TW202016301A - 肝外遞送技術 - Google Patents

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瓦桑特 賈達夫
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卡蘭索塔西爾 Ｇ 拉吉夫
穆西亞 馬諾哈蘭
亞歷山大 Ｖ 可因
穆蘇沙米 傑雅拉曼
克勞斯 夏里西
亞當 卡斯托里諾
克里斯多福 Ｓ 泰利
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Abstract

本發明之一個態樣係關於雙股iRNA劑，其包含與靶基因互補之反義股；與該反義股互補之義股；及任擇地經由連接子或載體與至少一股上之一或多個內部位置接合的一或多個親脂性部分。本發明之另一個態樣係關於基因沉默之方法，其包含向有需要之細胞或個體投與治療有效量之親脂性部分接合之雙股iRNA。

Description

肝外遞送技術
本申請案主張2018年5月7日申請之美國臨時申請案第62/668,072號；2018年9月28日申請之美國臨時申請案第62/738,747號；及2018年11月29日申請之美國臨時申請案第62/773,082號之優先權，其均以全文引用之方式併入本文中。
本案係有關於肝外遞送技術。
發明背景
活體內有效遞送iRNA劑至細胞需要特異性靶向及對細胞外環境，特別是血清蛋白之實質性保護。基於RNAi之治療劑顯示用於治療肝臟相關病症之有前景的臨床資料。然而，siRNA遞送至肝外組織仍為一個障礙，限制基於siRNA之療法的使用。
限制活體內iRNA劑之實驗及治療應用的因素之一為有效遞送完整siRNA之能力。特定困難已與非病毒基因活體內轉移至視網膜中相關。其中一個挑戰為克服阻礙視網膜轉染之內界膜。另外，已顯示玻璃體之帶負電荷的糖與陽性DNA-轉染劑複合物相互作用，促進其聚集，其阻礙擴散及細胞攝取。
由於游離寡核苷酸無法穿過之血腦屏障(BBB)，寡核苷酸向中樞神經系統(CNS)之遞送引起特定問題。將寡核苷酸遞送至CNS中之一種方式係藉由鞘內遞送(intrathecal delivery)。然而，寡核苷酸亦需要有效內化至CNS之靶細胞中以實現期望的治療效果。先前的研究通常使用諸如脂質體、陽離子脂質及奈米粒子形成複合物之遞送試劑，以幫助寡核苷酸細胞內內化至神經元起源之細胞中。
因此，持續需要用於活體內遞送siRNA分子而不使用組織遞送試劑之新的改良方法，以實現及增強iRNA劑之治療潛力。
發明概要
本發明之一個態樣提供一種雙股iRNA劑，其包含： 與靶基因互補之反義股(antisense strand)；與該反義股互補之義股(sense strand)；及任擇地經由連接子或載體與至少一股上之一或多個內部位置接合(conjugated)的一或多個親脂性部分。
在一些實施例中，藉由辛醇-水分配係數logKow 量測之親脂性部分的親脂性超過0。親脂性部分之logKow 可超過1、超過1.5、超過2、超過3、超過4、超過5或超過10。
在一些實施例中，藉由雙股iRNA劑之血漿蛋白結合分析中之未結合分數量測的雙股iRNA劑之疏水性超過0.2。在一個實施例中，測定之血漿蛋白結合分析為使用人類血清白蛋白之電泳遷移率變化分析(electrophoretic mobility shift assay)(EMSA)。藉由結合分析中未結合之siRNA的分數量測的雙股iRNA劑之疏水性超過0.15、超過0.2、超過0.25、超過0.3、超過0.35、超過0.4、超過0.45或超過0.5以增強siRNA之活體內遞送。
在一些實施例中，親脂性部分為脂族、環狀諸如脂環族、或多環諸如聚脂環化合物，諸如類固醇(例如固醇)或直鏈或分支鏈脂族烴。例示性親脂性部分為脂質、膽固醇、視黃酸、膽酸、金剛烷乙酸(adamantane acetic acid)、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉氧基己醇(geranyloxyhexyanol)、十六烷基甘油、冰片(borneol)、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、二甲氧基三苯甲基(dimethoxytrityl)或啡噁嗪(phenoxazine)。
適合之親脂性部分亦包括含有飽和或不飽和C4 -C30 烴鏈(例如C4 -C30 烷基或烯基)及選自由以下組成之群之任擇官能基的親脂性部分：羥基、胺、羧酸、磺酸酯基、磷酸酯基、硫醇、疊氮基及炔。該等官能基可用於將親脂性部分附接至iRNA劑。在一些實施例中，親脂性部分含有飽和或不飽和C6 -C18 烴鏈(例如直鏈C6 -C18 烷基或烯基)。在一個實施例中，親脂性部分含有飽和或不飽和C16 烴鏈(例如直鏈C16 烷基或烯基)。
在一些實施例中，親脂性部分為C6 -C30 酸(例如，己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、油酸、亞麻油酸、花生四烯酸、順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、維生素A、維生素E、膽固醇等)或C6 -C30 醇(例如，己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇、十三烷醇、十四烷醇、十五烷醇、十六烷醇、十七烷醇、十八烷醇、油醇、亞麻醇、花生四烯醇、順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯醇、視黃醇、維生素E、膽固醇等)。
親脂性部分可經由直接附接於iRNA劑之核糖而與iRNA劑接合。或者，親脂性部分可經由連接子或載體與iRNA劑接合。
在某些實施例中，親脂性部分經由一或多個連接子(繫鏈)與iRNA劑接合。
在一些實施例中，親脂性部分經由連接子與雙股iRNA劑接合，連接子含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、醯胺、馬來醯亞胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺醯胺鍵、點擊反應之產物(例如，來自疊氮化物-炔環加成之三唑)或胺基甲酸酯。
在一些實施例中，至少一個連接子(繫鏈)為氧化還原可裂解連接子(諸如還原可裂解連接子；例如二硫化物基團)、酸可裂解連接子(例如，腙基、酯基、縮醛基或縮酮基)、酯酶可裂解連接子(例如，酯基)、磷酸酶可裂解連接子(例如，磷酸酯基)或肽酶可裂解連接子(例如，肽鍵)。
在其他實施例中，至少一個連接子(繫鏈)為生物可裂解連接子，其選自由以下組成之群：DNA、RNA、二硫化物、醯胺；半乳糖胺、葡糖胺、葡萄糖、半乳糖、甘露糖之官能化單糖或寡糖及其組合。
在某些實施例中，親脂性部分經由置換一或多個核苷酸之載體與雙股iRNA劑接合。載體可為環狀基團或非環狀基團。在一個實施例中，環狀基團係選自由以下組成之群：吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊環、噁唑啶基、異噁唑啶基、嗎啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹喏啉基、噠嗪酮基、四氫呋喃基及十氫萘。在一個實施例中，非環狀基團為基於絲胺醇主鏈或二乙醇胺主鏈之部分。
在一些實施例中，載體置換雙股iRNA劑之內部位置中之一或多個核苷酸。
在其他實施例中，載體置換義股或反義股末端之核苷酸。在一個實施例中，載體置換義股3'端上之末端核苷酸，從而充當保護義股3'端之端帽。在一個實施例中，載體為具有胺之環狀基團，例如，載體可為吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊環基、噁唑啶基、異噁唑啶基、嗎啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹喏啉基、噠嗪酮基、四氫呋喃基或十氫萘基。
在一個實施例中，親脂性部分與至少一股上之一或多個內部位置接合，其包括除股各端之末端二個位置之外的所有位置。在一個實施例中，親脂性部分與至少一股上之一或多個內部位置接合，其包括除股各端之末端三個位置之外的所有位置。
在一個實施例中，至少一個親脂性部分與雙螺旋區之至少一端的一或多個位置接合，其包括雙螺旋區內之所有位置，但不包括突出端區或置換義股3'端之末端核苷酸的載體。
在一個實施例中，至少一個親脂性部分接合在雙螺旋區之反義股5'端的前五個鹼基對內的義股上。
在一個實施例中，至少一個親脂性部分接合在雙螺旋區之反義股5'端的前四個鹼基對內的義股上。
在一個實施例中，至少一個親脂性部分接合在雙螺旋區之反義股5'端的前三個鹼基對內的義股上。
在一個實施例中，至少一個親脂性部分接合在雙螺旋區之反義股5'端的前二個鹼基對內的義股上。
在一個實施例中，至少一個親脂性部分接合在雙螺旋區之反義股5'端的第一鹼基對上的義股上。
在一個實施例中，親脂性部分與至少一股上之一或多個內部位置接合，其不包括義股之裂解位點區。舉例而言，內部位置不包括自義股5'端計數之位置9-12。舉例而言，內部位置不包括自義股5'端計數之位置9-11。或者，內部位置不包括自義股3'端計數之位置11-13。
在一個實施例中，親脂性部分與至少一股上之一或多個內部位置接合，其不包括反義股之裂解位點區。舉例而言，內部位置不包括自義股5'端計數之位置12-14。
在一個實施例中，親脂性部分與至少一股上之一或多個內部位置接合，其不包括義股上自3'端計數之位置11-13及反義股上自5'端計數之位置12-14。
在一個實施例中，一或多個親脂性部分與以下內部位置中之一或多者接合：自各股之5'端計數，義股上之位置4-8及13-18，以及反義股上之位置6-10及15-18。
在一個實施例中，一或多個親脂性部分與以下內部位置中之一或多者接合：自各股之5'端計數，義股上之位置5、6、7、15及17，以及反義股上之位置15及17。
在一些實施例中，雙股iRNA劑之義股及反義股的長度各為15至30個核苷酸。
在一個實施例中，雙股iRNA劑之義股及反義股的長度各為19至25個核苷酸。
在一個實施例中，雙股iRNA劑之義股及反義股的長度各為21至23個核苷酸。
在一些實施例中，雙股iRNA劑包含至少一個末端上之單股突出端，例如長度為1-10個核苷酸之3'及/或5'突出端，例如具有1、2、3、4、5或6個核苷酸之突出端。在一些實施例中，二股在雙股區中具有至少一段1-5(例如，1、2、3、4或5)個單股核苷酸。在一個實施例中，單股突出端長度為1、2或3個核苷酸。在一些實施例中，雙股iRNA劑亦可具有平端，位於反義股之5'端(或義股之3'端)，或反之亦然。在一個實施例中，雙股iRNA劑在反義股之3'端包含3'突出端，且任擇地在反義股之5'端包含平端。在一個實施例中，雙股iRNA劑在義股之5'端具有5'突出端，且任擇地在反義股之5'端具有平端。在一個實施例中，雙股iRNA劑在iRNA雙螺旋體之二端具有二個鈍端。
在一個實施例中，雙股iRNA劑之義股長度為21個核苷酸，且反義股長度為23個核苷酸，其中該等股形成21個連續鹼基對之雙股區且在3'端具有2個核苷酸長的單股突出端。
在一些實施例中，親脂性部分與雙股iRNA劑之核鹼基、糖部分或核苷間鍵接合。
在一些實施例中，雙股iRNA劑進一步包含在反義股之5'端的磷酸酯或磷酸酯模擬物。在一個實施例中，磷酸酯模擬物為5'-乙烯基膦酸酯(VP)。
在一些實施例中，雙股iRNA劑之反義股的5'端不含有5'-乙烯基膦酸酯(VP)。
在一些實施例中，雙股iRNA劑進一步包含至少一個末端對掌性磷原子。
對核苷酸間鍵之位點特異性對掌性修飾可發生在股之5'端、3'端或5'端及3'端。此在本文中稱為「末端」對掌性修飾。末端修飾可發生在末端區之3'或5'末端位置，例如在股之末端核苷酸上或在最後2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸內之位置。對掌性修飾可發生在義股、反義股或義股及反義股。每個對掌性純磷原子可呈Rp構型或Sp構型及其組合。關於對掌性修飾及經對掌性修飾之dsRNA劑的更多詳情可見於2018年12月21日申請之名稱為「經對掌性修飾之雙股RNA劑(Chirally-Modified Double-Stranded RNA Agents)」的PCT/US18/67103，其以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，雙股iRNA劑進一步包含在反義股3'端之第一核苷酸間鍵處發生的具有Sp構型之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；在反義股5'端之第一核苷酸間鍵處發生的具有Rp構型之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；及在義股5'端之第一核苷酸間鍵處發生的具有Rp構型或Sp構型之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾。
在一個實施例中，雙股iRNA劑進一步包含在反義股3'端之第一及第二核苷酸間鍵處發生的具有Sp構型之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；在反義股5'端之第一核苷酸間鍵處發生的具有Rp構型之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；及在義股5'端之第一核苷酸間鍵處發生的具有Rp或Sp構型之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾。
在一個實施例中，雙股iRNA劑進一步包含在反義股3'端之第一、第二及第三核苷酸間鍵處發生的具有Sp構型之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；在反義股5'端之第一核苷酸間鍵處發生的具有Rp構型之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；及在義股5'端之第一核苷酸間鍵處發生的具有Rp或Sp構型之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾。
在一個實施例中，雙股iRNA劑進一步包含在反義股3'端之第一及第二核苷酸間鍵處發生的具有Sp構型之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；在反義股3'端之第三核苷酸間鍵處發生的具有Rp構型之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；在反義股5'端之第一核苷酸間鍵處發生的具有Rp構型之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；及在義股5'端之第一核苷酸間鍵處發生的具有Rp或Sp構型之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾。
在一個實施例中，雙股iRNA劑進一步包含在反義股3'端之第一及第二核苷酸間鍵處發生的具有Sp構型之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；在反義股5'端之第一及第二核苷酸間鍵處發生的具有Rp構型之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾；及在義股5'端之第一核苷酸間鍵處發生的具有Rp或Sp構型之鍵聯磷原子的末端對掌性修飾。
在一些實施例中，雙股iRNA劑在反義股上之前五個核苷酸處具有至少二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)。
在一些實施例中，反義股包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個磷酸酯核苷酸間鍵分開的二個具有一個、二個或三個硫代磷酸酯核苷酸間鍵的鏈段。
在一些實施例中，雙股iRNA劑進一步包含靶向配體，其靶向介導遞送至特定CNS組織的受體。在一個實施例中，靶向配體係選自由以下組成之群：血管肽-2 (Angiopep-2)、脂蛋白受體相關蛋白(LRP)配體、bEnd.3細胞結合配體、運鐵蛋白受體(TfR)配體、甘露糖受體配體、葡萄糖轉運蛋白及LDL受體配體。
在一些實施例中，雙股iRNA劑進一步包含靶向配體，其靶向介導遞送至眼組織的受體。在一個實施例中，靶向配體係選自由以下組成之群：反式視黃醇、RGD肽、LDL受體配體及基於碳水化合物之配體。在一個實施例中，靶向配體為RGD肽，諸如H-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-Cys-OH或Cyclo(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)。
在一些實施例中，雙股iRNA劑進一步包含靶向肝組織之靶向配體。在一些實施例中，靶向配體為基於碳水化合物之配體。在一個實施例中，靶向配體為GalNAc接合物(conjugate)。
所有上述態樣及實施例適用於具有與寡核苷酸上之一或多個內部位置接合之一或多個親脂性部分的寡核苷酸。在一些實施例中，100%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%或30%之寡核苷酸經修飾。舉例而言，當50%之寡核苷酸經修飾時，寡核苷酸中存在之所有核苷酸的50%含有如本文所述之修飾。
在一個實施例中，寡核苷酸為雙股dsRNA劑，且雙股dsRNA劑之至少50%的核苷酸獨立地經2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-去氧或2'-氟修飾。
在一個實施例中，寡核苷酸為反義的，且反義之至少50%的核苷酸獨立地經LNA、CeNA、2'-甲氧基乙基或2'-去氧修飾。
在一些實施例中，雙股iRNA劑在義股上具有少於12個、少於10個、少於8個、少於6個、少於4個、少於2個或不具有2'-F修飾。在一些實施例中，雙股iRNA劑在反義股上具有少於12個、少於10個、少於8個、少於6個、少於4個、少於2個或不具有2'-F修飾。
在一些實施例中，雙股iRNA劑在義股或反義股之任何位置上具有一或多個2'-F修飾。
在一些實施例中，雙股iRNA劑具有少於20%、少於15%、少於10%、少於5%的非天然核苷酸，或基本上不含非天然核苷酸。非天然核苷酸之實例包括無環核苷酸、LNA、HNA、CeNA、2'-O-甲氧基烷基(例如，2'-O-甲氧基甲基、2'-O-甲氧基乙基或2'-O-2-甲氧基丙基)、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-氟、2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)、2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)、2'-O-胺基丙基(2'-O-AP)、2'-ara-F、L-核苷修飾(諸如2'-修飾之L-核苷，例如2'-去氧-L-核苷)、BNA無鹼基糖、無鹼基環狀及開鏈烷基。
在一些實施例中，雙股iRNA劑具有大於80%、大於85%、大於90%、大於95%或幾乎100%的天然核苷酸。出於此等實施例之目的，天然核苷酸可包括具有2'-OH、2'-去氧及2'-OMe之天然核苷酸。
在一個實施例中，雙股iRNA劑包含各自具有15-30個核苷酸之長度的義股及反義股；在反義股上之前五個核苷酸處的至少二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)；其中雙螺旋區在19至25個鹼基對之間(較佳19、20、21或22個)；其中雙股iRNA劑具有少於20%、少於15%、少於10%、少於5%的非天然核苷酸，或基本上不具有非天然核苷酸。
在一個實施例中，雙股iRNA劑包含各自具有15-30個核苷酸之長度的義股及反義股；在反義股上之前五個核苷酸處的至少二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)；其中雙螺旋區在19至25個鹼基對之間(較佳19、20、21或22個)；其中雙股iRNA劑具有大於80%、大於85%、大於95%或幾乎100%的天然核苷酸，諸如具有2'-OH、2'-去氧或2'-OMe之天然核苷酸。
本發明之另一態樣係關於降低細胞中之靶基因表現的方法，其包含使該細胞與雙股iRNA劑接觸，該雙股iRNA劑包含與靶基因互補之反義股；與該反義股互補之義股；及任擇地經由連接子或載體與至少一股上之一或多個內部位置接合的一或多個親脂性部分。
在與雙股iRNA劑相關之本發明之第一態樣中，與親脂性部分及其與雙股iRNA劑之接合相關的所有上述實施例適合於與降低細胞中之靶基因表現的方法相關的本發明之此態樣。
在一個實施例中，細胞為肝外細胞。
本發明之另一態樣係關於降低個體體內之靶基因表現的方法，其包含向該個體投與雙股iRNA劑，包含使該細胞與雙股iRNA劑接觸，該雙股iRNA劑包含與靶基因互補之反義股；與該反義股互補之義股；及任擇地經由連接子或載體與至少一股上之一或多個內部位置接合的一或多個親脂性部分。
在與雙股iRNA劑相關之本發明之第一態樣中，與親脂性部分及其與雙股iRNA劑之接合相關的所有上述實施例適合於與降低個體體內之靶基因表現的方法相關的本發明之此態樣。
在一些實施例中，雙股iRNA劑係肝外投與。
在一個實施例中，雙股iRNA劑係鞘內投與。藉由鞘內投與雙股iRNA劑，該方法可降低腦或脊柱組織(例如皮質、小腦、頸椎、腰椎及胸椎)中之靶基因表現。
在一些實施例中，例示性靶基因為APP、ATXN2、C9orf72、TARDBP、MAPT(Tau)、HTT、SNCA、FUS、ATXN3、ATXN1、SCA1、SCA7、SCA8、MeCP2、PRNP、SOD1、DMPK及TTR。為了降低個體體內之此等靶基因的表現，可玻璃體內(intravitreally)投與雙股iRNA劑。藉由玻璃體內投與雙股iRNA劑，該方法可降低眼組織中之靶基因表現。
本發明之另一態樣係關於治療患有CNS病症之個體的方法，其包含向該個體投與治療有效量之雙股RNAi劑，從而治療該個體。雙股RNAi劑包含與靶基因互補之反義股；與該反義股互補之義股；及任擇地經由連接子或載體與至少一股上之一或多個內部位置接合的一或多個親脂性部分。
在與雙股iRNA劑相關之本發明之第一態樣中，與親脂性部分及其與雙股iRNA劑之接合相關的所有上述實施例適合於與治療患有CNS病症之個體的方法相關的本發明之此態樣。可藉由本發明之方法治療的例示性CNS病症包括阿茲海默病(alzheimer)、肌萎縮性側索硬化(ALS)、額顳葉型癡呆、亨廷頓病(huntington)、帕金森病(Parkinson)、脊髓小腦病、朊病毒病及拉福拉病(lafora)。
較佳實施例之詳細說明
本發明人尤其發現，將親脂性部分與雙股iRNA劑之至少一股上的一或多個內部位置接合為活體內玻璃體內遞送及鞘內遞送雙股iRNA提供令人驚訝的良好結果，致使有效進入CNS組織及眼組織且有效內化至CNS系統及眼系統之細胞中。
本發明之一個態樣提供一種雙股iRNA劑，其包含： 與靶基因互補之反義股；與該反義股互補之義股；及任擇地經由連接子或載體與至少一股上之一或多個內部位置接合的一或多個親脂部分。
術語「親脂體」或「親脂性部分」廣義上係指對脂質具有親和力之任何化合物或化學部分。表徵親脂性部分之親脂性的一種方式係藉由辛醇-水分配係數logKow ，其中Kow 為二相系統在平衡時化學物質在辛醇相中之濃度與其在水相中之濃度的比率。辛醇-水分配係數為實驗室量測之物質特性。然而，其亦可藉由使用歸因於化學物質之結構組分的係數來預測，該等係數係使用第一原理或經驗方法計算(參見例如Tetko等人,J. Chem. Inf. Comput. Sci. 41:1407-21 (2001)，其以全文引用之方式併入本文中)。其提供物質偏好非水性或油性環境而非水之傾向的熱力學量度(亦即其親水性/親脂性平衡)。原則上，當logKow 超過0時，化學物質具有親脂性。通常，親脂性部分之logKow 超過1、超過1.5、超過2、超過3、超過4、超過5或超過10。舉例而言，預測例如6-胺基己醇之logKow 為約0.7。使用相同方法，預測膽固醇基N-(己-6-醇)胺基甲酸酯之logKow 為10.7。
分子之親脂性可相對於其攜帶的官能基而改變。舉例而言，在親脂性部分之末端添加羥基或胺基可增加或降低親脂性部分之分配係數(例如logKow )值。
或者，與一或多個親脂性部分接合之雙股iRNA劑的疏水性可藉由其蛋白質結合特徵來量測。舉例而言，可確定雙股iRNA劑之血漿蛋白結合分析中的未結合分數與雙股iRNA劑之相對疏水性正相關，其可與雙股iRNA劑之沉默活性正相關。
在一個實施例中，測定之血漿蛋白結合分析為使用人類血清白蛋白之電泳遷移率變化分析(EMSA)。此結合分析之例示性方案詳細說明於實例14中。藉由結合分析中未結合之siRNA的分數量測的雙股iRNA劑之疏水性超過0.15、超過0.2、超過0.25、超過0.3、超過0.35、超過0.4、超過0.45或超過0.5，以增強siRNA之活體內遞送。
因此，將親脂性部分與雙股iRNA劑之內部位置接合為增強siRNA之活體內遞送提供最佳疏水性。
在某些實施例中，親脂性部分為脂族、環狀諸如脂環族、或多環諸如聚脂環化合物，諸如類固醇(例如固醇)或直鏈或分支鏈脂族烴。親脂性部分可一般包含烴鏈，其可為環狀或非環狀的。烴鏈可包含各種取代基及/或一或多個雜原子，諸如氧或氮原子。此類親脂性脂族部分包括但不限於飽和或不飽和C4 -C30 烴(例如C6 -C18 烴)、飽和或不飽和脂肪酸、蠟(例如脂肪酸及脂肪二醯胺之一元醇酯)、萜烯類(例如，C10 萜烯、C15 倍半萜烯、C20 二萜烯、C30 三萜烯及C40 四萜烯)及其他聚脂環烴。舉例而言，親脂性部分可含有C4 -C30 烴鏈(例如C4 -C30 烷基或烯基)。在一些實施例中，親脂性部分含有飽和或不飽和C6 -C18 烴鏈(例如直鏈C6 -C18 烷基或烯基)。在一個實施例中，親脂性部分含有飽和或不飽和C16 烴鏈(例如直鏈C16 烷基或烯基)。
親脂性部分可藉由此項技術中已知之任何方法附接至iRNA劑，包括經由已存在於親脂性部分中或引入iRNA劑中之官能基，諸如羥基(例如-CO-CH2 -OH)。已存在於親脂性部分中或引入iRNA劑中之官能基包括但不限於羥基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、疊氮基及炔。
iRNA劑與親脂性部分之接合可例如經由在羥基與烷基R-、烷醯基RCO-或經取代之胺甲醯基RNHCO-之間形成醚或羧基或胺甲醯基酯鍵來發生。烷基R可為環狀的(例如環己基)或非環狀的(例如直鏈或分支鏈的；及飽和或不飽和的)。烷基R可為丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基或十八烷基或其類似基團。
在一些實施例中，親脂性部分經由連接子與雙股iRNA劑接合，連接子含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、醯胺、馬來醯亞胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺醯胺鍵、點擊反應之產物(例如，來自疊氮化物-炔環加成之三唑)或胺基甲酸酯。
在另一個實施例中，親脂性部分為類固醇，諸如固醇。類固醇為含有全氫-1,2-環戊菲環系統之多環化合物。類固醇包括但不限於膽汁酸(例如膽酸、去氧膽酸及去氫膽酸)、皮質酮、地高辛(digoxigenin)、睪固酮、膽固醇及陽離子類固醇，諸如皮質酮。「膽固醇衍生物」係指例如藉由取代、添加或移除取代基衍生自膽固醇之化合物。
在另一個實施例中，親脂性部分為芳族部分。在此上下文中，術語「芳族」泛指單芳烴及多芳烴。芳基包括但不限於包含一至三個芳環之C6 -C14 芳基部分，其可視情況經取代；包含與烷基共價連接之芳基的「芳烷基」或「芳基烷基」，其中之任一者可獨立地任擇地經取代或未經取代；及「雜芳基」。如本文所用，術語「雜芳基」係指具有5至14個環原子，較佳5、6、9或10個環原子；具有在環陣列中共享之6、10或14個π電子，且除碳原子外具有一至約三個選自由氮(N)、氧(O)及硫(S)組成之群之雜原子的基團。
如本文所用，「經取代之」烷基、環烷基、芳基、雜芳基或雜環基為具有一至約四個、較佳一至約三個、更佳一或二個非氫取代基之基團。適合之取代基包括但不限於鹵基、羥基、硝基、鹵烷基、烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、烷氧基、芳氧基、胺基、醯胺基、烷基胺甲醯基、芳基胺甲醯基、胺基烷基、烷氧基羰基、羧基、羥烷基、烷磺醯基、芳磺醯基、烷磺醯胺基、芳磺醯胺基、芳烷基磺醯胺基、烷基羰基、醯氧基、氰基及脲基。
在一些實施例中，親脂性部分為芳烷基，例如2-芳基丙醯基部分。芳烷基之結構特徵經選擇以使得親脂性部分將活體內結合至少一種蛋白質。在某些實施例中，芳烷基之結構特徵經選擇以使得親脂性部分結合血清、血管或細胞蛋白。在某些實施例中，芳烷基之結構特徵促進與白蛋白、免疫球蛋白、脂蛋白、α-2-巨球蛋白或α-1-糖蛋白之結合。
在某些實施例中，配體為萘普生或萘普生之結構衍生物。合成萘普生之程序可見於美國專利第3,904,682號及美國專利第4,009,197號，其以全文引用之方式併入本文中。萘普生之化學名稱為(S)-6-甲氧基-α-甲基-2-萘乙酸，結構為
Figure 02_image001
。
在某些實施例中，配體為布洛芬或布洛芬之結構衍生物。合成布洛芬之程序可見於美國專利第3,228,831號，其以全文引用之方式併入本文中。布洛芬之結構為
Figure 02_image003
。
額外的例示性芳烷基在美國專利第7,626,014號中說明，其以全文引用之方式併入本文中。
在另一個實施例中，適合之親脂性部分包括脂質、膽固醇、視黃酸、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、布洛芬、萘普生、二甲氧基三苯甲基或啡噁嗪。
在一些實施例中，親脂性部分為C6 -C30 酸(例如，己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、油酸、亞麻油酸、花生四烯酸、順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、維生素A、維生素E、膽固醇等)或C6 -C30 醇(例如，己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇、十三烷醇、十四烷醇、十五烷醇、十六烷醇、十七烷醇、十八烷醇、油醇、亞麻醇、花生四烯醇、順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯醇、視黃醇、維生素E、膽固醇等)。
在某些實施例中，多於一個親脂性部分可併入雙股iRNA劑中，特別是當親脂性部分具有低親脂性或疏水性時。在一個實施例中，二個或更多個親脂性部分併入雙股iRNA劑之同一股中。在一個實施例中，雙股iRNA劑之各股具有一或多個併入的親脂性部分。在一個實施例中，二個或更多個親脂性部分併入雙股iRNA劑之相同位置(亦即，相同核鹼基、相同糖部分或相同核苷間鍵)。此可藉由例如經由載體接合二個或更多個親脂性部分，及/或經由分支鏈連接子接合二個或更多個親脂性部分，及/或經由一或多個連接子接合二個或更多個親脂性部分，使得一或多個連接子連續連接親脂性部分來達成。
親脂性部分可經由直接附接於iRNA劑之核糖而與iRNA劑接合。或者，親脂性部分可經由連接子或載體與雙股iRNA劑接合。
在某些實施例中，親脂性部分可經由一或多個連接子(繫鏈)與iRNA劑接合。
在一個實施例中，親脂性部分經由連接子與雙股iRNA劑接合，該連接子含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、醯胺、馬來醯亞胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺醯胺鍵、點擊反應之產物(例如，來自疊氮化物-炔環加成之三唑)或胺基甲酸酯。一些例示性鍵聯在圖1、實例2、3、5、6及7中示出。連接子 / 繫鏈
連接子/繫鏈在「繫鏈附接點(TAP)」處與親脂性部分連接。連接子/繫鏈可包括任何C1 -C100 含碳部分(例如C1 -C75 、C1 -C50 、C1 -C20 、C1 -C10 ；C1 、C2 、C3 、C4 、C5 、C6 、C7 、C8 、C9 或C10 )，且可具有至少一個氮原子。在某些實施例中，氮原子在連接子/繫鏈上形成末端胺基或醯胺基(NHC(O)-)之一部分，其可充當親脂性部分之連接點。連接子/繫鏈(加下劃線)之非限制性實例包括TAP-(CH2 )n NH- ；TAP-C(O)(CH2 )n NH- ；TAP-NR ''''(CH2 )n NH- ；TAP-C(O)-(CH2 )n -C(O)- ；TAP-C(O)-(CH2 )n -C(O)O- ； TAP-C(O)-O- ；TAP-C(O)-(CH2 )n -NH-C(O)- ；TAP-C(O)-(CH2 )n - ；TAP-C(O)-NH- ；TAP-C(O)- ；TAP-(CH2 )n -C(O)- ；TAP-(CH2 )n -C(O)O- ；TAP-(CH2 )n - ；或TAP-(CH2 )n -NH-C(O)- ；其中n為1-20 (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)且R''''為C1 -C6 烷基。較佳地，n為5、6或11。在其他實施例中，氮可形成末端氧胺基例如-ONH2 或肼基-NHNH2 之一部分。連接子/繫鏈可任擇地例如經羥基、烷氧基、全鹵烷基取代，及/或任擇地插入有一或多個額外雜原子，例如N、O或S。較佳繫鏈配體可包括例如TAP-(CH2 )n NH( 配體) ；TAP-C(O)(CH2 )n NH( 配體) ；TAP-NR ''''(CH2 )n NH( 配體) ；TAP-(CH2 )n ONH( 配體) ；TAP-C(O)(CH2 )n ONH( 配體) ；TAP-NR ''''(CH2 )n ONH( 配體) ；TAP-(CH2 )n NHNH2 ( 配體) ；TAP-C(O)(CH2 )n NHNH2 ( 配體) ；TAP-NR ''''(CH2 )n NHNH2 ( 配體) ；TAP-C(O)-(CH2 )n -C(O)( 配體) ；TAP-C(O)-(CH2 )n -C(O)O( 配體) ； TAP-C(O)-O( 配體) ；TAP-C(O)-(CH2 )n -NH-C(O)( 配體) ；TAP-C(O)-(CH2 )n ( 配體) ；TAP-C(O)-NH( 配體) ；TAP-C(O)( 配體) ；TAP-(CH2 )n -C(O) ( 配體) ；TAP-(CH2 )n -C(O)O( 配體) ；TAP-(CH2 )n ( 配體) ；或TAP-(CH2 )n -NH-C(O)( 配體) 。在一些實施例中，胺基封端的連接子/繫鏈(例如NH2 、ONH2 、NH2 NH2 )可與配體形成亞胺基鍵(亦即，C=N)。在一些實施例中，胺基封端的連接子/繫鏈(例如NH2 、ONH2 、NH2 NH2 )可例如用C(O)CF3 醯化。
在一些實施例中，連接子/繫鏈可用巰基(亦即SH)或烯烴(例如CH=CH2 )封端。舉例而言，繫鏈可為TAP-(CH2 )n -SH 、TAP-C(O)(CH2 )n SH 、TAP-(CH2 )n -(CH=CH2 ) 或TAP-C(O)(CH2 )n (CH=CH2 ) ，其中n可如別處所述。繫鏈可任擇地例如經羥基、烷氧基、全鹵烷基取代，及/或任擇地插入有一或多個額外雜原子，例如N、O或S。雙鍵可以是順式或反式或E 或Z 。
在其他實施例中，連接子/繫鏈可包括親電子部分，較佳在連接子/繫鏈之末端位置。例示性親電子部分包括例如醛、烷基鹵、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、硝基苯磺酸酯或溴苯磺酸酯，或活化的羧酸酯，例如NHS酯或五氟苯酯。較佳連接子/繫鏈(加下劃線)包括TAP-(CH2 )n CHO ；TAP-C(O)(CH2 )n CHO ；或TAP-NR ''''(CH2 )n CHO ，其中n為1-6且R''''為C1 -C6 烷基；或TAP-(CH2 )n C(O)ONHS ；TAP-C(O)(CH2 )n C(O)ONHS ；或TAP-NR ''''(CH2 )n C(O)ONHS ，其中n為1-6且R''''為C1 -C6 烷基；TAP-(CH2 )n C(O)OC6 F5 ；TAP-C(O)(CH2 )n C(O) OC6 F5 ；或TAP-NR ''''(CH2 )n C(O) OC6 F5 ，其中n為1-11且R''''為C1 -C6 烷基；或-(CH2 )n CH2 LG ；TAP-C(O)(CH2 )n CH2 LG ；或TAP-NR ''''(CH2 )n CH2 LG ，其中n可如別處所述且R''''為C1 -C6 烷基(LG可為離去基，例如鹵化物、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、硝基苯磺酸酯、溴苯磺酸酯)。繫鏈連接可藉由使配體之親核基團(例如硫醇或胺基)與繫鏈上之親電子基團偶合來進行。
在其他實施例中，可能需要單體在連接子/繫鏈之末端位置包括鄰苯二醯亞胺基(K)。
Figure 02_image005
。
在其他實施例中，其他受保護之胺基可在連接子/繫鏈之末端位置，例如烯丙氧羰基、單甲氧基三苯甲基(MMT)、三氟乙醯基、Fmoc或芳基磺醯基(例如，芳基部分可為鄰硝基苯基或鄰,對-二硝基苯基)。
本文所述之任何連接子/繫鏈可進一步包括一或多個額外連接基團，例如-O-(CH2 )n -、-(CH2 )n -SS-、-(CH2 )n -或-(CH=CH)-。可裂解連接子 / 繫鏈
在一些實施例中，連接子/繫鏈中之至少一者可為氧化還原可裂解連接子、酸可裂解連接子、酯酶可裂解連接子、磷酸酶可裂解連接子或肽酶可裂解連接子。
在一個實施例中，連接子/繫鏈中之至少一者可為還原可裂解連接子(例如二硫化物基團)。
在一個實施例中，連接子/繫鏈中之至少一者可為酸可裂解連接子(例如，腙基、酯基、縮醛基或縮酮基)。
在一個實施例中，連接子/繫鏈中之至少一者可為酯酶可裂解連接子(例如酯基)。
在一個實施例中，連接子/繫鏈中之至少一者可為磷酸酶可裂解連接子(例如磷酸酯基)。
在一個實施例中，連接子/繫鏈中之至少一者可為肽酶可裂解連接子(例如肽鍵)。
可裂解連接基團易受裂解劑影響，例如pH、氧化還原電位或降解分子之存在。一般而言，裂解劑在細胞內比在血清或血液中更普遍或以更高水準或活性發現。此類降解劑之實例包括：選擇用於特定受質或不具有受質特異性之氧化還原劑，包括例如細胞中存在之氧化或還原酶或還原劑，諸如硫醇，其可藉由還原降解氧化還原可裂解連接基團；酯酶；可產生酸性環境之內體或試劑，例如導致pH為5或更低之內體或試劑；可藉由充當一般酸、肽酶(其可為受質特異性的)及磷酸酶水解或降解酸可裂解連接基團之酶。
可裂解連接基團(諸如二硫鍵)可對pH敏感。人類血清之pH為7.4，而平均細胞內pH略微較低，範圍介於約7.1-7.3。內體具有在5.5-6.0範圍內的更酸的pH，且溶酶體具有約為5.0的甚至更酸的pH。一些繫鏈將具有在較佳pH下裂解之連接基團，從而自細胞內之配體(例如，靶向或細胞滲透性配體，諸如膽固醇)釋放iRNA劑，或進入細胞之所需區室。
將配體與iRNA劑連接之化學連接點(chemical junction)(例如，連接基團)可包括二硫鍵。當iRNA劑/配體複合物藉由內飲作用吸收至細胞中時，內體之酸性環境將致使二硫鍵裂解，從而自配體釋放iRNA劑(Quintana等人,Pharm Res. 19:1310-1316, 2002；Patri等人,Curr. Opin. Curr. Biol. 6:466-471, 2002)。配體可為靶向配體或第二治療劑，其可補充iRNA劑之治療效果。
繫鏈可包括可藉由特定酶裂解之連接基團。併入繫鏈中之連接基團的類型可視iRNA劑所靶向之細胞而定。舉例而言，靶向肝細胞中之mRNA的iRNA劑可與包括酯基之繫鏈接合。肝細胞富含酯酶，且因此繫鏈在肝細胞中將比在不富含酯酶之細胞類型中更有效地裂解。繫鏈之裂解自附接至繫鏈遠端之配體釋放iRNA劑，從而潛在地增強iRNA劑之沉默活性。富含酯酶之其他細胞類型包括肺、腎皮質及睪丸之細胞。
含有肽鍵之繫鏈可與靶向富含肽酶之細胞類型(諸如肝細胞及滑膜細胞)的iRNA劑接合。舉例而言，靶向滑膜細胞諸如用於治療炎性疾病(例如類風濕性關節炎)之iRNA劑可與含有肽鍵之繫鏈接合。
一般而言，可藉由測試降解劑(或條件)裂解候選連接基團之能力來評估候選可裂解連接基團之適合性。亦合乎需要的是，另外測試候選可裂解連接基團在血液中或當與其他非靶組織(例如當向個體投與時，iRNA劑將暴露於其中的組織)接觸時抵抗裂解的能力。因此，吾人可確定第一與第二條件之間對裂解的相對易感性，其中第一條件經選擇以指示靶細胞中之裂解，且第二條件經選擇以指示其他組織或生物流體(例如血液或血清)中之裂解。評估可在無細胞系統、細胞、細胞培養物、器官或組織培養物或整個動物中進行。在無細胞或培養條件中進行初始評估且藉由在整個動物中進一步評估進行確認可為有用的。在較佳實施例中，有用的候選化合物在細胞中(或在選擇用於模擬細胞內條件之活體外條件下)之裂解比在血液或血清(或在選擇用於模擬細胞外條件之活體外條件下)中快至少2、4、10或100倍。氧化還原可裂解連接基團
一類可裂解連接基團為氧化還原可裂解連接基團，其在還原或氧化時裂解。還原可裂解連接基團之實例為二硫化物連接基團(-S-S-)。為了確定候選可裂解連接基團是否為適合之「還原可裂解連接基團」或例如是否適合與特定iRNA部分及特定靶向劑一起使用，可考慮本文所述之方法。舉例而言，候選物可藉由使用此項技術中已知的試劑，與二硫蘇糖醇(DTT)或其他還原劑一起培育來評估，其模擬將在細胞(例如靶細胞)中觀察到的裂解速率。候選物亦可在選擇用於模擬血液或血清條件之條件下進行評估。在一較佳實施例中，候選化合物在血液中裂解至多10%。在較佳實施例中，有用的候選化合物在細胞中(或在選擇用於模擬細胞內條件之活體外條件下)之降解比在血液(或在選擇用於模擬細胞外條件之活體外條件下)中快至少2、4、10或100倍。候選化合物之裂解速率可在選擇用於模擬細胞內介質的條件下使用標準酶動力學分析來測定，且與選擇用於模擬細胞外介質的條件進行比較。基於磷酸酯基之可裂解連接基團
基於磷酸酯基之連接基團係藉由降解或水解磷酸酯基之試劑來裂解。裂解細胞中磷酸酯基之試劑的實例為細胞中之酶，諸如磷酸酶。基於磷酸酯基之連接基團的實例為—O—P(O)(ORk)-O—、—O—P(S)(ORk)-O—、—O—P(S)(SRk)-O—、—S—P(O)(ORk)-O—、—O—P(O)(ORk)-S—、—S—P(O)(ORk)-S—、—O—P(S)(ORk)-S—、—S—P(S)(ORk)-O—、—O—P(O)(Rk)-O—、—O—P(S)(Rk)-O—、—S—P(O)(Rk)-O—、—S—P(S)(Rk)-O—、—S—P(O)(Rk)-S—、—O—P(S)(Rk)-S—。較佳實施例為—O—P(O)(OH)—O—、—O—P(S)(OH)—O—、—O—P(S)(SH)—O—、—S—P(O)(OH)—O—、—O—P(O)(OH)—S—、—S—P(O)(OH)—S—、—O—P(S)(OH)—S—、—S—P(S)(OH)—O—、—O—P(O)(H)—O—、—O—P(S)(H)—O—、—S—P(O)(H)—O—、—S—P(S)(H)—O—、—S—P(O)(H)—S—、—O—P(S)(H)—S—。一較佳實施例為—O—P(O)(OH)—O—。此等候選物可使用與上文所述類似之方法評估。酸可裂解連接基團
酸可裂解連接基團為在酸性條件下裂解之連接基團。在較佳實施例中，酸可裂解連接基團在pH為約6.5或更低(例如，約6.0、5.5、5.0或更低)之酸性環境中，或藉由諸如可充當一般酸之酶的試劑來裂解。在細胞中，特定的低pH細胞器，諸如內體及溶酶體，可為酸可裂解連接基團提供裂解環境。酸可裂解連接基團之實例包括但不限於腙、縮酮、縮醛、酯及胺基酸酯。酸可裂解基團可具有通式-C═NN-、C(O)O或-OC(O)。一較佳實施例為當附接至酯之氧(烷氧基)的碳為芳基、經取代之烷基或三級烷基，諸如二甲基戊基或第三丁基時。此等候選物可使用與上文所述類似之方法評估。基於酯之連接基團
基於酯之連接基團係藉由細胞中諸如酯酶及醯胺酶之酶來裂解。基於酯之可裂解連接基團的實例包括但不限於伸烷基、伸烯基及伸炔基之酯。酯可裂解連接基團具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。此等候選物可使用與上文所述類似之方法評估。基於肽之裂解基團
基於肽之連接基團係藉由細胞中諸如肽酶及蛋白酶之酶來裂解。基於肽之可裂解連接基團為在胺基酸之間形成以產生寡肽(例如二肽、三肽等)及多肽的肽鍵。基於肽之可裂解基團不包括醯胺基(-C(O)NH-)。醯胺基可在任何伸烷基、伸烯基或伸炔基之間形成。肽鍵為在胺基酸之間形成以產生肽及蛋白質的特殊類型的醯胺鍵。基於肽之裂解基團一般限於在產生肽及蛋白質之胺基酸之間形成的肽鍵(亦即醯胺鍵)，且不包括整個醯胺官能基。肽可裂解之連接基團具有通式-NHCHR1 C(O)NHCHR2 C(O)-，其中R1 及R2 為二個相鄰胺基酸之R基團。此等候選物可使用與上文所述類似之方法評估。生物可裂解連接子 / 繫鏈
連接子亦可包括生物可裂解連接子，其為核苷酸及非核苷酸連接子或其組合，連接分子之二個部分，例如二個單獨siRNA分子之一個或二個股以產生雙(siRNA)。在一些實施例中，僅二個單獨siRNA之間的靜電或堆疊相互作用可表示連接子。非核苷酸連接子包括衍生自單糖、二糖、寡糖及其衍生物、脂族、脂環族、雜環及其組合的繫鏈或連接子。
在一些實施例中，連接子(繫鏈)中之至少一者為生物可裂解連接子，其選自由DNA、RNA、二硫化物、醯胺；半乳糖胺、葡糖胺、葡萄糖、半乳糖及甘露糖之官能化單糖或寡糖及其組合組成之群。
在一個實施例中，生物可裂解之碳水化合物連接子可具有1至10個糖單元，其具有至少一個能夠連接二個siRNA單元之變旋異構鍵聯。當存在二種或更多種醣時，此等單元可經由1-3、1-4或1-6個糖鍵或經由烷基鏈連接。
例示性生物可裂解連接子包括：
Figure 02_image007
Figure 02_image009
Figure 02_image011
額外例示性生物可裂解連接子在方案28-30中說明。
關於生物可裂解連接子之更多論述可見於2018年1月18日申請之名稱為「內體可裂解連接子(Endosomal Cleavable Linkers)」的PCT申請案第PCT/US18/14213號，其內容以全文引用之方式併入本文中。載體
在某些實施例中，親脂性部分經由置換一或多個核苷酸之載體與iRNA劑接合。
載體可為環狀基團或非環狀基團。在一個實施例中，環狀基團係選自由以下組成之群：吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊環、噁唑啶基、異噁唑啶基、嗎啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹喏啉基、噠嗪酮基、四氫呋喃基及十氫萘。在一個實施例中，非環狀基團為基於絲胺醇主鏈或二乙醇胺主鏈之部分。
在一些實施例中，載體置換雙股iRNA劑之內部位置中之一或多個核苷酸。
在其他實施例中，載體置換義股或反義股末端之核苷酸。在一個實施例中，載體置換義股3'端上之末端核苷酸，從而充當保護義股3'端之端帽。在一個實施例中，載體為具有胺之環狀基團，例如，載體可為吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊環基、噁唑啶基、異噁唑啶基、嗎啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹喏啉基、噠嗪酮基、四氫呋喃基或十氫萘基。
其中次單元之核糖已如此置換之核糖核苷酸次單元在本文中稱為核糖置換修飾次單元(RRMS)。載體可為環狀或非環狀部分，且包括二個「主鏈附接點」(例如羥基)及配體(例如親脂性部分)。親脂性部分可直接附接至載體或藉由插入的連接子/繫鏈間接附接至載體，如上所述。
Figure 02_image013
配體接合之單體次單元可為iRNA分子之5'或3'末端次單元，亦即二個「W」基團中之一者可為羥基，且另一個「W」基團可為具有二個或更多個未修飾或經修飾之核糖核苷酸之鏈。或者，配體接合之單體次單元可佔據內部位置，且二個「W」基團均可為一或多個未修飾或經修飾之核糖核苷酸。多於一個配體接合之單體次單元可存在於iRNA劑中。基於糖置換之單體，例如配體接合之單體 ( 環狀 )
基於糖置換之環狀單體，例如基於糖置換之配體接合之單體在本文中亦稱為RRMS單體化合物。載體可具有下面提供之通式(LCM-2 ) (在該結構中，較佳主鏈附接點可選自R1 或R2 ；R3 或R4 ；或若Y為CR9 R10 ，則R9 及R10 (選擇二個位置得到二個主鏈附接點，例如R1 及R4 或R4 及R9 ))。較佳繫鏈附接點包括R7 ；當X為CH2 時，R5 或R6 。載體在下文描述為實體，其可併入股中。因此，應理解，該結構亦涵蓋如下情形，其中一個(在末端位置之情況下)或二個(在內部位置之情況下)附接點，例如R1 或R2 ；R3 或R4 ；或R9 或R10 (當Y為CR9 R10 時)，與例如含硫主鏈之磷酸酯或經修飾之磷酸酯連接。例如，上述R基團中之一者可為-CH2 -，其中一鍵與載體連接且一鍵與主鏈原子(例如連接氧或中心磷原子)連接。
Figure 02_image015
(LCM-2 ) 其中： X為N(CO)R7 、NR7 或CH2 ； Y為NR8 、O、S、CR9 R10 ； Z為CR11 R12 或不存在； R1 、R2 、R3 、R4 、R9 及R10 中之每一者獨立地為H、ORa 或(CH2 )n ORb ，其限制條件為R1 、R2 、R3 、R4 、R9 及R10 中之至少二者為ORa 及/或(CH2 )n ORb ； R5 、R6 、R11 及R12 中之每一者獨立地為配體、H、任擇地經1-3個R13 取代之C1 -C6 烷基、或C(O)NHR7 ；或R5 及R11 一起為任擇地經R14 取代之C3 -C8 環烷基； R7 可為配體，例如R7 可為Rd ，或R7 可為例如經由繫鏈部分間接繫留於載體之配體，例如經NRc Rd 取代之C1 -C20 烷基；或經NHC(O)Rd 取代之C1 -C20 烷基； R8 為H或C1 -C6 烷基； R13 為羥基、C1 -C4 烷氧基或鹵基； R14 為NRc R7 ； R15 為任擇地經氰基取代之C1 -C6 烷基，或C2 -C6 烯基； R16 為C1 -C10 烷基； R17 為液相或固相支持試劑； L為-C(O)(CH2 )q C(O)-或-C(O)(CH2 )q S-； Ra 為保護基，例如CAr3 ；(例如二甲氧基三苯甲基)或Si(X5 ' )(X5 '' )(X5 ''' )，其中(X5 ' )、(X5 '' )及(X5 ''' )如別處所述。 Rb 為P(O)(O- )H、P(OR15 )N(R16 )2 或L-R17 ； Rc 為H或C1 -C6 烷基； Rd 為H或配體； 各Ar獨立地為任擇地經C1 -C4 烷氧基取代之C6 -C10 芳基； n為1-4；且q為0-4。
例示性載體包括其中例如X為N(CO)R7 或NR7 ，Y為CR9 R10 且Z不存在；或X為N(CO)R7 或NR7 ，Y為CR9 R10 且Z為CR11 R12 ；或X為N(CO)R7 或NR7 ，Y為NR8 且Z為CR11 R12 ；或X為N(CO)R7 或NR7 ，Y為O且Z為CR11 R12 ；或X為CH2 ；Y為CR9 R10 ；Z為CR11 R12 ，且R5 及R11 一起形成C6 環烷基(H ，z = 2)或茚滿環系統，例如X為CH2 ；Y為CR9 R10 ；Z為CR11 R12 ，且R5 及R11 一起形成C5 環烷基(H ，z = 1)之載體。
在某些實施例中，載體可基於吡咯啉環系統或4-羥脯胺酸環系統，例如X為N(CO)R7 或NR7 ，Y為CR9 R10 且Z不存在(D )。
Figure 02_image017
。OFG1 較佳附接至與五員環中之一個碳連接之一級碳，例如環外伸烷基，例如亞甲基(D 中之-CH2 OFG1 )。OFG2 較佳直接附接至五員環中之一個碳(D 中之-OFG2 )。對於基於吡咯啉之載體，-CH2 OFG1 可附接至C-2且OFG2 可附接至C-3；或-CH2 OFG1 可附接至C-3且OFG2 可附接至C-4。在某些實施例中，CH2 OFG1 及OFG2 可經偕位取代至上文提及之碳中之一者。對於基於3-羥脯胺酸之載體，-CH2 OFG1 可附接至C-2且OFG2 可附接至C-4。基於吡咯啉及4-羥脯胺酸之單體可因此含有鍵聯(例如碳-碳鍵)，其中鍵旋轉受限圍繞該特定鍵聯，例如由環存在產生之限制。因此，CH2 OFG1 及OFG2 在上文描述之任何配對中可相對於彼此為順式或反式的。因此，明確地包括所有順式/反式異構體。單體亦可含有一或多個不對稱中心，且因此以外消旋體及外消旋混合物、單一對映異構體、個別非對映異構體及非對映異構體混合物形式存在。明確地包括單體之所有此類異構形式(例如，帶有CH2 OFG1 及OFG2 之中心均可具有R構型；或均具有S構型；或一個中心可具有R構型且另一個中心可具有S構型，反之亦然)。繫鏈附接點較佳為氮。載體D 之較佳實例包括以下：
Figure 02_image019
。
在某些實施例中，載體可基於哌啶環系統(E )，例如X為N(CO)R7 或NR7 ，Y為CR9 R10 且Z為CR11 R12 。
Figure 02_image021
。 OFG1 較佳附接至與六員環中之一個碳連接的一級碳，例如環外伸烷基，例如亞甲基(n=1)或伸乙基(n=2) [E 中之-(CH2 )n OFG1 ]。OFG2 較佳直接附接至六員環中之一個碳(E 中之-OFG2 )。-(CH2 )n OFG1 及OFG2 可以偕位方式安置於環上，亦即二個基團可附接至同一碳，例如C-2、C-3或C-4。或者，-(CH2 )n OFG1 及OFG2 可以鄰位方式安置於環上，亦即二個基團可附接至相鄰環碳原子，例如-(CH2 )n OFG1 可附接至C-2且OFG2 可附接至C-3；-(CH2 )n OFG1 可附接至C-3且OFG2 可附接至C-2；-(CH2 )n OFG1 可附接至C-3且OFG2 可附接至C-4；或-(CH2 )n OFG1 可附接至C-4且OFG2 可附接至C-3。基於哌啶之單體可因此含有鍵聯(例如碳-碳鍵)，其中鍵旋轉受限圍繞該特定鍵聯，例如由環存在產生之限制。因此，-(CH2 )n OFG1 及OFG2 在上文描述之任何配對中可相對於彼此為順式或反式的。因此，明確地包括所有順式/反式異構體。單體亦可含有一或多個不對稱中心，且因此以外消旋體及外消旋混合物、單一對映異構體、個別非對映異構體及非對映異構體混合物形式存在。明確地包括單體之所有此類異構形式(例如，帶有CH2 OFG1 及OFG2 之中心均可具有R構型；或均具有S構型；或一個中心可具有R構型且另一個中心可具有S構型，反之亦然)。繫鏈附接點較佳為氮。
在某些實施例中，載體可基於哌嗪環系統(F )，例如X為N(CO)R7 或NR7 ，Y為NR8 且Z為CR11 R12 ，或嗎啉環系統(G )，例如X為N(CO)R7 或NR7 ，Y為O且Z為CR11 R12 。
Figure 02_image023
。OFG1 較佳附接至與六員環中之一個碳連接之一級碳，例如環外伸烷基，例如亞甲基(F 或G 中之-CH2 OFG1 )。OFG2 較佳直接附接至六員環中之一個碳(F 或G 中之-OFG2 )。對於F 及G ，-CH2 OFG1 可附接至C-2且OFG2 可附接至C-3；或反之亦然。在某些實施例中，CH2 OFG1 及OFG2 可經偕位取代至上文提及之碳中之一者。基於哌嗪及嗎啉之單體可因此含有鍵聯(例如碳-碳鍵)，其中鍵旋轉受限圍繞該特定鍵聯，例如由環存在產生之限制。因此，CH2 OFG1 及OFG2 在上文描述之任何配對中可相對於彼此為順式或反式的。因此，明確地包括所有順式/反式異構體。單體亦可含有一或多個不對稱中心，且因此以外消旋體及外消旋混合物、單一對映異構體、個別非對映異構體及非對映異構體混合物形式存在。明確地包括單體之所有此類異構形式(例如，帶有CH2 OFG1 及OFG2 之中心均可具有R構型；或均具有S構型；或一個中心可具有R構型且另一個中心可具有S構型，反之亦然)。R'''可為例如C1 -C6 烷基，較佳CH3 。繫鏈附接點較佳為F 及G 中之氮。
在某些實施例中，載體可基於十氫萘環系統，例如X為CH2 ；Y為CR9 R10 ；Z為CR11 R12 ，且R5 及R11 一起形成C6 環烷基(H ，z = 2)，或茚滿環系統，例如X為CH2 ；Y為CR9 R10 ；Z為CR11 R12 ，且R5 及R11 一起形成C5 環烷基(H ，z = 1)。
Figure 02_image025
。OFG1 較佳附接至一級碳，例如與C-2、C-3、C-4或C-5中之一者連接的環外亞甲基(n=1)或伸乙基(n=2) [H 中之-(CH2 )n OFG1 ]。OFG2 較佳直接附接至C-2、C-3、C-4或C-5中之一者(H 中之-OFG2 )。-(CH2 )n OFG1 及OFG2 可以偕位方式安置於環上，亦即二個基團可附接至同一碳，例如C-2、C-3、C-4或C-5。或者，-(CH2 )n OFG1 及OFG2 可以鄰位方式安置於環上，亦即二個基團可附接至相鄰環碳原子，例如-(CH2 )n OFG1 可附接至C-2且OFG2 可附接至C-3；-(CH2 )n OFG1 可附接至C-3且OFG2 可附接至C-2；-(CH2 )n OFG1 可附接至C-3且OFG2 可附接至C-4；或-(CH2 )n OFG1 可附接至C-4且OFG2 可附接至C-3；-(CH2 )n OFG1 可附接至C-4且OFG2 可附接至C-5；或-(CH2 )n OFG1 可附接至C-5且OFG2 可附接至C-4。基於十氫萘或茚滿之單體可因此含有鍵聯(例如碳-碳鍵)，其中鍵旋轉受限圍繞該特定鍵聯，例如由環存在產生之限制。因此，-(CH2 )n OFG1 及OFG2 在上文描述之任何配對中可相對於彼此為順式或反式的。因此，明確地包括所有順式/反式異構體。單體亦可含有一或多個不對稱中心，且因此以外消旋體及外消旋混合物、單一對映異構體、個別非對映異構體及非對映異構體混合物形式存在。明確地包括單體之所有此類異構形式(例如，帶有CH2 OFG1 及OFG2 之中心均可具有R構型；或均具有S構型；或一個中心可具有R構型且另一個中心可具有S構型，反之亦然)。在一較佳實施例中，C-1及C-6處之取代基相對於彼此為反式。繫鏈附接點較佳為C-6或C-7。
其他載體可包括基於3-羥脯胺酸之載體(J )。
Figure 02_image027
。因此，-(CH2 )n OFG1 及OFG2 可相對於彼此為順式或反式的。因此，明確地包括所有順式/反式異構體。單體亦可含有一或多個不對稱中心，且因此以外消旋體及外消旋混合物、單一對映異構體、個別非對映異構體及非對映異構體混合物形式存在。明確地包括單體之所有此類異構形式(例如，帶有CH2 OFG1 及OFG2 之中心均可具有R構型；或均具有S構型；或一個中心可具有R構型且另一個中心可具有S構型，反之亦然)。繫鏈附接點較佳為氮。
關於更具代表性之基於糖置換之環狀載體的細節可見於美國專利第7,745,608號及第8,017,762號，其以全文引用的方式併入本文中。基於糖置換之單體 ( 非環狀 )
基於糖置換之非環狀單體，例如基於糖置換之配體接合之單體，在本文中亦稱為核糖置換單體次單元(RRMS)單體化合物。較佳非環狀載體可具有式LCM - 3 或LCM - 4 ：
Figure 02_image029
。
在一些實施例中，x、y及z中之每一者可彼此獨立地為0、1、2或3。在式LCM-3 中，當y及z不同時，則三級碳可具有R或S構型。在較佳實施例中，式LCM-3 中之x為零且y及z各自為1 (例如基於絲胺醇)，式LCM-3 中之y及z各自為1。下式LCM-3 或LCM-4 中之每一者可任擇地例如經羥基、烷氧基、全鹵烷基取代。
關於更具代表性之基於糖置換之非環狀載體的細節可見於美國專利第7,745,608號及第8,017,762號，其以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，雙股iRNA劑包含與義股之5'端或反義股之5'端接合的一或多個親脂性部分。
在某些實施例中，親脂性部分經由載體及/或連接子與股之5'端接合。在一個實施例中，親脂性部分經由下式之載體與股之5'端接合：
Figure 02_image031
Figure 02_image033
Figure 02_image035
Figure 02_image037
Figure 02_image039
Figure 02_image041
Figure 02_image043
Figure 02_image045
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
或
Figure 02_image051
。R為配體，諸如親脂性部分。
在一些實施例中，雙股iRNA劑包含與義股之3'端或反義股之3'端接合的一或多個親脂性部分。
在某些實施例中，親脂性部分經由載體及/或連接子與股之3'端接合。在一個實施例中，親脂性部分經由下式之載體與股之3'端接合：
Figure 02_image031
Figure 02_image033
Figure 02_image035
Figure 02_image037
Figure 02_image039
Figure 02_image041
Figure 02_image043
Figure 02_image045
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
或
Figure 02_image051
。R為配體，諸如親脂性部分。
在一些實施例中，雙股iRNA劑包含與義股之二端接合的一或多個親脂性部分。
在一些實施例中，雙股iRNA劑包含與反義股之二端接合的一或多個親脂性部分。
在一些實施例中，雙股iRNA劑包含與義股之5'端或3'端接合的一或多個親脂性部分，及與反義股之5'端或3'端接合的一或多個親脂性部分，
在一些實施例中，親脂性部分經由一或多個連接子(繫鏈)及/或載體與股之末端接合。
在一個實施例中，親脂性部分經由一或多個連接子(繫鏈)與股之末端接合。
在一個實施例中，親脂性部分經由環狀載體，任擇地經由一或多個插入連接子(繫鏈)與義股或反義股之5'端接合。
在一些實施例中，親脂性部分與至少一股上之一或多個內部位置接合。股之內部位置係指股之任何位置上的核苷酸，股之3'端及5'端的末端位置除外(例如，不包括2個位置：自3'端計數之位置1及自5'端計數之位置1)。
在一個實施例中，親脂性部分與至少一股上之一或多個內部位置接合，其包括除股之各端的末端二個位置以外的所有位置(例如，不包括4個位置：自3'端計數之位置1及2以及自5'端計數之位置1及2)。在一個實施例中，親脂性部分與至少一股上之一或多個內部位置接合，其包括除股各端之末端三個位置以外的所有位置(例如，不包括6個位置：自3'端計數之位置1、2及3以及自5'端計數之位置1、2及3)。
在一個實施例中，親脂性部分與至少一股上之一或多個內部位置接合，義股之裂解位點區除外，例如，親脂性部分不與自義股之5'端計數的位置9-12接合，例如，親脂性部分不與自義股之5'端計數的位置9-11接合。或者，內部位置不包括自義股3'端計數之位置11-13。
在一個實施例中，親脂性部分與至少一股上之一或多個內部位置接合，其不包括反義股之裂解位點區。舉例而言，內部位置不包括自義股5'端計數之位置12-14。
在一個實施例中，親脂性部分與至少一股上之一或多個內部位置接合，其不包括義股上自3'端計數之位置11-13及反義股上自5'端計數之位置12-14。
在一個實施例中，一或多個親脂性部分與以下內部位置中之一或多者接合：自各股之5'端計數，義股上之位置4-8及13-18，以及反義股上之位置6-10及15-18。
在一個實施例中，一或多個親脂性部分與以下內部位置中之一或多者接合：自各股之5'端計數，義股上之位置5、6、7、15及17，以及反義股上之位置15及17。
在一些實施例中，親脂性部分與雙股iRNA劑之核鹼基、糖部分或核苷間鍵接合。 定義
除非提供具體定義，否則本文所述之結合分子生物學、分析化學、合成有機化學以及醫學及醫藥化學所用之命名法及該等學科之程序及技術為此項技術中眾所周知且常用的彼等命名法以及程序及技術。標準技術可用於化學合成及化學分析。某些此類技術及程序可見於例如「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」 由Sangvi及Cook編, American Chemical Society, Washington D.C., 1994；「Remington's Pharmaceutical Sciences,」 Mack Publishing Co., Easton, Pa., 第18版, 1990；及「Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications」 由Stanley T. Crooke編, CRC Press, Boca Raton, Fla.；及Sambrook等人, 「Molecular Cloning, A laboratory Manual,」 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989，其特此以引用之方式併入用於任何目的。在允許之情況下，本揭示案通篇引用之所有專利、申請案、公開申請案以及其他出版物及其他資料以全文引用之方式併入。
除非另外指明，否則以下術語具有以下含義：
如本文所用，術語「靶核酸」係指其表現或活性能夠由siRNA化合物調節之任何核酸分子。靶核酸包括但不限於自編碼靶蛋白DNA之轉錄的RNA (包括但不限於前體mRNA及mRNA或其部分)，以及衍生自此類RNA之cDNA，及miRNA。舉例而言，靶核酸可為細胞基因(或自基因轉錄之mRNA)，其表現與特定病症或疾病狀態相關聯。在一些實施例中，靶核酸可為來自感染物之核酸分子。
如本文所用，術語「iRNA」係指介導RNA轉錄物之靶向裂解的試劑。此等試劑與稱為RNAi誘導型沉默複合物(RISC)之細胞質多蛋白複合物締合。有效誘導RNA干擾之試劑在本文中亦稱為siRNA、RNAi劑或iRNA劑。因此，此等術語在本文中可互換使用。如本文所用，術語iRNA包括微小RNA及前體微小RNA。此外，如本文所用之本發明之「化合物」亦指iRNA劑，且可與iRNA劑互換使用。
iRNA劑應包括與靶基因具有足夠同源性且在核苷酸方面具有足夠長度之區域，使得iRNA劑或其片段可介導靶基因之下調。(為了便於說明，術語核苷酸或核糖核苷酸有時在本文中用於指iRNA劑之一或多個單體次單元。在本文中應理解，在本文中術語「核糖核苷酸」或「核苷酸」可在經修飾之RNA或核苷酸替代物的情況下使用，亦指在一或多個位置的經修飾之核苷酸或替代置換部分。) 因此，iRNA劑為或包括至少部分，且在一些實施例中完全，與靶RNA互補的區域。iRNA劑與靶標之間不必具有完美的互補性，但對應性必須足以使iRNA劑或其裂解產物能夠指導序列特異性沉默，例如藉由RNAi裂解靶RNA，例如mRNA。與靶股之互補性或同源性程度為反義股中最關鍵的。雖然通常需要完美的互補性，特別是在反義股中，但一些實施例可包括，特別是在反義股中，一或多個或例如6個、5個、4個、3個、2個或更少的錯配(相對於靶RNA)。義股僅需要與反義股充分互補以維持分子之整體雙股特徵。
iRNA劑包括：足夠長的分子以觸發干擾素反應(其可由Dicer裂解(Bernstein等人 2001. Nature, 409:363-366)且進入RISC (RNAi誘導型沉默複合物))；及足夠短的分子，其不會觸發干擾素反應(該等分子亦可由Dicer裂解及/或進入RISC)，例如具有允許進入RISC之尺寸的分子，例如類似Dicer裂解產物之分子。足夠短以至於不觸發干擾素反應之分子在本文中稱為siRNA劑或較短的iRNA劑。如本文所用，「siRNA劑或較短的iRNA劑」係指足夠短以至於其不在人類細胞中誘導有害的干擾素反應的iRNA劑，例如雙股RNA劑或單股劑，例如其具有少於60、50、40或30個核苷酸對的雙螺旋區。siRNA劑或其裂解產物可下調靶基因，例如藉由相對於靶RNA誘導RNAi，其中該靶可包含內源性或病原體靶RNA。
如本文所用，「單股iRNA劑」為由單分子構成之iRNA劑。其可包括由股內配對形成之雙螺旋區，例如，其可為或包括髮夾或鍋-柄結構。相對於靶分子，單股iRNA劑可為反義的。單股iRNA劑可足夠長以至於其可進入RISC且參與RISC介導之靶mRNA的裂解。單股iRNA劑之長度為至少14，且在其他實施例中至少15、20、25、29、35、40或50個核苷酸。在某些實施例中，其長度小於200、100或60個核苷酸。
環係指當iRNA股之一部分與另一股或與同一股之另一部分形成鹼基對時，iRNA股與雙螺旋體中相對核苷酸未配對的區域。
髮夾iRNA劑將具有等於或至少17、18、19、29、21、22、23、24或25個核苷酸對的雙螺旋區。雙螺旋區之長度可等於或小於200、100或50。在某些實施例中，雙螺旋區之長度範圍為15-30、17至23、19至23及19至21個核苷酸對。髮夾可具有單股突出端或末端未配對區，在一些實施例中在3'，且在某些實施例中在髮夾之反義側。在一些實施例中，突出端長度為2-3個核苷酸。
如本文所用，「雙股(ds) iRNA劑」為包括多於一股，且在一些情況下二股之iRNA劑，其中鏈間雜交可形成雙螺旋結構區。
如本文所用，術語「siRNA活性」及「RNAi活性」係指藉由siRNA之基因沉默。
如本文所用，藉由RNA干擾分子之「基因沉默」係指靶基因之細胞中mRNA水準降低在無miRNA或RNA干擾分子存在下細胞中發現之mRNA水準的至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%直至且包括100%，及其間的任何整數。在一個優選實施例中，mRNA水準降低至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%直至且包括100%，及5%與100%之間的任何整數。
如本文所用，術語「調節基因表現」意謂上調或下調基因表現或編碼一或多種蛋白質或蛋白質次單元之RNA分子或等效RNA分子的水準，以使得表現、水準或活性大於或小於在調節劑不存在下所觀察到的。舉例而言，術語「調節」可意謂「抑制」，但詞語「調節」之使用不限於此定義。
如本文所用，當基因表現或編碼一或多種蛋白質或蛋白質次單元之RNA分子或等效RNA分子的水準與在siRNA (例如RNAi劑)不存在下觀察到的至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍或更多不同時，發生基因表現調節。可相對於對照或非對照計算%及/或倍數差異，例如，
Figure 02_image053
如本文所用，與基因表現相關之術語「抑制」、「下調」或「降低」意謂基因表現，或編碼一或多種蛋白質或蛋白質次單元之RNA分子或等效RNA分子的水準，或一或多種蛋白質或蛋白質次單元之活性降低至低於在調節劑不存在下所觀察到的。當基因表現，或編碼一或多種蛋白質或蛋白質次單元之RNA分子或等效RNA分子的水準，或一或多種蛋白質或蛋白質次單元之活性相對於相應非調節對照降低至少10%，且較佳至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或最佳100% (亦即無基因表現)時，基因表現下調。
如本文所用，與基因表現相關之術語「增加」或「上調」意謂基因表現，或編碼一或多種蛋白質或蛋白質次單元之RNA分子或等效RNA分子的水準，或一或多種蛋白質或蛋白質次單元之活性增加至高於在調節劑不存在下所觀察到的。當基因表現，或編碼一或多種蛋白質或蛋白質次單元之RNA分子或等效RNA分子的水準，或一或多種蛋白質或蛋白質次單元之活性相對於相應非調節對照增加至少10%，且較佳至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、100%、1.1倍、1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍數、100倍或更多時，基因表現上調。
如本文所用，術語「增加(increased/increase)」通常意謂增加靜態顯著量；為避免任何疑問，「增加」意謂與參考水準相比增加至少10%，例如與參考水準相比增加至少約20%、或至少約30%、或至少約40%、或至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約80%、或至少約90%或直至且包括100%或10-100%之間的任何增加，或與參考水準相比增加至少約2倍、或至少約3倍、或至少約4倍、或至少約5倍或至少約10倍或2倍與10倍之間的任何增加或更大。
如本文所用，術語「降低(reduced/reduce)」通常意謂降低統計學上顯著之量。然而，為了避免疑問，「降低」意謂與參考水準相比降低至少10%，例如與參考水準相比降低至少約20%、或至少約30%、或至少約40%、或至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約80%、或至少約90%或直至且包括100% (亦即，與參考樣品相比不存在水準)，或10-100%之間的任何降低。
雙股iRNA包含二個寡核苷酸股，其充分互補以雜交形成雙螺旋結構。通常，雙螺旋結構之長度為15至30個，更通常18至25個，更通常19至24個，且最通常19至21個鹼基對。在一些實施例中，25至30個鹼基對長度之較長雙股iRNA為較佳的。在一些實施例中，10至15個鹼基對長度之較短雙股iRNA為較佳的。在另一個實施例中，雙股iRNA為至少21個核苷酸長。
在一些實施例中，雙股iRNA包含義股及反義股，其中反義RNA股具有與靶序列之至少一部分互補的互補區，且雙螺旋區長度為14-30個核苷酸。類似地，靶序列之互補區的長度為14至30個，更通常18至25個，更通常19至24個且最通常19至21個核苷酸。
如本文所用，片語「反義股」係指與感興趣的靶序列基本上或100%互補的寡聚化合物。片語「反義股」包括由二個單獨股形成之二種寡聚化合物的反義區以及能夠形成髮夾或啞鈴型結構之單分子寡聚化合物。術語「反義股」及「引導股」在本文中可互換使用。
片語「義股」係指具有與諸如信使RNA或DNA序列之靶序列全部或部分相同的核苷序列的寡聚化合物。術語「義股」及「隨從股」在本文中可互換使用。
「可特異性雜交」及「互補」意指核酸可藉由傳統沃森-克里克(Watson-Crick)或其他非傳統類型與另一種核酸序列形成氫鍵。關於本發明之核分子，核酸分子與其互補序列之結合自由能足以允許進行核酸之相關功能，例如RNAi活性。核酸分子之結合自由能的測定為此項技術中熟知的(參見例如Turner等人, 1987,CSH Symp. Quant. Biol. LII 第123-133頁；Frier等人, 1986,Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377；Turner等人, 1987, /.Am. Chem. Soc. 109:3783-3785)。百分比互補性指示核酸分子中可與第二核酸序列形成氫鍵(例如，沃森-克里克鹼基配對)之連續殘基的百分比(例如，10個中之5、6、7、8、9、10個為50%、60%、70%、80%、90%及100%互補)。「完美互補」或100%互補性意謂核酸序列之所有連續殘基將與第二核酸序列中之相同數目的連續殘基氫鍵結合。次完美互補性係指二股中之一些而非全部核苷單元可彼此氫鍵結合的情形。「顯著互補性」係指多核苷酸股展現90%或更高的互補性，不包括經選擇以非互補之多核苷酸股的區域，諸如突出端。特異性結合需要足夠程度的互補性以避免寡聚化合物與非靶序列在需要特異性結合之條件下，亦即在活體內分析或治療性治療之情況下在生理條件下，或在活體外分析之情況下在進行分析的條件下的非特異性結合。非靶序列通常相差至少5個核苷酸。
在一些實施例中，雙股iRNA劑之雙股區的長度等於或至少為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個核苷酸對。
在一些實施例中，雙股iRNA劑之反義股的長度等於或至少為14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。
在一些實施例中，雙股iRNA劑之義股的長度等於或至少為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。
在一個實施例中，雙股iRNA劑之義股及反義股的長度各為15至30個核苷酸。
在一個實施例中，雙股iRNA劑之義股及反義股的長度各為19至25個核苷酸。
在一個實施例中，雙股iRNA劑之義股及反義股的長度各為21至23個核苷酸。
在一些實施例中，一股在雙股區中具有至少一段1-5個單股核苷酸。「雙股區中之單股核苷酸段」意指在單股段之二端存在至少一個核苷酸鹼基對。在一些實施例中，二股在雙股區中具有至少一段1-5 (例如，1、2、3、4或5)個單股核苷酸。當二股在雙股區中具有一段1-5 (例如，1、2、3、4或5)個單股核苷酸時，此類單股核苷酸可彼此相反(例如，一段錯配)或其可經定位以使得第二股不具有與第一股之單股iRNA相反的單股核苷酸，反之亦然(例如，單股環)。在一些實施例中，單股核苷酸存在於任一端之8個核苷酸內，例如二股之間互補區之5'或3'端的8、7、6、5、4、3或2個核苷酸。
在一個實施例中，雙股iRNA劑在至少一個末端上包含單股突出端。在一個實施例中，單股突出端長度為1、2或3個核苷酸。
在一個實施例中，iRNA劑之義股長度為21個核苷酸，且反義股長度為23個核苷酸，其中該等股形成21個連續鹼基對之雙股區且在3'端具有2個核苷酸長的單股突出端。
在一些實施例中，雙股iRNA之各股具有ZXY結構，諸如PCT公開案第2004080406號中所述，其以全文引用之方式併入本文中。
在特定實施例中，雙股寡聚化合物之二股可連接在一起。二股可在二端彼此連接，或僅在一端連接。在一端連接意謂第一股之5'端與第二股之3'端連接或第一股之3'端與第二股之5'端連接。當二股在二端彼此連接時，第一股之5'端與第二股之3'端連接且第一股之3'端與第二股之5'端連接。二股可藉由寡核苷酸連接子連接在一起，該寡核苷酸連接子包括但不限於(N)n ；其中N獨立地為經修飾或未修飾之核苷酸且n為3-23。在一些實施例中，n為3-10，例如3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施例中，寡核苷酸連接子係選自由以下組成之群：GNRA、(G)4 、(U)4 及(dT)4 ，其中N為經修飾或未修飾之核苷酸且R為經修飾或未修飾之嘌呤核苷酸。連接子中之一些核苷酸可參與與連接子中之其他核苷酸的鹼基對相互作用。二股亦可藉由非核苷連接子連接在一起，例如本文所述之連接子。熟習此項技術者應瞭解，本文描述之任何寡核苷酸化學修飾或變化均可用於寡核苷酸連接子。
髮夾及啞鈴型寡聚化合物具有等於或至少14、15、15、16、17、18、19、29、21、22、23、24或25個核苷酸對之雙螺旋區。雙螺旋區之長度可等於或小於200、100或50。在一些實施例中，雙螺旋區之長度範圍為15-30、17至23、19至23及19至21個核苷酸對。
髮夾寡聚化合物可具有單股突出端或末端未配對區，在一些實施例中在3'，且在一些實施例中在髮夾之反義側。在一些實施例中，突出端長度為1-4、更通常2-3個核苷酸。可誘導RNA干擾之髮夾寡聚化合物在本文中亦稱為「shRNA」。
在某些實施例中，二個寡聚股在存在足夠程度的互補性時特異性雜交，以避免反義化合物與非靶序列在需要特異性結合之條件下，亦即在活體內分析或治療性治療之情況下在生理條件下，及在活體外分析之情況下在進行分析的條件下的非特異性結合。
如本文所用，「嚴格雜交條件」或「嚴格條件」係指反義化合物與其靶序列雜交但與最少數目之其他序列雜交的條件。嚴格條件為序列依賴性的且在不同情況下為不同的，且反義化合物與靶序列雜交之「嚴格條件」係由反義化合物之性質及組成及對其進行研究之分析來決定。
在此項技術中應理解，與未修飾之化合物相比，併入核苷酸親和力修飾可允許更大數目的錯配。類似地，某些寡核苷酸序列可比其他寡核苷酸序列對錯配更具耐受性。一般熟習此項技術者能夠確定寡核苷酸之間或寡核苷酸與靶核酸之間的適當數目的錯配，諸如藉由測定解鏈溫度(Tm)。Tm或ΔTm可藉由一般熟習此項技術者熟悉的技術來計算。舉例而言，Freier等人(Nucleic Acids Research, 1997, 25, 22: 4429-4443)中所述之技術允許一般熟習此項技術者評估核苷酸修飾增加RNA:DNA雙螺旋之解鏈溫度的能力。siRNA 設計
在一個實施例中，本發明之iRNA劑為19 nt長的雙端平端子，其中義股在5'端之位置7、8、9處的三個連續核苷酸上含有至少一個具有三個2'-F修飾之基元。反義股在5'端之位置11、12、13處的三個連續核苷酸上含有至少一個具有三個2'-O-甲基修飾之基元。
在一個實施例中，本發明之iRNA劑為20 nt長的雙端平端子，其中義股在5'端之位置8、9、10處的三個連續核苷酸上含有至少一個具有三個2'-F修飾之基元。反義股在5'端之位置11、12、13處的三個連續核苷酸上含有至少一個具有三個2'-O-甲基修飾之基元。
在一個實施例中，本發明之iRNA劑為21 nt長的雙端平端子，其中義股在5'端之位置9、10、11處的三個連續核苷酸上含有至少一個具有三個2'-F修飾之基元。反義股在5'端之位置11、12、13處的三個連續核苷酸上含有至少一個具有三個2'-O-甲基修飾之基元。
在一個實施例中，本發明之iRNA劑包含21個核苷酸(nt)義股及23個核苷酸(nt)反義股，其中義股在5'端之位置9、10、11處的三個連續核苷酸上含有至少一個具有三個2'-F修飾之基元；反義股在5'端之位置11、12、13處的三個連續核苷酸上含有至少一個具有三個2'-O-甲基修飾之基元，其中iRNA之一端為平端，而另一端包含2 nt突出端。較佳地，2 nt突出端位於反義之3'端。任擇地，iRNA劑進一步包含配體(例如GalNAc3 )。
在一個實施例中，本發明之iRNA劑包含義股及反義股，其中：義股為25-30個核苷酸殘基長，其中自該第一股之5'末端核苷酸(位置1)位置1至23開始包含至少8個核糖核苷酸；反義股為36-66個核苷酸殘基長，且自3'末端核苷酸開始，在與義股之位置1-23配對的位置包含至少8個核糖核苷酸以形成雙螺旋體；其中至少反義股之3'末端核苷酸與義股未配對，且至多6個連續3'末端核苷酸與義股未配對，從而形成1-6個核苷酸之3'單股突出端；其中反義股之5'端包含10-30個與義股未配對之連續核苷酸，從而形成10-30個核苷酸單股5'突出端；其中當比對義股及反義股之最大互補性時，至少義股5'末端及3'末端核苷酸與反義股之核苷酸鹼基配對，從而在義股與反義股之間形成基本上雙螺旋區；且當該雙股核酸引入哺乳動物細胞中時，反義股與靶RNA沿著至少19個核糖核苷酸的反義股長度充分互補以減少靶基因表現；且其中義股在三個連續核苷酸上含有至少一個具有三個2'-F修飾之基元，其中至少一個基元出現在裂解位點處或附近。反義股在裂解位點處或附近之三個連續核苷酸上含有至少一個具有三個2'-O-甲基修飾之基元。
在一個實施例中，本發明之iRNA劑包含義股及反義股，其中該iRNA劑包含長度為至少25且至多29個核苷酸之第一股及長度為至多30個核苷酸且在5'端之位置11、12、13處的三個連續核苷酸上具有至少一個具有三個2'-O-甲基修飾之基元的第二股；其中該第一股之該3'端及該第二股之該5'端形成平端且該第二股在其3'端比第一股長1-4個核苷酸，其中雙螺旋區長度為至少25個核苷酸，且當該iRNA劑引入哺乳動物細胞中時，該第二股與靶mRNA沿著該第二股至少19 nt之長度充分互補以降低靶基因表現，且其中該iRNA之dicer裂解較佳產生包含該第二股之該3'端的siRNA，從而降低哺乳動物中之靶基因表現。任擇地，iRNA劑進一步包含配體(例如GalNAc3 )。
在一個實施例中，iRNA劑之義股在三個連續核苷酸上含有至少一個具有三個一致修飾之基元，其中一個基元出現在義股之裂解位點。舉例而言，義股可在5'端之7-15個位置內的三個連續核苷酸上含有至少一個具有三個2'-F修飾之基元。
在一個實施例中，iRNA劑之反義股亦可在三個連續核苷酸上含有至少一個具有三個一致修飾之基元，其中一個基元出現在反義股之裂解位點處或附近。舉例而言，反義股可在5'端之9-15個位置內的三個連續核苷酸上含有至少一個具有三個2'-O-甲基修飾之基元。
對於具有17-23 nt長之雙螺旋區的iRNA劑，反義股之裂解位點通常在5'端之10、11及12位附近。因此，具有三個一致修飾之基元可出現在反義股之9、10、11位；10、11、12位；11、12、13位；12、13、14位；或13、14、15位，自反義股之5'端的第1個核苷酸開始計數，或自反義股之5'端的雙螺旋區內的第1個配對核苷酸開始計數。反義股中之裂解位點亦可根據iRNA之雙螺旋區距離5'端的長度而改變。
在一些實施例中，iRNA劑包含各自具有14至30個核苷酸之義股及反義股，其中義股在三個連續核苷酸上含有至少二個具有三個一致修飾之基元，其中至少一個基元出現在股內之裂解位點處或附近，且至少一個基元出現在股之另一部分，與裂解位點處之基元分隔至少一個核苷酸。在一個實施例中，反義股亦在三個連續核苷酸上含有至少一個具有三個一致修飾之基元，其中至少一個基元出現在股內之裂解位點處或附近。在義股中之裂解位點處或附近出現的基元中之修飾不同於在反義股中之裂解位點處或附近出現的基元中之修飾。
在一些實施例中，iRNA劑包含各自具有14至30個核苷酸之義股及反義股，其中義股在三個連續核苷酸上含有至少一個具有三個2'-F修飾之基元，其中至少一個基元出現在股中之裂解位點處或附近。在一個實施例中，反義股亦在裂解位點處或附近之三個連續核苷酸上含有至少一個具有三個2'-O-甲基修飾之基元。
在一些實施例中，iRNA劑包含各自具有14至30個核苷酸之義股及反義股，其中義股在5'端之位置9、10、11處的三個連續核苷酸上含有至少一個具有三個2'-F修飾之基元，且其中反義股在5'端之位置11、12、13處的三個連續核苷酸上含有至少一個具有三個2'-O-甲基修飾之基元。
在一個實施例中，本發明之iRNA劑包含與靶、雙螺旋體內或其組合之錯配。錯配可發生在突出端區或雙螺旋區中。鹼基對可基於其促進解離或解鏈之傾向排序(例如，基於特定配對之締合或解離的自由能，最簡單的方法為在單個對之基礎上檢查配對，但亦可使用下一個鄰近或類似分析)。在促進解離方面：A:U優於G:C；G:U優於G:C；且I:C優於G:C (I=肌核苷)。錯配，例如非典型配對(如本文別處所述)優於典型(A:T、A:U、G:C)配對；且包括通用鹼基之配對優於典型配對。
在一個實施例中，本發明之iRNA劑包含在反義股之5'端的雙螺旋區內的前1、2、3、4或5個鹼基對中之至少一者，其可獨立地選自以下之群：A:U、G:U、I:C及錯配配對，例如非典型配對或包括通用鹼基之配對，以促進反義股在雙螺旋體之5'端處的解離。
在一個實施例中，反義股中5'端雙螺旋區內之1位核苷酸係選自由以下組成之群：A、dA、dU、U及dT。或者，反義股之5'端的雙螺旋區內的前1、2或3個鹼基對中之至少一者為AU鹼基對。舉例而言，反義股之5'端的雙螺旋區內的第一個鹼基對為AU鹼基對。
在一個態樣中，本發明係關於用於抑制靶基因表現之雙股RNA (dsRNA)劑。dsRNA劑包含義股及反義股，各股具有14至40個核苷酸。dsRNA劑由式(I)表示：
Figure 02_image055
，
在式(I)中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'及B4'各自獨立地為含有選自由以下組成之群之修飾的核苷酸：2'-O-烷基、2'-取代之烷氧基、2'-取代之烷基、2'-鹵基、ENA及BNA/LNA。在一個實施例中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'及B4'各自含有2'-OMe修飾。在一個實施例中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'及B4'各自含有2'-OMe或2'-F修飾。在一個實施例中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'及B4'中之至少一者含有2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)修飾。
C1為位於與反義股種子區相對之位點的熱去穩定化核苷酸(亦即，在反義股之5'端的位置2-8處)。舉例而言，C1位於義股之位置，其與反義股之5'端的位置2-8處的核苷酸配對。在一個實例中，C1位於義股之5'端的位置15處。C1核苷酸具有熱去穩定化修飾，其可包括無鹼基修飾；與雙螺旋體中相對的核苷酸錯配；及糖修飾，諸如2'-去氧修飾或非環狀核苷酸，例如解鎖核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)。在一個實施例中，C1具有選自由以下組成之群的熱去穩定化修飾：i)與反義股中相對的核苷酸錯配；ii)選自由以下組成之群的無鹼基修飾：
Figure 02_image057
；及iii)選自由以下組成之群的糖修飾：
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
及
Figure 02_image069
，其中B為經修飾或未修飾之核鹼基，R1 及R2 獨立地為H、鹵素、OR3 或烷基；且R3 為H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖。在一個實施例中，C1中之熱去穩定化修飾為選自由以下組成之群的錯配：G:G、G:A、G:U、G:T、A:A、A:C、C:C、C:U、C:T、U:U、T:T及U:T；且任擇地，錯配對中之至少一個核鹼基為2'-去氧核鹼基。在一個實例中，C1中之熱去穩定化修飾為GNA或
Figure 02_image071
。
T1、T1'、T2'及T3'各自獨立地表示包含修飾之核苷酸，該修飾為核苷酸提供小於或等於2'-OMe修飾之空間體積的空間體積。空間體積係指修飾之空間效應的總和。確定核苷酸修飾之空間效應的方法為熟習此項技術者已知的。修飾可在核苷酸之核糖的2'位置，或為對非核糖核苷酸、非環狀核苷酸或與核糖之2'位置類似或等效之核苷酸的主鏈的修飾，且為核苷酸提供小於或等於2'-OMe修飾之空間體積的空間體積。舉例而言，T1、T1'、T2'及T3'各自獨立地選自DNA、RNA、LNA、2'-F及2'-F-5'-甲基。在一個實施例中，T1為DNA。在一個實施例中，T1'為DNA、RNA或LNA。在一個實施例中，T2'為DNA或RNA。在一個實施例中，T3'為DNA或RNA。
n1 、n3 及q1 之長度獨立地為4至15個核苷酸。
n5 、q3 及q7 之長度獨立地為1-6個核苷酸。
n4 、q2 及q6 之長度獨立地為1-3個核苷酸；或者，n4 為0。 q5 之長度獨立地為0-10個核苷酸。
n2 及q4 之長度獨立地為0-3個核苷酸。
或者，n4 之長度為0-3個核苷酸。
在一個實施例中，n4 可為0。在一個實例中，n4 為0，且q2 及q6 為1。在另一個實例中，n4 為0，且q2 及q6 為1，其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。
在一個實施例中，n4 、q2 及q6 各自為1。
在一個實施例中，n2 、n4 、q2 、q4 及q6 各自為1。
在一個實施例中，當義股長度為19-22個核苷酸且n4 為1時，C1位於義股之5'端的位置14-17處。在一個實施例中，C1位於義股之5'端的位置15處。
在一個實施例中，T3'始於反義股之5'端的位置2處。在一個實例中，T3'位於反義股之5'端的位置2處且q6 等於1。
在一個實施例中，T1'始於反義股之5'端的位置14處。在一個實例中，T1'位於反義股之5'端的位置14處且q2 等於1。
在一個例示性實施例中，T3'始於反義股之5'端的位置2處且T1'始於反義股之5'端的位置14處。在一個實例中，T3'始於反義股之5'端的位置2處且q6 等於1，T1'始於反義股之5'端的位置14處且q2 等於1。
在一個實施例中，T1'及T3'分隔長度為11個核苷酸(亦即不計數T1'及T3'核苷酸)。
在一個實施例中，T1'位於反義股之5'端的位置14處。在一個實例中，T1'位於反義股之5'端的位置14處且q2 等於1，在2'位置或非核糖、非環狀或主鏈中之位置處的修飾提供比2'-OMe核糖小的空間體積。
在一個實施例中，T3'位於反義股之5'端的位置2處。在一個實例中，T3'位於反義股之5'端的位置2處且q6 等於1，在2'位置或非核糖、非環狀或主鏈中之位置處的修飾提供小於或等於2'-OMe核糖之空間體積。 在一個實施例中，T1位於義股之裂解位點。在一個實例中，當義股長度為19-22個核苷酸且n2 為1時，T1位於義股之5'端的位置11處。在一個例示性實施例中，當義股長度為19-22個核苷酸且n2 為1時，T1位於義股之5'端的位置11處的義股之裂解位點，
在一個實施例中，T2'始於反義股之5'端的位置6處。在一個實例中，T2'位於反義股之5'端的位置6-10處，且q4 為1。 在一個例示性實施例中，當義股長度為19-22個核苷酸且n2 為1時，T1位於義股之裂解位點，例如義股之5'端的位置11處；T1'位於反義股之5'端的位置14處且q2 等於1，對T1'之修飾位於核糖之2'位置或非核糖、非環狀或主鏈中之位置處，該修飾提供比2'-OMe核糖小的空間體積；T2'位於反義股之5'端的位置6-10處且q4 為1；T3'位於反義股之5'端的位置2處且q6 等於1，對T3'之修飾位於2'位置或非核糖、非環狀或主鏈中之位置處，該修飾提供小於或等於2'-OMe核糖之空間體積。
在一個實施例中，T2'始於反義股之5'端的位置8處。在一個實例中，T2'始於反義股之5'端的位置8處，且q4 為2。 在一個實施例中，T2'始於反義股之5'端的位置9處。在一個實例中，T2'位於反義股之5'端的位置9處，且q4 為1。 在一個實施例中，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為1，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為6，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。
在一個實施例中，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為1，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為6，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為6，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為7，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為6，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為7，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為1，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為6，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為1，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為6，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為5，T2'為2'-F，q4 為1，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；任擇地，在反義股之3'端具有至少2個額外的TT。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為5，T2'為2'-F，q4 為1，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；任擇地，在反義股之3'端具有至少2個額外的TT；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自5'端計數)。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。
dsRNA劑可在義股或反義股之5'端包含含磷基團。5'端含磷基團可為5'端磷酸酯基(5'-P)、5'端硫代磷酸酯基(5'-PS)、5'端二硫代磷酸酯基(5'-PS2 )、5'端乙烯基膦酸酯基(5'-VP)、5'端甲基膦酸酯基(MePhos)或5'-去氧-5'-C -丙二醯基(
Figure 02_image073
)。當5'端含磷基團為5'端乙烯基膦酸酯基(5'-VP)時，5'-VP可為5'-E -VP異構體(亦即，反式乙烯基磷酸酯基，
Figure 02_image075
)、5'-Z -VP異構體(亦即，順式乙烯基磷酸酯基，
Figure 02_image077
)或其混合物。
在一個實施例中，dsRNA劑在義股之5'端包含含磷基團。在一個實施例中，dsRNA劑在反義股之5'端包含含磷基團。
在一個實施例中，dsRNA劑包含5'-P。在一個實施例中，dsRNA劑在反義股中包含5'-P。 在一個實施例中，dsRNA劑包含5'-PS。在一個實施例中，dsRNA劑在反義股中包含5'-PS。
在一個實施例中，dsRNA劑包含5'-VP。在一個實施例中，dsRNA劑在反義股中包含5'-VP。在一個實施例中，dsRNA劑在反義股中包含5'-E -VP。在一個實施例中，dsRNA劑在反義股中包含5'-Z -VP。
在一個實施例中，dsRNA劑包含5'-PS2 。在一個實施例中，dsRNA劑在反義股中包含5'-PS2 。
在一個實施例中，dsRNA劑包含5'-PS2 。在一個實施例中，dsRNA劑在反義股中包含5'-去氧-5'-C -丙二醯基。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1。dsRNA劑亦包含5'-PS。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1。dsRNA劑亦包含5'-P。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1。dsRNA劑亦包含5'-VP。5'-VP可為5'-E -VP、5'-Z -VP或其組合。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1。dsRNA劑亦包含5'-PS2 。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1。dsRNA劑亦包含5'-去氧-5'-C -丙二醯基。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-P。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-PS。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-VP。5'-VP可為5'-E -VP、5'-Z -VP或其組合。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-PS2 。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-去氧-5'-C -丙二醯基。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1。dsRNA劑亦包含5'-P。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1。dsRNA劑亦包含5'-PS。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1。dsRNA劑亦包含5'-VP。5'-VP可為5'-E -VP、5'-Z -VP或其組合。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1。dsRNA劑亦包含5'-PS2 。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1。dsRNA劑亦包含5'-去氧-5'-C -丙二醯基。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-P。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-PS。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-VP。5'-VP可為5'-E -VP、5'-Z -VP或其組合。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-PS2 。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-去氧-5'-C -丙二醯基。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1。dsRNA劑亦包含5'-P。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1。dsRNA劑亦包含5'-PS。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1。dsRNA劑亦包含5'-VP。5'-VP可為5'-E -VP、5'-Z -VP或其組合。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1。dsRNA劑亦包含5'-PS2 。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1。dsRNA劑亦包含5'-去氧-5'-C -丙二醯基。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-P。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-PS。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-VP。5'-VP可為5'-E -VP、5'-Z -VP或其組合。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-PS2 。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-去氧-5'-C -丙二醯基。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1。dsRNA劑亦包含5'-P。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1。dsRNA劑亦包含5'-PS。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1。dsRNA劑亦包含5'-VP。5'-VP可為5'-E -VP、5'-Z -VP或其組合。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1。dsRNA劑亦包含5'-PS2 。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1。dsRNA劑亦包含5'-去氧-5'-C -丙二醯基。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-P。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-PS。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-VP。5'-VP可為5'-E -VP、5'-Z -VP或其組合。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-PS2 。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-去氧-5'-C -丙二醯基。
在一個實施例中，100%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%或30%之本發明之dsRNA劑經修飾。舉例而言，當50%之dsRNA劑經修飾時，dsRNA劑中存在之所有核苷酸的50%含有如本文所述之修飾。
在一個實施例中，dsRNA劑之義股及反義股中之每一者獨立地經非環狀核苷酸、LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-去氧、2'-氟、2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)、2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)、2'-O-胺基丙基(2'-O-AP)或2'-ara-F修飾。
在一個實施例中，dsRNA劑之義股及反義股中之每一者含有至少二個不同的修飾。
在一個實施例中，式(I)之dsRNA劑進一步包含長度為1-10個核苷酸之3'及/或5'突出端。在一個實例中，式(I)之dsRNA劑包含處於反義股之3'端的3'突出端及處於反義股之5'端的平端。在另一個實例中，dsRNA劑在義股之5'端具有5'突出端。
在一個實施例中，本發明之dsRNA劑不含有任何2'-F修飾。
在一個實施例中，dsRNA劑之義股及/或反義股包含具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵之一或多個鏈段。在一個實例中，義股包含具有二個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵之一個鏈段。在一個實例中，反義股包含具有二個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵之二個鏈段。舉例而言，具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵之二個鏈段係由16-18個磷酸酯核苷酸間鍵分隔開。
在一個實施例中，dsRNA劑之義股及反義股中之每一者具有15-30個核苷酸。在一個實例中，義股具有19-22個核苷酸，且反義股具有19-25個核苷酸。在另一個實例中，義股具有21個核苷酸，且反義股具有23個核苷酸。
在一個實施例中，雙螺旋體反義股之5'端的位置1處的核苷酸係選自由A、dA、dU、U及dT組成之群。在一個實施例中，來自反義股之5'端的第一、第二及第三鹼基對中之至少一者為AU鹼基對。
在一個實施例中，本發明之dsRNA劑的反義股與靶RNA100%互補以與其雜交且經由RNA干擾抑制其表現。在另一個實施例中，本發明之dsRNA劑的反義股與靶RNA至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%或至少50%互補。
在一個態樣中，本發明係關於能夠抑制靶基因表現之如本文所定義之dsRNA劑。dsRNA劑包含義股及反義股，各股具有14至40個核苷酸。義股含有至少一個熱去穩定化核苷酸，其中至少一個該熱去穩定化核苷酸出現在與反義股之種子區相對的位點處或附近(亦即在反義股之5'端的位置2-8處)。本說明書中描述之與由式(I)表示之dsRNA相關的各實施例及態樣亦可適用於含有熱去穩定化核苷酸之dsRNA。
當義股長度為21個核苷酸時，熱去穩定化核苷酸可出現在例如義股之5'端的位置14-17之間。反義股含有至少二個經修飾之核酸，其小於空間苛刻的2'-OMe修飾。較佳地，小於空間苛刻的2'-OMe的二個經修飾之核酸分隔長度為11個核苷酸。舉例而言，二個經修飾之核酸位於反義股之5'端的位置2及14處。
在一個實施例中，dsRNA劑進一步包含至少一種ASGPR配體。舉例而言，ASGPR配體為經由二價或三價分支鏈連接子連接的一或多種GalNAc衍生物，諸如：
Figure 02_image079
。在一個實例中，ASGPR配體附接至義股之3'端。
舉例而言，如本文所定義之dsRNA劑可包含i)在義股或反義股之5'端處的含磷基團；ii)在義股之位置1-5內的二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾(自義股之5'端計數)，及在反義股之位置1及2處的二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾及在位置18-23內的二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾(自反義股之5'端計數)；及iii)配體，諸如在義股或反義股之5'端或3'端的ASGPR配體(例如，一或多種GalNAc衍生物)。舉例而言，配體可處於義股之3'端。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-P及靶向配體。在一個實施例中，5'-P處於反義股之5'端，且靶向配體處於義股之3'端。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-PS及靶向配體。在一個實施例中，5'-PS處於反義股之5'端，且靶向配體處於義股之3'端。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-VP (例如，5'-E -VP、5'-Z -VP或其組合)及靶向配體。在一個實施例中，5'-VP處於反義股之5'端，且靶向配體處於義股之3'端。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-PS2 及靶向配體。在一個實施例中，5'-PS2 處於反義股之5'端，且靶向配體處於義股之3'端。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-去氧-5'-C -丙二醯基及靶向配體。在一個實施例中，5'-去氧-5'-C -丙二醯基處於反義股之5'端，且靶向配體處於義股之3'端。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-P及靶向配體。在一個實施例中，5'-P處於反義股之5'端，且靶向配體處於義股之3'端。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-PS及靶向配體。在一個實施例中，5'-PS處於反義股之5'端，且靶向配體處於義股之3'端。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-VP (例如，5'-E -VP、5'-Z -VP或其組合)及靶向配體。在一個實施例中，5'-VP處於反義股之5'端，且靶向配體處於義股之3'端。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-PS2 及靶向配體。在一個實施例中，5'-PS2 處於反義股之5'端，且靶向配體處於義股之3'端。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-OMe且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-去氧-5'-C -丙二醯基及靶向配體。在一個實施例中，5'-去氧-5'-C -丙二醯基處於反義股之5'端，且靶向配體處於義股之3'端。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-P及靶向配體。在一個實施例中，5'-P處於反義股之5'端，且靶向配體處於義股之3'端。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-PS及靶向配體。在一個實施例中，5'-PS處於反義股之5'端，且靶向配體處於義股之3'端。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-VP (例如，5'-E -VP、5'-Z -VP或其組合)及靶向配體。在一個實施例中，5'-VP處於反義股之5'端，且靶向配體處於義股之3'端。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-PS2 及靶向配體。在一個實施例中，5'-PS2 處於反義股之5'端，且靶向配體處於義股之3'端。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為5，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-去氧-5'-C -丙二醯基及靶向配體。在一個實施例中，5'-去氧-5'-C -丙二醯基處於反義股之5'端，且靶向配體處於義股之3'端。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-P及靶向配體。在一個實施例中，5'-P處於反義股之5'端，且靶向配體處於義股之3'端。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-PS及靶向配體。在一個實施例中，5'-PS處於反義股之5'端，且靶向配體處於義股之3'端。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-VP (例如，5'-E -VP、5'-Z -VP或其組合)及靶向配體。在一個實施例中，5'-VP處於反義股之5'端，且靶向配體處於義股之3'端。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-PS2 及靶向配體。在一個實施例中，5'-PS2 處於反義股之5'端，且靶向配體處於義股之3'端。
在一個實施例中，B1為2'-OMe或2'-F，n1 為8，T1為2'F，n2 為3，B2為2'-OMe，n3 為7，n4 為0，B3為2'-OMe，n5 為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2 為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3 為4，q4 為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5 為7，T3'為2'-F，q6 為1，B4'為2'-F且q7 為1；其中二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在義股之位置1-5內(自義股之5'端計數)，二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在反義股之位置1及2處且二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵修飾在位置18-23內(自反義股之5'端計數)。dsRNA劑亦包含5'-去氧-5'-C -丙二醯基及靶向配體。在一個實施例中，5'-去氧-5'-C -丙二醯基處於反義股之5'端，且靶向配體處於義股之3'端。
在一具體實施例中，本發明之dsRNA劑包含： (a)   義股，其具有： (i)   21個核苷酸之長度； (ii)  任擇地附接於3'端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價分支鏈連接子附接之三個GalNAc衍生物；及 (iii)  在位置1、3、5、7、9至11、13、17、19及21處之2'-F修飾，以及在位置2、4、6、8、12、14至16、18及20處之2'-OMe修飾(自5'端計數)； 及 (b)   反義股，其具有： (i)    23個核苷酸之長度； (ii)   在位置1、3、5、9、11至13、15、17、19、21及23處之2'-OMe修飾，以及在位置2、4、6至8、10、14、16、18、20及22處之2'F修飾(自5'端計數)；及 (iii)  在核苷酸位置21與22之間，及在核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 其中dsRNA劑具有在反義股之3'端處的二個核苷酸突出物，及在反義股之5'端處的平端。
在另一具體實施例中，本發明之dsRNA劑包含： (a)   義股，其具有： (i)    21個核苷酸之長度； (ii)   任擇地附接於3'端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價分支鏈連接子附接之三個GalNAc衍生物； (iii)  在位置1、3、5、7、9至11、13、15、17、19及21處之2'-F修飾，以及在位置2、4、6、8、12、14、16、18及20處之2'-OMe修飾(自5'端計數)；及 (iv)  在核苷酸位置1與2之間，及在核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 及 (b)   反義股，其具有： (i)    23個核苷酸之長度； (ii)  在位置1、3、5、7、9、11至13、15、17、19及21至23處之2'-OMe修飾，以及在位置2、4、6、8、10、14、16、18及20處之2'F修飾(自5'端計數)；及 (iii) 在核苷酸位置1與2之間，在核苷酸位置2與3之間，在核苷酸位置21與22之間，及在核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 其中dsRNA劑具有在反義股之3'端處的二個核苷酸突出物，及在反義股之5'端處的平端。
在另一具體實施例中，本發明之dsRNA劑包含： (a)   義股，其具有： (i)    21個核苷酸之長度； (ii)   任擇地附接於3'端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價分支鏈連接子附接之三個GalNAc衍生物； (iii)  在位置1至6、8、10及12至21處之2'-OMe修飾，在位置7及9處之2'-F修飾，及在位置11處之去氧核苷酸(例如dT) (自5'端計數)；及 (iv)  在核苷酸位置1與2之間，及在核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 及 (b)   反義股，其具有： (i)   23個核苷酸之長度； (ii)  在位置1、3、7、9、11、13、15、17及19至23處之2'-OMe修飾，以及在位置2、4至6、8、10、12、14、16及18處之2'-F修飾(自5'端計數)；及 (iii) 在核苷酸位置1與2之間，在核苷酸位置2與3之間，在核苷酸位置21與22之間，及在核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 其中dsRNA劑具有在反義股之3'端處的二個核苷酸突出物，及在反義股之5'端處的平端。
在另一具體實施例中，本發明之dsRNA劑包含： (a)   義股，其具有： (i)    21個核苷酸之長度； (ii)   任擇地附接於3'端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價分支鏈連接子附接之三個GalNAc衍生物； (iii)  在位置1至6、8、10、12、14及16至21處之2'-OMe修飾，以及在位置7、9、11、13及15處之2'-F修飾；及 (iv)  在核苷酸位置1與2之間，及在核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 及 (b)   反義股，其具有： (i)   23個核苷酸之長度； (ii)  在位置1、5、7、9、11、13、15、17、19及21至23處之2'-OMe修飾，以及在位置2至4、6、8、10、12、14、16、18及20處之2'-F修飾(自5'端計數)；及 (iii) 在核苷酸位置1與2之間，在核苷酸位置2與3之間，在核苷酸位置21與22之間，及在核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 其中dsRNA劑具有在反義股之3'端處的二個核苷酸突出物，及在反義股之5'端處的平端。
在另一具體實施例中，本發明之dsRNA劑包含： (a)   義股，其具有： (i)    21個核苷酸之長度； (ii)   任擇地附接於3'端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價分支鏈連接子附接之三個GalNAc衍生物； (iii)  在位置1至9及12至21處之2'-OMe修飾，以及在位置10及11處之2'-F修飾；及 (iv)  在核苷酸位置1與2之間，及在核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 及 (b)   反義股，其具有： (i)   23個核苷酸之長度； (ii)  在位置1、3、5、7、9、11至13、15、17、19及21至23處之2'-OMe修飾，以及在位置2、4、6、8、10、14、16、18及20處之2'-F修飾(自5'端計數)；及 (iii) 在核苷酸位置1與2之間，在核苷酸位置2與3之間，在核苷酸位置21與22之間，及在核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 其中dsRNA劑具有在反義股之3'端處的二個核苷酸突出物，及在反義股之5'端處的平端。
在另一具體實施例中，本發明之dsRNA劑包含： (a)   義股，其具有： (i)    21個核苷酸之長度； (ii)   任擇地附接於3'端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價分支鏈連接子附接之三個GalNAc衍生物； (iii)  在位置1、3、5、7、9至11及13處之2'-F修飾，以及在位置2、4、6、8、12及14至21處之2'-OMe修飾；及 (iv)  在核苷酸位置1與2之間，及在核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 及 (b)   反義股，其具有： (i)   23個核苷酸之長度； (ii)  在位置1、3、5至7、9、11至13、15、17至19及21至23處之2'-OMe修飾，以及在位置2、4、8、10、14、16及20處之2'-F修飾(自5'端計數)；及 (iii) 在核苷酸位置1與2之間，在核苷酸位置2與3之間，在核苷酸位置21與22之間，及在核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 其中dsRNA劑具有在反義股之3'端處的二個核苷酸突出物，及在反義股之5'端處的平端。
在另一具體實施例中，本發明之dsRNA劑包含： (a)    義股，其具有： (i)     21個核苷酸之長度； (ii)    任擇地附接於3'端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價分支鏈連接子附接之三個GalNAc衍生物； (iii)   在位置1、2、4、6、8、12、14、15、17及19至21處之2'-OMe修飾，以及在位置3、5、7、9至11、13、16及18處之2'-F修飾；及 (iv)   在核苷酸位置1與2之間，及在核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 及 (b)    反義股，其具有： (i)   25個核苷酸之長度； (ii)  在位置1、4、6、7、9、11至13、15、17及19至23處之2'-OMe修飾，在位置2、3、5、8、10、14、16及18處之2'-F修飾，以及在位置24及25處之去氧核苷酸(例如dT) (自5'端計數)；及 (iii) 在核苷酸位置1與2之間，在核苷酸位置2與3之間，在核苷酸位置21與22之間，及在核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 其中dsRNA劑具有在反義股之3'端處的四個核苷酸突出物，及在反義股之5'端處的平端。
在另一具體實施例中，本發明之dsRNA劑包含： (a)    義股，其具有： (i)     21個核苷酸之長度； (ii)    任擇地附接於3'端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價分支鏈連接子附接之三個GalNAc衍生物； (iii)   在位置1至6、8及12至21處之2'-OMe修飾，以及在位置7及9至11處之2'-F修飾；及 (iv)   在核苷酸位置1與2之間，及在核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 及 (b)    反義股，其具有： (i)   23個核苷酸之長度； (ii)  在位置1、3至5、7、8、10至13、15及17至23處之2'-OMe修飾，以及在位置2、6、9、14及16處之2'-F修飾(自5'端計數)；及 (iii) 在核苷酸位置1與2之間，在核苷酸位置2與3之間，在核苷酸位置21與22之間，及在核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 其中dsRNA劑具有在反義股之3'端處的二個核苷酸突出物，及在反義股之5'端處的平端。
在另一具體實施例中，本發明之dsRNA劑包含： (a)    義股，其具有： (i)     21個核苷酸之長度； (ii)    任擇地附接於3'端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價分支鏈連接子附接之三個GalNAc衍生物； (iii)   在位置1至6、8及12至21處之2'-OMe修飾，以及在位置7及9至11處之2'-F修飾；及 (iv)   在核苷酸位置1與2之間，及在核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 及 (b)    反義股，其具有： (i)   23個核苷酸之長度； (ii)  在位置1、3至5、7、10至13、15及17至23處之2'-OMe修飾，以及在位置2、6、8、9、14及16處之2'-F修飾(自5'端計數)；及 (iii) 在核苷酸位置1與2之間，在核苷酸位置2與3之間，在核苷酸位置21與22之間，及在核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 其中dsRNA劑具有在反義股之3'端處的二個核苷酸突出物，及在反義股之5'端處的平端。
在另一具體實施例中，本發明之dsRNA劑包含： (a)    義股，其具有： (i)     19個核苷酸之長度； (ii)    任擇地附接於3'端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價分支鏈連接子附接之三個GalNAc衍生物； (iii)   在位置1至4、6及10至19處之2'-OMe修飾，以及在位置5及7至9處之2'-F修飾；及 (iv)   在核苷酸位置1與2之間，及在核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 及 (b)    反義股，其具有： (i)   21個核苷酸之長度； (ii)  在位置1、3至5、7、10至13、15及17至21處之2'-OMe修飾，以及在位置2、6、8、9、14及16處之2'-F修飾(自5'端計數)；及 (iii) 在核苷酸位置1與2之間，在核苷酸位置2與3之間，在核苷酸位置19與20之間，及在核苷酸位置20與21之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 其中dsRNA劑具有在反義股之3'端處的二個核苷酸突出物，及在反義股之5'端處的平端。
在一個實施例中，本發明之dsRNA劑包含： (a)    義股，其具有： (i)     18-23個核苷酸之長度； (ii)    在位置7-15處之三個連續2'-F修飾；及 (b)    反義股，其具有： (i)   18-23個核苷酸之長度； (ii)  在該股上任何地方的至少2'-F修飾；及 (iii) 在前五個核苷酸處之至少二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 其中該等dsRNA劑具有與至少一股上之一或多個位置接合的一或多個親脂性部分；且具有在反義股之3'端處的二個核苷酸突出端，及在反義股之5'端處的平端；或雙螺旋體二端均為平端。
在一個實施例中，本發明之dsRNA劑包含： (a)    義股，其具有： (i)     18-23個核苷酸之長度； (ii)    少於四個2'-F修飾； (b)    反義股，其具有： (i)   18-23個核苷酸之長度； (ii)  少於十二個2'-F修飾；及 (iii) 在前五個核苷酸處之至少二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 其中該等dsRNA劑具有與至少一股上之一或多個位置接合的一或多個親脂性部分；且具有在反義股之3'端處的二個核苷酸突出端，及在反義股之5'端處的平端；或雙螺旋體二端均為平端。
在一個實施例中，本發明之dsRNA劑包含： (a)    義股，其具有： (i)     19-35個核苷酸之長度； (ii)    少於四個2'-F修飾； (b)    反義股，其具有： (i)   19-35個核苷酸之長度； (ii)  少於十二個2'-F修飾；及 (iii) 在前五個核苷酸處之至少二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)； 其中雙螺旋區在19至25個鹼基對之間(較佳19、20、21或22個)；且其中該等dsRNA劑具有與至少一股上之一或多個位置接合的一或多個親脂性部分；且具有在反義股之3'端處的二個核苷酸突出端，及在反義股之5'端處的平端；或雙螺旋體二端均為平端。
在一個實施例中，本發明之dsRNA劑包含義股及反義股，其長度為15-30個核苷酸；在反義股之前五個核苷酸處具有至少二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)；其中雙螺旋區在19至25個鹼基對之間(較佳19、20、21或22個)；其中dsRNA劑具有與至少一股上之一或多個位置接合的一或多個親脂性部分；且其中dsRNA劑具有少於20%、少於15%及少於10%的非天然核苷酸。
非天然核苷酸之實例包括非環狀核苷酸、LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-去氧、2'-氟、2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)、2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)、2'-O-胺基丙基(2'-O-AP)或2'-ara-F及其他。
在一個實施例中，本發明之dsRNA劑包含義股及反義股，其長度為15-30個核苷酸；在反義股之前五個核苷酸處具有至少二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)；其中雙螺旋區在19至25個鹼基對之間(較佳19、20、21或22個)；其中dsRNA劑具有與至少一股上之一或多個位置接合的一或多個親脂性部分；且其中dsRNA劑具有大於80%、大於85%及大於90%的天然核苷酸，諸如2'-OH、2'-去氧及2'-OMe為天然核苷酸。
在一個實施例中，本發明之dsRNA劑包含義股及反義股，其長度為15-30個核苷酸；在反義股之前五個核苷酸處具有至少二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵(自5'端計數)；其中雙螺旋區在19至25個鹼基對之間(較佳19、20、21或22個)；其中dsRNA劑具有與至少一股上之一或多個位置接合的一或多個親脂性部分；且其中dsRNA劑具有100%天然核苷酸，諸如2'-OH、2'-去氧及2'-OMe為天然核苷酸。
親脂性部分之實例包括但不限於脂質(飽和或不飽和C4-C30烴鏈，及任擇的官能基，選自由羥基、胺、羧酸、磺酸酯基、磷酸酯基、硫醇、疊氮基及炔組成之群)、膽固醇、視黃酸、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基或啡噁嗪。
在一些實施例中，親脂性部分為C6 -C30 酸(例如，己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、油酸、亞麻油酸、花生四烯酸、順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、維生素A、維生素E、膽固醇等)或C6 -C30 醇(例如，己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇、十三烷醇、十四烷醇、十五烷醇、十六烷醇、十七烷醇、十八烷醇、油醇、亞麻醇、花生四烯醇、順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯醇、視黃醇、維生素E、膽固醇等)。
在一個實例中，親脂性部分為飽和或不飽和C6-C18烴鏈。
在一個實例中，親脂性部分為二十二碳六烯酸。
在一個實施例中，本發明之dsRNA劑包含義股及反義股，各股具有14至30個核苷酸，其中義股序列由式(I)表示：
Figure 02_image081
其中： i及j各自獨立地為0或1； p及q各自獨立地為0-6； 各Na 獨立地表示包含0-25個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列，各序列包含至少二個經不同修飾之核苷酸； 各Nb 獨立地表示包含1、2、3、4、5或6個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列； 各np 及nq 獨立地表示突出端核苷酸； 其中Nb 及Y不具有相同的修飾； 其中XXX、YYY及ZZZ各自獨立地表示在三個連續核苷酸上具有三個一致修飾的一個基元； 其中其中dsRNA劑具有與至少一股上之一或多個位置接合的一或多個親脂性部分；及 其中dsRNA之反義股包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個磷酸酯核苷酸間鍵分開的二個具有一個、二個或三個硫代磷酸酯核苷酸間鍵的鏈段。
各種公開案描述多聚體siRNA，且全部可與本發明之iRNA一起使用。此類公開案包括WO2007/091269、美國專利第7858769號、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887及WO2011/031520，其特此以全文引用之方式併入。
在一些實施例中，100%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%或30%之本發明之iRNA劑經修飾。
在一些實施例中，iRNA劑之義股及反義股中之每一者獨立地經非環狀核苷酸、LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-去氧、2'-氟、2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)、2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)、2'-O-胺基丙基(2'-O-AP)或2'-ara-F修飾。
在一些實施例中，iRNA劑之義股及反義股中之每一者含有至少二個不同的修飾。
在一些實施例中，本發明之雙股iRNA劑不含有任何2'-F修飾。
在一些實施例中，本發明之雙股iRNA劑含有一個、二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個或十二個2'-F修飾。在一個實例中，本發明之雙股iRNA劑含有九或十個2'-F修飾。
本發明之iRNA劑可進一步包含至少一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵修飾可出現在股中任何位置之義股或反義股或二者之任何核苷酸上。舉例而言，核苷酸間鍵修飾可出現在義股或反義股上之每一核苷酸上；各核苷酸間鍵修飾可以交替模式出現在義股或反義股上；或義股或反義股可以交替模式含有二個核苷酸間鍵修飾。義股上之核苷酸間鍵修飾的交替模式可與反義股相同或不同，且義股上之核苷酸間鍵修飾的交替模式可相對於反義股上之核苷酸間鍵修飾的交替模式具有移位。
在一個實施例中，iRNA在突出端區域中包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵修飾。舉例而言，突出端區域可含有二個核苷酸，在該二個核苷酸之間具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵。亦可進行核苷酸間鍵修飾以將突出端核苷酸與雙螺旋區內之末端配對核苷酸連接。舉例而言，至少2、3、4個或所有突出端核苷酸可經由硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵連接，且任擇地，可存在將突出端核苷酸與緊鄰突出端核苷酸之配對核苷酸連接的額外硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵。舉例而言，在末端三個核苷酸之間可存在至少二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵，其中三個核苷酸中之二個為突出端核苷酸，且第三個為緊鄰突出端核苷酸之配對核苷酸。較佳地，此等末端三個核苷酸可處於反義股之3'端。
在一些實施例中，iRNA劑之義股及/或反義股包含具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵之一或多個鏈段。在一個實例中，義股包含具有二個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵之一個鏈段。在一個實例中，反義股包含具有二個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵之二個鏈段。舉例而言，具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵之二個鏈段係由16-18個磷酸酯核苷酸間鍵分隔開。
在一些實施例中，本發明之iRNA劑的反義股與靶RNA100%互補以與其雜交且經由RNA干擾抑制其表現。在另一個實施例中，本發明之iRNA劑的反義股與靶RNA至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%或至少50%互補。
在一個態樣中，本發明係關於能夠抑制靶基因表現之iRNA劑。iRNA劑包含義股及反義股，各股具有14至40個核苷酸。義股含有至少一個熱去穩定化核苷酸，其中至少一個該熱去穩定化核苷酸出現在與反義股之種子區相對的位點處或附近(亦即在反義股之5'-端的位置2-8處)。舉例而言，當義股長度為21個核苷酸時，熱去穩定化核苷酸出現在義股之5'端的位置14-17之間。反義股含有至少二個經修飾之核酸，其小於空間苛刻的2'-OMe修飾。較佳地，小於空間苛刻的2'-OMe的二個經修飾之核酸分隔長度為11個核苷酸。舉例而言，二個經修飾之核酸位於反義股之5'端的位置2及14處。
在一些實施例中，本文揭示之本發明化合物為miRNA模擬物。在一種設計中，miRNA模擬物為雙股分子(例如，具有約16至約31個核苷酸長度的雙螺旋區)且含有與給定miRNA之成熟股具有一致性的一或多個序列。雙股miRNA模擬物具有與如上關於雙股iRNA所述類似之設計。在一些實施例中，miRNA模擬物包含16至31個核苷酸之雙螺旋區及以下化學修飾模式中之一或多者：義股含有核苷酸1及2之2'-O-甲基修飾(自有義寡核苷酸之5'端計數)以及所有C及U；反義股修飾可包含所有C及U之2'F修飾、寡核苷酸5'端之磷酸化及與2個核苷酸3'突出端相關之穩定的核苷酸間鍵。
在一些實施例中，本文揭示之本發明化合物為抗mir。在一些實施例中，本發明化合物包含至少二個經由基於核苷酸或非基於核苷酸之連接子，例如本揭示內容中所述之連接子彼此共價連接，或彼此非共價連接的抗mir。術語「抗mir」、「微小RNA抑制劑」或「miR抑制劑」為同義的且係指干擾特定miRNA活性的寡核苷酸或經修飾之寡核苷酸。抑制劑可採用多種構型，包括單股、雙股(RNA/RNA或RNA/DNA雙螺旋體)及髮夾設計，一般而言，微小RNA抑制劑包含與待靶向之miRNA的成熟股互補或部分互補的一或多個序列或序列部分，另外，miRNA抑制劑亦可包含位於成熟miRNA之反向互補序列之5'及3'的額外序列。額外序列可為與成熟miRNA來源之pri-miRNA中之成熟miRNA相鄰序列的反向互補序列，或額外序列可為任意序列(具有A、G、C、U或dT之混合物)。在一些實施例中，額外序列中之一或二者為能夠形成髮夾之任意序列。因此，在一些實施例中，作為miRNA之反向互補序列的序列藉由髮夾結構側接在5'側及3'側。當雙股時，微小RNA抑制劑可包括相反股上之核苷酸之間的錯配。此外，微小RNA抑制劑可與接合物部分連接，以促進抑制劑攝入細胞中。
微小RNA抑制劑，包括髮夾miRNA抑制劑，詳細描述於Vermeulen等人, 「Double-Stranded Regions Are Essential Design Components Of Potent Inhibitors of RISC Function,」 RNA 13: 723-730 (2007)以及WO2007/095387及WO 2008/036825中，其各自以全文引用之方式併入本文中。一般熟習此項技術者可自資料庫選擇序列用於所需miRNA，且設計可用於本文所揭示之方法的抑制劑。
在一些實施例中，本文揭示之本發明化合物為拮抗mir。在一些實施例中，本發明化合物包含至少二個經由基於核苷酸或非基於核苷酸之連接子，例如本揭示內容中所述之連接子彼此共價連接，或彼此非共價連接的拮抗mir。拮抗mir為RNA樣寡核苷酸，其具有用於RNA酶保護及藥理學特性之各種修飾，諸如增強組織及細胞攝取。其與正常RNA之不同之處在於例如糖之完全2'-O-甲基化、硫代磷酸酯糖間鍵及例如在3'端之膽固醇部分。在一較佳實施例中，拮抗mir包含在分子之所有核苷酸處之2'-O-甲基修飾、在3'端處之膽固醇部分、在5'端前二個位置處之二個硫代磷酸酯糖間鍵及在3'端處之四個硫代磷酸酯鍵。藉由形成包含拮抗mir及內源性miRNA之雙螺旋體，拮抗mir可用於有效沉默內源性miRNA，從而防止miRNA誘導之基因沉默。拮抗mir介導之miRNA沉默的實例為miR-122之沉默，描述於Krutzfeldt等人, Nature, 2005, 438: 685-689中，其明確地以全文引用之方式併入本文中。
近期研究已發現，dsRNA亦可活化基因表現，其為已稱為「小RNA誘導之基因活化」或RNAa (活化RNA)之機制。參見例如Li, L.C.等人Proc Natl Acad Sci U S A . (2006), 103(46):17337-42及Li L.C. (2008). 「Small RNA-Mediated Gene Activation」. RNA and the Regulation of Gene Expression: A Hidden Layer of Complexity. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-25-7。已顯示靶向基因啟動子之dsRNA誘導相關基因之有效轉錄活化。在人類中亦已發現引起RNAa之內源性miRNA。查閱E. Nature (2007). 448 (7156): 855-858。
另一個令人驚訝的觀察結果為藉由RNAa之基因活化為持久的。已發現基因表現之誘導持續超過十天。RNAa之延長效應可歸因於dsRNA靶位點處之表觀遺傳變化。在一些實施例中，RNA活化因子可增加基因之表現。在一些實施例中，增加的基因表現抑制活力、生長發育及/或繁殖。
因此，在一些實施例中，本文揭示之本發明化合物為活化RNA。在一些實施例中，本發明化合物包含至少二個經由基於核苷酸或非基於核苷酸之連接子，例如本揭示內容中所述之連接子彼此共價連接，或彼此非共價連接的活化RNA。
因此，在一些實施例中，本文揭示之本發明化合物為形成三螺旋體之寡核苷酸(TFO)。在一些實施例中，本發明化合物包含至少二個經由基於核苷酸或非基於核苷酸之連接子，例如本揭示內容中所述之連接子彼此共價連接，或彼此非共價連接的TFO。近期研究表明，可設計形成三螺旋體之寡核苷酸，其可以序列特異性方式識別且結合雙股螺旋DNA中之多嘌呤/多嘧啶區。此等識別規則由Maher III, L.J.等人,Science (1989) 第245卷, 第725-730頁；Moser, H. E.等人,Science (1987) 第238卷, 第645-630頁；Beal, P.A.等人,Science (1992) 第251卷, 第1360-1363頁；Conney, M.等人,Science (1988) 第241卷, 第456-459頁及Hogan, M.E.等人, EP公開案375408概述。寡核苷酸之修飾，諸如嵌入劑及糖間鍵取代之引入，以及結合條件(pH及陽離子濃度)之最佳化有助於克服TFO活性的固有障礙，諸如電荷排斥及不穩定性，且最近顯示合成寡核苷酸可靶向特定序列(關於最新的綜述，參見Seidman及Glazer, J Clin Invest 2003;l 12:487-94)。一般而言，形成三螺旋體之寡核苷酸具有序列對應關係： 寡核苷酸 3'-A G G T 雙螺旋體 5'-A G C T 雙螺旋體 3'-T C G A
然而，已顯示A-AT及G-GC三聯體具有最大的三螺旋穩定性(Reither及Jeltsch, BMC Biochem, 2002, Seρtl2, Epub)。同一作者已證明，根據A-AT及G-GC規則設計的TFO不形成非特異性三螺旋體，表明三鏈體形成確實為序列特異性的。
因此，對於任何給定的序列，可設計三螺旋體形成序列。形成三螺旋體之寡核苷酸的長度較佳為至少15、更佳25、再更佳30或更多個核苷酸，至多50或100個核苷酸。
用靶DNA形成三螺旋結構誘導空間及功能變化，阻斷轉錄起始及延伸，允許所需序列變化引入內源性DNA中且致使基因表現之特異性下調。在用TFO處理之細胞中此類基因表現抑制之實例包括在哺乳動物細胞中剔除附加型supFGl及內源性HPRT基因(Vasquez等人, Nucl Acids Res. 1999;27: 1176-81及Puri等人, J Biol Chem, 2001;276:28991-98)，以及前列腺癌病因中重要的Ets2轉錄因子(Carbone等人, Nucl Acid Res. 2003 ;31:833-43)及促炎性ICAM-I基因(Besch等人, J Biol Chem, 2002;277:32473-79)之表現的序列及靶特異性下調。另外，Vuyisich及Beal最近表明，序列特異性TFO可與dsRNA結合，抑制dsRNA依賴性酶諸如RNA依賴性激酶之活性(Vuyisich及Beal, Nuc. Acids Res 2000;28:2369-74)。
另外，根據上述原理設計之TFO可誘導能夠實現DNA修復之定向突變誘發，從而提供內源基因表現之下調及上調(Seidman及Glazer, J Clin Invest 2003; 112:487-94)。有效TFO之設計、合成及投與的詳細描述可見於Froehler等人之美國專利申請案第2003 017068號及第2003 0096980號，Emanuele等人之美國專利申請案第2002 0128218號及第2002 0123476號，以及Lawn之美國專利第5,721,138號，其內容以其整體併入本文中。核酸修飾
在一些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含至少一種本文所述之核酸修飾。舉例而言，至少一種修飾選自由經修飾之核苷間鍵、經修飾之核鹼基、經修飾之糖及其任何組合組成之群。在沒有限制之情況下，此類修飾可存在於本發明之雙股iRNA劑中的任何位置。舉例而言，修飾可存在於RNA分子中之一者中。核酸修飾 ( 核鹼基 )
核苷之天然存在之鹼基部分通常為雜環鹼基。此類雜環鹼基之二種最常見的類別為嘌呤及嘧啶。對於包括呋喃戊醣基糖之彼等核苷，磷酸酯基可連接於糖之2'、3'或5'羥基部分。在形成寡核苷酸時，彼等磷酸酯基將相鄰的核苷彼此共價連接以形成線性聚合化合物。在寡核苷酸內，磷酸酯基通常稱為形成寡核苷酸之核苷間主鏈。RNA及DNA之天然存在之鍵或主鏈為3'至5'磷酸二酯鍵。
除「未修飾」或「天然」核鹼基諸如嘌呤核鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，以及嘧啶核鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)之外，熟習此項技術者已知的許多經修飾之核鹼基或核鹼基模擬物適用於本文所述之化合物。未修飾或天然的核鹼基可經修飾或置換以提供具有改良特性之iRNA。舉例而言，可用此等鹼基或用合成及天然核鹼基(例如，肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、水粉蕈素(nubularine)、異鳥苷(isoguanisine)或殺結核菌素(tubercidine))及本文所述之寡聚物修飾中之任一者來製備核酸酶抗性寡核苷酸。或者，可採用任何上述鹼基及「通用鹼基」之經取代或經修飾之類似物。當天然鹼基經非天然及/或通用鹼基置換時，該核苷酸稱為包含本文中之經修飾之核鹼基及/或核鹼基修飾。經修飾之核鹼基及/或核鹼基修飾亦包括天然、非天然及通用鹼基，其包含接合部分，例如本文所述之配體。用於與核鹼基接合之較佳接合部分包括陽離子胺基，其可經由適當烷基、烯基或具有醯胺鍵之連接子與核鹼基接合。
本文所述之寡聚化合物亦可包括核鹼基(此項技術中通常簡稱為「鹼基」)修飾或取代。如本文所用，「未修飾」或「天然」核鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。例示性經修飾之核鹼基包括但不限於其他合成及天然核鹼基，諸如肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、水粉蕈素、異鳥苷、殺結核菌素、2-(鹵基)腺嘌呤、2-(烷基)腺嘌呤、2-(丙基)腺嘌呤、2-(胺基)腺嘌呤、2-(胺基烷基)腺嘌呤、2-(胺基丙基)腺嘌呤、2-(甲硫基)-N6 -(異戊烯基)腺嘌呤、6-(烷基)腺嘌呤、6-(甲基)腺嘌呤、7-(去氮)腺嘌呤、8-(烯基)腺嘌呤、8-(烷基)腺嘌呤、8-(炔基)腺嘌呤、8-(胺基)腺嘌呤、8-(鹵基)腺嘌呤、8-(羥基)腺嘌呤、8-(硫代烷基)腺嘌呤、8-(硫醇)腺嘌呤、N6 -(異戊基)腺嘌呤、N6 -(甲基)腺嘌呤、N6 ,N6 -(二甲基)腺嘌呤、2-(烷基)鳥嘌呤、2-(丙基)鳥嘌呤、6-(烷基)鳥嘌呤、6-(甲基)鳥嘌呤、7-(烷基)鳥嘌呤、7-(甲基)鳥嘌呤、7-(去氮)鳥嘌呤、8-(烷基)鳥嘌呤、8-(烯基)鳥嘌呤、8-(炔基)鳥嘌呤、8-(胺基)鳥嘌呤、8-(鹵基)鳥嘌呤、8-(羥基)鳥嘌呤、8-(硫代烷基)鳥嘌呤、8-(硫醇)鳥嘌呤、N-(甲基)鳥嘌呤、2-(硫基)胞嘧啶、3-(去氮)-5-(氮雜)胞嘧啶、3-(烷基)胞嘧啶、3-(甲基)胞嘧啶、5-(烷基)胞嘧啶、5-(炔基)胞嘧啶、5-(鹵基)胞嘧啶、5-(甲基)胞嘧啶、5-(丙炔基)胞嘧啶、5-(丙炔基)胞嘧啶、5-(三氟甲基)胞嘧啶、6-(偶氮基)胞嘧啶、N4 -(乙醯基)胞嘧啶、3-(3-胺基-3-羧丙基)尿嘧啶、2-(硫基)尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫基)尿嘧啶、5-(甲胺基甲基)-2-(硫基)尿嘧啶、4-(硫基)尿嘧啶、5-(甲基)-4-(硫基)尿嘧啶、5-(甲胺基甲基)-4-(硫基)尿嘧啶、5-(甲基)-2,4-(二硫基)尿嘧啶、5-(甲胺基甲基)-2,4-(二硫基)尿嘧啶、5-(2-胺基丙基)尿嘧啶、5-(烷基)尿嘧啶、5-(炔基)尿嘧啶、5-(烯丙基胺基)尿嘧啶、5-(胺基烯丙基)尿嘧啶、5-(胺基烷基)尿嘧啶、5-(胍烷基)尿嘧啶、5-(1,3-二唑-1-烷基)尿嘧啶、5-(氰基烷基)尿嘧啶、5-(二烷基胺基烷基)尿嘧啶、5-(二甲基胺基烷基)尿嘧啶、5-(鹵基)尿嘧啶、5-(甲氧基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸、5-(甲氧基羰基甲基)-2-(硫基)尿嘧啶、5-(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶、5-(丙炔基)尿嘧啶、5-(丙炔基)尿嘧啶、5-(三氟甲基)尿嘧啶、6-(偶氮基)尿嘧啶、二氫尿嘧啶、N3 -(甲基)尿嘧啶、5-尿嘧啶 (亦即假尿嘧啶)、2-(硫基)假尿嘧啶、4-(硫基)假尿嘧啶、2,4-(二硫基)假尿嘧啶、5-(烷基)假尿嘧啶、5-(甲基)假尿嘧啶、5-(烷基)-2-(硫基)假尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫基)假尿嘧啶、5-(烷基)-4-(硫基)假尿嘧啶、5-(甲基)-4-(硫基)假尿嘧啶、5-(烷基)-2,4-(二硫基)假尿嘧啶、5-(甲基)-2,4-(二硫基)假尿嘧啶、1-取代之假尿嘧啶、1-取代之2(硫基)-假尿嘧啶、1-取代之4-(硫基)假尿嘧啶、1-取代之2,4-(二硫基)假尿嘧啶、1-(胺基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1-(胺基羰基乙烯基)-2(硫基)-假尿嘧啶、1-(胺基羰基乙烯基)-4-(硫基)假尿嘧啶、1-(胺基羰基乙烯基)-2,4-(二硫基)假尿嘧啶、1-(胺基烷胺基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1-(胺基烷胺基-羰基乙烯基)-2(硫基)-假尿嘧啶、1-(胺基烷胺基羰基乙烯基)-4-(硫基)假尿嘧啶、1-(胺基烷胺基羰基乙烯基)-2,4-(二硫基)假尿嘧啶、1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噁嗪-1-基、1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噁嗪-1-基、1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噻嗪-1-基、1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噻嗪-1-基、7-取代之1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噁嗪-1-基、7-取代之1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噁嗪-1-基、7-取代之1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噻嗪-1-基、7-取代之1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噻嗪-1-基、7-(胺基烷基羥基)-1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噁嗪-1-基、7-(胺基烷基羥基)-1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噁嗪-1-基、7-(胺基烷基羥基)-1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噻嗪-1-基、7-(胺基烷基羥基)-1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噻嗪-1-基、7-(胍烷基羥基)-1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噁嗪-1-基、7-(胍烷基羥基)-1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噁嗪-1-基、7-(胍烷基-羥基)-1,3-(二氮雜)-2-(側氧基)-啡噻嗪-1-基、7-(胍烷基羥基)-1-(氮雜)-2-(硫基)-3-(氮雜)-啡噻嗪-1-基、1,3,5-(三氮雜)-2,6-(二氧雜)-萘、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、水粉蕈素、殺結核菌素、異鳥苷、肌苷基、2-氮雜-肌苷基、7-去氮-肌苷基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、胺基吲哚基、吡咯并嘧啶基、3-(甲基)異喹諾酮基、5-(甲基)異喹諾酮基、3-(甲基)-7-(丙炔基)異喹諾酮基、7-(氮雜)吲哚基、6-(甲基)-7-(氮雜)吲哚基、咪唑并吡啶基、9-(甲基)-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、異喹諾酮基、7-(丙炔基)異喹諾酮基、丙炔基-7-(氮雜)吲哚基、2,4,5-(三甲基)苯基、4-(甲基)吲哚基、4,6-(二甲基)吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、芪基、并四苯基、并五苯基、二氟甲苯基、4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑、4-(甲基)苯并咪唑、6-(偶氮基)胸腺嘧啶、2-吡啶酮、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、6-(氮雜)嘧啶、2-(胺基)嘌呤、2,6-(二胺基)嘌呤、5-取代之嘧啶、N2 -取代之嘌呤、N6 -取代之嘌呤、O6 -取代之嘌呤、經取代之1,2,4-三唑、吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、對取代之6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、鄰取代之6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、雙鄰取代之6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、對(胺基烷基羥基)- 6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、鄰(胺基烷基羥基)- 6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、雙鄰(胺基烷基羥基)- 6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、吡啶并嘧啶-3-基、2-側氧基-7-胺基-吡啶并嘧啶-3-基、2-側氧基-吡啶并嘧啶-3-基或其任何O-烷基化或N-烷基化衍生物。或者，可採用任何上述鹼基及「通用鹼基」之經取代或經修飾之類似物。
如本文所用，通用核鹼基為可與所有四種天然存在之核鹼基鹼基配對而基本上不影響解鏈行為、細胞內酶識別或iRNA雙螺旋體之活性的任何核鹼基。一些例示性通用核鹼基包括但不限於2,4-二氟甲苯、硝基吡咯基、硝基吲哚基、8-氮雜-7-去氮腺嘌呤、4-氟-6-甲基苯并咪唑、4-甲基苯并咪唑、3-甲基異喹諾酮基、5-甲基異喹諾酮基、3-甲基-7-丙炔基異喹諾酮基、7-氮雜吲哚基、6-甲基-7-氮雜吲哚基、咪唑并吡啶基、9-甲基-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、異喹諾酮基、7-丙炔基異喹諾酮基、丙炔基-7-氮雜吲哚基、2,4,5-三甲基苯基、4-甲基吲哚基、4,6-二甲基吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、芪基、并四苯基、并五苯基及其結構衍生物(參見例如Loakes, 2001,Nucleic Acids Research , 29, 2437-2447)。
其他核鹼基包括美國專利第3,687,808號中所揭示之核鹼基；2009年3月26日申請之國際申請案第PCT/US09/038425號中所揭示之核鹼基；Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 第858-859頁, Kroschwitz, J. I.編, John Wiley & Sons, 1990中所揭示之核鹼基；English等人, Angewandte Chemie, 國際版, 1991, 30, 613中所揭示之核鹼基；Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijin, P.編 Wiley-VCH, 2008中所揭示之核鹼基；及Sanghvi, Y.S., 第15章, dsRNA Research and Applications, 第289-302頁, Crooke, S.T.及Lebleu, B.編, CRC Press, 1993中所揭示之核鹼基。所有上述內容以引用的方式併入本文中。
在某些實施例中，經修飾之核鹼基為在結構上與親本核鹼基非常相似的核鹼基，諸如7-去氮嘌呤、5-甲基胞嘧啶或G形夾。在某些實施例中，核鹼基模擬物包括更複雜的結構，諸如三環啡噁嗪核鹼基模擬物。製備上述經修飾之核鹼基的方法為熟習此項技術者所熟知。核酸修飾 ( 糖 )
本文所提供之本發明之雙股iRNA劑可包含一或多種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多種)單體，包括具有經修飾之糖部分的核苷或核苷酸。舉例而言，核苷之呋喃糖基糖環可以多種方式修飾，包括但不限於添加取代基、橋連二個非偕位環原子以形成鎖核酸或雙環核酸。在某些實施例中，寡聚化合物包含一或多種(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多種)單體，其為LNA。
在鎖核酸之一些實施例中，呋喃糖基之2'位置藉由獨立地選自以下之連接子連接至4'位置：-[C(R1)(R2)]n -、-[C(R1)(R2)]n -O-、-[C(R1)(R2)]n -N(R1)-、-[C(R1)(R2)]n -N(R1)-O-、-[C(R1R2)]n -O-N(R1)-、-C(R1)=C(R2)-O-、-C(R1)=N-、-C(R1)=N-O-、-C(═NR1)-、-C(═NR1)-O-、-C(═O)-、-C(═O)O-、-C(═S)-、-C(═S)O-、-C(═S)S-、-O-、-Si(R1)2-、-S(═O)x -及-N(R1)-； 其中： x為0、1或2； n為1、2、3或4； 各R1及R2獨立地為H、保護基、羥基、C1-C12烷基、經取代之C1-C12烷基、C2-C12烯基、經取代之C2-C12烯基、C2-C12炔基、經取代之C2-C12炔基、C5-C20芳基、經取代之C5-C20芳基、雜環基、經取代之雜環基、雜芳基、經取代之雜芳基、C5-C7脂環基、經取代之C5-C7脂環基、鹵素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、醯基(C(═O)-H)、經取代之醯基、CN、磺醯基(S(═O)2-J1)或磺基(S(═O)-J1)；及 各J1及J2獨立地為H、C1-C12烷基、經取代之C1-C12烷基、C2-C12烯基、經取代之C2-C12烯基、C2-C12炔基、經取代之C2-C12炔基、C5-C20芳基、經取代之C5-C20芳基、醯基(C(═O)-H)、經取代之醯基、雜環基、經取代之雜環基、C1-C12胺基烷基、經取代之C1-C12胺基烷基或保護基。
在一些實施例中，LNA化合物之各連接子獨立地為-[C(R1)(R2)]n-、-[C(R1)(R2)]n-O-、-C(R1R2)-N(R1)-O-或-C(R1R2)-O-N(R1)-。在另一個實施例中，該等連接子中之每一者獨立地為4'-CH2 -2'、4'-(CH2 )2 -2'、4'-(CH2 )3 -2'、4'-CH2 -O-2'、4'-(CH2 )2 -O-2'、4'-CH2 -O-N(R1)-2'及4'-CH2 -N(R1)-O-2'-，其中各R1獨立地為H、保護基或C1-C12烷基。
某些LNA已製備且揭示於專利文獻以及科學文獻中(Singh等人, Chem. Commun., 1998, 4, 455-456；Koshkin等人,  Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630；Wahlestedt等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638；Kumar等人, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222；WO 94/14226；WO 2005/021570；Singh等人, J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039；揭示LNA之頒佈的美國專利及公開的申請案之實例包括例如美國專利第7,053,207號；第6,268,490號；第6,770,748號；第6,794,499號；第7,034,133號及第6,525,191號；及美國核准前公開案第2004-0171570號；第2004-0219565號；第2004-0014959號；第2003-0207841號；第2004-0143114號及第20030082807號。
本文亦提供LNA，其中核糖基糖環之2'-羥基與糖環之4'碳原子連接，從而形成亞甲基氧基(4'-CH2 -O-2')鍵以形成雙環糖部分(綜述於Elayadi等人, Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561；Braasch等人, Chem. Biol., 2001, 8 1-7；及Orum等人, Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243；亦參見美國專利第6,268,490號及第6,670,461號)。鍵聯可為橋連2'氧原子及4'碳原子之亞甲基(-CH2 -)，其中術語亞甲基氧基(4'-CH2 -O-2') LNA用於雙環部分；在此位置為伸乙基的情況下，使用術語伸乙基氧基(4'-CH2 CH2 -O-2') LNA (Singh等人, Chem. Commun., 1998, 4, 455-456: Morita等人, Bioorganic Medicinal Chemistry, 2003, 11, 2211-2226)。亞甲基氧基(4'-CH2 -O-2') LNA及其他雙環糖類似物顯示具有互補DNA及RNA之極高的雙螺旋體熱穩定性(Tm=+3至+10℃)，朝向3'-核酸外切降解之穩定性及良好的溶解特性。已描述包含BNA之有效且無毒的反義寡核苷酸(Wahlestedt等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638)。
亦已論述之亞甲基氧基(4'-CH2 -O-2') LNA的異構體為α-L-亞甲基氧基(4'-CH2 -O-2') LNA，其已顯示具有針對3'-核酸外切酶之優良穩定性。將α-L-亞甲基氧基(4'-CH2 -O-2') LNA併入反義間隔體及顯示有效反義活性之嵌合體中(Frieden等人, Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372)。
已描述亞甲基氧基(4'-CH2 -O-2') LNA單體腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶之合成及製備，以及其寡聚化及核酸識別特性(Koshkin等人, Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630)。BNA及其製備亦描述於WO 98/39352及WO 99/14226中。
亦已製備亞甲基氧基(4'-CH2 -O-2') LNA之類似物硫代磷酸酯-亞甲基氧基(4'-CH2 -O-2') LNA及2'-硫基-LNA (Kumar等人, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222)。亦已描述包含寡脫氧核苷酸雙螺旋體作為核酸聚合酶受質之鎖核苷類似物的製備(Wengel等人, WO 99/14226)。此外，此項技術中已描述2'-胺基-LNA之合成，其為一種新穎的構形受限的高親和力寡核苷酸類似物(Singh等人, J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039)。另外，已製備2'-胺基-及2'-甲胺基-LNA，且先前已報導其與互補RNA及DNA股之雙螺旋體的熱穩定性。
經修飾之糖部分為吾人所熟知，且可用以改變，通常增加反義化合物對其靶標之親和力及/或增加核酸酶抗性。較佳經修飾之糖的代表性清單包括但不限於經雙環修飾之糖，包括亞甲基氧基(4'-CH2 -O-2') LNA及伸乙基氧基(4'-(CH2 )2 -O-2'橋鍵) ENA；經取代之糖，尤其具有2'-F、2'-OCH3 或2'-O(CH2 )2 -OCH3 取代基的2'-取代之糖；及經4'-硫基修飾之糖。糖亦可經糖模擬基團以及其他置換。用於製備經修飾之糖的方法為熟習此項技術者所熟知。教示此類經修飾之糖的製備的一些代表性專利及公開案包括但不限於美國專利第4,981,957號；第5,118,800號；第5,319,080號；第5,359,044號；第5,393,878號；第5,446,137號；第5,466,786號；第5,514,785號；第5,519,134號；第5,567,811號；第5,576,427號；第5,591,722號；第5,597,909號；第5,610,300號；第5,627,053號；第5,639,873號；第5,646,265號；第5,658,873號；第5,670,633號；第5,792,747號；第5,700,920號；第6,531,584號及第6,600,032號；及WO 2005/121371。
「氧基」-2'羥基修飾之實例包括烷氧基或芳氧基(OR，例如R = H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH2 CH2 O)n CH2 CH2 OR，n =1-50；「鎖」核酸(LNA)，其中核苷之呋喃醣部分包括連接呋喃醣環上之二個碳原子的橋鍵，從而形成雙環系統；O-胺或O-(CH2 )n 胺(n = 1-10，胺= NH2 ；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基、乙二胺或聚胺基)；及O-CH2 CH2 (NCH2 CH2 NMe2 )2 。
「去氧」修飾包括氫(亦即去氧核糖，其與單鏈突出端特別相關)；鹵基(例如氟)；胺基(例如NH2 ；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基或胺基酸)；NH(CH2 CH2 NH)n CH2 CH2 -胺(胺 = NH2 ；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基)；-NHC(O)R (R = 烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；氰基；巰基；烷基-硫基-烷基；硫代烷氧基；硫代烷基；烷基；環烷基；芳基；烯基及炔基，其可任擇地經例如胺基官能基取代。
其他適合之2'-修飾，例如經修飾之MOE，描述於美國專利申請公開案第20130130378號中，其內容以引用的方式併入本文中。
在2'位置處之修飾可存在於阿拉伯糖構型中。術語「阿拉伯糖構型」係指取代基在核糖之C2'上的位置與2'-OH在阿拉伯糖中之構型相同。
糖可在糖中之同一碳處包含二種不同的修飾，例如偕位修飾。糖基亦可含有一或多個碳，其具有與核糖中之相應碳相反的立體化學構型。因此，寡聚化合物可包括一或多種含有例如阿拉伯糖作為糖之單體。單體可在糖之1'位置處具有α鍵，例如α-核苷。單體亦可在4'-位置處具有相反的構型，例如C5'及H4'或置換其之取代基彼此互換。當C5'及H4'或置換其之取代基彼此互換時，糖稱為在4'位置處經修飾。
本文所揭示之本發明之雙股iRNA劑亦可包括無鹼基糖，亦即在C-1'處缺乏核鹼基或在C1'處具有其他化學基團代替核鹼基的糖。參見例如美國專利第5,998,203號，其內容以其整體併入本文中。此等無鹼基糖亦可進一步在組成性糖原子中之一或多者處含有修飾。本發明之雙股iRNA劑亦可含有一或多種呈L異構體之糖，例如L-核苷。對糖基之修飾亦可包括用硫、任擇地經取代之氮或CH2 基團置換4'-O。在一些實施例中，C1'與核鹼基之間的鍵呈α構型。
糖修飾亦可包括非環狀核苷酸，其中核糖碳之間的C-C鍵(例如，C1'-C2'、C2'-C3'、C3'-C4'、C4'-O4'、C1'-O4')不存在及/或核糖碳或氧中之至少一者(例如，C1'、C2'、C3'、C4'或O4')獨立地或組合地不存在於核苷酸。在一些實施例中，非環狀核苷酸為
Figure 02_image083
、
Figure 02_image085
、
Figure 02_image087
、
Figure 02_image089
或
Figure 02_image091
，其中B為經修飾或未修飾之核鹼基，R1 及R2 獨立地為H、鹵素、OR3 或烷基；且R3 為H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)。
在一些實施例中，糖修飾係選自由以下組成之群：2'-H、2'-O -Me (2'-O -甲基)、2'-O -MOE (2'-O -甲氧基乙基)、2'-F、2'-O -[2-(甲胺基)-2-側氧基乙基] (2'-O -NMA)、2'-S -甲基、2'-O-CH2 -(4'-C) (LNA)、2'-O-CH2 CH2 -(4'-C) (ENA)、2'-O-胺基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲胺基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲胺基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)及偕位2'-OMe/2'F，其在阿拉伯糖構型中具有2'-O-Me。
應理解，當特定核苷酸經由其2'-位置與下一個核苷酸連接時，本文所述之糖修飾可置於該特定核苷酸(例如經由其2'-位置連接之核苷酸)之糖的3'-位置。3'位置處之修飾可以木糖構型存在。術語「木糖構型」係指取代基在核糖之C3'上的位置與3'-OH在木糖中之構型相同。
附接至C4'及/或C1'之氫可經直鏈或分支鏈的任擇地經取代之烷基、任擇地經取代之烯基、任擇地經取代之炔基置換，其中烷基、烯基及炔基之主鏈可含有O、S、S(O)、SO2 、N(R')、C(O)、N(R')C(O)O、OC(O)N(R')、CH(Z')、含磷鍵、任擇地經取代之芳基、任擇地經取代之雜芳基、任擇地經取代之雜環或任擇地經取代之環烷基中之一或多者，其中R'為氫、醯基或任擇地經取代之脂族基，Z'係選自由以下組成之群：OR11 、COR11 、CO2 R11 、
Figure 02_image093
、
Figure 02_image095
、
Figure 02_image097
、
Figure 02_image099
、NR21 R31 、CONR21 R31 、CON(H)NR21 R31 、ONR21 R31 、CON(H)N=CR41 R51 、N(R21 )C(=NR31 )NR21 R31 、N(R21 )C(O)NR21 R31 、N(R21 )C(S)NR21 R31 、OC(O)NR21 R31 、SC(O)NR21 R31 、N(R21 )C(S)OR11 、N(R21 )C(O)OR11 、N(R21 )C(O)SR11 、N(R21 )N=CR41 R51 、ON=CR41 R51 、SO2 R11 、SOR11 、SR11 及經取代或未經取代之雜環；R21 及R31 在每次出現時獨立地為氫、醯基、未經取代或經取代之脂族基、芳基、雜芳基、雜環基、OR11 、COR11 、CO2 R11 或NR11 R11 '；或R21 及R31 與其所附接之原子一起形成雜環；R41 及R51 在每次出現時獨立地為氫、醯基、未經取代或經取代之脂族基、芳基、雜芳基、雜環基、OR11 、COR11 或CO2 R11 或NR11 R11 '；且R11 及R11 '獨立地為氫、脂族基、經取代之脂族基、芳基、雜芳基或雜環基。在一些實施例中，附接至5'末端核苷酸之C4'的氫經置換。
在一些實施例中，C4'及C5'一起形成任擇地經取代之雜環基，其較佳包含至少一個-PX(Y)-，其中X為H、OH、OM、SH、任擇地經取代之烷基、任擇地經取代之烷氧基、任擇地經取代之烷硫基、任擇地經取代之烷基胺基或任擇地經取代之二烷基胺基，其中M在每次出現時獨立地為總電荷為+1之鹼金屬或過渡金屬；且Y為O、S或NR'，其中R'為氫、任擇地經取代之脂族基。較佳地，此修飾處於iRNA之5末端。
在某些實施例中，LNA包括具有下式之雙環核苷：
Figure 02_image101
其中： Bx為雜環鹼基部分； T1 為H或羥基保護基； T2 為H、羥基保護基或反應性磷基團； Z為C1 -C6 烷基、C2 -C6 烯基、C2 -C6 炔基、經取代之C1 -C6 烷基、經取代之C2 -C6 烯基、經取代之C2 -C6 炔基、醯基、經取代之醯基或經取代之醯胺。
在一些實施例中，各經取代之基團獨立地經任擇地受保護之取代基單或多取代，該等取代基獨立地選自鹵素、側氧基、羥基、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(═X)J1、OC(═X)NJ1J2、NJ3C(═X)NJ1J2及CN，其中各J1、J2及J3獨立地為H或C1 -C6 烷基，且X為O、S或NJ1。
在某些此類實施例中，各經取代之基團獨立地經取代基單或多取代，該等取代基獨立地選自鹵素、側氧基、羥基、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(═X)J1及NJ3C(═X)NJ1J2，其中各J1、J2及J3獨立地為H、C1 -C6 烷基或經取代之C1 -C6 烷基，且X為O或NJ1。
在某些實施例中，Z基團為經一或多個Xx取代之C1 -C6 烷基，其中各Xx獨立地為OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(═X)J1、OC(═X)NJ1J2、NJ3C(═X)NJ1J2或CN；其中各J1、J2及J3獨立地為H或C1 -C6 烷基，且X為O、S或NJ1。在另一個實施例中，Z基團為經一或多個Xx取代之C1 -C6 烷基，其中各Xx獨立地為鹵基(例如氟)、羥基、烷氧基(例如CH3 O-)、經取代之烷氧基或疊氮基。
在某些實施例中，Z基團為-CH2 Xx，其中Xx為OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(═X)J1、OC(═X)NJ1J2、NJ3C(═X)NJ1J2或CN；其中各J1、J2及J3獨立地為H或C1 -C6 烷基，且X為O、S或NJ1。在另一個實施例中，Z基團為-CH2 Xx，其中Xx為鹵基(例如氟)、羥基、烷氧基(例如CH3 O-)或疊氮基。
在某些此類實施例中，Z基團呈(R)-構型：
Figure 02_image103
。
在某些此類實施例中，Z基團呈(S)-構型：
Figure 02_image105
。
在某些實施例中，各T1 及T2 為羥基保護基。羥基保護基之較佳清單包括苯甲基、苯甲醯基、2,6-二氯苯甲基、第三丁基二甲基矽烷基、第三丁基二苯基矽烷基、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、9-苯基黃嘌呤-9-基(Pixyl)及9-(對甲氧基苯基)黃嘌呤-9-基(MOX)。在某些實施例中，T1 為選自乙醯基、苯甲基、第三丁基二甲基矽烷基、第三丁基二苯基矽烷基及二甲氧基三苯甲基之羥基保護基，其中更佳的羥基保護基為T1 為4,4'-二甲氧基三苯甲基。
在某些實施例中，T2 為反應性磷基團，其中較佳的反應性磷基團包括二異丙基氰基乙氧基胺基磷酸酯及H-膦酸酯。在某些實施例中，T1 為4,4'-二甲氧基三苯甲基且T2 為二異丙基氰基乙氧基胺基磷酸酯。
在某些實施例中，本發明化合物包含至少一種下式之單體：
Figure 02_image107
或下式之單體：
Figure 02_image109
下式之單體：
Figure 02_image111
其中 Bx為雜環鹼基部分； T3 為H、羥基保護基、連接之接合物基團或附接至核苷、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、單體次單元或寡聚化合物之核苷間連接基團； T4 為H、羥基保護基、連接之接合物基團或附接至核苷、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、單體次單元或寡聚化合物之核苷間連接基團； 其中T3 及T4 中之至少一者為附接至核苷、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、單體次單元或寡聚化合物之核苷間連接基團；且 Z為C1 -C6 烷基、C2 -C6 烯基、C2 -C6 炔基、經取代之C1 -C6 烷基、經取代之C2 -C6 烯基、經取代之C2 -C6 炔基、醯基、經取代之醯基或經取代之醯胺。
在一些實施例中，各經取代之基團獨立地經任擇地受保護之取代基單或多取代，該等取代基獨立地選自鹵素、側氧基、羥基、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(═X)J1、OC(═X)NJ1J2、NJ3C(═X)NJ1J2及CN，其中各J1、J2及J3獨立地為H或C1 -C6 烷基，且X為O、S或NJ1。
在一些實施例中，各經取代之基團獨立地經取代基單或多取代，該等取代基獨立地選自鹵素、側氧基、羥基、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(═X)J1及NJ3C(═X)NJ1J2，其中各J1、J2及J3獨立地為H或C1 -C6 烷基，且X為O或NJ1。
在某些此類實施例中，至少一個Z為C1 -C6 烷基或經取代之C1 -C6 烷基。在某些實施例中，各Z獨立地為C1 -C6 烷基或經取代之C1 -C6 烷基。在某些實施例中，至少一個Z為C1 -C6 烷基。在某些實施例中，各Z獨立地為C1 -C6 烷基。在某些實施例中，至少一個Z為甲基。在某些實施例中，各Z為甲基。在某些實施例中，至少一個Z為乙基。在某些實施例中，各Z為乙基。在某些實施例中，至少一個Z為經取代之C1 -C6 烷基。在某些實施例中，各Z獨立地為經取代之C1 -C6 烷基。在某些實施例中，至少一個Z為經取代之甲基。在某些實施例中，各Z為經取代之甲基。在某些實施例中，至少一個Z為經取代之乙基。在某些實施例中，各Z為經取代之乙基。
在某些實施例中，至少一個取代基為C1 -C6 烷氧基(例如，至少一個Z為經一或多個C1 -C6 烷氧基取代之C1 -C6 烷基)。在另一個實施例中，各取代基獨立地為C1 -C6 烷氧基(例如，各Z獨立地為經一或多個C1 -C6 烷氧基取代之C1 -C6 烷基)。
在某些實施例中，至少一個C1 -C6 烷氧基取代基為CH3 O- (例如，至少一個Z為CH3 OCH2 -)。在另一個實施例中，各C1 -C6 烷氧基取代基為CH3 O- (例如，各Z為CH3 OCH2 -)。
在某些實施例中，至少一個取代基為鹵素(例如，至少一個Z為經一或多個鹵素取代之C1 -C6 烷基)。在某些實施例中，各取代基獨立地為鹵素(例如，各Z獨立地為經一或多個鹵素取代之C1 -C6 烷基)。在某些實施例中，至少一個鹵素取代基為氟(例如，至少一個Z為CH2 FCH2 -、CHF2 CH2 -或CF3 CH2 -)。在某些實施例中，各鹵基取代基為氟(例如，各Z獨立地為CH2 FCH2 -、CHF2 CH2 -或CF3 CH2 -)。
在某些實施例中，至少一個取代基為羥基(例如，至少一個Z為經一或多個羥基取代之C1-C6烷基)。在某些實施例中，各取代基獨立地為羥基(例如，各Z獨立地為經一或多個羥基取代之C1 -C6 烷基)。在某些實施例中，至少一個Z為HOCH2 -。在另一個實施例中，各Z為HOCH2 -。
在某些實施例中，至少一個Z為CH3 -、CH3 CH2 -、CH2 OCH3 -、CH2 F-或HOCH2 -。在某些實施例中，各Z獨立地為CH3 -、CH3 CH2 -、CH2 OCH3 -、CH2 F-或HOCH2 -。
在某些實施例中，至少一個Z基團為經一或多個Xx取代之C1 -C6 烷基，其中各Xx獨立地為OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(═X)J1、OC(═X)NJ1J2、NJ3C(═X)NJ1J2或CN；其中各J1、J2及J3獨立地為H或C1 -C6 烷基，且X為O、S或NJ1。在另一個實施例中，至少一個Z基團為經一或多個Xx取代之C1 -C6 烷基，其中各Xx獨立地為鹵基(例如氟)、羥基、烷氧基(例如CH3 O-)或疊氮基。
在某些實施例中，各Z基團獨立地為經一或多個Xx取代之C1 -C6 烷基，其中各Xx獨立地為OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(═X)J1、OC(═X)NJ1J2、NJ3C(═X)NJ1J2或CN；其中各J1、J2及J3獨立地為H或C1 -C6 烷基，且X為O、S或NJ1。在另一個實施例中，各Z基團獨立地為經一或多個Xx取代之C1 -C6 烷基，其中各Xx獨立地為鹵基(例如氟)、羥基、烷氧基(例如CH3 O-)或疊氮基。
在某些實施例中，至少一個Z基團為-CH2 Xx，其中Xx為OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(═X)J1、OC(═X)NJ1J2、NJ3C(═X)NJ1J2或CN；其中各J1、J2及J3獨立地為H或C1 -C6 烷基，且X為O、S或NJ1。在某些實施例中，至少一個Z基團為-CH2 Xx，其中Xx為鹵基(例如氟)、羥基、烷氧基(例如CH3 O-)或疊氮基。
在某些實施例中，各Z基團獨立地為-CH2 Xx，其中各Xx獨立地為OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(═X)J1、OC(═X)NJ1J2、NJ3C(═X)NJ1J2或CN；其中各J1、J2及J3獨立地為H或C1 -C6 烷基，且X為O、S或NJ1。在另一個實施例中，各Z基團獨立地為-CH2 Xx，其中各Xx獨立地為鹵基(例如氟)、羥基、烷氧基(例如CH3 O-)或疊氮基。
在某些實施例中，至少一個Z為CH3 -。在另一個實施例中，各Z為CH3 -。
在某些實施例中，至少一種單體之Z基團呈(R)-構型，其由下式表示：
Figure 02_image113
或下式：
Figure 02_image115
或下式：
Figure 02_image117
。
在某些實施例中，各式單體之Z基團呈(R)-構型。
在某些實施例中，至少一種單體之Z基團呈(S)-構型，其由下式表示：
Figure 02_image119
或下式：
Figure 02_image121
或下式：
Figure 02_image123
在某些實施例中，各式單體之Z基團呈(S)-構型。
在某些實施例中，T3 為H或羥基保護基。在某些實施例中，T4 為H或羥基保護基。在另一個實施例中，T3 為附接至核苷、核苷酸或單體次單元之核苷間連接基團。在某些實施例中，T4 為附接至核苷、核苷酸或單體次單元之核苷間連接基團。在某些實施例中，T3 為附接至寡核苷或寡核苷酸之核苷間連接基團。在某些實施例中，T4 為附接至寡核苷或寡核苷酸之核苷間連接基團。在某些實施例中，T3 為附接至寡聚化合物之核苷間連接基團。在某些實施例中，T4 為附接至寡聚化合物之核苷間連接基團。在某些實施例中，T3 及T4 中之至少一者包含選自磷酸二酯或硫代磷酸酯之核苷間連接基團。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含具有至少二個連續單體之至少一個區域，該等單體具有下式：
Figure 02_image125
或具有下式：
Figure 02_image127
或具有下式：
Figure 02_image129
。
在某些此類實施例中，LNA包括但不限於(A) α-L-亞甲基氧基(4'-CH2 -O-2') LNA，(B) β-D-亞甲基氧基(4'-CH2 -O-2') LNA，(C)伸乙基氧基(4'-(CH2 )2 -O-2') LNA，(D)胺氧基(4'-CH2 -O-N(R)-2') LNA及(E)氧胺基(4'-CH2 -N(R)-O-2') LNA，如下所示：
Figure 02_image131
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含具有至少二個連續的上式單體的至少二個區域。在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含有缺口的基元。在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含至少一個具有約8至約14個連續的β-D-2'-去氧呋喃核糖基核苷的區域。在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含至少一個具有約9至約12個連續的β-D-2'-去氧呋喃核糖基核苷的區域。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含至少一個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個)包含至少一個下式之(S)-cEt單體：
Figure 02_image133
， 其中Bx為雜環鹼基部分。
在某些實施例中，單體包括糖模擬物。在某些此類實施例中，使用模擬物代替糖或糖-核苷間鍵組合，且保持核鹼基以便與選定的靶標雜交。糖模擬物之代表性實例包括但不限於環己烯基或N-嗎啉基。糖-核苷間鍵組合模擬物之代表性實例包括但不限於藉由不帶電荷的非對掌性鍵連接的肽核酸(PNA)及N-嗎啉基。在一些情況下，使用模擬物代替核鹼基。代表性核鹼基模擬物為此項技術中所熟知的，且包括但不限於三環啡噁嗪類似物及通用鹼基(Berger等人, Nuc Acid Res. 2000, 28:2911-14，以引用的方式併入本文中)。糖、核苷及核鹼基模擬物之合成方法為熟習此項技術者所熟知。核酸修飾 ( 糖間鍵 )
本文描述將單體(包括但不限於經修飾及未修飾之核苷及核苷酸)連接在一起的連接基團，從而形成寡聚化合物，例如寡核苷酸。此類連接基團亦稱為糖間鍵。二種主要類別之連接基團係由磷原子的存在或不存在來定義。代表性含磷鍵包括但不限於磷酸二酯(P═O)、磷酸三酯、甲基膦酸酯、胺基磷酸酯及硫代磷酸酯(P═S)。代表性不含磷之連接基團包括但不限於亞甲基甲基亞胺基(-CH2 -N(CH3 )-O-CH2-)、硫代二酯(-O-C(O)-S-)、硫代胺基甲酸酯(-O-C(O)(NH)-S-)；矽氧烷(-O-Si(H)2 -O-)；及N,N'-二甲基肼(-CH2 -N(CH3 )-N(CH3 )-)。與天然磷酸二酯鍵相比，經修飾之鍵可用於改變，通常增加寡核苷酸之核酸酶抗性。在某些實施例中，具有對掌性原子之鍵可製備為外消旋混合物，製備為單獨的對映異構體。代表性對掌性鍵包括但不限於烷基膦酸酯及硫代磷酸酯。含磷及不含磷之鍵的製備方法為熟習此項技術者所熟知。
連接基團中之磷酸酯基可藉由用不同取代基置換一個氧來修飾。此修飾之一種結果可為增加寡核苷酸對溶核分解之抗性。經修飾之磷酸酯基的實例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯、氫膦酸酯、胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯及磷酸三酯。在一些實施例中，鍵聯中之非橋連磷酸氧原子中之一者可經以下中之任一者置換：S、Se、BR3 (R為氫、烷基、芳基)、C (亦即烷基、芳基等……)、H、NR2 (R為氫、任擇地經取代之烷基、芳基)或OR (R為任擇地經取代之烷基或芳基)。未修飾之磷酸酯基中之磷原子為非對掌性的。然而，用上述原子或原子團中之一者置換非橋連氧中之一者使得磷原子呈對掌性；換言之，以此方式修飾之磷酸酯基中的磷原子為立體對稱中心。立體對稱磷原子可具有「R」構型(本文中為Rp)或「S」構型(本文中為Sp)。
二硫代磷酸酯具有經硫置換之二個非橋連氧。二硫代磷酸酯中之磷中心為非對掌性的，其杜絕寡核苷酸非對映異構體之形成。因此，儘管不希望受理論束縛，但對二個非橋連氧之修飾消除對掌性中心，例如二硫代磷酸酯形成，可為合乎需要的，因為其無法產生非對映異構體混合物。因此，非橋連氧可獨立地為O、S、Se、B、C、H、N或OR (R為烷基或芳基)中之任一者。
磷酸酯連接子亦可藉由用氮(橋連胺基磷酸酯)、硫(橋連硫代磷酸酯)及碳(橋連亞甲基膦酸酯)置換橋連氧(亦即連接磷酸酯與單體之糖的氧)來修飾。置換可發生在任一連接氧或二個連接氧處。當橋連氧為核苷之3'-氧時，用碳置換較佳。當橋連氧為核苷之5'-氧時，用氮置換較佳。
經修飾之磷酸酯鍵，其中至少一個與磷酸酯連接之氧已經置換或磷酸酯基已經非磷基團置換，亦稱為「非磷酸二酯糖間鍵」或「非磷酸二酯連接子」。
在某些實施例中，磷酸酯基可經不含磷之連接體置換，例如去磷連接子。去磷連接子在本文中亦稱為非磷酸二酯連接子。儘管不希望受理論束縛，但咸信由於帶電荷之磷酸二酯基為溶核降解之反應中心，因此其用中性結構模擬物置換應賦予增強的核酸酶穩定性。同樣，儘管不希望受理論束縛，但在一些實施例中，可能需要引入其中帶電荷之磷酸酯基經中性部分置換的改變。
可置換磷酸酯基之部分的實例包括但不限於醯胺(例如醯胺-3 (3'-CH2 -C(=O)-N(H)-5')及醯胺-4 (3'-CH2 -N(H)-C(=O)-5'))、羥基胺基、矽氧烷(二烷基矽氧烷)、甲醯胺、碳酸酯、羧甲基、胺基甲酸酯、羧酸酯、硫醚、環氧乙烷連接子、硫化物、磺酸鹽、磺醯胺、磺酸酯、硫代甲縮醛(3'-S-CH2 -O-5')、甲縮醛(3'-O-CH2 -O-5')、肟、亞甲基亞胺基、亞甲基羰胺基、亞甲基甲基亞胺基(MMI，3'-CH2 -N(CH3 )-O-5')、亞甲基肼、亞甲基二甲基肼、亞甲氧基甲基亞胺基、醚(C3'-O-C5')、硫醚(C3'-S-C5')、硫代乙醯胺(C3'-N(H)-C(=O)-CH2 -S-C5'、C3'-O-P(O)-O-SS-C5'、C3'-CH2 -NH-NH-C5'、3'-NHP(O)(OCH3 )-O-5'及3'-NHP(O)(OCH3 )-O-5'及含有混合的N、O、S及CH2 組成部分的非離子鍵。參見例如Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi及P.D. Cook編 ACS Symposium Series 580; 第3章及第4章, (第40-65頁)。較佳實施例包括亞甲基甲基亞胺基(MMI)、亞甲基羰胺基、醯胺、胺基甲酸酯及環氧乙烷連接子。
熟習此項技術者充分意識到，在某些情況下，非橋連氧之置換會引起相鄰2'-OH對糖間鍵之裂解增強，因此在許多情況下，非橋連氧之修飾可能需要修飾2'-OH，例如不參與相鄰糖間鍵之裂解的修飾，例如阿拉伯糖、2'-O-烷基、2'-F、LNA及ENA。
較佳非磷酸二酯糖間鍵包括硫代磷酸酯、具有至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多對映異構體過量之Sp異構體的硫代磷酸酯、具有至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多對映異構體過量之Rp異構體的硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、烷基-膦酸酯(例如甲基-膦酸酯)、硒代磷酸酯、胺基磷酸酯(例如N-烷基胺基磷酸酯)及硼烷膦酸酯。
在一些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含至少一個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個且至多包括所有)經修飾或非磷酸二酯鍵。在一些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含至少一個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個且至多包括所有)硫代磷酸酯鍵。
亦可構築本發明之雙股iRNA劑，其中磷酸酯連接子及糖經核酸酶抗性核苷或核苷酸替代物置換。儘管不希望受理論束縛，但咸信不存在重複帶電之主鏈減少與識別聚陰離子之蛋白質(例如核酸酶)的結合。同樣，儘管不希望受理論束縛，但在一些實施例中，可能需要引入其中鹼基藉由中性替代主鏈繫留之改變。實例包括N-嗎啉基、環丁基、吡咯啶、肽核酸(PNA)、胺基乙基甘胺醯基PNA (aeg PNA)及主鏈延伸之吡咯啶PNA (bep PNA)核苷替代物。較佳替代物為PNA替代物。
本文所述之本發明之雙股iRNA劑可含有一或多個不對稱中心，且因此產生對映異構體、非對映異構體及其他立體異構構型，就絕對立體化學而言，可定義為(R)或(S)，諸如對於糖端基異構體，或定義為(D)或(L)，諸如對於胺基酸等。本文提供之本發明之雙股iRNA劑包括所有此類可能的異構體，以及其外消旋及光學純形式。核酸修飾 ( 末端修飾
在一些實施例中，雙股iRNA劑進一步包含在反義股之5'端的磷酸酯或磷酸酯模擬物。在一個實施例中，磷酸酯模擬物為5'-乙烯基膦酸酯(VP)。
在一些實施例中，雙股iRNA劑之反義股的5'端不含有5'-乙烯基膦酸酯(VP)。
本發明之iRNA劑的末端可經修飾。此類修飾可在一端或二端。舉例而言，iRNA之3'及/或5'端可與其他功能性分子實體接合，諸如標記部分，例如螢光團(例如，芘、TAMRA、螢光素、Cy3或Cy5染料)或保護基(基於例如硫、矽、硼或酯)。功能性分子實體可經由磷酸酯基及/或連接子附接至糖。連接子之末端原子可連接至或置換磷酸酯基或糖之C-3'或C-5' O、N、S或C基團的連接原子。或者，連接子可連接至或置換核苷酸替代物(例如PNA)之末端原子。
當連接子/磷酸酯-功能性分子實體-連接子/磷酸酯陣列插入雙股寡聚化合物之二股之間時，此陣列可取代髮夾型寡聚化合物中之髮夾環。
可用於調節活性之末端修飾包括用磷酸酯或磷酸酯類似物修飾iRNA之5'端。在某些實施例中，iRNA之5'端經磷酸化或包括磷醯基類似物。例示性5'-磷酸酯修飾包括與RISC介導之基因沉默相容的彼等修飾。在5'末端處之修飾亦可用於刺激或抑制個體之免疫系統。在一些實施例中，寡聚化合物之5'端包含修飾
Figure 02_image135
，其中W、X及Y各自獨立地選自由以下組成之群：O、OR (R為氫、烷基、芳基)、S、Se、BR3 (R為氫、烷基、芳基)、BH3 - 、C (亦即烷基、芳基等……)、H、NR2 (R為氫、烷基、芳基)或OR (R為氫、烷基或芳基)；A及Z在每次出現時各自獨立地為不存在的、O、S、CH2 、NR (R為氫、烷基、芳基)或任擇地經取代之伸烷基，其中伸烷基之主鏈可在內部及/或末端包含O、S、SS及NR (R為氫、烷基、芳基)中之一或多者；且n為0-2。在一些實施例中，n為1或2。應理解，A置換與糖之5'碳連接的氧。當n為0時，W及Y與其所附接之P一起可形成任擇地經取代之5-8員雜環，其中W及Y各自獨立地為O、S、NR'或伸烷基。較佳地，雜環經芳基或雜芳基取代。在一些實施例中，5'末端核苷酸之C5'上的一個或二個氫經鹵素置換，例如F。
例示性5'-修飾包括但不限於5'-單磷酸酯((HO)2 (O)P-O-5')；5'-二磷酸酯((HO)2 (O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-三磷酸酯((HO)2 (O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-單硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)2(S)P-O-5')；5'-單二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5')、5'-硫代磷酸酯((HO)2(O)P-S-5')；5'-α-硫代三磷酸酯；5'-β-硫代三磷酸酯；5'-γ-硫代三磷酸酯；5'-胺基磷酸酯((HO)2 (O)P-NH-5'、(HO)(NH2 )(O)P-O-5')。其他5'-修飾包括5'-烷基膦酸酯(R(OH)(O)P-O-5'，R=烷基，例如甲基、乙基、異丙基、丙基等……)、5'-烷基醚膦酸酯(R(OH)(O)P-O-5'，R=烷基醚，例如甲氧基甲基(CH2 OMe)、乙氧基甲基等……)。其他例示性5'-修飾包括其中Z為任擇地經取代之烷基至少一次，例如((HO)2 (X)P-O[-(CH2 )a -O-P(X)(OH)-O]b -5'、((HO)2 (X)P-O[-(CH2 )a -P(X)(OH)-O]b -5'、((HO)2(X)P-[-(CH2 )a -O-P(X)(OH)-O]b - 5'；二烷基末端磷酸酯及磷酸酯模擬物：HO[-(CH2 )a -O-P(X)(OH)-O]b - 5'、H2 N[-(CH2 )a -O-P(X)(OH)-O]b - 5'、H[-(CH2 )a -O-P(X)(OH)-O]b - 5'、Me2 N[-(CH2 )a -O-P(X)(OH)-O]b - 5'、HO[-(CH2 )a -P(X)(OH)-O]b - 5'、H2 N[-(CH2 )a -P(X)(OH)-O]b - 5'、H[-(CH2 )a -P(X)(OH)-O]b - 5'、Me2 N[-(CH2 )a -P(X)(OH)-O]b - 5'，其中a及b各自獨立地為1-10。其他實施例包括用BH3 、BH3 - 及/或Se置換氧及/或硫。
末端修飾亦可用於監測分佈，且在此類情況下，欲添加之較佳基團包括螢光團，例如螢光素或Alexa染料，例如Alexa 488。末端修飾亦可用於增強攝取，對此有用的修飾包括靶向配體。末端修飾亦可用於將寡核苷酸與另一部分交聯；對此有用的修飾包括絲裂黴素C、補骨脂素及其衍生物。熱去穩定化修飾
本發明化合物，諸如iRNA或dsRNA劑，可藉由在義股中在反義股之種子區相對的位點處(亦即，在反義股之5'端的位置2-8處)引入熱去穩定化修飾增加iRNA雙螺旋體解離或解鏈之傾向(降低雙螺旋體締合之自由能)而經最佳化用於RNA干擾。此修飾可增加雙螺旋體在反義股之種子區中解離或解鏈的傾向。
熱去穩定化修飾可包括無鹼基修飾；與相對股中之相對核苷酸錯配；及糖修飾，諸如2'-去氧修飾或非環狀核苷酸，例如解鎖核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)。
例示性無鹼基修飾為：
Figure 02_image057
。
例示性糖修飾為：
Figure 02_image138
術語「非環狀核苷酸」係指具有非環狀核糖之任何核苷酸，例如，其中核糖碳之間的任何鍵(例如，C1'-C2'、C2'-C3'、C3'-C4'、C4'-O4'或C1'-O4')不存在及/或核糖碳或氧中之至少一者(例如，C1'、C2'、C3'、C4'或O4')獨立地或組合地不存在於核苷酸。在一些實施例中，非環狀核苷酸為
Figure 02_image061
、
Figure 02_image063
、
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
或
Figure 02_image069
，其中B為經修飾或未修飾之核鹼基，R1 及R2 獨立地為H、鹵素、OR3 或烷基；且R3 為H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)。術語「UNA」係指解鎖的非環狀核酸，其中糖之任何鍵已移除，形成解鎖的「糖」殘基。在一個實例中，UNA亦涵蓋移除C1'-C4'之間的鍵(亦即C1'與C4'碳之間的共價碳-氧-碳鍵)的單體。在另一個實例中，移除糖之C2'-C3'鍵(亦即C2'與C3'碳之間的共價碳-碳鍵) (參見Mikhailov等人, Tetrahedron Letters, 26 (17): 2059 (1985)；及Fluiter等人, Mol. Biosyst., 10: 1039 (2009)，其特此以全文引用之方式併入)。非環狀衍生物提供更大的主鏈撓曲性而不影響沃森-克里克配對。非環狀核苷酸可經由2'-5'或3'-5'鍵連接。
術語『GNA』係指二醇核酸，其為與DNA或RNA類似，但其「主鏈」組成不同的聚合物，其由藉由磷酸二酯鍵連接之重複甘油單元構成：
Figure 02_image145
。
熱去穩定化修飾可為dsRNA雙螺旋體內之熱去穩定化核苷酸與相對股中之相對核苷酸之間的錯配(亦即，非互補鹼基對)。例示性錯配鹼基配對包括G:G、G:A、G:U、G:T、A:A、A:C、C:C、C:U、C:T、U:U、T:T、U:T或其組合。此項技術中已知的其他錯配鹼基配對亦適用於本發明。錯配可發生在天然存在之核苷酸或經修飾之核苷酸的核苷酸之間，亦即，錯配鹼基配對可發生在相應核苷酸之核鹼基之間，而與核苷酸之核糖上的修飾無關。在某些實施例中，本發明化合物，諸如siRNA或iRNA劑，在錯配配對中含有至少一個核鹼基，亦即2'-去氧核鹼基；例如2'-去氧核鹼基在義股中。
無鹼基核苷酸、非環狀核苷酸修飾(包括UNA及GNA)及錯配修飾之更多實例已詳細描述於WO 2011/133876中，其以全文引用之方式併入本文中。
熱去穩定化修飾亦可包括具有降低或消除與相對鹼基形成氫鍵之能力的通用鹼基，以及磷酸酯修飾。
已針對dsRNA雙螺旋體中心區之去穩定化評估具有受損或完全消除的與相對股中之鹼基形成氫鍵之能力的核鹼基修飾，如WO 2010/0011895中所述，其以全文引用之方式併入本文中。例示性核鹼基修飾為：
Figure 02_image147
。
與天然磷酸二酯鍵相比，已知降低dsRNA雙螺旋體之熱穩定性的例示性磷酸酯修飾為：
Figure 02_image149
。
在一些實施例中，本發明化合物可包含2'-5'鍵(具有2'-H、2'-OH及2'-OMe且具有P=O或P=S)。舉例而言，2'-5'鍵修飾可用於促進核酸酶抗性或抑制義股與反義股之結合，或可在義股之5'端使用以避免RISC之義股活化。
在另一個實施例中，本發明化合物可包含L糖(例如，L核糖、具有2'-H、2'-OH及2'-OMe之L-阿拉伯糖)。舉例而言，此等L糖修飾可用於促進核酸酶抗性或抑制義股與反義股之結合，或可在義股之5'端使用以避免RISC之義股活化。
在一個實施例中，本發明之iRNA劑經由載體與配體接合，其中載體可為環狀基團或非環狀基團；較佳地，環狀基團係選自吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊環、噁唑啶基、異噁唑啶基、嗎啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹喏啉基、噠嗪酮基、四氫呋喃基及十氫萘；較佳地，非環狀基團係選自絲胺醇主鏈或二乙醇胺主鏈。
在一些實施例中，本文揭示之本發明之iRNA劑的至少一股經5'磷酸化或在5'末端包括磷醯基類似物。5'-磷酸酯修飾包括與RISC介導之基因沉默相容的彼等修飾。適合之修飾包括：5'-單磷酸酯((HO)2 (O)P-O-5')；5'-二磷酸酯((HO)2 (O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-三磷酸酯((HO)2 (O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-鳥苷帽(7-甲基化或非甲基化) (7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-腺苷帽(Appp)及任何經修飾或未修飾之核苷酸帽結構(N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-單硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)2 (S)P-O-5')；5'-單二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5')、5'-硫代磷酸酯((HO)2 (O)P-S-5')；任何額外的氧/硫置換之單磷酸酯、二磷酸酯及三磷酸酯的組合(例如5'-α-硫代三磷酸酯、5'-γ-硫代三磷酸酯等)、5'-胺基磷酸酯((HO)2 (O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5')、5'-烷基膦酸酯(R=烷基=甲基、乙基、異丙基、丙基等，例如RP(OH)(O)-O-5'-、5'-烯基膦酸酯(亦即乙烯基、經取代之乙烯基)、(OH)2 (O)P-5'-CH2 -)、5'-烷基醚膦酸酯(R=烷基醚=甲氧基甲基(MeOCH2-)、乙氧基甲基等，例如RP(OH)(O)-O-5'-)。靶基因
在沒有限制的情況下，siRNA之靶基因包括但不限於促進不需要的細胞增殖的基因、生長因子基因、生長因子受體基因、表現激酶之基因、接附蛋白基因、編碼G蛋白超家族分子之基因、編碼轉錄因子之基因、介導血管生成之基因、病毒基因、病毒複製所需之基因、介導病毒功能之細胞基因、細菌病原體之基因、阿米巴病原體之基因、寄生病原體之基因、真菌病原體之基因、介導不需要的免疫反應的基因、介導疼痛處理之基因、介導神經疾病之基因、在以雜合性缺失為特徵之細胞中發現的等位基因或多形性基因之一個等位基因。
siRNA之具體例示性靶基因包括但不限於PCSK-9、ApoC3、AT3、AGT、ALAS1、TMPR、HAO1、AGT、C5、CCR-5、PDGF β基因；Erb-B基因、Src基因；CRK基因；GRB2基因；RAS基因；MEKK基因；JNK基因；RAF基因；Erk1/2基因；PCNA(p21)基因；MYB基因；c-MYC基因；JUN基因；FOS基因；BCL-2基因；細胞週期素D基因；VEGF基因；EGFR基因；細胞週期素A基因；細胞週期素E基因；WNT-1基因；β-連環蛋白基因；c-MET基因；PKC基因；NFKB基因；STAT3基因；存活素基因；Her2/Neu基因；拓樸異構酶I基因；拓樸異構酶II α基因；p73基因；p21(WAF1/CIP1)基因、p27(KIP1)基因；PPM1D基因；小窩蛋白I基因；MIB I基因；MTAI基因；M68基因；腫瘤抑制基因；p53基因；DN-p63基因；pRb腫瘤抑制基因；APC1腫瘤抑制基因；BRCA1腫瘤抑制基因；PTEN腫瘤抑制基因；MLL融合基因，例如MLL-AF9、BCR/ABL融合基因；TEL/AML1融合基因；EWS/FLI1融合基因；TLS/FUS1融合基因；PAX3/FKHR融合基因；AML1/ETO融合基因；αv-整合素基因；Flt-1受體基因；微管蛋白基因；人類乳頭狀瘤病毒基因、人類乳頭狀瘤病毒複製所需之基因、人類免疫缺陷病毒基因、人類免疫缺陷病毒複製所需之基因、A型肝炎病毒基因、A型肝炎病毒複製所需之基因、B型肝炎病毒基因、B型肝炎病毒複製所需之基因、C型肝炎病毒基因、C型肝炎病毒複製所需之基因、D型肝炎病毒基因、D型肝炎病毒複製所需之基因、E型肝炎病毒基因、E型肝炎病毒複製所需之基因、F型肝炎病毒基因、F型肝炎病毒複製所需之基因、G型肝炎病毒基因、G型肝炎病毒複製所需之基因、H型肝炎病毒基因、H型肝炎病毒複製所需之基因、呼吸道合胞病毒基因、呼吸道合胞病毒複製所需之基因、單純疱疹病毒基因、單純疱疹病毒複製所需之基因、疱疹細胞巨大病毒基因、疱疹細胞巨大病毒複製所需之基因、疱疹埃-巴二氏病毒(Epstein Barr Virus)基因、疱疹埃-巴二氏病毒複製所需之基因、卡堡氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)相關疱疹病毒基因、卡堡氏肉瘤相關疱疹病毒複製所需之基因、JC病毒基因、JC病毒複製所需之人類基因、黏液病毒基因、黏液病毒基因複製所需之基因、鼻病毒基因、鼻病毒複製所需之基因、冠狀病毒基因、冠狀病毒複製所需之基因、西尼羅河病毒基因、西尼羅河病毒複製所需之基因、聖路易腦炎(St. Louis Encephalitis)基因、聖路易腦炎複製所需之基因、蜱傳腦炎病毒基因、蜱傳腦炎病毒複製所需之基因、墨萊溪谷腦炎(Murray Valley encephalitis)病毒基因、墨萊溪谷腦炎病毒複製所需之基因、登革熱病毒基因、登革熱病毒基因複製所需之基因、猿猴病毒40基因、猿猴病毒40複製所需之基因、人類嗜T淋巴細胞病毒基因、人類嗜T淋巴細胞病毒複製所需之基因、莫洛尼小鼠白血病病毒基因、莫洛尼小鼠白血病病毒複製所需之基因、腦心肌炎病毒基因、腦心肌炎病毒複製所需之基因、麻疹病毒基因、麻疹病毒複製所需之基因、水痘帶狀疱疹病毒基因、水痘帶狀疱疹病毒複製所需之基因、腺病毒基因、腺病毒複製所需之基因、黃熱病病毒基因、黃熱病病毒複製所需之基因、脊髓灰質炎病毒基因、脊髓灰質炎病毒複製所需之基因、痘病毒基因、痘病毒複製所需之基因、瘧原蟲基因、瘧原蟲基因複製所需之基因、潰瘍分枝桿菌(Mycobacterium ulcerans)基因、潰瘍分枝桿菌複製所需之基因、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)基因、結核分枝桿菌複製所需之基因、麻風分支桿菌(Mycobacterium leprae)基因、麻風分支桿菌複製所需之基因、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)基因、金黃色葡萄球菌複製所需之基因、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)基因、肺炎鏈球菌複製所需之基因、化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)基因、化膿性鏈球菌複製所需之基因、肺炎披衣菌(Chlamydia pneumoniae)基因、肺炎披衣菌複製所需之基因、肺炎黴漿菌(Mycoplasma pneumoniae)基因、肺炎黴漿菌複製所需之基因、整合素基因、選擇素基因、補體系統基因、趨化因子基因、趨化因子受體基因、GCSF基因、Gro1基因、Gro2基因、Gro3基因、PF4基因、MIG基因、前血小板鹼性蛋白基因、MIP-1I基因、MIP-1J基因、RANTES基因、MCP-1基因、MCP-2基因、MCP-3基因、CMBKR1基因、CMBKR2基因、CMBKR3基因、CMBKR5v、AIF-1基因、I-309基因、離子通道組分基因、神經傳遞質受體基因、神經傳遞質配體基因、類澱粉蛋白家族基因、早老素基因、HD基因、DRPLA基因、SCA1基因、SCA2基因、MJD1基因、CACNL1A4基因、SCA7基因、SCA8基因、雜合性缺失(LOH)細胞中發現的等位基因、多形性基因之一個等位基因及其組合。
雜合性缺失(LOH)可導致LOH區域中序列(例如基因)之半合子性。此可導致正常細胞與病態細胞(例如癌細胞)之間的顯著基因差異，且提供正常細胞與病態細胞(例如癌細胞)之間的有用差異。此差異可能係因為基因或其他序列在二倍體細胞中為異型接合的(heterozygous)，但在具有LOH之細胞中為半合子的而產生。LOH區通常包括基因，其缺失引起不需要的增殖，例如腫瘤抑制基因；及其他序列，包括例如其他基因，在一些情況下為正常功能(例如生長)所必需的基因。本發明之方法部分依賴於用本發明之組合物對必需基因之一個等位基因的特異性調節。
在某些實施例中，本發明提供調節微小RNA之本發明之雙股iRNA劑。靶向CNS
在一些實施例中，本發明提供雙股iRNA劑，其靶向早發性家族性阿茲海默病(Early Onset Familial Alzheimer Disease)之APP、脊髓小腦失調2及ALS之ATXN2以及肌肉萎縮性側索硬化及額顳葉型癡呆之C9orf72。
在一些實施例中，本發明提供雙股iRNA劑，其靶向ALS之TARDBP、額顳葉型癡呆之MAPT (Tau)及亨廷頓病之HTT。
在一些實施例中，本發明提供雙股iRNA劑，其靶向帕金森病之SNCA、ALS之FUS、脊髓小腦失調3之ATXN3、SCA1之ATXN1、SCA7及SCA8之基因、DRPLA之ATN1、XLMR之MeCP2、朊病毒疾病隱性CNS病症：拉福拉病之PRNP、DM1 (CNS及骨骼肌)之DMPK及hATTR (CNS、眼及全身)之TTR。
脊髓小腦失調為一種遺傳性腦功能障礙。顯性遺傳形式之脊髓小腦失調，諸如SCA1-8，為破壞性病症，沒有疾病改善療法。例示性靶標包括SCA2、SCA3及SCA1。靶向SCA2 之ATXN2
脊髓小腦失調2 (SCA2)，一種進行性失調，為第二常見的SCA。與此靶標相關之另一種疾病為肌肉萎縮性側索硬化(ALS)。此等疾病為使人衰弱且最終致死的疾病，沒有疾病改善療法。SCA之盛行率為每100,000人中有2-6人；ATXN2造成全球15%之SCA人口且在一些國家中SCA人口多得多，尤其在古巴(每100,000人中有40人)。經由人類分子遺傳學靶向ATXN2可為優異的，例如，在家族性及偶發性SCA及ALS中，在諸如脊髓、腦幹或小腦之組織中發現ATXN2中之編碼CAG重複擴增。此靶向之機制可能係因為ATXN2之常染色體顯性編碼CAG擴增導致有毒、錯誤摺疊的蛋白質之表現以及浦金埃氏細胞(Purkinje cell)及神經元死亡。已藉由ATXN2 mRNA之70%阻斷基因表現(KD)顯示功效；且已證實mATXN2小鼠KD POC。關於安全性，已報告mATXN2基因剔除(KO)小鼠為健康的。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF CAG mRNA及肽重複蛋白靶向SCA3 之ATXN3
脊髓小腦失調3 (SCA3)，一種進行性失調，為全球最常見的SCA。此疾病為使人衰弱且最終致死的疾病，沒有疾病改善療法。其為SCA之最常見病因，且SCA之盛行率為每100,000人中有2-6人；ATXN3在美國造成21%之SCA人口且在歐洲多得多，尤其在葡萄牙。經由人類分子遺傳學靶向ATXN3可為優異的，例如，在家族性及偶發性SCA中，在諸如脊髓、腦幹或小腦之組織中發現ATXN3中之編碼CAG重複擴增。此靶向之機制可能係因為ATXN3之常染色體顯性編碼CAG擴增導致有毒、錯誤摺疊的蛋白質之表現、浦金埃氏細胞及神經元死亡。已藉由ATXN3 mRNA之70% KD顯示功效；且已證實mATXN3 KD小鼠POC。關於安全性，已報告mATXN3 KO小鼠為健康的。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF CAG mRNA及肽重複蛋白。靶向SCA1 之ATXN1
脊髓小腦失調1 (SCA1)，一種進行性失調，為1993年發現的第一個SCA基因。此疾病為使人衰弱且最終致死的疾病，沒有疾病改善療法。SCA之盛行率為每100,000人中有2-6人；ATXN1在美國及全球造成6%之SCA人口，且在一些國家(在日本為25%)多得多，尤其在波蘭(64%)及西伯利亞(100%)。經由人類分子遺傳學靶向ATXN1可為優異的，例如，在家族性及偶發性SCA中，在諸如脊髓、腦幹或小腦之組織中發現ATXN1中之編碼CAG重複擴增。此靶向之機制可能係因為ATXN1之常染色體顯性編碼CAG擴增導致有毒、錯誤摺疊的蛋白質之表現、浦金埃氏細胞及神經元死亡。已藉由ATXN1 mRNA之70% KD顯示功效；且已證實mATXN1小鼠POC。關於安全性，已報告mATXN1 KO小鼠為健康的。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF CAG mRNA及肽重複蛋白。靶向SCA7 之ATXN7
脊髓小腦失調7 (SCA7)造成進行性失調及視網膜變性。此疾病為使人衰弱且最終致死的視網膜及小腦病症，沒有疾病改善療法。SCA之盛行率為每100,000人中有2-6人；ATXN7造成全球5%之SCA人口，且在一些國家多得多，尤其在南非。經由人類分子遺傳學靶向ATXN7可為優異的，例如，在家族性及偶發性SCA中，在諸如脊髓、腦幹、小腦或視網膜之組織中發現ATXN7中之編碼CAG重複擴增。此靶向之機制可能係因為ATXN1之常染色體顯性編碼CAG擴增導致有毒、錯誤摺疊的蛋白質之表現，從而引發視錐及視桿變性、浦金埃氏細胞及神經元致死性。經由鞘內(IT)及玻璃體內(IVT)投與，已藉由ATXN1 mRNA之70% KD顯示功效。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF CAG mRNA及肽重複蛋白。靶向SCA8 之ATXN8
脊髓小腦失調8 (SCA8)，一種進行性神經退化性失調，係由ATXN8中之CTG重複擴增引起。此疾病為使人衰弱且最終致死的疾病，沒有疾病改善療法。盛行率：SCA為每100,000人中有2-6人；ATXN8造成全球3%之SCA人口，且在一些國家多得多，尤其在芬蘭。經由人類分子遺傳學靶向ATXN8可為優異的，例如，在家族性及偶發性SCA中，在諸如脊髓、腦幹或小腦之組織中發現ATXN8中之編碼CTG重複擴增。此靶向之機制可能係因為ATXN8之常染色體顯性編碼CTG擴增導致有毒、錯誤摺疊的蛋白質之表現，從而引發浦金埃氏細胞及神經元致死性。已藉由ATXN8 mRNA之70% KD顯示功效。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF CTG mRNA及肽重複蛋白。靶向SCA6 之CACNA1A
脊髓小腦失調6 (SCA6)為進行性失調。此疾病為使人衰弱且最終致死的疾病，沒有疾病改善療法。SCA之盛行率為每100,000人中有2-6人；且CACNA1A造成全球15%之SCA人口。經由人類分子遺傳學靶向CACNA1A可為優異的，例如，在家族性及偶發性SCA中，在諸如脊髓、腦幹或小腦之組織中發現CACNA1A中之編碼CAG重複擴增。此靶向之機制可能係因為CACNA1A之常染色體顯性編碼CAG擴增導致有毒、錯誤摺疊的蛋白質之表現以及浦金埃氏細胞及神經元死亡。已藉由CACNA1A CAG擴增之70% KD顯示功效。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF CAG mRNA及肽重複蛋白。
遺傳性聚麩醯胺酸病症之例示性靶標包括亨廷頓病(HD)。靶向亨廷頓病之HTT
亨廷頓突變導致HD，一種進行性CNS退化疾病。此疾病為使人衰弱且最終致死的疾病，沒有疾病改善療法。全球HD之盛行率為每100,000人中有5-10人，且在某些國家更加常見，尤其在委內瑞拉。經由人類分子遺傳學靶向HTT可為優異的，例如，在家族性及偶發性HD中，在諸如紋狀體或皮質之組織中發現的HTT中之編碼CAG重複擴增。此靶向之機制可能係因為HTT之常染色體顯性編碼CAG擴增導致有毒、錯誤摺疊的蛋白質之表現及神經元死亡。已藉由僅HTT CAG擴增之70% KD顯示功效；且已證實小鼠POC。關於安全性，小鼠HTT之KO可為致死性的；已證實人類之KD。可能的診斷包括家族病史；基因測試；早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF mRNA及肽重複蛋白。靶向DRPLA 之ATN1
Atrophin 1突變導致齒狀核紅核蒼白球路易氏體萎縮症(DRPLA)，其為與HD類似之進行性脊髓小腦病症。此疾病為使人衰弱且最終致死的疾病，沒有疾病改善療法。在日本，DRPLA之盛行率為每1,000,000人中有2-7人。經由人類分子遺傳學靶向ATN1可為優異的，例如，在家族性及偶發性SCA中，在諸如脊髓、腦幹、小腦或皮質之組織中發現ATN1中之編碼CAG重複擴增。此靶向之機制可能係因為ATN1之常染色體顯性編碼CAG擴增導致有毒、錯誤摺疊的蛋白質之表現及神經元死亡。已藉由ATN1之70% KD顯示功效。關於安全性，已報告ATN1 KO小鼠為健康的。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF CAG mRNA及肽重複蛋白。靶向脊髓延髓肌肉萎縮之 AR
雄激素受體突變導致脊髓延髓肌肉萎縮(SBMA，甘乃迪病(Kennedy disease))，一種進行性肌肉萎縮疾病，及其他疾病。此疾病為使人衰弱且最終致死的疾病，沒有疾病改善療法。SBMA之盛行率為每100,000個男性中有2例；女性有輕微表型。經由人類分子遺傳學靶向AR可為優異的，例如，在家族性SBMA中，在諸如脊髓或腦幹之組織中發現的AR中之編碼CAG重複擴增。此靶向之機制可能係因為AR之X性聯編碼CAG擴增導致毒性功能獲得性及運動神經元致死性。已藉由AR之70% KD顯示功效。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF CAG mRNA及肽重複蛋白。靶向 弗里德里希 失調 ( Friedrich Ataxia ) 之 FXN
FXN之隱性功能喪失GAA擴增導致弗里德里希失調(FA)，一種進行性退化性失調。此疾病為使人衰弱且最終致死的疾病，沒有疾病改善療法。FA之盛行率為全球每100,000人中有2人。經由人類分子遺傳學靶向FXN可為優異的，例如，在家族性FA中，在諸如脊髓、小腦或可能視網膜及心臟之組織中發現FXN中之內含子GAA重複擴增。此靶向之機制可能係因為FXN之常染色體隱性非編碼FAA擴增導致FXN (一種重要的粒線體蛋白)之死亡表現。已藉由FXN內含子GAS擴增之70% KD顯示功效。關於安全性，內含子GAA之KD在小鼠中為安全且有效的。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF mRNA及肽重複蛋白。靶向FXTAS 之FMR1
X脆折相關性震顫/失調症候群(FXTAS)，一種成人進行性失調及認知喪失病症，由FMR1過度表現引起。此疾病為使人衰弱的疾病，沒有疾病改善療法。FMR1預突變之盛行率為500個男性中有1個。經由人類分子遺傳學靶向FMR1可為優異的，例如在FXTAS中，在諸如脊髓、小腦或皮質之組織中發現FMR1中之編碼CCG重複擴增預突變。此靶向之機制可能係因為FMR1之X性聯編碼CCG擴增導致毒性mRNA。已藉由毒性mRNA之70% KD顯示功效。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF mRNA及肽重複蛋白。靶向X 脆折症候群之FMR1 的上游
X脆折症候群(FRAXA)，一種進行性智力遲鈍病症，可藉由靶向FMR1之上游mRNA來治療。此疾病為使人衰弱的疾病，沒有疾病改善療法。FRAXA之盛行率為每4,000個男性中有1個及每8,000個女性中有1個。經由人類分子遺傳學靶向FMR1可為優異的，例如，在FRAXA中，在諸如CNS之組織中發現FMR1中之編碼CCG重複擴增。此靶向之機制可能係因為FMR1之X性聯編碼CCG擴增導致LOF；且正常FMR1用於自細胞核轉運特異性mRNA。已藉由毒性mRNA之70% KD顯示功效。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF mRNA及肽重複蛋白。
顯性遺傳性肌肉萎縮性側索硬化為破壞性病症，沒有疾病改善療法。例示性靶標包括C9orf72、ATXN2 (亦造成SCA2)及MAPT。靶向ALS 之C9orf72
C9orf72為肌肉萎縮性側索硬化(ALS)及額顳葉型癡呆(FTD)之最常見病因。此等疾病為運動神經元之致死性病症，沒有疾病改善療法。ALS之盛行率為每100,000人中有2-5人(10%為家族性)；C9orf72造成美國及歐洲39%之家族性ALS及7%之偶發性ALS。經由人類分子遺傳學靶向C9orf72可為優異的，例如，在家族性及偶發性ALS中，在諸如上部及下部運動神經元(對於ALS)；或皮質(對於FTD)之組織中發現六核苷酸擴增。此靶向之機制可能係因為常染色體顯性六核苷酸擴增導致毒性二肽重複蛋白之重複相關的非AUG依賴性轉譯及神經元致死性。已藉由C9orf72之70% KD顯示功效。關於安全性，C9orf72之異型接合LOF突變似乎在人類及小鼠中為安全的。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF六核苷酸重複mRNA及二肽重複蛋白。靶向ALS 之TARDBP
TARDBP突變導致ALS及額顳葉型癡呆(FTD)。此等疾病為運動神經元之致死性病症，沒有疾病改善療法。ALS之盛行率為每100,000人中有2-5人(10%為家族性)；TARDBP造成5%之家族性ALS及1.5%之偶發性ALS。經由人類分子遺傳學靶向TARDBP可為優異的，例如，在家族性及偶發性ALS中，在諸如上部及下部運動神經元(對於ALS)；或皮質(對於FTD)之組織中發現突變。此靶向之機制可能係因為常染色體顯性TRDBP突變導致毒性TRDBP蛋白及神經元致死性。已藉由TARDBP突變等位基因之70% KD顯示功效。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF蛋白。靶向ALS 之FUS
FUS突變導致ALS及FTD。此等疾病為運動神經元之致死性病症，沒有疾病改善療法。ALS之盛行率為每100,000人中有2-5人(10%為家族性)；FUS造成5%之家族性ALS；FUS包含物常見於偶發性ALS。經由人類分子遺傳學靶向FUS可為優異的，例如，在家族性ALS中，在諸如對於ALS之上部及下部運動神經元之組織中發現突變。此靶向之機制可能係因為常染色體顯性FUS突變導致異常蛋白質摺疊及神經元致死性。已藉由FUS突變等位基因之70% KD顯示功效。關於安全性，KO小鼠掙扎但存活且具有ADHD表型。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF蛋白。靶向ALS 之SOD1
SOD1之顯性及隱性突變導致ALS。此疾病為運動神經元之致死性病症，沒有疾病改善療法。ALS之盛行率為每100,000人中有2-5人(10%為家族性)；SOD1造成5-20%之家族性ALS。經由人類分子遺傳學靶向SOD1可為優異的，例如，在諸如對於ALS之上部及下部運動神經元之組織中，許多SOD1突變與家族中之AD及AR ALS相關。此靶向之功效可能需要突變特異性KD。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。生物標誌物可為突變特異性的。
顯性遺傳性額顳葉型癡呆及進行性核上麻痹。靶標包括MAPT，因為其對於AD可為重要的，或C9orf72。靶向 FTD - 17 及 PSP 之微管相關蛋白 Tau
家族性額顳葉型癡呆17 (FTD-17)，一種排列於染色體17之家族性FTD形式，及家族性進行性核上麻痹可能由MAPT突變引起，其亦可引起罕見形式之進行性核上麻痹、皮質基底核退化症、伴有呼吸衰竭之Tau蛋白病、伴有癲癇之癡呆。此等疾病為致死性神經退化性病症，沒有疾病改善療法。FTD之盛行率為每100,000人中有15-22人；荷蘭的FTD-17盛行率為1,000,000人口中有1人。經由人類分子遺傳學靶向MAPT可為優異的，例如，在家族性及偶發性FTD中，在諸如額葉或顳葉皮質之組織中發現MAPT之GOF點突變及剪接位點突變。此靶向之機制可能係因為MAPT之常染色體顯性GOF突變導致毒性Tau肽及神經元死亡。已藉由MAPT之70% KD顯示功效。關於安全性，已報告MAPT KO小鼠為健康的。可能的診斷包括家族病史；基因測試；早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF Tau mRNA及蛋白質。靶向FTD 及ALS 之Sequestosome 1
偶發性FTD/ALS與顯性SQSTM1突變相關。此疾病為致死性神經退化性病症，沒有疾病改善療法。此為一種非常罕見的疾病。在散發病例中，在諸如額葉及顳葉皮質、或小腦及脊髓之組織中，經由人類分子基因關聯靶向Sequestosome 1為合理的。可能的診斷包括基因測試；早期症狀。
顯性遺傳性帕金森病為破壞性病症，沒有疾病改善療法。靶標包括SNCA。靶向帕金森病之SNCA
α突觸核蛋白突變導致家族性帕金森病(PD)及路易體性癡呆(Lewy body dementia)。此等疾病為致死性神經退化性病症，沒有疾病改善療法。PD之盛行率為全球4百萬；1/3之PD為家族性的；1%之fPD由SNCA引起。經由人類分子遺傳學靶向SNCA可為優異的，例如，在諸如延髓；或中腦之黑質的組織中，SNCA點突變及重複引起家族性PD。此靶向之機制可能係因為異常SNCA蛋白之過度表現或表現導致毒性肽及神經元死亡。已藉由SNCA之70% KD顯示功效。關於安全性，SNCA KO小鼠為健康的。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF SNCA mRNA及蛋白質。靶向帕金森病之LRRK2
富含白胺酸之重複激酶2突變導致家族性帕金森病。此疾病為致死性神經退化性病症，沒有疾病改善療法。PD之盛行率為全球4百萬；1/3之PD為家族性的；3-7%之fPD由LRRK2引起。經由人類分子遺傳學靶向LRRK2可為優異的，例如，在諸如延髓；或中腦之黑質的組織中，LRRK2點突變引起家族性PD。可能的診斷包括家族病史；基因測試；早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF mRNA及蛋白質。靶向脊髓性肌萎縮 V 之 GARS
常染色體顯性甘胺醯基-tRNA合成酶突變導致脊髓性肌萎縮V (SMAV)或遠端遺傳性運動神經病Va。此等疾病為神經退化性病症，沒有疾病改善療法。此等為非常罕見的疾病。經由人類分子遺傳學靶向GAR可為良好的，例如，在諸如脊髓之組織中，GARS點突變引起家族性SMA。可能的診斷包括家族病史；基因測試；早期症狀。靶向脊髓性肌萎縮之 Seipin
常染色體顯性Seipin突變導致脊髓性肌萎縮(SMA)或遠端遺傳性運動神經病。此等疾病為神經退化性病症，沒有疾病改善療法。此等為非常罕見的疾病。經由人類分子遺傳學靶向Seipin可為良好的，例如，在諸如脊髓之組織中，Seipin點突變引起家族性SMA。此靶向之機制可能為GOF及毒性肽。已藉由50% KD顯示功效。關於安全性，隱性LOF突變導致伴有或不伴有脂質營養不良之進行性腦病。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。
顯性遺傳性阿茲海默病為破壞性病症，沒有疾病改善療法。由於在家族性疾病中之中心機製作用及在常見AD中之可能作用，靶標包括APP。靶向阿茲海默病之APP
類澱粉前驅蛋白質突變導致早發性家族性阿茲海默病(EOFAD)；唐氏症候群(down syndrome)中之AD；或AD。此等疾病為致死性神經退化性病症，沒有疾病改善療法。EOFAD-APP之盛行率為1% AD；第21對染色體三體症之盛行率為1% AD；且在美國，AD之盛行率為約2.5 -5百萬。經由人類分子遺傳學靶向APP可為優異的，例如，在諸如大腦皮質或海馬體之組織中，APP重複及點突變導致EOFAD。此靶向之機制可能係因為APP過度表現或毒性代謝物之表現引起進行性神經元死亡。已藉由APP之70% KD顯示功效。關於安全性，已報告KD小鼠為健康的，有一些行為異常；已報告KD小鼠為健康的，有一些空間記憶影響。可能的診斷包括家族病史；基因測試；早期症狀；或MRI。可使用之生物標誌物包括例如CSF APP mRNA及肽。靶向阿茲海默病之PSEN1
早老素1突變導致早發性家族性阿茲海默病(EOFAD)；或AD。此等疾病為致死性神經退化性病症，沒有疾病改善療法。經由人類分子遺傳學靶向PSEN1可為優異的，例如，在諸如大腦皮質或海馬體之組織中，PSEN1點突變導致EOFAD。此靶向之機制可能係因為PSEN1之常染色體顯性突變引起異常APP代謝且毒性肽引起進行性神經元死亡。已藉由APP KD可免除對PSEN1特異性療法之需求來顯示功效。可能的診斷包括家族病史；基因測試；早期症狀；或MRI。可使用之生物標誌物包括例如CSF PSEN1及APP肽。靶向阿茲海默病之PSEN2
早老素2突變導致早發性家族性阿茲海默病(EOFAD)；或AD。此等疾病為致死性神經退化性病症，沒有疾病改善療法。經由人類分子遺傳學靶向PSEN2可為優異的，例如，在諸如大腦皮質或海馬體之組織中，PSEN2點突變導致EOFAD。此靶向之機制可能係因為PSEN2之常染色體顯性突變引起異常APP代謝且毒性肽引起進行性神經元死亡。可能的診斷包括家族病史；基因測試；早期症狀；或MRI。可使用之生物標誌物包括例如CSF PSEN2及APP肽。靶向阿茲海默病之Apo E
載脂蛋白E4與老年人偶發性AD相關聯。此疾病為致死性神經退化性病症，沒有疾病改善療法。在美國，AD之盛行率為2.5-5百萬。靶向Apo E可為有效的，因為支持ApoE4與AD之間關聯的基因組證據在許多群體中為優異的。靶組織可為大腦皮質。儘管在許多群體中存在強烈關聯，但尚不清楚Apo E4是否促成AD之發病機制。迄今為止，資料表明Apo E4純合子指示老年人AD風險增加，但即使在老年人中仍不足以引起AD。關於安全性，CNS中Apo E之KD可為安全的，因為Apo E中之人類LOF突變與明顯的神經缺陷無關，儘管全身暴露可能引起III型高脂蛋白血症。可能的診斷包括AD之臨床診斷；排除EOFAD突變；脫輔基E4基因型之基因測試。可使用之生物標誌物包括例如CSF APP、Tau mRNA及肽。
CNS基因重複病症。一致的KD減半可改善此等病症。靶標包括MeCP2。靶向 X 性聯智力遲鈍之 MeCP2
甲基CpG結合蛋白2基因重複導致X性聯智力遲鈍(XLMR)。此疾病為致死性認知障礙，沒有疾病改善療法。1-15%之X性聯MR由MeCP2重複引起；2-3%之人口患有MR。經由人類分子遺傳學靶向MeCP2可為優異的，例如，在諸如大腦皮質之組織中，MeCP2重複導致XLMR。此靶向之機制可能係因為MeCP2過度表現導致其他基因之調節異常及神經退化。已藉由MeCP2之50% KD顯示功效；且小鼠模型中之ASO KD逆轉表型。關於安全性，MeCP2 LOF突變可能引起雷特氏症候群(Rett syndrome)。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF MeCP2 mRNA及肽。
顯性遺傳性腦類澱粉蛋白血管病為破壞性病症，沒有疾病改善療法。靶標包括TTR。靶向hATTR CAA 之TTR
此靶向可為CNS siRNA之低風險引入。腦類澱粉蛋白血管病(CAA)及腦膜類澱粉蛋白為致死性病症，沒有疾病改善療法。經由人類遺傳學及藥理學靶向TTR可為優異的。靶組織可為CNS血管系統或CNS。此靶向之機制可能係因為突變蛋白在血管外膜中積聚，引起CNS出血。已藉由TTR之70% KD顯示功效。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF mRNA及蛋白質。靶向CAA 之ITM2B
整合膜蛋白2B突變導致腦類澱粉蛋白血管病(CAA)、英國型或家族性英國癡呆(FBD)。特異性突變亦可導致顯性視網膜變性。此疾病為致死性病症，沒有疾病改善療法。此為一種罕見的疾病。經由人類分子遺傳學靶向ITM2B可為優異的。靶組織可為CNS血管系統或CNS。此靶向之機制可能涉及GOF突變。已藉由ITM2B突變等位基因之70% KD顯示功效。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF mRNA及可能的蛋白質。靶向CAA 之CST3
胱抑素C突變導致冰島型家族性腦類澱粉蛋白血管病。此疾病為致死性病症，沒有疾病改善療法。除冰島及丹麥外，此為一種罕見的疾病。經由人類遺傳學靶向CST3可為優異的。靶組織可為CNS血管系統。此靶向之機制可能係因為突變蛋白在血管外膜中積聚，引起CNS出血。已藉由突變等位基因之可能70% KD顯示功效。關於安全性，CST3 KO小鼠可能有患關節炎之風險。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF mRNA及可能的蛋白質。靶向痙攣性截癱之 SPAST
SPASTIN突變導致伴有認知喪失之痙攣性截癱(SP) 4。此疾病為下部運動神經退化性病症，沒有疾病改善療法。SP之盛行率為每100,000人口中有5人；SP4為45%之顯性SP。經由人類分子遺傳學靶向SPAST可為優異的，例如，在諸如脊髓；或CNS之組織中，SPAST三核苷酸突變導致家族性SP。此靶向之機制可能係因為無義及可能的顯性負突變引起異常微管代謝及神經退化。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF SPAST mRNA及可能的蛋白質。靶向痙攣性截癱之 KIF5A
驅動蛋白家族成員5A突變導致伴有周邊神經病變及其他病症之痙攣性截癱(SP) 10。此疾病為下部運動神經退化性病症，沒有疾病改善療法。SP之盛行率為每100,000人中有5人；SP10為每1,000,000人中有1人。經由人類分子遺傳學靶向KIF5A可為優異的，例如，KIF5A胺基端錯義突變導致SP10；KIF5A在CNS中表現且編碼微管運動蛋白。靶組織可為脊髓。此靶向之機制可能係因為常染色體顯性錯義突變導致可能影響與運動神經結合的微管的SP10。功效可藉由突變等位基因之可能KD提供。關於安全性，KIF5A框移突變導致新生兒難治性肌陣攣，且剪接位點突變可能經由LOF機制與家族性ALS相關聯。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF mRNA及可能的蛋白質。靶向痙攣性截癱之 ATL1
Atlastin突變導致痙攣性截癱3A及感覺神經病1D、遺傳性感覺神經病(HSN)。此疾病為下部運動神經退化性病症，沒有疾病改善療法。SP之盛行率為每100,000人中有5人；SP3A為一種罕見的顯性形式。經由人類分子遺傳學靶向ATL1可為優異的，例如，ATL1點突變導致家族性SP。靶組織可為脊髓。此靶向之機制可能係因為顯性負ATL1蛋白之常染色體顯性表現導致SP3A；然而，LOF突變導致感覺神經病1D。已藉由特異性ATL1等位基因之70% KD顯示功效。關於安全性，ATL1異型接合LOF突變導致HSN1D。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF ATL1 mRNA及蛋白質。靶向痙攣性截癱之 NIPA1
LOF NIPA1突變導致伴有癲癇症及癲癇發作之痙攣性截癱6。此疾病為下部運動神經退化性病症，沒有疾病改善療法。SP之盛行率為每100,000人中有5人；SP6為一種罕見的顯性形式。經由人類分子遺傳學靶向NIPA1可為優異的，例如，NIPA1點突變導致家族性SP。靶組織可為脊髓；或CNS。此靶向之機制可能係因為缺陷膜蛋白之常染色體顯性表現導致SP3A；且可能為LOF。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF mRNA及可能的蛋白質。
顯性遺傳性肌緊張性營養障礙為需要CNS及全身性療法之CNS、骨骼肌及心肌病症。靶標包括DM1之MPK。靶向肌緊張性營養障礙 1 之 DMPK
靶向肌緊張性營養障礙蛋白激酶之有效療法需要CNS及全身性療法。肌緊張性營養障礙1 (DM1)為肌肉及CNS之退化性病症。其為致死性病症，沒有疾病改善療法。DM1之盛行率為全球每8,000人中有1人。經由人類分子遺傳學靶向DMPK可為優異的，例如，DMPK CTG重複擴增導致家族性DM1。靶組織可為骨骼肌、心肌或CNS。此靶向之機制可能係因為常染色體顯性非編碼CTG重複導致異常RNA加工及顯性負效應；極端擴增之預期導致早發性疾病。已藉由70%之DMPK顯示功效；且已在小鼠中證實ASO功效。已在KO及ASO KD小鼠中證明安全性。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如血液及CSF mRNA及蛋白質。靶向肌緊張性營養障礙 2 之 ZNF9
鋅指蛋白9突變導致肌緊張性營養障礙2 (DM2)，一種骨骼肌之退化性病症。此為嚴重病症，沒有疾病改善療法。DM2之盛行率為全球每8,000人中有1人；其為成人中最常見的肌營養不良症。經由人類分子遺傳學靶向ZNF9可為優異的，例如，內含子1中之ZNF9 CTTG重複擴增導致家族性DM2。靶組織可為骨骼肌或心肌。此靶向之機制可能係因為內含子1中之常染色體顯性CTTG重複擴增導致異常RNA代謝及顯性負效應。已藉由70%之ZNF9顯示功效。已證實小鼠中之安全KD。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如血液mRNA及蛋白質。
顯性遺傳性朊病毒疾病為遺傳性、偶發性及傳染性PRNP病症。靶標包括PRNP。靶向肌緊張性朊病毒疾病之 PRNP
肌緊張性朊病毒疾病為顯性遺傳性朊病毒疾病，包括PRNP相關之腦類澱粉蛋白血管病、吉斯氏病(Gerstmann-Straussler Disease，GSD)、庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease，CJD)、致死性家族性失眠(FFI)、類亨廷頓病1 (HDL1)及庫魯易感性(Kuru susceptibility)。此等疾病為致死性神經退化性病症，沒有疾病改善療法。此類疾病之盛行率為每1,000,000人中有1人。經由人類分子遺傳學靶向PRNP可為優異的，例如，PRNP突變導致家族性及偶發性朊病毒疾病。靶組織可為CNS。此靶向之機制可能係因為常染色體顯性蛋白中摺疊導致神經毒性。已藉由70%之PRNP KD顯示功效；且PRNP多形現象似乎對庫魯病有保護作用。關於安全性，已報告PRNP KO小鼠為健康的。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF mRNA及蛋白質。靶向拉福拉之肌痙攣癲癇症的糖原合成酶
Laforin (EPM2A)基因突變導致AR肌痙攣癲癇症，一種遺傳性進行性癲癇發作病症。此疾病為癲癇發作及認知減退之致死性病症，沒有疾病改善療法。此疾病之盛行率為每1,000,000人中有4人。經由人類分子遺傳學靶向糖原合成酶可為優異的，例如，突變導致拉福拉之AR家族性肌痙攣癲癇症。靶組織可為CNS。此靶向之機制可能係因為Laforin之常染色體隱性功能障礙導致糖原之錯誤摺疊及癲癇發作之病灶。已藉由糖原合成酶GYS1之70% KD顯示功效。關於安全性，GYS1缺乏導致骨骼肌及心肌糖原缺乏；存活之GYS1小鼠具有肌肉缺陷。可能的診斷包括家族病史；基因測試；或早期症狀。可使用之生物標誌物包括例如CSF mRNA及蛋白質。
在一些實施例中，本發明提供靶向疾病基因之雙股iRNA劑，該等疾病包括但不限於年齡相關性黃斑變性(AMD) (乾性及濕性)、鳥槍彈樣脈絡膜視網膜病變、顯性色素性視網膜炎4、富克氏營養不良(Fuch's dystrophy)、hATTR澱粉樣變性、遺傳性及偶發性青光眼以及斯特格特氏病(stargardt's disease)。
在一些實施例中，本發明提供靶向濕性(或滲出性) AMD之VEGF的雙股iRNA劑。
在一些實施例中，本發明提供靶向乾性(或非滲出性) AMD之C3的雙股iRNA劑。
在一些實施例中，本發明提供靶向乾性(或非滲出性) AMD之CFB的雙股iRNA劑。
在一些實施例中，本發明提供靶向青光眼之MYOC的雙股iRNA劑。
在一些實施例中，本發明提供靶向青光眼之ROCK2的雙股iRNA劑。
在一些實施例中，本發明提供靶向青光眼之ADRB2的雙股iRNA劑。
在一些實施例中，本發明提供靶向青光眼之CA2的雙股iRNA劑。
在一些實施例中，本發明提供靶向白內障之CRYGC的雙股iRNA劑。
在一些實施例中，本發明提供靶向乾眼症候群之PPP3CB的雙股iRNA劑。配體
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑係藉由共價連接一或多個接合物基團來進一步修飾。一般而言，接合物基團調節所附接之本發明之雙股iRNA劑的一或多個特性，包括但不限於藥力學、藥物動力學、結合、吸收、細胞分佈、細胞攝取、電荷及清除。接合物基團通常用於化學技術，且直接或經由任擇的連接部分或連接基團連接至母體化合物，諸如寡聚化合物。接合物基團之較佳清單包括但不限於嵌入劑、報導分子、聚胺、聚醯胺、聚乙二醇、硫醚、聚醚、膽固醇、硫代膽固醇、膽酸部分、葉酸、脂質、磷脂、生物素、吩嗪、啡啶、蒽醌、金剛烷、吖啶、螢光素、若丹明、香豆素及染料。
在一些實施例中，雙股iRNA劑進一步包含靶向配體，其靶向介導遞送至特定CNS組織的受體。此等靶向配體可與親脂性部分組合接合，以實現特異性鞘內及全身遞送。
靶向介導遞送至CNS組織之受體的例示性靶向配體為肽配體，諸如血管肽-2、脂蛋白受體相關蛋白(LRP)配體、bEnd.3細胞結合配體；運鐵蛋白受體(TfR)配體(其可利用腦中之鐵轉運系統且負荷轉運至腦實質中)；甘露糖受體配體(其靶向嗅鞘細胞、膠細胞)、葡萄糖轉運蛋白及LDL受體配體。
在一些實施例中，雙股iRNA劑進一步包含靶向配體，其靶向介導遞送至特定眼組織之受體。此等靶向配體可與親脂性部分組合接合，以實現特異性玻璃體內及全身遞送。靶向介導遞送至眼組織之受體的例示性靶向配體為親脂性配體，諸如全反式視黃醇(其靶向視黃酸受體)；RGD肽(其靶向視網膜色素上皮細胞)，諸如H-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-Cys-OH或Cyclo(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys；LDL受體配體；及基於碳水化合物之配體(其靶向後眼內皮細胞)。
適用於本發明之較佳接合物基團包括脂質部分，諸如膽固醇部分(Letsinger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553)；膽酸(Manoharan等人, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053)；硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306；Manoharan等人, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765)；硫代膽固醇(Oberhauser等人, Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533)；脂族鏈，例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras等人, EMBO J., 1991, 10, 111；Kabanov等人, FEBS Lett., 1990, 259, 327；Svinarchuk等人, Biochimie, 1993, 75, 49)；磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙銨-1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油基-3-H-膦酸酯(Manoharan等人, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651；Shea等人, Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777)；聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等人, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969)；金剛烷乙酸(Manoharan等人, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651)；棕櫚基部分(Mishra等人, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229)；或十八基胺或己基胺基-羰基-羥膽固醇部分(Crooke等人, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923)。
一般而言，廣泛多種實體，例如配體，可與本文所述之寡聚化合物偶合。配體可包括天然存在之分子，或重組或合成分子。例示性配體包括但不限於聚離胺酸(PLL)、聚L-天冬胺酸、聚L-麩胺酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG，例如PEG-2K、PEG-5K、PEG-10K、PEG-12K、PEG-15K、PEG-20K、PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2 、聚乙烯醇(PVA)、聚胺基甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物、聚磷嗪、聚乙烯亞胺、陽離子基團、精胺、亞精胺、聚胺、偽肽-聚胺、肽模擬物聚胺、樹枝狀聚合物聚胺、精胺酸、脒、魚精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉、聚胺之四級鹽、促甲狀腺激素、促黑素、凝集素、糖蛋白、界面活性蛋白A、黏蛋白、糖基化聚胺基酸、運鐵蛋白、雙膦酸鹽、聚麩胺酸鹽、聚天冬胺酸、適體、去唾液酸胎球蛋白、玻尿酸、原膠原、免疫球蛋白(例如抗體)、胰島素、運鐵蛋白、白蛋白、糖-白蛋白接合物、嵌入劑(例如吖啶)、交聯劑(例如補骨脂素、絲裂黴素C)、卟啉(例如TPPC4、德卟啉、賽卟啉)、多環芳烴(例如吩嗪、二氫吩嗪)、人工核酸內切酶(例如EDTA)、親脂性分子(例如類固醇、膽汁酸、膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-鄰(十六烷基)甘油、香葉氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基或啡噁嗪)、肽(例如α螺旋肽、兩親性肽、RGD肽、細胞滲透肽、內體裂解/膜融合肽)、烷基化劑、磷酸酯、胺基、巰基、聚胺基、烷基、經取代之烷基、放射性標記之標誌物、酶、半抗原(例如生物素)、轉運/吸收促進劑(例如萘普生、阿司匹林、維生素E、葉酸)、合成核糖核酸酶(例如咪唑、雙咪唑、組織胺、咪唑簇、吖啶-咪唑接合物、四氮雜巨環之Eu3+複合物)、二硝基苯基、HRP、AP、抗體、激素及激素受體、凝集素、碳水化合物、多價碳水化合物、維生素(例如維生素A、維生素E、維生素K、維生素B，例如葉酸、B12、核黃素、生物素及吡哆醛)、維生素輔因子、脂多醣、p38 MAP激酶之活化因子、NF-κB之活化因子、塔克酮(taxon)、長春新鹼、長春花鹼、細胞遲緩素、諾考達唑(nocodazole)、傑普肯立德(japlakinolide)、拉春庫林A (latrunculin A)、鬼筆環肽(phalloidin)、斯文霍立德A (swinholide A)、引達喏新(indanocine)、美瑟文(myoservin)、腫瘤壞死因子α (TNFα)、介白素-1β、γ干擾素、天然或重組低密度脂蛋白(LDL)、天然或重組高密度脂蛋白(HDL)及細胞滲透劑(例如螺旋細胞滲透劑)。
肽及肽模擬物配體包括具有天然存在或經修飾之肽的配體，例如D或L肽；α、β或γ肽；N-甲基肽；氮雜肽；具有一或多個醯胺之肽，亦即鍵經一或多個脲、硫脲、胺基甲酸酯或磺醯脲鍵置換之肽；或環肽。肽模擬物(在本文中亦稱為寡肽模擬物)為能夠摺疊成與天然肽類似之確定三維結構的分子。肽或肽模擬物配體可為約5-50個胺基酸長，例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸長。
例示性兩親性肽包括但不限於蛾血素(cecropin)、洛克托辛(lycotoxin)、帕拉達辛(paradaxin)、蟾蜍苷元(buforin)、CPF、鈴蟾抗菌肽樣肽(bombinin-like peptide，BLP)、抗菌肽(cathelicidin)、克拉托辛(ceratotoxin)、柄海鞘(S. clava )肽、八目鰻腸道抗微生物肽(HFIAP)、爪蟾抗菌肽(magainine)、林蛙抗菌肽-2 (brevinin-2)、德瑪普汀(dermaseptin)、蜂毒肽(melittin)、普洛西汀(pleurocidin)、H2 A肽、非洲爪蟾(Xenopus)肽、艾庫尼絲-1 (esculentini-1)及卡厄林(caerin)。
如本文所用，術語「內體裂解配體」係指具有內體裂解特性之分子。內體裂解配體促進本發明組合物或其組分之溶解及/或自細胞內之細胞區室，諸如內體、溶酶體、內質網(ER)、高基氏器、微管、過氧化體或其他囊泡體轉運至細胞之細胞質。一些例示性內體裂解配體包括但不限於咪唑、聚咪唑或寡聚咪唑、直鏈或分支鏈聚乙烯亞胺(PEI)、直鏈及分支鏈聚胺(例如精胺、陽離子直鏈及分支鏈聚胺)、聚羧酸酯、聚陽離子、經掩蔽之寡聚或聚陽離子或陰離子、縮醛、聚縮醛、縮酮/聚縮酮、原酸酯、具有經掩蔽或未掩蔽之陽離子或陰離子電荷的直鏈或分支鏈聚合物、具有經掩蔽或未掩蔽之陽離子或陰離子電荷的樹枝狀聚合物、聚陰離子肽、聚陰離子肽模擬物、pH敏感肽、天然及合成膜融合脂質、天然及合成陽離子脂質。
例示性內體裂解/膜融合肽包括但不限於AALEALAEALEALAEALEALAEAAAAGGC (GALA)；AALAEALAEALAEALAEALAEALAAAAGGC (EALA)；ALEALAEALEALAEA；GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYG (INF-7)；GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG (Inf HA-2)；GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGCGLFEAIEGFIENGWEGMID GWYGC (diINF-7)；GLFEAIEGFIENGWEGMIDGGCGLFEAIEGFIENGWEGMIDGGC (diINF-3)；GLFGALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAAGGSC (GLF)；GLFEAIEGFIENGWEGLAEALAEALEALAAGGSC (GALA-INF3)；GLF EAI EGFI ENGW EGnI DG K GLF EAI EGFI ENGW EGnI DG (INF-5，n為正白胺酸)；LFEALLELLESLWELLLEA (JTS-1)；GLFKALLKLLKSLWKLLLKA (ppTG1)；GLFRALLRLLRSLWRLLLRA (ppTG20)；WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA (KALA)；GLFFEAIAEFIEGGWEGLIEGC (HA)；GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ (蜂毒素)；H5 WYG；及CHK6 HC。
不希望受理論所束縛，膜融合脂質與膜融合且因此使膜不穩定。膜融合脂質通常具有小的頭部基團及不飽和醯基鏈。例示性膜融合脂質包括但不限於1,2-二油醯基-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、磷脂醯乙醇胺(POPE)、棕櫚醯油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-醇(Di-Lin)、N-甲基(2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)-1,3-二氧戊環-4-基)甲胺(DLin-k-DMA)及N-甲基-2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)-1,3-二氧戊環-4-基)乙胺(在本文中亦稱為XTC)。
適用於本發明之具有內體裂解活性的合成聚合物描述於美國專利申請公開案第2009/0048410號；第2009/0023890號；第2008/0287630號；第2008/0287628號；第2008/0281044號；第2008/0281041號；第2008/0269450號；第2007/0105804號；第20070036865號及第2004/0198687號中，其內容特此以全文引用之方式併入。
例示性細胞滲透肽包括但不限於RQIKIWFQNRRMKWKK (穿膜肽)；GRKKRRQRRRPPQC (Tat片段48-60)；GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV (基於信號序列之肽)；LLIILRRRIRKQAHAHSK (PVEC)；GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL (運輸蛋白)；KLALKLALKALKAALKLA (兩親性模型肽)；RRRRRRRRR (Arg9)；KFFKFFKFFK (細菌細胞壁滲透肽)；LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES  (LL-37)；SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR (殺菌肽P1)；ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC (α-防禦素)；DHYNCVSSGGQCLYSACPIFTKIQGTCYRGKAKCCK (β-防禦素)；RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFPGKR-NH2 (PR-39)；ILPWKWPWWPWRR-NH2 (肽抗生素)；AAVALLPAVLLALLAP (RFGF)；AALLPVLLAAP (RFGF類似物)；及RKCRIVVIRVCR (牛抗菌肽)。
例示性陽離子基團包括但不限於質子化胺基，其衍生自例如O-胺(胺= NH2 ；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺、聚胺基)；胺基烷氧基，例如O(CH2 )n 胺(例如胺= NH2 ；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺、聚胺基)；胺基(例如NH2 ；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基或胺基酸)；及NH(CH2 CH2 NH)n CH2 CH2 -胺(胺= NH2 ；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基)。
如本文所用，術語「靶向配體」係指為所選靶標提供增強的親和力的任何分子，所選靶標例如細胞、細胞類型、組織、器官、身體區域或區室，例如細胞、組織或器官區室。一些例示性靶向配體包括但不限於抗體、抗原、葉酸、受體配體、碳水化合物、適體、整合素受體配體、趨化因子受體配體、運鐵蛋白、生物素、血清素受體配體、PSMA、內皮素、GCPII、生長抑素、LDL及HDL配體。
基於碳水化合物之靶向配體包括但不限於D-半乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-D-半乳糖胺(GalNAc)、多價GalNAc，例如GalNAc2 及GalNAc3 (GalNAc及多價GalNAc在本文中統稱為GalNAc接合物)；D-甘露糖、多價甘露糖、多價乳糖、N-乙醯基-葡糖胺、葡萄糖、多價葡萄糖、多價海藻糖、經糖基化之聚胺基酸及凝集素。術語多價指示存在多於一個單糖單元。此類單糖次單元可經由糖苷鍵彼此連接或連接至骨架分子。
作為配體適用於本發明之許多葉酸及葉酸類似物描述於美國專利第2,816,110號；第5,552,545號；第6,335,434號及第7,128,893號中，其內容以全文引用的方式併入本文中。
如本文所用，術語「PK調節配體」及「PK調節劑」係指可調節本發明組合物之藥物動力學的分子。一些例示性PK調節劑包括但不限於親脂性分子、膽汁酸、固醇、磷脂類似物、肽、蛋白質結合劑、維生素、脂肪酸、啡噁嗪、阿司匹林、萘普生、布洛芬、舒洛芬(suprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、(S)-(+)-普拉洛芬(pranoprofen)、卡洛芬(carprofen)、PEG、生物素及甲狀腺素轉運蛋白結合配體(例如四碘甲狀腺乙酸、2,4,6-三碘苯酚及氟芬那酸(flufenamic acid))。亦已知包含多個硫代磷酸酯糖間鍵之寡聚化合物與血清蛋白結合，因此短寡聚化合物，例如包含約5至30個核苷酸(例如，5至25個核苷酸，較佳5至20個核苷酸，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸)且在主鏈中包含多個硫代磷酸酯鍵的寡核苷酸亦作為配體(例如作為PK調節配體)適用於本發明。PK調節寡核苷酸可包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個硫代磷酸酯及/或二硫代磷酸酯鍵。在一些實施例中，PK調節寡核苷酸中之所有核苷酸間鍵為硫代磷酸酯及/或二硫代磷酸酯鍵。另外，結合血清組分(例如血清蛋白)之適體亦作為PK調節配體適用於本發明。與血清組分(例如血清蛋白)之結合可自白蛋白結合分析預測，諸如Oravcova等人, Journal of Chromatography B (1996), 677: 1-27中所述之分析。
當存在二個或更多個配體時，配體可皆具有相同特性，皆具有不同特性，或一些配體具有相同特性而其他配體具有不同特性。舉例而言，配體可具有靶向特性，具有內體裂解活性或具有PK調節特性。在一較佳實施例中，所有配體皆具有不同特性。
當單體併入本發明之雙股iRNA劑的組分(例如本發明之雙股iRNA劑或連接子)中時，配體或繫鏈配體可存在於該單體上。在一些實施例中，在「前體」單體已併入本發明之雙股iRNA劑的組分(例如本發明之雙股iRNA劑或連接子)中後，配體可經由偶合併入該「前體」單體。舉例而言，具有例如胺基封端之繫鏈(亦即，無相關配體)之單體，例如單體-連接子-NH2 可併入本發明化合物之組分(例如本發明之雙股iRNA劑或連接子)中。在後續操作中，亦即在前體單體併入本發明化合物之組分(例如本發明之雙股iRNA劑或連接子)之後，具有親電子基團之配體，例如五氟苯基酯或醛基，可隨後藉由將配體之親電子基團與前體單體之繫鏈的末端親核基團偶合而附接至前體單體。
在另一個實例中，可併入具有適於參與點擊化學反應之化學基團的單體，例如疊氮基或炔封端之繫鏈/連接子。在後續操作中，亦即在將前體單體併入股中之後，可藉由將炔及疊氮基偶合在一起而將具有互補化學基團(例如炔或疊氮基)之配體附接至前體單體。
在一些實施例中，配體可與本發明之雙股iRNA劑的核鹼基、糖部分或核苷間鍵接合。與嘌呤核鹼基或其衍生物之接合可發生在包括內環及環外原子之任何位置。在一些實施例中，嘌呤核鹼基之2-、6-、7-或8-位置附接至接合物部分。與嘧啶核鹼基或其衍生物之接合亦可發生在任何位置。在一些實施例中，嘧啶核鹼基之2-、5-及6-位置可經接合物部分取代。當配體與核鹼基接合時，較佳位置為不干擾雜交，亦即不干擾鹼基配對所需之氫鍵相互作用的位置。
與核苷之糖部分的接合可發生在任何碳原子處。可附接至接合物部分之糖部分的例示性碳原子包括2'、3'及5'碳原子。1'位置亦可附接至接合物部分，諸如在無鹼基殘基中。核苷間鍵亦可帶有接合物部分。對於含磷鍵(例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、硫代磷酸二酯、磷醯胺酸及其類似物)，接合物部分可直接附接至磷原子或與磷原子鍵結之O、N或S原子。對於含有胺或醯胺之核苷間鍵(例如PNA)，接合物部分可附接至胺或醯胺之氮原子或相鄰碳原子。
存在許多製備寡核苷酸接合物之方法。一般而言，藉由使寡核苷酸上之反應性基團(例如OH、SH、胺、羧基、醛及其類似基團)與接合物部分上之反應性基團接觸而將寡核苷酸附接至接合物部分。在一些實施例中，一個反應性基團為親電子的且其他為親核的。
舉例而言，親電子基團可為含羰基之官能基且親核基團可為胺或硫醇。在存在及不存在連接基團之情況下用於接合核酸及相關寡聚化合物之方法充分描述於文獻中，諸如Manoharan in Antisense Research and Applications, Crooke及LeBleu編, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, 第17章，其以全文引用之方式併入本文中。
配體可經由連接子或載體單體(例如配體載體)附接至本發明之雙股iRNA劑。載體包括(i)至少一個「主鏈附接點」，較佳二個「主鏈附接點」及(ii)至少一個「繫鏈附接點」。如本文所用，「主鏈附接點」係指可用於且適用於將載體單體併入主鏈(例如寡核苷酸之磷酸酯或經修飾之磷酸酯，例如含硫主鏈)之官能基，例如羥基，或通常鍵。「繫鏈附接點」(TAP)係指連接所選部分之載體單體的原子，例如碳原子或雜原子(不同於提供主鏈附接點之原子)。所選部分可為例如碳水化合物，例如單糖、二糖、三糖、四糖、寡醣及多醣。任擇地，所選部分藉由插入的繫鏈連接至載體單體。因此，載體將通常包括官能基，例如胺基，或通常提供鍵，其適於將另一種化學實體(例如配體)併入或繫栓至組成原子。
教示核酸接合物之製備的代表性美國專利包括但不限於美國專利第4,828,979號；第4,948,882號；第5,218,105號；第5,525,465號；第5,541,313號；第5,545,730號；第5,552,538號；第5,578,717號；第5,580,731號；第5,580,731號；第5,591,584號；第5,109,124號；第5,118,802號；第5,138,045號；第5,414,077號；第5,486,603號；第5,512,439號；第5,578,718號；第5,608,046號；第4,587,044號；第4,605,735號；第4,667,025號；第4,762, 779號；第4,789,737號；第4,824,941號；第4,835,263號；第4,876,335號；第4,904,582號；第4,958,013號；第5,082,830號；第5,112,963號；第5,214,136號；第5,082,830號；第5,112,963號；第5,149,782號；第5,214,136號；第5,245,022號；第5,254, 469號；第5,258,506號；第5,262,536號；第5,272,250號；第5,292,873號；第5,317, 098號；第5,371,241號；第5,391,723號；第5,416,203號；第5,451,463號；第5,510,475號；第5,512,667號；第5,514,785號；第5,565,552號；第5,567,810號；第5,574,142號；第5,585,481號；第5,587,371號；第5,595,726號；第5,597,696號；第5,599,923號；第5,599,928號；第5,672,662號；第5,688,941號；第5,714,166號；第6,153,737號；第6,172,208號；第6,300,319號；第6,335,434號；第6,335,437號；第6,395, 437號；第6,444,806號；第6,486,308號；第6,525,031號；第6,528,631號；第6,559, 279號；其內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，雙股iRNA劑進一步包含靶向肝組織之靶向配體。在一些實施例中，靶向配體為基於碳水化合物之配體。在一個實施例中，靶向配體為GalNAc接合物。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑進一步包含具有如下所示之結構的配體：
Figure 02_image151
， 其中： LG 在每次出現時獨立地為配體，例如碳水化合物，例如單糖、二糖、三糖、四糖、多醣；及 Z'、Z''、Z'''及Z''''在每次出現時各自獨立地為O或S。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含式(II)、(III)、(IV)或(V)之配體：
Figure 02_image153
， 其中： q2A 、q2B 、q3A 、q3B 、q4A 、q4B 、q5A 、q5B 及q5C 在每次出現時獨立地表示0-20且其中重複單元可相同或不同； Q及Q'在每次出現時獨立地為不存在的、-(P7 -Q7 -R7 )p -T7 -或-T7 -Q7 -T7 ' -B-T8 ' -Q8 -T8 ； P2A 、P2B 、P3A 、P3B 、P4A 、P4B 、P5A 、P5B 、P5C 、P7 、T2A 、T2B 、T3A 、T3B 、T4A 、T4B 、T4A 、T5B 、T5C 、T7 、T7 ' 、T8 及T8 ' 在每次出現時各自獨立地為不存在的、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2 、CH2 NH或CH2 O； B為-CH2 -N(BL )-CH2 -； BL 為-TB -QB -TB ' -Rx ； Q2A 、Q2B 、Q3A 、Q3B 、Q4A 、Q4B 、Q5A 、Q5B 、Q5C 、Q7 、Q8 及QB 在每次出現時獨立地為不存在的、伸烷基、經取代之伸烷基，且其中一或多個亞甲基可間雜有O、S、S(O)、SO2 、N(RN )、C(R')=C(R')、C≡C或C(O)中之一或多者或由其封端； TB 及TB ' 在每次出現時各自獨立地為不存在的、CO、NH、O、S、OC(O)、OC(O)O、NHC(O)、NHC(O)NH、NHC(O)O、CH2 、CH2 NH或CH2 O； Rx 為親脂體(例如，膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基或啡噁嗪)、維生素(例如，葉酸、維生素A、維生素E、生物素、吡哆醛)、肽、碳水化合物(例如，單糖、二糖、三糖、四糖、寡醣、多醣)、內體裂解組分、類固醇(例如，熊果醇、海柯吉寧(hecigenin)、薯蕷皂苷配基(diosgenin))、萜烯(例如三萜，例如薩灑皂苷配基(sarsasapogenin)、無羈萜(Friedelin)、表無羈萜醇(epifriedelanol)衍生之石膽酸)或陽離子脂質； R1 、R2 、R2A 、R2B 、R3A 、R3B 、R4A 、R4B 、R5A 、R5B 、R5C 、R7 在每次出現時各自獨立地為不存在的、NH、O、S、CH2 、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra )C(O)、-C(O)-CH(Ra )-NH-、CO、CH=N-O、
Figure 02_image155
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Figure 02_image157
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Figure 02_image159
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Figure 02_image161
、
Figure 02_image163
或雜環基； L1 、L2A 、L2B 、L3A 、L3B 、L4A 、L4B 、L5A 、L5B 及L5C 在每次出現時各自獨立地為碳水化合物，例如單糖、二糖、三糖、四糖、寡醣及多醣； R'及R''各自獨立地為H、C1 -C6 烷基、OH、SH或N(RN )2 ； RN 在每次出現時獨立地為H、甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基或苯甲基； Ra 為H或胺基酸側鏈； Z'、Z''、Z'''及Z''''在每次出現時各自獨立地為O或S； p在每次出現時獨立地表示0-20。
如上文所論述，因為配體可經由連接子或載體與iRNA劑接合，且因為連接子或載體可含有分支鏈連接子，所以iRNA劑可隨後經由載體之相同或不同主鏈附接點，或經由分支鏈連接子含有多個配體。舉例而言，分支鏈連接子之分支點可為二價、三價、四價、五價或六價原子，或呈現此類多價之基團。在某些實施例中，分支點為-N、-N(Q)-C、-O-C、-S-C、-SS-C、-C(O)N(Q)-C、-OC(O)N(Q)-C、-N(Q)C(O)-C或-N(Q)C(O)O-C；其中Q在每次出現時獨立地為H或任擇地經取代之烷基。在其他實施例中分支點為甘油或甘油衍生物。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image079
。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image166
。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image168
。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image170
。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image172
。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image174
。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image176
。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image178
。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image180
。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image182
。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image184
。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image186
。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image188
。例示性配體單體
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image190
。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image192
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image194
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image196
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image198
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image200
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image202
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image204
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image206
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image208
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image210
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image212
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image214
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image216
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image218
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image220
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image222
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image224
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image226
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image228
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image230
在一些實施例中，L2A 及L2B 為不同的。
在一些較佳實施例中，L3A 及L3B 為相同的。
在一些實施例中，L3A 及L3B 為不同的。
在一些較佳實施例中，L4A 及L4B 為相同的。
在一些實施例中，L4A 及L4B 為不同的。
在一些較佳實施例中，L5A 、L5B 及L5C 皆為相同的。
在一些實施例中，L5A 、L5B 及L5C 中之二者為相同的
在一些實施例中，L5A 及L5B 為相同的。
在一些實施例中，L5A 及L5C 為相同的。
在一些實施例中，L5B 及L5C 為相同的。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image232
。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image234
。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image236
。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image238
，其中Y為O或S，且n為1-6。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image240
，其中Y為O或S，n為1-6，R為氫或核酸，且R'為核酸。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image242
，其中Y為O或S，且n為1-6。
在某些實施例中，本文所述之寡聚化合物，包括但不限於本發明之雙股iRNA劑，包含以下結構之單體：
Figure 02_image244
，其中Y為O或S，n為2-6，x為1-6，且A為H或磷酸酯鍵。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含至少1、2、3或4個以下結構之單體：
Figure 02_image246
。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image248
，其中X為O或S。
在某些實施例中，本文所述之寡聚化合物，包括但不限於本發明之雙股iRNA劑，包含以下結構之單體：
Figure 02_image250
，其中x為1-12。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image252
，其中R為OH或NHCOCH3 。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image254
，其中R為OH或NHCOCH3 。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image256
，其中R為O或S。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image258
，其中R為OH或NHCOCH3 。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image260
。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image262
，其中R為OH或NHCOCH3 。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image264
，其中R為OH或NHCOCH3 。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image266
，其中R為OH或NHCOCH3 。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image268
，其中R為OH或NHCOCH3 。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image270
。
在上述單體中，X及Y在每次出現時各自獨立地為H、保護基、磷酸酯基、磷酸二酯基、活化的磷酸酯基、活化的亞磷酸酯基、胺基磷酸酯、固體支撐物、-P(Z')(Z'')O-核苷、-P(Z')(Z'')O-寡核苷酸、脂質、PEG、類固醇、聚合物、核苷酸、核苷或寡核苷酸；且Z'及Z''在每次出現時各自獨立地為O或S。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑與以下結構之配體接合：
Figure 02_image079
或
Figure 02_image166
。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之配體：
Figure 02_image079
:或
Figure 02_image166
。
在某些實施例中，本發明之雙股iRNA劑包含以下結構之單體：
Figure 02_image276
或
Figure 02_image278
。 上述配體及單體之合成描述於例如美國專利第8,106,022號中，其內容以全文引用之方式併入本文中。候選 iRNA 之評估
吾人可藉由將試劑或經修飾之分子及對照分子暴露於適當條件且評估所選特性之存在來針對所選特性評估候選iRNA劑，例如經修飾之RNA。舉例而言，可如下評估對降解劑之抗性。候選經修飾之RNA (及對照分子，通常為未修飾之形式)可暴露於降解條件，例如暴露於包括降解劑(例如核酸酶)之環境。例如，吾人可使用生物樣品，例如與治療用途可能遇到之環境類似的生物樣品，例如血液或細胞部分，例如無細胞勻漿或破碎的細胞。隨後可藉由多種方法中之任一者來評估候選物及對照物對降解之抗性。舉例而言，候選物及對照物可在暴露之前，用例如放射性或酶標記物或螢光標記物(諸如Cy3或Cy5)來標記。對照及經修飾之RNA可與降解劑及任擇的對照(例如不活化，例如加熱不活化)降解劑一起培育。隨後測定經修飾之分子及對照分子的物理參數，例如大小。其可藉由物理方法來測定，例如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳或篩分管柱，以評定分子是否保持其原始長度，或在功能上評定。或者，可使用北方墨點分析來分析未標記的經修飾之分子的長度。
功能分析亦可用於評估候選試劑。功能分析可在最初或在較早的非功能性分析(例如，對降解之抗性的分析)之後應用，以確定修飾是否改變分子使基因表現沉默之能力。舉例而言，細胞，例如哺乳動物細胞，諸如小鼠或人類細胞，可與表現螢光蛋白(例如GFP)之質體及與編碼螢光蛋白之轉錄物同源的候選RNA劑共轉染(參見例如WO 00/44914)。舉例而言，與轉染不包括候選dsiRNA的對照細胞(例如，未添加試劑之對照及/或添加未修飾之RNA的對照)相比，可藉由監測細胞螢光之降低來分析與GFP mRNA同源的經修飾之dsiRNA抑制GFP表現的能力。可藉由在經修飾及未修飾之dssiRNA化合物存在下比較細胞螢光來評定候選試劑對基因表現的功效。
在另一功能分析中，與內源性小鼠基因(例如母系表現之基因，諸如c-mos )同源之候選dssiRNA化合物可注射至未成熟的小鼠卵母細胞中，以評定試劑活體內抑制基因表現的能力(參見例如WO 01/36646)。可監測卵母細胞之表型，例如在中期II維持停滯的能力，作為該試劑抑制表現之指標。舉例而言，藉由dssiRNA化合物裂解c-mos mRNA將導致卵母細胞退出中期停滯且引發單性發育(Colledge等人 Nature 370: 65-68, 1994；Hashimoto等人 Nature, 370:68-71, 1994)。與陰性對照相比，經修飾之試劑對靶RNA水準之影響可藉由北方墨點分析靶mRNA之水準降低，或藉由西方墨點分析靶蛋白之水準降低來驗證。對照可包括其中未添加試劑之細胞及/或其中添加未修飾之RNA的細胞。生理效應
本文所述之siRNA化合物可經設計以使得更容易藉由siRNA與人類及非人類動物序列之互補性來確定治療毒性。藉由此等方法，siRNA可由與來自人類之核酸序列及來自至少一種非人類動物(例如，非人類哺乳動物，諸如嚙齒動物、反芻動物或靈長類動物)之核酸序列完全互補的序列組成。舉例而言，非人類哺乳動物可為小鼠、大鼠、狗、豬、山羊、綿羊、牛、猴、倭黑猩猩、黑猩猩、恆河猴或食蟹獼猴。siRNA化合物之序列可與非人類哺乳動物及人類之同源基因(例如致癌基因或腫瘤抑制基因)內的序列互補。藉由確定siRNA化合物在非人類哺乳動物中之毒性，吾人可推知siRNA化合物在人類中之毒性。對於更繁重之毒性測試，siRNA可與人類及多於一種，例如二種或三種或更多種非人類動物互補。
本文所述之方法可用於關聯siRNA化合物對人類之任何生理效應，例如任何不需要的效應，諸如毒性效應，或任何陽性或所需效應。增加 siRNA 之細胞攝取
本文描述各種siRNA組合物，其含有共價連接之增加siRNA之細胞攝取及/或細胞內靶向的接合物。
另外提供本發明之方法，其包括投與siRNA化合物及影響siRNA攝入細胞之藥物。可在投與siRNA化合物之前、之後或同時投與藥物。藥物可與siRNA化合物共價或非共價連接。藥物可為例如脂多醣、p38 MAP激酶之活化劑或NF-κB之活化劑。藥物可對細胞具有短暫影響。藥物可例如藉由破壞細胞之細胞骨架，例如藉由破壞細胞之微管、微絲及/或中間絲來增加siRNA化合物攝入細胞。藥物可為例如塔克酮、長春新鹼、長春花鹼、細胞遲緩素、諾考達唑、傑普肯立德、拉春庫林A、鬼筆環肽、斯文霍立德A、引達喏新或美瑟文。藥物亦可藉由例如活化發炎反應來增加siRNA化合物攝入給定細胞或組織。具有此類效應之例示性藥物包括腫瘤壞死因子α (TNFα)、介白素-1β、CpG基元、γ干擾素或更通常為活化toll樣受體之藥劑。siRNA 產生
siRNA可例如藉由多種方法大量產生。示例性方法包括：有機合成及RNA裂解，例如活體外裂解。
有機合成。 siRNA可藉由分別合成單股RNA分子或雙股RNA分子之各個股來製備，之後可接著黏接組分股。
大型生物反應器，例如來自Pharmacia Biotec AB (Uppsala Sweden)之OligoPilot II，可用於產生給定siRNA之大量特定RNA股。OligoPilotII反應器可僅使用1.5莫耳過量之胺基磷酸酯核苷酸有效偶合核苷酸。為了製造RNA股，使用核糖核苷酸胺基酸酯。單體添加之標準循環可用於合成siRNA之21至23個核苷酸股。通常，二個互補股分開製備且隨後黏接，例如在自固體支撐物釋放及去保護之後。
有機合成可用於產生離散的siRNA物種。可精確指定物種與特定靶基因之互補性。舉例而言，物種可與包括多形現象(例如單核苷酸多形現象)之區域互補。另外，可精確確定多形現象之位置。在一些實施例中，多形現象位於內部區域，例如來自一個或二個末端之至少4、5、7或9個核苷酸。
dsiRNA 裂解。 siRNA亦可藉由裂解較大siRNA來製備。可活體外或活體內介導裂解。舉例而言，為了藉由活體外裂解產生iRNA，可使用以下方法：
活體外轉錄。dsiRNA係藉由在二個方向上轉錄核酸(DNA)鏈段來產生。舉例而言，HiScribe™ RNAi轉錄套組(New England Biolabs)提供用於產生核酸鏈段之dsiRNA的載體及方法，該核酸鏈段在任一側與T7啟動子側接之位置處選殖至載體中。為dsiRNA之二個互補股的T7轉錄產生單獨的模板。藉由添加T7 RNA聚合酶活體外轉錄模板且產生dsiRNA。使用PCR及/或其他RNA聚合酶(例如T3或SP6聚合酶)之類似方法亦可為可能污染重組酶製劑之毒素。
活體外裂解。 在一個實施例中，通過此方法產生之RNA經仔細純化以移除末端siRNA，其例如使用Dicer或類似的基於RNA酶III之活性活體外裂解成siRNA。舉例而言，dsiRNA可在來自果蠅之活體外提取物中或使用經純化之組分，例如經純化之RNA酶或RISC複合物(RNA誘導沉默複合物)培育。參見例如Ketting等人Genes Dev 2001年10月15日;15(20):2654-9.及HammondScience 2001年8月10日;293(5532):1146-50。
dsiRNA裂解一般產生多個siRNA物種，各自為源dsiRNA分子之特定21至23 nt片段。舉例而言，可存在包括與源dsiRNA分子之重疊區域及相鄰區域互補之序列的siRNA。
無論合成方法如何，siRNA製劑可在適於調配物之溶液(例如水溶液及/或有機溶液)中製備。舉例而言，siRNA製劑可沈澱且再溶解於純雙蒸水中，且凍乾。乾燥的siRNA可隨後再懸浮於適合於預期調配方法之溶液中。製造與親脂性部分接合之雙股 iRNA 劑
在一些實施例中，親脂性部分經由核鹼基、糖部分或核苷間鍵與雙股iRNA劑接合。
與嘌呤核鹼基或其衍生物之接合可發生在包括內環及環外原子之任何位置。在一些實施例中，嘌呤核鹼基之2-、6-、7-或8-位置附接至接合物部分。與嘧啶核鹼基或其衍生物之接合亦可發生在任何位置。在一些實施例中，嘧啶核鹼基之2-、5-及6-位置可經接合物部分取代。當親脂性部分與核鹼基接合時，較佳位置為不干擾雜交，亦即不干擾鹼基配對所需之氫鍵相互作用的位置。在一個實施例中，親脂性部分可經由含有烷基、烯基或醯胺鍵之連接子與核鹼基接合。親脂性部分與核鹼基之例示性接合示於圖1及實例7中。
與核苷之糖部分的接合可發生在任何碳原子處。親脂性部分可附接之糖部分的例示性碳原子包括2'、3'及5'碳原子。親脂性部分亦可附接至1'位置，諸如在無鹼基殘基中。在一個實施例中，親脂性部分可在存在或不存在連接子之情況下經由2'-O修飾與糖部分接合。親脂性部分與糖部分之例示性接合(經由2'-O修飾)示於圖1及實例1、2、3及6中。
核苷間鍵亦可帶有親脂性部分。對於含磷鍵(例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、硫代磷酸二酯、磷醯胺酸及其類似物)，親脂性部分可直接附接至磷原子或與磷原子鍵結之O、N或S原子。對於含有胺或醯胺之核苷間鍵(例如PNA)，親脂性部分可附接至胺或醯胺之氮原子或相鄰碳原子。
存在許多製備寡核苷酸接合物之方法。一般而言，藉由使寡核苷酸上之反應性基團(例如OH、SH、胺、羧基、醛及其類似基團)與接合物部分上之反應性基團接觸而將寡核苷酸附接至接合物部分。在一些實施例中，一個反應性基團為親電子的且其他為親核的。
舉例而言，親電子基團可為含羰基之官能基且親核基團可為胺或硫醇。在存在及不存在連接基團之情況下用於接合核酸及相關寡聚化合物之方法充分描述於文獻中，諸如Manoharan in Antisense Research and Applications, Crooke及LeBleu編, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, 第17章，其以全文引用之方式併入本文中。
在一個實施例中，可分別合成第一(互補) RNA股及第二(有義) RNA股，其中RNA股中之一者包含側接親脂性部分，且第一及第二RNA股可混合形成dsRNA。合成RNA股之步驟較佳涉及固相合成，其中各個核苷酸經由在連續合成循環中形成核苷酸間3'-5'磷酸二酯鍵而端與端相接。
在一個實施例中，具有胺基磷酸酯基之親脂性分子在最後的合成循環中與第一(互補)或第二(有義) RNA股之3'端或5'端偶合。在RNA之固相合成中，核苷酸最初為核苷胺基磷酸酯之形式。在各合成循環中，另一個核苷胺基磷酸酯與先前併入之核苷酸的-OH基團連接。若親脂性分子具有胺基磷酸酯基團，則其可以類似於核苷胺基磷酸酯之方式與先前在固相合成中合成之RNA的游離OH末端偶合。合成可使用習知RNA合成儀以自動化及標準化方式進行。具有胺基磷酸酯基團之親脂性分子的合成可包括游離羥基之亞磷醯化以產生胺基磷酸酯基團。
親脂性部分接合之胺基磷酸酯的合成程序例示於實例1、2、4、5、6及7中。在實例3中說明親脂性部分或其他配體之合成後接合程序的實例。
一般而言，寡核苷酸可使用此項技術中已知的方案合成，例如，如Caruthers等人, Methods in Enzymology (1992) 211:3-19；WO 99/54459；Wincott等人, Nucl. Acids Res. (1995) 23:2677-2684；Wincott等人, Methods Mol. Bio., (1997) 74:59；Brennan等人, Biotechnol. Bioeng. (1998) 61:33-45；及美國專利第6,001,311號中所述；其各自以全文引用之方式併入本文中。一般而言，寡核苷酸之合成涉及習知的核酸保護及偶合基團，諸如5'端處之二甲氧基三苯甲基及3'端處之胺基磷酸酯。在一非限制性實例中，使用由ChemGenes Corporation (Ashland, Mass.)銷售之核苷胺基磷酸酯，在由Applied Biosystems, Inc. (Weiterstadt, Germany)銷售之Expedite 8909 RNA合成儀上進行小規模合成。或者，合成可在96孔盤合成儀，諸如由Protogene (Palo Alto, Calif.)生產之儀器上，或藉由諸如Usman等人, J. Am. Chem. Soc. (1987) 109:7845；Scaringe等人, Nucl. Acids Res. (1990) 18:5433；Wincott等人, Nucl. Acids Res. (1990) 23:2677-2684；及Wincott等人, Methods Mol. Bio. (1997) 74:59中所述之方法來進行，其各自以全文引用之方式併入本文中。
本發明之核酸分子可單獨合成且在合成後相接在一起，例如在合成及/或去保護後藉由連接(Moore等人, Science (1992) 256:9923；WO 93/23569；Shabarova等人, Nucl. Acids Res. (1991) 19:4247；Bellon等人, Nucleosides & Nucleotides (1997) 16:951；Bellon等人, Bioconjugate Chem. (1997) 8:204；或藉由雜交。核酸分子可藉由使用習知方法之凝膠電泳純化，或可藉由高壓液相層析(HPLC；參見Wincott等人，見上文，其全部以引用的方式併入本文中)純化且再懸浮於水中。醫藥組合物
在一個態樣中，本發明之特徵在於醫藥組合物，其包括siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前體，例如可加工成ssiRNA化合物之較大siRNA化合物，或編碼siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前體之DNA)，該化合物包括與靶RNA互補(例如基本上及/或精確互補)的核苷酸序列。靶RNA可為內源性人類基因之轉錄物。在一個實施例中，siRNA化合物(a)長度為19-25個核苷酸，例如21-23個核苷酸，(b)與內源性靶RNA互補，且任擇地，(c)包括至少一個1-5 nt長的3'突出端。在一個實施例中，醫藥組合物可為乳液、微乳液、乳膏、膠凍或脂質體。
在一個實例中，醫藥組合物包括與局部遞送劑混合之siRNA化合物。局部遞送劑可為多個微觀囊泡。微觀囊泡可為脂質體。在一些實施例中，脂質體為陽離子脂質體。
在另一個態樣中，醫藥組合物包括siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前體，例如可加工成ssiRNA化合物之較大siRNA化合物，或編碼siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前體之DNA)與局部滲透增強劑混合。在一個實施例中，局部滲透增強劑為脂肪酸。脂肪酸可為花生四烯酸、油酸、月桂酸、羊脂酸、羊蠟酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、或C1-10 烷基酯、單酸甘油酯、二酸甘油酯或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一個實施例中，局部滲透增強劑為膽汁鹽。膽汁鹽可為膽酸、去氫膽酸、去氧膽酸、谷胺膽酸、甘胺膽酸、甘胺去氧膽酸、牛膽酸、牛去氧膽酸、鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸、牛磺酸-24,25-二氫-夫西地酸鈉、二醇二氫夫西地酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂基醚或其醫藥學上可接受之鹽。
在另一個實施例中，滲透增強劑為螯合劑。螯合劑可為EDTA、檸檬酸、水楊酸鹽、膠原蛋白之N-醯基衍生物、月桂醇醚-9、β-二酮之N-胺基醯基衍生物或其混合物。
在另一個實施例中，滲透增強劑為界面活性劑，例如離子或非離子界面活性劑。界面活性劑可為月桂基硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-十六烷基醚、全氟化學乳液或其混合物。
在另一個實施例中，滲透增強劑可選自由不飽和環脲、1-烷基-烷酮、1-烯基氮雜環-丙烷酮、類固醇消炎劑及其混合物組成之群。在另一個實施例中，滲透增強劑可為二醇、吡咯、氮酮或萜烯。
在一個態樣中，本發明之特徵在於呈適於經口遞送之形式的醫藥組合物，其包括siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前體，例如可加工成ssiRNA化合物之較大siRNA化合物，或編碼siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前體之DNA)。在一個實施例中，經口遞送可用於將siRNA化合物組合物遞送至胃腸道之細胞或區域，例如小腸、結腸(例如治療結腸癌)等等。經口遞送形式可為錠劑、膠囊或凝膠膠囊。在一個實施例中，醫藥組合物之siRNA化合物調節細胞黏附蛋白之表現，調節細胞增殖速率，或具有針對真核病原體或反轉錄病毒之生物活性。在另一個實施例中，醫藥組合物包括腸溶材料，其基本上防止錠劑、膠囊或凝膠膠囊在哺乳動物胃中溶解。在一些實施例中，腸溶材料為包衣。包衣可為乙酸鄰苯二甲酸酯、丙二醇、脫水山梨糖醇單油酸酯、乙酸偏苯三酸纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯或乙酸鄰苯二甲酸纖維素。
在另一個實施例中，醫藥組合物之口服劑型包括滲透增強劑。滲透增強劑可為膽汁鹽或脂肪酸。膽汁鹽可為熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸及其鹽。脂肪酸可為羊蠟酸、月桂酸及其鹽。
在另一個實施例中，醫藥組合物之口服劑型包括賦形劑。在一個實例中，賦形劑為聚乙二醇。在另一個實例中，賦形劑為precirol。
在另一個實施例中，醫藥組合物之口服劑型包括塑化劑。塑化劑可為鄰苯二甲酸二乙酯、三乙酸甘油酯癸二酸二丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯或檸檬酸三乙酯。
在一個態樣中，本發明之特徵在於包括siRNA化合物及遞送媒劑之醫藥組合物。在一個實施例中，siRNA化合物(a)長度為19-25個核苷酸，例如21-23個核苷酸，(b)與內源性靶RNA互補，且任擇地，(c)包括至少一個1-5 nt長的3'突出端。
在一個實施例中，遞送媒劑可藉由局部投與途徑將siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前體，例如可加工成ssiRNA化合物之較大siRNA化合物，或編碼siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前體之DNA)遞送至細胞。遞送媒劑可為微觀囊泡。在一個實例中，微觀囊泡為脂質體。在一些實施例中，脂質體為陽離子脂質體。在另一個實例中，微觀囊泡為微胞。在一個態樣中，本發明之特徵在於呈可注射劑型之醫藥組合物，其包括siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前體，例如可加工成ssiRNA化合物之較大siRNA化合物，或編碼siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前體之DNA)。在一個實施例中，醫藥組合物之可注射劑型包括無菌水溶液或分散液及無菌粉末。在一些實施例中，無菌溶液可包括稀釋劑，諸如水；生理食鹽水溶液；不揮發性油、聚乙二醇、甘油或丙二醇。
在一個態樣中，本發明之特徵在於呈口服劑型之醫藥組合物，其包括siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前體，例如可加工成ssiRNA化合物之較大siRNA化合物，或編碼siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前體之DNA)。在一個實施例中，口服劑型係選自由錠劑、膠囊及凝膠膠囊組成之群。在另一個實施例中，醫藥組合物包括腸溶材料，其基本上防止錠劑、膠囊或凝膠膠囊在哺乳動物胃中溶解。在一些實施例中，腸溶材料為包衣。包衣可為乙酸鄰苯二甲酸酯、丙二醇、脫水山梨糖醇單油酸酯、乙酸偏苯三酸纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯或乙酸鄰苯二甲酸纖維素。在一個實施例中，醫藥組合物之口服劑型包括滲透增強劑，例如本文所述之滲透增強劑。
在另一個實施例中，醫藥組合物之口服劑型包括賦形劑。在一個實例中，賦形劑為聚乙二醇。在另一個實例中，賦形劑為precirol。
在另一個實施例中，醫藥組合物之口服劑型包括塑化劑。塑化劑可為鄰苯二甲酸二乙酯、三乙酸甘油酯癸二酸二丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯或檸檬酸三乙酯。
在一個態樣中，本發明之特徵在於呈直腸劑型之醫藥組合物，其包括siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前體，例如可加工成ssiRNA化合物之較大siRNA化合物，或編碼siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前體之DNA)。在一個實施例中，直腸劑型為灌腸劑。在另一個實施例中，直腸劑型為栓劑。
在一個態樣中，本發明之特徵在於呈陰道劑型之醫藥組合物，其包括siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前體，例如可加工成ssiRNA化合物之較大siRNA化合物，或編碼siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前體之DNA)。在一個實施例中，陰道劑型為栓劑。在另一個實施例中，陰道劑型為泡沫、乳膏或凝膠。
在一個態樣中，本發明之特徵在於呈經肺或經鼻劑型之醫藥組合物，其包括siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前體，例如可加工成ssiRNA化合物之較大siRNA化合物，或編碼siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前體之DNA)。在一個實施例中，將siRNA化合物併入粒子中，例如大粒子，例如微球體。粒子可藉由噴霧乾燥、凍乾、蒸發、流化床乾燥、真空乾燥或其組合來產生。微球體可調配為懸浮液、粉末或可植入固體。治療方法及遞送途徑
本發明之另一態樣係關於降低細胞中靶基因之表現的方法，其包含使該細胞與本發明之雙股iRNA劑接觸。在一個實施例中，細胞為肝外細胞。
本發明之另一態樣係關於降低個體體內之靶基因表現的方法，其包含向該個體投與本發明之雙股iRNA劑。
本發明之另一態樣係關於治療患有CNS病症之個體的方法，其包含向該個體投與治療有效量之本發明之雙股RNAi劑，從而治療該個體。可藉由本發明之方法治療的例示性CNS病症包括阿茲海默病、肌萎縮性側索硬化(ALS)、額顳葉型癡呆、亨廷頓病、帕金森病、脊髓小腦病、朊病毒病及拉福拉病。
本發明之雙股iRNA劑可藉由多種途徑遞送至個體，其視所靶向之基因的類型及待治療之病症的類型而定。在一些實施例中，雙股iRNA劑係肝外投與，諸如眼部投與(例如玻璃體內投與)或鞘內投與。
在一個實施例中，雙股iRNA劑係鞘內投與。藉由鞘內投與雙股iRNA劑，該方法可降低腦或脊柱組織(例如皮質、小腦、頸椎、腰椎及胸椎)中之靶基因表現。
在一些實施例中，例示性靶基因為APP、ATXN2、C9orf72、TARDBP、MAPT(Tau)、HTT、SNCA、FUS、ATXN3、ATXN1、SCA1、SCA7、SCA8、MeCP2、PRNP、SOD1、DMPK及TTR。為了降低個體體內之此等靶基因的表現，可玻璃體內投與雙股iRNA劑。藉由玻璃體內投與雙股iRNA劑，該方法可降低眼組織中之靶基因表現。
為了便於說明，此部分中之調配物、組合物及方法主要針對經修飾之siRNA化合物進行論述。然而，可理解，此等調配物、組合物及方法可用其他siRNA化合物，例如未修飾之siRNA化合物加以實踐，且此類實踐在本發明內。包括iRNA之組合物可藉由多種途徑遞送至個體。例示性途徑包括：靜脈內、局部、直腸、肛門、陰道、經鼻、經肺、經眼。
本發明之iRNA分子可併入適於投與之醫藥組合物中。此類組合物通常包括一或多個iRNA物種及醫藥學上可接受之載劑。如本文所用，語言「醫藥學上可接受之載劑」意欲包括與醫藥投與相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。此類介質及藥劑用於醫藥活性物質之用途為此項技術中所熟知。除非任何習知介質或藥劑與活性化合物不相容，否則考慮將其用於組合物中。補充活性化合物亦可併入組合物中。
本發明之醫藥組合物可以多種方式投與，其視是否需要局部或全身治療及待治療之區域而定。投與可為局部(包括眼部、陰道、直腸、鼻內、經皮)、經口或非經腸的。非經腸投與包括靜脈內滴注，皮下、腹膜內或肌肉內注射，或鞘內或心室內投與。
可選擇投與途徑及位點以增強靶向。舉例而言，為了靶向肌肉細胞，肌肉內注射至感興趣的肌肉中將為合乎邏輯的選擇。藉由以氣溶膠形式投與iRNA可靶向肺細胞。可藉由用iRNA塗覆球囊導管且以機械方式引入DNA來靶向血管內皮細胞。
用於局部投與之調配物可包括經皮貼片、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體及粉末。習知醫藥載劑、水性、粉末或油性基質、增稠劑及其類似物可為必需或合乎需要的。經塗佈之保險套、手套及其類似物亦可為有用的。
用於經口投與之組合物包括粉末或顆粒、於水中之懸浮液或溶液、糖漿、酏劑或非水性介質、錠劑、膠囊、口含錠或糖衣錠。在錠劑之情況下，可使用之載劑包括乳糖、檸檬酸鈉及磷酸鹽。各種崩解劑諸如澱粉及潤滑劑諸如硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉及滑石常用於錠劑中。對於膠囊形式之經口投與，有用的稀釋劑為乳糖及高分子量聚乙二醇。當經口使用需要水性懸浮液時，核酸組合物可與乳化劑及懸浮劑組合。若需要，可添加某些甜味劑及/或調味劑。
用於鞘內或心室內投與之組合物可包括無菌水溶液，其亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他適合之添加劑。
用於非經腸投與之調配物可包括無菌水溶液，其亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他適合之添加劑。心室內注射可藉由例如附接至儲集器之心室內導管來促進。對於靜脈內使用，可控制溶質之總濃度以使製劑等張。
對於眼部投與，軟膏或可滴注液體可藉由此項技術已知的眼部遞送系統遞送，諸如施用器或滴眼器。此類組合物可包括黏液模擬物諸如玻尿酸、硫酸軟骨素、羥丙基甲基纖維素或聚(乙烯醇)，防腐劑諸如山梨酸、EDTA或苄基氯化銨，及常用量之稀釋劑及/或載劑。
在一個實施例中，siRNA化合物(例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物)、組合物之投與為非經腸的，例如靜脈內(例如，以推注或可擴散的輸注形式)、皮內、腹膜內、肌肉內、鞘內、心室內、顱內、皮下、經黏膜、頰內、舌下、內視鏡檢、直腸、經口、陰道、局部、經肺、鼻內、尿道或眼部。投與可由個體或另一個人(例如健保提供者)提供。藥物可以量測之劑量或在遞送計量劑量之施配器中提供。下文更詳細地論述所選遞送模式。
鞘內投與。 在一個實施例中，雙股iRNA劑係藉由鞘內注射(亦即注射至沐浴腦及脊髓組織之脊髓液中)來遞送。將iRNA劑鞘內注射至脊髓液中可以推注注射形式或經由微型泵來進行，該等微型泵可植入皮膚下方，從而提供定期且恆定的siRNA遞送至脊髓液中。脊髓液自產生其之脈絡叢向下循環至脊髓及背根神經節周圍且隨後向上通過小腦及皮質達到蜘蛛膜顆粒，在此處液體可離開CNS，其視所注射之化合物的尺寸、穩定性及溶解度而定，鞘內遞送之分子可在整個CNS中擊中靶標。
在一些實施例中，鞘內投與係經由泵。泵可為手術植入的滲透泵。在一個實施例中，將滲透泵植入椎管之蜘蛛膜下腔以促進鞘內投與。
在一些實施例中，鞘內投與係經由醫藥之鞘內遞送系統，其包括含有一定體積藥劑的儲集器及經組態以遞送儲集器中所含之一部分藥劑的泵。關於此鞘內遞送系統之更多細節可見於2015年1月28日提交的PCT/US2015/013253，其以全文引用的方式併入本文中。
鞘內注射之iRNA劑之量可自一種靶基因至另一種靶基因而變化，且必須針對各靶基因單獨確定必須施用的適當量。通常，此量範圍介於10 μg至2 mg，較佳50 μg至1500 μg，更佳100 μg至1000 μg。
直腸投與。 本發明亦提供用於直腸投與或遞送本文所述之siRNA化合物的方法、組合物及套組。
因此，本文所述之siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前體，例如可加工成ssiRNA化合物之較大siRNA化合物，或編碼siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前體之DNA)，例如治療有效量之本文所述之siRNA化合物，例如具有少於40且例如少於30個核苷酸之雙股區且具有一或二個1-3個核苷酸之單股3'突出物的siRNA化合物可經直腸投與，例如經由直腸引入下結腸或上結腸。此方法特別適用於治療發炎性病症、以不需要的細胞增殖為特徵之病症，例如息肉或結腸癌。
藥物可藉由引入施配裝置遞送至結腸中之部位，該施配裝置為例如與用於檢查結腸或移除息肉類似之可撓性攝影機引導裝置，其包括用於遞送藥物之構件。
siRNA化合物之直腸投與係藉助於灌腸劑。灌腸劑之siRNA化合物可溶解於生理食鹽水或緩衝溶液中。直腸投與亦可藉助於栓劑，其可包括其他成分，例如賦形劑，例如可可脂或羥丙基甲基纖維素。
眼部遞送。 本文所述之iRNA劑可投與至眼組織。舉例而言，藥物可施用於眼睛表面或附近組織，例如眼瞼內側。其可例如藉由噴霧、滴劑、作為洗眼劑或軟膏局部施用。投與可由個體或另一個人(例如健保提供者)提供。藥物可以量測之劑量或在遞送計量劑量之施配器中提供。藥物亦可投與至眼睛內部，且可藉由針或可將藥物引入所選區域或結構之其他遞送裝置引入。眼部治療特別適用於治療眼睛或附近組織的炎症。
在某些實施例中，雙股iRNA劑可藉由眼組織注射，諸如眼周、結膜、筋膜下、前房內、玻璃體內、眼內、前或後近鞏膜、視網膜下、結膜下、眼球後或小管內注射；藉由使用導管或其他置放裝置(諸如視網膜小丸、眼內插入物、栓劑或包含多孔、無孔或膠狀材料之植入物)直接施用；藉由局部眼滴劑或軟膏；或藉由盲管或鄰近鞏膜植入(經鞏膜)或鞏膜中(鞏膜內)或眼內之緩慢釋放裝置直接遞送至眼。前房內注射可通過角膜進入前房，以使藥劑到達小樑網。小管內注射可進入靜脈收集器通道，從而排出施累姆氏管(Schlemm's canal)或進入施累姆氏管。
在一個實施例中，雙股iRNA劑可諸如使用以準備注射形式供醫務人員使用之預填充注射器，藉由玻璃體內注射投與至眼睛中，例如眼睛之玻璃體房。
對於眼科遞送，雙股iRNA劑可與眼科學上可接受之防腐劑、共溶劑、界面活性劑、黏度增強劑、滲透增強劑、緩衝劑、氯化鈉或水組合以形成水性無菌眼用懸浮液或溶液。溶液調配物可藉由將接合物溶解於生理學上可接受之等張水性緩衝液中來製備。另外，溶液可包括可接受之界面活性劑以幫助溶解雙股iRNA劑。可將黏度構成劑，諸如羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮或其類似物添加至醫藥組合物中以改良雙股iRNA劑之保留。
為了製備無菌眼用軟膏調配物，將雙股iRNA劑與防腐劑在適當媒劑(諸如礦物油、液體羊毛蠟或白凡士林)中組合。無菌眼用凝膠調配物可根據此項技術中已知之方法，藉由將雙股iRNA劑懸浮於由例如CARBOPOL®-940 (BF Goodrich, Charlotte, N.C.)或其類似物之組合製備的親水性基質中來製備。
局部遞送。 本文所述之任何siRNA化合物可直接投與至皮膚。舉例而言，藥物可局部施用或遞送至皮膚層中，例如藉由使用微針或一組微針，其穿透至皮膚中，但例如不進入下面的肌肉組織。siRNA化合物組合物之投與可為局部的。局部施用可例如將組合物遞送至個體之真皮或表皮。局部投與可為經皮貼片、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體或粉末形式。用於局部投與之組合物可調配為脂質體、微胞、乳液或其他親脂性分子組裝體。經皮投與可與至少一種滲透增強劑一起應用，諸如離子導入療法、超音波藥物透入療法及超音波電滲法。
為了便於說明，此部分中之調配物、組合物及方法主要針對經修飾之siRNA化合物進行論述。然而，可理解，此等調配物、組合物及方法可用其他siRNA化合物，例如未修飾之siRNA化合物加以實踐，且此類實踐在本發明內。在一些實施例中，siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前體，例如可加工成ssiRNA化合物之較大siRNA化合物，或編碼siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前體之DNA)係經由局部投與遞送至個體。「局部投與」係指藉由使調配物直接與個體表面接觸而遞送至個體。最常見的局部遞送形式係至皮膚，但本文所揭示之組合物亦可直接施用於身體之其他表面，例如眼睛、黏膜、體腔表面或內表面。如上文所提及，最常見的局部遞送係至皮膚。該術語涵蓋數種投藥途徑，包括但不限於局部及經皮。此等投與模式通常包括滲透皮膚之滲透性障壁且有效遞送至靶組織或層。局部投與可用作穿透表皮及真皮且最終實現組合物之全身遞送的手段。局部投與亦可用作將寡核苷酸選擇性遞送至個體之表皮或真皮，或其特定層，或下層組織的手段。
如本文所用，術語「皮膚」係指動物的表皮及/或真皮。哺乳動物皮膚由二個主要的不同層組成。皮膚之外層稱為表皮。表皮由角質層、顆粒層、棘層及基層構成，其中角質層位於皮膚表面且基層為表皮之最深部分。表皮之厚度在50 μm與0.2 mm之間，視其在身體上之位置而定。
表皮下方為真皮，其明顯比表皮厚。真皮主要由纖維束形式之膠原蛋白構成。膠原束尤其為血管、淋巴毛細管、腺體、神經末梢及免疫活性細胞提供支持。
皮膚作為器官之主要功能之一為調節物質進入體內。皮膚之主要滲透障壁由角質層提供，角質層由處於各種分化狀態的多層細胞形成。角質層中之細胞間的空隙用不同的脂質填充，該等脂質以網格狀形式排列，提供密封以進一步增強皮膚滲透性障壁。
由皮膚提供之滲透性障壁使其對分子量大於約750 Da之分子很大程度上為不可滲透的。對於較大分子穿過皮膚的滲透性障壁，必須使用除正常滲透以外的機制。
數個因素決定皮膚對所投與之藥劑的滲透性。此等因素包括經治療之皮膚的特徵、遞送劑之特徵、藥物及遞送劑與藥物及皮膚之間的相互作用、所施用之藥物的劑量、治療形式及後治療方案。為了選擇性靶向表皮及真皮，有時可調配包含一或多種滲透增強劑之組合物，該一或多種滲透增強劑使得藥物能夠滲透至預先選擇的層中。
經皮傳遞為用於投與脂溶性治療劑之有價值的途徑。真皮比表皮更具滲透性，因此經由磨損、燒傷或裸露的皮膚吸收快得多。增加血液流向皮膚之炎症及其他生理條件亦增強經皮吸附。經由此途徑之吸收可藉由使用油性媒劑(塗油)或經由使用一或多種滲透增強劑來增強。經由經皮途徑遞送本文所揭示之組合物的其他有效方式包括皮膚之水合及控制釋放局部貼片的使用。經皮途徑提供遞送本文所揭示之組合物用於全身及/或局部療法的潛在有效手段。
另外，離子導入療法(在電場影響下穿過生物膜轉移離子溶質) (Lee等人, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 第163頁)、超音波藥物透入療法或超音波電滲法(使用超音波增強各種治療劑跨越生物膜，特別是皮膚及角膜的吸收) (Lee等人, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 第166頁)及相對於劑量位置及在投與部位處之保留之媒劑特徵的最佳化(Lee等人, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 第168頁)可為用於增強局部施用之組合物跨越皮膚及黏膜部位之轉運的有用方法。
所提供之組合物及方法亦可用於活體外檢查各種蛋白質及基因在培養或保存的真皮組織中及動物體內的功能。因此，本發明可用於檢查任何基因的功能。本發明之方法亦可在治療上或預防上使用。舉例而言，用於治療已知或疑似罹患以下疾病之動物：諸如牛皮癬、扁平苔癬、中毒性表皮壞死溶解、多形性紅斑、基底細胞癌、鱗狀細胞癌、惡性黑素瘤、佩吉特氏病(Paget's disease)、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、肺纖維化、萊姆病(Lyme disease)及皮膚之病毒、真菌及細菌感染。
肺部遞送。 本文所述之任何siRNA化合物可投與至肺部系統。肺部投與可藉由吸入或藉由將遞送裝置引入肺部系統，例如藉由引入可施配藥物之遞送裝置來實現。某些實施例可使用藉由吸入之肺部遞送方法。藥物可提供於施配器中，該施配器以足夠小的形式遞送藥物(例如濕的或乾的)，以使其可被吸入。該裝置可遞送計量劑量之藥物。個體或另一個人可投與藥物。肺部遞送不僅對直接影響肺部組織之病症有效，且亦對影響其他組織之病症有效。siRNA化合物可調配為用於肺部遞送之液體或非液體，例如粉末、晶體或氣溶膠。
為了便於說明，此部分中之調配物、組合物及方法主要針對經修飾之siRNA化合物進行論述。然而，可理解，此等調配物、組合物及方法可用其他siRNA化合物，例如未修飾之siRNA化合物加以實踐，且此類實踐在本發明內。包括siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前體，例如可加工成ssiRNA化合物之較大siRNA化合物，或編碼siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前體之DNA)的組合物可藉由肺部遞送投與個體。肺部遞送組合物可藉由患者吸入分散體來遞送，使得分散體內之組合物(例如iRNA)可到達肺，在此處其可容易地經由肺泡區直接吸收至血液循環中。肺部遞送對於全身遞送及治療肺病之局部遞送可為有效的。
肺部遞送可藉由不同方法來實現，包括使用基於霧化、氣溶膠化、微胞化及乾燥粉末之調配物。遞送可藉由液體噴霧器、基於氣溶膠之吸入器及乾粉分散裝置來實現。可使用計量劑量裝置。使用霧化器或吸入器的益處之一為將污染的可能性降至最低，因為該等裝置為獨立的。舉例而言，乾粉分散裝置遞送可容易地調配為乾粉之藥物。iRNA組合物可作為凍乾或噴霧乾燥粉末單獨或與適合之粉末載體組合穩定地儲存。用於吸入之組合物的遞送可藉由給藥定時元件來介導，其可包括定時器、劑量計數器、時間量測裝置或時間指示器，當併入裝置中時能夠在氣溶膠藥物投與期間實現劑量追蹤、順應性監測及/或劑量觸發患者。
術語「粉末」意謂由細分散之固體粒子組成的組合物，該等粒子自由流動且能夠容易地分散於吸入裝置中並隨後由個體吸入，使得粒子到達肺以允許滲透至肺泡中。因此，該粉末稱為「可吸入的」。舉例而言，平均粒度為直徑小於約10 μm，具有相對均一的球形分佈。在一些實施例中，直徑小於約7.5微米且在一些實施例中小於約5.0 μm。通常，粒度分佈為直徑在約0.1 μm與約5 μm之間，有時為約0.3 μm至約5 μm。
術語「乾燥」意謂組合物之水分含量低於約10重量% (% w)水，通常低於約5% w且在一些情況下低於約3% w。乾燥組合物可使得粒子易於分散在吸入裝置中以形成氣溶膠。
術語「治療有效量」為組合物中存在的在待治療之個體中提供所需水準之藥物以得到預期生理反應所需的量。
術語「生理學有效量」為遞送至個體以得到所需緩解性或治癒性效應的量。
術語「醫藥學上可接受之載劑」意謂可進入肺而對肺沒有顯著不良毒理作用的載劑。
可用作載劑之醫藥賦形劑的類型包括穩定劑，諸如人類血清白蛋白(HSA)；增積劑，諸如碳水化合物、胺基酸及多肽；pH調節劑或緩衝劑；鹽，諸如氯化鈉；及其類似物。此等載劑可呈結晶或非晶形式，或可為二者之混合物。
特別有價值的增積劑包括相容性碳水化合物、多肽、胺基酸或其組合。適合之碳水化合物包括單糖，諸如半乳糖、D-甘露糖、山梨糖及其類似物；二糖，諸如乳糖、海藻糖及其類似物；環糊精，諸如2-羥丙基-β-環糊精；及多糖，諸如棉子糖、麥芽糊精、葡聚糖及其類似物；醛醣醇，諸如甘露糖醇、木糖醇及其類似物。一組碳水化合物可包括乳糖、海藻糖、棉子糖麥芽糊精及甘露糖醇。適合之多肽包括阿斯巴甜糖。胺基酸包括丙胺酸及甘胺酸，在一些實施例中使用甘胺酸。
可包括添加劑，其為本發明組合物之次要組分，用於噴霧乾燥期間之構形穩定性及改良粉末之分散性。此等添加劑包括疏水性胺基酸，諸如色胺酸、酪胺酸、白胺酸、苯丙胺酸及其類似物。
適合之pH調節劑或緩衝劑包括由有機酸及鹼製備的有機鹽，諸如檸檬酸鈉、抗壞血酸鈉及其類似物；在一些實施例中可使用檸檬酸鈉。
微胞iRNA調配物之肺部投與可經由計量劑量噴霧裝置來實現，該等裝置具有推進劑，諸如四氟乙烷、七氟乙烷、二甲基氟丙烷、四氟丙烷、丁烷、異丁烷、二甲醚及其他非CFC及CFC推進劑。
經口或經鼻遞送。 本文所述之任何siRNA化合物可例如以錠劑、膠囊、凝膠膠囊、口含錠、糖衣錠或液體糖漿形式經口投與。另外，該組合物可局部施用於口腔表面。
本文所述之任何siRNA化合物可經鼻投與。經鼻投與可藉由將遞送裝置引入鼻中來實現，例如藉由引入可施配藥物之遞送裝置。經鼻遞送之方法包括噴霧劑、氣溶膠、液體(例如藉由滴劑)，或藉由局部投與至鼻腔表面。藥物可提供於施配器中，該施配器以足夠小的形式遞送藥物(例如濕的或乾的)，以使其可被吸入。該裝置可遞送計量劑量之藥物。個體或另一個人可投與藥物。
經鼻遞送不僅對直接影響鼻組織之病症有效，且亦對影響其他組織之病症有效。siRNA化合物可調配為液體或非液體，例如粉末、晶體或用於經鼻遞送。如本文所用，術語「結晶」描述具有晶體結構或特徵之固體，亦即三維結構之粒子，其中平面以特定角度相交且其中存在規則的內部結構。本發明之組合物可具有不同的結晶型。結晶型可藉由多種方法製備，包括例如噴霧乾燥。
為了便於說明，此部分中之調配物、組合物及方法主要針對經修飾之siRNA化合物進行論述。然而，可理解，此等調配物、組合物及方法可用其他siRNA化合物，例如未修飾之siRNA化合物加以實踐，且此類實踐在本發明內。口腔膜及鼻膜均提供優於其他投與途徑之優點。舉例而言，經由此等膜投與之藥物快速起效，提供治療性血漿水準，避免肝臟代謝之首過效應且避免藥物暴露於惡劣的胃腸(GI)環境。額外優點包括容易進入膜位點，從而可容易地施用、定位及移除藥物。
在經口遞送中，組合物可靶向口腔表面，例如舌下黏膜，其包括舌頭腹面之膜及口腔底部，或構成面頰內層之頰黏膜。舌下黏膜相對可滲透，因此許多藥物具有快速吸收及可接受之生體可用率。另外，舌下黏膜方便，可接受且易於接近。
分子滲透通過口腔黏膜之能力似乎與分子大小、脂溶性及肽蛋白電離相關。小於1000道爾頓之小分子似乎迅速穿過黏膜。隨著分子大小增加，滲透性迅速下降。脂溶性化合物比非脂溶性分子更具滲透性。當分子未電離或電荷中性時，發生最大吸收。因此帶電分子對通過口腔黏膜之吸收提出最大的挑戰。
iRNA之醫藥組合物亦可藉由自計量劑量噴霧施配器將如上所述之混合微胞醫藥調配物及推進劑噴霧至頰腔中而不吸入來投與至人類之頰腔。在一個實施例中，首先震盪施配器，隨後將醫藥調配物及推進劑噴霧至頰腔中。舉例而言，藥物可噴霧至頰腔中或例如以液體、固體或凝膠形式直接施用至頰腔中之表面。此投與特別適用於治療頰腔(例如牙齦或舌頭)之炎症，例如在一個實施例中，頰內投與係藉由自施配器，例如施配醫藥組合物及推進劑之計量劑量噴霧施配器噴霧至頰腔中而例如不吸入。
本發明之一個態樣亦關於將寡核苷酸藉由鞘內遞送而遞送至CNS中或藉由玻璃體內遞送至眼組織中的方法。
一些實施例係關於降低細胞中靶基因之表現的方法，其包含使該細胞與具有一或多個任擇地經由連接子或載體與寡核苷酸接合之親脂性部分的寡核苷酸接觸。在一個實施例中，細胞為CNS系統中之細胞。在一個實施例中，細胞為眼細胞。
一些實施例係關於降低個體體內之靶基因表現的方法，其包含向該個體投與具有一或多個任擇地經由連接子或載體與寡核苷酸接合之親脂性部分的寡核苷酸。在一個實施例中，寡核苷酸結合物係鞘內投與(以降低腦或脊柱組織中靶基因之表現)。在一個實施例中，寡核苷酸結合物係玻璃體內投與(以降低眼組織中靶基因之表現)。
在一些實施例中，寡核苷酸為雙股的。在一個實施例中，寡核苷酸為雙股iRNA劑，其包含與靶基因互補之反義股及與該反義股互補之義股。
在一些實施例中，寡核苷酸為單股的。在一個實施例中，寡核苷酸為反義的。
在一些實施例中，親脂性部分與寡核苷酸之至少一股上的一或多個內部位置接合。在一些實施例中，親脂性部分與寡核苷酸之至少一股上的一或多個末端位置接合。套組
在某些其他態樣中，本發明提供包括適合容器之套組，該容器含有siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前體，例如可加工成ssiRNA化合物之較大siRNA化合物，或編碼siRNA化合物，例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前體之DNA)的醫藥調配物。在某些實施例中，醫藥調配物之各個組分可提供於一個容器中。或者，可能需要分別在二個或更多個容器中提供醫藥調配物之組分，例如一個容器用於siRNA化合物製劑，且至少另一個用於載體化合物。套組可以許多不同的組態封裝，諸如單盒中之一或多個容器。可例如根據套組提供之說明書組合不同的組分。可根據本文所述之方法組合組分，例如以製備及投與醫藥組合物。套組亦可包括遞送裝置。
藉由以下實例進一步說明本發明，該等實例不應理解為進一步限制性的。本申請案通篇引用之所有參考文獻、申請中的專利申請案及公開專利的內容特此以引用的方式明確地併入。實例
現已大體描述本發明，參考以下實例將更容易理解本發明，該等實例僅用於說明本發明之某些態樣及實施例的目的而包括，且不意欲限制本發明。實例 1 ：用於合成親脂性接合物之核苷胺基磷酸酯的合成 方案1
Figure 02_image279
化合物201 之合成 ：將氫化鈉(NaH) (21 g)添加至含2,6-二胺基9-(B-D-呋喃核糖基)嘌呤200 (105 g)之無水二甲基甲醯胺(DMF) (1500 ml)中。攪拌30分鐘後，添加1-溴十六烷(150 ml)。將溶液在室溫下攪拌隔夜，且隨後藉由添加乙醇(EtOH) (50 ml)淬滅。真空蒸發反應混合物，且將殘餘物懸浮於二氯甲烷中且使用5-10% MeOH/CH2 Cl2 作為溶離劑，藉由矽膠層析來純化。合併含有產物之溶離份且汽提溶劑，得到粗泡沫201 (95 g)。
化合物203 之合成 ：將上述泡沫(95g)及腺苷脫胺酶(2000 mg，Sigma Chemicals Type II)在室溫下在0.1 M tris緩衝液(1500 ml，pH 7.4)、DMSO (1000 ml)及0.1 M磷酸鈉緩衝劑(100 ml)中攪拌隔夜。再添加含腺苷脫胺酶(140 mg)之0.1 M磷酸鹽緩衝液(30 mL)及DMSO (20 ml)的等分試樣，且攪拌反應物10天。真空蒸發溶劑且使用0-10% MeOH/CH2 Cl2 對殘餘物進行矽膠急驟層析。真空蒸發含有產物之溶離份，得到固體203 (35 g)。
化合物204 之合成 ：將含上述固體(35 g)之吡啶(500 ml)在冰浴中冷卻且添加氯化三甲基矽烷(84 ml)。將反應混合物攪拌30分鐘且添加異丁醯氯(58 ml)。將溶液攪拌4小時以達到室溫。藉由添加H2 O (100 ml)冷卻溶液，且將溶液再攪拌30分鐘。添加濃NH4 -OH (100 ml)且真空蒸發溶液。使用0-5% MeOH/DCM，藉由矽膠層析純化殘餘物，以溶離產物。蒸發含產物之溶離份，得到25 g呈泡沫狀之產物204 。
化合物205 之合成 ：將N2-異丁醯基-2'-O-十六烷基鳥苷204 (25 g)與吡啶一起共蒸發且隨後溶解於吡啶(180 ml)中。在室溫下在攪拌下添加二甲氧基三苯甲基氯(20 g)及二甲胺基吡啶(50mg)。將反應混合物攪拌隔夜且真空蒸發。使殘餘物分配於CH2 C12 /NaHCO3 水溶液之間。將有機相乾燥(MgSO4 )且蒸發。藉由矽膠層析(1:1 EtOAc/己烷)純化殘餘物，得到30 g產物205 。
化合物206 之合成 ：將上述固體205 (30 g)、雙-(N,N-二異丙基胺基)-2-氰基乙基亞磷酸酯(20 g)及N,N-二異丙基四唑銨(10 g)在室溫下攪拌隔夜。將溶液相對於NaHCO3 水溶液分配且經MgSO4 乾燥。真空蒸發溶劑且藉由矽膠層析(1% TEA在EtOAc中)純化殘餘物，得到29 g呈泡沫狀之產物206 。1 H NMR (500 MHz, 乙腈-d3) δ 7.84 (d, J = 11.1 Hz, 1H), 7.45 (dd, J = 7.7, 5.7 Hz, 2H), 7.33 (dd, J = 9.0, 7.1 Hz, 4H), 7.27 (m, 2H), 7.22 (dd, J = 8.5, 6.0 Hz, 1H), 6.83 (m, 4H), 5.89 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 4.64 (m, 1H), 4.47 (m, 1H), 4.27 (m, 1H), 3.92 - 3.77 (m, 1H), 3.75 (d, J = 2.3 Hz, 6H), 3.72 - 3.66 (m, 1H), 3.62 (m, 3H), 3.49 (m, 1H), 3.37 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 3.33 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 2.67 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 2.58 - 2.41 (m, 2H), 1.48 (m, 2H), 1.34 - 1.14 (m, 35H), 1.14 - 1.02 (m, 9H), 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 3H)。31 P NMR (202 MHz, 乙腈-d3) δ 151.11, 150.93。 方案2
Figure 02_image281
化合物208 之合成： 將氫化鈉(NaH) (25 g)添加至含2,6-二胺基9-(B-D-呋喃核糖基)嘌呤207 (125 g)之無水二甲基甲醯胺(DMF) (1500 ml)中。攪拌30分鐘後，添加1-溴十六烷(180 gl)。將溶液在室溫下攪拌隔夜，且隨後藉由添加乙醇(EtOH) (50 ml)淬滅。真空蒸發反應混合物，且將殘餘物懸浮於二氯甲烷中且使用0-10% MeOH/CH2 Cl2 作為溶離劑，藉由矽膠層析來純化。合併含有產物之溶離份且汽提溶劑，得到呈泡沫狀之產物208 (36 g)。
化合物209 之合成 ：將含上述固體208 (36 g)之吡啶(500 ml)在冰浴中冷卻且添加氯化三甲基矽烷(30 ml)。將反應混合物攪拌30分鐘且添加苯甲醯氯(20 ml)。將溶液攪拌4小時以達到室溫。藉由添加H2 O (100 ml)冷卻溶液，且將溶液再攪拌30分鐘。添加濃NH4 -OH (100 ml)且真空蒸發溶液。使用0-5% MeOH/CH2 Cl2 ，藉由矽膠層析純化殘餘物，以溶離產物。蒸發含有產物之溶離份，得到32 g呈泡沫狀之產物209 。
化合物210 之合成 ：將N2-苯甲醯基-2'-O-十六烷基腺苷209 (32 g)與吡啶一起共蒸發，且隨後溶解於吡啶(180 ml)中。在室溫下在攪拌下添加二甲氧基三苯甲基氯(20 g)及二甲胺基吡啶(50mg)。將反應混合物攪拌隔夜且真空蒸發。使殘餘物分配於DCM/NaHCO3 水溶液之間。將有機相乾燥(MgSO4 )且蒸發。藉由矽膠層析(1:1 EtOAc/己烷)純化殘餘物，得到35 g產物210 。
化合物211 之合成 ：將上述固體210 (35g)、雙-(N,N-二異丙基胺基)-2-氰基乙基亞磷酸酯(20 g)及N,N-二異丙基四唑銨(10 g)在室溫下攪拌隔夜。將溶液相對於NaHCO3 水溶液分配且經MgSO4 乾燥。真空蒸發溶劑且藉由矽膠層析(1:1 EtOAc/己烷)純化殘餘物，得到37 g呈泡沫狀之產物211 。1 H NMR (500 MHz, 乙腈-d3) δ 9.37 (s, 1H), 8.57 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 8.27 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.52 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.42 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 7.34 - 7.16 (m, 7H), 6.85 - 6.77 (m, 4H), 6.11 (dd, J = 5.0, 2.5 Hz, 1H), 4.80 (m, 1H), 4.69 (m, 1H), 4.32 (m, 1H), 3.97 - 3.78 (m, 1H), 3.74 (d, J = 3.1 Hz, 7H), 3.64 (m, 4H), 3.56 - 3.40 (m, 2H), 3.33 (m, 1H), 2.73 - 2.59 (m, 1H), 2.50 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 1.52 - 1.45 (m, 2H), 1.33 - 1.12 (m, 37H), 1.09 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H)。31 P NMR (202  MHz, 乙腈-d3) δ 151.19, 150.78。 方案3
Figure 02_image283
213 之合成 ：在氬氣氛圍中，向脫水化合物212 (24.0 g，0.1 mol)及DMAP (0.16 g，1.3 mmol)於無水吡啶(120 mL)中之溶液中添加TBDPSCl (28 mL，0.11 mol)。將混合物在室溫下攪拌24小時，之後可藉由TLC (氯仿:甲醇5:1)觀察到無顯著量的起始物質212 。在減壓下移除吡啶，且使殘餘物分配於乙酸乙酯與10%磷酸之間。分離有機相，依次用5% NaCl水溶液及飽和NaCl洗滌，且經無水硫酸鈉乾燥。一旦在水性洗滌期間開始結晶，則添加有限量之DCM以溶解固體。過濾硫酸鈉後，蒸發溶液，將殘餘物與800 mL乙醚一起攪拌2天。過濾白色沈澱物，用乙醚洗滌一次且乾燥，得到40.8 g (85%)呈白色結晶固體狀之213 。
化合物215f 及215g 之合成 ：在裝配有磁性棒、進氣口、回流冷凝器、油加熱浴、加料漏斗及冷凝器頂部之鼓泡器的圓底燒瓶中，在燒瓶充滿Ar之情況下，在高真空下乾燥0.36 mol十六烷-1-醇或油醇約40分鐘。添加無水二乙二醇二甲醚(65 mL)，隨後逐滴添加2M AlMe3 之庚烷溶液(55 mL，0.11 mmol)。將混合物加熱至110℃且藉由甲烷逸出結束監測反應之完全性。將混合物在Ar下冷卻至室溫，隨後添加脫水核苷213 (23.2 g，50 mmol)且在145℃下加熱油浴隔夜。將混合物在Ar下冷卻至室溫且分配於10% H3 PO4 (500 mL)與乙酸乙酯(250 mL)之間。分離有機層，依次用NaCl水溶液(5%)及飽和NaCl洗滌，且經無水Na2 SO4 乾燥。真空移除溶劑，將殘餘物溶解於THF (200 mL)中且用三氫氟化三乙胺(33 mL，0.2 mol)處理。將混合物在Ar下攪拌3天且分配於5% NaCl水溶液(300 mL)與乙酸乙酯(300 mL)之間。分離有機相，用飽和NaCl水溶液洗滌且蒸發溶劑。將殘餘物溶解於己烷(800 mL)中，且用90% MeOH水溶液(2 x 800 mL)萃取。蒸發合併之甲醇萃取物，且將殘餘物分配於乙酸乙酯與飽和NaCl水溶液之間。分離有機相且經無水Na2 SO4 乾燥。蒸發溶劑且藉由矽膠管柱層析，用3%-10%甲醇在DCM中之梯度純化殘餘物，得到10.9 g (47%) 215f (R = C16 H33 )或13.7 g (55%) 215g (R = C18 H35 ，油基)。
化合物216f 之合成 ：在氬氣氛圍中，向脫水化合物215f (10.61 g，22.6 mmol)、DMAP (.550g，4.4 mmol)及DMTrCl (9.76 g，29 mmol)於無水吡啶(70 mL)中之溶液中添加三乙胺(4.1 mL，29 mmol)。將混合物在室溫下攪拌隔夜，藉由添加1 mL MeOH淬滅。真空移除吡啶，且將殘餘物分配於乙酸乙酯與5% NaCl水溶液之間。分離有機相，用飽和NaCl洗滌且經無水硫酸鈉乾燥。真空蒸發溶劑，且在矽膠管柱上用乙酸乙酯在己烷中之梯度(35至60%)層析殘餘物來分離產物，得到14.89 g (86%)呈淡黃色非晶形泡沫狀之216f 。
化合物217f 之合成 ：將化合物216f (25 g)、雙-(N,N-二異丙基胺基)-2-氰基乙基亞磷酸酯(15 g)及N,N-二異丙基四唑銨(7.5 g)在室溫下攪拌隔夜。將溶液相對於NaHCO3 水溶液分配且經MgSO4 乾燥。真空蒸發溶劑且藉由矽膠層析(1:1 EtOAc/己烷)純化殘餘物，得到27 g呈泡沫狀之產物。1 H NMR (500 MHz, 乙腈-d3) δ 9.02 (s, 1H), 7.77 (dd, J = 43.4, 8.1 Hz, 1H), 7.49 - 7.40 (m, 2H), 7.36 - 7.29 (m, 6H), 7.26 (m, 1H), 6.88 (dd, J = 8.7, 6.4 Hz, 4H), 5.85 (dd, J = 7.5, 3.4 Hz, 1H), 5.22 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 4.44 (m, 1H), 4.14 (m, 1H), 4.07 - 3.99 (m, 1H), 3.86 (m, 1H), 3.77 (d, J = 3.1 Hz, 7H), 3.63 (m, 5H), 3.45 - 3.33 (m, 2H), 2.66 (m, 1H), 2.52 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 1.55 (m, 2H), 1.26 (s, 26H), 1.16 (dd, J = 11.0, 6.7 Hz, 9H), 1.05 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H)。31 P NMR (202 MHz, 乙腈-d3) δ 151.01, 150.61。
化合物216a 之合成 ：使用關於216f 所描述之程序，合成化合物216a 。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.37 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.39 - 7.34 (m, 2H), 7.31 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.28 - 7.20 (m, 5H), 6.94 - 6.83 (m, 4H), 5.28 (dd, J = 8.1, 2.2 Hz, 1H), 5.11 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 4.16 (m, 1H), 4.01 - 3.92 (m, 1H), 3.89 (t, J = 4.6 Hz, 1H), 3.73 (s, 6H), 3.55 (m, 2H), 3.30 - 3.18 (m, 2H), 1.54 - 1.43 (m, 2H), 1.33 - 1.15 (m, 6H), 0.83 (t, J = 6.7 Hz, 3H)。
化合物217a 之合成 ：將化合物216a (4.0g，6.35mmol)添加至反應燒瓶中，抽空且用氬氣淨化。將起始物質溶解於二氯甲烷中，且經由注射器添加二異丙基乙胺(2.21ml，12.7mmol)。添加N,N-二異丙基胺基氯磷酸2-氰基乙酯(2.12ml，9.53mmol)且在室溫下攪拌3小時。藉由TLC (70% EtOAc/己烷)檢查反應物，且減壓濃縮反應物。將殘餘物溶解於二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，且將有機層用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌。分離有機層且用鹽水溶液洗滌。隨後分離有機層且經硫酸鈉乾燥。濾出固體且濃縮母液。藉由矽膠急驟層析(30%至100% EtOAc/己烷)純化殘餘物，合併產物溶離份且減壓濃縮，得到(3.42g，65%)216a 。1 H NMR (400 MHz, 乙腈-d3) δ 8.98 (s, 1H), 7.86 - 7.66 (m, 1H), 7.49 - 7.39 (m, 2H), 7.39 - 7.21 (m, 7H), 6.93 - 6.83 (m, 4H), 5.85 (dd, J = 6.2, 3.5 Hz, 1H), 5.22 (dd, J = 8.2, 6.3 Hz, 1H), 4.44 (m, 1H), 4.20 - 3.98 (m, 2H), 3.93 - 3.82 (m, 1H), 3.77 (d, J = 2.4 Hz, 7H), 3.71 - 3.55 (m, 5H), 3.47 - 3.32 (m, 2H), 2.72 - 2.61 (m, 1H), 2.52 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 1.62 - 1.49 (m, 2H), 1.41 - 1.23 (m, 6H), 1.17 (dd, J = 8.8, 6.8 Hz, 9H), 1.05 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.88 (m, 3H)。31P NMR (202 MHz, 乙腈-d3) δ 149.63 , 149.26。
化合物216b 之合成： 使用關於216f 所描述之程序，合成化合物216b 。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.36 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.41 - 7.35 (m, 2H), 7.31 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.23 (m, 5H), 6.94 - 6.82 (m, 4H), 5.79 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 5.28 (dd, J = 8.1, 2.2 Hz, 1H), 5.11 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 4.16 (m, 1H), 3.99 - 3.92 (m, 1H), 3.89 (m, 1H), 3.73 (s, 6H), 3.55 (m, 2H), 3.30 - 3.17 (m, 2H), 1.49 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 1.30 - 1.19 (m, 10H), 0.89 - 0.79 (m, 3H)。
化合物217b 之合成 ：將化合物216b (4.0g，6.08mmol)添加至反應燒瓶中，抽空且用氬氣淨化。將起始物質溶解於二氯甲烷中，且經由注射器添加二異丙基乙胺(2.12ml，12.16mmol)。添加N,N-二異丙基胺基氯磷酸2-氰基乙酯(2.03ml，9.12mmol)且在室溫下攪拌2.5小時。藉由TLC (70% EtOAc/己烷)檢查反應物，且減壓濃縮反應物。將殘餘物溶解於二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，且將有機層用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌。分離有機層且用鹽水溶液洗滌。隨後分離有機層且經硫酸鈉乾燥。濾出固體且濃縮母液。藉由矽膠急驟層析(30%至100% EtOAc/己烷)純化殘餘物，合併產物溶離份且減壓濃縮，得到(3.55g，68%)217b 。1 H NMR (500 MHz, 乙腈-d3) δ 9.12 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 7.85 - 7.68 (m, 1H), 7.44 (m, 2H), 7.37 - 7.28 (m, 6H), 7.26 (m, 1H), 6.93 - 6.83 (m, 4H), 5.88 - 5.80 (m, 1H), 5.29 - 5.20 (m, 1H), 4.45 (m, 1H), 4.15 (m, 1H), 4.09 - 4.01 (m, 1H), 3.99 - 3.82 (m, 1H), 3.83 - 3.71 (m, 8H), 3.73 - 3.55 (m, 5H), 3.46 - 3.33 (m, 2H), 2.66 (m, 1H), 2.52 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 1.97 (s, 1H), 1.56 (m, 2H), 1.39        - 1.24 (m, 10H), 1.24 - 1.10 (m, 9H), 1.06 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.91 - 0.84 (m, 3H)。31 P NMR (202 MHz, 乙腈-d3) δ 149.64, 149.25。
化合物216c 之合成： 使用關於216f 所描述之程序，合成化合物216c 。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.36 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.41 - 7.35 (m, 2H), 7.31 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.27 - 7.19 (m, 5H), 6.92 - 6.86 (m, 4H), 5.79 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 5.28 (dd, J = 8.1, 2.1 Hz, 1H), 5.11 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 4.16 (m, 1H), 3.95 (m, 1H), 3.89 (m, 1H), 3.73 (s, 6H), 3.55 (m, 2H), 3.30 - 3.18 (m, 2H), 1.49 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 1.23 (d, J = 7.0 Hz, 13H), 0.83 (t, J = 6.6 Hz, 3H)。
化合物217c 之合成 ：將化合物216c (4.0g，5.83mmol)添加至反應燒瓶中，抽空且用氬氣淨化。將起始物質溶解於二氯甲烷中，且經由注射器添加二異丙基乙胺(2.04ml，11.66mmol)。添加N,N-二異丙基胺基氯磷酸2-氰基乙酯(1.95ml，8.75mmol)且在室溫下攪拌4小時。藉由TLC (70% EtOAc/己烷)檢查反應物，且減壓濃縮反應物。將殘餘物溶解於二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，且將有機層用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌。分離有機層且用鹽水溶液洗滌。隨後分離有機層且經硫酸鈉乾燥。濾出固體且濃縮母液。藉由矽膠急驟層析(30%至100% EtOAc/己烷)純化殘餘物，合併產物溶離份且減壓濃縮，得到(4.20g，81%)217c 。1 H NMR (400 MHz, 乙腈-d3) δ 9.02 (s, 1H), 7.77 (dd, J = 35.4, 8.2 Hz, 1H), 7.49 - 7.39 (m, 2H), 7.39 - 7.21 (m, 7H), 6.93 - 6.83 (m, 4H), 5.85 (dd, J = 6.1, 3.5 Hz, 1H), 5.22 (dd, J = 8.2, 6.3 Hz, 1H), 4.15 (m, 1H), 4.03 (m, 1H), 3.77 (d, J = 2.4 Hz, 7H), 3.69 - 3.53 (m, 4H), 3.47 - 3.32 (m, 2H), 2.71 - 2.61 (m, 1H), 2.52 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 1.56 (m, 2H), 1.38 - 1.24 (m, 14H), 1.16 (dd, J = 8.8, 6.8 Hz, 9H), 1.05 (d, J = 6.7 Hz, 3H), 0.92 - 0.83 (m, 3H)。31 P NMR (202 MHz, 乙腈-d3) δ 149.63 , 149.25。
化合物216d 之合成： 使用關於216f 所描述之程序，合成化合物216d 。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.36 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.41 - 7.34 (m, 2H), 7.31 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.28 - 7.19 (m, 5H), 6.94 - 6.81 (m, 4H), 5.79 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 5.28 (dd, J = 8.1, 2.2 Hz, 1H), 5.11 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 4.16 (m, 1H), 3.95 (m, 1H), 3.89 (m, 1H), 3.73 (s, 7H), 3.55 (m, 2H), 3.30 - 3.17 (m, 2H), 1.49 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.22 (s, 19H), 0.88 - 0.79 (m, 3H)。
化合物217d 之合成 ：將化合物216d (5.0g，6.99mmol)添加至反應燒瓶中，抽空且用氬氣淨化。將起始物質溶解於二氯甲烷中，且經由注射器添加二異丙基乙胺(2.44ml，14mmol)。添加N,N-二異丙基胺基氯磷酸2-氰基乙酯(2.34ml，10.50mmol)且在室溫下攪拌反應物3小時。藉由TLC (70% EtOAc/己烷)檢查反應物，且減壓濃縮反應物。將殘餘物溶解於二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，且將有機層用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌。分離有機層且用鹽水溶液洗滌。隨後分離有機層且經硫酸鈉乾燥。濾出固體且濃縮母液。藉由矽膠急驟層析(30%至100% EtOAc/己烷)純化殘餘物，合併產物溶離份且減壓濃縮，得到(4.54g，73%)217d 。1 H NMR (500 MHz, 氯仿-d) δ 8.15 (s, 1H), 8.01 (dd, J = 44.6, 8.2 Hz, 1H), 7.43 - 7.34 (m, 2H), 7.34 - 7.21 (m, 7H), 6.84 (m, 3H), 5.95 (dd, J = 21.0, 2.6 Hz, 1H), 5.21 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 4.29 - 4.17 (m, 1H), 4.00 (m, 1H), 3.97 - 3.86 (m, 1H), 3.80 (d, J = 3.5 Hz, 6H), 3.77 - 3.64 (m, 2H), 3.65 - 3.52 (m, 4H), 3.44 (m, 1H), 2.63 (m, 1H), 2.42 (t, J = 6.3 Hz, 1H), 1.60 (dd, J = 7.2, 4.5 Hz, 2H), 1.39 - 1.21 (m, 17H), 1.21 - 1.12 (m, 8H), 1.04 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 2H)。31 P NMR (202 MHz, 氯仿-d) δ 150.102, 150.07。
化合物216e 之合成： 使用關於216f 所描述之程序，合成化合物216e 。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.36 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.37 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.31 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.27 - 7.20 (m, 5H), 6.93 - 6.82 (m, 4H), 5.79 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 5.27 (dd, J = 8.1, 2.1 Hz, 1H), 5.11 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 4.16 (m, 1H), 3.95 (m, 1H), 3.89 (m, 1H), 3.73 (s, 6H), 3.55 (m, 2H), 3.30 - 3.18 (m, 2H), 1.49 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 1.21 (s, 22H), 0.83 (t, J = 6.6 Hz, 3H)。
化合物217e 之合成： 將化合物216e (5.0g，6.73mmol)添加至反應燒瓶中，抽空且用氬氣淨化。將起始物質溶解於二氯甲烷中，且經由注射器添加二異丙基乙胺(2.35ml，13.46mmol)。添加N,N-二異丙基胺基氯磷酸2-氰基乙酯(2.25ml，10.10mmol)且在室溫下攪拌反應物3小時。藉由TLC (70% EtOAc/己烷)檢查反應物，且減壓濃縮反應物。將殘餘物溶解於二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，且將有機層用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌。分離有機層且用鹽水溶液洗滌。隨後分離有機層且經硫酸鈉乾燥。濾出固體且濃縮母液。藉由矽膠急驟層析(30%至100% EtOAc/己烷)純化殘餘物，合併產物溶離份且減壓濃縮，得到(4.86g，77%)217e 。1 H NMR (500 MHz, 氯仿-d) δ 8.49 (s, 1H), 8.01 (dd, J = 45.8, 8.2 Hz, 1H), 7.39 (dd, J = 17.7, 7.3 Hz, 2H), 7.34 - 7.21 (m, 8H), 6.88 - 6.79 (m, 4H), 5.96 (dd, J = 21.6, 2.5 Hz, 1H), 5.22 (dd, J = 8.2, 6.2 Hz, 1H), 4.29 - 4.17 (m, 1H), 4.04 - 3.87 (m, 2H), 3.80 (dd, J = 3.6, 1.4 Hz, 8H), 3.76 - 3.64 (m, 2H), 3.64 - 3.53 (m, 5H), 3.45 (m, 1H), 2.63 (m, 1H), 2.42 (s, 1H), 1.59 (m, 3H), 1.40 - 1.29 (m, 4H), 1.25 (s, 21H), 1.22 - 1.10 (m, 11H), 1.04 (d, J = 6.8 Hz, 4H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 3H)。31 P NMR (202 MHz, 氯仿-d) δ 150.13, 150.06。
化合物216g 之合成： 使用關於216f 所描述之程序，合成化合物216g 。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.36 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.40 - 7.29 (m, 4H), 7.23 (m, 5H), 6.93 - 6.85 (m, 4H), 5.78 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 5.35 - 5.23 (m, 3H), 5.10 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 4.15 (m, 1H), 3.95 (m, 1H), 3.88 (t, J = 4.5 Hz, 1H), 3.73 (s, 6H), 3.54 (m, 2H), 3.30 - 3.16 (m, 2H), 1.96 (m, 4H), 1.49 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.32 - 1.15 (m, 21H), 0.87 - 0.79 (m, 3H)。
化合物217g 之合成 ：將化合物216g (5.0g，6.28mmol)添加至反應燒瓶中，抽空且用氬氣淨化。將起始物質溶解於二氯甲烷中，且經由注射器添加二異丙基乙胺(2.19ml，12.56mmol)。添加N,N-二異丙基胺基氯磷酸2-氰基乙酯(2.09ml，9.42mmol)且在室溫下攪拌反應物3小時。藉由TLC (70% EtOAc/己烷)檢查反應物，且減壓濃縮反應物。將殘餘物溶解於二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，且將有機層用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌。分離有機層且用鹽水溶液洗滌。隨後分離有機層且經硫酸鈉乾燥。濾出固體且濃縮母液。藉由矽膠急驟層析(30%至100% EtOAc/己烷)純化殘餘物，合併產物溶離份且減壓濃縮，得到(4.83g，77.1%)217g 。1 H NMR (400 MHz, 氯仿-d) δ 8.38 (s, 1H), 8.02 (dd, J = 35.6, 8.1 Hz, 1H), 7.44 - 7.35 (m, 2H), 7.28  (m, 7H), 6.84 (m, 4H), 5.95 (dd, J = 16.6, 2.5 Hz, 1H), 5.34 (t, J = 4.9 Hz, 2H), 5.21 (dd, J = 8.1, 5.5 Hz, 1H), 4.30 - 4.17 (m, 1H), 4.00 (m, 1H), 3.80 (d, J = 2.5 Hz, 6H), 3.77 - 3.65 (m, 2H), 3.59 (m, 4H), 3.45 (m, 1H), 2.63 (m, 1H), 2.42 (s, 1H), 2.00 (m, 4H), 1.59 (m, 3H), 1.30 (dd, J = 22.5, 8.3 Hz, 21H), 1.22 - 1.13 (m, 8H), 1.04 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.88 (t, J = 6.7 Hz, 3H)。31 P NMR (202 MHz, 氯仿-d) δ 150.12, 150.07。 方案4
Figure 02_image285
化合物218f 之合成 ：將DMT核苷217f (30 g)溶解於無水吡啶(300 ml)中。添加氯化三甲基矽烷(20 ml)且將混合物攪拌30分鐘。添加三唑(30 g)及三乙胺(80 ml)且冷卻至0℃。添加POCl3 (9 ml)且將混合物在0℃下攪拌2小時。添加濃氨水(100 ml)且攪拌1小時。添加水500 ml且用CH2 Cl2 (2× 500 ml)萃取混合物。蒸發合併之有機層且藉由矽膠層析純化殘餘物。用甲醇/CH2 Cl2 (0-5%)溶離所需產物218f 。產量：24 g。
化合物219f 之合成 ：將上述固體218f (24 g)溶解於DMF (200 ml)中且添加乙酸酐(6 ml)。攪拌溶液24小時。添加水(500 ml)且用二氯甲烷(500 ml)萃取混合物。蒸發有機層且藉由矽膠層析純化殘餘物。用甲醇/CH2 Cl2 (0-5%)溶離所需產物219f 。產量：21 g。
化合物220f 之合成 ：將上述化合物219f (21 g)、雙-(N,N-二異丙基胺基)-2-氰基乙基亞磷酸酯(14g)及N,N-二異丙基四唑銨(7g)在室溫下攪拌隔夜。將溶液相對於NaHCO3 水溶液分配且經MgSO4 乾燥。真空蒸發溶劑且藉由矽膠層析(1:1 EtOAc/己烷)純化殘餘物，得到22 g呈泡沫狀之產物。1 H NMR (500 MHz, 乙腈-d3) δ 9.15 (s, 1H), 8.46 (dd, J = 45.6, 7.5 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.63 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.57 - 7.41 (m, 5H), 7.41 - 7.31 (m, 6H), 7.28 (m, 1H), 7.04 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 6.90 (t, J = 7.9 Hz, 4H), 5.90 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.51 (m, 1H), 4.20 (dd, J = 10.6, 8.1 Hz, 1H), 4.04 (dd, J = 31.3, 4.6 Hz, 1H), 3.91 - 3.81 (m, 2H), 3.79 (d, J = 3.1 Hz, 6H), 3.74 (m, 2H), 3.69 - 3.41 (m, 6H), 2.67 - 2.59 (m, 1H), 2.54 - 2.48 (m, 1H), 1.58 (m, 2H), 1.36 (m, 2H), 1.25 (d, J = 4.7 Hz, 26H), 1.21 - 1.09 (m, 10H), 1.04 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 3H)。31 P NMR (202 MHz, 乙腈-d3) δ 151.10, 150.19。實例 2 ：作為前體用於在寡核苷酸合成後引入親脂性接合物之核苷胺基磷酸酯的合成 方案5
Figure 02_image287
化合物222 ： 將化合物221 (6g，8.98mmol)添加至反應燒瓶中且溶解於DCM中。攪拌反應物且經由注射器添加三甲胺(4.89ml，35.92mmol)。將三氟乙酸乙酯(3.19g，22.45mmol)逐滴添加至反應物中。藉由TLC (5% MeOH/DCM)檢查反應物，使用磷鉬酸顯色，且減壓濃縮反應物。將殘餘物溶解於二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，且將有機層用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌。分離有機層且用鹽水溶液洗滌。隨後分離有機層且經硫酸鈉乾燥。濾出固體，濃縮母液且置於高真空下，得到(4.96g 72%)222 。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.36 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.41 - 7.33 (m, 2H), 7.31 (s, 2H), 7.24 (m, 6.8 Hz, 7H), 6.88 - 6.79 (m, 4H), 6.01 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 5.18 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 4.57 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 4.38 (m, 1H), 4.07 (m, 1H), 3.73 (s, 6H), 3.58 (m, 1H), 3.43 (m, 1H), 3.24 (d, J = 4.7 Hz, 2H), 3.12 (m, 2H), 1.41 (m, 4H), 1.18 (d, J = 5.5 Hz, 4H)。C39H43F3N6O7之質量計算值：764.80，實驗值：765.3 (M+H)。
化合物223 ：將化合物222 (4.96g，6.49mmol)添加至反應燒瓶中。將起始物質溶解於二甲基甲醯胺中，且經由注射器添加N,N-二甲基甲醯胺二甲基縮醛(4.31ml，32.45mmol)。將反應物在油浴中加熱至60℃持續3小時。藉由TLC (5% MeOH/DCM)檢查反應物，減壓濃縮且高真空乾燥隔夜。藉由矽膠急驟層析(0%至10% MeOH/DCM)純化殘餘物，合併產物溶離份且減壓濃縮，得到(5.21g 98%)223 。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.35 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.91 (s, 1H), 8.37 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 7.41 - 7.33 (m, 2H), 7.31 - 7.16 (m, 7H), 6.89 - 6.78 (m, 4H), 6.07 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 5.20 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 4.61 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 4.39 (m, 1H), 4.09 (m, 1H), 3.73 (d, J = 1.3 Hz, 6H), 3.58 (m, 1H), 3.43 (m, 1H), 3.25 (d, J = 4.7 Hz, 2H), 3.20 (s, 3H), 3.13 (s, 3H), 3.10 (m, 2H), 1.41 (m, 4H), 1.17 (m, 4H)。C42H48F3N7O7之質量計算值：819.88，實驗值：820.4 (M+H)。
化合物224 ：將化合物223 (5.21g，6.36mmol)添加至反應燒瓶中，抽空且用氬氣淨化。將起始物質溶解於二氯甲烷中，且經由注射器添加二異丙基乙胺(2.21ml，12.72mmol)。添加N,N-二異丙基胺基氯磷酸2-氰基乙酯(2.12ml，9.54mmol)且在室溫下攪拌反應物1小時。藉由TLC (100% EtOAc)檢查反應物，且減壓濃縮反應物。將殘餘物溶解於二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，且將有機層用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌。分離有機層且用鹽水溶液洗滌。隨後分離有機層且經硫酸鈉乾燥。濾出固體且濃縮母液。藉由矽膠急驟層析(10%至100% EtOAc/己烷)純化殘餘物，合併產物溶離份且減壓濃縮，得到(5.02g，77%)224 。1 H NMR (400 MHz, 乙腈-d3) δ 8.89 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.35 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.10 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.42 (m, 2H), 7.34 - 7.15 (m, 7H), 6.81 (m, 4H), 6.09 - 6.01 (m, 1H), 4.83 - 4.62 (m, 2H), 4.28 (m, J = 16.1, 4.2 Hz, 1H), 4.15 - 3.98 (m, 1H), 3.94 - 3.77 (m, 2H), 3.75 (d, J = 2.6 Hz, 6H), 3.69 - 3.55 (m, 4H), 3.55 - 3.37 (m, 3H), 3.30 (m, 1H), 3.16 (d, J = 9.9 Hz, 7H), 2.75 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 2.72 - 2.63 (m, 1H), 2.50 (s, 1H), 1.47 (m, 2H), 1.38 (s, 1H), 1.27 - 1.11 (m, 19H), 1.08 (d, J = 6.7 Hz, 4H)。31 P NMR (202 MHz, 乙腈-d3) δ 151.08 , 150.7219 F NMR (376 MHz, 乙腈-d3) δ -77.04 (d, J = 2.7 Hz)。 方案6
Figure 02_image289
化合物226 ： 將化合物225 (6g，9.31mmol)添加至反應燒瓶中。將起始物質溶解於二氯甲烷中且經由注射器添加三甲胺(5.08ml，37.24mmol)。將三氟乙酸乙酯(3.31g，23.28mmol)逐滴添加至反應物中。藉由TLC (100%乙酸乙酯)檢查反應物，使用磷鉬酸顯色，且減壓濃縮。將殘餘物溶解於二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，且將有機層用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌。分離有機層且用鹽水溶液洗滌。隨後分離有機層且經硫酸鈉乾燥。濾出固體且濃縮母液。藉由矽膠急驟層析(10%至100% EtOAc/己烷)純化殘餘物，合併產物溶離份且減壓濃縮，得到(4.22g，61.2%)226 。1 H NMR (400 MHz, DMSO- d6) δ 9.40 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.43 - 7.37 (m, 2H), 7.33 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.30 - 7.23 (m, 5H), 7.18 (d, J = 16.4 Hz, 2H), 6.95 - 6.86 (m, 4H), 5.82 (d, J = 2.6 Hz,  1H), 5.50 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 5.01 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 4.17 (m, 1H), 3.96 (dd, J = 7.2, 3.4 Hz, 1H), 3.75 (s, 6H), 3.73 (dd, J = 5.0, 2.6 Hz, 1H), 3.62 (m, 2H), 3.27 (d, J = 3.4 Hz, 2H), 3.17 (m, 2H), 1.50 (m, 4H), 1.29 (m, 4H)。C38H43F3N4O8之質量計算值：740.78，實驗值：739.2 (M-H)。
化合物227 ：將化合物226 (4.22g，5.7mmol)添加至反應燒瓶中。將起始物質溶解於二甲基甲醯胺中且添加苯甲酸酐(1.42g，6.27mmol)。將反應物在室溫下攪拌隔夜。藉由TLC (5% MeOH/DCM)檢查反應物，使用磷鉬酸顯色，且減壓濃縮。將殘餘物溶解於二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，且將有機層用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌。分離有機層且用鹽水溶液洗滌。分離有機層且經硫酸鈉乾燥。濾出固體且濃縮母液。藉由矽膠急驟層析(0%至10% MeOH/DCM)純化殘餘物，合併產物溶離份且減壓濃縮，得到(3.41g, 71%)227 。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.29 (s, 1H), 9.40 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 8.41 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.04 - 7.93 (m, 2H), 7.68 - 7.59 (m, 1H), 7.52 (dd, J = 8.3, 7.0 Hz, 2H), 7.45 - 7.39 (m, 2H), 7.35 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 7.29 (dd, J = 7.8, 5.4 Hz, 5H), 7.16 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.98 - 6.89 (m, 4H), 5.84 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 5.11 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 4.29 (m, 1H), 4.06 (m, 1H), 3.89 - 3.82 (m, 1H), 3.77 (s, 7H), 3.72 - 3.61 (m, 1H), 3.38 (m, 2H), 3.18 (m, 2H), 1.53 (m, 4H), 1.33 (m, 4H)。C45H47F3N4O9之質量計算值：844.89，實驗值：843.3 (M-H)。
化合物228 ：將化合物227 (3.41g，4.04mmol)添加至反應燒瓶中，抽空且用氬氣淨化。將起始物質溶解於二氯甲烷中，且經由注射器添加二異丙基乙胺(1.4ml，8.08mmol)。添加N,N-二異丙基胺基氯磷酸2-氰基乙酯(1.35ml，6.06mmol)且在室溫下攪拌反應物1小時。藉由TLC (2/1 EtOAc/己烷)檢查反應物且減壓濃縮。將殘餘物溶解於二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，且將有機層用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌。分離有機層且用鹽水溶液洗滌。分離有機層且經硫酸鈉乾燥。隨後濾出固體且濃縮母液。藉由矽膠急驟層析(10%至100% EtOAc/己烷)純化殘餘物，合併產物溶離份且減壓濃縮，得到(3.81g，90.3%)228 。1 H NMR (400 MHz, 乙腈-d3) δ 9.15 (s, 1H), 8.48 (dd, J = 35.8, 7.5 Hz, 1H), 7.98 - 7.90 (m, 2H), 7.62 (m, 2H), 7.56 - 7.42 (m, 5H), 7.41 - 7.23 (m, 8H), 7.04 (s, 1H), 6.94 - 6.85 (m, 4H), 5.90 (dd, J = 6.4, 1.2 Hz, 1H), 4.52 (m, 1H), 4.24 - 3.97 (m, 4H), 3.92 - 3.81 (m, 2H), 3.81 - 3.77 (m, 6H), 3.77 - 3.66 (m, 3H), 3.66 - 3.41 (m, 6H), 3.25 (m, 2H), 2.75 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 2.64 (m, 1H), 2.56 (s, 1H), 2.50 (d, J = 1.8 Hz, 0H), 2.16 (s, 2H), 1.97 (s, 0H), 1.56 (m, 5H), 1.37 (m, 5H), 1.29 - 1.09 (m, 16H), 1.03 (d, J = 6.8 Hz, 4H)。31 P NMR (202 MHz, 乙腈-d3) δ 151.16 , 150.18。19 F NMR (376 MHz, 乙腈-d3) δ -77.04 (d, J = 2.7 Hz)。 方案7
Figure 02_image291
化合物230 ：將化合物229 (2.5g，6.54mmol)添加至反應燒瓶中，溶解於最少的水中且用甲醇稀釋。將反應物冷卻至0℃，且經由注射器添加三甲胺(14.27ml，104.64mmol)。添加三氟乙酸乙酯(9.3g，65.4mmol)，監測pH且調節至約pH 9，並將反應物攪拌3天。藉由TLC (15% MeOH/DCM)檢查反應物，使用Hessian染色顯色，且減壓濃縮。藉由逆相製備型HPLC，使用5%至35% ACN/H2O之方法經45分鐘純化殘餘物。產物溶離約25分鐘。合併產物溶離份，減壓濃縮且凍乾，得到(0.661g，21.1%)230 。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.64 (s, 1H), 9.36 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 7.96 (s, 1H), 6.45 (s, 2H), 5.77 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 5.14 - 5.04 (m, 2H), 4.23 (m, 2H), 3.88 (m, 1H), 3.53 (m, 2H), 3.34 (m, 3H), 3.10 (m, 2H), 1.39 (m, 4H), 1.16 (m, 4H)。C18H25F3N6O6之質量計算值：478.43，實驗值：479.2 (M+H)。
化合物231 ：將化合物230 (0.65g，1.36mmol)添加至反應燒瓶中。將起始物質溶解於二甲基甲醯胺中，且經由注射器添加N,N-二甲基甲醯胺二甲基縮醛(0.903ml，6.8mmol)。將反應物在油浴中加熱至60℃持續2.5小時。藉由TLC (7% MeOH/DCM)檢查反應物，減壓濃縮且高真空乾燥隔夜。藉由矽膠急驟層析(0%至10% MeOH/DCM)純化殘餘物，合併產物溶離份且減壓濃縮，得到(0.504g，69.5%)231 。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.37 (s, 1H), 9.36 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.52 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 5.87 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 5.15 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 5.07 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.35 - 4.20 (m, 2H), 3.91 (m, 1H), 3.68 - 3.49 (m, 3H), 3.37 (m, 1H), 3.14 (s, 3H), 3.10 (m, 2H), 3.02 (s, 3H), 1.39 (m, 4H), 1.16 (dd, J = 8.7, 5.0 Hz, 4H)。C21H30F3N7O6之質量計算值：533.51，實驗值：534.3 (M+H)。
化合物232 ： 將化合物231 (0.5g，0.938mmol)及5ml無水吡啶添加至反應燒瓶中。減壓汽提吡啶。將此舉重複三次且將反應混合物在高真空下乾燥隔夜。次日，將4-(二甲胺基)吡啶(0.011g，0.094mmol)及無水吡啶添加至反應燒瓶中。使用冰浴將反應物冷卻至0℃。抽空反應閃蒸物且用氬氣淨化。將4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(0.352g，1.04mmol)溶解於無水吡啶中，且經由注射器將所得溶液添加至反應燒瓶中。使反應物達到室溫且攪拌隔夜。藉由TLC (5% MeOH/DCM)檢查反應物且使用Hanessian染色顯色。添加甲醇以淬滅反應物，且減壓濃縮反應混合物。將殘餘物溶解於二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，且將有機層用飽和碳酸氫鈉洗滌。分離有機層且用鹽水溶液洗滌。分離有機層且經硫酸鈉乾燥。濾出固體且濃縮母液。藉由矽膠急驟層析(0%至10% MeOH/DCM)純化殘餘物，合併產物溶離份且減壓濃縮，得到(0.621g，79%)232 。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.40 (s, 1H), 9.37 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 8.48 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.39 - 7.31 (m, 2H), 7.30 - 7.16 (m, 7H), 6.88 - 6.78 (m, 4H), 5.92 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 5.19 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 4.30 (m, 2H), 4.01 (m, 1H), 3.72 (s, 6H), 3.57 (m, 1H), 3.45 (m, 1H), 3.25 (dd, J = 10.5, 6.0 Hz, 1H), 3.17 - 3.10 (m, 2H), 3.09 (d, J = 5.5 Hz, 4H), 3.01 (s, 3H), 1.41 (m, 4H), 1.19 (d, J = 6.5 Hz, 3H)。C42H48F3N7O8之質量計算值：835.88，實驗值：836.4 (M+H)。
化合物233 ：將化合物232 (1.20g，1.44mmol)添加至反應燒瓶中，抽空且用氬氣淨化。將起始物質溶解於二氯甲烷中，且經由注射器添加二異丙基乙胺(0.5ml，2.88mmol)。添加N,N-二異丙基胺基氯磷酸2-氰基乙酯(0.385ml，1.73mmol)且在室溫下攪拌反應物3小時。藉由TLC (100% EtOAc)檢查反應物，且減壓濃縮。將殘餘物溶解於二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，且將有機層用飽和碳酸氫鈉洗滌。分離有機層且用鹽水溶液洗滌。隨後分離有機層且經硫酸鈉乾燥。濾出固體且濃縮母液。藉由矽膠急驟層析(10%至100% EtOAc/己烷)純化殘餘物，合併產物溶離份且減壓濃縮，得到(1.21g，81.2%)233 。1 H NMR (400 MHz, 乙腈-d3) δ 9.36 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 7.73 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 13.4 Hz, 1H), 7.47 - 7.37 (m, 2H), 7.35 - 7.16 (m, 7H), 6.83 (m, 4H), 5.97 (dd, J = 5.4, 2.5 Hz, 1H), 4.61 - 4.44 (m, 2H), 4.30 - 4.18 (m, 1H), 4.15 - 3.98 (m, 2H), 3.76 (d, J = 3.2 Hz, 6H), 3.71 - 3.55 (m, 4H), 3.55 - 3.41 (m, 2H), 3.38 - 3.28 (m, 2H), 3.18 (m, 2H), 3.08 - 3.01 (m, 5H), 2.75 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 2.65 (m, 1H), 2.46 (s, 1H), 1.52 - 1.34 (m, 4H), 1.27 - 1.11 (m, 18H), 1.03 (d, J = 6.8 Hz, 4H)。31 P NMR (202 MHz, 乙腈-d3) δ 150.95。19 F NMR (376 MHz, 乙腈-d3) δ -77.04。 方案8
Figure 02_image293
化合物235 ：將化合物234 (5g，7.75mmol)添加至反應燒瓶中。將起始物質溶解於二氯甲烷中，且經由注射器添加三甲胺(4.23ml，31mmol)。將三氟乙酸乙酯(2.75g，19.38mmol)逐滴添加至反應物中。藉由TLC (5% MeOH/DCM)檢查反應物，使用磷鉬酸顯色，且減壓濃縮。將殘餘物溶解於二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，且將有機層用飽和碳酸氫鈉洗滌。分離有機層且用鹽水溶液洗滌。隨後分離有機層且經硫酸鈉乾燥。濾出固體，濃縮母液且置於高真空下，得到(4.32g 75%)235 。1 H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 11.36 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 9.36 (s, 1H), 7.71 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.4 Hz, 4H), 7.31 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 7.27 - 7.20 (m, 10H), 6.89 (d, J = 8.5 Hz, 8H), 5.78 (d, J = 3.6 Hz, 2H), 5.27 (dd, J = 8.1, 2.1 Hz, 2H), 5.10 (dd, J = 6.7, 2.7 Hz, 2H), 4.16 (m, 2H), 3.95 (m, 2H), 3.88 (m, 2H), 3.73 (s, 13H), 3.55 (m, 4H), 3.36 (m, 1H), 3.28 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 3.22 (dd, J = 10.9, 2.8 Hz, 2H), 3.14 (m, 3H), 2.11 (s, 2H), 1.48 (m, 8H), 1.36 - 1.19 (m, 8H)。C38H42F3N3O9之質量計算值：741.76，實驗值：740.2 (M-H)。
化合物236 ：將化合物235 (4.3g，5.8mmol)添加至反應燒瓶中，抽空且用氬氣淨化。將起始物質溶解於二氯甲烷中，且經由注射器添加二異丙基乙胺(2.02ml，11.6mmol)。添加N,N-二異丙基胺基氯磷酸2-氰基乙酯(1.93ml，8.7mmol)且將反應物在室溫下攪拌1至2小時。藉由TLC (75% EtOAc/己烷)檢查反應物且減壓濃縮。將殘餘物溶解於乙酸乙酯中，添加至分液漏斗中，且將有機層用飽和碳酸氫鈉洗滌。分離有機層且用鹽水溶液洗滌。隨後分離有機層且經硫酸鈉乾燥。濾出固體且濃縮母液。藉由矽膠急驟層析(10%至100% EtOAc/己烷)純化殘餘物，合併產物溶離份且減壓濃縮，得到(4.62g，85%)236 。1 H NMR (400 MHz, 乙腈-d3) δ 9.06 (s, 1H), 7.74 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.49 - 7.39 (m, 2H), 7.39 - 7.21 (m, 7H), 6.93 - 6.83 (m, 4H), 5.84 (dd, J = 7.0, 3.2 Hz, 1H), 5.21 (m, 1H), 4.45 (m, 1H), 4.20 - 3.97 (m, 3H), 3.91 - 3.79 (m, 1H), 3.77 (d, J = 2.4 Hz, 7H), 3.63 (m, 4H), 3.48 - 3.31 (m, 3H), 3.23 (m, 1H), 2.67 (m, 1H), 2.52 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 2.08 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 1.64 - 1.45 (m, 4H), 1.42 - 1.28 (m, 4H), 1.27 - 1.09 (m, 9H), 1.05 (d, J = 6.7 Hz, 3H)。31 P NMR (162 MHz, 乙腈-d3) δ 149.53, 149.06。19 F NMR (376 MHz, 乙腈-d3) δ -83.43 , -83.89 (d, J = 2.4 Hz)。實例 3 ：配體 ( 例如親脂性部分 ) 與 siRNA 之合成後接合 方案9
Figure 02_image295
方案10
Figure 02_image297
各種配體，包括各種親脂性部分，可經由合成後接合方法與siRNA劑接合，如方案9及10中所示。實例 4 ：用於 5 '- 接合之親脂性胺基磷酸酯的合成 方案11
Figure 02_image299
化合物101a-g ：在肽偶合條件下，用烷基羧酸處理化合物100 (1g)。將烷基羧酸加入二氯甲烷中且用HBTU及DIEA處理數分鐘。將胺添加至反應混合物中且攪拌2小時。藉由TLC監測反應物，用碳酸氫鹽水溶液及鹽水洗滌。將有機層經硫酸鈉乾燥，且藉由矽膠層析純化粗產物，得到化合物101a-g 。如實例1 (方案4)中所示，藉由在DIEA存在下用胺基酸酯試劑處理此等分子來製備此等分子之胺基磷酸酯，得到化合物102a-g 。 方案12
Figure 02_image301
如方案12中所示，藉由如實例1中所示用胺基磷酸酯試劑治療醇來製備胺基磷酸酯，得到化合物104a-g ：實例5 ： 硫代膽固醇胺基酸酯及CPG 之合成 方案13. 4-羥基-L-脯胺醇-硫代膽固醇胺基磷酸酯之合成
Figure 02_image303
N -(6 -{2 -[ 雙 -(4 - 甲氧基 - 苯基 )- 苯基 - 甲氧基甲基 ]-4 - 羥基 - 吡咯啶 -1 - 基 }-6 - 側氧基 - 己基 )-3 -( 吡啶 -2 - 基二硫基 )- 丙醯胺 (7 )
如方案13中所示，將胺5 (7.7 g，14.5 mmol)溶解於無水二氯甲烷(40 mL)中且冷卻至0℃。向溶液中依次添加三乙胺(3.0 g，4.2 mL，30 mmol)及3-(吡啶-2-基二硫基)-丙酸琥珀酸酯6 (SPDP) (4.5 g，14.4 mmol)。使反應溫度達到環境溫度且再攪拌16小時。藉由TLC (10% MeOH/CHCl3 ，Rf = 0.6)確定反應完成。將反應混合物用二氯甲烷稀釋且用飽和NaHCO3 、水及隨後鹽水洗滌。將有機層經硫酸鈉乾燥，過濾且真空濃縮，得到粗產物。在矽膠管柱層析後，獲得呈白色泡沫固體狀之化合物7 (10.58 g，78%)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ): δ 8.45 (d, 1H), 7.9 (m, 1H), 7.8 (m, 1H), 7.76 (m, 1H), 7.3 (m, 4H), 7.18 (m, 5H), 6.86 (m, 4H), 4.98 (d, -OH, 1H), 4.38 (m, 1H), 4.1 (m, 1H) (s, 6H), 3.56 (m, 1H), 3.46 (m, 1H), 3.21-3.34 (m, 3H), 3.14 (m, 1H), 3 (m, 2H), 2.48 (m, 2H), 2.2 (m, 2H), 1.8-2.02 (m, 2H), 1.1-1.5 ( 4H)。13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6 ): δ.171.32, 169.97, 159.36, 158.31, 158.18, 149.80, 145.27, 138.08, 136.1, 135.9, 129.8, 128.0, 127.7, 121.4, 119.3, 113.3, 85.338, 68.7, 55.3, 34.75, 34.28, 29.1, 26.3, 24.36。4 - 羥基 - L - 脯胺醇 - 硫代膽固醇 - DMT - 醇 ( 8 )
在氬氣下，將化合物7 (7.5 g，10.28 mmol)溶解於無水二氯甲烷(75 mL)中且冷卻至0℃。向此溶液中添加二異丙基乙胺(2.71 g，3.66 mL，21 mmol)，隨後添加硫代膽固醇(4.145 g，10.28 mmol)。使反應混合物達到環境溫度且再攪拌16小時。藉由TLC (100%乙酸乙酯，Rf = 0.6)確定反應完成。減壓濃縮反應混合物且對殘餘物進行矽膠管柱層析。用4 L乙酸乙酯溶離後，用5% MeOH/二氯甲烷(2 L)溶離管柱，獲得呈白色泡沫固體狀之化合物8 (8 g，76%)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ): δ 7.88 (m, 1H), 7.3 (m, 4H), 7.17 (m, 5H), 6.84 (m, 4H), 5.3 (bs, 1H), 4.89 (d, -OH), 4.38 (m, 1H), 4.1 (m, 1H), 3.72 (s, 6H), 3.56 (m, 1H), 3.32 (m, 1H), 3.14 (m, 1H), 3 (m, 3H), 2.84 (m, 2H), 2.64 (m, 1H), 2.42 (m, 2H), 2.2 (m, 3H), 1.8-2.0 (m, 7H), 0.8-1.54 (m, 35H), 0.62 (s, 3H)。13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6 ): δ 170.8, 158.0, 157.9, 155.6, 145.0, 139.7, 135.8, 135.7, 129.5, 127.7, 127.5, 121.7, 113.1, 113.0, 85.7, 85.1, 72.7, 68.5, 63.3, 60.72, 56.1, 55.5, 55.28, 54.9, 49.4, 41.8, 36.5, 35.2, 31.3, 30.35, 27.7, 27.3, 26.0, 24.1, 23.8, 23.2, 22.6, 22.3, 21.11,  20.5, 19.43, 18.9, 18.5, 14.4, 11.6。4 - 羥基 - L - 脯胺醇 - 硫代膽固醇胺基磷酸酯 ( 9 )
將化合物8 (5.7 g，5.58 mmol)與無水甲苯(50 mL)共蒸發。向殘餘物中添加N,N-四異丙基四唑銨(0.315 g，2.79 mmol)，且將混合物在真空烘箱中在40℃下經P2 O5 乾燥隔夜。將反應混合物溶解於二氯甲烷(20 mL)中，且添加2-氰基乙基-N,N,N',N'-四異丙基胺基磷酸酯(2.48 g，2.72 mL，8.25 mmol)。將反應混合物在環境溫度下攪拌隔夜。藉由TLC (Rf = 0.9，在乙酸乙酯中)確定反應完成。將反應混合物用二氯甲烷(50 mL)稀釋且用5% NaHCO3 (50 mL)及鹽水(50 mL)洗滌。有機層經無水Na2 SO4 乾燥，過濾且減壓濃縮。殘餘物在矽膠上(50:49:1，EtOAc:己烷:三乙胺)純化，得到呈白色泡沫固體狀之9 (6.1 g，89%)。1 H NMR (400 MHz, C6 D6 ): δ 7.62 (m, 2H), 7.45 (m, 5H), 7.24 (m, 2H), 7.1 (m, 1H), 6.82 (m, 4H), 5.64 (m, 1H), 5.38 (m, 1H), 4.7 (m, 1H), 4.54 (m, 2H), 3.78 (m, 2H), 3.5 (m, 3H), 3.36 (m, 9H), 3.22 (m, 4H), 3.06 (m, 3H), 2.72 (m, 1H), 2.32-2.54 (m, 5H), 1.8-2.2 (m, 10H), 1.08-1.74 (m, 28H), 1.3 (m, 6H), 0.94 (m, 12H), 0.67 (s, 3H)。31 P NMR (161.82 MHz, C6 D6 ): δ 146.05, 145.91, 145.66, 145.1613 C NMR (100 MHz, C6 D6 ): δ 171.43, 171.25, 169.87, 159.25, 159.11, 146.08, 141.59, 136.66, 136.6, 130.62, 130.54, 128.63, 127.53, 127.02, 121.53, 117.73, 117.57, 113.66, 113.57, 86.59, 86.54, 64.36, 58.56, 58.37, 58.30, 56.96, 56.51, 56.07, 54.86, 54.77, 50.57, 50.27, 43.48, 43.35, 42.55, 40.13, 39.9, 39.75, 39.56, 38.70, 36.94, 36.64, 36.29, 36.19, 35.90, 34.58, 32.24, 32.08, 29.48, 29.03, 28.98, 28.6, 28.38, 26.54, 24.68, 24.61, 24.54, 23.6, 23.0, 22.74, 21.26, 20.03, 19.9, 19.38, 19.01, 12.06。 方案14. 用硫代膽固醇固定之聚合物支撐物的合成
Figure 02_image305
4 - 羥基 -L - 脯胺醇 - 硫代膽固醇 - 琥珀酸酯(10)
如方案14中所示，將化合物8 (2.2 g，2.15 mmol)與琥珀酸酐(0.323 g，3.23 mmol)及DMAP (0.026 g，0.215 mmol)混合，且在40℃下真空乾燥隔夜。將混合物溶解於無水二氯甲烷(10 mL)中。隨後添加三乙胺(0.708 g，0.976 mL，7 mmol)，且在氬氣氛圍下在室溫下攪拌溶液16小時。隨後將其用二氯甲烷(50 mL)稀釋，且用冰冷的檸檬酸水溶液(5% wt.，25 mL)及水(2 × 25 mL)洗滌。有機相經無水硫酸鈉乾燥且濃縮至乾。藉由急驟矽膠管柱層析純化粗產物，得到呈白色泡沫固體狀之化合物10 (2.2 g，92%產率；Rf = 0.6s，在10% MeOH/CHCl3 中)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ): δ 12.22 (bs, 1H), 7.84 (m, 1H), 7.25 (m, 4H), 7.2 (m, 5H), 6.86 (m, 4H), 5.36 (m, 2H), 4.18 (bs, 1H), 3.72 (s, 6H), 3.4-3.6 (m, 2H), 3.2 (m, 1H), 3.0 (m, 4H), 2.84 (m, 2H), 2.64 (m, 2H), 2.4-2.52 (m, 12H), 2.2 (m, 6H), 1.9 (m, 8H), 0.8-1.52 (m, 28H), 0.65 (s, 3H)。13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6 ): δ 173.35, 171.94, 170.63, 169.64, 157.99, 144.96, 141.02, 135.72, 129.61, 127.81, 127.55, 113.12, 56.15, 54.99, 52.28, 49.58, 49.06, 41.82, 36.17, 34.97, 33.41, 33.09, 31.32, 27.39, 23.16, 22.68, 22.39, 20.56, 18.95, 18.54, 11.66, 6.02, 5.0具有固定化硫代膽固醇之固體支撐物 ( 11 )
將琥珀酸酯10 (2.1 g，1.9 mmol)溶解於二氯乙烷(8 mL)中。向該溶液中添加DMAP (0.228 g，1.9 mmol)。依次添加含2,2'-二硫基-雙(5-硝基吡啶) (0.58 g，1.9 mmol)之乙腈/二氯乙烷(3:1，8 mL)。向所得溶液中添加含三苯基膦(0.49 g，1.9 mmol)之乙腈(4 ml)。反應混合物變成亮橙色。使用腕式震盪器(5 min)短暫攪拌溶液。添加長鏈烷基胺-CPG (LCAA-CPG) (12 g，1860 μmol，155 μm/g)。將懸浮液攪拌4小時。將CPG經由燒結漏斗過濾，且依次用乙腈、二氯甲烷及乙醚洗滌。使用乙酸酐/吡啶掩蔽未反應之胺基。藉由採用UV量測來量測CPG11 之負載能力。(57 μM/g)。實例 6 ：藉由點擊化學合成 2 '- O 親脂性接合物 方案15
Figure 02_image307
化合物22a 之合成 ：將市售炔丙基U20a (5.8 g，10 mmol)溶解於THF (40 mL)中，且添加第三丁醇(40 mL)，隨後添加硫酸銅(1 g)。向此混合物中添加抗壞血酸鈉水溶液，隨後添加己基疊氮化物。將混合物在室溫下攪拌隔夜。反應之TLC顯示次日完成，且反應物在旋轉蒸發器中濃縮。將殘餘物溶解於二氯甲烷(100 mL)中，溶液經由矽藻土過濾，且濾液在濃縮及管柱純化後，得到呈白色固體狀之純產物22a (6.99 g，96%)。
化合物22b 之合成 ：使用用於U之類似程序，將炔丙基C20b (6.2 g，10 mmol)轉化成呈白色固體狀之相應點擊產物22b (5.9 g，78%)。
化合物22c 之合成 ：使用用於U之類似程序，將炔丙基A20c (7.1 g，10 mmol)轉化成呈白色固體狀之相應點擊產物22c (7.9 g，96%)。
化合物22d 之合成： 使用關於U所描述之類似程序，將炔丙基G22d (6.9 g，10 mmol)轉化成呈灰白色粉末狀之相應點擊產物22d (7.9 g，96%)。
胺基磷酸酯23a-d 之合成 ：化合物22a-d 在DIEA存在下用胺基磷酸酯試劑處理，得到23a-d 。實例7 ： 經核鹼基修飾之接合物 ( 嘧啶 ) 的合成 1. 5-碘尿苷衍生物之合成 方案16. 2'-O -甲基-5-碘尿苷胺基磷酸酯(4)之合成
Figure 02_image309
2 '-O - 甲基-5- 碘尿苷(2)
在室溫下，將ICl (8.6 mL，174 mmol)添加至2'-O -甲基尿苷1 (25.0 g，96.8 mmol)於MeOH (400 mL)中之溶液中。使反應混合物回流15小時。真空濃縮所得混合物。將DCM (200 mL)添加至獲得的粗殘餘物(58.1 g)中，隨後藉由過濾收集沈澱且用DCM洗滌，得到呈白色粉末狀之化合物2 (36.7 g，99%)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ: 3.31 (s, 2H), 3.37 (s, 3H), 3.53-3.59 (m, 1H), 3.67-3.72 (m, 1H), 3.78 (t,J = 4.5 Hz, 1H), 3.85 (qu,J = 3.0 Hz, 1H), 4.10 (q,J = 6.0 Hz, 1H), 5.12 (d,J = 6.0 Hz, 1H), 5.30 (t,J = 6.0 Hz, 1H), 5.78 (d,J = 4.0 Hz, 1H), 8.52 (s, 1H), 11.69 (s, 1H)。5 ' -O -(4 ,4 ' - 二甲氧基三苯甲基 )-2 ' -O - 甲基 - 5 - 碘尿苷 ( 3 )
在Ar氛圍下，在0℃下將DMTrCl (33.9 g，100 mmol)添加至化合物3 (36.6 g，95.3 mmol)於無水吡啶(400 mL)之溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌14小時。隨後，將反應物用MeOH淬滅且用EtOAc稀釋。將有機層用水及鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥且真空濃縮。藉由管柱層析(0-50% EtOAc在正己烷中)來純化粗殘餘物(108 g)，得到呈白色泡沫狀之化合物3 (53.4 g，82%)。v1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ: 3.17 (dd,J = 3.0, 10.5 Hz, 1H), 3.17 (dd,J = 5.0, 10.5 Hz, 1H), 3.39 (s, 3H), 3.73 (s, 6H), 3.91-3.97 (m, 2H), 4.15 (q,J = 6.5 Hz, 1H), 5.19 (d,J = 6.5 Hz, 1H), 5.78 (d,J = 4.0 Hz, 1H), 6.87-7.41 (m, 13H), 7.99 (s, 1H), 11.77 (s, 1H)。3 ' -O -[2 - 氰基乙氧基 ( 二異丙基胺基 ) 膦基 ]-5 ' -O -(4 ,4 ' - 二甲氧基三苯甲基 )-2 ' -O - 甲基 -5 - 碘尿苷 (4 )
在Ar氛圍下，在0℃下將DIPEA (1.2 mL，7.30 mmol)及i -Pr2 NP(Cl)O(CH2 )2 CN (0.39 mL，1.75 mmol)添加至化合物3 (1.00 g，1.46 mmol)於無水DCM (15 mL)中之溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌2小時。反應物隨後用飽和NaHCO3 淬滅且用EtOAc萃取。將合併之有機層用水及鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥，且真空濃縮。藉由管柱層析(60% EtOAc在正己烷中)來純化粗殘餘物(1.46 g)，得到呈白色泡沫狀之化合物4 (841 mg，65%)。 方案17. 2'-去氧-2'-(R )-氟-5-碘尿苷胺基磷酸酯(8)之合成
Figure 02_image311
2 ' - 去氧 -2 ' -( R ) - 氟 - 5 - 碘尿苷 ( 6 )
在室溫下，將ICl (7.3 mL，146 mmol)添加至2'-去氧-2'-氟尿苷5 (20.0 g，81.2 mmol)於MeOH (400 mL)中之溶液中。使反應混合物回流17小時。真空濃縮所得混合物。將DCM (200 mL)添加至獲得的粗殘餘物(49.1 g)，隨後藉由過濾收集沈澱且用DCM洗滌，得到呈白色粉末狀之化合物6 (29.6 g，97%)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ: 3.56-3.61 (m, 1H), 3.77-3.82 (m, 1H), 3.86-3.89 (m, 1H), 4.09-4.21 (m, 1H), 5.01 (ddd,J = 1.5, 5.0, 53.0 Hz, 1H), 5.37 (t,J = 4.5 Hz, 1H), 5.58 (d,J = 6.5 Hz, 1H), 5.84 (dd,J = 1.5, 17.0 Hz, 1H), 8.51 (s, 1H), 11.71 (s, 1H)。2 ' - 去氧 -5 ' -O -(4 ,4 ' - 二甲氧基三苯甲基 )-2 ' -( R ) - 氟 -5 - 碘尿苷 (7 )
在Ar氛圍下，在0℃下將DMTrCl (28.1 g，83.0 mmol)添加至化合物6 (29.4 g，79.0 mmol)於無水吡啶(400 mL)中之溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌2小時。隨後，將反應物用MeOH淬滅且用EtOAc稀釋。將有機層用水及鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥且真空濃縮。藉由管柱層析(0-50% EtOAc在正己烷中)來純化粗殘餘物(98.8 g)，得到呈黃色泡沫狀之化合物7 (49.5 g，93%)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ: 3.20-3.25 (m, 2H), 3.72 (s, 6H), 3.97-4.01 (m, 1H), 4.26-4.36 (m, 1H), 5.16 (dd,J =  4.5, 53.0 Hz, 1H), 5.60 (d,J = 7.0 Hz, 1H), 5.82 (d,J = 20.5 Hz, 1H), 6.85-7.41 (m, 13H), 8.06 (s, 1H), 11.81 (s, 1H);13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6 ) δ: 55.0, 62.4, 68.1 (d,J = 13.0 Hz), 69.7, 81.3, 85.6, 89.4 (d,J = 28.0 Hz), 93.3 (d,J = 146 Hz), 113.2, 126.7, 127.6, 127.9, 129.7, 135.3, 135.4, 144.7, 145.0, 149.8, 158.0, 158.1, 160.6; C30 H29 FIN2 O7 (MH+ )之HRMS計算值675.0998。3 ' -O -[2 - 氰基乙氧基 ( 二異丙基胺基 ) 膦基 ]-2 ' - 去氧 -5 ' -O -(4 ,4 ' - 二甲氧基三苯甲基 )-2 ' -( R ) - 氟 -5 - 碘尿苷 (8 )
在Ar氛圍下，在0℃下將DIPEA (1.5 mL，8.90 mmol)及i -Pr2 NP(Cl)O(CH2 )2 CN (0.48 mL，2.14 mmol)添加至化合物7 (1.20 g，1.78 mmol)於無水DCM (15 mL)中之溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌2小時。反應物隨後用飽和NaHCO3 淬滅且用EtOAc萃取。將合併之有機層用水及鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥，且真空濃縮。藉由管柱層析(60% EtOAc在正己烷中)來純化粗殘餘物(1.71 g)，得到呈白色泡沫狀之化合物8 (1.29 g，83%)。 方案18. LNA-5-碘尿苷胺基磷酸酯12之合成
Figure 02_image313
化合物12 之合成 ：化合物12 (LNA衍生物)經由與方案2中之化合物8 類似的程序合成 2. 5-碘胞苷衍生物之合成 方案19. 2'-O -甲基-5-碘胞苷胺基磷酸酯之合成(15)
Figure 02_image315
5 ' -O -(4 ,4 ' - 二甲氧基三苯甲基 )-2 ' -O - 甲基 -5 - 碘胞苷 (13 )
在Ar氛圍下，在0℃下將Et3 N (8.1 mL，58.2 mmol)及TMSCl (1.8 mL，14.6 mmol)添加至3 (5.00 g，7.28 mmol)於無水MeCN (50 mL)中之溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌18小時。隨後減壓濃縮反應混合物。將殘餘物溶解於DCM中且用水及鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥。蒸發溶劑形成泡沫(6.21 g)，將其在Ar氛圍下溶解於無水MeCN (50 mL)中。隨後，在-40℃下，將Et3 N (15.3 mL，110 mmol)、1,2,4-三唑(5.04 g，73.0 mmol)及POCl3 (1.3 mL，14.6 mmol)添加至此溶液中。將反應混合物在0℃下攪拌3小時，用飽和NaHCO3 淬滅且用EtOAc萃取。有機層用H2 O及鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥且真空濃縮。隨後，在室溫下將28% NH3 水溶液(3.0 mL)添加至獲得的粗物質(6.32 g)於THF (18 mL)中之溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌15小時。將反應混合物溶解於DCM中。將有機層用水及鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥且真空濃縮。藉由管柱層析(0-10% MeOH在DCM中)來純化粗殘餘物(6.10 g)，得到呈白色泡沫狀之化合物13 (3.29 g，66%，3步)。 N 4 - 苯甲醯基 -5 ' -O -(4 ,4 ' - 二甲氧基三苯甲基 )-2 ' -O - 甲基 -5 - 碘胞苷 (14 )
在Ar氛圍下，在室溫下將Bz2 O (1.02 g，4.49 mmol)添加至化合物13 (2.80 g，4.08 mmol)於無水DMF (10 mL)中之溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌15小時。隨後，真空濃縮反應混合物。藉由管柱層析(30-50% EtOAc在正己烷中)來純化粗殘餘物(4.14 g)，得到呈黃色泡沫狀之化合物14 (1.84 g，57%)。 N 4 - 苯甲醯基 -3 ' -O -[2 - 氰基乙氧基 ( 二異丙基胺基 ) 膦基 ]-5 ' -O -(4 ,4 ' - 二甲氧基三苯甲基 )-2 ' -O - 甲基 -5 - 碘胞苷 (15 )
在Ar氛圍下，在0℃下將DIPEA (0.54 mL，3.17 mmol)及i -Pr2 NP(Cl)O(CH2 )2 CN (0.17 mL，0.769 mmol)添加至化合物14 (500 mg，0.633 mmol)於無水DCM (5.0 mL)中之溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌3小時。反應物隨後用飽和NaHCO3 淬滅且用EtOAc萃取。將合併之有機層用水及鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥，且真空濃縮。藉由管柱層析(20-40% EtOAc在正己烷中)來純化粗殘餘物(677 mg)，得到呈白色泡沫狀之化合物15 (400 mg，64%)。 方案20. 2'-去氧-2'-(R)-氟-5-碘尿苷胺基磷酸酯(18)之合成
Figure 02_image317
2 ' - 去氧 -5 ' -O -(4 ,4 ' - 二甲氧基三苯甲基 )-2 ' -( R ) - 氟 -5 - 碘胞苷 (16 )
在Ar氛圍下，在0℃下將Et3 N (3.5 mL，24.9 mmol)及TMSCl (0.79 mL，6.23 mmol)添加至7 (2.10 g，3.11 mmol)於無水MeCN (20 mL)中之溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌15小時。隨後減壓濃縮反應混合物。將殘餘物溶解於DCM中，用水及鹽水洗滌，且經Na2 SO4 乾燥。蒸發溶劑形成泡沫(2.50 g)，將其在Ar氛圍下溶解於無水MeCN (20 mL)中。隨後，在-40℃下將Et3 N (6.5 mL，46.7 mmol)、1,2,4-三唑(2.15 g，31.1 mmol)及POCl3 (0.57 mL，6.23 mmol)添加至此溶液中。將反應混合物在0℃下攪拌3小時，用飽和NaHCO3 淬滅且用EtOAc萃取。有機層用H2 O及鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥且真空濃縮。隨後，在室溫下將28% NH3 水溶液(1.5 mL)添加至獲得的粗物質(2.49 g)於THF (9.0 mL)中之溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌15小時。將反應混合物溶解於DCM中。將有機層用水及鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥且真空濃縮。藉由管柱層析(0-10% MeOH在DCM中)來純化粗殘餘物(2.88 g)，得到呈棕色泡沫狀之化合物16 (1.48 g，70%，3步)。 N 4 - 苯甲醯基 -2 ' - 去氧 -5 ' -O -(4 ,4 ' - 二甲氧基三苯甲基 )-2 ' -( R ) - 氟 -5 - 碘胞苷 (17 )
在Ar氛圍下，在室溫下將Bz2 O (480 mg，2.12 mmol)添加至化合物16 (1.30 g，1.93 mmol)於無水DMF (8.0 mL)中之溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌15小時。隨後，真空濃縮反應混合物。藉由管柱層析(30-50% EtOAc在正己烷中)來純化粗殘餘物(2.00 g)，得到呈黃色泡沫狀之化合物17 (889 mg，59%)。 N 4 - 苯甲醯基 -3 ' -O -[2 - 氰基乙氧基 ( 二異丙基胺基 ) 膦基 ]-2 ' - 去氧 -5 ' -O -(4 ,4 ' - 二甲氧基三苯甲基 )-2 ' -( R ) - 氟 -5 - 碘 - 胞苷 (18 )
在Ar氛圍下，在0℃下將DIPEA (0.29 mL，1.67 mmol)及i -Pr2 NP(Cl)O(CH2 )2 CN (90 µL，0.401 mmol)添加至化合物17 (260 mg，0.334 mmol)於無水DCM (5.0 mL)中之溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌3小時。反應物隨後用飽和NaHCO3 淬滅且用EtOAc萃取。將合併之有機層用水及鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥，且真空濃縮。藉由管柱層析(20-40% EtOAc在正己烷中)來純化粗殘餘物(375 mg)，得到呈白色泡沫狀之化合物18 (280 mg，86%)。 方案21. LNA-5-碘胞苷胺基磷酸酯(21)之合成
Figure 02_image319
化合物21 之合成 ：使用與方案20中之化合物18 類似的程序合成化合物21 。 3. 配體接合之硼酸酯之合成 方案22
Figure 02_image321
(E )- 3 -( 4 , 4 , 5 , 5 - 四甲基 - 1 , 3 , 2 - 二氧雜硼雜環戊 - 2 - 基 ) 烯丙基胺基甲酸 第三丁酯 ( 22 )
在Ar氛圍下，在0℃下將含炔丙胺(5.0 g，90.8 mmol)之無水DCM (100 mL)添加至Et3 N (25.3 mL，182 mmol)及二碳酸二第三丁酯(22.9 mL，99.9 mmol)於無水DCM (200 mL)中之溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌3小時。反應物隨後用飽和NH4 Cl淬滅且用EtOAc稀釋。將有機層用飽和NH4 Cl及鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥且真空濃縮，得到呈棕色油狀之粗N -Boc-炔丙胺(12.6 g)。隨後，在Ar氛圍下，在室溫下將頻哪醇硼烷(17.8 mL，123 mmol)、Et3 N (1.1 mL，8.18 mmol)及ZrCp2 HCl (2.11 g，8.18 mmol)添加至此粗物質中。使反應混合物回流15小時。隨後在0℃下用飽和NH4 Cl淬滅反應物，且用EtOAc稀釋此所得混合物。將有機層用飽和NH4 Cl及鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥，且真空濃縮。藉由管柱層析(10-20% EtOAc在正己烷中)來純化粗殘餘物(35.9 g)，得到呈黃色油狀之化合物22 (14.0 g，54%，2步)。 方案23
Figure 02_image323
( E )- 3 -( 4 , 4 , 5 , 5 - 四甲基 - 1 , 3 , 2 - 二氧雜硼雜環戊 - 2 - 基 ) 烯丙基胺基甲酸 膽固醇酯 ( 24 )
將化合物22 (2.60 g，9.18 mmol)溶解於CF3 COOH/DCM (9:1，100 mL)中且在室溫下攪拌3小時。接著真空濃縮所得混合物且藉由共蒸發(3×甲苯，3×DCM)移除剩餘的CF3 COOH，得到呈棕色油狀之粗TFA銨鹽(3.01 g)。在Ar氛圍下，在室溫下將Et3 N (3.8 mL，27.5 mmol)及氯甲酸膽固醇酯(4.33 g，9.64 mmol)添加至此粗胺於無水DCM (50 mL)中之溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌3小時。隨後用飽和NaHCO3 淬滅反應物。將有機層用鹽水洗滌，經Na2 SO4 乾燥，且真空濃縮。藉由管柱層析(二氧化矽100 g；溶劑：10-20% EtOAc在正己烷中)來純化粗殘餘物(6.90 g)，得到呈白色泡沫狀之化合物24 (4.76 g，87%，2步)。 方案24
Figure 02_image325
Figure 02_image327
4. 藉由鈴木-宮浦交叉偶合(Suzuki-Miyaura cross-coupling)接合 方案25
Figure 02_image329
方案26
Figure 02_image331
如方案25-26中所示，將寡核苷酸之單股與配體(諸如親脂性部分) 接合，純化產物，隨後與互補股雜交，得到siRNA接合物。 方案27. 在CPG上接合
Figure 02_image333
方案27展示將配體(諸如親脂性部分)與附接至CPG之RNA接合的程序。實例8 ： 官能化之生物可裂解連接子及胺基磷酸酯 方案28. 各種碳水化合物(半乳糖、半乳糖胺、葡萄糖、葡糖胺、甘露糖、甘露糖胺衍生物或戊糖衍生物)。
Figure 02_image335
Figure 02_image337
在固體支撐物上合成siRNA接合物，連續添加方案28中所示之可裂解連接子中之一或多者，且隨後與互補股雜交，如圖3中所示。實例9 . 官能化之可裂解連接子及胺基磷酸酯 方案29. 各種經修飾之碳水化合物(半乳糖、半乳糖胺、葡萄糖、葡糖胺、甘露糖、甘露糖胺衍生物之二糖或三糖)
Figure 02_image339
在固體支撐物上合成siRNA接合物，連續添加方案29中所示之可裂解連接子中之一或多者，且隨後與互補股雜交，如圖3中所示。實例 10 ：官能化之蛋白酶可裂解連接子及胺基磷酸酯 方案30
Figure 02_image341
在固體支撐物上合成siRNA接合物，連續添加方案30中所示之可裂解連接子中之一或多者，且隨後與互補股雜交，如圖3中所示。實例 11 ：小鼠眼中之 mRNA 基因表現阻斷
用表1a中所列之siRNA接合物在野生型C57BL/6小鼠(n=5)中研究β連環蛋白基因沉默，隨後以7.5µg/眼(1.5µL)玻璃體內注射，在第14天處死小鼠。結果顯示於圖4中。 表1a.  使用小鼠玻璃體內注射之siRNA雙螺旋體。
Figure 108115771-A0304-0001
 * 斜體的大寫及小寫字母分別表示對腺苷、胞苷、鳥苷及尿苷之2'-去氧-2'-氟(2'-F)及2'-O -甲基(2'-OMe)糖修飾；s表示硫代磷酸酯(PS)鍵；VP-乙烯基膦酸酯；Uhd，2'-O -十六烷基尿苷'；Tam，2'-O -(N - 甲基乙醯胺)胸苷
Figure 02_image343
表1b. 表1a中所列之siRNA雙螺旋體的義股修飾的簡要描述。
Figure 108115771-A0304-0002
 實例 12 ： CNS 中之 mRNA 基因表現阻斷 表2. CNS研究中用於鞘內注射之siRNA雙螺旋體
Figure 108115771-A0304-0003
 Nf表示2'-去氧-2'-氟(2'-F)，小寫字母表示2'-O -甲基(2'-OMe)核苷酸；s表示硫代磷酸酯(PS)鍵；VP，乙烯基膦酸酯；Uhd，2'-O -十六烷基尿苷'；Tam，2'-O -(N -甲基乙醯胺)胸苷；靶基因轉錄物：SOD1，超氧化歧化酶1；b-cat，β-連環蛋白。
Figure 02_image345
在以0.9 mg劑量之單次鞘內注射後，與內源性對照及β連環蛋白處理組相比，用表2中所列之siRNA接合物研究史泊格多利大鼠(Sprague Dawley Rat)皮質中SOD1 mRNA之基因沉默(平均值±SD水準)。結果顯示於圖5中。
在以0.9 mg劑量之單次鞘內注射後，與內源性對照及β連環蛋白處理組相比，用表2中所列之siRNA接合物研究史泊格多利大鼠小腦中SOD1 mRNA之基因沉默(平均值±SD水準)。結果顯示於圖6中。
在以0.9 mg劑量之單次鞘內注射後，與內源性對照及β連環蛋白處理組相比，用表2中所列之siRNA接合物研究史泊格多利大鼠頸椎中SOD1 mRNA之基因沉默(平均值±SD水準)。結果顯示於圖7中。
在以0.9 mg劑量之單次鞘內注射後，與內源性對照及β連環蛋白處理組相比，用表2中所列之siRNA接合物研究史泊格多利大鼠腰椎中SOD1 mRNA之基因沉默(平均值±SD水準)。結果顯示於圖8中。
在以0.9 mg劑量之單次鞘內注射後，與內源性對照及β連環蛋白處理組相比，用表2中所列之siRNA接合物研究史泊格多利大鼠胸椎中SOD1 mRNA之基因沉默(平均值±SD水準)。結果顯示於圖9中。實例 13 ：親脂性修飾 ( C16 ) 在 siRNA 序列中之 位置影響
使用GalNAc接合物(基於二個F12序列，如表3中所示)在小鼠肝細胞中評估親脂性修飾之位置在整個siRNA序列中對義股及反義股的影響。將細胞與2.5及250 nM濃度之各siRNA接合物(列於表3中)一起培育以進行自由攝取(無轉染劑)，且在24小時後藉由RT-qPCR量測F12 mRNA (如圖10及圖11中所示)。將每孔2.5 μL來自表3之各siRNA添加至384孔盤中含有~5 ×103 PMH細胞之40 μL William's E培養基(Life Technology)中。在RNA純化之前，將細胞在37℃，5% CO2 下培育24小時。將值繪製為未處理對照細胞之一部分。各樣品以技術性一式二份運行，且各點代表2個生物樣品之平均值±%誤差。GAPDH充當內部對照，且相對未處理之對照繪製剩餘F12 mRNA的值。在初級食蟹猴肝細胞之一個內部位置具有C16修飾的F12 siRNA的活體外活性顯示在siRNA雙螺旋體中存在耐受C16-接合物之區域且所有位置的活性並不同等。 表3. 用於親脂性修飾(C16)在siRNA序列(F12)中之位置影響的siRNA
Figure 108115771-A0304-0004
 * 斜體的大寫及小寫字母分別表示對腺苷、胞苷、鳥苷及尿苷之2'-去氧-2'-氟(2'-F)及2'-O -甲基(2'-OMe)糖修飾；s表示硫代磷酸酯(PS)鍵；VP-乙烯基膦酸酯乙烯基膦酸酯；Nhd，2'-O -十六烷基；Tam，2'-O -(N -甲基乙醯胺)胸苷。
Figure 02_image347
實例 14 . C16 siRNA 結合物之血漿蛋白接合。
使用電泳遷移率變化分析(EMSA)測定具有親脂性修飾之siRNA雙螺旋體的蛋白質(使用人類血清白蛋白)結合特徵。將雙螺旋體與人類血清白蛋白一起培育，且測定未結合之部分。關於方案之詳情如下。將儲備濃度為10 µM之雙螺旋體稀釋至在1×PBS中含有0、20或90%血清的0.5 µM (20 µL總體積)的最終濃度。將樣品混合，離心30秒，且隨後在室溫下培育10分鐘。在培育完成後，將4 µL 6× EMSA凝膠加載溶液添加至各樣品中，離心30秒，且將12 µL各樣品加載於26孔BioRad 10% PAGE (聚丙烯醯胺凝膠電泳)上。凝膠在100伏下運行1小時。在運行完成後，自外殼中移出凝膠且在50 mL 10% TBE (Tris鹼、硼酸及EDTA)中洗滌。洗滌完成後，將5 µL SYBR Gold添加至凝膠中，使其在室溫下培育10分鐘，且再在50 mL 10% TBE中洗滌凝膠。使用Gel Doc XR+凝膠記錄系統使用以下參數讀取凝膠：成像應用設置為SYBR Gold，尺寸設置為Bio-Rad標準凝膠，曝光設置為自動用於強烈的條帶，高光飽和像素轉為1且顏色設置為灰色。偵測、分子量分析及輸出均被禁用。一旦獲得乾淨的凝膠照片，使用Image Lab 5.2處理圖像。手動設置泳道及條帶以量測條帶強度。各樣品之條帶強度相對於PBS標準化以獲得未結合之siRNA的分數。自此量測結果確定相對疏水性且繪製在圖12中。雙螺旋體之一些區域呈現中等蛋白質結合，且此在活體外轉化為更好的活性(參見實例13)實例15 ： 血漿蛋白結合之Kd 值 ( 與疏水性之相關性 ) 的測定 - 較低的數字表示緊密結合。
人類血清白蛋白與寡核苷酸之Kd 測定程序 ：將BioRad 10% TBE凝膠在100伏下預運行20分鐘。將儲備濃度為10 µM之雙螺旋體稀釋至含有各種濃度人類血清白蛋白(0 µM至1000 µM，增量為100)之0.5 µM (20 µL總體積)的最終濃度。將樣品混合，離心30秒，且隨後在室溫下培育10分鐘。在培育完成後，將4 µL 6× EMSA凝膠加載溶液添加至各樣品中，離心30秒，且將12 µL各樣品加載於26孔BioRad 10% TBE凝膠上。將凝膠在50伏下運行約20分鐘，以使整個樣品加載至凝膠上。一旦樣品完全加載，凝膠在100伏下運行1小時。在運行完成後，自外殼中移出凝膠且在50 mL 10% TBE中洗滌。洗滌完成後，將5 µL SYBR Gold添加至凝膠中，使其在室溫下培育10分鐘，且再在50 mL 10% TBE中洗滌凝膠。使用Gel Doc XR+凝膠記錄系統使用以下參數讀取凝膠：成像應用設置為SYBR Gold，尺寸設置為Bio-Rad標準凝膠，曝光設置為自動用於強烈的條帶，高光飽和像素轉為1且顏色設置為灰色。偵測、分子量分析及輸出均被禁用。一旦獲得乾淨的凝膠照片，使用Image Lab 5.2處理圖像。手動設置泳道及條帶以量測條帶強度。各樣品之條帶強度相對於無HSA之雙螺旋體標準化，以獲得結合之siRNA相對於HSA濃度之分數。結果顯示於表4-5中。 表4.
Figure 108115771-A0304-0005
 表5.
Figure 108115771-A0304-0006
 實例16 ：siRNA 接合物之鞘內遞送 (IT ) - 大鼠中之單次劑量時程 方案16-A. 用於CNS研究中之鞘內注射的方案及siRNA雙螺旋體
Figure 02_image349
在0.9 mg劑量之單次鞘內注射後，用上述方案16-A中所示之表中所列的siRNA接合物研究大鼠中之SOD1基因沉默及β-連環蛋白基因沉默。結果顯示於圖13-15中。
圖13B顯示所測試之腦及脊髓的所有區域。圖13A及13C顯示在大鼠中siRNA雙螺旋體之單次IT給藥後SOD1在圖13B中所示之各種區域中沉默的結果。如圖13A及13C中所示，在所測試之腦及脊髓的所有區域中均見到持久的SOD1 mRNA沉默。圖14A-14B顯示在單次IT給藥後β-連環蛋白沉默的結果。如圖14A-14B中所示，在所測試之腦及脊髓的所有區域中均見到持久的β-連環蛋白沉默。圖15顯示在大鼠中siRNA雙螺旋體之單次IT給藥後SOD1在各個區域中沉默的結果。圖15A顯示與未接合之siRNA水準相比，CSF中之接合之siRNA水準。如圖所示，對於接合之siRNA，發現CSF之快速siRNA清除。圖15B顯示與未接合之siRNA水準相比，腦中之接合之siRNA水準。如圖所示，發現接合之siRNA在腦中具有優於未接合之siRNA的攝取及穩定性。圖15C顯示與未接合之siRNA水準及對照siRNA水準相比，小腦中之接合之siRNA水準。如圖所示，接合之siRNA在腦中之攝取增加致使mRNA基因表現阻斷的顯著改良，從而表明靶向沉默。圖15A-15C示出在具有SOD1 siRNA接合物之腦中觀察到更高的藥物水準及穩固的沉默。實例 17 ：進一步改進 SOD1 siRNA 表6.
Figure 108115771-A0304-0007
表6顯示用不同化學方法修飾之SOD1 siRNA。對照為aCSF。圖16A-16B顯示用不同劑量的不同化學方法修飾之SOD1 siRNA使SOD1沉默的結果。如圖16A-16B所示，與親本SOD1 siRNA相比，用經修飾之SOD1 siRNA在低10倍的劑量水平下實現優異的沉默。實例18 ： 評估CNS siRNA 接合物向非人類靈長類動物 (NHP ) 遞送之轉化 - 單次劑量NHP 設計 方案18-A. 用於CNS研究中之鞘內注射的方案及siRNA雙螺旋體
Figure 02_image351
在72 mg推注劑量之單次鞘內注射後，用上述方案18-A中所示之表中所列的siRNA接合物研究非人類靈長類動物中之β-連環蛋白基因沉默。結果顯示於圖17-23中。
圖17顯示在第31天，在例示性siRNA雙螺旋體之單次鞘內(IT)給藥後，非人類靈長類動物(NHP)之各種脊髓及腦區中的β-連環蛋白siRNA水準。該圖示出，在第31天時間點，在所有測試組織中仍存在顯著的siRNA水準，儘管siRNA攝取在各種CNS區域之間變化，且在肝臟中亦觀察到siRNA。圖18顯示在第31天在NHP中例示性siRNA雙螺旋體之單次鞘內給藥後β-連環蛋白mRNA沉默的結果。如圖所示，靶向β-連環蛋白之siRNA接合物在31天時間點在CNS中(在整個脊髓及腦區中)產生穩固的阻斷基因表現。圖19顯示說明在單次IT給藥後β-連環蛋白siRNA在非人類靈長類動物之整個CNS中之分佈的圖像。圖20顯示說明神經元中siRNA攝取之圖像。如圖所示，MAP2為神經元標誌物，且用siRNA抗體探測β-連環蛋白(CTNNB) siRNA。圖21顯示說明在單次IT給藥後定位於微神經膠質細胞之siRNA接合物的圖像。如圖所示，Iba1為微神經膠質細胞標誌物，且用siRNA抗體探測β-連環蛋白(CTNNB) siRNA。圖22顯示說明在單次IT給藥後定位於星形膠質細胞之siRNA接合物的圖像。如圖所示，GFAP為星形膠質細胞標誌物，且用siRNA抗體探測β-連環蛋白(CTNNB) siRNA。圖23比較在大鼠及NHP中在區室標度劑量下觀察到的基因沉默活性。
總之，在IT投與後，在大鼠及NHP之CNS中觀察到靶mRNA之持久沉默。沉默延長至研究結束。具有不同化學性質之siRNA的進一步最佳化設計使得效力提高大於10倍。在所檢查之所有CNS組織中觀察到組織攝取，其中藥物水準在ng/g至mg/g範圍內。在大鼠及NHP研究中，發現鞘內投與新穎的siRNA接合物通常具有良好的耐受性。實例 19 ：親脂體與 siRNA 之內部接合 方案31
Figure 02_image353
方案31示出親脂體與siRNA雙螺旋體內部接合之合成方案。在方案31中，親脂部分R可為C6 -C30 醇(例如，己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇、十三烷醇、十四烷醇、十五烷醇、十六烷醇、十七烷醇、十八烷醇、油醇、亞油醇、花生四烯醇、順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯醇、視黃醇、維生素E、膽固醇等)。 方案32
Figure 02_image355
方案32示出親脂體與siRNA雙螺旋體內部接合之替代性合成方案。在方案32中，親脂部分R可為C6 -C30 醇(例如，己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇、十三烷醇、十四烷醇、十五烷醇、十六烷醇、十七烷醇、十八烷醇、油醇、亞油醇、花生四烯醇、順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯醇、視黃醇、維生素E、膽固醇等)。實例 20 ：親脂性部分與 siRNA 之合成後接合 方案33
Figure 02_image357
Figure 02_image359
方案33示出親脂體與siRNA雙螺旋體之合成後內部接合的方案。在方案33中，R或COR = C6 -C30 酸(例如，己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、油酸、亞麻油酸、花生四烯酸、順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、維生素A、維生素E、膽固醇等。COOR= C6 -C30 醇(例如，己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇、十三烷醇、十四烷醇、十五烷醇、十六烷醇、十七烷醇、十八烷醇、油醇、亞油醇、花生四烯醇、順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯醇、視黃醇、維生素E、膽固醇等)。 方案34
Figure 02_image361
方案34示出親脂體與siRNA雙螺旋體之合成後內部接合的替代性方案。在方案34中，R、COR或COOR = C6 -C30 酸(例如，己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、油酸、亞麻油酸、花生四烯酸、順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、維生素A、維生素E、膽固醇等)。COOR= C6 -C30 醇(例如，己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇、十三烷醇、十四烷醇、十五烷醇、十六烷醇、十七烷醇、十八烷醇、油醇、亞油醇、花生四烯醇、順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯醇、視黃醇、維生素E、膽固醇等)。實例 21 ：小鼠內部脂質接合物之 SAR
在小鼠中研究具有親脂性內部接合之siRNA的結構活性關係。此實例中之序列顯示於下表7中。 表7
Figure 108115771-A0304-0008
Figure 02_image363
小鼠 1 號內部脂質接合物之 SAR 。 圖24顯示在以3 μg或7.5 μg之劑量投與表7中所示之各種例示性siRNA雙螺旋體後，在第14天小鼠眼中TTR mRNA水準的結果。如上表7中所示，siRNA係藉由在義股之內部位置接合親脂性部分(油基、C16 、C14 、C12 或C10 )來修飾。如圖24中所示，具有親脂性接合之siRNA的TTR阻斷基因表現能力為：油基(C18 ) ≥ C16 > C14 > C12 > C10 。 此結果說明疏水性對siRNA之基因沉默活性的影響。
Figure 02_image365
小鼠 2 號內部脂質接合物之 SAR 。 圖25顯示在以7.5 μg之劑量投與表7中所示之各種例示性siRNA雙螺旋體後，在第14天小鼠眼中TTR mRNA水準的結果。如圖25所示，與油基(C18 )、花生四烯酸及維生素A接合物接合之siRNA具有比其他接合物更好的TTR阻斷基因表現能力。
Figure 02_image367
。
小鼠中具有內部C16 接合物之5 ' AS 股 SAR 。 圖26顯示在以7.5 μg之劑量玻璃體內投與表7中所示之各種例示性siRNA雙螺旋體後，在第14天小鼠眼中TTR mRNA水準的結果。如上表7中所示，siRNA係藉由接合在義股之內部位置的親脂性部分(C16 )及在反義股之5'端的各種修飾(例如，2個對掌性PS；2'-OMe；VP；1個對掌性PS；PO3；DNA；RNA；2'-F；磷酸酯前藥)來修飾。
Figure 02_image369
。參考文獻
本文提及之所有公開案及專利，包括下面列出的彼等條目，特此以全文引用之方式併入，如同各個別公開案或專利具體地且獨立地指示為以引用之方式併入一般。在有衝突之情況下，以本申請案(包括本文中之任何定義)為準。
圖1為顯示在義股或反義股之內部位置(亦即，siRNA序列內之某處)與siRNA接合之配體(諸如親脂性部分)的示意圖。
圖2為顯示在義股或反義股之3'及/或5'端經由連接子或載體與siRNA接合之配體(諸如親脂性部分)的示意圖。
圖3為顯示經由生物可裂解連接子與siRNA接合之配體(諸如親脂性部分)的示意圖。
圖4為顯示藉由在小鼠玻璃體內注射各種例示性siRNA接合物使β連環蛋白基因(眼CTNNB1)沉默之結果的圖。
圖5為顯示藉由在史泊格多利大鼠之皮質中單次鞘內注射各種例示性siRNA接合物使SOD1 mRNA沉默之結果的圖。
圖6為顯示藉由在史泊格多利大鼠之小腦中單次鞘內注射各種例示性siRNA接合物使SOD1 mRNA沉默之結果的圖。
圖7為顯示藉由在史泊格多利大鼠之頸椎中單次鞘內注射各種例示性siRNA接合物使SOD1 mRNA沉默之結果的圖。
圖8為顯示藉由在史泊格多利大鼠之腰椎中單次鞘內注射各種例示性siRNA接合物使SOD1 mRNA沉默之結果的圖。
圖9為顯示藉由在史泊格多利大鼠之胸椎中單次鞘內注射各種例示性siRNA接合物使SOD1 mRNA沉默之結果的圖。
圖10顯示在2.5及250 nM濃度下與藉由在反義股及義股之各位置接合親脂性部分(C16)而修飾之F12 siRNA培育之細胞的初級食蟹猴肝細胞(PCH)自由攝取(無轉染劑)的結果，其係在24小時後使用RT-qPCR量測F12 mRNA水準所得。
圖11顯示在2.5及250 nM濃度下與藉由在反義股及義股之各位置接合親脂性部分(C16)而修飾之F12 siRNA培育之細胞的初級食蟹猴肝細胞(PCH)自由攝取(無轉染劑)的結果，其係在24小時後使用RT-qPCR量測F12 mRNA水準所得。
圖12顯示藉由在反義股及義股之各位置接合親脂性部分(C16)而修飾之siRNA雙螺旋體之反義股及義股的各位置的相對疏水性結果，其係藉由在各siRNA接合物與人類血清白蛋白一起培育後使用電泳遷移率變化分析量測未結合分數來測定。
圖13A-13C顯示在所測試之腦及脊髓的所有區域中均觀察到持久的SOD1 mRNA沉默。圖13A顯示在大鼠中藉由單次鞘內注射各種例示性siRNA接合物而分別在腰椎、胸椎及頸椎區域中使SOD1 mRNA沉默的結果。圖13B為顯示在大鼠CNS中測試之各種組織的示意圖。圖13C顯示在大鼠中藉由單次鞘內注射各種例示性siRNA接合物而分別在小腦、額葉皮質及其餘腦區域中使SOD1 mRNA沉默的結果。
圖14A-14B顯示在單次鞘內劑量後使β-連環蛋白沉默的結果。圖14A顯示在大鼠中之各種例示性siRNA接合物分別在腰椎、胸椎及頸椎區域中使β-連環蛋白沉默的結果。圖14B顯示在大鼠中之各種例示性siRNA接合物分別在小腦、額葉皮質及其餘腦區域中使β-連環蛋白沉默的結果。
圖15A-15C顯示在大鼠中在例示性siRNA雙螺旋體之單次鞘內給藥後使SOD1沉默的結果，表明在具有SOD1 siRNA接合物之腦中觀察到更高的藥物水準及穩固的沉默。圖15A顯示與未接合之siRNA水準相比，CSF中之接合之siRNA水準。圖15B顯示與未接合之siRNA水準相比，腦中之接合之siRNA水準。圖15C顯示與未接合之siRNA水準及對照siRNA水準相比，小腦中之接合之siRNA水準。
圖16A-16B顯示在不同劑量下在不同化學修飾下使SOD1沉默的結果。圖16A顯示在大鼠中分別在腰椎、胸椎及頸椎區域中使SOD1沉默的結果。圖16B顯示在大鼠中分別在小腦、額葉皮質及其餘腦區域中使SOD1沉默的結果。
圖17顯示在例示性siRNA雙螺旋體之單次鞘內(IT)給藥後，在第31天在非人類靈長類動物(NHP)之各種區域中之β-連環蛋白siRNA水準的結果。
圖18顯示在第31天，在各種組織中β-連環蛋白mRNA之穩固基因沉默的結果。
圖19顯示說明在單次IT給藥後，在NHP中分佈在整個CNS中之siRNA的圖片。
圖20顯示說明在單次IT給藥後，定位於神經元之siRNA接合物的圖片。MAP2為神經元標誌物。
圖21顯示說明在單次IT給藥後，定位於微神經膠質細胞之siRNA接合物的圖片。Iba1為微神經膠質細胞標誌物。
圖22顯示說明在單次IT給藥後，定位於星形膠質細胞之siRNA接合物的圖片。
圖23顯示比較在大鼠及NHP中在區室標度劑量下觀察到的基因沉默活性的圖。
圖24顯示在以3 μg或7.5 μg之劑量投與表7中所示之各種例示性siRNA雙螺旋體後，在第14天小鼠眼中TTR mRNA水準的結果。
圖25顯示在以7.5 μg之劑量投與表7中所示之各種例示性siRNA雙螺旋體後，在第14天小鼠眼中TTR mRNA水準的結果。
圖26顯示在以7.5 μg之劑量玻璃體內投與表7中所示之各種例示性siRNA雙螺旋體後，在第14天小鼠眼中TTR mRNA水準的結果。

Claims (56)

  1. 一種雙股iRNA劑，其包含： 與一靶基因互補之一反義股(antisense strand)； 與該反義股互補之一義股(sense strand)；以及 任擇地經由一連接子或載體與至少一股上之一或多個內部位置接合(conjugated)的一或多個親脂性部分。
  2. 如請求項1之雙股iRNA劑，其中藉由logKow 量測之該親脂性部分之親脂性超過0。
  3. 如請求項1之雙股iRNA劑，其中藉由該雙股iRNA劑之血漿蛋白結合分析中之未結合分數量測的該雙股iRNA劑之疏水性超過0.2。
  4. 如請求項3之雙股iRNA劑，其中該血漿蛋白結合分析為一使用人類血清白蛋白之電泳遷移率變化分析(electrophoretic mobility shift assay)。
  5. 如請求項1之雙股iRNA劑，其中該等內部位置包括除該股各端之末端二個位置之外的所有位置。
  6. 如請求項5之雙股iRNA劑，其中該等內部位置包括除該股各端之末端三個位置之外的所有位置。
  7. 如請求項5或6之雙股iRNA劑，其中該等內部位置不包括該義股之裂解位點區。
  8. 如請求項7之雙股iRNA劑，其中該等內部位置不包括自該義股之5'端計數的位置9-12。
  9. 如請求項7之雙股iRNA劑，其中該等內部位置不包括自該義股之3'端計數的位置11-13。
  10. 如請求項5或6之雙股iRNA劑，其中該等內部位置不包括該反義股之裂解位點區。
  11. 如請求項10之雙股iRNA劑，其中該等內部位置不包括自該反義股之5'端計數的位置12-14。
  12. 如請求項5或6之雙股iRNA劑，其中該等內部位置不包括該義股上自3'端計數之位置11-13以及該反義股上自5'端計數之位置12-14。
  13. 如請求項1之雙股iRNA劑，其中一或多個親脂性部分與以下內部位置中之一或多者接合：自各股之5'端計數，該義股上之位置4-8以及13-18，以及該反義股上之位置6-10以及15-18。
  14. 如請求項13之雙股iRNA劑，其中一或多個親脂性部分與以下內部位置中之一或多者接合：自各股之5'端計數，該義股上之位置5、6、7、15以及17，以及該反義股上之位置15以及17。
  15. 如請求項1至14中任一項之雙股iRNA劑，其中該等義股以及反義股之長度各為15至30個核苷酸。
  16. 如請求項1至14中任一項之雙股iRNA劑，其中該等義股以及反義股之長度各為19至25個核苷酸。
  17. 如請求項1至14中任一項之雙股iRNA劑，其中該等義股以及反義股之長度各為21至23個核苷酸。
  18. 如請求項17之雙股iRNA劑，其中該義股之長度為21個核苷酸，且該等反義股之長度為23個核苷酸，其中該等股形成一21個連續鹼基對之雙股區且在3'端具有一2個核苷酸長的單股突出端。
  19. 如請求項1之雙股iRNA劑，其中該親脂性部分為一脂族、脂環族或聚脂環化合物。
  20. 如請求項19之雙股iRNA劑，其中該親脂性部分為脂質、膽固醇、視黃酸、膽酸、金剛烷乙酸(adamantane acetic acid)、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉氧基己醇(geranyloxyhexyanol)、十六烷基甘油、冰片(borneol)、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基(dimethoxytrityl)或啡噁嗪(phenoxazine)。
  21. 如請求項19之雙股iRNA劑，其中該親脂性部分含有一飽和或不飽和C4 -C30 烴鏈以及一選自由以下組成之群之任擇官能基：羥基、胺、羧酸、磺酸酯基、磷酸酯基、硫醇、疊氮基以及炔。
  22. 如請求項21之雙股iRNA劑，其中該親脂性部分含有一飽和或不飽和C6 -C18 烴鏈。
  23. 如請求項22之雙股iRNA劑，其中該親脂性部分含有一飽和或不飽和C16 烴鏈。
  24. 如請求項1至23中任一項之雙股iRNA劑，其中該親脂性部分經由一載體來接合，該載體置換該(等)內部位置中之一或多個核苷酸。
  25. 如請求項24之雙股iRNA劑，其中該載體為一選自由以下組成之群的環狀基團：吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊環基、噁唑啶基、異噁唑啶基、嗎啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹喏啉基、噠嗪酮基、四氫呋喃基以及十氫萘基；或為基於絲胺醇主鏈或二乙醇胺主鏈之非環狀部分。
  26. 如請求項1至25中任一項之雙股iRNA劑，其中該親脂性部分經由一連接子與該雙股iRNA劑接合，該連接子含有一醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、醯胺、馬來醯亞胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺醯胺鍵、點擊反應之產物或胺基甲酸酯。
  27. 如請求項1至26中任一項之雙股iRNA劑，其中該iRNA劑在該等末端中之至少一者上包含一單股突出端。
  28. 如請求項27之雙股iRNA劑，其中該單股突出端之長度為1、2或3個核苷酸。
  29. 如請求項1至28中任一項之雙股iRNA劑，其中該親脂性部分與一核鹼基、糖部分或核苷間鍵接合。
  30. 如請求項1至29中任一項之雙股iRNA劑，其進一步包含在該反義股之5'端的一磷酸酯或磷酸酯模擬物。
  31. 如請求項30之雙股iRNA劑，其中該磷酸酯模擬物為一5'-乙烯基膦酸酯(VP)。
  32. 如請求項1至31中任一項之雙股iRNA劑，其進一步包含一靶向配體，其靶向一介導遞送至一CNS組織的受體。
  33. 如請求項32之雙股iRNA劑，其中該靶向配體係選自由以下組成之群：血管肽-2(Angiopep-2)、脂蛋白受體相關蛋白(LRP)配體、bEnd.3細胞結合配體、運鐵蛋白受體(TfR)配體、甘露糖受體配體、葡萄糖轉運蛋白以及LDL受體配體。
  34. 如請求項1至31中任一項之雙股iRNA劑，其進一步包含一靶向配體，其靶向一介導遞送至一眼組織的受體。
  35. 如請求項34之雙股iRNA劑，其中該靶向配體係選自由以下組成之群：反式視黃醇、RGD肽、LDL受體配體以及基於碳水化合物之配體。
  36. 如請求項35之雙股iRNA劑，其中該RGD肽為H-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-Cys-OH或Cyclo(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)。
  37. 如請求項1至36中任一項之雙股iRNA劑，其進一步包含一靶向一肝組織的靶向配體。
  38. 如請求項37之雙股iRNA劑，其中該靶向配體為一GalNAc接合物。
  39. 如請求項1至38中任一項之雙股iRNA劑，其中該親脂性部分或靶向配體經由一生物可裂解連接子接合，該生物可裂解連接子選自由以下組成之群：DNA、RNA、二硫化物、醯胺；半乳糖胺、葡糖胺、葡萄糖、半乳糖、甘露糖之官能化單糖或寡糖以及其組合。
  40. 如請求項1至39中任一項之雙股iRNA劑，其中該義股之3'端經由一端帽受保護，該端帽為一具有一胺之環狀基團，該環狀基團係選自由以下組成之群：吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊環基、噁唑啶基、異噁唑啶基、嗎啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹喏啉基、噠嗪酮基、四氫呋喃基以及十氫萘基。
  41. 一種降低一細胞中一靶基因之表現的方法，其包含使該細胞與一雙股iRNA劑接觸，該雙股iRNA劑包含： 與一靶基因互補之一反義股； 與該反義股互補之一義股；以及 任擇地經由一連接子或載體與至少一股上之一或多個內部位置接合的一或多個親脂性部分。
  42. 如請求項41之方法，其中該細胞為一肝外細胞。
  43. 如請求項41之方法，其中藉由logKow 量測之該親脂性部分之親脂性超過0。
  44. 如請求項41之方法，其中藉由該雙股iRNA劑之血漿蛋白結合分析中之未結合分數量測的該雙股iRNA劑之疏水性超過0.2。
  45. 如請求項44之方法，其中該血漿蛋白結合分析為一使用人類血清白蛋白之電泳遷移率變化分析。
  46. 如請求項41之方法，其中該親脂性部分含有一飽和或不飽和C16 烴鏈。
  47. 一種降低一個體內之一靶基因之表現的方法，其包含向該個體投與一雙股iRNA劑，該雙股iRNA劑包含： 與一靶基因互補之一反義股； 與該反義股互補之一義股；以及 任擇地經由一連接子或載體與至少一股上之一或多個內部位置接合的一或多個親脂性部分。
  48. 如請求項47之方法，其中該雙股iRNA劑係肝外投與。
  49. 如請求項48之方法，其中該雙股iRNA劑係鞘內(intrathecally)投與。
  50. 如請求項49之方法，其中該方法降低一腦或脊柱組織中一靶基因之表現。
  51. 如請求項50之方法，其中該腦或脊柱組織係選自由以下組成之群：皮質、小腦、頸椎、腰椎以及胸椎。
  52. 如請求項48之方法，其中該靶基因係選自由以下組成之群：APP、ATXN2、C9orf72、TARDBP、MAPT(Tau)、HTT、SNCA、FUS、ATXN3、ATXN1、SCA1、SCA7、SCA8、MeCP2、PRNP、SOD1、DMPK以及TTR。
  53. 如請求項52之方法，其中該雙股iRNA劑係玻璃體內(intravitreally)投與。
  54. 如請求項53之方法，其中該方法降低一眼組織中一靶基因之表現。
  55. 一種治療一患有一CNS病症之個體的方法，其包含： 向該個體投與治療有效量之如請求項1至40中任一項之雙股RNAi劑，從而治療該個體。
  56. 如請求項55之方法，其中該CNS病症係選自由以下之群：阿茲海默病(alzheimer)、肌萎縮性側索硬化(ALS)、額顳葉型癡呆、亨廷頓病(huntington)、帕金森病(Parkinson)、脊髓小腦病、朊病毒病以及拉福拉病(lafora)。
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