JP5650367B2 - 医薬組成物 - Google Patents
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Description
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある(国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む)。
は、モルホリノ誘導体であり、その活性誘導体は、モルホリノオリゴヌクレオチドである。
本発明の医薬組成物の投与は、当業者に既知であるいかなる手段において行われても良い。投与経路は、これに限定されないが、経口、経鼻、髄腔内、接眼、経肺、膣内、直腸、非経口(例えば筋肉注射、皮内、腫瘍内、静脈内、又は皮下、又は直接注射)、局所、経皮を含む。
吸入投与に対する別の実施形態において、本発明に従った使用に対する化合物は、エアロゾールスプレーの形態で便利に送達されてもよく、加圧パック又は噴霧器から、例えばジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素、又は他の適切なガスなどの適切な高圧ガス使用を伴っても良い。加圧されたエアロゾールの場合、投与量単位は、定量を送達するためにバルブを提供することにより決定されても良い。例えば吸入器中において使用するゼラチンなどのカプセル及びカートリッジは、化合物とラクトース又はデンプンなどの適切な粉末ベースとの粉末混合物を含んで処方されても良い。
別の方法を示していない場合、本試験に使用される配列はホスホロチオエートとして使用されるものである。本発明の本文中におけるTGF−β1、TGF−β2はそれぞれTGF−ベータ1、TGF−ベータ2と同じ意味である。AP12009及びAP11014はアンチセンスオリゴヌクレオチドと同義語であり、AP12009はTGF−ベータ2のm−RNAと相補的であるアンチセンスヌクレオチドであり、及びAP11014はTGF−ベータ1のm−RNAと相補的であるアンチセンスヌクレオチドである。
試験下における細胞株
結腸癌: HCT−116メラノーマ:MER191a,MER116,ME
S100a
NSCLC: SW900,NCI−H661
卵巣癌: EFO−21,Colo704
膵臓癌: PATU−8902,Hup−T3,Hup−T4
前立腺癌: PC−3,DU−145
細胞株はそれぞれAmerican Type Culture Collection(ATCC)、German Collection of Microorganisms、及びCell Culturesから入手した。すべての細胞は前記提供者による記述どおりに培養した。
肝細胞癌 HepG2
メラノーマ RPMI−7951,SK−Mel3
NSCLC A−549
腎臓癌 Caki−1
細胞株はさらにCell Line Service(CLS)から入手した。
腫瘍細胞を生成するために、1%FCS及び3%Panexin(Pan Biosystems)を補足した培地において上清細胞を培養し、培地中のTGF−β量を減少させた。細胞はリポフェクチン、リポフェクチンと各試験物質によって2日連続で処理するか、或いは未処理のまま放置した。培養上清は最後のリポフェクチン処理の後3日で取り除いた。腫瘍細胞により生成されたTGF−ベータは1N HCl(1:20希釈)を用いて室温10分間で活性化した。中和のためにNaOHを加えた。キラー細胞を活性化するリンフォカインを生成するために、健康な供血者から単離したヒト末梢血単球(PBMC)をIL−2の存在下(10ng/ml)腫瘍細胞上清と共にインキュベートした。活性化TGF−ベータ1を阻害するためにTGF−ベータ1特異抗体(1μg/ml,R&D Systems)を加えた。3日後、4h CARE−LASS試験において、標的として各癌細胞株に対するLAK細胞の細胞毒性活性を測定した。
1ミリリットルあたり約75.000細胞の各腫瘍細胞株を、ATCC(American Type Culture Collection)により推奨されているように、12ウェル平底マイクロタイタープレートにおける10%ウシ胎児血清(FCS,Gibco)を補足したMEM−Dulbecco培地中において培養した。24時間後及び48時間後、前記細胞を各TGF−ベータ1特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの指示濃度で6時間処理した。細胞再取り込みを促進するために、更に指示濃度のリポフェクチン(登録商標)(Invitrogen,USA)をこの2×6時間加えた。一部の実験はリポフェクチン(登録商標)を添加せずに行った。この6時間と最終3日間と2つの期間の間、細胞をリポフェクチン(登録商標)の不在下において上述のTGF−ベータ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド5μMで処理した。コントロール細胞は同じ期間純粋培地で培養した。さらに対照細胞は指示濃度のリポフェクチン(登録商標)で処理した。
細胞直径及び細胞増殖速度に依存しているが1ミリリットルあたり約25.000〜200.000細胞を、ATCC(American Type Culture Collection)により推奨されているように、12ウェル平底マイクロタイタープレートにおける10%仔ウシ胎児血清(FCS,Gibco)を補足したMEM−Dulbecco培地中において培養した。さらに、TGF−ベータ1特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを3日間添加したが、コントロール細胞は3日間未処理で維持した。
腫瘍細胞(約900,000/ウェル)を6ウェルプレートに播種した。次の日この細胞を検体物質及びリポフェクチンを用いて一度処理し、それぞれOptimen(Invitrogen)中6時間リポフェクチンで処理するか、或いは未処理で放置した。その後、滅菌プラスチックピペットチップを用いた標準的な方法において前記細胞の密集単層に傷をつけ(着手)、各ウェルに約1,000の幅の細胞のない帯域を作製した。その後、前記細胞を一度洗浄し、正常培地中37℃でインキュベートした。写真撮影することによってin vitroにおける遊走を記録し、NIH Image 1.6を使用したコンピューター援用画像解析によって前記遊走距離を定量した。核実験は4回ずつ行った。
遊走の球状モデルは別のもので記載されている通りに確立した(Nygaard et al.,1998)。腫瘍細胞は、2%寒天で被膜した組織培養フラスコにおいて培養した。3日後、多細胞球状体を96ウェルプレートに移し、未処理のまま放置、試験物質を用いて処理、或いは10ng/mlの組換えTGF−β2(R&D Systems)を用いて処理した。各細胞株の遊走反応を位相差顕微鏡(×10)を用いて分析した。
腫瘍細胞から分泌されたTGF−β1及びTGF−β2の量はそれぞれELISAによって測定した。簡便に腫瘍細胞(細胞の大きさと細胞成長によるが、15,000〜200,000)を12ウェルの組織培養プレート中に播種し、陽イオン性脂質(リポフェクチン試薬、Gibco BRL)の存在下、無血清Optimem培地(Invitrogen)中、試験下のオリゴヌクレオチドを用いて6時間2日連続で処理、又は未処理のまま放置した。その後この細胞を5μmol/AP11014の存在下で培養、又は未処理のまま放置した。72時間後、リポフェクチン及び試験下のオリゴヌクレオチドを用いて2回目の処理を行い、この細胞培養上清を収集した。標準TGF−β1−ELISA−Kit及びTGF−β2−ELISA−Kit(Quantikine,R&D Systems,USA)を用いて上清中のTGF−β1/β2の量を測定した。
実施例7において記載したようにTGF−β1特異的ELISAを用いて分析し、リポフェクチン3μg/mlの存在下、配列ID番号14からのホスホロチオエート200nMによって、結腸癌細胞株HCT−116におけるTGF−β1の分泌が100%に合わせた未処理コントロールと比較して約13.8%減少した。別の増殖実施例においては、約46%減少した。
実施例3に従った増殖試験において、リポフェクチン3μg/mlの存在下、配列ID番号14によって、結腸癌細胞株(HCT−116)の増殖が100%に合わせた未処理コントロールと比較して約35%減少した。配列ID番号14は200nMol用いた。
実施例5に従ったスクラッチ試験において、配列ID番号14は、リポフェクチン3μg/mlの存在下200nMの濃度において、結腸癌細胞株の遊走を顕著に抑制した。
TGF−β抑制
実施例7に記載したようにTGF−β1特異的ELISAを用いて分析し、リポフェクチン6μg/mlの存在下、肝細胞癌細胞株HepG2におけるTGF−β1の分泌が配列ID番号14からのホスホロチオエートによって、100%に合わせた未処理コントロールと比較して約75%抑制された。
実施例3に従った増殖試験において、6μg/mlのリポフェクチンの存在下、配列ID番号14は400nM濃度において、肝細胞癌細胞株HepG2の増殖を100%に合わせた未処理コントロールと比較して約39%減少させた。
TGF−ベータ1
実施例7において記載したようにTGF−β1特異的ELISAを用いて分析し、1μg/mlのリポフェクチンの存在下、メラノーマ癌細胞株MER−116におけるTGF−β1の分泌が配列ID番号14からのホスホロチオエートによって、100%に合わせた未処理コントロールと比較して約0%減少した。
実施例7において記載したようにTGF−β1特異的ELISAを用いて分析し、メラノーマ癌細胞株MES−100aにおけるTGF−ベータの分泌が配列ID番号14からのホスホロチオエート10μMによって、100%に合わせた未処理コントロールと比較して約23%減少した。
実施例7において記載したようにTGF−β2特異的ELISAを用いて分析し、6μg/mlのリポフェクチンの存在下、メラノーマ細胞株RPMI−7951におけるTGF−β2の分泌が配列ID番号30からのホスホロチオエート400nMによって、100%に合わせた未処理コントロールと比較して約14.2%減少した。
実施例3に従った増殖試験において、リポフェクチン3μg/mlの存在下、配列ID番号14は、100%に合わせた未処理コントロールと比較して、50nM濃度においては約33%、200nM濃度においては約23%、メラノーマ細胞株(MER−116)の増殖を減少させた。A−549細胞株を用いた別の試験において、前記増殖は100%に合わせた未処理コントロールと比較して約0.4%減少した。
実施例3に従った増殖試験において、リポフェクチン6μg/mlの存在下、配列ID番号30は、100%に合わせた未処理コントロールと比較して、400nM濃度において約17.8%までメラノーマ細胞株(RPMI−7951)の増殖を減少させた。
TGF−β1抑制
実施例7に記載したようにTGF−β1特異的ELISAを用いて分析し、リポフェクチン3μg/mlの存在下、配列ID番号14からのホスホロチオエートによって、100%に合わせた未処コントロールと比較して、非小細胞肺癌株SW−900におけるTGF−β1の分泌が約34%減少し、NCI−H661において約38%減少した。
実施例3に従った増殖試験において、配列ID番号14は、リポフェクチン3μg/mlの存在下、100%に合わせた未処理コントロールと比較して、NSCLC細胞株(SW−900)の増殖を約30%減少させた。配列ID番号14は200nM濃度を適用した。実施例3に従った増殖試験の別の実施例において、配列ID番号14は200nM濃度においてNSCLC細胞株A−549の増殖を約36%減少させ、NCI−H661を約44%減少させた。
実施例5に従ったスクラッチ試験において、配列ID番号14はリポフェクチン6μg/mlの存在下200nM及び400nMの濃度においてNSCLC癌細胞株SW−900の遊走を顕著に阻害した。配列ID番号14の前記両方の濃度で処理した前記細胞の17時間後の遊走は約50μmであったのに対し、リポフェクチンと共にインキュベートした前記細胞は約75μmの遊走であり、コントロール細胞は約80μmであった。24時間後の結果は、コントロール120μm、リポフェクチン処理細胞115μm、及び配列ID番号14処理細胞は約60μmであった。48時間の遊走は、コントロール及びリポフェクチン処理細胞が250μm、配列ID番号14で処理した細胞が前記両方の濃度において150μmであった。
TGF−ベータ1抑制
実施例7に記載したようにTGF−β1特異的ELISAを用いて分析し、リポフェクチン3μg/mlの存在下、配列ID番号14からの10nMのホスホチオエートによって、100%にあわせた未処理コントロール細胞と比較して、卵巣癌Colo 704におけるTGF−β1の分泌が約54%減少した。
実施例7に記載したようにTGF−β2特異的ELISAを用いて分析し、リポフェクチン3μg/mlの存在下、配列ID番号30からの200nMのホスホロチオエートによって、100%に合わせた未処理コントロールと比較して、卵巣癌EFO−21におけるTGF−β2の分泌が約31%減少した。
TGF−ベータ1:実施例3に従った増殖試験において、リポフェクチン3μg/mlの存在下、配列ID番号14は50nM濃度において、100%にあわせた未処理コントロールと比較して卵巣癌細胞株Colo704の増殖を約54%減少させた。
TGF−ベータ1抑制
実施例7において記載したようにTGF−β1特異的ELISAを用いて分析し、配列ID番号14からのホスホチオエート10μMによって、100%に合わせた未処理コントロールと比較して膵臓癌Hup T3におけるTGF−β1の分泌が約74%減少した。
実施例7において記載したように、TGF−ベータ2特異的ELISAを用いて分析し、リポフェクチン3μg/mlの存在下、配列ID番号30からのホスホロチオエート200nMによって、100%に合わせた未処理コントロールと比較して、膵臓癌細胞株Hup−T3におけるTGF−β2の分泌が約2%減少し、さらにPATU−8902においては約10%減少した。
実施例3に従った増殖試験において、配列ID番号30は200nM濃度において、リポフェクチン3μg/mlの存在下、100%に合わせた未処理コントロールと比較して、膵臓癌細胞株Hup−T3の増殖を約1%減少させ、細胞株PATU−8902における増殖を約10%減少させた。
実施例4に従った増殖試験において、配列ID番号14は10μM濃度において、リポフェクチン3μg/mlの存在下、100%に合わせた未処理コントロールと比較して、膵臓癌細胞株Hup−T3の増殖を約13%減少させ、細胞株PATU−8902においては約10%減少させた。
膵臓細胞株PATU−8902の遊走は、実施例6の手順に従って測定し、5μMol/l濃度の配列ID番号30は未処理対照と比較して約65時間ほぼ完全に阻害したが、コントロール細胞の球状体の直径は同じ期間において約1000μm増大した。
TGF−ベータ1抑制
実施例7において記載したようにTGF−β1特異的ELISAを用いて分析し、配列ID番号14からのホスホロチオエート200nMによって、リポフェクチン3μg/mlの存在下、100%に合わせた未処理コントロールと比較して、前立腺癌細胞株PC−3におけるTGF−β1の分泌を約36%減少させ、DU−145においては約57%減少させた。
実施例7において示したようにTGF−β2特異的ELISAを用いて分析し、配列ID番号14からのホスホロチオエート200nMによって、リポフェクチン3μg/mlの存在下、100%に合わせた未処理コントロールと比較して、前立腺細胞癌株PC−3におけるTGF−β2の分泌が約19%減少し、DU−145においては約20%減少した。
実施例3に従った増殖試験において、配列ID番号14は200nM濃度において、リポフェクチン3μg/mlの存在下、100%に合わせた未処理コントロールと比較して、前立腺癌細胞株PC−3の増殖を約74%減少させた。
実施例3に従った増殖試験において、配列ID番号30は200nM濃度において、リポフェクチン3μg/mlの存在下、100%に合わせた未処理コントロールと比較して、前立腺癌細胞株PC−3の増殖を約29%減少させ、さらにDU−145においては約34%減少させた。
実施例5に従ったスクラッチ試験において、配列ID番号14は400nMの濃度において、リポフェクチン6μg/mlの存在下前立腺癌細胞株PC−3の遊走を阻害した。配列ID番号14を用いて処理した細胞の17時間後の遊走が約37μmであったのに対して、リポフェクチンと共にインキュベートした細胞は約140μmであり、コントロール細胞は約165μmであった。24時間後の結果は、コントロールにおいて288μm、リポフェクチン処理細胞において213μm、及び配列ID番号14処理細胞において約60μmであった。48時間後の移動は、コントロールにおいて約366μm、リポフェクチン処理細胞において328μm、配列ID番号14処理細胞において約150μmであった。
TGF−ベータ1抑制
実施例7において記載したようにTGF−β1特異的ELISAを用いて分析し、リポフェクチン3μg/mlの存在下、100%に合わせた未処理コントロールと比較して、配列ID番号14からのホスホロチオエート200nMは、腎臓癌細胞株Caki−1におけるTGF−β1の分泌を約4%減少させた。
実施例3に従った増殖試験において、配列ID番号14は200nMの濃度において、リポフェクチン3μg/mlの存在下、100%に合わせた未処理コントロールと比較して、腎臓癌細胞株Caki−1における増殖を約5%減少させた。
オリゴデオキシ−ヌクレオチドの合成方法は、亜リン酸トリエステル化学を用いたヌクレオシドの保護を含む5段階によって実施される。最初のヌクレオチドは、5’−ジメトキシトリチル−デオキシアデノシン(N4ベンゾイル)−N,N’−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホアミド(01M)として導入し、Cは5’ジメトキシトリチル−デオキシシチジン(N4ベンゾイル)−N,N’−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホアミドによって導入し、Gは5’−ジメトキシトリチル−デオキシグアノシン(N8イソブチリル)−N,N’−ジイソプロピル−2−シアノエチルホスホアミドとして導入し、さらにTは5’−ジメトキシトリチル−デオキシチミジン−N,N’−ジ−イソプロピル−2−シアノエチルホスホアミドとして導入した。前記ヌクレオシドは好ましくはアセトニトリル中0.1M濃度において適用した。
最終ヌクレオチドを添加した後、アンモニア溶液中インキュベートすることによって、デオキシヌクレオチドを固体支持体から分割した。環外(exoxyclic)の保護基をさらにアンモニア中でインキュベートすることによって除去した。その後、前記アンモニアを真空下でエバポレートした。シリカC18固定相逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて、より短い失敗混合物から5’DMT保護基を有する全長(full−length)合成生成物を分離した。生成物ピークからの溶出物を収集し、真空下で乾燥し、酢酸中におけるインキュベートにより5’−DMT保護基を開裂し、その後酢酸を真空下でエバポレートした。前記合成生成物を純水中に可溶化させ、ジエチルエーテルを用いて3回抽出した。その後前記生成物を真空中で乾燥した。別に、HPLC−AXクロマトグラフィーを行い、生成物ピークの溶出物を過剰のTris−バッファーに対して透析し、その後純水で透析した。最終生成物を凍結乾燥して乾燥保存した。
驚くべきことに、高値TGF−ベータ2によって阻害される膵臓癌細胞株PA−TU−8902における細胞媒介性毒性は、リポフェクチン3μg/mlの存在下、200nMの配列ID番号30によってほとんど完全に回復した。前記試験は、腫瘍細胞に対する抹消血単核細胞(PBMC)の異なる比(10:1、5:1、2.5:1)によって確立した。前記細胞媒介細胞毒性の各回復は、80%、88%、及び100%であった。結果は三回のものを採用した。同等の結果が、非小細胞肺癌細胞株K562、結腸癌細胞株HCT−116において見出された。
TGF−ベータ2−膵臓癌細胞株PA−TU−8902
驚くべきことに、リポフェクチン6μg/mlの存在下、400nMの配列ID番号30を用いて処理したPA−TU−8902の細胞培養上清中において培養したPBMCのHup−T3標的細胞における細胞媒介性細胞毒性は、エフェクター:標的細胞比(20:1、10:1、5:1、2.5:1、1.25:1)において未処理標的細胞と比較して、約140〜400%増大した。結果は4回のもの採取した。
高値TGF−ベータ1によって阻害された細胞媒介細胞毒性は、リポフェクチン6μg/mlの存在下、400nMの配列ID番号30によって結腸癌細胞株K562において完全に回復した。前記試験は腫瘍細胞に対する末梢血単核細胞(PBMC)の異なる比(20:1、10:1、5:1、2.5:1、1.25:1)によって確立した。これらすべての比において細胞媒介性細胞毒性の回復は100%であった。結果は3回の試験のものを採用した。
驚くべきことに、リポフェクチン6μg/mlの存在下、400nMの配列ID番号30を用いて処理したHCT−116の細胞培養上清中において培養したPBMCのK562標的細胞における細胞媒介性細胞毒性は、エフェクター:標的細胞比(20:1、10:1、5:1、2.5:1、1.25:1)において未処理標的細胞と比較して、約170〜285%増大した。結果は4回のもの採取した。
驚くべきことに、リポフェクチン3μg/mlの存在下、200nMの配列ID番号30を用いて処理したPS−TU−8902の細胞培養上清中において培養したPBMCのHup−T3標的細胞における細胞媒介性細胞毒性は、エフェクター:標的細胞比(10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.625:1)において未処理標的細胞と比較して、約250〜415%増大した。結果は4回のもの採取した。
TGF−ベータ1:膵臓癌細胞株PC−3
驚くべきことに、リポフェクチン6μg/mlの存在下、400nMの配列ID番号30を用いて処理したPC−3細胞の細胞培養上清中において培養したPBMCのK562標的細胞における細胞媒介性細胞毒性は、エフェクター:標的細胞比(20:1、10:1、5:1、2.5:1、1.25:1)において未処理標的細胞と比較して、約130〜270%増大した。結果は4回のもの採取した。
TGF−ベータ1 アンチセンスオリゴヌクレオチド
Claims (4)
- 癌治療における転移形成を阻害するための薬学的組成物であって、配列ID番号30において示した配列において同定されるオリゴヌクレオチドを有する、組成物。
- 請求項1記載の組成物において、前記オリゴヌクレオチドは、前記転移形成に関与するタンパク質の合成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、組成物。
- 請求項1又は2記載の組成物において、前記オリゴヌクレオチドは、TGF−ベータ2の生成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、組成物。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の組成物において、前記癌は、胆管癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、気管支癌、腎臓癌、子宮頸癌、絨毛癌、嚢胞腺癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、胚性癌腫、子宮内膜癌、上皮性癌、食道癌、嚢胞癌、胃癌、頭頸部癌、肝細胞癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、髄様癌、非小細胞気管支/胚癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、乳頭癌、乳頭腺癌、前立腺癌、小腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌、脂腺癌、皮膚癌、非小細胞気管支/肺癌、軟組織癌、扁平上皮細胞癌、睾丸癌、子宮癌、聴神経腫瘍、神経線維腫、トラコーマ、及び化膿性肉芽腫、前癌状態の腫瘍、芽細胞腫、ユーイング腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、血管細胞腫、髄芽細胞腫、メラノーマ、中皮腫、神経芽腫、神経線維腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、肉腫(血管肉腫、軟骨肉腫、内皮性肉腫、線維肉腫、神経膠腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ内皮性肉腫、リンパ管肉腫、メラノーマ、髄膜腫、筋肉腫、骨原性肉腫、骨肉腫を含む)、セミノーマ、ウィルムス腫瘍、及び/又は多発性骨髄腫からなる群から選択されるものである、組成物。
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