ES2830051T3 - Oligonucleótidos TGF-beta2 modificados - Google Patents

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Abstract

Oligonucleótido antisentido que consiste en 10 a 18 nucleótidos complementarios a la secuencia de ácido nucleico de TGF-beta2 de SEQ ID NO:1, en donde el oligonucleótido se selecciona del grupo que consiste en CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), AGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 3), AAGTATTTGGTCTC (SEQ ID NO: 4), AAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 5), AGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 6), AGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 6), AGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 6), AGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 6), AAGTATTTGGTCTC (SEQ ID NO: 6), AGTATTTGGTCTCCA (SEQ ID NO: 7), AGTATTTGGTCTCCA (SEQ ID NO: 7), AGTATTTGGTCTCCA (SEQ ID NO: 7), AGTATTTGGTCTCCA (SEQ ID NO: 7), AGTATTTGGTCTCCA (SEQ ID NO: 7), AGTATTTGGTCTCCA (SEQ ID NO: 7), AGTATTTGGTCTCCA (SEQ ID NO: 7), AAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 8), AAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 8), AAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 8), AAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 8), AAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 8), AAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 8), CAAAGTATTTGGTCTC (SEQ ID NO: 9), CAAAGTATTTGGTCT (SEQ ID NO: 10), CAAAGTATTTGGTC (SEQ ID NO: 11), AAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 12), AAAGTATTTGGTCTC (SEQ ID NO: 13), AAAGTATTTGGTCT (SEQ ID NO: 14), AAAGTATTTGGTC (SEQ ID NO: 15), AAGTATTTGGTCT (SEQ ID NO: 16), AAGTATTTGGTC (SEQ ID NO: 17), AGTATTTGGTCTC (SEQ ID NO:18) y AGTATTTGGTCT (SEQ ID NO: 19), AGTATTTGGTC (SEQ ID NO: 20), en donde los nucleótidos en letras negritas son oligonucleótidos modificados con LNA.

Description

DESCRIPCIÓN
Oligonucleótidos TGF-beta2 modificados
Descripción
La invención está dirigida a oligonucleótidos que consisten en 10 a 18 nucleótidos que hibridan con la secuencia de ácido nucleico de TGF-beta2, en donde el oligonucleótido comprende un nucleótido modificado, en donde la modificación es una modificación de LNA.
Antecedentes técnicos
El factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta) es una proteína que controla la proliferación, la diferenciación celular y otras funciones en la mayoría de las células. Es un tipo de citocina que desempeña, entre otros, un papel en la inmunidad, el cáncer, las enfermedades cardíacas, la diabetes, el síndrome de Marfan, el síndrome de Loeys-Dietz, la enfermedad de Parkinson y el SIDA.
La TGF-beta es una proteína secretada que existe en al menos tres isoformas (TGF-beta1, TGF-beta2 y TGF-beta3) codificadas por diferentes genes pero que comparten fuertes homologías de secuencia y estructura. La TGF-beta actúa como factor antiproliferativo en las células epiteliales normales y en las primeras etapas de la oncogénesis. Sin embargo, más adelante en el desarrollo del tumor, la TGF-beta se puede convertir en promotor de tumores a través de mecanismos que incluyen la inducción de la transición epitelial a mesenquimal (EMT), un proceso que se cree que contribuye a la progresión, invasión y metástasis del tumor (ver "Glycoproteomic analysis of two mouse mammary cell lines during transforming growth factor (TGF)-beta induced epithelial to mesenchymal transition" 7th space.com.2009-01-08. Consultado: 2009-01-29).
En las células normales (epiteliales), la TGF-beta detiene el ciclo celular en la etapa G1 (y detiene la proliferación celular), induce la diferenciación o promueve la apoptosis. Cuando una célula se transforma en una célula cancerosa, la TGF-beta ya no suprime la proliferación celular, que a menudo es el resultado de mutaciones en la trayectoria de señalización, y las células cancerosas proliferan. La proliferación de fibroblastos estromales también se induce por la TGF-beta. Ambas células aumentan su producción de TGF-beta. Esta TGF-beta actúa sobre las células estromales circundantes, las células inmunitarias, las células endoteliales, del músculo liso y el microambiente tumoral (ver Pickup y otros "The roles of TGFp in the tumour microenvironment", Nature Reviews Cancer (2013), 13: 788-799). De esta manera, promueve la angiogénesis y, al suprimir la proliferación y activación de las células inmunes, provoca inmunosupresión.
Los ratones con deficiencia de TGF-beta1 mueren por inflamación cardíaca, pulmonar y gástrica, lo que sugiere que la TGF-beta tiene un papel vital en la supresión de la activación y proliferación de células inflamatorias. Smad3 es uno de los elementos clave en las trayectorias de señalización aguas abajo dependientes de TGF-beta. Los ratones deficientes en Smad3 desarrollan infecciones crónicas de las mucosas debido al deterioro de la activación de las células T y la inmunidad de la mucosa, lo que sugiere un papel clave para la TGF-beta en estos procesos. Con respecto al cáncer, la producción y secreción de TGF-beta por parte de ciertas células cancerosas suprime las actividades de infiltración de las células inmunitarias, de esta manera ayuda al tumor a escapar de la vigilancia inmunológica del huésped. Este efecto inmunosupresor puede ser otro mecanismo importante por el cual la TGF-beta estimula el crecimiento de tumores en etapa tardía (ver Blobe GC y otros, mayo de 2000, "Role of transforming growth factor beta in human disease", N. Engl. J. Med. 342 (18), 1350-1358). TGF-beta también convierte las células T efectoras, que normalmente atacan el cáncer con una reacción inflamatoria (inmune), en células T reguladoras (supresoras), que a su vez cortan la reacción inflamatoria.
Además, la TGF-beta es uno de los reguladores más potentes de la producción y deposición de la matriz extracelular. Estimula la producción y afecta las propiedades adhesivas de la matriz extracelular mediante dos mecanismos principales. En primer lugar, la TGF-beta estimula los fibroblastos y otras células para producir proteínas de la matriz extracelular y proteínas de adhesión celular, que incluyen colágeno, fibronectina e integrinas. En segundo lugar, la TGF-beta disminuye la producción de enzimas que degradan la matriz extracelular, lo que incluye la colagenasa, la heparinasa y la estromelisina, y aumenta la producción de proteínas que inhiben las enzimas que degradan la matriz extracelular, lo que incluye el inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 y el inhibidor tisular de metaloproteasa. El efecto neto de estos cambios es aumentar la producción de proteínas de la matriz extracelular y aumentar o disminuir las propiedades adhesivas de las células de una manera específica para cada célula. En muchas células cancerosas, la producción de TGF-beta aumenta, lo que aumenta la capacidad de invasión de las células al aumentar su actividad proteolítica y promover su unión a moléculas de adhesión celular (ver Blobe GC y otros, mayo de 2000, "Role of transforming growth factor beta in human disease", N. Engl. J. Med. 342 (18), 1350-1358).
Por tanto, los agentes terapéuticos que pueden influir en la expresión y actividad de la TGF-beta, respectivamente, son esenciales en particular para su uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades ligadas a TGF-beta. WO 2011/154542, Ep 1008649 y EP 0695354, por ejemplo, describen oligonucleótidos que se hibridan con el ARNm de TGF-beta1 y/o TGF-beta2, y que son adecuados para su uso en fabricar composiciones farmacéuticas, por ejemplo, para prevenir y/o tratar el cáncer. Ninguno de estos oligonucleótidos comprende modificaciones como LNA, ENA, etc. Stanton y otros en NUCLEIC ACID THERAPEUTICS, vol. 22, (2012), páginas 344-359, describen oligonucleótidos gapméricos que tienen alas modificadas con LNA.
WO 2003/85110, WO 2005/061710y WO 2008/138904 por ejemplo, se refieren a oligonucleótidos que comprenden modificaciones de los nucleótidos, que están dirigidos a la inhibición de HIF-1A, Bcl-2 y HER3, respectivamente, y que se pueden usar en el tratamiento del cáncer.
Los criterios para la selección de oligonucleótidos son principalmente la longitud del oligonucleótido, el porcentaje de GC, la tendencia a la formación de horquillas, la dimerización y la temperatura de fusión (Tm). En general, se prefiere una Tm alta (temperatura de fusión). Además, los oligonucleótidos deben ser específicos para el ARNm diana y no deben hibridar con ARNm no diana para disminuir los posibles efectos fuera de la diana.
Por tanto, existe una gran necesidad científica y médica de agentes terapéuticos que reduzcan o inhiban la expresión y/o actividad de TGF-beta. Particularmente, existe una necesidad de larga data de oligonucleótidos tales como oligonucleótidos antisentido, que interactúan específicamente y, por lo tanto, reducen o inhiben la expresión de TGF-beta1, TGF-beta2 y/o TGF-beta3, así como también oligonucleótidos, que inhiben específicamente TGF-beta1 y TGF-beta2, o TGF-beta1 y TGF-beta3, o TGF-beta2 y TGF-beta3, sin provocar efectos secundarios (graves).
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a un oligonucleótido antisentido que consiste en 10 a 18 nucleótidos complementarios a la secuencia de ácido nucleico TGF-beta2 de SEQ ID NO: 1, en donde el oligonucleótido se selecciona del grupo que consiste en
CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), AGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 3), AAGTATTTGGTCTC (SEQ ID NO: 4), AAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 5), AGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 6), AGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 6), AGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 6), AGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 6), AAGTATTTGGTCTC (SEQ ID NO: 6), AGTATTTGGTCTCCA (SEQ ID NO: 7), AGTATTTGGTCTCCA (SEQ ID NO: 7), AGTATTTGGTCTCCA (SEQ ID NO: 7), AGTATTTGGTCTCCA (SEQ ID NO: 7), AGTATTTGGTCTCCA (SEQ ID NO: 7), AGTATTTGGTCTCCA (SEQ ID NO: 7), AGTATTTGGTCTCCA (SEQ ID NO: 7), AAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 8), AAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 8), AAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 8), AAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 8), AAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 8), AAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 8), CAAAGTATTTGGTCTC (SEQ ID NO: 9), CAAAGTATTTGGTCT (SEQ ID NO: 10), CAAAGTATTTGGTC (SEQ ID NO: 11), AAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 12), AAAGTATTTGGTCTC (SEQ ID NO: 13), AAAGTATTTGGTCT (SEQ ID NO: 14), AAAGTATTTGGTC (SEQ ID NO: 15), AAGTATTTGGTCT (SEQ ID NO: 16), AAGTATTTGGTC (SEQ ID NO: 17), AGTATTTGGTCTC (SEQ ID NO: 18), y AGTATTTGGTCT (SEQ ID NO: 19), AGTATTTGGTC (SEQ ID NO: 20),
en donde los nucleótidos en letra negrita son oligonucleótidos que se modifican con LNA.
Además, se describen los oligonucleótidos ASPH213, ASPH215, ASPH216, ASPH222 y ASPH223, respectivamente.
Las modificaciones de uno o más nucleótidos de los oligonucleótidos de la presente invención son modificaciones de LNA. Las modificaciones alternativas descritas en la presente descripción se seleccionan del grupo que consiste en ENA, óxido de polialquileno tal como trietilenglicol (TEG), 2'-fluoro, 2'-O-metoxi y 2'-O-metilo. Las modificaciones se localizan preferentemente en el extremo 5' y/o 3' del oligonucleótido. Un oligonucleótido que comprende tal nucleótido modificado es un oligonucleótido modificado.
La invención se dirige además a una composición farmacéutica que comprende uno cualquiera de los oligonucleótidos antisentido de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
El oligonucleótido antisentido o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se usa en un método para prevenir y/o tratar un tumor maligno y/o benigno, una enfermedad inmunológica, fibrosis o una enfermedad oftálmica. El tumor, por ejemplo, se selecciona del grupo que consiste en tumores sólidos, tumores sanguíneos, leucemias, metástasis tumorales, hemangiomas, neuromas acústicas, neurofibromas, tracomas, granulomas piógenos, psoriasis, astrocitoma, neuroma acústica, blastoma, tumor de Ewing, craneofaringioma, ependimoma, meduloblastoma, glioma, hemangloblastoma, linfoma de Hodgkin, medulalastoma, leucemia, mesotelioma, neuroblastoma, neurofibroma, linfoma no Hodgkin, pinealoma, retinoblastoma, sarcoma, seminoma, tracoma, tumor del conducto de Wilm, o se selecciona del grupo de carcinomas del conducto biliar, de vejiga, tumor cerebral, cáncer de mama, carcinoma broncogénico, carcinoma de riñón, cáncer de cuello uterino, coriocarcinoma, cistadenocarcinoma, carcinoma embrionario, carcinoma epitelial, cáncer de esófago, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, cáncer de cabeza, carcinoma de hígado, carcinoma de pulmón, carcinoma medular, cáncer de cuello, carcinoma de células no pequeñas de pulmón/broncogénico, cáncer de ovario, carcinoma de páncreas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cáncer de próstata, carcinoma de intestino delgado, carcinoma de próstata, cáncer del recto, carcinoma de células renales, cáncer de piel, carcinoma de células pequeñas de pulmón/broncogénico, carcinoma de células escamosas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma testicular y cáncer de útero.
La enfermedad oftálmica se selecciona, por ejemplo, del grupo que consiste en glaucoma, opacificación capsular posterior, ojo seco, degeneración macular, por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad, edema macular diabético, cataratas, vitreorretinopatía proliferativa, síndrome de Marfan y Loeys-Dietz.
Figuras
La Figura 1 muestra la secuencia de ácido nucleico del ARNm de TGF-beta2 humano (NM_003238.3).
La Figura 2 presenta ejemplos de modificaciones de nucleótidos.
La Figura 3 muestra la inhibición de la expresión de ARNm de TGF-beta1, TGF-beta2 y TGF-beta3 en células de cáncer de páncreas humano Panc-1 y células de carcinoma de células renales de ratón RenCa. Las células Panc-1 y las células RenCa se trataron con diferentes oligonucleótidos modificados a una dosis de 1,1 pM en ausencia de cualquier reactivo de transfección (transfección gimnótica o transfección no asistida o suministro gimnótico), e inhibición de TGF-beta1 (columnas negras), TGF-beta2 (columnas blancas) y TGF-beta3 (columnas rayadas) y se midió la expresión de ARNm después de 72 h. La Figura 3 se refiere a los resultados para los oligonucleótidos modificados ASPH190, ASPH191, ASPH192, ASPH193, ASPH194, ASPH195, ASPH196, ASPH197, ASPH198, ASPH199, ASPH200, ASPH201, ASPH202, ASPH203, ASPH204, ASPH205, ASPH206, ASPH207, ASPH208, ASPH209, ASPH210, ASPH211, ASPH212, ASPH213, ASPH214, ASPH215, ASPH216, ASPH217, ASPH218, ASPH219, ASPH220, ASPH221, ASPH222 y ASPH223, respectivamente. La Figura 3a presenta el efecto inhibidor de estos oligonucleótidos TGF-beta en células Panc-1 y la Figura 3b en células RenCa.
La Figura 4 representa el efecto inhibidor de los oligonucleótidos de la presente invención sobre la expresión de la proteína TGF-beta1 y TGF-beta2. Se transfectaron células Panc-1 humanas con 20, 6,67, 2,22, 0,74, 0,25, 0,08 o 0,009 pM del oligonucleótido modificado ASPH47 (Figura 4a). El control negativo es el oligonucleótido modificado (scrLNA) de SEQ ID NO: 22 (Figura 4b) en concentraciones de 40, 13,33, 4,44, 1,48, 0,49, 0,16, 0,05 o 0,02 pM. Los niveles de proteína TGF-beta1 (diamantes) y TGF-beta2 (cuadrados) en los sobrenadantes celulares se determinaron mediante ELISA.
Descripción detallada
La presente invención está dirigida a oligonucleótidos antisentido, que comprenden al menos un nucleótido modificado con LNA y son adecuados para interactuar con el ARNm de TGF-beta, preferentemente con TGF-beta1, TGF-beta2 y/o TGF-beta3. Los oligonucleótidos comprenden o consisten en 10 a 18 nucleótidos del ácido nucleico TGF-beta2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 1. Con la máxima preferencia, el oligonucleótido comprende o consta de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 nucleótidos. El oligonucleótido es un ARN o ADN de simple o doble hebra, que incluye ARNip, microARN, aptámero o spiegelmer.
Los oligonucleótidos de la presente invención son ASPH47, ASPH190, ASPH191, ASPH192, ASPH193, ASPH194, ASPH195, ASPH196, ASPH197, ASPH198, ASPH199, ASPH200, ASPH201, and ASPH202, ASPH203, ASPH204, ASPH205, ASPH206, ASPH207, ASPH208, ASPH209, ASPH210, ASPH211, ASPH212, ASPH214, ASPH217, ASPH218, ASPH219, ASPH220 y ASPH221, respectivamente. Además, se describen los oligonucleótidos antisentido ASPH213, ASPH215, ASPH216, ASPH222 y ASPH223, respectivamente. Tanto los oligonucleótidos antisentido de la presente invención como los oligonucleótidos antisentido que se describieron adicionalmente se pueden describir de manera diferente, por ejemplo, ASPH47, ASPH0047, ASPH_47 o ASPH_0047 en referencia al mismo oligonucleótido.
Un nucleótido forma el bloque de construcción de un oligonucleótido y se compone, por ejemplo, de una base nucleotídica (base nitrogenada, por ejemplo, purina o pirimidina), un azúcar de cinco carbonos (por ejemplo, ribosa, 2-desoxirribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altorsa, glucosa, manosa, gulosa, idosa, galactosa, talosa o modificaciones estabilizadas de esos azúcares), y uno o más grupos fosfato. Ejemplos de grupos fosfato modificados son fosforotioato o metilfosfonato. Cada compuesto del nucleótido se puede modificar y se produce de forma natural o no natural. Estos últimos son, por ejemplo, ácido nucleico bloqueado (LNA), un ácido nucleico con puente de etileno 2'-O, 4'-C (ENA), óxido de polialquileno-(tal como trietilenglicol (TEG)), 2'-fluoro, 2'-O-metoxi y 2'-O-metil, nucleótidos modificados como se describe, por ejemplo, por Freier y Altmann (Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443) y Uhlmann (Curr. Opinion in Drug & Development (2000, 3 (2): 293-213), que se muestran en la Figura 2.
Un LNA es un nucleótido de ARN modificado, en donde el resto de ribosa se modifica con un puente adicional que conecta el oxígeno 2' y el carbono 4' (ribonucleósido 2'- 4'). El puente "bloquea" la ribosa en el extremo 3' de la conformación (Norte), que a menudo se encuentra en los dúplex en forma de A. Los nucleósidos y nucleótidos de LNA, respectivamente, comprenden, por ejemplo, las formas de tio-LNA, oxi-LNA o amino-LNA, en la configuración alfa-D- o beta-L, y se pueden mezclar y combinar, respectivamente, con residuos de ADN o ARN en el oligonucleótido.
Los oligonucleótidos de la presente invención, es decir, oligonucleótidos modificados, comprenden al menos un nucleótido modificado que es una modificación de LNA, por ejemplo, en el extremo 5' y/o 3' del oligonucleótido. El oligonucleótido de la presente invención comprende 1, 2, 3 o 4 LNA en el extremo 5' y 1, 2, 3 o 4 LNA en el extremo 3'. En otra modalidad preferida, el oligonucleótido comprende 1, 2, 3 o 4 LNA en el extremo 5' o en el extremo 3'. Además, se describen oligonucleótidos, es decir, oligonucleótidos modificados, que comprenden al menos un nucleótido modificado seleccionado del grupo que consiste en LNA y/o ENA, en el extremo 5' y/o 3' del oligonucleótido. Estos oligonucleótidos que se describen comprenden 1, 2, 3 o 4 ENA en el extremo 5' y 1, 2, 3 o 4 ENA en el extremo 3'. Alternativamente, el oligonucleótido que se describe comprende 1, 2, 3 o 4 ENA en el extremo 5' o en el extremo 3', y un óxido de polialquileno tal como TEG en el extremo 3' o 5'. Los oligonucleótidos modificados de la presente invención muestran un aumento significativo de la inhibición sobre la expresión y actividad de TGF-beta, respectivamente, lo que da como resultado una prevención y/o tratamiento mejorados de un tumor maligno o benigno, una enfermedad inmunológica, fibrosis, enfermedad ocular como ojo seco, glaucoma u opacificación capsular posterior (PCO), pérdida de cabello por enfermedad del CNS, etc. Los oligonucleótidos de la presente invención, así como también otros oligonucleótidos que se describen en la presente descripción, se dirigen a enfermedades ligadas a TGF-beta mediante hibridación con ARNm de TGF-beta, preferentemente TGF-beta1, TGF-beta2 o TGF-beta3.
Preferentemente se combinan dos o más oligonucleótidos, en donde al menos un oligonucleótido inhibe específicamente a TGF-beta1 y al menos un oligonucleótido inhibe específicamente a TGF-beta2, o en donde al menos un oligonucleótido inhibe específicamente a TGF-beta1 y al menos un oligonucleótido inhibe específicamente a TGF-beta3, o en donde al menos un oligonucleótido inhibe específicamente a TGF-beta2 y al menos un oligonucleótido inhibe específicamente a TGF-beta3, o en donde al menos un oligonucleótido inhibe específicamente a TGF-beta1, al menos un oligonucleótido inhibe específicamente a TGF-beta2, y al menos un oligonucleótido inhibe específicamente a TGF-beta3. El oligonucleótido de la presente invención inhibe con la máxima preferencia la expresión y/o actividad del ARNm de TGF-beta2.
En otra modalidad, un oligonucleótido inhibe dos isoformas de TGF-beta tales como TGF-beta1 y TGF-beta2, TGF-beta2 y TGF-beta3, o TGF-beta1 y TGF-beta3. Un oligonucleótido que inhibe la expresión de dos o las tres isoformas (TGF-beta1, TGF-beta2 y TGF-beta3) se define como oligonucleótido panespecífico.
En una modalidad adicional, se combinan tres o más oligonucleótidos, en donde al menos un oligonucleótido inhibe específicamente a TGF-beta1, otro oligonucleótido inhibe específicamente a TGF-beta2 y un oligonucleótido adicional inhibe específicamente a TGF-beta3, y opcionalmente uno o más oligonucleótidos adicionales que inhiben a TGF- beta1, TGF-beta2 o TGF-beta3.
Los oligonucleótidos de la presente invención tienen, por ejemplo, un IC50 en el intervalo de 0,1 a 20 pM, preferentemente en el intervalo de 0,2 a 15 pM, con mayor preferencia en el intervalo de 0,4 a 10 pM, y aún con la mayor preferencia en el intervalo de 0,5 a 5 pM.
La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido de acuerdo con la invención como ingrediente activo. La composición farmacéutica comprende al menos un oligonucleótido de la presente invención y opcionalmente además un compuesto antisentido, un anticuerpo, un compuesto quimioterapéutico, un compuesto antiinflamatorio, un compuesto antiviral y/o un compuesto inmunomodulador. Los agentes aglutinantes y adyuvantes farmacéuticamente aceptables están opcionalmente comprendidos por la composición farmacéutica.
En una modalidad, el oligonucleótido y la composición farmacéutica, respectivamente, se formulan como unidad de dosificación en forma de una solución que comprende aglutinantes, excipientes, estabilizadores, etc.
El oligonucleótido y/o la composición farmacéutica se pueden administrar por diferentes vías. Estas vías de administración incluyen, pero no se limitan a, electroporación, epidérmica, impresión en la piel, intraarterial, intraarticular, intracraneal, intradérmica, intralesional, intramuscular, intranasal, intraocular, intratecal, intracameral, intraperitoneal, intraprostática, intrapulmonar, intraespinal, intratraqueal, intratumoral, intravenosa, intravesical, colocación dentro de las cavidades del cuerpo, inhalación nasal, oral, inhalación pulmonar (por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluso por nebulizador), subcutánea, subdérmica, tópico (incluyendo oftálmico y membranas mucosas incluyendo suministro vaginal y rectal) o transdérmico.
Para la administración parenteral, subcutánea, intradérmica o tópica, el oligonucleótido y/o la composición farmacéutica incluyen, por ejemplo, un diluyente estéril, tampones, reguladores de toxicidad y antibacterianos. En una modalidad preferida, el oligonucleótido o composición farmacéutica se prepara con portadores que protegen contra la degradación o eliminación inmediata del cuerpo, lo que incluye implantes o microcápsulas con propiedades de liberación controlada. Para la administración intravenosa, los portadores preferidos son, por ejemplo, solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato. Un oligonucleótido y/o una composición farmacéutica que comprende tal oligonucleótido para administración oral incluye, por ejemplo, polvo o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensión o solución en agua o medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, bolsitas, comprimidos o minicomprimidos. Un oligonucleótido y/o una composición farmacéutica que comprende administración parenteral, intratecal, intracameral o intraventricular, que incluye, por ejemplo, soluciones acuosas estériles que contienen opcionalmente tampón, diluyente y otro aditivo adecuado como potenciador de la penetración, compuesto portador y otro portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Un portador farmacéuticamente aceptable es, por ejemplo, líquido o sólido y se selecciona con la manera de administración planificada para proporcionar el volumen, consistencia, etc. deseados, cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Los portadores farmacéuticamente aceptables típicos incluyen, pero no se limitan a, un agente aglutinante (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.); relleno (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etil celulosa, poliacrilatos o hidrógeno fosfato de calcio, etc.); lubricante (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); desintegrante (por ejemplo, almidón, glicolato de almidón de sodio, etc.); o agente humectante (por ejemplo, lauril sulfato de sodio, etc.). Los sistemas de suministro orales de liberación sostenida y/o recubrimientos entéricos para formas de dosificación administradas por vía oral se describen en la Patente de EE.UU. No. 4,704,295; 4,556,552; 4,309,406; y 4,309,404. En estas frases se incluye un adyuvante.
Además de usarse en un método de prevención y/o tratamiento de enfermedades humanas, el oligonucleótido y/o la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención también se usa en un método para la prevención y/o tratamiento de otros sujetos, incluidos animales veterinarios, reptiles, aves, animales exóticos y animales de granja, incluidos mamíferos, roedores y similares. Los mamíferos incluyen, por ejemplo, caballos, perros, cerdos, gatos o primates (por ejemplo, un mono, un chimpancé o un lémur). Los roedores incluyen, por ejemplo, ratas, conejos, ratones, ardillas o cobayas.
El oligonucleótido o la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se usa en un método para la prevención y/o tratamiento de muchas enfermedades diferentes, preferentemente tumores benignos o malignos, enfermedades inmunológicas, asma bronquial, enfermedad cardíaca, fibrosis (por ejemplo, fibrosis hepática, fibrosis idiopática pulmonar, cirrosis hepática, cirrosis renal, esclerodermia), diabetes, cicatrización de las heridas, trastornos del tejido conectivo (por ejemplo, en el corazón, vasos sanguíneos, huesos, articulaciones, ojos tal como el síndrome de Marfan o Loeys-Dietz), psoriasis, enfermedades de los ojos (por ejemplo, glaucoma, opacificación capsular posterior (PCO), retinoblastoma, carcinoma coroide, degeneración macular, tal como degeneración macular relacionada con la edad, edema macular diabético o catarata), enfermedad del SNC (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson), aterosclerosis coronaria (intervención coronaria o cirugía de injerto de derivación de arteria coronaria (CABG) o pérdida de cabello. Un tumor se selecciona, por ejemplo, del grupo de tumores sólidos, tumores sanguíneos, leucemias, metástasis tumorales, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, granulomas piógenos, astrocitomas tales como astrocitoma anaplásico, neuroma acústico, blastoma, tumor de Ewing, craneofaringioma, ependimoma, meduloblastoma, glioma, glioblastoma, hemangloblastoma, linfoma de Hodgkin, meduloblastoma, leucemia, melanoma como melanoma primario y/o metastásico, mesotelioma, mieloma, neuroblastoma, neurofibroma, linfoma no Hodgkin, pinealoma, retinoblastoma, sarcoma, seminoma, tracomas, Tumor de Wilm, carcinoma de vías biliares, carcinoma de vejiga, tumor cerebral, cáncer de mama, carcinoma broncogénico, carcinoma de riñón, cáncer de cuello uterino, coriocarcinoma, cistadenocarcinoma, carcinoma embrionario, carcinoma epitelial, cáncer de esófago, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, cáncer de cabeza, carcinoma de hígado, carcinoma de pulmón, carcinoma medular, cáncer de cuello, carcinoma de células no pequeñas de pulmón/broncogénico, cáncer de ovario, carcinoma de páncreas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cáncer de próstata, carcinoma de intestino delgado, carcinoma de próstata, cáncer de recto, carcinoma de células renales (CCR, por ejemplo, CCR de células claras, CCR papilar, CCR cromófobo), cáncer de riñón oncocitoma, cáncer de riñón de células transicionales, cáncer de piel, carcinoma de células pequeñas broncogénico/pulmonar, carcinoma de células escamosas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma testicular y cáncer de útero. El oligonucleótido o la composición farmacéutica de la presente invención no solo se utiliza en un método para la prevención y/o tratamiento de un tumor, sino igualmente en una metástasis.
La presente invención se dirige preferentemente a un oligonucleótido para su uso en un método para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades oftálmicas tales como, pero sin limitarse a, retinoblastoma, carcinoma coroide, glaucoma, opacificación capsular posterior, ojo seco, degeneración macular, por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad, edema macular diabético, cataratas, vitreorretinopatía proliferativa, síndrome de Marfan o Loeys-Dietz.
Los oligonucleótidos antisentido de la presente invención se caracterizan porque muestran una baja toxicidad inesperada y, por tanto, se toleran bien por diferentes organismos. Los oligonucleótidos muestran una distribución razonable en el organismo, en donde las concentraciones más altas se miden en el riñón, hígado, piel y bazo.
La presente invención proporciona numerosos oligonucleótidos, que son altamente eficientes en la reducción e inhibición, respectivamente, de la expresión de ARNm de TGF-beta, en particular de TGF-beta2 debido a la selección específica de la secuencia del oligonucleótido y la modificación del nucleótido. La Tabla 1 siguiente muestra numerosos oligonucleótidos modificados preferidos de acuerdo con la presente invención y describe algunos oligonucleótidos modificados adicionales (es decir, a Sp H213, ASPH215, ASPH216, ASPH222, As Ph 223) (los nucleósidos modificados se indican en letras negritas). Cada oligonucleótido se define como ASPH y un número, que se define por una secuencia específica y modificación de los nucleósidos:
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La Tabla 1 muestra las secuencias de ácido nucleico de oligonucleótidos seleccionados de la presente invención, así como también las modificaciones de los nucleótidos, en donde LNA 4 4 significa 4 x LNA en los extremos 5' y 3' del oligonucleótido están modificados, en donde LNA 4 3 significa 4 x LNA en el extremo 5' y 3 x LNA en el extremo 3' del oligonucleótido están modificados, en donde LNA 3 4 significa 3 x LNA en el extremo 5' y 4 x LNA en el extremo 3' del oligonucleótido está modificado, en donde LNA 3 3 significa 3 x LNA en el extremo 5' y 3' del oligonucleótido están modificados, en donde LNA 3 2 significa 3 x LNA en el extremo 5' y 2 x LNA en el extremo 3' del oligonucleótido están modificados, en donde LNA 2 3 significa 2 x LNA en el extremo 5' y 3 x LNA en el extremo 3' del oligonucleótido están modificados, en donde LNA 2 2 significa que se modifican 2 x LNA en el extremo 5' y 3' del oligonucleótido. Algunos oligonucleótidos que se describen adicionalmente comprenden ENA 4 4, es decir, 4 x ENA en el extremo 5'- y 3'- del oligonucleótido están modificados, o ENA 3 3, es decir, 3 x ENA en los extremos 5'- y 3' se modifican los extremos del oligonucleótido. Otros oligonucleótidos comprenden 2' O-met 4 4, en donde el oligonucleótido comprende 4 x 2 ' O-metil nucleótidos modificados en el extremo 5' y 3' del oligonucleótido, o comprende 2' fluoro 4 4, en donde el oligonucleótido comprende 4 x 2 ' nucleótidos modificados con flúor en el extremo 5' y 3'. Los oligonucleótidos que comprenden LNA 3 TEG comprenden 3 x LNA en el extremo 5' y un trietilenglicol (t Eg ) en el extremo 3' del oligonucleótido. Algunos oligonucleótidos comprenden LNA que no se disponen en una hilera sino que están separados por un nucleósido desbloqueado (no modificado) que tiene, por ejemplo, las secuencias 1LNA 1N 1LNA 8N 3LnA, 3LNA 8N 1LNA 1N 1LNA, 3LNA 8N 1LNA 1N 2LNA, 3LNA 8N 2LNA 1N 1LNA, 2LNA 1N 1LNA 8N 3LNA, 1LNA 1N 2LNA 8N 3LNA, 1LNA 2N 2LNA 8N 3LNA, 1LNA 3N 1LNA 8N 3LNA, 1LNA 2N 2LNA 8N 4LNA, 1LNA 2N 2LNA 8N 1LNA 1N 2LNA, 1LNA 1N 3LNA 8N 3LNA, 1LNA 1N 2LNA 8N 3LNA, 1LNA 2N 3LNA 8N 2LNA, o 1LNA 2N 3LNA 8N 1LNA 1N 1LNA, en donde "N" es un nucleósido sin modificación bloqueada. Los nucleósidos de LNA se indican en la secuencia en letras negritas y el trietilenglicol se abrevia como TEG en esta tabla.
"ASPH" en combinación con un número se refiere a los diferentes oligonucleótidos y sus diferentes modificaciones como se describe en la Tabla 1. Los oligonucleótidos antisentido de la presente invención y los oligonucleótidos antisentido descritos adicionalmente se pueden describir de manera diferente, por ejemplo, ASPH47, ASPH0047, ASPH_47 o ASPH_0047 y se refieren al mismo oligonucleótido. Estos oligonucleótidos modificados se probaron, por ejemplo, en experimentos que se muestran en los siguientes ejemplos.
Con el propósito de dar claridad y una descripción concisa, en la presente descripción se describen las características como parte de las mismas modalidades o modalidades separadas, sin embargo, se apreciará que el alcance de la invención puede incluir modalidades que tienen combinaciones de todas o algunas de las características descritas.
Los siguientes ejemplos servirán para ilustrar más la presente invención, sin embrago, al mismo tiempo, no constituyen ninguna limitación de la misma, en donde los oligonucleótidos antisentido de la presente invención se reivindican en la reivindicación 1.
EJEMPLOS
En los siguientes ejemplos, se ha probado el efecto de los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 1 en vista de la reducción e inhibición, respectivamente, de la expresión de TGF-beta1 y/o TGF-beta2. SEQ ID NO: 21 (T-LNA: CGGCATGTCTATTTTGTA, en donde 3 x nucleótidos en el extremo 5' y 3' son LNA) y SEQ ID NO: 22 (scr-LNA: CGTTTAGGCTATGTACTT, en donde 3 x nucleótidos en el extremo 5' y 3' son LNA) se usan como oligonucleótidos de control, en donde la SEQ ID NO: 22 (control negativo) es la forma modificada de la SEQ ID NO: 21 (control positivo). Las células setransfectaron en presencia de un agente de transfección (por ejemplo, lipofectamina) o en ausencia de cualquier agente de transfección (que se define como transfección gimnótica o transfección sin ayuda o suministro gimnótico). En caso del suministro gimnótico, la entrada del oligonucleótido en la célula depende únicamente de la interacción del oligonucleótido con la célula (ningún agente soporta la entrada). Por lo tanto, se considera que el suministro gimnótico refleja mejores condiciones del entorno in vivo.
Ejemplo 1
Se trataron células de cáncer de páncreas humano panc-1 (Figura 3a) o células de carcinoma de células renales de ratón RenCa (Figura 3b) con 1,1 pM de ASPH190, ASPH191, ASPH192, ASPH193, ASPH194, ASPH195, ASPH196, ASPH197, ASPH198, ASPH199, ASPH200, ASPH201, ASPH202, ASPH203, ASPH204, ASPH205, ASPH206, ASPH207, ASPH208, ASPH209, ASPH210, ASPH211, ASPH212, ASPH213, ASPH214, ASPH215, ASPH216, ASPH217, ASPH218, ASPH219, ASPH220, ASPH221, ASPH222, o ASPH223 en ausencia de un agente de transfección (transfección gimnótica o suministro gimnótico). La expresión de ARNm de TGF-beta1 (columna negra), TGF-beta2 (columna blanca) y TGF-beta3 (columna rayada) se determinó 72 h después de la transfección. En las Figuras 3a y 3b se demuestra una reducción significativa de la expresión de ARNm de TGF-beta2. El control negativo es LNA modificado (scr LNA) de SEQ ID NO: 22.
Ejemplo 2
Se trataron células de cáncer de páncreas humano panc-1 con 10 pM, 3,3 pM, 1,1 pM, 0,37 pM y 0,12 pM de ASPH47, M1-ASPH47, M2-ASPH47, M3-ASPH47, M4-ASPH47, M5-ASPH47, M6-ASPH47, M7-ASPH47, M8-ASPH47, M9-ASPH47, M10-ASPH47, M11-ASPH47, M12-ASPH47, M13-ASPH47, M14-ASPH47, o M15-ASPH47 en ausencia de un agente de transfección (transfección gimnótica o suministro gimnótico). El efecto inhibidor de los oligonucleótidos modificados sobre la expresión del ARNm de TGF-beta2 se determinó 72 h después del inicio del tratamiento. Los valores de TGF-beta2 se normalizaron a GAPDH y las concentraciones de oligonucleótidos, lo que resultó en una reducción del 50 % del ARNm de TGF-beta2 (valores = IC50) se calcularon. En condiciones experimentales de transfección gimnótica, los oligonucleótidos ingresan a las células e inhiben fuertemente la expresión de ARNm de TGF-beta2. Los resultados de los experimentos se muestran en la Tabla 2:
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Todos los oligonucleótidos modificados muestran un IC50 en el rango submicromolar a submicromolar inferior, lo que demuestra que tienen una potencia extremadamente alta incluso sin el requisito de un reactivo de transfección.
Ejemplo 3
Se transfectaron células de cáncer de páncreas humano panc-1 con 20, 6,67, 2,22, 0,74, 0,25, 0,08 o 0,009 pM del oligonucleótido modificado ASPH47 y los resultados se muestran en la Figura 4a. El control negativo es el oligonucleótido modificado (scr LNA) de SEQ ID NO: 22 (Figura 4b). Las células se transfectaron en ausencia de un agente de transfección (transfección gimnótica o suministro gimnótico). Los oligonucleótidos se agregaron a las células durante 3 días, las cuales se incubaron a 37 °C. A continuación, el medio se cambió por medio que contenía oligonucleótidos frescos y las células se incubaron durante 4 días más a 37 °C. Los niveles de proteína TGF-beta1 y TGF-beta2 en los sobrenadantes celulares se determinaron mediante ELISA. ASPH47 inhibe específicamente la expresión de TGF-beta2 de una manera dependiente de la dosis y no muestra un efecto inhibidor diana sobre TGF-beta1 (Figura 4a). El scrLNA de SQE ID NO: 22 no muestra ningún efecto inhibidor sobre la expresión de TGF-beta1 o TGF-beta2, incluso si las concentraciones se duplican (40, 13,33, 4,44, 1,48, 0,49, 0,16, 0,05 o 0,02 pM) en comparación con las concentraciones individuales de ASPH47. Los resultados para TGF-beta1 se indican en diamantes y los resultados para TGF-beta2 en cuadrados en las Figuras 4a y 4b.

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Oligonucleótido antisentido que consiste en 10 a 18 nucleótidos complementarios a la secuencia de ácido nucleico de TGF-beta2 de SEQ ID n O:1, en donde el oligonucleótido se selecciona del grupo que consiste en
CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), CAAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 2), AGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 3), AAGTATTTGGTCTC (SEQ ID NO: 4), AAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 5), AGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 6), AGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 6), AGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 6), AGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 6), AAGTATTTGGTCTC (SEQ ID NO: 6), AGTATTTGGTCTCCA (SEQ ID NO: 7), AGTATTTGGTCTCCA (SEQ ID NO: 7), AGTATTTGGTCTCCA (SEQ ID NO: 7), AGTATTTGGTCTCCA (SEQ ID NO: 7), AGTATTTGGTCTCCA (SEQ ID NO: 7), AGTATTTGGTCTCCA (SEQ ID NO: 7), AGTATTTGGTCTCCA (SEQ ID NO: 7), AAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 8), AAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 8), AAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 8), AAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 8), AAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 8), AAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 8), CAAAGTATTTGGTCTC (SEQ ID NO: 9), CAAAGTATTTGGTCT (SEQ ID NO: 10), CAAAGTATTTGGTC (SEQ ID NO: 11), AAAGTATTTGGTCTCC (SEQ ID NO: 12), AAAGTATTTGGTCTC (SEQ ID NO: 13).
AAAGTATTTGGTCT (SEQ ID NO: 14), AAAGTATTTGGTC (SEQ ID NO: 15), AAGTATTTGGTCT (SEQ ID NO 16), AAGTATTTGGTC (SEQ ID NO: 17), AGTATTTGGTCTC (SEQ ID NO:18) y AGTATTTGGTCT (SEQ ID NO 19), AGTATTTGGTC (SEQ ID NO: 20),
en donde los nucleótidos en letras negritas son oligonucleótidos modificados con LNA.
2. Una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los oligonucleótidos antisentido de la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.
3. Oligonucleótido antisentido de acuerdo con la reivindicación 1 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 2 para su uso en un método de prevención y/o tratamiento de un tumor maligno y/o benigno, una enfermedad inmunológica, fibrosis o una enfermedad oftálmica.
4. Composición farmacéutica u oligonucleótido antisentido para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el tumor se selecciona del grupo que consiste en tumores sólidos, tumores sanguíneos, leucemias, metástasis tumorales, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, granulomas piógenos, psoriasis, astrocitoma, blastoma, tumor de Ewing, craneofaringioma, ependimoma, meduloblastoma, glioma, hemangioblastoma, linfoma de Hodgkin, mesotelioma, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, pinealoma, retinoblastoma, sarcoma, seminoma, tumor de Wilm o se selecciona del grupo de carcinoma del conducto biliar, carcinoma de vejiga, tumor cerebral, cáncer de mama, carcinoma broncogénico, carcinoma de riñón, cáncer de cuello uterino, coriocarcinoma, cistadenocarcinoma, carcinoma embrionario, carcinoma epitelial, cáncer de esófago, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, cáncer de cabeza, carcinoma de hígado, carcinoma de pulmón, carcinoma medular, cáncer de cuello, carcinoma de células no pequeñas de pulmón/broncogénico, cáncer de ovario, carcinoma de páncreas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cáncer de próstata, carcinoma de intestino delgado, carcinoma de próstata, cáncer del recto, carcinoma de células renales, cáncer de piel, carcinoma de células pequeñas de pulmón/broncogénico, carcinoma de células escamosas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma testicular y cáncer de útero.
5. Composición farmacéutica u oligonucleótido antisentido para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la enfermedad oftálmica se selecciona del grupo que consiste en glaucoma, opacificación capsular posterior, ojo seco, degeneración macular, por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad, edema macular diabético, catarata, vitreorretinopatía proliferativa, síndrome de Marfan y Loeys-Dietz.
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