。^**p＜0.01、^***p＜0.001（ベクター対照との比較による）。図26Aは、ベクターのみ（左）またはアデノウイルス性アンチセンスXIAP（右）によるアデノウイルス感染を60時間行った後のOV2008細胞における細胞全体の形態（位相差；黒い矢印は細胞剥離を示す）に対するXIAPのダウンレギュレーションの影響を示す一連の写真である。MOI＝5（1×；「a」および「b」）、倍率400 倍。図26Bは、ベクターのみ（「a」および「c」）またはアデノウイルス性アンチセンスXIAP（「b」および「d」）によるアデノウイルス感染を60時間行った後の OV2008細胞における核の形態（ヘキスト染色、白い矢印は核断片化を示す）に対するXIAPのダウンレギュレーションの影響を示す一連の写真（「a」から「d」）である。MOI＝5（1×；「a」および「b」）およびMOI＝10（2×；「c」および「 d」）、倍率400倍。図26Cは、非処理、ベクターのみによるアデノウイルス感染、またはアンチセンスXIAPによるアデノウイルス感染を60時間行った後のOV2008細胞におけるアポトーシスの程度に対するXIAPダウンレギュレーションの影響を示す棒グラフである。データは3回から4回の実験の平均+/-SEMである。MOI＝5（1×）およびM01＝ 10（2×）、^*p＜0.05、^**p＜0.01（ベクター対照との比較による）。図26Dは、非処理、ベクターのみによるアデノウイルス感染、またはアンチセンスXIAPによるアデノウイルス感染を60時間行った後のOV2008細胞におけるXIAP アンチセンスの効率的感染を示すウエスタンブロット解析の結果である。各レーンは左から右の順に以下の通りである：対照、ベクター（1×）、ベクター（2× ）、アンチセンスXIAP（1×）およびアンチセンスXIAP（2×）。MO1＝5（1×）およびMOI＝10（2×）。図26Eは、モレキュラーダイナミクスホスフォイメージャー（Molecular Dynam ics Phosphoimager）を用いたデンシトメトリー分析による、非処理、ベクターのみによるアデノウイルス感染、またはアンチセンスXIAPによるアデノウイルス感染を60時間行った後のOV2008細胞におけるXIAP蛋白質の含有量の変化を示す棒グラフである。データは3回から4回の実験の平均+/-SEMで表す。MOI＝5（1×）およびMOI＝10（2×）、^*p＜0.05、^**p＜0.01（ベクター対照との比較による）。図27Aは、ヘキスト染色を用いた倍率400倍でのシスプラチン感受性細胞（OV20 08；左側の２点の写真）およびシスプラチン耐性細胞（C13；右側の２点の写真）の核の形態に対するシスプラチン誘発性アポトーシス（0および30μMシスプラチン中で24時間培養）の効果を示す一連の写真であり、矢印は断片化された核を示している。図27Bは、シスプラチン処理を受けたOV2008およびC13細胞からの、電気泳動的に分掘されたアポトーシス性低分子量DNA断片が固定されたアガロースゲルを示す一組の写真である。図27Cは、0、10、20および30μMシスプラチン中での24時間の培養後のOV2008 およびC13細胞におけるアポトーシスに関する濃度反応試験の結果を示す折れ線グラフである。データは3回の実験の平均+/-SEMである。^**p＜0.01（対照との比較による）。図28Aは、0、10、20および30μMシスプラチンとの24時間の培養後のシスプラチン感受性（OV2008）およびシスプラチン耐性（C13）卵巣上皮癌細胞におけるX IAPおよびHIAP-2蛋白質発現の濃度依存的抑制を示す一連の代表的なウエスタンブロット解析の結果である。同量の可溶化蛋白質（個々の実験により、20〜60μ g／レーン）を、抗ヒトXIAPまたは抗HIAP-2抗体を用いるウエスタンブロット法によって分析した。図28Bは、シスプラチン処理（表記濃度にて24時間）を受けたOV2008細胞（上方の2点のグラフ）およびC13細胞（下方の2点のグラフ）に関する、モレキュラーダイナミクスホスフォイメージャー（Molecular Dynamics Phosphoimager）を用いたデンシトメトリー分析による、XIAP（左側の2点のグラフ）およびHIAP-2 （右側の2点のグラフ）蛋白質含有量の変化を示す一連の棒グラフである。データは3回の実験の平均+/-SEMである。^*p＜0.05、^**p＜0.01（対照との比較による）。図29Aは、30μMシスプラチンの存在下または非存在下で6、12または24時間培養した後のシスプラチン感受性（OV2008）およびシスプラチン耐性（C13）卵巣上皮癌細胞におけるXIAPおよびHIAP-2蛋白質発現の濃度依存的抑制を示す一連の代表的なウエスタンブロット解析の結果である。同量の可溶化蛋白質（個々の実験により、20〜60μg／レーン）を、抗ヒトXIAPまたは抗HIAP-2抗体を用いるウエスタンブロット法によって分析した。図29Bは、30μMシスプラチンの存在下または非存在下で6、12または24時間培養したOV2008細胞（白いバー）およびC13細胞（黒いバー）に関する、モレキュラーダイナミクスホスフォイメージャー（Molecular Dynamics Phosphoimager）を用いたデンシトメトリー分析による、XIAP（左側の2点のグラフ）およびHIAP-2 （右側の2点のグラフ）蛋白質含有量の変化を示す一連の棒グラフである。データは3回の実験の平均+/-SEMで表す。^*p＜0.05、^**p＜0.01（対照との比較による）。図30Aは、30μMシスプラチンの存在下または非存在下で数時間培養した後のシスプラチン感受性（A2780s）およびシスプラチン耐性（A2780cp）卵巣上皮癌細胞におけるXIAPおよびHIAP-2蛋白質発現の濃度依存的抑制を示す一連の代表的なウエスタンブロット解析の結果である。同量の可溶化蛋白質（個々の実験により、40〜60μg／レーン）を、抗ヒトXIAPまたは抗HIAP-2抗体を用いるウエスタンブロット法によって分析した。図30Bは、30μMシスプラチンの存在下（黒のバー）または非存在下（白のバー）で24時間培養したA2780s細胞（左）およびA2780cp細胞（右）に関する、モレキュラーダイナミクスホスフォイメージャー（Molecular Dynamics Phosphoimag er）を用いたデンシトメトリー分析による、XIAP（上のグラフ）およびHIAP-2（下のグラフ）蛋白質含有量の変化を示す一連の棒グラフである。データは3回の実験の平均+/-SEMで表す。^**p＜0.01（対照との比較による）。図31Aは、アデノウイルス性センスXIAP cDNAまたはベクターのみ（対照）による感染を48時間行った後のシスプラチン感受性OV2008細胞の核の形態に対するシスプラチン（30μM）のアポトーシス作用に対するXIAP過剰発現の効果を示す一組の写真である（「a」から「d」）。倍率400倍。「a」、ベクター（シスプラチンなし）；「b」、センスXIAP（シスプラチンなし）；「c」、ベクター＋シスプラチン処理；「d」、センスXIAP＋シスプラチン処理。図31Bは、アデノウイルス性センスXIAP cDNAまたはベクターのみ（対照）による感染から48時間後の30μMシスプラチン処理OV2008細胞のうちアポトーシスを起こしたものの全細胞集団に占める比率を示すグラフである。データは3回の実験の平均+/-SEMで表す。^*p＜0.05、^***p＜0.001（ベクター対照との比較による）、⁺⁺゛p＜0.01、⁺⁺⁺p＜0.001（ベクター＋シスプラチン群との比較による）。図31Cは、30μMシスプラチンでの処理または非処理におけるアデノウイルス性センスXIAP cDNAまたはベクターのみ（対照）による感染後のOV2008細胞におけるXIAP蛋白質含有量の変化を示す代表的なウエスタンブロット解析の結果である。各レーンは左から右の順に以下の通りである：対照、ベクター、ベクター＋シスプラチン、センスXIAP、およびセンスXIAP＋シスプラチン。図31Dは、モレキュラーダイナミクスホスフォイメージャー（Molecular Dynam ics Phosphoimager）を用いたデンシトメトリー分析による、30μMシスプラチンでの処理または非処理におけるアテノウイルス性センスXIAP cDNAまたはベクターのみ（対照）による感染後のOV2008細胞におけるXIAP蛋白質含有量の変化を示すグラフである。データは3回の実験の平均+/-SEMで表す。^*p＜0.05、^***p＜0.0 01（ベクター対照との比較による）、⁺⁺p＜0.01、⁺⁺⁺p＜0.001（ベクター＋シスプラチン群との比較による）。図32A〜32Dは、ヒト卵巣表面上皮腫瘍組織におけるアポトーシスのインサイチュー検出（TUNELを用いた）ならびにPCNA、XIAPおよびHIAP-2の免疫局在性を示す一連の写真である。図32Aはアポトーシス性細胞のインサイチューTUNEL反応の局在を示している。図32B、32Cおよび32DはそれぞれPCNA、XIAPおよびHIAP-2に対する免疫反応物を示している。図32A〜32Dのそれぞれにおいて円形および長方形の内部に示された腫瘍の領域はそれぞれTUNEL陽性およびTUNEL陰性であった。倍率は400倍である。詳細な説明本発明者らはこれまでに、アポトーシス抑制因子の新規フアミリーであるIAP およびほかの関連した抗アポトーシス性蛋白質であるNAIPを提供してきた。本明細書において本発明者らは、IAP類およびNAIPの調節不全が明らかな種類の癌の同定法を提供する。本発明者らの結果は極めて重要であり、癌の検出および効果的な治療に向けた診断法、予後判定法、治療法、および薬物スクリーニング法を提供する。癌のスクリーニング本発明者らはまず、市販のノーザンブロット手法を用いて、種々の健常組織および癌細胞系におけるIAPおよびNAIPの発現レベルを検討した。結腸直腸癌、リンパ腫、白血病および黒色腫細胞系を含む、驚くほど多くの多様な系統のガン細胞系において、XIAP、HIAP-1およびHIAP-2 mRNAの増加が認められた。これに対して、BCL-2 mRNAが増加していたのは1つの細胞系のみであった。この結果は癌におけるIAP類およびNAIPの重要性を裏づけるものであったが、ブロット上の個々の癌細胞系が癌の種類を代表するものであるか否かに関する疑問は残った。この結果を受け、本発明者らは、IAPおよびNAIPの調節不全の頻度を確かめるために、ノーザンブロットおよび定量的RT-PCR分析により、特定の種類の腫瘍の一連の癌細胞系のスクリーニングを行った。結果の概要は以下の通りである：バーキットリンパ腫本発明者らは、バーキットリンパ腫におけるIAPのアップレギュレーションの頻度およびその結果の両方を検討した。検討したバーキット細胞系の大多数において、HIAP-1およびHIAP-2値の上昇が認められた。さらに、HIAP-1の発現レベルが低かったバーキット細胞系も、エプスタイン・バーウイルス（EBV）感染により転写活性化される。乳房腺癌本調査では重要な観察がなされ、薬物耐性、p53の状況、ならびにHIAP-1およびHIAP-2の発現の間に相関が認められた。細胞系のうち4つは野生型p53を有していたが、3つはp53変異を有することが実証されており、これは抗癌剤アドリアマイシンに対する耐性と相関していた。重要なことは、相対的に薬剤耐性が高度であったこの3つの細胞系がHIAP-1およびHIAP-2 mRNA値の上昇も呈したことである。これらの結果は、p53がアポトーシスを制御する方式の1つがこれらの遺伝子の調節を介したものであることを示している。卵巣腺癌 mRNAのインサイチュー分析から、卵巣の発生生物学的過程におけるNAIPの役割が示唆された。いくつかの卵巣癌細胞系においてもHIAP-2およびXIAPmRNAの過剰発現が実証された。膵癌現在までに検討した膵癌細胞系のうち約25％が、HIAP-1およびHIAP-2 mRNAの増加を示した。一連の癌に関する概要現在までに検討した各種の癌細胞系のうち、かなりの割合がIAP値の上昇を示した。NAIP値の上昇も癌に関係するとみられている。本発明者らの結果は、HIAP -1およびHIAP-2が最も高頻度かつ劇的にアップレギュレートされる傾向にあることを示している。両方の遺伝子が外見上は協調的に調節されていることは、これらの蛋白質の正常組織での分布が極めて異なることを考えれば驚くべきことであった。本発明者らの観察結果は、HIAP-1およびHIAP-2が、リンパ腫および白血病で高頻度に再配列が起こる部位である染色体11q23上に縦列配列として存在するとの事実によって補強された。癌細胞系におけるIAPの転写調節本発明者らの実験により、p53の状況とHIAP-1およびHIAP-2の転写過剰発現との問に相関があることが実証された。このことから、特にp53が細胞の運命を支配する機序のほとんどが不明のままであるという事実を鑑みれば、アポトーシスを増強させるための重要な新たな方法が提供される。これまでに、野生型p53がB CL-2を負の方向にダウンレギュレートし、BCL-2のアンタゴニストであるBAXを正の方向にアップレギュレートすることが示されている。いくつかの癌細胞種においてp53変異は二重の影響を及ぼす。これはすなわち、BCL-2のアップレギュレーションおよびBAXのダウンレギュレーションであり、これらはいずれも抗アポトーシス性表現型の一因となる。本発明者らは特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは野生型p53がHIAP-1およびHIAP-2を転写的にも抑制すると考えている。野生型p53レベルの上昇を含むDNA損傷は、このために正常細胞におけるHIAP-1およびHIAP-2の減少をもたらし、アポトーシスをもたらす。このため、p53遺伝子における変異は、これらのIAP遺伝子の転写制御の喪失をもたらす。その結果、p53変異型の癌細胞は高レベルのHIAP-1およびHIAP-2を構成的に示し、細胞を抗癌療法に対して耐性にすると考えられる。p53／HIAP-1およびHIAP-2の相関は、他の一連の癌細胞系にも拡張しうると考えられる。トランスフェクション解析およびノーザンブロット解析を用いて、p53によるIAPの調節を直接示すことも可能である。したがって本発明者らは、p53変異（p53^*）を有する癌細胞ではIAPレベルが上昇しており、これが化学療法に対する反応性を乏しくすると予想している。IAP レベルの評価はp53^*変異の有無の評価よりも容易であると考えられるため、本発明者らの所見は癌の診断および予後判定における重要な改善をも提供する（下記参照）。トランスジェニックマウス本発明者らは、T細胞、B細胞およびニューロン特異的プロモーター構築物を含む、多数のIAPおよびNAIPトランスジェニックマウス用発現ベクターを作製した。生存可能なファウンダーマウスを同定し、これらの作製生物の大部分に関して、本発明者らは繁殖コロニーを作った。これらのマウスは、プロモーターが活動性である組織型の癌を生じやすい傾向があると考えられる。このため、このマウスは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性の検討のため、およびアポトーシス増強性の癌治療法のスクリーニングのための優れた資源となる。この目的にマウスを利用するために、標準的なマウス薬物スクリーニング用モデルおよび遺伝子送達の手順を用いてもよい。診断／予後判定用試薬臨床腫瘍医（clinical oncologist）が癌治療における適切な介入の程度を決定する際に用いうる診断および予後判定試験は比較的不足している。p53遺伝子の変異は現在も癌の生物学的評価における最も優れた予後判定指標の一つである。しかし、今日までに同定された異なる変異の数は極めて多く、変異は遺伝子全体に分散している。さらに、p53における多くの変異は蛋白質の不適切な安定化をもたらし、これはmRNAレベルよりもむしろ蛋白質のレベルでの検出を可能とする。蛋白質のトランス活性化／リプレッション活性を変化させる変異は、mRNAまたは蛋白質レベルのいずれにおいても必ずしも明瞭ではない。また他方において、IAPおよびNAIPの発現レベルがp53変異と相関するならば、それらはより意義のある予後判定情報を提供するとともに、どの患者がより積極的な治療を必要とし、またはどの患者が現時点で承認されている治療法では治療不能と考えられるかといった判定の助けになると思われる。後者に属する患者は、新たな癌治療薬、特にIAPレベルを低下させるか、または抗アポトーシス経路とは独立した様式で作用するものの臨床試験の理想的な候補者として同定されると思われる。このため、本発明は子後判定および診断のための少なくとも2つの解析法を提供する。半定量的RT-PCRに基づく解析法は、IAPおよび／もしくはNAIP遺伝子または蛋白質発現レベルの解析に用いることができる。または、蛋白質レベルの直接的測定のためにELISA（固相酵素免疫測定法）型解析にモノクローナル抗体を組み入れてもよい。治療的産物 IAPまたはNAIPに関連する治療法のためには、BCL-2およびRASアンチセンスの開発に利用された範例を用いうるが、RASアンチセンスとは異なり、変異のアコモデーションは必要でない。最も有用なものは、好ましくは核内のRNAの分解を増強することにより、アポトーシスを少なくとも10％増強させるアンチセンス構築物である。本明細書に記載されるアンチセンス方法に加えて、本発明は、IAP類またはNAI Pを負の方向に調節するリード化合物の同定に用いうる低分子スクリーニング解析を特徴とする。例えば、IAP過剰発現の存在下でアポトーシスを増強させる、またはIAPの生物活性レベルを低下させる化合物を検出することができ、それらは有用なガン治療薬である。本明細書中に記載される方法により、IAP遺伝子の発現またはポリペプチド活性を効果的に調節することが見いだされた分子は、標準的な癌動物モデルでさらに検討することができる。それらがインビボ状況でも首尾よく機能し続けるなら、それらは必要に応じてアポトーシスを抑制または増強するための治療薬として用いることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび断片の手法による癌化学療法薬耐性の操作本発明者らは、IAP類の過剰発現が、いずれも通常はアポトーシスを誘発する処置である、血清増殖因子の除去、腫瘤壊死因子α（TNF）およびメナジオンへの曝露に対する耐性を細胞に付与することを示してきた。本明細書において、本発明者らは、ドキソルビシン、アドリアマイシンおよびメトトレキセートなどの臨床的状況下で用いられるアポトーシス誘発因子を用いた、これらの研究の癌細胞系への拡張に関して説明する。本発明者らの知見は、アンチセンスRNA治療薬の設計にもつながっている。一連のセンスおよびアンチセンスアデノウイルス性 IAPおよびNAIP発現ベクター、ならびに対照1acZ遺伝子の作製により、アポトーシス反応に関する多くの細胞系の迅速スクリーニングが実施可能になっている。現在ではこれらの発現構築物を用いて薬物耐性の増強または薬物感受性の増強を示すことができる。さらに、アンチセンスアデノウイルス構築物が開発され、適当な細胞系の薬物耐性表現型の反転の検討に用いられている。本発明者らは、IAPまたはNAIPの過剰発現が明瞭であるか、または変化している腫瘍の種類を同定することを目的として癌細胞系の調査を行い、これらの結果を上記および以下の実施例の両方に記載している。本研究に伴い、本発明者らは、各IAPの種々の領域に対する一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。解析系、すなわちアデノウイルスベクター系で検討した後に、薬物感受性を高めるために、これらのオリゴヌクレオチドならびにNAIPの種々の領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてもよい。試験における段階としてアンチセンスIAPおよびNAIPオリゴヌクレオチドの有効性を動物モデルを用いて検討することもでき、このための適切なトランスジェニック哺乳動物は上記に記載されており、当技術分野において一般的に入手可能でもある。以下では用いうるいくつかの試験系について説明する。抗-遺伝子療法治療的構築物のためのオリゴヌクレオチド移入到達系としては、アポトーシスを増強する必要のある細胞（例えば乳癌細胞および卵巣癌細胞）に対する親和性を有する、レトロウイルスベタター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、またはその他のウイルスベクターを用いることができる。または、標準的非ウイルス性送達方法を用いることもできる。ウイルス送達に使用することができる多数のベクターは公知である（MillerA.D.，Human Gene T herapy 1:5-14，1990;Friedman,T.，Science 244:1275-1281，1989;EglitisおよびAnderson，BioTechniques 6:608-614，1988;TolstoshevおよびAnderson，Curr ．Opin．Biotech．1;55-61，1990;Cornettaら、Prog．Nucl．Acid Res．and Mol ．Biol．36:311-322，1987;Anderson,W.F.，Science 22−:401-409，1984;Moen, R.C.，Blood Cells 17:407-416，1991;Millerら、Biotechniques 7:980-990，19 89;Le Gai La Salleら、Science 259:988-990，1993;およびJohnson，C hest 107:77S-83S，1995）。レトロウイルスベクターは特に開発が進んでおり、臨床の場でも使用されている（Rosenbergら、New Engl．J．Med．323:570-578，1990;Andersonら、米国特許第5,399,346号）。そのままではアポトーシスを起こすと予想される細胞内に治療的核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）を導入するために、非ウイルス的手法を用いることもできる。例えば、リポフェクション（Felgnerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7413-7417，1987;Onoら、Neurosci．Lett．117:259-263，1990;Brighamら、A m．J．Med．Sci．298:278-281，1989;Staubingerら、Meth．Enz．101:512-527， 1983）、アシアロソヌコイド-ポリリジン抱合（Wuら、J．Biol．Chem．263:1462 1-14624，1988;Wuら、J．Biol．Chem．264:16985-16987，1989）、塩類溶液としての直接的送達、または、好ましさは落ちるが、外科的状況下におけるマイクロインジェクション（Wolffら、Science 247:1465-1468，1990）によって、神経細胞またはT細胞にIAPを導入することもできる。上記の適用方法のいずれについても、治療的な核酸構築物は、好ましくはアポトーシス事象が必要とされる部位に対して適用される（例えば注入による）。しかし、アポトーシス事象が予想される部位の近傍の組織、アポトーシスを増強する必要があると予想される細胞に供給される血管に対して、または経口的にそれを適用してもよい。上記の構築物において、核酸の発現は任意の適したプロモーターによって指向させることができ（例えば、ヒト・サイトメガロウイルス（CMV）、シミアンウイルス40（SV40）またはメタロチオネインのプロモーター）、任意の適切な哺乳類調節要素によって調節することができる。例えば、必要であれば、直接的に発現させるために、卵巣細胞、乳房組織、神経細胞、T細胞またはB細胞における遺伝子発現を優先的に指向することが知られているエンハンサーを用いてもよい。使用するエンハンサーは、その発現が組織または細胞に特異的であると特徴づけられたものを無制限に含む。または、IAPゲノムのクローンを治療的構築物として用いる場合には、コグネイト調節配列、または、必要であれば、上記の任意のプロモーターもしくは調節要素を含む異種供給源に由来する調節配列を介して調節することもできる。抗癌療法は、アポトーシスの増強が必要と考えられる細胞に対して治療的センスIAP核酸またはアンチセンスIAP核酸（例、オリゴヌクレオチド）を直接投与することによっても達成される。核酸分子は任意の標準的な技法によって生産および単離しうるが、高効率プロモーター（例えばT7プロモーター）の制御下にある IAP関連核酸を用いるインビトロ転写、または有機合成法（例えばオリゴヌクレオチドに関するもの）による生産が最も容易である。悪性細胞に対するIAPアンチセンス核酸の投与は、核酸を直接投与するための土記の任意の方法、またはさもなければ当技術分野で公知の任意の方法によって実施しうる。本発明の範囲内にあるもう１つの治療的手法には、組換えIAP蛋白質断片またはIAP抗体の、アポトーシスを増強することが望ましい部位への直接的（例えば注入による）または全身的（例えば、任意の従来の組換え蛋白質の投与法）のいずれかによる投与が含まれる。 NAIPもしくはIAP蛋白質、それらのポリペプチド断片、それらの変異体、またはNAIPもしくはIAPポリペプチドに特異的に結合する抗体の用量は、個々の患者のサイズおよび健康状態を含む多くの因子に依存するが、一般的には何らかの薬学的に許容しうる製剤の形で成人に対して1目当たり0.1mgから500mgの範囲で投与される。IAP およびNAIPポリペプチド、核酸、ならびにIAPもしくはNAIPの合成もしくは機能の阻害剤の投与 IAPもしくはNAIP変異蛋白質または蛋白質断片、それらをコードする核酸分子、IAPもしくはNAIPのアンチセンス核酸をコードする核酸分子、またはIAPもしくはNAIPの阻害剤は、1回量を含む形で、薬学的に許容しうる希釈液、担体または賦形剤中に含めて投与することができる。過剰な細胞増殖によって引き起こされる疾患に罹患した患者に対する該化合物の投与に適した製剤または組成物を提供するために、従来の薬学的行為を用いてもよい。投与は患者に症候が現れる前に行ってもよい。投与経路には任意の適切なものを採用することができ、例えば投与は、非経口的、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼部、脳室内、硬膜下腔内、関節包内、槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、坐剤または経口投与であってもよい。例えば、治療的製剤は液性溶液または懸濁液の形態をとることもでき、経口投与用であれば製剤は錠剤またはカプセル剤の形態をとることもでき、鼻腔内投与用であれば粉末剤、点鼻薬またはエアロゾル剤の形態をとることもできる。製剤を製造するための当技術分野において周知の方法は、例えば、「レミントンの製薬科学」（Reminton's Pharmaceutical Sciences）（第18版、A.Gennaro 編、1990，Mack Publishing Company，Easton，PA）に記載されている。非経口投与用の製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水もしくは生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物由来の油、または水素化ナフタレンを含むことができる。化合物の放出の制御のために、生体適合性で生分解性のラクチド重合体、ラクチド／グリコリド共重合体、またはポリオキシエチレン -ポリオキシプロピレン共重合体を用いてもよい。その他の利用可能と考えられるIAPまたはNAIPの調節性化合物の非経目的送達系には、エチレン-酢酸ビニル共重合体の粒子、浸透圧性ポンプ、埋め込み可能な注入系およびリポソームが含まれる。吸入用の製剤は、例えばラクトースなどの賦形剤を含んでも、もしくは例えばポリエチレン-9-ラウリルエーテル、グリココール酸塩およびデオキシコール酸塩などを含む水性溶液であってもよく、または点鼻剤の剤形として投与するための油性溶液、またはケルであってもよい。必要に応じて、IAPもしくはNAIPの変異蛋白質またはIAPもしくはNAIPの断片、関連遺伝子または調節性化合物による処置を、外科手術または化学療法などの、増殖性疾患のより伝統的な治療法と併用してもよい。不十分なアポトーシスが関与する状態の検出 IAPおよびNAIPのポリペプチドおよび核酸には、不十分なレベルのアポトーシス、すなわち増殖性疾患が関与する状態の検出または観測における診断的用途も見いだされる。例えば、IAPまたはNAIPの発現の増加、存在位置の変化、およびI APまたはNAIPの切断は、ヒトにおけるアポトーシスおよび癌の阻害に相関する。したがって、IAPまたはNAIPの産生レベルの上昇により、増殖性の状態またはそうした状態に対する疾病素質の指標が提供される。IAPまたはNAIPの発現レベルは、任意の標準的な技法によってアッセイすることができる。例えば、生物試料（生検試料など）におけるIAPまたはNAIPの発現は標準的なノーザンブロット分析によって観測してもよく、PCRによる補助も可能である（例えば、Ausubelら、分子生物学の最新プロトコル（Current Protocol in Molecular Biology），John Wile y & Sons，New York，1994;およびPCR 技術：DNA増幅の原理および応用（PCR Tec hnology：Principles and Applications for DNA Amplification）、H.A．Ehrli ch編，Stcokton Press，NY；Yapら、Nucl．Acids．Res．19:4294、1991を参照）。または、ミスマッチ検出法を用いて、患者から採取した生物試料を、IAPもしくはNAIP配列またはp53配列における1つまたはそれ以上の変異に関して分析することもできる。一般にこれらの技法には、患者の試料から得た核酸のPCR増幅、および引き続いて行われるハイブリダイゼーションの変化、電気泳動ケル移動の異常、ミスマッチ結合蛋白質を介した結合もしくは切断、または直接的な核酸塩基配列の決定のいずれかによる変異（すなわちミスマッチ）の同定が含まれる。変異型IAPもしくはNAIPの検出を容易にするためにこれらの任意の技法を用いることができ、それぞれは本技術分野において周知である。特殊な技法の例は、オリタ（Orita）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:2766〜2770、1989；シェフィールド（Sheffield）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:232〜236に無制限的に記載されている。さらにもう1つの手法では、生物試料中のIAPまたはNAIPの蛋白質の検出または観測のためにイムノアッセイが用いられる。対照癌細胞からIAPまたはNAIPのポリペプチドのレベルを測定するには、任意の標準的なイムノアッセイ形式（例えば、ELISA、ウェスタンブロット法またはRIA）において、IAPまたはNAIPに特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いることもできる。これらのレベルは野生型IAPまたはNAIPのレベルと比較され、野生型細胞と比較してIAP産生に低下がみられれば、アポトーシスの亢進が関与する状態であることが示され、既知の癌細胞と比較して減少していればIAPまたはNAIPに関連した癌の可能性が減少していることが示される。イムノアッセイの例は例えばアウスユーべル（ Ausubel）ら、前記に記載されている。IAPまたはNAIPの検出のために免疫組織化学的な技法を用いてもよい。例えば、患者から組織試料を採取し、切片化して、抗IAP抗体または抗NAIP抗体および任意の標準的な検出系（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼと共役させた二次抗体を含むもの）を用いてIAPまたはNAIPの有無に関して染色することもできる。このような技法に関する一般的な指導は、例えばバンクロフト（Bancroft）およびスティーブンス（Stevens）（組織学的テクニックの理論および実践（Theory and Practice of Histological Techniques ）、Ch urchill Livingstone、1982）およびアウスユーべルら（前記）に見いだすことができる。 1つの好ましい例では、IAPまたはNAIP蛋白質の産生の評価（例えば、免疫学的技法または蛋白質切断試験（Hogerrorstら、Nature Genetics 10:208〜212、199 5））に始まり、より微妙なIAPまたはNAIPの変化（例えば変異）を同定するように設計された核酸に基づく検出法も含む、複合的な診断法を使用することができる。上記の通り、当業者には多数のミスマッチ検出アッセイが利用可能であり、任意の好ましい技法を用いることが可能である。IAPまたはNAIPにおける変異としては、IAPまたはNAIP生物活性におけるIAPまたはNAIPの発現または変化のいずれかを増強させるものを検出することができる。この複合的な診断法の変法では、任意の適切なアポトーシスアッセイ系（例えば上記のもの）を用いて、IAPまたはNAIPの生物活性が抗アポトーシス活性として測定される。ミスマッチ検出アッセイによって、不十分なアポトーシスによってもたらされるIAPを介した疾患またはNAIPを介した疾患の素因を診断する機会も提供される。例えば、IAPまたはNAIPの変異に関してヘテロ接合性である患者は何ら臨床症状を示さないものの、1つまたは複数種の増殖性疾患を発症する可能性は正常例よりも高いと考えられる。この診断を受けた場合、患者は有害な環境因子（例えば、紫外線照射または化学的突然変異誘発物質）に対する曝露を最小限にし、自らの医学的状態を慎重に監視する（例えば、頻回の身体検査を通じて）ように予防策を講じると考えられる。この種のIAPまたはNAIPの診断手法を、出生前スクリーニングにおいてIAPまたはNAIPの変異を検出するために用いることもできる。上記のIAPまたはNAIPの診断アッセイは、その内部でIAPまたはNAIPが通常発現される任意の生物試料（例えば、生検試料、または体液もしくは組織）を用いて実施することができる。被験試料に関するこれらの供給源を用いて、変異型IAP 遺伝子または変異型NAIP遺伝子の同定に関するアッセイを行うこともできる。または、特にIAPに関連またはNAIPに関連した増殖性疾患に対する素因を診断する一環として、IAPまたはNAIP活性における変化を、任意の細胞からの核酸試料を用いて、例えばミスマッチ検出法によって検討することもできる。好ましくは、このDNA試料は分析に先立ってPCR増幅にかけられる。以下の実施例は例示を意味するものであり、本発明を制限するものではない。実施例１．癌細胞系におけるIAPレベルの上昇癌の診断法および予後判定法としてのIAP遺伝子の有用性を特に示すために、ヒト癌細胞系複数組織ノーザンブロット（Clontech，Palo Alto，CA;#7757-1）をプローブ標識した。このノーザンブロットの各レーンには、以下の8種の異なるヒト細胞系からのポリA⁺RNAが約2μg含まれている：(1)前骨髄球性白血病L-60 、(2)ヒーラ（Hela）細胞S-3、(3)慢性骨髄性白血病K-562、(4)リンパ芽球性リンパ腫MOLT-4、(5)バーキットリンパ腫ラジ（Raji）、(6)結脳直腸腺癌SW480、( 7)肺癌A549、および(8)悪性黒色腫G361。対照として、ヒト複数組織ノーザンブロット（Clontech，Palo Alto，CA;#7759-1）のプローブ標識も行った。このノーザンブロットには、以下の8つの異なるヒト組織からのポリA⁺RNAが約2μg含まれている：(1)脾臓、(2)胸腺、(3)前立腺、(4)精巣、(5)卵巣、(6)小腸、(7)大脳、および(8)末梢血白血球。ノーザンブロットには以下のものを連続的にハイブリダイズさせた：(1)XIAP コード領域に対する1.6kbのプローブ、(2)3'非翻訳領域に対応する375bpのHIAP- 2特異的プローブ、(3)HIAP-2と交差反応する、HIAP-1のコード領域に対数RZFドメイン1.3kbのプローブ、(4)BCL-2のコード領域に由来する1.0kbのプローブ、(5 )製造者によって提供されたβ-アクチンに対するプローブ。ハイブリダイゼーションは、製造者の意見に従って50℃で一晩実施した。ブロットには室温の2X SSC 、0.1％SDSによる15分間の洗浄を2回行い、続いて50℃の2X SSC、0.1％SDSによる洗浄を行った。検討した癌細胞系のすべてにおいて、非癌対照組織からの試料と比較してIAP の発現の増加が示された（表１）。XIAPの発現は、ヒーラ（S-3）、慢性骨髄性白血病（K-562）、結腸直腸腺癌（SW480）および悪性黒色腫（G361）で特に高度であった。HIAP-1の発現はバーキットリンパ腫で著しく高度であり、結脳直腸腺癌でも上昇が認められた。HIAP-2の発現は、慢性骨髄性白血病（K-562）および結腸直腸腺癌（SW480）で特に高度であった。BCL-2の発現にアップレギュレーションが認められたのはHL-60白血病細胞のみであった。ノーザンブロットによる癌細胞中のIAP RNAレベル^* *レベルは(+)によって示し、非癌対照細胞系からのRNAのノーザンブロットと比較したRNAレベルのおおよその増加を示す。１つの+は増加の推計値が少なくとも 1倍であることを示す。以上の観察から、抗アポトーシス性IAP遺伝子のアップレギュレーションは増殖性疾患において広範にみられる事象であって、おそらくBCL-2のアップレギュレーションよりも高い頻度で起こっていることが示唆された。さらに、アップレギュレーションは、癌性細胞の形質転換状態の確立または維持のために必要であると考えられる。上記の観察を追究するために、すなわちラジ・バーキットリンパ腫細胞系においてHIAP-1が過剰発現されるように、複数のバーキットリンパ腫細胞系において RT-PCR分析を実施した。ラジ（Raji）、ラモス（Ramos）、EB-3およびジヨーエ（Jiyoye）細胞系の細胞、ならびに陽性対照として正常胎盤組織から全RNAを抽出した。RNAを逆転写させ、以下のオリゴヌクレオチドの組を用いるPCRによって増幅した： 5'-AGTGCGGGTTTTTATTATGTG-3'（配列番号：15）および5'-AGATGACCACAAGGAATAAA CACTA-3'（配列番号：16）、これらはhiap-1のcDNA断片を選択的に増幅する。RT -PCRはパーキンエルマ−480サーモサイタラー（PerkinElmer 480 Thermocycler ）を用いて行い、以下のプログラムを35サイクル実施した：94℃を1分間、50℃ を1.5分間、および72℃を1分間。PCR反応産物をアガロースゲル上で電気泳動し、臭化エチジウムによって染色した。適切なサイズの増幅されたcDNA断片は、バーキットリンパ腫の試料を含むすべてのレーンで明らかに可視化されたが、正常胎盤組織の試料を含むレーンでは認められず、テンプレートDNAを反応に加えなかった陰性対照を含むレーンでも認められなかった（図11）。実施例２：乳癌におけるIAP 以下のデータは、癌細胞におけるHIAPの調節および役割に関する。図18および 19は、変異型p53を含む乳癌細胞系においてHIAP-1およびHIAP-2の両方がアップレキュレートされていることを示すデータを示している。各レーンは以下の系からの全RNA20μgを含む：1．MCF-7（クローン1、野生型p53）、2．MCF-7（クローン2、野生型p53）、3．MCF-7（American Type Culture Collection、野生型p53 ）、4．MCF-7（親系、California、野生型p53）、5．MCF-7（California）アドリアマイシン耐性変異株、変異型p53）、6．MDA MB 231（ATCC、変異型p53、コドン280）、7．T47-D（ATCC、変異型p53、コドン194）、8．ZR-75（ATCC、野生型p53）。各ゲルにロードするRNAの量は、グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）とのハイブリダイゼーションにより操作した。実施例３：卵巣癌におけるIAP 概要上皮卵巣癌は婦人科臓器の悪性腫瘍による主な死因の一つである。腫瘤の進行度および外科的病期分類などの臨床的および組織学的な予後判定因子はよく理解されているが、制御不能な細胞増殖に至る生物的過程には不明な点が多い。組織発育中の細胞数の制御は細胞増殖と細胞死とのバランスの結果であると考えられている。この自然なホメオスタシスにおける異常が細胞の悪性トランスフォーメーションの一因である可能性が高いと思われる。卵巣癌の細胞生物学的過程に関する最近の研究から、アポトーシスの調節不全が本疾患の基礎にある病理学的機序の一つであることが示唆されている。しかし、この調節に関与する分子的機序はほとんど解明されておらず、卵巣細胞のトランスフォーメーションにおけるIAP遺伝子の役割および調節はこれまで検討されていない。卵巣上皮細胞癌は、一部には卵巣表面上皮細胞のアポトーシスが抑制された結果である。特定の化学療法薬の有効性は、それらに細胞死を誘導する能力があることに基づく。これらの薬剤に対する細胞の反応性の喪失は、これらの薬剤に対するアポトーシス過程の脱感作に起因する。卵巣上皮細胞アポトーシスの調節には、IAP遺伝子の発現およびIAP遺伝子産物の翻訳後修飾／プロセシングにおける変化が含まれる。本発明者らはいくつかの実験を行い、現在ではIAP類が卵巣表面上皮細胞の正常な増殖の維持に重要な役割を果たしており、これらの遺伝子の過剰発現が細胞トランスフォーメーションを招くと考えている。さらに本発明者らは、この型の悪性腫瘍の治療における化学療法薬の有効性は、それらがIAP遺伝子の発現を抑制する能力に基づくことを見いだした。ヒト卵巣上皮癌細胞におけるIAP遺伝子の調節を制御しようとの探索を通じて、本発明者らは、現行の癌治療薬に対して反応性および耐性である双方の患者に対する新たな化学療法薬を開発するための合理的な手法を提供した。同様に、IAPの生物活性を低下させる化合物を検出するために設計された解析法により、薬物発見のための合理的な方法が提供される。方法 a）ヒト卵巣上皮癌細胞の培養シスプラチン感受性（0V2008）およびシスプラチン耐性（C13）のヒト卵巣上皮細胞を、TGFβ（20ng／ml）、タキソール（0〜1.0μM）またはシスプラチン（ 0〜30μM）の存在下または非存在下において、化学的に規定された培地中にて37 ℃で最大48時間培養した。細胞は培養期間が終了した時点で免疫細胞化学分析もしくはTUNEL分析のために固定するか、または後にIAP mRNAおよび蛋白質分析用に抽出するために急速凍結した。 b）細胞死の同定核染色のためには、ヒト卵巣上皮癌細胞を固定し（4％ホルマリンPBS溶液；10 分間、室温）、PBSで洗い、ヘキスト（Hoechst）33248染色液（0.1μg／mlのPBS 溶液、10分間）中に再懸濁し、再度洗った後にスライドグラス上に滴下して顕微鏡検査を行った。核染色を観察し、FITCフィルター付きのツァス（Zeiss）蛍光顕微鏡を用いてこれを撮影した。アポトーシス細胞は典型的な核形態によって同定し、算定時の偏差を避けるために無作為に選択された視野を用いて算定し、複数の写真用スライドグラスを用いた。 DNAラダーの定量化のためには、キアゲン血液キット（Quiagen Blood Kit）（ Quiagen Inc.、Chatsworth，CA）を用いて細胞のDNAを抽出した。DNAの定量化は臭化エチジウム蛍光法によって行った。続いてDNA（0.5μg）に対して、クレノウ酵素（2U、10mM Tris+5mM MgCl₂中）および0.1μCiの[α³²P]dCTPとともにインキュベート（20分間、室温）することによって末端標識を施した。取り込まれなかったヌクレオチドをキアケン（Quiagen）ヌクレオチド除去キットによって除去し、試料をTris-アセテート-EDTAアガロース（1.8％）ゲル電気泳動によって分離した。続いてゲルを乾燥させ（2時間、非加熱）、低分子量DNA（＜15キロ塩基対）をデンシトメトリーによって定量するために、バイオラッドホスフォイメージャー（Bio-Rad Phosphoimager）スクリーンに対して、続いてX線フィルムに対して-80℃で露出した。細胞死を同定するためのアポトーシス細胞のインサイチューTUNEL標識のためには、インサイチュー細胞死検出キット（Boehringer-Mannheim、Indianapolis 、IN）を、製造者の指示に従って用いた。組織検査用に調製したスライドを、FI TC結合dUTPの存在下でターミナルトランスフェラーゼによって処理した（20分間、37℃で）。 c）IAP類に関するウエスタンブロット解析蛋白質抽出物は、スクロース緩衝液（0.25Mスクロース、0.025M NaCl、1mM EG TAおよび15mM Tris-HCl pH6.8に1mM PMSF、2μg／mlのロイペプチンおよび5μg ／mlのアプロチニンを加えたもの）中で氷上にて超音波処理（8秒／サイクル、3 サイクル）を施したヒト表面上皮癌細胞から調製した。超音波処理物を13,000× gで10分間遠心し、上消を回収して、電気泳動分析を行う時点まで-20℃で保存した。蛋白質濃度はバイオラッド蛋白質解析（Bio-Rad Protein Assay）によって測定した。蛋白質（10〜30μg）を１次元SDS-PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜に電気泳動的に移行させた。膜には5％脱脂乳によってブロッキングを行い、続いて5%乳汁を含むTBST（10mM Tris緩衝生理食塩水、0.1％ Tween-20、pH7.5）中に希釈したIAPに対するウサギポリクローナル抗体［抗ヒトHIAP-2ΔE（960529； 1：1000希釈）、抗ヒトNAIP E1.0（951015；1：1000希釈）または抗ヒトXIAP（1 ：1000希釈）］とともにインキュベートした。免疫陽性の蛋白質の可視化にはEC Lキットを用いた（Amersham Intl.、Arlington Heights、IL）。 d）IAP mRNAに対するノーザンブロット RNイージーキット（RNeasy Kit）（Quiagen）の使用による卵巣表面上皮癌細胞からの全RNAを調製した。RNA試料（10〜15μg）を分光光度計によって定量化し、RNA試料が均一にローディングされたこと、ならびに28Sおよび18Sリボゾームのバンドが適切に分離されたことを確かめるための1μg／ml臭化エチジウムを含むホルムアルデヒド-アガロースゲル（1.1％）上での電気泳動によってサイズ別に分画した。RNAバンドをナイロン膜に対してブロットし、紫外線により架橋させた。50％ホルムアルデヒド、塩性クエン酸ナトリウム（saline sodium citr ate）（SSC；750mM NaCl、75mMクエン酸ナトリウム）、1×デンハート溶液、1％ SDS、4mM EDTAおよび100μg／mlの破砕（sheared）サケ精子DNA中にて42℃で４時間、膜のプレハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは20 00万cpmの³²P標識IAP cDNAプローブ（ラットNAIP、ラットXIAPまたはヒトHIAP-2 ）を添加したプレハイブリダイゼーション緩衝液により、42℃で一晩実施した。続いて膜に対して、SSC（300mM NaCl、30mMクエン酸ナトリウム）を含む0.1％SD S中にて室温での20分間の洗浄を2回行い、SSC（30mM NaCl、3mMクエン酸ナトリウム）を含む0.1％SDS中にて55℃で20分間の洗浄を2回行った後に可視化のために-80℃でX線フィルムに対して露出した。種々のIAP類および28S rRNAバンドの濃度測定分析はバイオラッドラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories）社の画像解析システム（Image Analysis Systems）を用いて実施した。データはそれぞれの28Sによって標準化し、対照（100％と定義）に対する比率として記した。結果本発明者らは以下のことを観察した。 1．シスプラチンにより、インビトロでシスプラチン感受性（OV2008）ヒト卵巣上皮細胞におけるアポトーシスの発生率の濃度依存的な増加が誘導されたが、耐性（C13）細胞における程度はそれよりも低かった（図20）。同様に、タキソールもOV2008細胞においてアポトーシスを誘発させたが、C13細胞ではその程度は低かった（図21）。 2．XIAPおよびHIAP-2蛋白質の基両含有量は、シスプラチン感受性細胞の方が耐性細胞よりも顕著に多かった。タキソール（0.04〜1.0μM）はXIAPおよびHIAP-2 蛋白質のレベルを濃度依存的な様式で低下させ、その反応は感受性細胞の方が耐性細胞よりも顕著であった（図22）。HIAP-2の比較的低分子量（約45kDa）の免疫反応性断片も感受性細胞および耐性細胞のいずれにおいても明らかであった。タキソールにより、この断片の含有量はC13細胞では増加したが、OV2008細胞では減少した（図22）。 3．タキソール（0.2μM）は、シスプラチン感受性細胞ではHIAP-2 mRNAの存在量を著しく抑制したが（約80％）、耐性細胞では効果がみられなかった（図23）。 4．TGFβ（20ng／ml）は、OV2008ではアポトーシスを誘発したがC13では誘発しなかった。シスプラチン耐性細胞におけるXIAP蛋白質含有量に対するその影響はごくわずかであったが、シスプラチン感受性細胞における本IAPの蛋白質レベルは著しく抑制された（図24A、24B）。TGFβ（20ng／ml）もまた、OV2008細胞におけるHIAP-2 mRNAを減少させたが、C13では減少しなかった（図23）。重要な観察結果および考えられる用途タキソールによるヒト卵巣上皮癌細胞でのアポトーシス誘発が、IAP遺伝子発現の抑制によって達成された。化学療法剤に対する細胞の感受性が最終的に喪失することは、細胞がIAP遺伝子を発現する能力の低下と関連している可能性がある。薬物耐性細胞におけるタキソールの存在下でのHIAP-2蛋白質含有量の減少（ HIAP-2 mRNAの存在量に顕著な変化がなかったにもかかわらず）は、45kDaの免疫反応性HIAP-2蛋白質バンドの強度の増加を伴っていた。これらの観察結果から、本発明者らは、45kDa蛋白質がHIAP-2の蛋白質分解産物であり、薬物耐性の発生において一定の役割を果たすと考えている。さらに、これらの卵巣癌細胞におけるIAPフアミリーのタキソールに対する感受性は、ヒト卵巣上皮細胞癌の治療を目的とする新たな化学療法剤の開発における遺伝子ターゲティングのための有望な新規部位を示唆するものである。実施例４．星状細胞における26kDa切断蛋白質の蓄積 26kDa切断蛋白質の同定ジャーカット（Jurkat）細胞および星状細胞腫細胞に対して、50mM Tris-HCl （pH8.0）、150mM NaCl、1mM PMSF、1μg/mlアプロチニン、および5mMベンザミジン中にて超音波処理（×3回、4℃で15分間）を施すことにより、それらの細胞から全蛋白抽出物を調製した。超音波処理の後、試料に5分間の遠心処理を行った（遠心管中にて14,000RPM）。10％SDS-ポリアクリルアミドゲルの各ウェルに蛋白質20μgを載せて電気泳動を行い、標準的な方法によってPVDF膜に対するエレクトロブロット法（electroblot）を行った。すでに記載した方法の通りにウェスタンブロット分析を実施した結果、星状細胞腫細胞系（CCF-STTG1）が、アポトーシスの誘因となるイベントがなかったにもかかわらず、抗XIAP反応性の約 26kDaのバンドを大量に発現したことが明らかになった（図12）。実際に、この細胞系が標準的なアポトーシス誘因に対して特に抵抗性を有するという特徴はすでに分析されている。 26kDaのXIAP反応性バンドは以下の実験条件下でも認められた。ジャーカット細胞（形質転換ヒトT細胞系）は、抗Fas抗体（1μg/ml）への曝露によって誘導されてアポトーシスを起こした。ジャーカット細胞の同一培養物に対して以下のいずれかを暴露させた：(1)抗Fas抗体およびシタロヘキシミド（20μg/ml）、(2 )腫瘍壊死因子α（TNF-α、1000U/ml）または(3)TNF-αおよびシタロヘキシミド（20μg/ml）。投与開始から6時間後にすべての細胞を収集した。このほかに陰性対照として、細胞を収集した後の抽出物に抗Fas抗体を添加した。細胞はSDS試料緩衝液中に収集し、12.5％SDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、標準的な方法を用いてPVDF膜へのエレクトロブロッティングを行った。この膜に、1 ：1000としたウサギ抗XIAPポリクローナル抗体による免疫染色を1時間行った。1 5分間洗浄した後に、西洋ワサビペルオキシダーゼと共役させたヤギ抗ウサギ抗体を室温で1時間適用した。非結合型の二次抗体を洗い流し、化学発光によるXIA P蛋白質の検出を実施した。このウェスタンブロットにより、非処置および処置細胞の両方に完全長の55kDaのXIAP蛋白質が存在することが明らかになった。さらに、アポトーシス性細胞の抽出物には約26kDaの新規なXIAP反応性バンドも認められたが、対照の非処置細胞の抽出物ではこれは認められなかった（図13）。 XIAPの切断は、ヒーラ（Hela）などの他の癌細胞系を含むさまざまな細胞種で起こる。26kDaのXIAP切断産物の発現は、ヒーラ細胞では以下のようにして示されている。ヒーラ細胞に以下のいずれかの処置を行った：(1)シクロヘキシミド（20μg/ml）、(2)抗Fas抗体（1μg/ml）、(3)抗Fas抗体（1μg/ml）およびシクロヘキシミド（20μg/ml）、(4)TNFα（1,000U/ml）、または(5)TNFα（1,000U/ ml）およびシクロヘキシミド（20μg/ml）。処置開始から18時間後にすべての細胞を収集した。上記の通りに細胞を収集した後の抽出物に抗Fas抗体を添加した。ヒーラ細胞を収集し、ジャーカット細胞の試料からのXIAP反応性バンドの可視化に用いたものと同一の条件下でウエスタンブロットのプローブ標識を行った。アポトーシス性細胞調製物では同じく26kDaのXIAPのバンドが認められた（図14 ）。さらに、XIAPの切断の程度とアポトーシス誘因物質への細胞の曝露との間には正の相関が認められた。ヒーラ細胞にシクロヘキシミドまたはTNFαのいずれかのみを投与した場合にはわずかなアポトーシスが引き起こされたのみであり、切断産物はほとんど認められなかった。細胞に抗Fas抗体を投与した場合には、より多量の切断産物が明らかに認められた。これらのデータは、XIAPが１種を超える細胞種において、1種を超えるアポトーシス誘因に反応して切断されることを示している。発現の時間経過ヒーラおよびジャーカット細胞に抗Fas抗体（1μg/ml）を投与して、投与の直後または1、2、3、5、10もしくは22時間後のいずれかに収集することにより、26 kDa切断産物の蓄積に関する時間経過を検討した。上記の通りに、蛋白質抽出物を調製してウェスタンブロット分析を実施した。検討した時間経過の範囲にわたって、26kDa切断産物の蓄積量は両方の種類の細胞で増加した（図15Aおよび15B ）。 26kDaのXIAP切断産物の細胞下局在 26kDa切断産物の細胞下配置を決定するために、抗Fas抗体（1μg/ml）への曝露によってジャーカット細胞がアポトーシスを起こすように誘導し、続いてその直後、3時間後または6時間後に細胞を収集した。上記の通りに、それぞれの時点で収集した細胞から全蛋白質抽出物を調製した。核および細胞質の細胞抽出物を調製するために、アポトーシス性ジャーカット細胞を等張トリス（Tris）緩衝生理食塩水（pH7.0）で洗い、細胞抽出緩衝液（50mM PIPES、50mM KCl、5mM EGTA、2 mM MgCl₂、1mM DTTおよび20μMサイトカラシンB）中での凍結解凍を5回行うことによって溶解した。核は遠心処理によってペレット化し、等張トリス緩衝液（pH 7.0）中に再懸濁させて-80℃で凍結した。抽出物の細胞買分画は、TA 100.3ローターに入れて60,000RPMでの遠心処理をさらに30分間施した。上消を除去し、-80 ℃で凍結した。核および細胞質の両方の分画の試料を12.5％SDS-ポリアクリルアミドゲルに載せた後、PVDF膜へのエレクトロブロッティングを行った。続いて、抗CPP32抗体（Transduction Laboratories Lexington，KY；図16A）または上記のウサギ抗XIAP抗体（図16B）のいずれかを用いてウェスタンブロット分析を実施した。 CPP32プロテアーゼを認識する抗CPP32抗体（YAMAまたはアポパイン（Apopain ）としても知られる）は、ほぼ独占的に細胞質分画中に分配された。55kDaのXIA P蛋白質は独占的にアポトーシス性細胞の細胞質中に位置しており、これは、正常で健全なCOS細胞でXIAPが細胞質に位置することが免疫蛍光顕微鏡法によって示した上記の研究の結果と一致する。これに対して、アポトーシス性ジャーカット細胞では、核分画に独占的に26kDa切断産物が位置していた。以上を総合すると、これらの観察から、XIAPの抗アポトーシス成分は26kDa切断産物であって、それは核内に作用を及ぼすと考えられることが示唆される。 XIAP蛋白質のインビトロでの切断、および切断産物の特徴分析この一連の実験のために、プラスミドpcDNA3-6myc-XIAP、T7 RNAポリメラーゼ、および一対の転写／翻訳キット（Promega，Madison，WI）を製造者の指示に従って用いて、XIAP蛋白質にS35による標識を施した。セファデックス（Sephadex ）G-50を用いるカラムクロマトグラフィーにより、放射性標識が施されたXIAP蛋白質を、取り込まれなかったメチオニンから分離した。さらに、抗Fas抗体（1μ g/ml）による処置を3時間行った後、アポトーシス性ジャーカット細胞の抽出物を調製した。抽出物を調製するために、細胞をTriton X-100緩衝液（1％ Triton X-100、25mM Tris HCl）中にて氷上に2時間置いて溶解し、続いて5分間のマイクロ遠心処理（microcentrifuge）を行った。可溶性抽出物を残した（これはTX1 00と表記した）。細胞抽出緩衝液中にて凍結／解凍を行って細胞を溶解した。可溶性の細胞質分画は別にまとめた（これはCEBと表記した）。CEB細胞質分画の調製物から得た核ペレットは、Triton X-100緩衝液によって可溶化し、マイクロ遠心処理を行って、主に核DNAを含む可溶性分画を残した（これはCEB-TX100と表記した）。可溶性細胞抽出物は細胞をNP-40緩衝液によって溶解することによって調製し、続いてマイクロ遠心処理を5分間実施した（これはNP-40と表記した）。インビトロでの切断は、それぞれの抽出物（CEB、TX-100、CEB-TX100およびNP-40）16 μlを、インビトロで翻訳されたXIAP蛋白質とともに37℃で7時間インキュベートすることによって実施した。TX100緩衝液またはCEB緩衝液のみを含む陰性対照も含めた。蛋白質は10％SDS-ポリアクリルアミド上で分離し、乾燥させた後にX線フィルムに一晩露光させた。 XIAPのインビトロでの切断は、CEB抽出物では明らかであった。切断産物の分子量の観測値は約36kDaであった（図17）。切断産物のサイズに10kDaの差があったことは、観察された産物が、mycエピトープの6つのコピー（10kDa）を含む組換え蛋白質のアミノ末端に由来することを示している。このため、この切断産物は少なくとも2つのBIRドメインを有しており、核内に位置していると考えられる。実施例５．IAP活性の特徴分析および細胞内局在に関する試験 IAPがアポトーシスを調節する能力は、その中でアポトーシスの変化を検出することができるインビトロ系において規定することができる。完全長、切断型、またはアンチセンス構築物であるIAPのcDNAを載せた哺乳類の発現構築物を、CHO 、NIH 3T3、HL60、Rat-1またはジャーカット細胞などの細胞系に導入することができる。さらに、SF21昆虫細胞を用いてもよく、この場合にはIAP遺伝子は好ましくは昆虫の熱ショックプロモーターを用いて発現させられる。遺伝子導入の後には、血清除去またはスタウロスポリン、メナジオン（これはフリーラジカルの形成を介してアポトーシスを誘導する）もしくは抗Fas抗体の適用を含む標準的な方法によってアポトーシスを誘導することができる。対照として、アポトーシスを起こすように誘導される細胞と同じ条件下において細胞を培養し、これには遺伝子導入を行わないか、IAP挿入物を含まないベクターによる遺伝子導入を行った。それぞれのIAP関連構築物が発現した際にアポトーシスを抑制または増強する能力は、細胞の生存指標、すなわち生存している遺伝子導入細胞と生存している対照細胞との比を算出することによって定量化することができる。これらの実験は、アポトーシス抑制活性の存在に関する確認を可能とするほか、以下に説明するように、アポトーシスを増強させるのに用いることのできるIAPの機能性領域の決定に用いることもできる。また、これらのアッセイは、IAPの発現を介してアポトーシスを調節する化合物を同定するために、他の化合物の適用と併用して実施することもできる。実施例６．完全長IAP構築物によるトランスフェクション後の細胞の生存、およびアポトーシスの誘導さまざまなアポトーシス抑制アッセイを実施することによって得た結果の具体例を図10Aから10Dに示した。例えば、6種の構築物のうち1種による遺伝子導入を行い、引き続いて血泊除去を行った後のCHO細胞の生存の様子を図10Aに示した。以下の組換えプラスミドのうち1つを2μg用いるとともにリポフェクターセ（Lip ofectace（登録商標））を用いて細胞に遺伝子導入を施した:pCDNA36myc-xiap（ XIAP）、pCDNA3-6myc-hiap-1（HIAP-1）、pCDNA3-6myc-hiap-2（HIAP-2）、pCDN A3-bcl-2（BCL-2）、pCDNA3-HA-smn（SMN）およびpCDNA3-6myc（6-myc）。XIAP 、HIAP-1およびHIAP-2のORFのPCR増幅およびpCDNA3（Invitrogen）へのクローニングを可能とするためにオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。それぞれの構築物に改変を施してペプチド配列MEQKLISEEDL（配列番号：17）の6回反復物をコードする合成mycタグを組み込み、これによってモノクローナル抗myc抗血消（ Eganら、Nature 363:45〜51、1993）を介したmyc-IAP融合蛋白質の検出が可能となるようにした。3シリーズ分の細胞系の試料を24穴皿に入れて無血清培地で5回洗い、実験の間は無血消条件を維持した。トリパンブルーを排出した細胞、すなわち生きている細胞を、血消除去の直後、24時間、48時間および72時間後に血球算定板を用いて算定した。生存率は最初の生存細胞数に対する比率として算出した。この実験ならびに図10Bおよび10Dに提示した実験に関して表示した生存細胞の比率は、3回に分けて実施した3つの別々の実験での平均±平均偏差を表す。遺伝子導入（上記の6種の構築物のそれぞれ1種による）およびメナジオンへの曝露の後のCHO細胞の生存率を図10Bに示した。細胞を24穴皿に播いた後、一晩増殖させ、続いて20μMメナジオン（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO）に1.5 時間曝露させた。3シリーズ分の試料をメナジオンへの曝露時および24時間後に採取し、トリパンブルーの排出によって生存率を評価した。遺伝子導入（上記の6種の構築物のそれぞれ1種による）およびスタウロスポリンへの曝露の後のRat-1細胞の生存率を図10Cに示した。Rat-1細胞に遺伝子導入を施した後、800μg/mlのG418を含む培地中に2週間置いて選択した。この細胞系を、5時間にわたるスタウロスポリン誘発性アポトーシス（1μM）に対する抵抗性に関して評価した。スタウロスポリンへの曝露から24時間後にトリパンブルーの排出によって生存細胞を算定した。表示した生存細胞の比率は、2回の実験での平均±平均偏差を表す。 Rat-1細胞系は、これらの細胞に上記の6種の構築物のそれぞれによる遺伝子導入を施した後のメナジオンに対する抵抗性を試験する目的にも用いた（図10D）。細胞を10μMメナジオンに1.5時間曝露させ、18時問後に生存細胞数を算定した。実施例７．完全長および部分的IAP構築物による遺伝子導入後の細胞生存率の比較 XIAP、HIAP-1およびHIAP-2を含むヒトIAPが細胞死に対する防御をもたらす機序を調べるために、(1)完全長のIAP cDNA（上記のもの）、(2)BIRドメインをコードするがRZFはコードしないIAP遺伝子の一部、または(3)RZFをコードするがBI RドメインはコードしないIAP遺伝子の一部、のいずれかを含む発現ベクターを構築した。ヒーラ、ジャーカットおよびCHO細胞系における一時的または安定的発現により、ヒトおよびマウスのXIAP cDNAを検討した。遺伝子導入後には、血消除去、メナジオンの適用、または抗Fas抗体の適用によってアポトーシスが誘導された。続いて上記のようにトリパンブルー排出によって細胞死を評価した。遺伝子導入の効率に関する対照として、細胞にβ-gal発現構築物による同時遺伝子導入を施した。典型的には、首尾よく遺伝子導入がなされたのは細胞の約20％であった。 CHO細胞に一過性的トランスフェクションを施した場合には、完全長のヒトまたはマウスのXIAP cDNAを含む構築物によってもたらされた細胞死の防御はわずかだが明確であった。これに対して、BIRドメインのみをコードした構築物（すなわち、RZFドメインを含まないもの）によりトランスフェクトされたCHO細胞の生存率は、血消除去から72時間後では著明に高値であった。さらに、BIRドメインを発現している細胞の大部分は96時間後にも生存しており、この時点では対照、すなわち遺伝子導入を受けていない細胞培養物には生存細胞は残っておらず、ベクターのみ、すなわちcDNA挿入物を含まないものによる遺伝子導入を受けた細胞の中で生存していたものは5％未満であった。いずれのBIRドメインの欠失によっても、血消除去から72時間以内の対照レベルに対しての生存CHO細胞の比率の低下に反映されるように、アポトーシス抑制の完全損失がもたらされる。 G418による選択下において数ヶ月維持された遺伝子導入CHO細胞の安定プール（stable pool）に対して10μMメナジオンを2時間曝露させることにより、アポトーシスを起こすように誘導した。検討したCHO細胞は、(1)完全長マウスXIAPの cDNA（MIAP）、(2)完全長XIAPのcDNA（XIAP）(3)完全長BCL-2のcDNA（BCL-2）、 (4)マウスXIAPの3つのBIRドメインをコードする（しかしRZFはコードしない）cD NA（BIR）、および(5)M-XIAPのRZFをコードする（しかしBIRドメインはコードしない）cDNA（RZF）、による安定的な遺伝子導入を受けたものである。非遺伝子導入細胞（CHO）またはベクターのみによる遺伝子導入を受けた細胞（pcDNA3）を本実験における対照として用いた。10μMメナジオンへの曝露の後に、遺伝子導入細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗い、メナジオンを含まない培地中にてさらに24時間培養した。細胞死は、上記のようにトリパンブルー排出によって評価した。非遺伝子導入細胞およびベクターのみによる遺伝子導入を受けた細胞ともに24時間の生存試験期間の後に生存していたのは10％未満であった。RZF を発現している細胞に関して有意に優れた経過は認められなかった。しかし、完全長のマウスXIAP、ヒトXIAP、またはBCL-2の発現、およびBIRドメインの発現によって細胞の生存率は高まった。メナジオンの濃度を10μMから20μMに高めた場合（その他のすべての実験条件は10μMメナジオンを適用した際と同じにした）には、BIRドメインのcDNA構築物を発現した生存CHO細胞の比率は、完全長のマウスXIAPまたはBCL-2のいずれかを発現した生存細胞の比率よりも高かった（図16B ）。実施例８．発現されたRZFおよびBIRドメインの細胞下局在の分析上記の細胞死に関するアッセイから、RZFがIAPの抗アポトーシス機能の負の調節因子として作用することが示された。RZF、およびおそらくはその他のIAPドメインが、その調節性作用を発揮する１つの仕方は、その産物がアポトーシス経路において機能する遺伝子の発現を変化させることによると考えられる。発現されたRZFおよびBIRドメインの細胞下配置が核内調節因子としての役割と一致しているか否かを判定するために、COS細胞に以下の4種の構築物による一時的遺伝子導入を施し、発現されたポリペプチドの位置を免疫蛍光顕微鏡によって調べた：(1)配列番号：4の497個のアミノ酸全部をコードするpcDNA3-6myc-XIAP 、(2)マウスXIAP（配列番号：10）の496個のアミノ酸全部をコードするpcDNA3-6 myc-m-XIAP、(3)m-XIAPのアミノ酸1〜341をコードするpcDNA3-6myc-mXIAP-BIR、 (4)マウスXIAPのアミノ酸342〜496をコードするpcDNA3-6myc-mXIAP-RZF。細胞をマルチウェル組織培養スライド上にて12時間増殖させた後に固定し、メタノールによる透過化処理を行った。用いた構築物（本試験および細胞死アッセイにおいて使用）には、N末端にヒトMycエピトープタグによるタグ付加を施した。このため、FITCを共役させた抗Mycモノクローナル抗体およびヤギ抗マウス二次抗体を用いて、一時的遺伝子導入を受けたCHO細胞における発現産物の位置を調べることができると考えられた。完全長のXIAPおよびMIAPは細胞質に位置しており、核周辺領域で特に発現が顕著であった。RZFドメインをコードする（しかしBIRドメインはコードしない）構築物を発現する細胞の場合にも同じ配置パターンが認められた。しかし、BIRドメイン（RZFは含まない）を発現する細胞は主に核の染色を呈した。BIRドメインの構築物によって発現された蛋白質は、核への移行のさまざまな段階にあると考えられた。以上の観察は、以下に説明するように、抗Fas抗体（これはアポトーシスの強力な誘導因子である）によって処理したT細胞内ではXIAPが切断され、そのN端領域が核に移動しているとの事実と一致する。実施例２に記載したように、HIAP-2 は同様の切断事象を受けると考えられる。実施例９：アンチセンスオリゴヌクレオチドの検討 1．アデノウイルス構築物の完全な集団（panel）本集団には約4種の組換えウイルスが含まれうる。A）それそれのIAPまたはNAIP：XIAP、HIAP-1、HIAP-2およびNAIPの読み取り枠に対するセンス配向性ウイルス。これらのウイルスは感染細胞において組換え蛋白質を大量に過剰発現するよう設計されている。B）ウイルス性プロモーターがIAP mRNAとは逆の極性を持つmRNAの合成を推進し、それによって宿主細胞による標的蛋白質コード領域の合成が停止されるようなアンチセンス配向性ウイルス。XIAP、HIAP-1、HIAP-2およびNAIP「アンチセンス」構築物が必要である。C）サブドメイン発現ウイルス。これらの構築物は感染細胞においてIAP 蛋白質の一部のみを発現する。本発明者らの結果は、XIAPのジンクフィンガーの欠失により、この蛋白質が細胞をアポトーシス誘発因子から防御する能力がより強力になることを示している。また、これらのデータは、ジンクフィンガーの発現のみであっても、XIAP機能のドミナントネガティブリプレッサーとして機能することによりアポトーシスの指標になることを示している。XIAP-ΔZFおよびXIA P-ΔBIRウイルスが必要である。D）対照ウイルス。IAPの機能的解析には、比較のための適切な陽性および陰性対照が必要である。BCL-2センス、BCL-2アンチセンス、p53センス、およびLac Z（陰性対照）ウイルスを用いうる。 2．組換えアデノウイルスの機能の確認センスアデノウイルスの機能の確認には、組織培養細胞の感染および蛋白質発現レベルの決定が含まれる。本発明者らは、NAIP、XIAPおよびXIAP-ΔRZFを含む、いくつかの組換えアデノウイルスのウエスタンブロット解析を行った。残るウイルスは、ポリクローナルIAP抗体を用いて蛋白質発現に関して容易に評価しうる。アンチセンスウイルスの機能解析を、感染した組織培養細胞から回収した全RNAのノーザンブロットまたはリボヌクレアーゼ保護解析のいずれかを用いてRNAレベルで行ってもよい。発現されたアンチセンスRNAが宿主細胞のIAPの発現を妨げるか否かを判定するためには、感染細胞のウエスタンブロット解析が用いられる。 3．IAP過剰発現が薬剤耐性の増強をもたらす証拠の提示（documentation）本発明者らは、試料の偏差を最小限にした上で試料の高スループット（through-pu t）処理が可能なように細胞死解析法を最適化した。センスIAPアデノウイルスが乳房および膵臓の腺癌細胞系の薬物感受性を変化させる能力の検討は以下のようにして達成しうる。癌細胞系を組換えウイルスに感染させ、5日間培養した後に2 4穴プレートに細分した。3組の細胞に対して、調べようとする抗癌薬を種々の濃度で与えた。試料を曝露から24、48および72時間後に回収し、ウェル内の生存細胞の数を計測した。続いて用量反応曲線を、非感染細胞および対照ウイルス（陽性および陰性の両方）に感染した細胞と比較する。癌細胞系がセンスウイルスに感染した際には比耐性（relative resistance）の劇的な上昇が認められると思われ、これによってIAP蛋白質の過剰発現が癌細胞の抗アポトーシス性表現型の一因であることが裏づけられる。初期の実験では化学療法薬ドキソルビシンおよびアドリアマイシンを用いる。 4．アンチセンスIAP過剰発現が薬剤感受性の増強をもたらす証拠の提示 IAPの過剰発現によって癌細胞が化学療法薬に対してより耐性になることが確かめられれば、アンチセンスアデノウイルスが同じ細胞をより感受性にするか否かを検討することもできる。アンチセンスBCL-2ウイルスと対比してのアンチセンスIAPウイルスの有効性も重要な段階として評価されるであろう。 5．アンチセンスオリゴヌクレオチドの同定アデノウイルスに関する作業と同時に、本発明者らは各IAPの種々の領域に対する一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した。アンチセンスオリゴヌタレオチドがいかに機能するかに関して一般に受け入れられているモデルは、核内でのRNA／DNA二重鎖の形成によって細胞のRNaseH酵素が活性化され、それが次にハイブリッド体のmRNA成分を酵素的に分解するというものである。mRNAの実質的にあらゆる部分を標的とすることができ、このため標的に対する適切な配列の選択は幾分経験的になされる。特定のオリゴヌクレオチドが有効と考えられるか否かは標的mRNAの二次構造および標的配列の結合親和性を含む多くの因子によって決定され、これにより各IAPにはいくつかのオリゴヌクレオチドが必要となる。結合親和性およびmRNA二次構造を予測するために利用可能なコンピュータアルゴリズムに基づき、各IAP mRNAに対して5種のオリゴヌクレオチドを作製した。これらおよびその他のオリゴヌクレオチドがそれぞれのmRNAを標的として分解する能力はノーザンブロット解析を用いて検討しうる。 6．オリゴヌクレオチドの最適化有効な標的領域が同定されれば、第2段階（se condary round）のオリゴヌクレオチドを作製することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、上記に提供されたものなどの方法を用いて同定された最も活性の高いアンチセンスオリゴヌクレオチドに隣接した配列を標的とする。ノーザンブロット解析による2回目の検討が必要になることもある。 7．アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロでの検討標的オリゴヌクレオチドが首尾よく同定および最適化された後に、本明細書に記載される癌検査において記載されるものなどの最適な細胞系を用いる組織培養モデル系でこれらを検討することができる。実験手順は組換えアンチセンスアデノウイルスの研究に用いられるものと類似したものでよい。ミスマッチ配列を有する陰性対照オリゴヌクレオチドがベースソインまたは非特異的効果を確定するために用いられる。陽イオン性脂質担体を用いる補助下でのオリゴヌクレオチドのトランスフェクションを非補助下でのトランスフェクションと比較してもよい。特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性の確認により、ホスホロチオエートまたはメチルイミノ置換オリゴヌクレオチドなどの修飾ホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドの合成が促される。これらもインビトロで検討することができる。 8．アンチセンスオリゴヌクレオチド療法の動物モデルでの検討（animal modeli ng）ここではアンチセンスIAP方法の有効性の動物モデルでの検討について説明する。細胞系の腫瘍形成能に関する評価は、免疫不全状態にあり（機能的胸腺を欠く）、このため腫瘍を極めて発症しやすい無毛の系統のマウスである「ヌード」マウスを用いてなされることが目常的である。ヌードマウス解析法では、癌細胞を組織培養系で増殖させ、続いて複数の部位の皮下に注射する。これらの細胞が定められた期間内に触知可能な腫瘍を生じる頻度は、機能的免疫系による干渉が存在しない場合の細胞系の腫瘍形成能の指標となる。アンチセンスIAP治療薬の予備的評価には、組換えアデノウイルス（センス、アンチセンスおよび対照ウイルス）に感染した癌細胞の皮下への注射、および非処理細胞との腫瘍形成指標の比較が含まれる。また、このモデルを、ヌードマウスモデルにおける抗癌薬の効力を高めるという点でのアンチセンスオリゴヌクレオチドの全身投与の有効性を評価するために用いてもよい。ホスホロチオエートまたはメチルイミノ置換オリゴヌクレオチドはこの段階で評価される。この種のアンチセンスオリゴヌクレオチドでは、細胞透過性の増強、および実験的動物モデルにおける体内からの排出速度の低下が示されている。実施例10．付加的なアポトーシスアッセイの例アポトーシスアッセイの具休例は以下の参考文献でも提供されている。リンパ球におけるアポトーシスに関するアッセイは以下に開示されている：ロ（Li）ら、Science 268:429〜431；ジベリーニ（Gibellini）ら、Br．J．Haenlatol．89: 24〜33、1995；マーチン（Martin）ら、J．Immunol．152:330〜42、1994；テライ（Terai）ら、J．Clin．Invest．87:1710〜5、1991；デイン（Dhein）ら、Nat ure 373:438〜441、1995；カチキス（Katsikis）ら、J．Exp．Med．1815:2029〜 2036、1995；ウェステンドープ（Westendorp）ら、Nature 375:497-500、1995；デロッシ（DeRossi）ら、Virology 198:234〜44、1994。線維芽細胞におけるアポトーシスに関するアッセイは以下に開示されている：フォスベック（Vossbeck）ら、Int．J．Cancer 61:92〜97、1995；ゴルッピ（Go ruppi）ら、Oncogene 9:1537〜44；フェルナンデス（Fernandez）ら、Oncogene 9:2009〜17、1994；ハリントン（Harrington）ら、EMBO J．13:3286〜3295、199 4；イトウ（Itoh）ら、J．Biol．Chem．268:10932〜7、1993。神経細胞におけるアポトーシスに関するアッセイは以下に開示されている：メリノ（Melino）ら、Mol．Cell．Biol．14:6584〜6596、1994；ローゼンバウム（ Rosenbaum）ら、Ann．Neurol．36:864〜870、1994；サトウ（Sato）ら、J．Neur obiol．25:1227〜1234、1994；フェラーリ（Ferrari）ら、J．Neurosci．1516:2 857〜2866、1995；タレー（Talley）ら、Mol．Cell．Biol．1585:2359〜2366、1 995；ウォルキンショー（Walkinshaw）ら、J．Clin．Invest．95:2458〜2464、1 995。昆虫細胞におけるアポトーシスに関するアッセイは以下に開示されている：クレム（Clem）ら、Science 254:1388〜90、1991；クルーク（Crook）ら、J．Viro l．67:2168〜74、1993；ラビザデー（Rabizadeh）ら、J．Neurochem．61:2318〜 21、1993、バーンバウム（Birnbaum）ら、J．Virol．68:2521〜8、1994；タレムら、Mol．Cell．Biol．14:5212〜5222、1994。実施例11：トランスジェニック動物の作製 IAPおよびNAIP遺伝子の特徴分析により、相同組換え（ノックアウト生物に関して）またはトランスフェクション（IAPもしくはNAIPの断片、アンチセンス核酸の発現のため、または野生型もしくは変異型のIAPもしくはNAIPの発現増強のため）によって開発しようとするIAPおよびNAIPトランスジェニック動物モデルの作製に必要な情報が得られた。このようなモデルとしては例えばマウスなどの哺乳動物が可能であり、単独または癌誘発性の細胞もしくは薬剤との併用による癌治療法の同定のため、またはこのようなマウスを造伝的に癌を発症しやすいマウスと交配する場合に有用である。好ましいトランスジェニック動物はIAPまたはNAIPを過剰発現し、癌を発症しやすい素因を持つ。このマウスは有望な癌治療法のスクリーニングのために特に有用である。実施例12．IAP蛋白質の発現 IAP遺伝子およびNAIP遺伝子ならびにそれらの断片（すなわちRZF断片）は原核生物および真核生物の両方の細胞種において発現すると考えられる。IAPまたはN AIPの断片がアポトーシスを増強する場合には、その蛋白質は誘導可能なプロモーターの制御下において発現されることが望ましいと考えられる。一般に、IAPおよびNAIP、ならびにそれらの断片は、適切な発現ベクター内に配置されたIAPをコードするcDNA断片またはNAIPをコードするcDNA断片の全体または一部を有する適切な宿主細胞の形質転換によって産生することが可能である。分子生物学の分野における当業者は、組換え蛋白質を産生させるためにさまざまに異なる種類の発現系を用いうることを理解すると考えられる。厳密にどの宿主細胞を用いるかは、癌細胞が好ましいが、本発明にとって本質的ではない。IA P蛋白質の産生には、原核生物の宿主（大腸菌など）を用いてもよく、真核生物の宿主（例えば、ビール酵母菌、Sf21細胞などの昆虫細胞、もしくはCOS-1、NIH 3T3またはヒーラ（Hela）細胞、または他の高増殖性細胞種などの哺乳類細胞）を用いてもよい。これらの細胞は、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）、Rockville、即などから広く人手可能である。アウスユーべル（Ausubel）ら（前記）も参照されたい。形質導入の方法および発現用媒介物（expression vehicle）の選択は、選択される宿主系に依存すると考えられる。形質転換および遺伝子導入の方法は、例えばアウスユーベルら（前記）に記載されており、発現用媒介物は、例えばクロ−ニングベクター：実験マニュアル（Cloning Vector:A Laboratory Manual）（P．H．Pouwel sら、1985，Supp．1987）に提供されているものから選択してもよい。本発明のポリペプチド、特にIAPの短い断片は、化学合成によっても生成することができる（例えば、固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Synthesis）第2版、1984に記載されている方法による。The Pierce Chemical Co.，Rockford ，IL）。ポリペプチドの発現および精製に関するこれらの一般的な技法は、本明細書に記載したように、有用なIAP断片またはその類似体の産生および単離に用いることもできる。実施例13．抗IAP抗体および抗NAIP抗体 IAP特異的抗体およびNAIP特異的抗体を作製するために、IAPコード配列または NAIPコード配列（例えば、アミノ酸180〜276）を、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST；Smithら、Gene 67:31〜40、1988）とのC端融合体として発現させることができる。この融合蛋白質は、グルタチオン-セファロースビーズ上にて精製し、グルタチオンによって溶出させ、トロンビンによって切断し（操作によって作成した切断部位において）、ウサギを首尾よく免疫化するために必要な程度まで精製することができる。一次免疫化はフロイント完全アジュバントによって実施することができ、その後の免疫化はフロイント不完全アジュバントを用いて実施することができる。抗体価の観測は、GST-IAP融合蛋白質およびGST-NAIP 融合蛋白質のトロンビン切断IAP断片を用いるウェスタンブロットおよび免疫沈降分析によって行う。免疫血清には、CNBr-セファロースを連結したIAP蛋白質を用いてアフィニティ精製を行う。抗血清の特異性は、一連の非関連GST蛋白質（G STp53、Rb、HPV-16 E6およびE6-APを含む）およびGST-トリプシン（既知の配列を用いるPCRによって作製されたもの）を用いて決定する。 GST融合蛋白質に対する代替的または付属的な免疫原として、例えばIAPまたは NAIPの比較的ユニークな親水性領域に対応するペプチドを作製し、導入したC端リジンを介してキーホールリンペット・ヘモシアニン（KLH）と連結させることもできる。これらのペプチドのそれぞれに対する抗血清をBSAと共役させたペプチド上で同様にアフィニティ精製し、ペプチド共役体を用いるELISAおよびウェスタンブロット法、ならびに発現したIAPまたはNAIPをGST融合蛋白質として用いるウェスタンブロット法および免疫沈降法によって特異性を検討する。または、上記のIAPまたはNAIP蛋白質および標準的なハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体を作製することもできる（例えば、Kohlerら、Nature 256 ：495、1975；Kohlerら、Eur．J．Immunol．6:511、1976；Kohlerら、Eur．J．I mmunol．6:292、1976；Hammerlingら、モノクローナル抗体およびT細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas）、Elsevier，New Yor k，NY，1981、Ausubelら、前記を参照）。いったん産生されたモノクローナル抗体を、ウェスタンブロット法または免疫沈降分析によって（Ausubelら、前記に記載された方法による）、IAPまたはNAIPの特異的認識に関して検討することもできる。 1つまたはそれ以上のBIRドメインを含む（しかしリングジンクフィンガードメインは含まない）または1つのリングジンクフィンガードメインを含む（しかしB IRドメインは含まない）本明細書に記載されたものなどのIAPもしくはNAIPまたはそれらの断片を認識する抗体は、本発明において有用であると考えられる。それらは例えば、IAPもしくはNAIPの発現レベルを観測するためのイムノアッセイ、または哺乳動物によって産生されるIAPもしくはNAIP（またはそれらの断片）の細胞下配置を決定するために用いることができる。本明細書で説明する26kDa のIAP切断産物（少なくとも1つのBIRドメインを含む）を抑制する抗体は、望ましくない増殖を起こしている細胞におけるアポトーシスの誘導に特に有用であると考えられる。好ましくは、本発明の抗体は、高度に保存された領域内に位置しておらず、ジエームソン（Jameson）およびウルフ（Wolf）のアルゴリズム（CABIOS 4:181，1 988）を用いてペプチド構造プログラム（Genetics Computer Group Sequence An alysis Package，Program Manual for the GCG Package，Version 7，1991）によって示される基準などによる解析などで抗原性を有する可能性が高いと考えられるIAP配列またはNAIP配列を用いて産生される。具体的には、すべてのIAPのBI R1とBIR2との間に見いだされるこれらの領域は以下の通りである:HIAP-1のアミノ酸99からアミノ酸170まで、HIAP-2のアミノ酸123からアミノ酸184まで、およびXIAPまたはm-XIAPのアミノ酸116からアミノ酸133まで。これらの断片は、PCR などの標準的手法によって作製し、pGEX発現ベクターにクローニングすることができる（Ausubelら、前記）。融合蛋白質は大腸菌で発現され、アウスユーベル（Aus ubel）ら（前記）に記載されたように、グルタチオンアガロースアフィニティマトリックスを用いて精製される。IAPに対して非特異的または低親和性の結合を示す抗血清が得られる可能性を極めて少なくするためには、それぞれの蛋白質について2種類または3種類の融合体を作製し、それぞれの融合体を少なくとも2匹のウサギに注入する。抗血清は、一連の連続注入、好ましくは少なくとも3回のブースター注入によって産生される。実施例14：IAPまたはNAIP遺伝子の発現または生物機能を調節する分子の同定 IAPおよびNAIP cDNAは、IAPもしくはNAIPの発現を低下させる、または通常はこれらのポリペプチドによって阻止されているアポトーシスを増強させる分子の同定を容易にする。このような化合物は、例えば、本明細書に記載されるようなものの一つであって、IAPまたはNAIPポリペプチドのレベルの上昇を伴うような癌細胞を破壊するため、または癌細胞の増殖を抑えるための化学療法剤として非常に有用である。 1つの手法においては、候補となる分子を、IAPまたはNAIPのmRNAを発現する細胞を含む培地に種々の濃度で添加する。続いてIAPまたはNAIPの発現を、例えばハイブリダイゼーション用プローブとしてIAPまたはNAIPのcDNAまたはcDNAの断片を用いる標準的なノーザンブロット分析（Ausubelら、前記）によって測定する。候補分子の存在下におけるIAPまたはNAIPの発現レベルを、その他のすべての因子（例えば細胞種および培養条件など）を同一一にした候補分子の非存在下におけるIAPまたはNAIPの発現レベルと比較する。その代わりに、IAPまたはNAIPを介したアポトーシスに対する候補分子の影響を、IAP特異的抗体またはNAIP特異的抗体（例えば、本明細書で説明する抗体）を用いるウェスタンプロット法または免疫沈降法などの標準的なポリペプチド検出法とともに上記の一般的な手法を用いて、蛋白質レベルまたはIAPもしくはNAI Pポリペプチドのポリペプチド断片のレベルで測定してもよい。 IAPまたはNAIPポリペプチドのレベルを調節する化合物は、精製されたもの、もしくは実質的に精製されたものでも、または細胞からの抽出物または上清などの化合物の混合体の1つの成分であってもよい（Ausubelら、前記）。化合物の混合体の1つのアッセイでは、化合物プール（例えば、HPLCまたはFPLCなどの標準的な精製法によって作成されたもの）のサブセットの大きさを段階的に小さくしていきながら、IAPまたはNAIPポリペプチドの発現を調節する単一の化合物または効力のある最小数の化合物が示されるまで、IAPまたはNAIPポリペプチドの発現の検討を続ける。例えばIAPまたはNAIPを介するアポトーシスを増強させる能力によって、IAPまたはNAIPポリペプチドの生物活性を調節する能力に基づいて、化合物をスクリーニングすることもできる。この手法では、候補化合物の存在下におけるアポトーシスの程度と、その非存在トにおけるアポトーシスの程度とを同一条件下で比較する。さらにまた、候補化合物のプールを用いてスクリーニングを開始し、そこから1つまたはそれ以上の有用な調節性化合物を段階的なやり方で単離してもよい。アボトーシス活性は、例えば、本明細書で説明するものなどの任意の標準的アッセイ法によって測定することができる。 IAPまたはNAIPポリペプチドの発現を調節する化合物または該ポリペプチドの生物活性を調節する化合物を検出するためのもう1つの方法は、ある任意のIAPポリペプチドと物理的に相互作用する化合物をスクリーニングすることである。これらの化合物は、当業者に周知のツーハイブリッド系を適合させることによって検出された。これらの系は、転写活性化アッセイを用いて蛋白質の相互作用を検出することができ、キュリス（Gyuris）ら（Cell 75:791-803，1993）およびフィールド（Field）ら（Nature 340:245-246，1989）にその概ねが記載されており、Clontech社（Palo Alto，CA）から商業的に入手可能である。さらに、国際公開公報第95/28497号には、ツーハイブリッド系が記載されており、そこではアポトーシスに関与する蛋白質がBCL-2との相互作用を利用して検出される。IAPまたはNAIPポリペプチドと相互作用する蛋白質およひその他の化合物を同定するために、同様の方法を用いることもできる。 IAPを介した細胞死の調節因子として機能する化合物または分子には、細胞抽出物、哺乳動物の血清、または哺乳類細胞を培養していた増殖培地に存在するようなペプチドおよび非ペプチド分子を含めてもよい。さらに、癌細胞におけるアポトーシスを調節できることが既知の化合物を、IAP分子の発現を制御する能力について試験することができる。表２ IAP遺伝子の特異的RT-PCR増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマー *それぞれのIAP遺伝子に関する図1〜4から決定されたヌクレオチドの位置＆ hiap2aのPCR産物のサイズ＠hiap2bのPCR産物のサイズ実施例15：ヒト卵巣癌のシスプラチン耐性におけるIAP類の役割卵巣上皮癌細胞のアポトーシスはシスプラチン誘発性細胞死に関与することが示されている（Havrileskyら、Obstet．Gynecol．85：1007〜1010、1995；Antho neyら、Cancer Res．56：1374〜1381、1996）。シスプラチン処理後に細胞死に至る事象については不明であるが、シスプラチンの作用には、DNAのストランド間およびストランド内架橋の形成が含まれると考えられている（Shermanら、Sci ence 230：412〜417、1985）。IAP類が卵巣癌細胞におけるアポトーシスの調節に真に重要な要素であるならば、この抗アポトーシス性蛋白質のダウンレギュレーションによって細胞死がもたらされるであろうと予想される。このことを検証するために、シスプラチン感受性ヒト卵巣表面上皮細胞（OV2008）をアデノウイルス性XIAPアンチセンス、アデノウイルス性HIAP-2アンチセンスまたはlacZを有するエンプティベクター（emptyvector）（対照として）に最大60時間感染させ、その時点で細胞形態の変化、アポトーシス性細胞の数、細胞の生存度、および全細胞数を測定した。XIAPおよびHIAP-2の完全長のセンスおよびアンチセンス構築物は、以ドに簡単に説明する通りに調製した。アデノウイルスの構築のために、アミノおよびカルボキシ末端に対応するプライマーを用いるPCRにより、XIAPおよびH IAP-2に関する読み取り枠を増幅した。これらのPCR産物をpCR2.1ベクター（Invi troGen、Carlsbad、CA）中にクローニングし、塩基配列を決定した。続いてEcoR I消化によってORFを切断し、クレノウ断片によって平滑末端化して、SwaIで消化したpAdex1CAwtコスミドDNA中に連結した。パッケージングはプロメガ（Promega ）社（Madison、WI）のコスミドパッケージング抽出物を用いて行い、これを用いて大腸菌に感染させた。コロニーを選択し、ニワトリB-アクチン（CA）プロモーターに対してセンスおよびアンチセンス配向の双方の挿入物の存在に関してスクリーニングした。CsCl精製コスミドDNAを、DNAの両端に結合した末端蛋白質を含む野生型アデノウイルスDNAとともにコトランスフェクトした。コスミドDNAとの相同組換え体のみから感染性アデノウイルスDNAが生じるように、野生型アデノウイルスDNAをNsiIによって切断した。最終的な組換えアデノウイルスは、44, 820bpに挿入物のサイズ（XIAPについては約1,500、HIAP-2については約1,800）を加えた大きさの直鎖状の2本鎖ゲノムを含む。シスプラチン感受性（OV2008）およびシスプラチン耐性（C13）の卵巣上皮癌細胞を、アンチセンスXIAPもしくはHIAP-2 cDNAを含むアデノウイルス［感染多重度（MOI）＝5（1×）；M01＝10（2×）］またはベクター（対照）で60分間感染させた。続いて細胞をトリプシン処理し、血球計算法によって全細胞数を決定し、細胞の生存度をトリパンブルー色素排除試験によって決定した。トリパンブルー色素排除試験による評価では、OV2008細胞のXIAPアンチセンスへの感染により、死細胞の比率は対照（ベクター、p＜0.001）に比べて有意に増加した（図25 、左上の図面）。OV2008細胞のHIAP-2アンチセンスへの感染でも死細胞の比率のわずかな増加が認められたが、これは統計学的に有意ではなかった（図25、左上の図面；p＞0.05）。OV2008細胞のシスプラチン耐性変異株（C13）のXIAPアンチセンスへの感染でも程度はより低いものの細胞の生存度は有意に低下したが、Hi sp-2アンチセンスではこれはみられなかった（図25、右上の図面）。XIAPアンチセンスによってOV2008およびC13の双方に誘発された細胞死は全細胞数の減少も伴っており、アンチセンス感染の効果はシスプラチン感受性細胞の方がより顕著であった（図25、下の2点の図面）。これに加えて、OV2008のアデノウイルス性XIAPアンチセンスへの60時間の感染により、図26に示されている通り、XIAP蛋白質含有量は減少し、広範な細胞剥離が誘発された（左側の「b」の写真における黒矢印）。核断片化（図26B、写真「 b」および「d」における白矢印）およびアポトーシス性細胞の数の増加、ならびにアポトーシス小休の存在量（図26B：写真「b」および「d」を「a」および「c 」と比較）も、アデノウイルス性XIAPアンチセンスによる60分間の感染後のOV20 08細胞において誘発される。核染色に関しては、細胞を4％ホルマリン（PBS中、室温、10分間）中に固定し、PBSで洗った。洗浄した細胞を次にヘキスト染色溶液（0.1μgヘキスト33248／PBS 1ml、10分間）中に再懸濁し、再度洗い、顕微鏡検査のためにスライドグラス上に滴下した。核染色を観察し、ツァイス(Zeiss) 蛍光顕微鏡を用いて写真を撮影した。算定時の偏差を避けるために無作為に選択した視野および複数の写真用スライドグラスを用いて、典型的なアポトーシス性の核形態を有する細胞を同定および算定した。偏差の解析から、アンチセンスにはXIAP蛋白質の含有量（p＜0.001；図26Dおよび26E）およびアポトーシス（p＜0 .001；図26C）に対して極めて有意な効果があることが示された。事実、高力価のアデノウイルス性アンチセンス（MOI＝10（2×））によるこれらの細胞の感染では、アポトーシスを起こす細胞の数がさらに増加した（図26C）。 IAPの発現がシスプラチンの化学療法的作用の標的であるか否かを検討するために、シスプラチンの非存在下および存在下（10〜30μM）でOV2008細胞を24時間培養し、アポトーシスならびにXIAPおよびHIAP-2の発現をそれぞれ形態学的およびウエスダンブロット解析によって評価した。アデノウイルス性XIAPアンチセンスによる感染と同じく、シスプラチンの存在は、OV2008細胞において細胞体積の減少、クロマチン凝縮および核断片化（図27A、左の2点の写真）ならびにアポトーシス性の低分子量DNAの断片化（図27B）を含むアポトーシスの形態学的特徴を誘発し、さらにIAP発現の低下を伴っていた（図28Aおよび28B）。シスプラチンに対する反応によるアポトーシス性細胞数の増加は濃度依存的でもあり、シスプラチン濃度が10μMでも有意であった（50％に対して2％；p＜0.05）（図27C）。図28Aおよび28Bに示されている通り、XIAPおよびHIAP-2は両方ともシスプラチン感受性のヒト卵巣表面上皮癌細胞系OV2008に存在し（蛋白質サイズはそれぞれ 55kDaおよび68kDa）、それらの発現はシスプラチンによって濃度依存的な様式でダウンレギュレートされた。XIAPの方がこの抗癌剤に対する反応性がより強いように思われる。XIAP蛋白質の含有量は20μMシスプラチンの存在下ではほぼ80％減少したが（p＜0.01）、HIAP-2蛋白質の含有量の減少はシスプラチンによって抑制されなかった（図28Aおよび28B）。 OV2008のシスプラチン耐性変異株であるC13におけるXIAPおよびHIAP-2の発現はシスプラチンによって抑制されず（図28Aおよび28B）、アポトーシスに特徴的な形態学的および生化学的変化は検出されなった（図27Aおよび27B）。C13におけるXIAPおよびHIAP-2の含有量はこの抗癌剤が存在する方が多いように思われたが、この差は統計学的に有意ではなかった（p＞0.05）。IAP発現の経時的推移に関する実験では、OV2008におけるシスプラチンによるXIAPおよびHIAP-2蛋白質レベルの抑制が時間依存的であることが示され、培養12〜24時間の範囲で有意な低下が認められた（図29Aおよび29B）。C13細胞におけるXIAPおよびHIAP-2の発現は、処理期間にかかわらず、シスプラチンによる影響を受けなかった。 OV2008およびC13細胞で認められたXIAPの反応がこの一対の細胞系に固有であるか否かを明らかにするために、もう1つのシスプラチン感受性卵巣表面上皮癌細胞系（A2780s）およびそのシスプラチン耐性変異株（A2780cp）におけるXIAP およびHIAP-2蛋白質の含有量に対するインビトロでのシスプラチンの影響を検討した（図30Aおよび30B）。興味深いことに、感受性および耐性細胞のいずれにおいてもHIAP-2の発現はシスプラチン（30μM；図30B）の存在によって有意の変化を受けなかったが、この化学療法薬の存在下におけるXIAP蛋白質の含有量はA278 0sでは減少し（OV2008細胞と同じ）、A2780cpでは有意な変化がみられなかった( C13細胞と同じ）。以上を総合すると、これらのデータから、卵巣癌細胞のシスプラチンに対するアポトーシス反応は化学療法薬がXIAP発現をダウンレギュレートする能力と関連すると思われること、およびHIAP-2のシスプラチン誘発性アポトーシスにおいてほとんどまたは全く役割を果たしていないことが示唆される。 XIAPの発現が真にヒト卵巣表面上皮癌の化学療法耐性における重要な決定因子であるか否かを明らかにするために、アデノウイルス性XIAPセンス感染後のOV20 08細胞におけるXIAP蛋白質の含有量およびアポトーシスに対するシスプラチンの影響を調べた。シスプラチンはエンプティベクター（図31Cおよび31D、ベクター＋シスプラチン）に感染したOV2008細胞におけるXIAP蛋白質の含有量を減少させたが、インビトロでの化学療法剤による処理の前に48時間のアデノウイルス性センスXIAP cDNAによって蛋白質を過剰発現させると、シスプラチンの影響はXIAP 蛋白質の発現に対してのみならす（図31Cおよび31D）、アポトーシス性の核断片化（図31A、「d」を「c」と比較）およびアポトーシス性細胞の数に対しても減弱し（図31B)、このことからXIAPがヒト卵巣上皮癌の化学療法耐性における重要な要素であることが示唆される。卵巣上皮癌細胞系を用いたインビトロ試験から、ヒト卵巣癌でのアポトーシスおよび腫瘍進行の制御におけるIAP類、特にXIAPの重要な役割が強く示唆された。IAP類が真に卵巣癌において発現されており、それ故に臨床的関連があるか否かを明らかにするために、それぞれにヒトXIAPおよびHIAP-2に対するポリクローナル抗体（ヒトXIAPおよびHIAP-2GST融合蛋白質による免疫化によってウサギポリクローナル抗XIAPおよびHIAP-2抗体を調製した）を用いて、減量手術時に患者から病理標本として採取したヒト卵巣表面上皮腫瘍におけるXIAPおよびHIAP-2の免疫局在性を調べた（それぞれ図32Cおよび32D）。さらに、これらのIAP類の発現が上皮細胞アポトーシスおよび／または増殖に関連するか否か、およびその様式を検討するために、インサイチューTUNEL（Gavrieliら、J．Cell．Biol．119 ：493〜501、1992）およびPCNA（増殖細胞核抗原：DNAポリメラーゼαの補助蛋白質であり、G1／S間期に高発現される）に対する免疫組織化学検査を行った。卵巣上皮腫瘤は高度の細胞不均一性を呈し（図32A）、PCNA陽性細胞は腫瘍切片の核全体にわたって明瞭に認められた（図32B）。一般に細胞の大部分はTUNEL陰性であり（図32A）、XIAPおよびHIAP-2の発現は細胞の増殖状態と強く相関しており、上皮細胞の死滅とは負の相関がみられた。細胞質または核周囲領域に特異的に局在するXIAPおよびHIAP-2の免疫反応性（それぞれ図32Cおよび32D）は、増殖活動性細胞（PCNA陽性）で最も高く、腫瘍標本に時に認められるアポトーシス性細胞（TUNEL陽性）では低いか全く認められなかった。実施例16：他の癌治療法癌細胞の増殖速度が高い場合には、抗癌治療計画において、目的とする特定の癌の増殖をうまく抑制すると思われる抗癌剤による治療を開始することが好ましい。このような薬剤を検出するための1つの方法は、目的とする癌から増殖性細胞を採取し、個々のIAPまたはNAIPポリペプチドのそれぞれの発現レベルおよび／または生物活性レベルを測定し、これらのレベルを、罹患していない個体から得た同様の細胞種におけるこれらのポリペプチドのレベルと比較することである。例えば、ヒト女性個体に乳癌（または癌性の疑いのある新生物）があれば、例えば癌の生検の際などに癌から細胞を回収し、それを単離して、必要に応じて培養系で増殖させることができる。続いて細胞を、細胞内での全てのIAPおよびNAI Pポリペプチドの発現レベルおよび／または生物活性レベルに関して分析することができる。増殖性細胞からのこれらのペプチドの発現レベルおよび／または生物活性レベルは、ヒト女性個体の正常な健康細胞からのこれらのポリペプチドの発現レベルおよび／または生物活性レベルと比較することができる。好ましくは、この比較は、同一個体の罹患細胞（すなわち、異常増殖性の）と健常細胞（例えば、検討しようとする個体の健康な乳房組織から採取した細胞）との間で行うことが好ましい。罹患細胞における各ポリペプチドの発現レベルおよび／または生物活性レベルを、健常細胞における対応物と比較する。IAPまたはNAIPポリペプチドのいずれか（またはすべて）に増加があればそれが検出される。その後は、増加している特定のIAPまたはNAIPポリペプチドのそれぞれの発現レベルまたは生物活性レベルを低下させる化合物により、癌を治療する。このような化合物を同定するための方法は上記に説明している（例えば実施例14を参照されたい）。このような分析および治療を受ける個体は、抗癌治療薬による治療をすでに受けている可能性があることは理解されると思われる。また、IAPおよびNAIPポリペプチドの発現レベルおよび／または生物活性レベルを標的とすることに加えて、抗癌化合物はBCL-2などの他のアポトーシス抑制性ポリペプチドに関するこれらのレベルを標的としてもよい。例えば、健康な乳房細胞におけるXIAPレベルと比べてXIAPレベルが上昇している増殖性細胞を持つ乳癌を有する個体には、ある化合物（例えばシスプラチン）に加えて、もう1つのIAPポリペプチドを標的とする化合物、またはNAIPポリペプチドもしくはBCL-2などの別の種類のアポトーシス抑制性ポリペプチドを標的とする化合物を用いて治療を行うことができる。 IAPおよびNAIPポリペプチドの発現レベルを明らかにする1つの迅速な方法は、これらのポリペプチドのそれぞれと特異的に結合する抗体を用いるELISA解析である。その他の方法には、定量的PCRおよび本明細書に記載される種々のアポトーシス解析法が含まれる。実施例17．蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）によるXIAP、 HIAP-1 およびHIAP-2の染色体XQ25および11Q22-23への割り当て蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）を用いてXIAP、HIAP-1およびHIAP-2の染色体上の位置を同定した。上記のようにして、合計101個の分裂中期展開物をXIAPプローブを用いて検討した。分析した細胞の74％では、Xq25染色体の相同体の1つまたは両方のいずれかに対称的な蛍光信号が認められた。HIAP-1およびHIAP-2のプローブで染色した後に56個の細胞を分析したところ、検討した細胞の83％で11q22-23領域に対となる信号が認められた。XIAP遺伝子はXq25にマッピングされ、HIAP-1およびHIAP-2 遺伝子は11q22および11q23バンドの境界部にマッピングされた。以上の実験により、XIAP遺伝子の位置が染色体Xq25上にあることが裏づけられた。これまでのところ、いずれの悪性腫瘍についてもバンドXq25が関与する高度に一貫した染色体異常は報告されていない。しかし、この領域内の欠失は、伴性劣性リンパ増殖症候群を含む多数の免疫系欠損症と関連している（Wuら、Genomi cs 17:163〜170、1993）。小児白血病の50％を超える割合で、表現型とは無関係にバンド11q23の細胞遺伝学的異常が同定されている（Martinez-Climetら、Leukemia 9:1299〜1304、19 95）。MLL遺伝子（混合連鎖白血病（mixed lineage leukemia）または骨髄系リンパ球性白血病；Ziemin Van der Poelら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:107 35〜10739）の再配列は、11q23の転座を有する症例の80％以上で検出されているが、MLL遺伝子以外の領域が明らかに再配列に関与している患者も報告されている（Kobayashiら、Blood 82:547〜551、1993）。このため、IAP遺伝子はBcl-2のパラダイムに従うと考えられ、したがって癌の形質転換において重要な役割を果たすと考えられる。参照としての組み入れ以下の文書および本明細書で引用されるすべての参考文献は、参照として本明細書に組み入れられる：1995年8月4日に提出された米国特許出願第08／511,485 号、1995年12月22目に提出された米国特許出願第08／576,956号、1996年8月5日に提出されたPCT／IB96／01022号、1996年4月26日に提出された来国特許出願第6 0／017,354号、1996年11月15日に提出された米国特許出願第60／030,931号、199 6年11月14目に提出された米国特許出願第60／030,590号、1996年11月19目に発行された米国特許第5,576,208号、および1996年1月19目に提出されたUK9601108.5 号からの優先権を主張する1997年1月17日に提出されたPCT出願IB97／00142号。その他の態様その他の態様において、本発明は、哺乳類IAPポリペプチド（図1〜6、配列番号：3〜14）と実質的に同一な任意の蛋白質の使用を含む。このような相同体は、その他の実質的に純粋な天然の哺乳類IAP蛋白質のほか、対立遺伝子変異体、天然変異体、誘導変異体、蛋白質をコードしておりかつ高度に厳密な条件、または好ましさは落ちるが厳密性の低い条件（例えば、少なくとも40ヌクレオチド長のプローブとともに40℃で2X SSCにより洗浄）において図1〜6のIAPのDNA配列（配列番号：3〜14）とハイブリダイズするDNA配列、およびIAPを指向する抗血清と特異的に結合する蛋白質を含む。また、この用語は、IAPの一部を含むキメラ蛋白質を含む。本発明はさらに、任意の天然のIAPの類似体の使用を含む。類似体は天然のIAP とは、アミノ酸配列の違い、翻訳後修飾のいずれかまたはその両方の点で異なる。一般に本発明の類似体は、天然のIAPの配列の全体または一部と少なくとも85 ％、より好ましくは90％、最も好ましくは95％またはさらに99％の同一性を示す。比較する配列の長さは、少なくとも15アミノ酸残基であり、好ましくは25アミノ酸残基、より好ましくは35アミノ酸残基を上回る。修飾には、インビボおよびインビトロでのポリペプチドの化学的誘導体化、例えばアセチル化、カルボキシル化、リン酸化、またはグリコシル化などが含まれる。このような修飾は、ポリペプチドの合成もしくはプロセッシングの間、または単離された修飾酵素による処置後にも起こる。また、類似体は、天然のIAPとは一次配列に変化を生じている点でも異なる。これらには、天然型および誘導型の両方（例えば、Sambrook， Frit schおよびManiatis、分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）第2版、CSH Press、1989またはAusubelら、前記に記載された方法による、放射線照射もしくはエタンメチルスルホネート曝露によるランダム変異誘発または部位特異的変異誘発によって生じたもの）による遺伝的変異体が含まれる。また、環状化ペプチド分子、および例えばD-アミノ酸またはβもしくはγアミノ酸などの非天然型もしくは合成アミノ酸などの、L-アミノ酸以外の残基を含む類似体も含まれる。完全長のポリペプチドのほかに、本発明にはIA Pの断片も含まれる。本明細書で用いる「断片」という用語は、少なくとも20個の隣接アミノ酸、好ましくは30個の隣接アミノ酸、より好ましくは50個の隣接アミノ酸、最も好ましくは60から80個またはそれ以-Lの隣接アミノ酸を意味する。 IAPの断片は当業者に周知の方法によって作製することができるが、通常の蛋白質プロセッシング（例えば、新生ポリペプチドからの生物活性に必要でないアミノ酸の除去、または選択的mRNAスプライシングもしくは選択的蛋白質プロセッシング過程によるアミノ酸の除去）によって得られたものでもよい。本発明の方法に従って用いられる好ましい断片または類似体は、診断対象となる試料におけるIAPの核酸またはアミノ酸配列の特異的な検出を容易にするものである。この目的に特に有用なIAP断片には、表2に示したアミノ酸断片が無制限的に含まれる。本発明の方法には、種々の方法によって調製された抗体を用いることができる。例えば、ポリクローナル抗体の産生を誘発させるために、動物にIAPもしくはN AIPポリペプチド、またはその抗原性断片を投与することができる。または、本明細書で記載されるように使用される抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて調製されるモノクローナル抗体であってもよい（例えば、Kohlerら、Nature 256：49 5-497、1975；Kohlerら、Eur．J．Immunol．6：511-519、1976；Kohlerら、Eur ．J．Immunol．6：292〜295、1976；Hammerlingら、モノクローナル抗体およびT 細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridoma）、Elsevi er、NY、1981；HalowおよびLane、抗体：実験室マニュアル（Antibodies:A Labo ratory Manual）、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY、 1988）。本発明は、ヒトまたはマウスのIAPもしくはNAIPポリペプチドまたはその断片と特異的に結合する抗体の使用を特徴とする。特に、本発明は「中和」抗体を特徴とする。「中和」抗体とは、IAPまたはNAIPポリペプチドの任意の生物活性、特にIAP類がアポトーシスを抑制する能力に障害を及ぼす抗体を意味する。中和抗体は、IAPポリペプチドがアポトーシスを抑制する能力を、好ましくは50％、より好ましくは70％、最も好ましくは90％またはそれ以上低下させる。中和抗体の評価には、本明細書に記載されるものを含む、参照として組み入れられるものおよび当技術分野におけるものによる、アポトーシスの任意の標準的な解析法を用いることができる。本来のモノクローナル抗IAP抗休およびポリクローナル抗IAP抗体に加えて、本発明は種々の遺伝的に操作された抗体、ヒト化抗体ならびにF(ab')2、Fab'、Fab 、FvおよびsFv断片を含む抗体断片の使用を特徴とする。抗体は、当技術分野で知られた方法によってヒト化することができ、例えば所望の結合特異性を持つモノクローナル抗体を商業的にヒト化することができる(Scotgene、Scotland；Oxf ord Molecular、Palo Alto、CA）。また、トランスジェニック動物で発現されるものなどの完全なヒト抗体も本発明の特徴である（Greenら、Nature Genetics 7 :13〜21、1994）。ラドナー（Ladner）（米国特許第4,946,778号および第4,704,692号）は、単一ポリペプチド鎖抗体を調製するための方法を記載している。ワード（Ward）ら（ Natuve 341：544〜546，1989）は、重鎖可変領域の調製を記載しており、高い抗原結合親和性を持つそれらを「単一領域抗体」と命名している。マッカファーティー（MacCafferty）ら（Nature 348：552〜554，1990）は、完全な抗体V領域が fdバクテリオファージの表面に提示され、このファージが抗原と特異的に結合し、ファージのごく一部（100万個のうち1個）をアフィニティクロマトグラフィーによって単離しうることを示している。ボス（Boss）ら（米国特許第4,816,397 号）は、免疫グロブリン、および単一宿主細胞において少なくとも重鎖および軽鎖の可変領域を含んでいて免疫機能を持つその断片を産生するためのさまざまな方法を記載している。キャビリー（Cabilly）ら（米国特許第4,816,567号）はキメラ型抗体を調製するための方法を記載している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者バードステファンカナダ国オンタリオ州オタワジュリアンアベニュー 20 (72)発明者トゥサンベンジャミンカナダ国オンタリオ州オタワカーリングアベニュー 1053 (72)発明者プラットクリスティンカナダ国オンタリオ州ヌピーンロングゲイトコート 31

Claims

【特許請求の範囲】１．増殖性疾患を有する哺乳動物からの細胞におけるアポトーシスを増強させるための方法であって、該細胞へのIAPポリペプチドまたはNAIPポリペプチドの生物活性を抑制する化合物の投与を含み、該化合物が該細胞におけるアポトーシスを増強するために十分な量で該細胞に投与される方法。２．細胞が増殖性疾患において増殖性である、請求項1記載の方法。３．生物活性がポリペプチドの発現レベルであるか、該生物活性がポリペプチドをコードするmRNA分子の発現レベルであるか、または該生物活性がアポトーシス抑制活性である、請求項1記載の方法。４．発現レベルが細胞中に存在するポリペプチドの量を解析することによって測定される、請求項3記載の方法。５．ポリペプチドがHIAP-1、m-HIAP-1、HIAP-2、m-HIAP-2、XIAPおよびm-XIAPからなる群より選択される、請求項1記載の方法。６．ポリペプチドがNAIPである、請求項1記載の方法。７．ポリペプチドがXIAPである、請求項1記載の方法。８．ポリペプチドがHIAP-1である、請求項1記載の方法。９．ポリペプチドがHIAP-2である、請求項1記載の方法。 10．化合物がIAPもしくはNAIP依存性抗アポトーシス経路の負の調節因子であるか、該化合物がリンダジンクフィンガーを含んでいて2つを上回る数のBIRドメインを持たない該IAPポリペプチドの断片であるか、該化合物が該IAPポリペプチドのリングジンクフィンガードメインをコードする核酸分子であるか、該化合物が該IAPポリペプチドもしくは該NAIPポリペプチドの切断を阻止する化合物であるか、該化合物が該IAPポリペプチドもしくは該NAIPポリペプチドと特異的に結合する精製抗体もしくはその断片であるか、該化合物がリボザイムであるか、または該化合物が、該IAPポリペプチドもしくは該NAIPポリペブチドをコードする核酸配列のコード鎖に相補的な核酸配列を有するアンチセンス核酸分子である、詰求項1記載の方法。 11．切断が細胞内で少なくとも20％減少する、請求項10記載の方法。 12．抗体がIAPポリペプチドまたはNAIPポリペプチドのBIRドメインと結合する、請求項10記載の方法。 13．IAPポリペプチドまたはNAIPポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7、配列番号：9、配列番号：11、配列番号：13 の塩基配列、またはNAIPの核酸配列と約50％またはそれ以上の同一性を有する、請求項10記載の方法。 14．アンチセンス核酸分子がIAPポリペプチドまたはNAIPポリペプチドをコードする核酸配列のレベルを少なくとも20％低下させ、該レベルが細胞の細胞質内で測定される、請求項10記載の方法。 15．アンチセンス核酸分子がウイルスベクターによりコードされる、請求項10記載の方法。 16．アンチセンス核酸分子が導入遺伝子によってコードされる、請求項10記載の方法。 17．哺乳動物がヒトまたはマウスである、請求項1記載の方法。 18．増殖性疾患が癌である、請求項1記載の方法。 19．癌が、卵巣、乳房、膵臓、リンパ節、皮膚、血液、肺、脳、腎臓、肝臓、鼻咽頭腔、甲状腺、中枢神経系、前立腺、結腸、直腸、子宮頸部、および子宮内膜からなる群より選択される組織中に存在する、請求項18記載の方法。 20．下記の段階を含む、哺乳動物における増殖性疾患または増殖性疾患の可能性が高いことを検出するための方法： (a)約18ヌクレオチド長を超えるIAPまたはNAIP核酸分子と、該疾患において増殖性であって組織由来の細胞である該哺乳動物細胞の核酸調製物とを接触させる段階、および (b)対照と比較して該哺乳動物の該細胞からの量が増加していることによって該哺乳動物が増殖性疾患を有するか、または発症する可能性が高いことが示される、該分子とハイブリダイズする該哺乳動物の該細胞からの核酸の量を測定する段階。 21．下記の段階をさらに含む、請求項20記載の方法： (a)対照が第2の哺乳動物の組織由来の細胞であって該第2の哺乳動物が増殖性疾患を持たない、前記分子と該対照の核酸調製物とを接触させる段階、および (b)該分子とハイブリダイズする該哺乳動物の該細胞由来の核酸の量が該対照の核酸の量と比較して増加していることによって該哺乳動物が増殖性疾患を有するか、または発症する可能性が高いことが示される、該対照の核酸の量を測定する段階。 22．下記の段階を含む、請求項20または21記載の方法： (a)IAPまたはNAIP核酸分子のある領域と同一またはそれに相補的な配列を有する一対のオリゴヌクレオチドを提供する段階、 (b)ポリメラーゼ連鎖反応を介した核酸増幅に適した条件下で該一対のオリゴヌクレオチドと該核酸とを混合する段階、および (c)該増幅された核酸またはその断片を単離する段階。 23．増幅が逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる、請求項22記載の方法。 24．逆転写ポリメラーゼ連鎖反応がRACEである、請求項23記載の方法。 25．方法によって配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7、配列番号：9、配列番号：11、配列番号：13のヌクレオチド配列またはNAIPの核酸配列との同一性が約50％またはそれ以上である核酸の測定が提供される、請求項20、21または22記載の方法。 26．ヌクレオチド配列が配列番号：3のヌクレオチド配列と約50％またはそれ以上の同一性を有する核酸が測定される、請求項20、21または22記載の方法。 27．ヌクレオチド配列が配列番号：5のヌクレオチド配列と約50％またはそれ以上の同一性を有する核酸が測定される、請求項20、21または22記載の方法。 28．ヌクレオチド配列が配列番号：7のヌクレオチド配列と約50％またはそれ以上の同一性を有する核酸が測定される、請求項20、21または22記載の方法。 29．ヌクレオチド配列がNAIPのヌクレオチド配列と約50％またはそれ以上の同一性を有する核酸が測定される、請求項20、21または22記載の方法。 30．哺乳動物における増殖性疾患またはその疾患を発症する可能性が高いことを検出するための方法であって、該哺乳動物の試料におけるIAPポリペプチドまたはNAIPポリペプチドの生物活性レベルの測定を含み、対照哺乳動物からの試料と比較して該IAPポリペプチドまたは該NAIPポリペプチドのレベルが増加していることにより、該哺乳動物が該疾患を有するか、または該疾患を発症する可能性が高いことが示される方法。 31．試料が、前記疾患において増殖性である哺乳動物からの細胞であって組織由来である細胞を含む、請求項30記載の方法。 32．対照動物からの前記試料が組織由来の細胞であって健常細胞からなる、請求項31記載の方法。 33．哺乳動物および対照哺乳動物が同一である、請求項32記載の方法。 34．生物活性がポリペプチドの発現レベルであるか、該生物活性がポリペプチドをコードするmRNA分子の発現レベルであるか、または該生物活性がアポトーシス抑制活性である、請求項30記載の方法。 35．発現レベルが細胞に存在するポリペプチドの量を解析することによって測定される、請求項34記載の方法。 36．ポリペプチドがHIAP-1、m-HIAP-1、HIAP-2、m-HIAP-2、XIAPおよびm-XIAPからなる群より選択される、請求項30記載の方法。 37．ポリペプチドがNAIPである、請求項30記載の方法。 38．ポリペプチドがXIAPである、請求項30記載の方法。 39．ポリペプチドがHIAP-1である、請求項30記載の方法。 40．ポリペプチドがHIAP-2である、請求項30記載の方法。 41．増殖性疾患において増殖性である罹患細胞におけるアポトーシスを増強させる化合物を同定するための方法であって、IAPポリペプチドまたはNAIPポリペプチドを過剰発現する細胞を候補化合物に曝露させることを含み、該ポリペプチドの生物活性レベルの低下によって該増殖性疾患において増殖性である該罹患細胞におけるアポトーシスを増強させる化合物の存在が示される方法。 42．下記の段階を含む、増殖性疾患において増殖性である罹患細胞におけるアポトーシスを増強させる化合物を同定するための方法： (a)IAPポリペプチドをコードする核酸分子またはNAIPポリペプチドをコードする核酸分子を含む細胞であって、該核酸分子が該細胞内で発現される細胞を提供する段階、および (b)候補化合物と接触していない細胞と比較して該候補化合物と反応した該細胞内での該IAPポリペプチドまたは該NAIPポリペプチドの生物活性レベルが低下していることによって該増殖性疾患において増殖性である該罹患細胞におけるアポトーシスを増強させる化合物の存在が示される、該細胞と該候補化合物とを接触させ該細胞内での該IAPポリペプチドまたは該NAIPポリペプチドの生物活性レベルを観測する段階。 43．細胞が増殖性疾患に関連したp53ポリペプチドをさらに発現する、請求項42 記載の方法。 44．生物活性がポリペプチドの発現レベルであるか、該生物活性がポリペプチドをコードするmRNA分子の発現レベルであるか、または該生物活性がアポトーシス抑制活性である、請求項41または42記載の方法。 45．発現レベルが細胞に存在するポリペプチドの量を解析することによって測定される、請求項44記載の方法。 46．ポリペプチドがHIAP-1、m-HIAP-1、HIAP-2、m-HIAP-2、XIAPおよびm-XIAPからなる群より選択される、請求項41または42記載の方法。 47．ポリペプチドがNAIPである、請求項41または42記載の方法。 48．ポリペプチドがXIAPである、請求項41または42記載の方法。 49．ポリペプチドがHIAP-1である、請求項41または42記載の方法。 50．ポリペプチドがHIAP-2である、請求項41または42記載の方法。 51．下記の段階を含む、増殖性疾患と診断された哺乳動物の予後判定のための方法： (a)該哺乳動物由来の組織から試料を単離する段階、および (b)該試料におけるレベルの上昇が該哺乳動物の予後が不良であることの指標となる、対照試料と比較して該試料のIAPポリペプチドまたはNAIPポリペプチドの生物活性レベルが上昇しているか否かを判定する段階。 52．試料に増殖性疾患において増殖性である細胞が含まれ、対照試料が組織由来であって健常細胞からなる、請求項51記載の方法。 53．試料および対照試料が哺乳動物に由来するものである、請求項52記載の方法。 54．試料が増殖性疾患に関連したp53ポリペプチドを発現する細胞をさらに含む、請求項51記載の方法。 55．生物活性がポリペプチドの発現レベルであるか、該生物活性がポリペプチドをコードするmRNA分子の発現レベルであるか、または該生物活性がアポトーシス抑制活性である、請求項51記載の方法。 56．発現レベルが細胞に存在するポリペプチドの量を解析することによって測定される、請求項55記載の方法。 57．ポリペプチドがHIAP-1、m-HIAP-1、HIAP-2、m-HIAP-2、XIAPおよびm-XIAPからなる群より選択される、請求項51記載の方法。 58．ポリペプチドがNAIPである、請求項51記載の方法。 59．ポリペプチドがXIAPである、請求項51記載の方法。 60．ポリペプチドがHIAP-1である、請求項51記載の方法。 61．ポリペプチドがHIAP-2である、請求項51記載の方法。 62．レベルが試料中に存在する64kDa未満のIAPペプチドの量を測定することによって解析される、請求項51記載の方法。 63．下記の段階を含む、増殖性疾患と診断された哺乳動物の予後判定のための方法： (a)該哺乳動物から核画分を有する試料を単離する段階、および (b)該試料の該核画分中のIAPポリペプチドと特異的に結合する抗体またはNAIP ポリペプチドと特異的に結合する抗体によって認識されるポリペプチドの量を、対照試料の量と対比して測定する段階であって、該試料からの該量が増加していることにより該哺乳動物の予後が不良であることが示される段階。 64．試料が哺乳動物の組織由来のものであり、該試料に増殖性疾患において増殖性である細胞が含まれ、対照試料が組織由来であって健常細胞からなる、請求項 63記載の方法。 65．試料および対照試料が哺乳動物に由来するものである、請求項64記載の方法。 66．生物活性がポリペプチドの発現レベルであるか、該生物活性がポリペプチドをコードするmRNA分子の発現レベルであるか、または該生物活性がアポトーシス抑制活性である、請求項63記載の方法。 67．発現レベルが細胞に存在するポリペプチドの量を解析することによって測定される、請求項66記載の方法。 68．ポリペプチドがHIAP-1、m-HIAP-1、HIAP-2、m-HIAP-2、XIAPおよびm-XIAPからなる群より選択される、請求項63記載の方法。 69．ポリペプチドがNAIPである、請求項63記載の方法。 70．ポリペプチドがXIAPである、請求項63記載の方法。 71．ポリペプチドがHIAP-1である、請求項63記載の方法。 72．ポリペプチドがHIAP-2である、請求項63記載の方法。 73．量が免疫学的方法によって測定される、請求項63記載の方法。 74．下記の段階を含む、増殖性疾患と診断された哺乳動物の治療のための方法： (a)該増殖性疾患において増殖性である細胞が含まれる、該哺乳動物の組織由来の第1の試料におけるIAPまたはNAIPポリペプチドの量を測定する段階、 (b)健常細胞からなる、該組織由来の第2の試料における該ポリペプチドの量を測定する段階、 (c)該第2の試料における該ポリペプチドの量と対比させた該第1の試料における該ポリペプチドの量の増加を検出する段階、および (d)該ポリペプチドの生物活性を低下させる化合物によって該哺乳動物を治療する段階。 75．第1の試料および第2の試料が哺乳動物由来のものである、請求項74記載の方法。 76．生物活性がポリペプチドの発現レベルであるか、該生物活性がポリペプチドをコードするmRNA分子の発現レベルであるか、または該生物活性がアポトーシス抑制活性である、請求項74記載の方法。 77．発現レベルが細胞に存在するポリペプチドの量を解析することによって測定される、請求項76記載の方法。 78．ポリペプチドがHIAP-1、m-HIAP-1、HIAP-2、m-HIAP-2、XIAPおよびm-XIAPからなる群より選択される、請求項74記載の方法。 79．ポリペプチドがNAIPである、請求項74記載の方法。 80．ポリペプチドがXIAPである、請求項74記載の方法。 81．ポリペプチドがHIAP-1である、請求項74記載の方法。 82．ポリペプチドがHIAP-2である、請求項74記載の方法。 83．アポトーシス増強のための医薬晶の製造を目的とする、IAPポリペプチドまたはNAIPポリペプチドの生物活性を低下させる化合物の使用。 84．生物活性がポリペプチドの発現レベルであるか、該生物活性がポリペプチドをコードするmRNA分子の発現レベルであるか、または該生物活性がアポトーシス抑制活性である、請求項83記載の使用。 85．発現レベルが細胞に存在するポリペプチドの量を解析することによって測定される、請求項84記載の使用。 86．ポリペプチドがHIAP-1、m-HIAP-1、HIAP-2、m-HIAP-2、XIAPおよびm-XIAPからなる群より選択される、請求項83記載の使用。 87．ポリペプチドがNAIPである、請求項83記載の使用。 88．ポリペプチドがXIAPである、請求項83記載の使用。 89．ポリペプチドがHIAP-1である、請求項83記載の使用。 90．ポリペプチドがHIAP-2である、請求項83記載の使用。 91．増殖性疾患の存在または増殖性疾患を発症する可能性が高いことに関して哺乳動物を診断するためのキットであって、IAPポリペプチドまたはNAIPポリペプチドをコードする核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むキット。 92．ポリペプチドがHIAP-1、m-HIAP-1、HIAP-2、m-HIAP-2、XIAPおよびm-XIAPからなる群より選択される、請求項91記載のキット。 93．ポリペプチドがNAIPである、請求項91記載のキット。 94．ポリペプチドがXIAPである、請求項91記載のキット。 95．ポリペプチドがHIAP-1である、請求項91記載のキット。 96．ポリペプチドがHIAP-2である、請求項91記載のキット。 97．IAPポリペプチドまたはNAIPポリペプチドの生物活性レベルが上昇しているトランスジェニック哺乳動物。 98．生物活性がポリペプチドの発現レベルであるか、該生物活性がポリペプチドをコードするmRNA分子の発現レベルであるか、または該生物活性がアポトーシス抑制活性である、請求項97記載のトランスジェニック哺乳動物。 99．発現レベルが細胞に存在するポリペプチドの量を解析することによって測定される、請求項98記載のトランスジェニック哺乳動物。 100．ポリペプチドがHIAP-1、m-HIAP-1、HIAP-2、m-HIAP-2、XIAPおよびm-XIAP からなる群より選択される、詰求項97記載のトランスジェニック哺乳動物。 101．ポリペプチドがNAIPである、請求項97記載のトランスジェニッタ哺乳動物。 102．ポリペプチドがXIAPである、請求項97記載のトランスジェニック哺乳動物。 103．ポリペプチドがHIAP-1である、請求項97記載のトランスジェニック哺乳動物。 104．ポリペプチドがHIAP-2である、請求項97記載のトランスジェニック哺乳動物。