ES2627500T3 - Terapia de combinación - Google Patents

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Abstract

Una combinación de al menos un tipo de agente de silenciamiento de HDAC4 y, o bien un compuesto de Fórmula (I):**Fórmula** en donde R' es H o alquilo; R" es H o alcoxi; R1 y R2 son H o juntos forman oxo; R3 y R4 son independientemente H, OH o juntos forman oxo: R5, R6, R6', R7 y R8 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en H, alquilo, alcoxi, hidroxi, hidroxialquilo, alcoxicarbonilo, o monoalquilamino y dialquilamino; X es CH2 u O; y n es 0 o 1; o un compuesto**Fórmula** para uso como un medicamento.

Description

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DESCRIPCION
Terapia de combinacion Campo de la invencion
Esta invencion se refiere al campo de agentes terapeuticos de combinacion contra el cancer.
Antecedentes de la invencion
HDAC4 pertenece a la familia de histonas desacetilasas de clase IIa que se han nombrado tradicionalmente por su capacidad para desacetilar residuos de lisina en protemas de histonas nucleares y para reprimir la expresion genica de forma epigenetica. Sin embargo, en las ultimas decadas se ha encontrado que estas HDACs regulan muchas protemas no histonas, tanto en el nucleo como en el citoplasma (revisado por Yao y Yang en J Biomed Biotechnol. (2011) 2011:146493). Los rasgos caractensticos de las HDACs de clase IIa incluyen (i) presencia de un dominio regulador N-terminal conservado, que contiene NLS (senal de localizacion nuclear) para la translocacion nucleo- citoplasmica y motivos de union para factores de transcripcion y correpresores; (ii) expresion espedfica de tejido y; (iii) capacidad de respuesta a la fosforilacion mediada por estfmulos externos/internos (Parra y Verdin, Curr Opin Pharmacol. (2010) 10(4):454-60).
La expresion elevada de HDAC4 se observa en los musculos cardfacos y lisos, corazon y cerebro. La HDAC4 puede inhibir la expresion de muchos genes mediante la union a factores de transcripcion espedficos de tejido (por ejemplo, MEF2, Runx2, p53 y SRF) en asociacion con correpresores (por ejemplo, N-CoR y SMRT) y otras HDACs (HDAC3 y 5) (Parra y Verdin de 2010, idd.). Una serie de estudios se refiere a la expresion anormal de HDAC4 y la localizacion subcelular de defectos en el desarrollo y enfermedades neurodegenerativas (Majdzadeh et al., Front Biosci. (2008) 13:1072-82). Como respuesta a un estfmulo celular espedfico, una variedad de cinasas (principalmente CAMKs) pueden fosforilar HDAC4 en residuos de serina conservados (Ser-246, Ser-467 y Ser-632 en los seres humanos), creando un sitio de acoplamiento para la protema 14-3-3, que atrapa las HDACs en el citoplasma, liberando de esto modo los promotores diana de la represion mediada por HDAC. La desfosforilacion mediada por las fosfatasas PP2A y PP1, por el contrario, se ha mostrado que expone la NLS de HDAC4 y favorece su importacion al nucleo (Parra y Verdin, 2010, ibid.).
Wilson et al. describen en Mol Biol Cell. (2008) 19(10):4062-75, una expresion fuerte de HDAC4 en las criptas del colon de raton en proliferacion. El silenciamiento de HDAC4 o de algunas otras HDACs, asf como el tratamiento con inhibidores de pan-HDAC, ha mostrado que inhibe la proliferacion de celulas cancengenas a traves de una regulacion positiva de p21, ya sea de forma directa o indirecta a traves de p53, en condiciones perjudiciales para el ADN (Basile et al., J Biol Chem. (2006) 281(4):2347-57; Wilson et al., 2008, ibid.). En un estudio de alto rendimiento, muestras de tumores de mama humanos mostraron una hiperexpresion significativa de HDAC4, lo que sugiere un papel potencial de HDAC4 en los canceres humanos (Witt et al., Cancer Lett. (2009) 277(1):8-21).
Los hallazgos mas recientes han identificado una serie de dianas citoplasmaticas, que ponen de relieve el papel de la HDAC4 en la regulacion del desarrollo, la angiogenesis, la apoptosis y la quimiorresistencia. Se ha observado que la actividad de HDAC4 y su asociacion con HIF1a en el citoplasma es necesaria para la supervivencia de neuronas de la retina (Chen y Cepko, Science (2009) 323(5911):256-9). La desacetilacion de las lisinas N-terminales de HIF1a mediada por HDAC4 estabiliza HIF1a y favorece la transcripcion de sus genes diana, a saber, VEGF y genes glicolfticos (LDHA y Glut1) (Geng et al., J Biol Chem. (2011) 286(44):38095-102). Por lo tanto, HDAC4 parece que prepara las celulas para que se adapten a condiciones de hipoxia/estres y tambien contribuye a la angiogenesis tumoral. Es importante destacar que, en este informe, las celulas del cancer de prostata con HDAC4 silenciada eran mas sensibles al tratamiento con docetaxel en condiciones de hipoxia.
Tambien se muestra que la hiperexpresion de HDAC4 mejora la resistencia a cisplatino en el cancer de ovario mediante la activacion y la translocacion nuclear de STAT1 (desacetilacion seguida de fosforilacion). En su lugar, un inhibidor mas espedfico de HDAC4, APHA4a, induda una actividad caspasa y restauraba la sensibilidad a cisplatino (Stronach et al., Cancer Res. (2011) 71(13):4412-22).
Mas recientemente, se ha mostrado la importancia de HDAC4 tanto nuclear como citoplasmatica en la supervivencia neuronal y la patogenesis ataxia telangiectasia (AT) (Li et al., Nat Med. (2012) 18 (5): 783-790). Se ha mostrado que una mejora de la actividad de PP2A, debido a la perdida de ATM, favorece la acumulacion nuclear de HDAC4 y la represion epigenetica de diversos promotores. A la inversa, la HDAC4 citoplasmatica inhida la entrada de nuevo en el ciclo celular y la activacion de la caspasa-3. Es importante destacar que estos descubrimientos son de gran importancia tambien en el campo del cancer, ya que la activacion de PP2A puede ser util para mejorar la eliminacion de celulas cancerosas en el cerebro, transformando la HDAC4 citoplasmatica pro-supervivencia a una HDAC4 nuclear anti-supervivencia.
Dado que el cancer es una enfermedad devastadora que afecta a todas las comunidades en todo el mundo y que una resistencia intrmseca o adquirida es el principal problema relacionado con las quimioterapias utilizadas actualmente, existe una necesidad identificada en la tecnica de nuevos regfmenes de terapias contra el cancer que induzcan la apoptosis.
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Breve descripcion de la invencion
En un aspecto, la presente invencion proporciona una combination de al menos un tipo de agente de silenciamiento de HDAC4 y, o bien un compuesto de Formula (I) o PKC412 (es decir Midostaurina) para uso como un medicamento. Los compuestos de Formula (I) tienen la estructura general:
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en donde R' es H o alquilo;
R" es H o alcoxi;
R1 y R2 son H o juntos forman oxo;
R3 y R4 son independientemente H, OH o juntos forman oxo:
R5, R6, R6', R7 y R8 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en H, alquilo, alcoxi, hidroxi, hidroxialquilo, alcoxicarbonilo, o monoalquilamino y dialquilamino;
X es CH2 u O; y
n es 0 o 1.
PKC412 (es decir Midostaurina) tiene la formula
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En algunas realizaciones, el agente de silenciamiento de HDAC4 se selecciona a partir del grupo que consiste en moleculas de ARNsi, moleculas de DARNsi, precursores de miARN artificiales, moleculas de shARN, oligonucleotidos antisentido y ribozimas. En algunas realizaciones adicionales, el agente de silenciamiento de 20 HDAC4 comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 a 170.
En algunas otras realizaciones, el compuesto de Formula (I) se selecciona a partir del grupo que consiste en
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De acuerdo con algunas realizaciones, la combination se puede utilizar en el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa seleccionada a partir de un grupo que consiste en cancer de cerebro, glioma, astrocitoma y glioblastoma.
De acuerdo con algunas realizaciones adicionales, el agente de silenciamiento de HDAC4 y, o bien el compuesto de Formula (I) o PCK412, se van a administrar de forma simultanea, secuencial o por separado.
En otro aspecto, la presente invention proporciona una composition farmaceutica que comprende una combinacion de acuerdo con cualquier realization que se expone en el presente documento y al menos un vedculo farmaceuticamente aceptable.
Tambien se describe en esta memoria un metodo para la sensibilization de celulas hiperproliferativas frente a un agente quimioterapeutico, mediante el silenciamiento del gen de HDAC4 en un sujeto humano o animal que requiere tal sensibilizacion.
Tambien se describe en esta memoria un metodo para tratar una enfermedad hiperproliferativa en un sujeto humano o animal que requiere tal tratamiento, mediante la administration a dicho sujeto de al menos un tipo de agente de silenciamiento de HDAC4 y, o bien un compuesto de Formula (I) descrito en el presente documento o PCK412, de forma concomitante, simultanea o posterior.
Todas las realizaciones descritas para el uso medico de la presente combinacion se aplican a los metodos mencionados anteriormente, asf como viceversa.
Otros aspectos, realizaciones espedficas, objetos, detalles y ventajas de la invencion se exponen en los siguientes dibujos, description detallada y ejemplos.
Breve descripcion de los dibujos
A continuation, la invencion se describira con mayor detalle por medio de realizaciones preferidas haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los cuales
La Figura 1A es una transferencia Western que muestra la actividad silenciadora de HDAC4 de un ARNbc desorganizado (Scr.) y ARNbc especfico de HDAC4 (HDAC4) en celulas T98G de glioblastoma humano.
La Figura 1B muestra la cantidad de fragmentaciones nucleares apoptoticas en celulas T98G de glioblastoma despues de la transfection con un ARNbc desorganizado o especfico de HDAC4 durante 48 horas, despues de un tratamiento con la concentration indicada de farmacos mencionados durante otras 24 horas.
La Figura 2A representa el potencial colonogenico de celulas T98G de glioblastoma transfectadas con un ARNbc desorganizado o especfico de HDAC4, despues de dos dfas de tratamiento con la concentracion indicada de compuestos qdmicos.
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La Figura 2B muestra el analisis cuantitativo de los resultados mostrados en la Figura 2A como una medida del area cubierta por las colonias de celulas T98G por pocillo en las condiciones indicadas.
La Figura 2C muestra el analisis cuantitativo de los resultados mostrados en la Figura 2A como una medida del factor de cambio en el area cubierta por colonias de celulas T98G tratadas con los farmacos indicados, con respecto a las celulas de control no tratadas.
La Figura 3A representa el potencial colonogenico de celulas de glioblastoma U87MG-luciferasa transfectadas con un ARNbc desorganizado o espedfico de HDAC4, despues de dos dfas de tratamiento con la concentracion indicada de compuestos qrnmicos.
La Figura 3B muestra el analisis cuantitativo de los resultados mostrados en la Figura 3A como una medida del area cubierta por las colonias de celulas U87MG-luciferasa por pocillo en las condiciones indicadas.
La Figura 3C muestra el analisis cuantitativo de los resultados mostrados en la Figura 3A como una medida del factor de cambio en el area cubierta por las colonias de celulas U87MG-luciferasa tratadas con los farmacos indicados con respecto a las celulas de control no tratadas.
La Figura 4A es una transferencia Western que muestra la actividad silenciadora de HDAC4 de un ARNbc desorganizado (Scr.) y un ARNbc espedfico de HDAC4 (HDAC4.2) en celulas T98G de glioblastoma humano.
La Figura 4B muestra la cantidad de fragmentaciones nucleares apoptoticas en celulas T98G de glioblastoma despues de la transfeccion con un ARNbc desorganizado o HDAC4.2 durante 48 horas, seguida por un tratamiento con la concentracion indicada de los farmacos mencionados durante otras 24 horas.
La Figura 4C representa el potencial colonogenico de celulas T98G de glioblastoma transfectadas con un ARNbc desorganizado o HDAC4.2, despues de dos dfas de tratamiento con la concentracion indicada de compuestos qrnmicos.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se basa en un descubrimiento sorprendente en el que el silenciamiento del gen de HDAC4 aumenta la actividad inductora de apoptosis de agentes de molecula pequena que comparten caractensticas estructurales comunes
Un silenciamiento concomitante del gen de HDAC4 y la administracion de dicho agente da como resultado un aumento sinergico del nivel de apoptosis. Por lo tanto, en un aspecto, la invencion proporciona una terapia de combinacion de agotamiento de HDAC4 y dichos agentes.
El silenciamiento del gen de HDAC4 se puede producir a traves de cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica, incluyendo, pero no limitado a, aRn de interferencia (ARNi). El enfoque mas comun para el silenciamiento de genes basado en ARNi, es el uso de ARN de interferencia pequeno (ARNsi).
El principio de ARNsi se presenta ampliamente en las publicaciones. A modo de ejemplos se pueden mencionar los documentos de publicaciones de patente de EE.UU. 2003/0143732, 2003/0148507, 2003/0175950, 2003/0190635, 2004/0019001, 2005/0008617 y 2005/0043266. Una molecula de ARNsi duplex comprende una region antisentido (no codificante) y una cadena homosentido (codificante), en donde dicha cadena antisentido comprende una secuencia complementaria a una region diana en una secuencia de ARNm que codifica cierta protema y la cadena homosentido comprende una secuencia complementaria a dicha cadena antisentido. Por lo tanto, la molecula de ARNsi duplex se ensambla a partir de dos fragmentos de acido nucleico, en donde un fragmento comprende la cadena antisentido y el segundo fragmento comprende la cadena homosentido de dicha molecula de ARNsi. En otras palabras, los ARNsi son pequenos ARNs bicatenarios (ARNbc). La cadena homosentido y la cadena antisentido se pueden conectar covalentemente a traves de una molecula enlazadora, que puede ser un enlazador polinucleotido o un enlazador no nucleotido. La longitud de las cadenas homosentido y antisentido puede variar y es normalmente de aproximadamente 19 a 21 nucleotidos cada una. En algunos casos, el ARNsi puede comprender 22, 23 o 24 nucleotidos.
Otro enfoque para el silenciamiento de HDAC4 basado en ARNi es usar ARNsi de sustrato Dicer (DARNsi) mas largos, normalmente de 25-35 nt, que en algunos casos se ha descrito que son mas potentes que los ARNsi correspondientes de 21 meros (Kim et al., Nat Biotechol de 2005, 23: 222-226). Los DARNsi se procesan in vivo en ARNsi activos mediante Dicer.
En una celula, se forma una cadena de ARNsi antisentido activa y reconoce una region diana del ARNm diana. Esto a su vez conduce a una escision del ARN diana a traves del complejo de endonucleasa RISC (RISC = complejo de silenciamiento inducido con ARN) y tambien a la smtesis de ARN adicional mediante una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP), que puede activar Dicer y produce moleculas de ARNsi duplex adicionales, amplificando de este modo la respuesta.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresion "ARNbc" se refiere tanto a los ARNsi como a los DARNsi.
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Normalmente, pero no necesariamente, la cadena antisentido y la cadena homosentido de ARNbc comprenden ambas un saliente 3' terminal de unos pocos nucleotidos, normalmente de 1 a 3. El saliente 3' puede incluir uno o varios nucleotidos modificados, tales como un 2'-O-metil ribonucleotido. El extremo 5'-terminal de la cadena antisentido es normalmente un grupo fosfato (P). Los duplex de ARNbc que tienen grupos fosfato terminales (P) son mas faciles de administrar en la celula que una sola cadena antisentido. En algunos casos, el extremo 5'-terminal de la cadena homosentido o de ambas cadenas homosentido y antisentido, puede comprender un grupo P.
Generalmente, un ARN no modificado tiene una estabilidad baja en condiciones fisiologicas debido a su degradacion por enzimas ribonucleasas presentes en la celula viva. Si el oligonucleotido se va a administrar exogenamente, es altamente deseable modificar la molecula de acuerdo con metodos conocidos, con el fin de mejorar su estabilidad frente a una degradacion qrnmica y enzimatica.
Las modificaciones de nucleotidos que se van a administrar de forma exogena in vivo se describen extensamente en la tecnica (por ejemplo, en el documento US 2005/0255487, incorporado en esta memoria como referencia). Principalmente, cualquier parte del nucleotido, es decir, el azucar ribosa, la base y/o las cadenas fosfodiester internucleotidicas se pueden modificar. Por ejemplo, la eliminacion del grupo 2'-OH de la unidad de ribosa para proporcionar 2-desoxirribonucleotidos, da como resultado una estabilidad mejorada. Antes se han descrito tambien otras modificaciones en este grupo: la sustitucion del grupo 2'-OH de la ribosa por grupos alquilo, alquenilo, alilo, alcoxialquilo, halo, amino, azido o sulfhidrilo. Tambien se pueden realizar otras modificaciones en la unidad de ribosa: acidos nucleicos bloqueados (LNA) que contienen enlaces metileno entre las posiciones 2' y 4' de la ribosa, se pueden emplear para crear una mayor estabilidad intrmseca.
Ademas, el enlace fosfodiester internucleotfdico se puede modificar, por ejemplo, de modo que uno o varios oxfgenos se sustituyen por grupos azufre, amino, alquilo o alcoxi. Tambien se puede modificar la base en los nucleotidos.
Preferiblemente, el oligonucleotido comprende modificaciones de uno o varios grupos 2'-hidroxilo en los azucares de la ribosa, y/o modificaciones en uno o varios enlaces fosfodiester internucleotfdicos, y/o una o varias modificaciones de acidos nucleicos bloqueados (LNA) entre la posicion 2' y 4' de los azucares de la ribosa.
Modificaciones particularmente preferibles son, por ejemplo, la sustitucion de uno o varios de los grupos 2'-OH por 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-halo, por ejemplo, fluoro o 2'-metoxietilo. Especialmente preferidos son los oligonucleotidos en los que algunos de los enlaces fosfodiester internucleotfdicos tambien estan modificados, por ejemplo, reemplazados por enlaces fosforotioato.
En algunas realizaciones, los ARNbc pueden contener uno o varios analogos de nucleotidos sinteticos o naturales, incluyendo, pero no limitados a, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de quiral-metilo y acidos peptidonucleicos (PNAs), siempre que los ARNbc conserven su capacidad de silenciamiento de HDAC4.
Se debe subrayar que las modificaciones mencionadas anteriormente son solo ejemplos no limitantes.
Uno de los desaffos relacionados con el ARNi es la identificacion de un ARNbc potente para el ARNm correspondiente. Cabe senalar que los genes con una complementariedad incompleta estan regulados a la baja de forma inadvertida por el ARNbc, lo que conduce a problemas en la interpretacion de datos y una toxicidad potencial. Sin embargo, esto se puede abordar en parte mediante un cuidadoso diseno de ARNbc apropiados con algoritmos de diseno. Estos programas informaticos criban una secuencia diana dada con un conjunto de normas para encontrar tramos de secuencia con bajo contenido en GC, falta de repeticiones internas, un extremo 5' rico en A/U y energfa de union libre local elevada, que son caractensticas que mejoran el efecto del silenciamiento del ARNbc.
Los ARNbc espedficos de HDAC4 estan disponibles en la tecnica y otras moleculas de ARNbc se pueden disenar utilizando algoritmos comerciales y no comerciales. Para este fin, la secuencia de ADNc completa de la HDAC4 se puede cargar en los programas de algoritmos de ARNsi, como la herramienta de diseno Eurofins MWG Operon's Online Design Tool, la herramienta de diseno de ARNsi de Dharmacon y el programa independiente desarrollado por Cui et al. (Comput Methods Programs Biomed (2004) 75(1):67-73). De forma ideal, las secuencias de ARNsi generadas por el algoritmo se criban entonces mediante una alineacion de la secuencia de ADN de todo el genoma (BLAST) para eliminar los ARNsi que no estan exentos de efectos inespedficos. En otras palabras, todos esos ARNsi que tienen incluso regiones de secuencias cortas que se emparejan con otros genes distintos del gen diana (HDAC4), se deben considerar invalorables para un uso posterior. Un ejemplo no limitativo de ARNsi espedficos de HDAC4, adecuados para uso en diversas realizaciones de la presente invencion, se enumeran en la Tabla 1.
Los ARNsi espedficos de HDAC4 se pueden transfectar con diferentes lmeas celulares para comprobar su capacidad para degradar el ARNm. Ademas, el agotamiento de la traduccion de HDAC4 se puede estudiar a nivel de protemas mediante la medicion de la cantidad de protema HDAC4 despues del tratamiento con ARNsi, con anticuerpos espedficos de HDAC4.
Tabla 1. ARNsi especificos de HDAC4
SEQ ID NO:
secuencia homosentido de ARNsi (5' a 3') Region Posicion de partida
1
CAGUGACCACUGGCCCGUCTT1 ORF 1627
2
UCAUACACGAGGCCUGUCGUU1 ORF 2768
3
UCUUUGGCGUCGUACAUUCUU1 ORF 1502
4
CGACAGGCCUCGUGUAUGAUU2 ORF 2750
5
AAAUUACGGUCCAGGCUAAUU2 ORF 1543
6
TCATGAGCCAGGTAACCCAC3 ORF 613
7
CATACAAGTACCGGGACGGT3 ORF 681
8
TCATTGCTAGCAATGTCCAC3 ORF 777
9
CAGAAAGTCCATCTGGATGG3 ORF 807
10
CTGGTCTCGGCCAGAAAGTC3 ORF 818
11
TGGGCATGTGGTTCACGCGG3 ORF 861
12
CACCGTGCTGGGCATGTGGT3 ORF 869
13
GTCCAGGCGCAGGTCCATGG3 ORF 935
14
AGTGAGAACTGGTGGTCCAG3 ORF 949
15
CGGCTCTGCCACAGGCAGTG3 ORF 965
16
TCCCGCAGGGCCGGCTCTGC3 ORF 976
17
TGCTGGTGCTTCATGGCCAG3 ORF 1147
18
TCCTTGTTCTTGAGCTGCTG3 ORF 1249
19
CCTTCTCCTTGTTCTTGAGC3 ORF 1254
20
ACTTCATCTTCACTTCTGTG3 ORF 1296
21
CTTCTTTTTATTGAGGACAA3 ORF 1325
22
GCTGGAAATGCAGTGGTTCA3 ORF 1364
23
GAGGGTCGCTGGAAATGCAG3 ORF 1371
24
AACTCTGGTCAAGGGAACTG3 ORF 1416
25
CCTAAGAGGGAAGTCATCTT3 ORF 1499
26
GCTTTAGCCTGGACCGTAAT3 ORF 1545
27
TTTCTGCTTTAGCCTGGACC3 ORF 1550
28
CTGCTCCGTCTTTCGGCCAC3 ORF 1570
29
GTGACCACTGGCCCGTCTTT3 ORF 1606
30
AGCAGTGACCACTGGCCCGT3 ORF 1610
31
CGCGGAGTCTGTGACATCCA3 ORF 1646
32
AAGTGGAGCGGCCGAGCCTT3 ORF 1802
33
GGCCCAGCGTGATGTTGGGC3 ORF 1845
34
CAGGCCCAGCGTGATGTTGG3 ORF 1847
35
GTCCCGCTCCAAGGGCGAGG3 ORF 1988
36
TCCAGTAAGACCATGTGCTG3 ORF 2035
37
GCTCCCAGGCCTGTGACGAG3 ORF 2077
38
AACCAAGGACTGTGCGTGGA3 ORF 2105
39
TCTGCACCAACCAAGGACTG3 ORF 2113
SEQ ID NO:
secuencia homosentido de ARNsi (5' a 3') Region Posicion de partida
40
GTAGGGCTCGTCCAGCAGAG3 ORF 2393
41
CCTCATCGCTCTCAATGGGC3 ORF 2475
42
TCTGAAGAGCAGCTCCTGCT3 ORF 2546
43
GGATGCCGGCGGCCTCCATG3 ORF 2625
44
ATACACGAGGCCTGTCGTGA3 ORF 2747
45
ACTCCCGCAGGTGCACTGGT3 ORF 2786
46
TGCTGCTACTCCCGCAGGTG3 ORF 2793
47
GCTGCTGCTACTCCCGCAGG3 ORF 2795
48
TGCACTCGCATTTGCCCCGG3 ORF 2874
49
TGTGGGCTTCCGAGTGCACC3 ORF 2931
50
GGTTCGTGCCATACAGGAGG3 ORF 2952
51
GCCCACAGCCAGGCGGGCTG3 ORF 3101
52
GACCAGCTCTACCACGCAGC3 ORF 3119
53
AGGGTCGCTGTAGAAAGCCT3 ORF 3338
54
TGGAGGGACATGTACAGGAC3 ORF 3361
55
TAGCGGTGGAGGGACATGTA3 ORF 3367
56
GCTGCCTGGGAAGAAGTTCC3 ORF 3395
57
AAGCCTGATGACACCAGCAC3 ORF 3571
58
TGGCGGAGAGGTTGTAGCCC3 ORF 3624
59
TACCCGAAGCATCTGGCGGA3 ORF 3637
60
GCGTTTGCATTGGGTCTTTG3 ORF 3811
61
CTCCATGGAACGGACAGCGT3 ORF 3827
62
TCTGAGCCTCGATCAGAGAA3 ORF 3912
63
TCTTCCATGGGCTCCTCATC3 ORF 4012
64
CTTCGAGGGAGTGCTACAGG3 codon de parada 4041
65
TTTCATAAGAATCAAGTAAG3 3'UTR 5225
66
GCAATCTGCATTCATTTTAT3 3'UTR 5295
67
ACAGGCTCCAAAATCCAGG3 3'UTR 6203
68
GCTGTCCTGGTCAGGCAATC3 3'UTR 6276
69
AAGAGTAAAGACTGGCTGTC3 3'UTR 6290
70
ACTGGTGGCTTCATGTGCTG3 3'UTR 6360
71
GTCTGAACTTCTGCCCCCAA3 3'UTR 6410
72
GAGCACGGTGTGTCTGAACT3 3'UTR 6421
73
CACTCATTTGGTCAAAAGTT3 3'UTR 6508
74
CAAACCACTGTCTCAGAGCT3 3'UTR 6569
75
ATGAGGCCAAGGAGGCCAGA3 3'UTR 6734
76
AGCAGTCCATGTTATCCCAT3 3'UTR 6854
77
GCGTCTCCATTTGAATGAGA3 3'UTR 6911
78
CCTGCCAGGCCTTTGCAGAG3 3'UTR 6932
79
GGAGAAGAGCCGAGTGTGTC3 3'UTR 7031
SEQ ID NO:
secuencia homosentido de ARNsi (5' a 3') Region Posicion de partida
80
AAGTCCATTGCTAGTGCTGC3 3'UTR 7519
81
GAATGTTCTGATCAAAAAGA3 3'UTR 7548
82
GCCCATAAAACACGTGGGCC3 3'UTR 7623
83
AAAGTGAGGCCGAGCTAAGA3 3'UTR 8399
84
GCACAGAAGTGAAGATGAA4 ORF 1295
85
CAGCAGAGGTTGAGCGTGA4 ORF 3268
86
GGAGAAGGGCAAAGAGAGT4 ORF 1266
87
GGTCCAGGCTAAAGCAGAA4 ORF 1550
88
GCGATGAGGAAGAGGCAGA4 ORF 2486
89
CGACAGGCCTCGTGTATGA4 ORF 2750
90
CAGCAGATCCAGAGGCAGA4 ORF 1036
91
TGGAGAAAGTCATGGAGAT4 ORF 3842
92
GCAGAAAGTGGCCGAAAGA4 ORF 1563
93
GGGACGTGCACCATGGAAA4 ORF 3308
94
CATTGAGAGCGATGAGGAA4 ORF 2478
95
TGGTAGAGCTGGTCTTCAA4 ORF 3125
96
GCAAAGACCCAATGCAAAC4 ORF 3810
97
GAACAAGGAGAAGGGCAAA4 ORF 1260
98
GAAGATGAAGTTACAAGAA4 ORF 1305
99
GGGAATGTACGACGCCAAA4 ORF 1482
100
CAGAAGTGAAGATGAAGTT4 ORF 1298
101
AAGTGAAGATGAAGTTACA4 ORF 1301
102
CCGGGAGGATCCAGAGCAT4 ORF 2828
103
CCATATGGAACGAGGTGCA4 ORF 3071
104
CCACAGGGGAGCTGAAGAA4 ORF 3149
105
AGGTTGAGCGTGAGCAAGA4 ORF 3274
106
AGCAAAGACCCAATGCAAA4 ORF 3809
107
ATGAGGAGCCCATGGAAGA4 ORF 4013
108
CCATGAAGCACCAGCAGGA4 ORF 1151
109
AGCAGGAGCTGGAGAAGCA4 ORF 1211
110
TGCAGCAGCTCAAGAACAA4 ORF 1247
111
CAGCCAAGCTTCTGCAGCA4 ORF 3254
112
TCGCTGAGTTCCAGAGGCA4 ORF 1061
113
AGGTGAAGCAGGAGCCCAT4 ORF 2462
114
GGATCCACCAGCTGAGGAA4 ORF 2594
115
GGGAGGATCCAGAGCATCT4 ORF 2830
116
AGAGGTTGAGCGTGAGCAA4 ORF 3272
117
GGAGAAAGTCATGGAGATC4 ORF 3843
118
ACGAAGAAGCCGAGACGGT4 ORF 3941
119
GAAGAAGCCGAGACGGTCA4 ORF 3943
SEQ ID NO:
secuencia homosentido de ARNsi (5' a 3') Region Posicion de partida
120
AGGAGATGCTGGCCATGAA4 ORF 1139
121
AGCGGAAGCTGGAGAGGCA4 ORF 1184
122
AGGAGCAGGAGCTGGAGAA4 ORF 1208
123
AGCTCAAGAACAAGGAGAA4 ORF 1253
124
AAGGAGAAGGGCAAAGAGA4 ORF 1264
125
AATCTGAACCACTGCATTT4 ORF 1360
126
GAAATTACGGTCCAGGCTA4 ORF 1542
127
CAGCAACTGCAGATGAACA4 ORF 2290
128
CTGCAGATGAACAAGATCA4 ORF 2296
129
TTGAGAGCGATGAGGAAGA4 ORF 2480
130
TGGGAGACGCTGAGTACTT4 ORF 3497
131
GCGAGAACGAAGAAGCCGA4 ORF 3935
132
TGGAGAAACACAAGCAGCA4 ORF 2261
133
AAACAAAACTGGACAGAAA4 3'UTR 4636
134
GGGCAGAAGTTCAGACACA4 3'UTR 6413
135
GGAACAATGCCTTAAGAAA4 3'UTR 4774
136
GGGCATTGATACATATATA4 3'UTR 7638
137
GTAAATAAAGACTGCGTTA4 3'UTR 8946
138
GCACTGTGGTTTACAATTA4 3'UTR 8327
139
GAACAATGCCTTAAGAAAA4 3'UTR 4775
140
GGAAAGGGATCCTGATTGA4 3'UTR 5364
141
GAGTTGATTTGGAGGAATT4 3'UTR 8096
142
CTGTTCAACTT GTGGGTTA4 5'UTR 602
143
CGTAATGGTCTGACACAAA4 3'UTR 7483
144
AGAGGGACCTTTAAAGAAA4 3'UTR 4619
145
GCAAGTAGCATGAAGTATT4 3'UTR 5135
146
GGGAAGGACCATTTCGTAA4 3'UTR 7469
147
CAGGGTAGCTTCTGAAATT4 3'UTR 6482
148
CCTAGGAGCTGTATAAAGA4 3'UTR 5884
149
ATGGATGGCTTGTGAATTT4 3'UTR 5328
150
CCAAATGAGTGCAGATTCT4 3'UTR 6516
151
TTAAGCAGATGATGGGATA4 3'UTR 6842
152
GCACATATGTACCTAATGA4 3'UTR 5524
153
CCAATGTATTCCAAGCTAA4 3'UTR 5201
154
GCAGAACGGTCTTGGGACT4 3'UTR 6595
155
CGTGTTATCTTGTGGTGTA4 3'UTR 8930
156
CGACTCATCTTGTAGCTTA4 3'UTR 4508
157
GCAAATGGATGGCTTGTGA4 3'UTR 5324
158
GGACTTAATTCTAATCTCA4 3'UTR 6896
159
GATGAGAATGACAAACATA4 3'UTR 8527
5
10
15
20
25
SEQ ID NO:
secuencia homosentido de ARNsi (5' a 3') Region Posicion de partida
160
CAAGGGACGCCGTGGAAGA4 3'UTR 4333
161
GGACAGAGGGACCTTTAAA4 3'UTR 4615
162
GGATCCTGATTGATTGAAA4 3'UTR 5370
163
CAGAATTGTTGCTGTCAGA4 3'UTR 5787
164
GGGCAGGGAGGGTTGCTTA4 3'UTR 5977
165
AAACCAAGTTGTAACGACA4 3'UTR 8636
1 Descrita por Mottet et al. en Oncogene (2009) 28, 243-256 2 Descrita por Wilson et al. en Mol. Biol. Cell (2008) 19, 4062-4075 3 Descrita en el documento US 2004/0077083 y US 2004/0077084 4 ARNsi previstos dirigidos a HDAC4 disenados en relacion con la presente invencion mediante la
herramienta de diseno de ARNsi (siDESIGN Center) proporcionada por Dharmacon/Thermo Scientific.
Los ARNbc adecuados incluyen los que tienen una identidad de secuencia mayor que el 80%, por ejemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o incluso una identidad de secuencia del 100% con SEQ ID NOs: 1 a 165, siempre y cuando tengan propiedades de union similares y actividad de silenciamiento de HDAC4 como los ARNbc de referencia.
Todavfa otros ARNbc espedficos de HDAC4, adecuados para uso en diversas realizaciones de la presente invencion, se pueden disenar y sintetizar de acuerdo con metodos conocidos en la tecnica. Cualquiera de tales ARNbc aislados debe ser suficientemente complementary a la secuencia de ADNc de HDAC4, con el fin de silenciar el gen de HDAC4.
Los precursores de microARN artificial (miARN) son otra clase de ARNs pequenos adecuados para mediar con el ARNi. Normalmente, los precursores de miARN artificiales tienen una longitud de aproximadamente 21-25 nucleotidos y pueden tener 1 a 3 nucleotidos, normalmente 2, sobresalientes en 3'. Los precursores de miARN artificiales que silencian HDAC4 se pueden disenar y sintetizar por metodos conocidos en la tecnica.
Los ARNs cortos en forma de horquilla (shARNs) son todavfa otra forma de silenciar la HDAC4. Los shARNs consisten en i) una secuencia de nucleotidos corta que vana normalmente de 19 a 29 nucleotidos, obtenida a partir del gen diana; ii) un bucle, que vana normalmente entre 4 a 23 nucleotidos; y iii) una secuencia de nucleotidos corta complementaria de forma inversa a la secuencia diana inicial, que vana normalmente desde 19 a 29 nucleotidos. Los shARNs de silenciamiento de HDAC4 se pueden disenar y sintetizar por medios y metodos conocidos por una persona experta. Ejemplos no limitantes de shARNs espedficos de HDAC4 incluyen los enumerados en la Tabla 2.
Tabla 2. shARNs espedficos de HDAC4
SEQ ID NO:
Secuencia diana de shARN (5' a 3') Region Posicion de partida
166
GGAGATGCTGGCCATGAAGCA1 ORF 1140
167
ACGGCATGACTTTATATTGTAT2 3'UTR 7732
168
AGACCGGCATGACTTTATATTG2 3'UTR 7729
169
CGACTCATCTTGTAGCTTATT3 3'UTR 4508
170
GCCAAAGATGACTTCCCTCTT3 ORF 2550
1 Descrita por Chen et al. en Science (2009) 323(5911):256-9. 2 Descrita por Liu et al. en Cancer Res. (2009) 69(6):2252-9. 3 Descrita por Lin et al. en Nature (2012) 482(7384):251-5.
El silenciamiento de HDAC4 se puede obtener tambien mediante una terapia antisentido, en donde oligonucleotidos de ADN o ARN monocatenarios sinteticos, relativamente cortos (normalmente 13-25 nucleotidos) inactivan el gen de HDAC4 mediante la union a un ARNm correspondiente. Los oligonucleotidos antisentido pueden estar sin modificar o modificados qmmicamente. En algunas realizaciones, el hidrogeno en la posicion 2' de la ribosa se sustituye por un grupo O-alquilo, tal como metilo. En realizaciones adicionales, los oligonucleotidos antisentido pueden contener uno o varios analogos de nucleotidos sinteticos o naturales que incluyen, pero no se limitan a los PNAs.
Ademas, el silenciamiento de HDAC4 se puede obtener mediante ribozimas que escinden el ARNm de HDAC4. La tecnologfa de ribozimas esta descrita, por ejemplo, por Li et al. en Adv. Cancer Res 2007, 96:103-43.
5
10
15
20
25
30
35
Tal y como se emplea en este documento, la expresion "silenciamiento de HDAC4" se refiere a una reduction completa o parcial de la expresion genica de HDAC4. En algunas realizaciones, la expresion genica de HDAC4 se reduce en al menos el 50%, o al menos el 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% cuando se introduce ARNbc espedfico de HDAC4, precursor de miARN artificial, shARN, oligonucleotido antisentido, ribozima o cualquier combination de los mismos en un sujeto humano o animal.
Los compuestos qdmicos adecuados para uso en diversas realizaciones de la presente invention incluyen los enumerados en la Tabla 3 y cualquier estereoisomero, sal, solvato o profarmaco de los mismos. En una realization, los compuestos adecuados tienen una formula general (I):
imagen4
en donde R' es H o alquilo;
R" es H o alcoxi;
R1 y R2 son H o juntos forman oxo;
R3 y R4 son independientemente H u OH, o juntos forman oxo:
R5, R6, R6', R7 y R8 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en H, alquilo, alcoxi, hidroxi, hidroxialquilo, alcoxicarbonilo, monoalquilamino y dialquilamino;
X es CH2 u O; y
n es 0 o 1.
Tal y como se emplea en el presente documento, la expresion "que tiene la formula" no se pretende que sea limitante y se emplea del mismo modo que como se utiliza normalmente la expresion "que comprende".
El termino "alquilo" hace referencia a grupos alquilo C1-6 lineales o ramificados incluidos anteriormente, tales como metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo y similares. En algunas realizaciones, el grupo alquilo es un grupo alquilo C1-3 que contiene de 1 a 3 atomos de carbono.
Tal y como se emplea en el presente documento, el termino "alcoxi" se refiere a grupos alcoxi C1-6 tanto lineales como ramificados, tales como metoxi, etoxi, propoxi y similares. En algunas realizaciones, el grupo alcoxi es un grupo alcoxi C1-3 que contiene de 1 a 3 atomos de carbono.
Tal y como se emplea en el presente documento, el termino "hidroxialquilo" se refiere a cualquiera de los grupos alquilo C1-6 mencionados anteriormente, sustituidos con -OH.
Tal y como se usa en el presente documento, el termino "alcoxicarbonilo" se refiere a cualquiera de los grupos alcoxi C1-6 emplea anteriormente sustituidos con -COOH.
El termino "amino" se refiere a -NH2.
El termino "monoalquilamino" incluye cualquiera de los grupos alquilo mencionados anteriormente sustituidos con un grupo amino.
El termino "dialquilamino" se refiere a cualquiera de los grupos alquilo mencionados anteriormente sustituidos con dos grupos amino.
Tal y como se emplea en el presente documento, el termino "estereoisomero" es un termino general para todos los isomeros de moleculas individuales que difieren solo en la orientation de sus atomos en el espacio. Incluye enantiomeros e isomeros de compuestos con mas de un centro quiral que no son imagenes especulares uno de otro
5
10
15
20
25
(diastereomeros).
Tal y como se emplea en el presente documento, la expresion "centro quiral" o "centro asimetrico" se refiere a un atomo de carbono al que estan fijados cuatro grupos diferentes.
El termino "enantiomero" se refiere a una molecula que no se puede superponer a su imagen especular y por lo tanto es opticamente activa, en donde el enantiomero hace girar el plano de luz polarizada en una direction y su imagen especular hace girar el plano de luz polarizada en la direccion opuesta.
El termino "racemico" se refiere a una mezcla de partes iguales de enantiomeros y que es opticamente inactiva.
Cualquiera de los compuestos descritos se puede convertir en una sal farmaceuticamente aceptable. La sal farmaceuticamente aceptable no esta particularmente limitada siempre que no sea toxica. Ejemplos no limitativos de sales con una base inorganica u organica incluyen sales de metales alcalinos (p. ej., sal de sodio, sal de potasio y similares), sales de metales alcalinoterreos (por ejemplo, sal de calcio, sal de magnesio y similares), sales de amonio, sales de aminas (por ejemplo, sal de trietilamina) y similares. Ejemplos no limitantes de sales de adicion de acido obtenidas a partir de un acido mineral (por ejemplo acido clorhidrico, acido bromhidrico, acido yodhidrico, acido fosforico, acido mtrico, acido sulfurico y similares) y sales obtenidas a partir de acidos organicos (por ejemplo acido tartarico, acido acetico, acido cftrico, acido malico, acido lactico, acido fumarico, acido maleico, acido benzoico, acido glicolico, acido gluconico, acido suctinico y similares).
Cualquiera de los compuestos descritos se puede emplear como un profarmaco para la composition farmaceutica mencionada a continuation. Tal y como se emplea en el presente documento, el termino "profarmaco" se refiere a cualquier compuesto que se puede convertir en un farmaco activo in vivo despues de la administration, por ejemplo, al ser metabolizado.
Ejemplos no limitantes de compuestos que tienen la Formula (I) incluyen estaurosporina (STS), K252a, UCN-01, CEP-701 y SB-218078 enumerados en la Tabla 3.
Tabla 3. Ejemplos de analogos/derivados de estaurosporina sometidos a ensayo. Se muestra la cantidad de fragmentation nuclear apoptotica (% de Potenciacion) en celulas T98G de glioblastoma despues de la transfection con ARNbc espetifico de PME-1 y el tratamiento con una concentration indicada de diferentes analogos/derivados de estaurosporina.
Farmacos (sinonimos)
Nombre qulmico Numero de CAS Concentra cion % de Potenciacion (escala) Estructura
Estaurosporina
[9S-(9a, 10p, 11p, 13a)]- 2.3.10.11.12.13- hexahidro-10-metoxi-9- metil-11-(metilamino)- 9.13- epoxi-1H,9H-diindolo [1,2,3-gh:3',2',1'-lm] pirrolo [3,4-j][1,7] benzodiazonin- 1-ona 62996-74-1 50 nM 30-40% (+) H H3Ci'V,'0'x/'iH HN CH3
PKC412/Midostaurina / 4'-N-benzoil estaurosporina/CGP 41251
[9S-(9a, 10p, 11p, 13a)]- N-(2,3,10,11,12,13- hexahidro-10-metoxi-9- metil-1 -oxo-9,13-epoxi- 1H,9H-diindolo [1,2,3- gh:3',2',1'-lm] pirrolo [3,4-j] [1,7] benzo diazonin-11-il) -N-metil benzamida 120685-11-2 5 |JM 50-60% (++) H N N. V0vf-CH:, 0
Farmacos (sinonimos)
Nombre qulmico Numero de CAS Concentra- cion % de Potenciacion (escala) Estructura
K252a/SF 2370
Ester metflico de acido (9S, 10R, 12R)- 2.3.9.10.11.12- hexahidro- 10-hidroxi-9-metil-1-oxo- 9.12- epoxi-1H-diindolo [1,2,3-fg:3',2',1'-kl] pirrolo[3,4-i][1,6] benzodiazocina-10- carboxflico 99533-80-9 3,5 jM 5 |jM 50-60% (++) 80-90% (++++)
UCN-01/7-hidroxi- estaurosporina
(9S)-2,3,10,11,12,13- hexahidro-3a-hidroxi-10a- metoxi-9-metil-11a-metil amino-9p,13p-epoxi- 1H,9H-diindolo [1,2,3- gh:3',2',1'-lm] pirrolo [3,4- j][1,7] benzo diazonin-1- ona 112953-11-4 1.5 jM 2.5 jM 20-30% (+) 70-80% (+++) H HO/,, Cv j \ ,-cx / h3ci ■ x r"H HjCCT'Y'^ HN ch3
CEP-701/Lestaurtinib
(9S, 10S, 12R)- 2,3,9,10,11,12-hexahidro- 10-hidroxi-10- (hidroximetil)-9-metil-9,12- epoxi-1H-diindolo [1,2,3- fg:3',2',1'-kl] pirrolo [3,4- i][1,6] benzo diazocin-1- ona 111358-88-4 3,5 jM 5 jM 40-50% (++) 70-80% (+++) H H/c..voy \---i \ OH
SB-218078
9,10,11,12-tetrahidro-9,12- epoxi-1H-diindolo [1,2,3- fg:3',2',1'-kl] pirrolo [3,4- i][1,6] benzodiazocin- 1,3(2H)-diona 135897-06-2 5 jM 20-30% (+) H
GO-6976
12-(2-cianoetil)-6,7,12,13- tetrahidro-13-metil-5-oxo- 5H-indolo[2,3-a]pirrolo[3,4- c]carbazol 136194-77-9 5 jM 10-20% (-)
Farmacos (sinonimos)
Nombre qulmico Numero de CAS Concentra- cion % de Potenciacion (escala) Estructura
H Q N... ; "N N M e ,i r CN
K252c/estaurosporina aglicona/ estaurosporinona
6,7,12,13-tetrahidro-5H- indolo[2,3-a]pirrolo[3,4-c] carbazol-5-ona 85753-43-1 5 pM 10-20% (-) H \J (V{ y-o
Enzastaurina/LY- 317615
3-(1-metil-1H-indol-3-M)-4- (1-(1-(2-piridinil metil)-4- piperidinil)-1H-indol-3-il)- 1H-pirrol-2,5-diona 170364-57-5 5 pM 10-20% (-) O^y^O "" "l\" 'V........ 1 .A, ! ] U'
Arciriaflavina A
12,13-dihidro-5H-indolo [2,3-a] pirrolo[3,4-c] carbazol-5,7(6H)-diona 118458-54-1 5 pM 5-10% (-) H °-V'. j / \ "VA )L ' N‘" 7 H HN--!
Rebecamicina
5H-indolo(2,3- a)pirrolo(3,4-c)carbazol- 5,7(6h)-diona,1,11-dicloro- 12,13-dihidro-12-(4-o- metil-beta-d- glucopiranosil) 93908-02-2 5 pM 5-10% (-) H x / .....I A ” A'"/ £ ...i V- •'•Nx h ; _.x C\ o'7'.-oi-i /"'1a A/ ( Or: fetec*
Escala:
(-) 0-20%
(+) 20-40%
(++) 40-60%
(+++) 60-80%
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(++++)
80-100%
La administracion de los ARNbc de HDAC4 y los compuestos de formula (I) puede ser concomitante, simultanea o posterior.
La entrega de ARNbc espedficos de HDAC4 se puede lograr de dos formas principalmente diferentes: 1) transcripcion endogena de una secuencia de acido nucleico que codifica el oligonucleotido, en donde la secuencia de acido nucleico se encuentra en una estructura artificial de expresion, o 2) entrega exogena del oligonucleotido.
Para la transcripcion endogena, los ARNbc espedficos de HDAC4 se pueden insertar en sistemas de expresion adecuados usando metodos conocidos en la tecnica. Ejemplos no limitantes de tales sistemas de expresion incluyen vectores retrovmcos, vectores adenovmcos, vectores lentivmcos, otros vectores vmcos, casetes de expresion y plasmidos, tales como los encapsulados en inmunoliposomas pegilados (PILs), con o sin uno o varios promotores inducibles, conocidos en la tecnica. Ambas cadenas de ARNbc se pueden expresar en una sola estructura artificial de expresion a partir de los mismos o de distintos promotores, o las cadenas se pueden expresar en estructuras artificiales de expresion distintas.
Los sistemas de expresion mencionados anteriormente tambien se pueden usar para la entrega de precursores de miARN artificiales y shARNs que silencian HDAC4.
Normalmente, las estructuras artificiales de expresion se formulan en composiciones farmaceuticas antes de la administracion a un sujeto humano o animal (por ejemplo, un sujeto canino). La administracion se puede realizar por cualquier metodo adecuado, conocido en la tecnica, incluyendo la administracion sistemica y local. La formulacion depende de la via de administracion prevista como es sabido por una persona experta en la tecnica. A modo de ejemplo, la estructura artificial de expresion se puede administrar en un vehnculo o diluyente farmaceuticamente aceptable, o puede estar embebida en una composicion de liberacion lenta adecuada. En algunos casos, la composicion farmaceutica puede contener una o varias celulas que producen la estructura artificial de expresion. Tambien las bacterias se pueden utilizar para la administracion de ARNi. Por ejemplo, Escherichia coli modificada geneticamente puede entrar en las celulas de mairnfero despues de la administracion in vivo y transferir los shARNs. Un enfoque relacionado es el uso de minicelulas obtenidas, por ejemplo, a partir de Salmonella enterica.
Para la administracion exogena, las moleculas de ARNbc normalmente forman complejos con liposomas o vehnculos basados en lfpidos, conjugados de colesterol o polietilen-imina (PEI). Un nuevo enfoque prometedor es formar complejos de ARNbc con partfculas lipfdicas de acidos nucleicos estables (SNALPs). Las vfas de administracion adecuadas para la administracion exogena, con o sin dicha formacion de complejo, incluyen, pero no se limitan a, administracion parenteral (por ejemplo, inyeccion intravenosa), administracion enterica (por ejemplo, oral), administracion local, administracion topica (por ejemplo, por via dermica o transdermica) como es conocido por una persona experta en la tecnica. Ya que la extirpacion quirurgica de un tumor es generalmente la intervencion clmica primaria, los ARNbc se pueden administrar directamente en la cavidad del tumor resecado.
Los agentes quimioterapeuticos de formula (I) se pueden administrar a un sujeto humano o animal a traves de cualquier via adecuada, conocida en la tecnica incluyendo, pero no limitadas a, las mencionadas para la administracion de ARNbc espedficos de HDAC4.
En la presente terapia de combinacion, las moleculas de ARNbc y los compuestos de formula (I) se pueden formular en la misma composicion farmaceutica o en una distinta. Cuando se utilizan composiciones farmaceuticas distintas, la administracion puede ser concomitante, simultanea o posterior. La formulacion y/o la via de administracion para las moleculas de ARNbc y los compuestos de formula (I) se puede seleccionar independientemente una de otra. En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica puede comprender uno o varios ARNbc silenciadores de HDAC4 diferentes y/o uno o varios agentes quimioterapeuticos de formula (I).
Las composiciones farmaceuticas se pueden administrar en cualquier vehnculo farmacologico apropiado, adecuado para la administracion. Se pueden administrar en cualquier forma que tenga un efecto profilactico, paliativo, preventivo o curativo de enfermedades hiperproliferativas, tales como cancer, en pacientes humanos o animales.
Para los fines de una administracion parenteral o topica, los ARNbc y/o los compuestos de formula (I) se pueden formular, por ejemplo, como soluciones, suspensiones o emulsiones. Las formulaciones pueden comprender disolventes acuosos o no acuosos, codisolventes, agentes solubilizantes, dispersantes o humectantes, agentes de suspension y/o agentes de viscosidad, segun sea necesario. Ejemplos no limitantes de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal, aceite de pescado y esteres organicos inyectables. Los vehnculos acuosos incluyen, por ejemplo, agua, soluciones de agua-alcohol, incluyendo solucion salina y vehnculos parenterales mediales tamponados que incluyen solucion de cloruro sodico, solucion de dextrosa de Ringer, solucion de dextrosa mas cloruro de sodio, solucion de Ringer que contiene lactosa o aceites fijos. Ejemplos no limitantes de vehnculos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer y similares. Las composiciones acuosas pueden comprender agentes tamponadores adecuados, tales como tampones fosfatos de sodio y potasio, citrato, acetato, carbonato o glicina, en funcion del
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intervalo de pH deseado. El uso de cloruro de sodio como un ajustador de la tonicidad es tambien util. Las composiciones tambien pueden incluir otros excipientes, tales como agentes estabilizantes o conservantes. Los excipientes estabilizadores utiles incluyen tensioactivos (polisorbato 20 y 80, poloxamero 407), polfmeros (polietilenglicoles, povidonas), hidratos de carbono (sacarosa, manitol, glucosa, lactosa), alcoholes (sorbitol, glicerol propilenglicol, etilenglicol), protemas adecuadas (albumina), aminoacidos adecuados (glicina, acido glutamico), acidos grasos (etanolamina), antioxidantes (acido ascorbico, cistema, etc.), agentes quelantes (sales de EDTA, histidina, acido aspartico) o iones metalicos (Ca, Ni, Mg, Mn). Entre los agentes conservantes utiles se encuentra alcohol bendlico, clorobutanol, cloruro de benzalconio y, posiblemente, los parabenos.
Las formas de dosificacion solidas para administracion oral incluyen, pero no se limitan a, capsulas, comprimidos, pfldoras, trociscos, pastillas, polvos y granulos. En tales formas de dosificacion solidas, los ARNbc y/o los compuestos de formula (I) se pueden mezclar por adicion con al menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidon. Tales formas de dosificacion tambien pueden comprender, como es practica normal, sustancias adyuvantes farmaceuticas, por ejemplo, agentes lubricantes de estearato o agentes aromatizantes. Las preparaciones orales solidas tambien se pueden preparar con recubrimientos entericos o de otro tipo que modulan la liberacion de los ingredientes activos.
Ejemplos no limitantes de formas de dosificacion lfquidas para administracion oral incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmaceuticamente aceptables que contienen diluyentes inertes no toxicos, utilizados comunmente en la tecnica, tales como agua y alcohol. Tales composiciones tambien pueden comprender adyuvantes, tales como agentes humectantes, tampones, agentes emulsionantes, de suspension, edulcorantes y aromatizantes.
La composicion farmaceutica se puede proporcionar en una forma concentrada o en forma de un polvo para ser reconstituido segun sea la demanda. En caso de liofilizacion, se prefieren ciertos crioprotectores, incluyendo polfmeros (povidonas, polietilenglicol, dextrano), azucares (sacarosa, glucosa, lactosa), aminoacidos (glicina, arginina, acido glutamico) y albumina. Si en el envase se anade una solucion para reconstitucion, puede consistir por ejemplo, en agua esteril para inyeccion o solucion de cloruro sodico o soluciones de dextrosa o glucosa.
Los medios y los metodos para formular las presentes preparaciones farmaceuticas son conocidos por los expertos en la tecnica y se pueden preparar de una manera que es en sf conocida, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezcla, granulacion, disolucion, liofilizacion o similares.
La presente terapia de combinacion se puede utilizar para tratar canceres de cerebro humano o animal, incluyendo, pero no limitados a, gliomas, astrocitomas y glioblastomas.
Tal como se utiliza en este documento, el termino "tratamiento" o "tratar" se refiere no solo a completar la curacion de una enfermedad, sino tambien a la prevencion, el alivio y la mejora de una enfermedad o los smtomas relacionados con la misma.
Por una "cantidad eficaz" de una combinacion de ARNbc y compuestos de formula (I) se entiende una cantidad en la que los efectos perjudiciales de un tumor, como mmimo, se mejoran. Las cantidades y los regfmenes para la administracion de la presente terapia de combinacion pueden ser determinados facilmente por aquellos con una habilidad ordinaria en la tecnica clmica del tratamiento de trastornos relacionados con el cancer. Generalmente, la dosificacion de la presente terapia de combinacion depende de consideraciones tales como: la edad, el sexo y la salud general del paciente que se va a tratar; el tipo de tratamiento concurrente, si lo hay; la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado; la magnitud del dano tisular; la duracion de los smtomas; y otras variables que ajustara cada medico. Una dosis deseada se puede administrar en una o varias aplicaciones para obtener los resultados deseados. Las composiciones farmaceuticas de acuerdo con las presentes realizaciones se pueden proporcionar en formas de dosificacion unitarias.
En una realizacion, los ARNbc se pueden administrar en una cantidad eficaz dentro del intervalo de dosificacion de aproximadamente 0,01 pg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, o aproximadamente 1,0 pg/kg a aproximadamente 10 |jg/kg. Los ARNbc se pueden administrar en una sola dosis diaria, o la dosificacion diaria total se puede administrar en dosis divididas, por ejemplo, de dos, tres o cuatro veces al dfa.
En una realizacion, los compuestos de formula (I) se pueden administrar en una cantidad eficaz dentro del intervalo de dosificacion de aproximadamente 0,1 pg/kg a aproximadamente 300 mg/kg, o aproximadamente 1,0 pg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Los compuestos de formula (I) se pueden administrar en una sola dosis diaria, o la dosificacion diaria total se puede administrar en dosis divididas, por ejemplo, de dos, tres o cuatro veces al dfa. La pauta de dosificacion se puede seleccionar independientemente de la pauta de dosificacion de los ARNbc.
Ejemplos
Materiales y metodos
Cultivo de celulas eucariotas y transfecciones de ARN de interferencia pequeno (ARNsi): Para este estudio, hemos utilizado la lmea celular de glioblastoma humano T98G. Las celulas se cultivaron en medio MEM de Eagle
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(Sigma-Aldrich), complementado con 10% de FCS termoinactivado y penicilina (100 unidades/ml)-estreptomicina (100 Ag/ml) en una atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37°C. Las transfecciones de ARN de interferencia pequeno (ARNsi o ARNbc) se realizaron con el reactivo Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) segun las instrucciones del fabricante. Las transfecciones se realizaron usando el protocolo de transfeccion directa. Se utilizaron las siguientes secuencias de ARNsi: desordenada (5'-GUA ACA aUg AGA GCA CGG C-3'; SEQ ID NO: 171), HDAC4 (5'-UCA UAC ACG AGG CCU GUC GUU-3'; SEQ ID NO: 2), HDAC4.2 (5'-AAA UUA CGG UCC AGG CUA AUU-3'; SEQ ID NO: 5).
Inhibidores qmmicos y farmacos: PKC412 se adquirio en Cayman Chemicals; GO 6976 en Calbiochem. Estaurosporina (STS), K252a, CEP-701, UCN-01 se obtuvieron de Sigma-Aldrich; Arciriaflavina-A, K252c y SB218078 de Tocris Bioscience; Rebecamicina de Enzo Life Sciences y Enzastaurina de LC laboratories. Todos los productos qmmicos se reconstituyeron como soluciones madre 5 o 10 mM en DMSO y se mantuvieron congelados a -20°C.
Transferencia Western y anticuerpos: Celulas cultivadas y tratadas se lisaron en tampon de muestra 2X SDS/tampon Laemmli, se hirvieron y se determinaron por SDS-PAGE, usando geles de acrilamida al 10%. Las protemas se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon y se incubaron con una dilucion requerida de dilucion de anticuerpo primario y una dilucion 1:5000 de anticuerpo secundario en 5% de leche-PBS- Tween 20 durante el tiempo requerido y se revelaron mediante quimioluminiscencia incrementada (ECL). Anticuerpos anti-HDAC4 (clon H-92) (dilucion 1:1000) y anti-actina (clon AC-40) (dilucion 1:10.000) se adquirieron en Santa Cruz Biotechnology y Sigma-Aldrich, respectivamente. El analisis cuantitativo de las pelfculas se realizo utilizando un analizador de imagenes MCID 5+.
Ensayo de la apoptosis mediante estimacion de la fraccion sub-G0/G1: El porcentaje de la fraccion sub-G0/G1 que contema nucleos fragmentados tenidos con yoduro de propidio (PI), se tomo como una medida de las celulas apoptoticas. Se extendieron 3,5-4 x 104 celulas en placas de 24 pocillos, se transfectaron con ARNsi durante 48 h y despues se trataron con la concentracion indicada de compuestos del ensayo en medio de nuevo aporte. Despues de 24 h de tratamiento, tanto las celulas flotantes como las adherentes se recogieron por centrifugacion. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 400 pl de tampon PI hipotonico, que contema tricitrato sodico 40 mM (Merck), 0,3% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich) y 50 pg/ml de yoduro de propidio (Sigma-Aldrich) en PBS y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad. Se realizo el analisis por citometna de flujo de los nucleos tenidos con PI y se analizaron los datos recogidos, utilizando un citometro de flujo de FACScan y el programa informatico (Becton Dickinson), respectivamente.
Ensayo de formacion de colonias: Las celulas se extendieron en placas con una densidad muy baja (4-6 x 103) en placas de 6 pocillos y se dejaron crecer durante aproximadamente 7 dfas hasta que formaron pequenas colonias. Estas celulas se transfectaron a continuacion con ARNsi desordenado o de HDAC4 usando el reactivo Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) segun las instrucciones del fabricante. Despues de 48 h, se administraron los tratamientos con la concentracion indicada de farmacos qmmicos durante otras 48 h. Las colonias celulares se lavaron con PBS, se fijaron con formaldefudo al 3,7% y se tineron con solucion de cristal violeta al 0,2% (preparada en 10% de etanol) durante 15 minutos a temperatura ambiente cada una. El exceso de tincion se elimino mediante lavados repetidos con PBS. Las placas se secaron y se tomaron imagenes con el escaner Epson perfection V700 y se analizaron con ImageJ.
Analisis estadistico: El nivel de significacion de las diferencias entre los valores medios de dos grupos de datos se evaluo utilizando la prueba t de Student no apareada, suponiendo varianzas iguales entre las medias de la muestra. Todos los valores de p eran de dos colas. Los parametros con un valor de probabilidad p <0,05 se representaron como estadfsticamente significativos y p <0,001 como diferencia altamente significativa.
Resultados
Con el fin de estudiar el efecto de la inhibicion de HDAC4 sobre la supervivencia de las celulas de cancer y la sensibilidad frente a diferentes farmacos qmmicos, en primer lugar, las celulas T98G de glioblastoma humano se transfectaron transitoriamente con ARNsi desordenado (ARNsi no dirigido representado en SEQ ID NO: 171) o ARNsi espedfico de HDAC4 (representado en SEQ ID NO: 2) durante 72 h. La regulacion a la baja eficaz mediante el ARNsi espedfico de HDAC4 se mostro mediante inmunotransferencia (Figura 1A).
Las celulas T98G que conteman niveles normales o reducidos de HDAC4, es decir, celulas transfectadas con ARNsi desordenado o ARNsi de HDAC4, respectivamente, se trataron con estaurosporina (STS) y sus derivados relacionados estructuralmente que inclman PKC413, K252a, UCN-01, CEP-701, SB-218078, GO-6976, Enzastaurina, K252c, Arciriaflavina A y Rebecamicina. Los tratamientos se proporcionaron 48 h despues de la transfeccion. Despues de 24 h de tratamiento con el farmaco, las celulas se lisaron en tampon hipotonico y sus nucleos se tineron con yoduro de propidio. Se analizaron los lisados de celulas tenidas para estimar la fraccion sub- G0/G1 de nucleos fragmentados mediante citometna de flujo (FACS) (Figura 1B). La condensacion y la fragmentacion del nucleo es una caractenstica bioqmmica clave de la apoptosis y el analisis de sub-G0/G1 se ha utilizado ampliamente para la deteccion de la apoptosis (Afanas'ev et al., FEBS Lett, 1986, 194(2):347-50; Prosperi et al., Cytometry, 1991, 12(4):323-329). Este escrutinio identifico cinco farmacos potentes que favoredan la muerte
celular fomentaban una apoptosis significativamente mayor de las celulas T98G de glioblastoma cuando se utilizaban en combinacion con ARNsi de HDAC4.
La eficacia de los farmacos potentes seleccionados se analizo despues mediante el ensayo de formacion de colonias en lmeas celulares de glioblastoma T98G no tumongenas y U87MG-luciferasa altamente tumongenas 5 (celulas U87MG que expresaban luciferasa). Para este experimento, las celulas se cultivaron en placas de 6 pocillos con baja densidad hasta la formacion de pequenas colonias que despues se transfectaron con ARNsi desordenado o espedfico de HDAC4 durante 48 h, seguido de tratamiento con sTs, PKC412, K252a, UCN-01 y CEP-701 a las concentraciones indicadas, durante otras 48 h. Las colonias se fijaron con formaldelddo, se tineron con cristal violeta y las imagenes se analizaron con Image J. En ambas lmeas celulares, tanto el tratamiento por agotamiento de 10 HDAC4 como con farmacos qrnmicos por sf solo, reduda moderadamente la capacidad de formacion de colonias, mientras que la combinacion de estos dos tratamientos daba como resultado una reduccion muy elevada del crecimiento de colonias (Figuras 2A-2C y 3A-3C). Se encontro que el tratamiento con el derivado CEP-701 de STS era menos eficaz en las celulas U87MG (Figura 3C), lo que sugiere la posibilidad de un mayor grado de resistencia a los farmacos en estas celulas, en comparacion con las celulas T98G (Figura 2C). Mas importante aun, el derivado 15 K252a era muy potente en la reduccion del crecimiento de colonias, en ambas lmeas celulares agotadas
espedficamente para HDAC4.
Con el fin de excluir los posibles efectos inespedficos de ARNsi, tambien sometimos a ensayo otro ARNsi espedfico de HDAC4 (HDAC4.2; SeQ ID: 5) en las celulas T98G. Tambien este ARNsi inhida los niveles de expresion de la protema HDAC4 como se muestra por la transferencia Western (Figura 4A) y aumentaba el nivel de apoptosis 20 despues del tratamiento con STS (Figura 4B). Estos resultados fueron corroborados por una reduccion en el crecimiento de colonias de celulas transfectadas con ARNsi de HDAC4.2 tratadas con STS y sus derivados eficaces PKC412 y K252a (Figura 4C).

Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una combinacion de al menos un tipo de agente de silenciamiento de HDAC4 y, o bien un compuesto de Formula
    (I):
    imagen1
    5 en donde
    R' es H o alquilo;
    R" es H o alcoxi;
    R1 y R2 son H o juntos forman oxo;
    R3 y R4 son independientemente H, OH o juntos forman oxo:
    10 R5, R6, R6', R7 y R8 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en H, alquilo, alcoxi,
    hidroxi, hidroxialquilo, alcoxicarbonilo, o monoalquilamino y dialquilamino;
    X es CH2 u O; y
    n es 0 o 1;
    o un compuesto
    15
    imagen2
    para uso como un medicamento.
  2. 2. La combinacion para uso segun la reivindicacion 1, en la que el agente de silenciamiento de HDAC4 se selecciona a partir del grupo que consiste en una molecula de ARNsi, una molecula de DARNsi, un precursor de miARN artificial, una molecula de shARN, un oligonucleotido antisentido y una ribozima.
    20 3. La combinacion para uso segun la reivindicacion 1, en la que el agente de silenciamiento de HDAC4 comprende
    una secuencia de acido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 a 170.
  3. 4. La combinacion para uso segun la reivindicacion 1, en la que el compuesto de Formula (I) se selecciona a partir del grupo que consiste en
    imagen3
  4. 5. la combinacion segun la reivindicacion 1, para uso en el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa seleccionada a partir de un grupo que consiste en cancer de cerebro, glioma, astrocitoma y glioblastoma.
    5 6. La combinaciOn para uso segUn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el agente de
    silenciamiento de HDAC4 y el compuesto de FOrmula (I) o el compuesto
    imagen4
    se van a administrar simultaneamente, secuencialmente o por separado.
  5. 7. Una composiciOn farmaceutica que comprende una combinaciOn segUn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 6, y al menos un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
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