JP2021522810A - 肝臓外送達 - Google Patents

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Abstract

本発明は、遺伝子サイレンシングの方法であって、任意選択でリンカー又は担体を介して、少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置において親油性部分がコンジュゲートした二本鎖ｉＲＮＡの治療有効量を、細胞又は必要としている対象に投与するステップを含む、方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、それぞれ参照により全内容が本明細書に組み入れられる、２０１８年５月７日出願の米国仮特許出願第６２／６６８，０７２号；２０１８年９月２８日出願の米国仮特許出願第６２／７３８，７４７号；及び２０１８年１１月２９日出願の米国仮特許出願第６２／７７３，０８２号の優先権の利益を主張するものである。
ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞へのｉＲＮＡ剤の効率的な送達は、特異的な標的化、及び細胞外環境、特に血清タンパク質からの実質的な保護を必要とする。ＲＮＡｉに基づく治療法は、肝臓関連疾患の治療のための有望な臨床データを示す。しかしながら、肝臓外組織へのｓｉＲＮＡの送達は、依然として障害であり、ｓｉＲＮＡに基づく治療法の使用を制限している。
ｉｎ ｖｉｖｏでのｉＲＮＡ剤の実験的及び治療的応用を制限する要因の１つは、インタクトなｓｉＲＮＡを効率的に送達する能力である。具体的な困難は、ｉｎ ｖｉｖｏでの網膜への非ウイルス遺伝子導入に関連している。難題の１つは、網膜のトランスフェクションを妨げる内境界膜を乗り越えることである。さらに、硝子体の負に帯電した糖が、陽性ＤＮＡ−トランスフェクション試薬複合体と相互作用して、それらの凝集を促進し、拡散及び細胞取り込みを妨げることが示されている。
中枢神経系（ＣＮＳ）中へのオリゴヌクレオチドの送達は、遊離オリゴヌクレオチドが越えられない血液脳関門（ＢＢＢ）による特定の問題を有する。オリゴヌクレオチドを中枢神経系中に送達するための一手段は、髄腔内送達による。しかしながら、オリゴヌクレオチドはまた、所望の治療効果を達成するために、中枢神経系の標的細胞に効率的に取り込まれる必要がある。過去の研究では、典型的に、ニューロン由来の細胞へのオリゴヌクレオチドの細胞内取り込みを助けるために、リポソーム、カチオン性脂質、及びナノ粒子形成複合体などの送達試薬を使用した。
したがって、ｉＲＮＡ剤の治療可能性を達成及び促進するために、組織送達試薬を用いずに、ｉｎ ｖｉｖｏでｓｉＲＮＡ分子を送達するための新規の且つ改良された方法が必要とされ続けている。
本発明の一態様は、標的遺伝子に相補的なアンチセンス鎖；前記アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖；及び任意選択でリンカー又は担体を介して、少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分を含む二本鎖ｉＲＮＡ剤を提供する。
一部の実施形態では、オクタノール−水分配係数、ｌｏｇＫｏｗによって測定される親油性部分の親油性は、０を超える。親油性部分は、１超、１．５超、２超、３超、４超、５超、又は１０超のｌｏｇＫｏｗを有し得る。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤の血漿タンパク質結合アッセイにおいて非結合分画によって測定される、二本鎖ｉＲＮＡ剤の疎水性は、０．２を超える。一実施形態では、決定される血漿タンパク質結合アッセイは、ヒト血清アルブミンタンパク質を用いた電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）である。結合アッセイにおいて非結合ｓｉＲＮＡの分画によって測定される、二本鎖ｉＲＮＡ剤の疎水性は、ｓｉＲＮＡの向上したｉｎ ｖｉｖｏ送達のために、０．１５超、０．２超、０．２５超、０．３超、０．３５超、０．４超、０．４５超、又は０．５超である。
一部の実施形態では、親油性部分は、脂肪族、環状、例えば脂環式、又は多環式、例えば多脂環式化合物、例えばステロイド（例えば、ステロール）又は直鎖若しくは分岐鎖脂肪族炭化水素である。例示的な親油性部分は、脂質、コレステロール、レチノイン酸、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキサノール（ｇｅｒａｎｙｌｏｘｙｈｅｘｙａｎｏｌ）、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、イブプロフェン、ナプロキセン、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジンである。
適切な親油性部分としては、飽和又は不飽和Ｃ４〜Ｃ３０炭化水素鎖（例えば、Ｃ４〜Ｃ３０アルキル又はアルケニル）、並びにヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジド、及びアルキンからなる群から選択される任意選択の官能基を含有するものも挙げられる。この官能基は、親油性部分をｉＲＮＡ剤に結合するのに有用である。一部の実施形態では、親油性部分は、飽和又は不飽和Ｃ６〜Ｃ１８炭化水素鎖（例えば、直鎖Ｃ６〜Ｃ１８アルキル又はアルケニル）を含有する。一実施形態では、親油性部分は、飽和又は不飽和Ｃ１６炭化水素鎖（例えば、直鎖Ｃ１６アルキル又はアルケニル）を含有する。
一部の実施形態では、親油性部分は、Ｃ６〜Ｃ３０酸（例えば、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸、オクタデカン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、シス−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサン酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ、コレステロールなど）又はＣ６〜Ｃ３０アルコール（例えば、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプタデカノール、オクタデカノール、オレイルアルコール、リノレイルアルコール、アラキドン酸アルコール、シス−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサノール、レチノール、ビタミンＥ、コレステロールなど）である。
親油性部分は、ｉＲＮＡ剤のリボ糖への直接結合を介して、ｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされ得る。或いは、親油性部分は、リンカー又は担体を介して、ｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされ得る。
特定の実施形態では、親油性部分は、１つ以上のリンカー（テザー）を介して、ｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、親油性部分は、エーテル、チオエーテル、尿素、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド−チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホンアミド結合、クリック反応の生成物（例えば、アジド−アルキン環状付加からのトリアゾール）、又はカルバメートを含むリンカーを介して、二本鎖ｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、リンカー（テザー）の少なくとも１つは、酸化還元性切断可能リンカー（還元的に切断可能なリンカー；例えば、ジスルフィド基など）、酸性切断可能リンカー（例えば、ヒドラゾン基、エステル基、アセタール基、又はケタール基）、エステラーゼ切断可能リンカー（例えば、エステル基）、ホスファターゼ切断可能リンカー（例えば、リン酸基）、又はペプチダーゼ切断可能リンカー（例えば、ペプチド結合）である。
他の実施形態では、リンカー（テザー）の少なくとも１つは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ジスルフィド、アミド、ガラクトサミン、グルコサミン、グルコース、ガラクトース、マンノースの官能化単糖又はオリゴ糖、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるバイオ切断可能リンカーである。
特定の実施形態では、親油性部分は、１つ以上のヌクレオチドを置換する担体を介して、二本鎖ｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされる。担体は、環状基又は非環状基であり得る。一実施形態では、環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル、及びデカリンからなる群から選択される。一実施形態では、非環状基は、セリノール骨格又はジエタノールアミン骨格に基づく部分である。
一部の実施形態では、担体は、二本鎖ｉＲＮＡ剤の内部位置において１つ以上のヌクレオチドを置換する。
他の実施形態では、担体は、センス鎖又はアンチセンス鎖の末端においてヌクレオチドを置換する。一実施形態では、担体は、センス鎖の３’末端において末端ヌクレオチドを置換し、それによって、センス鎖の３’末端を保護するエンドキャップとして機能する。一実施形態では、担体は、アミンを有する環状基であり、例えば、担体は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、又はデカリニルであり得る。
一実施形態では、親油性部分は、鎖の各末端から末端の２つの位置を除く全ての位置を含む、少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置にコンジュゲートされる。一実施形態では、親油性部分は、鎖の各末端から末端の３つの位置を除く全ての位置を含む、少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置にコンジュゲートされる。
一実施形態では、少なくとも１つの親油性部分は、二重鎖領域内の全ての位置を含むが、オーバーハング領域を含まない、二重鎖領域の少なくとも１つの端部の１つ以上の位置、又はセンス鎖の３’末端において末端ヌクレオチドを置換する担体にコンジュゲートされる。
一実施形態では、少なくとも１つの親油性部分は、二重鎖領域のアンチセンス鎖の５’末端における最初の５つの塩基対内のセンス鎖にコンジュゲートされる。
一実施形態では、少なくとも１つの親油性部分は、二重鎖領域のアンチセンス鎖の５’末端における最初の４つの塩基対内のセンス鎖にコンジュゲートされる。
一実施形態では、少なくとも１つの親油性部分は、二重鎖領域のアンチセンス鎖の５’末端における最初の３つの塩基対内のセンス鎖にコンジュゲートされる。
一実施形態では、少なくとも１つの親油性部分は、二重鎖領域のアンチセンス鎖の５’末端における最初の２つの塩基対内のセンス鎖にコンジュゲートされる。
一実施形態では、少なくとも１つの親油性部分は、二重鎖領域のアンチセンス鎖の５’末端における最初の塩基対内のセンス鎖にコンジュゲートされる。
一実施形態では、親油性部分は、センス鎖の切断部位領域を除く、少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置にコンジュゲートされる。例えば、内部位置は、センス鎖の５’末端から数えて９〜１２位を除く。例えば、内部位置は、センス鎖の５’末端から数えて９〜１１位を除く。或いは、内部位置は、センス鎖の３’末端から数えて１１〜１３位を除く。
一実施形態では、親油性部分は、アンチセンス鎖の切断部位領域を除く、少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置にコンジュゲートされる。例えば、内部位置は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて１２〜１４位を除く。
一実施形態では、親油性部分は、３’末端から数えて、センス鎖上の１１〜１３位、及び５’末端から数えて、アンチセンス鎖上の１２〜１４位を除く、少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置にコンジュゲートされる。
一実施形態では、１つ以上の親油性部分は、以下の内部位置：各鎖の５’末端から数えて、センス鎖上の４〜８及び１３〜１８位、並びにアンチセンス鎖上の６〜１０及び１５〜１８位のうちの１つ以上にコンジュゲートされる。
一実施形態では、１つ以上の親油性部分は、以下の内部位置：各鎖の５’末端から数えて、センス鎖上の５、６、７、１５、及び１７位、並びにアンチセンス鎖上の１５及び１７位のうちの１つ以上にコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖はそれぞれ、１５〜３０ヌクレオチド長である。
一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖はそれぞれ、１９〜２５ヌクレオチド長である。
一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖はそれぞれ、２１〜２３ヌクレオチド長である。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、末端の少なくとも１つに一本鎖オーバーハング、例えば、１〜１０ヌクレオチド長の３’及び／又は５’オーバーハング、例えば、１、２、３、４、５、又は６ヌクレオチドのオーバーハングを含む。一部の実施形態では、両方の鎖は、二本鎖領域において１〜５つ（例えば、１、２、３、４、又は５つ）の一本鎖ヌクレオチドの少なくとも１つの区間を有する。一実施形態では、一本鎖オーバーハングは、１、２、又は３ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤はまた、アンチセンス鎖の５’末端（又はセンス鎖の３’末端）に位置する平滑末端を有してもよく、又は逆もまた同様である。一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に３’オーバーハング、及び任意選択で、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む。一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、センス鎖の５’末端に５’オーバーハング、及び任意選択で、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ二重鎖の両端に２つの平滑末端を有する。
一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、２１ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は、２３ヌクレオチド長であり、ここで、鎖は、３’末端に２ヌクレオチド長の一本鎖オーバーハングを有する２１の連続した塩基対の二本鎖領域を形成する。
一部の実施形態では、親油性部分は、二本鎖ｉＲＮＡ剤の核酸塩基、糖部分、又はヌクレオシド間結合にコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の５’末端にリン酸塩又はリン酸塩模倣体をさらに含む。一実施形態では、リン酸塩模倣体は、５’−ビニルホスホネート（ＶＰ）である。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の５’末端は、５’−ビニルホスホネート（ＶＰ）を含まない。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、少なくとも１つの末端キラルリン原子をさらに含む。
ヌクレオチド間結合の部位特異的なキラル修飾が、鎖の５’末端、３’末端、又は５’末端及び３’末端の両方において存在し得る。これは、本明細書では、「末端」キラル修飾と呼ばれる。末端修飾は、末端領域における３’又は５’末端位置において、例えば、末端ヌクレオチド又は鎖の最後の２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０ヌクレオチド内の位置において存在し得る。キラル修飾は、センス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方において起こり得る。キラル純粋リン原子のそれぞれは、Ｒｐ配置又はＳｐ配置、及びそれらの組み合わせのいずれかであり得る。キラル修飾及びキラル修飾ｄｓＲＮＡ剤に関するさらなる詳細が、参照により全内容が本明細書に組み入れられる、２０１８年１２月２１日出願の、“Ｃｈｉｒａｌｌｙ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ Ａｇｅｎｔｓ”という名称のＰＣＴ／ＵＳ１８／６７１０３号明細書に見出され得る。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、Ｓｐ配置で結合リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端における第１のヌクレオチド間結合において存在する末端キラル修飾；Ｒｐ配置で結合リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’末端における第１のヌクレオチド間結合において存在する末端キラル修飾；及びＲｐ配置又はＳｐ配置のいずれかで結合リン原子を有する、センス鎖の５’末端における第１のヌクレオチド間結合において存在する末端キラル修飾をさらに含む。
一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、Ｓｐ配置で結合リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端における第１及び第２のヌクレオチド間結合において存在する末端キラル修飾；Ｒｐ配置で結合リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’末端における第１のヌクレオチド間結合において存在する末端キラル修飾；及びＲｐ又はＳｐ配置のいずれかで結合リン原子を有する、センス鎖の５’末端における第１のヌクレオチド間結合において存在する末端キラル修飾をさらに含む。
一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、Ｓｐ配置で結合リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端における第１、第２、及び第３のヌクレオチド間結合において存在する末端キラル修飾；Ｒｐ配置で結合リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’末端における第１のヌクレオチド間結合において存在する末端キラル修飾；及びＲｐ又はＳｐ配置のいずれかで結合リン原子を有する、センス鎖の５’末端における第１のヌクレオチド間結合において存在する末端キラル修飾をさらに含む。
一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、Ｓｐ配置で結合リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端における第１及び第２のヌクレオチド間結合において存在する末端キラル修飾；Ｒｐ配置で結合リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端における第３のヌクレオチド間結合において存在する末端キラル修飾；Ｒｐ配置で結合リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’末端における第１のヌクレオチド間結合において存在する末端キラル修飾；及びＲｐ又はＳｐ配置のいずれかで結合リン原子を有する、センス鎖の５’末端における第１のヌクレオチド間結合において存在する末端キラル修飾をさらに含む。
一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における第１及び第２のヌクレオチド間結合において存在する末端キラル修飾、Ｓｐ配置で結合リン原子を有する、；Ｒｐ配置で結合リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’末端における第１、及び第２のヌクレオチド間結合において存在する末端キラル修飾；及びＲｐ又はＳｐ配置のいずれかで結合リン原子を有する、センス鎖の５’末端における第１のヌクレオチド間結合において存在する末端キラル修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、（５’末端から数えて）アンチセンス鎖上の最初の５つのヌクレオチドにおいて少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８のリン酸塩ヌクレオチド間結合によって隔てられる、１つ、２つ、又は３つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の２つのブロックを含む。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、特定の中枢神経系組織への送達を媒介する受容体を標的とする標的化リガンドをさらに含む。一実施形態では、標的化リガンドは、Ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）リガンド、ｂＥｎｄ．３細胞結合リガンド、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）リガンド、マンノース受容体リガンド、グルコーストランスポータータンパク質、及びＬＤＬ受容体リガンドからなる群から選択される。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、眼組織への送達を媒介する受容体を標的とする標的化リガンドをさらに含む。一実施形態では、標的化リガンドは、トランス−レチノール、ＲＧＤペプチド、ＬＤＬ受容体リガンド、及び糖質系リガンドからなる群から選択される。一実施形態では、標的化リガンドは、Ｈ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−ＯＨ又はＣｙｃｌｏ（−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ）などのＲＧＤペプチドである。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、肝組織を標的とする標的化リガンドをさらに含む。一部の実施形態では、標的化リガンドは、糖質系リガンドである。一実施形態では、標的化リガンドは、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートである。
上記の態様及び実施形態の全ては、オリゴヌクレオチド上の１つ以上の内部位置にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分を有するオリゴヌクレオチドに適用可能であろう。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％又は３０％が修飾される。例えば、オリゴヌクレオチドの５０％が修飾される場合、オリゴヌクレオチド中に存在する全てのヌクレオチドの５０％が、本明細書に記載される修飾を含む。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、二本鎖ｄｓＲＮＡ剤であり、二本鎖ｄｓＲＮＡ剤のヌクレオチドの少なくとも５０％が、独立に、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−デオキシ、又は２’−フルオロで修飾される。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスであり、アンチセンスのヌクレオチドの少なくとも５０％が、独立に、ＬＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、又は２’−デオキシで修飾される。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、センス鎖上に１２未満、１０未満、８つ未満、６つ未満、４つ未満、２つ未満の２’−Ｆ修飾を有するか、又は２’−Ｆ修飾を有さない。一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖上に１２未満、１０未満、８つ未満、６つ未満、４つ未満、２つ未満の２’−Ｆ修飾を有するか、又は２’−Ｆ修飾を有さない。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の位置に１つ以上の２’−Ｆ修飾を有する。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満の非天然ヌクレオチドを有するか、又は非天然ヌクレオチドを実質的に有さない。非天然ヌクレオチドの例としては、非環状ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−Ｏ−メトキシアルキル（例えば、２’−Ｏ−メトキシメチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、又は２’−Ｏ−２−メトキシプロパニル）、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−ａｒａ−Ｆ、Ｌ−ヌクレオシド修飾（２’−修飾Ｌ−ヌクレオシド、例えば、２’−デオキシ−Ｌ−ヌクレオシドなど）、ＢＮＡ脱塩基糖、脱塩基環状及び開放鎖アルキルが挙げられる。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、又は実質的に１００％の天然ヌクレオチドを有する。これらの実施形態の趣旨では、天然ヌクレオチドは、２’−ＯＨ、２’−デオキシ、及び２’−ＯＭｅを有するものを含み得る。
一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、１５〜３０ヌクレオチドの長さをそれぞれ有するセンス鎖及びアンチセンス鎖；（５’末端から数えて）アンチセンス鎖上の最初の５つのヌクレオチドにおける少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、二重鎖領域は、１９〜２５の塩基対（好ましくは、１９、２０、２１又は２２）であり；ここで、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満の天然ヌクレオチドを有するか、又は非天然ヌクレオチドを実質的に有さない。
一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、１５〜３０ヌクレオチドの長さをそれぞれ有するセンス鎖及びアンチセンス鎖；（５’末端から数えて）アンチセンス鎖上の最初の５つのヌクレオチドにおける少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、二重鎖領域は、１９〜２５の塩基対（好ましくは、１９、２０、２１又は２２）であり；ここで、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、８０％超、８５％超、９５％超、又は実質的に１００％の天然ヌクレオチドを有し、例えば、２’−ＯＨ、２’−デオキシ、又は２’−ＯＭｅを有するものである。
本発明の別の態様は、細胞内での標的遺伝子の発現を低下させる方法であって、標的遺伝子に相補的なアンチセンス鎖；前記アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖；及び任意選択でリンカー又は担体を介して、少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分を含む二本鎖ｉＲＮＡ剤と前記細胞を接触させるステップを含む、方法に関する。
二本鎖ｉＲＮＡ剤に関する本発明の第１の態様における親油性部分及び二本鎖ｉＲＮＡ剤へのそれらのコンジュゲーションに関する上記の実施形態は全て、細胞内での標的遺伝子の発現を低下させる方法に関する本発明のこの態様において好適である。
一実施形態では、細胞は、肝臓外細胞である。
本発明の別の態様は、対象における標的遺伝子の発現を低下させる方法であって、標的遺伝子に相補的なアンチセンス鎖；前記アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖；及び任意選択でリンカー又は担体を介して、少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分を含む二本鎖ｉＲＮＡ剤と前記細胞を接触させることを含む、二本鎖ｉＲＮＡ剤を対象に投与するステップを含む、方法に関する。
二本鎖ｉＲＮＡ剤に関する本発明の第１の態様における親油性部分及び二本鎖ｉＲＮＡ剤へのそれらのコンジュゲーションに関する上記の実施形態は全て、対象における標的遺伝子の発現を低下させる方法に関する本発明のこの態様において好適である。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、肝臓外で投与される。
一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、髄腔内に投与される。二本鎖ｉＲＮＡ剤の髄腔内投与によって、本方法は、脳又は脊椎組織、例えば、大脳皮質、小脳、頚椎、腰椎、及び胸椎における標的遺伝子の発現を低下させることができる。
一部の実施形態では、例示的な標的遺伝子は、ＡＰＰ、ＡＴＸＮ２、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＴＡＲＤＢＰ、ＭＡＰＴ（タウ）、ＨＴＴ、ＳＮＣＡ、ＦＵＳ、ＡＴＸＮ３、ＡＴＸＮ１、ＳＣＡ１、ＳＣＡ７、ＳＣＡ８、ＭｅＣＰ２、ＰＲＮＰ、ＳＯＤ１、ＤＭＰＫ、及びＴＴＲである。対象におけるこれらの標的遺伝子の発現を低下させるために、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、硝子体内に投与され得る。二本鎖ｉＲＮＡ剤の硝子体内投与によって、本方法は、眼組織における標的遺伝子の発現を低下させることができる。
本発明の別の態様は、中枢神経系疾患に罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量の二本鎖ＲＮＡｉ剤を対象に投与し、それによって、対象を治療するステップを含む、方法に関する。二本鎖ＲＮＡｉ剤は、標的遺伝子に相補的なアンチセンス鎖；前記アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖；及び任意選択でリンカー又は担体を介して、少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分を含む。
二本鎖ｉＲＮＡ剤に関する本発明の第１の態様における親油性部分及び二本鎖ｉＲＮＡ剤へのそれらのコンジュゲーションに関する上記の実施形態は全て、中枢神経系疾患に罹患している対象を治療する方法に関する本発明のこの態様において好適である。本発明の方法によって治療され得る例示的な中枢神経系疾患としては、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭認知症、ハンチントン病、パーキンソン病、脊髄小脳失調、プリオン病、及びラフォラ病が挙げられる。
センス鎖又はアンチセンス鎖の内部位置（即ち、ｓｉＲＮＡ配列内のどこか）においてｓｉＲＮＡにコンジュゲートされた、親油性部分などのリガンドを示すスキームである。 センス鎖又はアンチセンス鎖の３’末端及び／又は５’末端においてリンカー又は担体を介してｓｉＲＮＡにコンジュゲートされた、親油性部分などのリガンドを示すスキームである。 バイオ切断可能リンカーを介してｓｉＲＮＡにコンジュゲートされた、親油性部分などのリガンドを示すスキームである。 マウスにおける様々な例示的なｓｉＲＮＡコンジュゲートの硝子体内注入によるβカテニン遺伝子（眼内ＣＴＮＮＢ１）サイレンシングの結果を示すグラフである。 スプラーグドーリーラットの大脳皮質における様々な例示的なｓｉＲＮＡコンジュゲートの単回髄腔内注入によるＳＯＤ１ ｍＲＮＡサイレンシングの結果を示すグラフである。 スプラーグドーリーラットの小脳における様々な例示的なｓｉＲＮＡコンジュゲートの単回髄腔内注入によるＳＯＤ１ ｍＲＮＡサイレンシングの結果を示すグラフである。 スプラーグドーリーラットの頚椎における様々な例示的なｓｉＲＮＡコンジュゲートの単回髄腔内注入によるＳＯＤ１ ｍＲＮＡサイレンシングの結果を示すグラフである。 スプラーグドーリーラットの腰椎における様々な例示的なｓｉＲＮＡコンジュゲートの単回髄腔内注入によるＳＯＤ１ ｍＲＮＡサイレンシングの結果を示すグラフである。 スプラーグドーリーラットの胸椎における様々な例示的なｓｉＲＮＡコンジュゲートの単回髄腔内注入によるＳＯＤ１ ｍＲＮＡサイレンシングの結果を示すグラフである。 ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて２４時間後にＦ１２ ｍＲＮＡレベルを測定することによる、２．５及び２５０ｎＭの濃度で、アンチセンス鎖及びセンス鎖の各位置で親油性部分（Ｃ１６）をコンジュゲートすることによって修飾された、Ｆ１２ ｓｉＲＮＡと共にインキュベートされた細胞についての初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）自然取り込み（ｆｒｅｅ ｕｐｔａｋｅ）（トランスフェクション剤を用いない）の結果を示す。 ＲＴ−ｑＰＣＲを用いて２４時間後にＦ１２ ｍＲＮＡレベルを測定することによる、２．５及び２５０ｎＭの濃度で、アンチセンス鎖及びセンス鎖の各位置で親油性部分（Ｃ１６）をコンジュゲートすることによって修飾された、Ｆ１２ ｓｉＲＮＡと共にインキュベートされた細胞についての初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）自然取り込み（トランスフェクション剤を用いない）の結果を示す。 各ｓｉＲＮＡコンジュゲートをヒト血清アルブミンと共にインキュベートした後に電気泳動移動度シフトアッセイを用いて非結合分画を測定することによって決定される、アンチセンス鎖及びセンス鎖の各位置で親油性部分（Ｃ１６）をコンジュゲートすることによって修飾された、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖及びセンス鎖の各位置についての相対的疎水性の結果を示す。 持続的なＳＯＤ１ ｍＲＮＡサイレンシングが、試験される脳及び脊髄の全ての領域において見られることを示す。図１３Ａは、腰椎、胸椎、及び頚椎領域のそれぞれにおけるラットにおける様々な例示的なｓｉＲＮＡコンジュゲートの単回髄腔内注入による、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡサイレンシングの結果を示す。図１３Ｂは、ラットの中枢神経系において試験された様々な組織を示す概略図である。 持続的なＳＯＤ１ ｍＲＮＡサイレンシングが、試験される脳及び脊髄の全ての領域において見られることを示す。図１３Ｃは、小脳、前頭葉、及び残りの脳領域のそれぞれにおけるラットにおける様々な例示的なｓｉＲＮＡコンジュゲートの単回髄腔内注入による、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡサイレンシングの結果を示す。 単回髄腔内投与後のβ−カテニンのサイレンシングの結果を示す。図１４Ａは、腰椎、胸椎、及び頚椎領域のそれぞれにおけるラットにおける様々な例示的なｓｉＲＮＡコンジュゲートのβ−カテニンサイレンシングの結果を示す。図１４Ｂは、小脳、前頭葉、及び残りの脳領域のそれぞれにおけるラットにおける様々な例示的なｓｉＲＮＡコンジュゲートのβ−カテニンサイレンシングの結果を示す。 ラットにおける例示的なｓｉＲＮＡ二重鎖の単回髄腔内投与後のＳＯＤ１のサイレンシングの結果を示し、これは、ＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートを用いた脳において観察されるより高い薬物レベル及び堅固なサイレンシングを示している。図１５Ａは、非コンジュゲートｓｉＲＮＡレベルと比較した、ＣＳＦにおけるコンジュゲートｓｉＲＮＡレベルを示す。図１５Ｂは、非コンジュゲートｓｉＲＮＡレベルと比較した、脳におけるコンジュゲートｓｉＲＮＡレベルを示す。図１５Ｃは、非コンジュゲートｓｉＲＮＡレベル及び対照ｓｉＲＮＡレベルと比較した、小脳におけるコンジュゲートｓｉＲＮＡレベルを示す。 様々な用量における様々な化学修飾によるＳＯＤ１のサイレンシングの結果を示す。図１６Ａは、腰椎、胸椎、及び頚椎領域のそれぞれにおけるラットにおけるＳＯＤ１サイレンシングの結果を示す。図１６Ｂは、小脳、前頭葉、及び残りの脳領域のそれぞれにおけるラットにおけるＳＯＤ１サイレンシングの結果を示す。 ３１日目の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の様々な領域における例示的なｓｉＲＮＡ二重鎖の単回髄腔内（ＩＴ）投与後のβ−カテニンｓｉＲＮＡレベルの結果を示す。 ３１日目における、様々な組織におけるβ−カテニンｍＲＮＡの堅固な遺伝子サイレンシングの結果を示す。 単回ＩＴ投与後に、ＮＨＰの中枢神経系全体にわたって分布しているｓｉＲＮＡを示す写真を示す。 単回ＩＴ投与後に、ニューロンに局在しているｓｉＲＮＡコンジュゲートを示す写真を示す。ＭＡＰ２は、ニューロンマーカーである。 単回ＩＴ投与後に、ミクログリアに局在しているｓｉＲＮＡコンジュゲートを示す写真を示す。Ｉｂａ１は、ミクログリアマーカーである。 単回ＩＴ投与後に、星状膠細胞に局在しているｓｉＲＮＡコンジュゲートを示す写真を示す。 区画で測られる（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ ｓｃａｌｅｄ）用量で、ラット及びＮＨＰにおいて観察される遺伝子サイレンシング活性を比較するグラフを示す。 ３μｇ又は７．５μｇの投与量で、表７に示される様々な例示的なｓｉＲＮＡ二重鎖を投与した後の、１４日目におけるマウスの眼におけるＴＴＲ ｍＲＮＡレベルの結果を示す。 ７．５μｇの投与量で、表７に示される様々な例示的なｓｉＲＮＡ二重鎖を投与した後の、１４日目におけるマウスの眼におけるＴＴＲ ｍＲＮＡレベルの結果を示す。 ７．５μｇの投与量で、表７に示される様々な例示的なｓｉＲＮＡ二重鎖の硝子体内の投与後の、１４日目におけるマウスの眼におけるＴＴＲ ｍＲＮＡレベルの結果を示す。
本発明者らは、特に、親油性部分を、二本鎖ｉＲＮＡ剤の少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置にコンジュゲートすることが、二本鎖ｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ硝子体内送達及び髄腔内送達に意外なほど良好な結果をもたらし、中枢神経系組織及び眼組織への効率的な進入をもたらし、中枢神経系及び視覚系の細胞に効率的に取り込まれることを見出した。
本発明の一態様は、標的遺伝子に相補的なアンチセンス鎖；前記アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖；及び任意選択でリンカー又は担体を介して、少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分を含む二本鎖ｉＲＮＡ剤を提供する。
「親油部」又は「親油性部分」という語は、脂質に対する親和性を有する任意の化合物又は化学部分を広く指す。親油性部分の親油性を特徴付けるための一方法は、オクタノール−水分配係数、ｌｏｇＫｏｗによるものであり、ここで、Ｋｏｗは、平衡状態における二相系の水性相中の化学物質の濃度に対するオクタノール相中のその濃度の比率である。オクタノール−水分配係数は、物質の実験室で測定される特性である。しかしながら、それはまた、第１原理法又は経験的方法を用いて計算される化学物質の構成成分に起因する係数を用いることによって予測され得る（例えば、参照により全内容が本明細書に組み入れられる、Ｔｅｔｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．４１：１４０７−２１（２００１）を参照されたい）。それは、水より非水性又は油性環境を好む物質の傾向の熱力学的な尺度を提供する（即ち、その親水性／親油性バランス）。原理的に、化学物質は、そのｌｏｇＫｏｗが０を超える場合に親油性である。典型的に、親油性部分は、１超、１．５超、２超、３超、４超、５超、又は１０超のｌｏｇＫｏｗを有する。例えば、６−アミノヘキサノールのｌｏｇＫｏｗは、例えば、約０．７であると予測される。同じ方法を用いて、コレステリルＮ−（ヘキサン−６−オール）カルバメートのｌｏｇＫｏｗは、１０．７であると予測される。
分子の親油性は、それが保有する官能基に対して変化し得る。例えば、ヒドロキシル基又はアミン基を、親油性部分の末端に付加すると、親油性部分の分配係数（例えば、ｌｏｇＫｏｗ）値を増加又は減少させ得る。
或いは、１つ以上の親油性部分にコンジュゲートされた二本鎖ｉＲＮＡ剤の疎水性は、そのタンパク質結合特性によって測定され得る。例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤の血漿タンパク質結合アッセイにおける非結合分画は、二本鎖ｉＲＮＡ剤のサイレンシング活性に正に相関し得る、二本鎖ｉＲＮＡ剤の相対的疎水性に相関すると決定され得る。
一実施形態では、決定される血漿タンパク質結合アッセイは、ヒト血清アルブミンタンパク質を用いた電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）である。この結合アッセイの例示的なプロトコルが、実施例１４に詳細に示される。結合アッセイにおいて非結合ｓｉＲＮＡの分画によって測定される、二本鎖ｉＲＮＡ剤の疎水性は、ｓｉＲＮＡの向上したｉｎ ｖｉｖｏ送達のために、０．１５超、０．２超、０．２５超、０．３超、０．３５超、０．４超、０．４５超、又は０．５超である。
したがって、親油性部分を、二本鎖ｉＲＮＡ剤の内部位置にコンジュゲートすることは、ｓｉＲＮＡの向上したｉｎ ｖｉｖｏ送達のために最適な疎水性を提供する。
特定の実施形態では、親油性部分は、脂肪族、環状、例えば脂環式、又は多環式、例えば多脂環式化合物、例えばステロイド（例えば、ステロール）又は直鎖若しくは分岐鎖脂肪族炭化水素である。親油性部分は、一般に、環状又は非環状であり得る炭化水素鎖を含み得る。炭化水素鎖は、様々な置換基及び／又は１個以上のヘテロ原子、例えば酸素又は窒素原子を含み得る。このような親油性脂肪族部分としては、限定されるものではないが、飽和又は不飽和Ｃ４〜Ｃ３０炭化水素（例えば、Ｃ６〜Ｃ１８炭化水素）、飽和又は不飽和脂肪酸、ワックス（例えば、脂肪酸及び脂肪ジアミドの一価アルコールエステル）、テルペン（例えば、Ｃ１０テルペン、Ｃ１５セスキテルペン、Ｃ２０ジテルペン、Ｃ３０トリテルペン、及びＣ４０テトラテルペン）、及び他の多脂環式炭化水素が挙げられる。例えば、親油性部分は、Ｃ４〜Ｃ３０炭化水素鎖（例えば、Ｃ４〜Ｃ３０アルキル又はアルケニル）を含有し得る。一部の実施形態では、親油性部分は、飽和又は不飽和Ｃ６〜Ｃ１８炭化水素鎖（例えば、直鎖Ｃ６〜Ｃ１８アルキル又はアルケニル）を含有する。一実施形態では、親油性部分は、飽和又は不飽和Ｃ１６炭化水素鎖（例えば、直鎖Ｃ１６アルキル又はアルケニル）を含有する。
親油性部分は、ヒドロキシ基（例えば、−ＣＯ−ＣＨ２−ＯＨ）などの、親油性部分中に既に存在するか又はｉＲＮＡ剤中に導入される官能基を介するなど、当分野で公知の任意の方法によって、ｉＲＮＡ剤に結合され得る。親油性部分中に既に存在するか又はｉＲＮＡ剤中に導入される官能基としては、限定されるものではないが、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジド、及びアルキンが挙げられる。
ｉＲＮＡ剤及び親油性部分のコンジュゲーションは、例えば、ヒドロキシ及びアルキル基Ｒ−、アルカノイル基ＲＣＯ−又は置換カルバモイル基ＲＮＨＣＯ−の間の、エーテル又はカルボキシル又はカルバモイルエステル結合の形成によって起こり得る。アルキル基Ｒは、環状（例えば、シクロヘキシル）又は非環状（例えば、直鎖若しくは分岐鎖；及び飽和若しくは不飽和）であり得る。アルキル基Ｒは、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル又はオクタデシル基などであり得る。
一部の実施形態では、親油性部分は、エーテル、チオエーテル、尿素、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド−チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホンアミド結合、クリック反応の生成物（例えば、アジド−アルキン環状付加からのトリアゾール）、又はカルバメートを含むリンカーを介して、二本鎖ｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされる。
別の実施形態では、親油性部分は、ステロールなどのステロイドである。ステロイドは、ペルヒドロ−１，２−シクロペンタノフェナントレン環系を含有する多環式化合物である。ステロイドとしては、限定されるものではないが、胆汁酸（例えば、コール酸、デオキシコール酸及びデヒドロコール酸）、コルチゾン、ジゴキシゲニン、テストステロン、コレステロール、及びカチオン性ステロイド、例えばコルチゾンが挙げられる。「コレステロール誘導体」は、例えば、置換基の置換、付加、又は除去によって、コレステロールから誘導される化合物を指す。
別の実施形態では、親油性部分は、芳香族部分である。これに関連して、「芳香族」という語は、単環及び多環芳香族炭化水素を広く指す。芳香族基としては、限定されるものではないが、任意選択で置換され得る１〜３つの芳香環を含むＣ６〜Ｃ１４アリール部分；そのいずれかが、独立に、任意選択で置換されていても又は置換されていなくてもよい、アルキル基に共有結合されたアリール基を含む「アラルキル」又は「アリールアルキル」基；及び「ヘテロアリール」基が挙げられる。本明細書で使用される「ヘテロアリール」という語は、５〜１４個の環原子、好ましくは、５、６、９、又は１０個の環原子を有し；環状の配置で共有された６、１０、又は１４個のπ電子を有し、且つ炭素原子に加えて、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、及び硫黄（Ｓ）からなる群から選択される１〜約３個のヘテロ原子を有する基を指す。
本明細書で使用される「置換された」アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又は複素環式基は、１〜約４個、好ましくは、１〜約３個、より好ましくは、１又は２個の、非水素置換基を有するものである。適切な置換基としては、限定されるものではないが、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリール、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、アルカンスルホニル、アレンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレンスルホンアミド、アラルキルスルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノ、及びウレイド基が挙げられる。
一部の実施形態では、親油性部分は、アラルキル基、例えば、２−アリールプロパノイル部分である。アラルキル基の構造的特徴は、親油性部分が、少なくとも１つのタンパク質にｉｎ ｖｉｖｏで結合するように選択される。特定の実施形態では、アラルキル基の構造的特徴は、親油性部分が、血清、血管、又は細胞タンパク質に結合するように選択される。特定の実施形態では、アラルキル基の構造的特徴は、アルブミン、免疫グロブリン、リポタンパク質、α−２−マクログロブリン、又はα−１−糖タンパク質への結合を促進する。
特定の実施形態では、リガンドは、ナプロキセン又はナプロキセンの構造的誘導体である。ナプロキセンの合成のための手順が、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、米国特許第３，９０４，６８２号明細書及び米国特許第４，００９，１９７号明細書に見出される。ナプロキセンは、化学名（Ｓ）−６−メトキシ−α−メチル−２−ナフタレン酢酸を有し、構造は、
Figure 2021522810
 である。
特定の実施形態では、リガンドは、イブプロフェン又はイブプロフェン構造的誘導体である。イブプロフェンの合成のための手順が、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、米国特許第３，２２８，８３１号明細書に見出される。イブプロフェンの構造は、
Figure 2021522810
 である。
さらなる例示的なアラルキル基が、参照により全内容が本明細書に組み入れられる、米国特許第７，６２６，０１４号明細書に示されている。
別の実施形態では、適切な親油性部分としては、脂質、コレステロール、レチノイン酸、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキサノール、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、イブプロフェン、ナプロキセン、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジンが挙げられる。
一部の実施形態では、親油性部分は、Ｃ６〜Ｃ３０酸（例えば、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸、オクタデカン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、シス−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサン酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ、コレステロールなど）又はＣ６〜Ｃ３０アルコール（例えば、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプタデカノール、オクタデカノール、オレイルアルコール、リノレイルアルコール、アラキドン酸アルコール、シス−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサノール、レチノール、ビタミンＥ、コレステロールなど）である。
特定の実施形態では、特に、親油性部分が、低い親油性又は疎水性を有する場合、２つ以上の親油性部分が、二本鎖ｉＲＮＡ剤に組み込まれ得る。一実施形態では、２つ以上の親油性部分が、二本鎖ｉＲＮＡ剤の同じ鎖に組み込まれる。一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤の各鎖には、１つ以上の親油性部分が組み込まれる。一実施形態では、２つ以上の親油性部分が、二本鎖ｉＲＮＡ剤の同じ位置（即ち、同じ核酸塩基、同じ糖部分、又は同じヌクレオシド間結合）に組み込まれる。これは、例えば、担体を介して２つ以上の親油性部分をコンジュゲートすること、及び／又は分岐リンカーを介して２つ以上の親油性部分をコンジュゲートすること、及び／又は１つ以上のリンカーが親油性部分を連続して連結した状態で、１つ以上のリンカーを介して２つ以上の親油性部分をコンジュゲートすることによって達成され得る。
親油性部分は、ｉＲＮＡ剤のリボ糖への直接結合を介して、ｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされ得る。或いは、親油性部分は、リンカー又は担体を介して、二本鎖ｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされ得る。
特定の実施形態では、親油性部分は、１つ以上のリンカー（テザー）を介して、ｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされ得る。
一実施形態では、親油性部分は、エーテル、チオエーテル、尿素、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド−チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホンアミド結合、クリック反応の生成物（例えば、アジド−アルキン環状付加からのトリアゾール）、又はカルバメートを含有するリンカーを介して、二本鎖ｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされる。いくつかの例示的な結合が、図１、実施例２、３、５、６、及び７に示される。
リンカー／テザー
リンカー／テザーは、「テザー付着点（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｏｉｎｔ）（ＴＡＰ）」において親油性部分に連結される。リンカー／テザーは、任意のＣ１〜Ｃ１００炭素含有部分、（例えばＣ１〜Ｃ７５、Ｃ１〜Ｃ５０、Ｃ１〜Ｃ２０、Ｃ１〜Ｃ１０；Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、又はＣ１０）を含んでもよく、少なくとも１つの窒素原子を有し得る。特定の実施形態では、窒素原子は、親油性部分のための連結点として働き得るリンカー／テザーにおいて末端アミノ又はアミド（ＮＨＣ（Ｏ）−）基の一部を成す。リンカー／テザー（下線）の非限定的な例としては、
Figure 2021522810
 が挙げられ；ここで、ｎは、１〜２０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０）であり、Ｒ’’’’は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。好ましくは、ｎは、５、６、又は１１である。他の実施形態では、窒素は、末端オキシアミノ基、例えば、−ＯＮＨ２、又はヒドラジノ基、−ＮＨＮＨ２の一部を成し得る。リンカー／テザーは、例えば、ヒドロキシ、アルコキシ、ペルハロアルキルで、任意選択で置換されてもよく、及び／又は１つ以上のさらなるヘテロ原子、例えば、Ｎ、Ｏ、若しくはＳが任意選択で挿入され得る。好ましい連結配位子は、例えば、
Figure 2021522810
 を含み得る。一部の実施形態では、アミノ末端リンカー／テザー（例えば、ＮＨ２、ＯＮＨ２、ＮＨ２ＮＨ２）は、リガンドと共にイミノ結合（即ち、Ｃ＝Ｎ）を形成し得る。一部の実施形態では、アミノ末端リンカー／テザー（例えば、ＮＨ２、ＯＮＨ２、ＮＨ２ＮＨ２）は、例えば、Ｃ（Ｏ）ＣＦ３によりアシル化され得る。
一部の実施形態では、リンカー／テザーは、メルカプト基（即ち、ＳＨ）又はオレフィン（例えば、ＣＨ＝ＣＨ２）で終端し得る。例えば、テザーは、
Figure 2021522810
 であり得、ここで、ｎは、他の箇所に記載される通りであり得る。テザーは、例えば、ヒドロキシ、アルコキシ、ペルハロアルキルで、任意選択で置換されてもよく、及び／又は１つ以上のさらなるヘテロ原子、例えば、Ｎ、Ｏ、若しくはＳが任意選択で挿入され得る。二重結合は、シス又はトランス又はＥ又はＺであり得る。
他の実施形態では、リンカー／テザーは、好ましくは、リンカー／テザーの末端位置に求電子部分を含み得る。例示的な求電子部分としては、例えば、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、メシレート、トシレート、ノシレート、若しくはブロシレート、又は活性カルボン酸エステル、例えばＮＨＳエステル、又はペンタフルオロフェニルエステルが挙げられる。好ましいリンカー／テザー（下線）としては、
Figure 2021522810
 が挙げられ、ここで、ｎは、１〜６であり、Ｒ’’’’は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル；又は
Figure 2021522810
 であり、ここで、ｎは、１〜６であり、Ｒ’’’’は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル；
Figure 2021522810
 であり、ここで、ｎは、１〜１１であり、Ｒ’’’’は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル；又は
Figure 2021522810
 であり、ここで、ｎは、他の箇所に記載される通りであり得、Ｒ’’’’は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである（ＬＧは、脱離基、例えば、ハロゲン化物、メシレート、トシレート、ノシレート、ブロシレートであり得る）。連結（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）は、リガンドの求核基、例えば、チオール又はアミノ基を、求電子基とテザー上でカップリングすることによって行われ得る。
他の実施形態では、モノマーが、リンカー／テザーの末端位置にフタルイミド基（Ｋ）を含むことが望ましいことがある。
Figure 2021522810
他の実施形態では、他の保護アミノ基は、リンカー／テザーの末端位置、例えば、アロック、モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）、トリフルオロアセチル、Ｆｍｏｃ、又はアリールスルホニルにあり得る（例えば、アリール部分は、オルト−ニトロフェニル又はオルト、パラ−ジニトロフェニルであり得る）。
本明細書に記載されるリンカー／テザーのいずれかは、１つ以上のさらなる連結基、例えば、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＳ−、−（ＣＨ２）ｎ−、又は−（ＣＨ＝ＣＨ）−をさらに含み得る。
切断可能リンカー／テザー
一部の実施形態では、リンカー／テザーの少なくとも１つは、酸化還元性切断可能リンカー、酸性切断可能リンカー、エステラーゼ切断可能リンカー、ホスファターゼ切断可能リンカー、又はペプチダーゼ切断可能リンカーであり得る。
一実施形態では、リンカー／テザーの少なくとも１つは、還元的に切断可能なリンカー（例えば、ジスルフィド基）であり得る。
一実施形態では、リンカー／テザーの少なくとも１つは、酸性切断可能リンカー（例えば、ヒドラゾン基、エステル基、アセタール基、又はケタール基）であり得る。
一実施形態では、リンカー／テザーの少なくとも１つは、エステラーゼ切断可能リンカー（例えば、エステル基）であり得る。
一実施形態では、リンカー／テザーの少なくとも１つは、ホスファターゼ切断可能リンカー（例えば、リン酸基）であり得る。
一実施形態では、リンカー／テザーの少なくとも１つは、ペプチダーゼ切断可能リンカー（例えば、ペプチド結合）であり得る。
切断可能連結基は、切断剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位又は分解性分子の存在の影響を受けやすい。一般に、切断剤は、血清又は血液中よりも細胞内において、より行き渡る、又はより高いレベル若しくは活性で存在する。このような分解剤の例としては、還元によって酸化還元性切断可能連結基を分解することができる、例えば、細胞内に存在する、酸化酵素若しくは還元酵素又は還元剤、例えば、メルカプタンを含む、特定の基質に対して選択されるか、若しくは基質特異性を有さない酸化還元剤；エステラーゼ；酸性環境を生じさせる、例えば、５以下のｐＨにすることができるエンドソーム又は作用剤；一般酸、ペプチダーゼ（基質特異的であってもよい）、及びホスファターゼとしての機能を果たすことによって酸性切断可能連結基を加水分解又は分解することができる酵素が挙げられる。
切断可能連結基、例えば、ジスルフィド結合は、ｐＨの影響を受けやすい。ヒト血清のｐＨは、７．４であるが、平均細胞内ｐＨは、わずかに低く、約７．１〜７．３の範囲である。エンドソームは、５．５〜６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０のさらに酸性のｐＨを有する。いくつかのテザーは、好ましいｐＨで切断され、それによって、リガンド（例えば、標的化又は細胞透過性リガンド、例えばコレステロール）から細胞内へ、又は細胞の所望の区画内にｉＲＮＡ剤を放出する連結基を有する。
リガンドをｉＲＮＡ剤に連結する化学結合（例えば、連結基）は、ジスルフィド結合を含み得る。ｉＲＮＡ剤／リガンド複合体が、エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれる場合、エンドソームの酸性環境は、ジスルフィド結合を切断させ、それによって、リガンドからｉＲＮＡ剤を放出する（Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．１９：１３１０−１３１６，２００２；Ｐａｔｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：４６６−４７１，２００２）。リガンドは、標的化リガンド又はｉＲＮＡ剤の治療効果を補完し得る二次治療剤であり得る。
テザーは、特定の酵素によって切断可能である連結基を含み得る。テザーに組み込まれる連結基の種類は、ｉＲＮＡ剤によって標的とされる細胞によって異なり得る。例えば、肝細胞内のｍＲＮＡを標的とするｉＲＮＡ剤は、エステル基を含むテザーにコンジュゲートされ得る。肝細胞は、エステラーゼが豊富であり、したがって、テザーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも肝細胞でより効率的に切断される。テザーの切断は、テザーの遠心端に結合されたリガンドからｉＲＮＡ剤を放出し、それによって、ｉＲＮＡ剤のサイレンシング活性を潜在的に高める。エステラーゼが豊富な他の細胞型としては、肺、腎皮質、及び睾丸の細胞が挙げられる。
ペプチド結合を含むテザーは、ペプチダーゼが豊富な細胞型、例えば、肝細胞及び滑膜細胞を標的とするｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされ得る。例えば、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ）の治療のために、例えば、滑膜細胞に標的化されたｉＲＮＡ剤は、ペプチド結合を含むテザーにコンジュゲートされ得る。
一般に、候補の切断可能連結基の適合性は、候補連結基を切断する分解剤の能力（又は条件）を試験することによって評価することができる。血中での、又は他の非標的組織、例えば、対象に投与されるときにｉＲＮＡ剤が曝される組織と接触しているときの切断に抵抗する能力について候補の切断可能連結基を試験することも望ましい。したがって、第１の条件と第２の条件との間の相対的な切断のしやすさを決定することができ、この第１の条件は、標的細胞内の切断を示すために選択され、この第２の条件は、他の組織又は体液、例えば、血液若しくは血清中での切断を示すために選択される。無細胞系、細胞、細胞培養物、器官若しくは組織培養物、又は動物全体で評価を行うことができる。無細胞又は培養条件で最初の評価を行い、動物全体でのさらなる評価によって確認することが有用であり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液若しくは血清（又は細胞外の条件を模倣するように選択されるｉｎ ｖｉｔｒｏでの条件下）と比較して細胞内（又は細胞内の条件を模倣するように選択されるｉｎ ｖｉｔｒｏでの条件下）で少なくとも２倍、４倍、１０倍又は１００倍速く切断される。
酸化還元性切断可能連結基
切断可能連結基の１つのクラスは、還元又は酸化時に切断される酸化還元性切断可能連結基である。還元的に切断可能な連結基の一例は、ジスルフィド連結基（−Ｓ−Ｓ−）である。候補の切断可能連結基が、適切な「還元的に切断可能な連結基」であるか否か、又は例えば特定のｉＲＮＡ部分及び特定の標的作用剤と共に使用するのに適しているか否かを決定するために、本明細書に記載される方法を確認することができる。例えば、候補は、細胞、例えば、標的細胞で観察され得る切断速度を模倣する、当分野で公知の試薬を使用して、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、又は他の還元剤と共にインキュベートすることによって評価することができる。候補はまた、血液又は血清条件を模倣するために選択される条件下でも評価することができる。好ましい実施形態では、候補化合物は、血中では最大で１０％切断される。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液（又は細胞外の条件を模倣するように選択されるｉｎ ｖｉｔｒｏでの条件下）と比較して、細胞内（又は細胞内の条件を模倣するように選択されるｉｎ ｖｉｔｒｏでの条件下）では少なくとも２倍、４倍、１０倍又は１００倍速く分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内培地を模倣するように選択される条件下で標準的な酵素反応速度アッセイを使用して決定して、細胞外培地を模倣するように選択される条件と比較することができる。
リン酸塩系切断可能連結基
リン酸塩系連結基は、リン酸基を分解又は加水分解する作用剤によって切断される。細胞内のリン酸基を切断する作用剤の一例は、細胞内の酵素、例えば、ホスファターゼである。リン酸塩系の連結基の例は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。これらの候補は、上記の方法と類似した方法を使用して評価することができる。
酸性切断可能連結基
酸性切断可能連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸性切断可能連結基は、約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０、又はそれ以下）のｐＨの酸性環境において、又は一般酸として機能し得る作用剤、例えば、酵素剤によって切断される。細胞において、特定のｐＨの低い細胞小器官、例えば、エンドソーム及びリソソームは、酸性切断可能連結基に切断環境を提供することができる。酸性切断可能連結基の例としては、限定されるものではないが、ヒドラゾン、ケタール、アセタール、エステル、及びアミノ酸のエステルが挙げられる。酸性切断可能な基は、一般式−Ｃ＝ＮＮ−、Ｃ（Ｏ）Ｏ、又は−ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施形態は、エステル（アルコキシ基）の酸素に結合した炭素が、アリール基、置換アルキル基、又は第３級アルキル基、例えば、ジメチルペンチル若しくはｔ−ブチルである場合である。これらの候補は、上記の方法と類似した方法を使用して評価することができる。
エステル系連結基
エステル系連結基は、細胞内の酵素、例えば、エステラーゼ及びアミダーゼによって切断される。エステル系切断可能連結基の例としては、限定されるものではないが、アルキレン基、アルケニレン基及びアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル切断可能連結基は、一般式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、又は−ＯＣ（Ｏ）−を有する。これらの候補は、上記の方法と類似した方法を用いて評価することができる。
ペプチド系切断連結基
ペプチド系連結基は、細胞内の酵素、例えば、ペプチダーゼ及びプロテアーゼによって切断される。ペプチド系切断可能連結基は、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）及びポリペプチドが生じる、アミノ酸間に形成されるペプチド結合である。ペプチド系切断可能基は、アミド基（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン又はアルキニレン間で形成され得る。ペプチド結合は、ペプチド及びタンパク質が生じる、アミノ酸間に形成されるアミド結合の特別な種類である。ペプチド系切断基は、一般に、ペプチド及びタンパク質が生じる、アミノ酸間に形成されるペプチド結合（即ち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全体を含むものではない。ペプチド切断可能連結基は、一般式−ＮＨＣＨＲ１Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨＲ２Ｃ（Ｏ）−を有し、ここで、Ｒ１及びＲ２は、２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上記の方法と類似した方法を用いて評価することができる。
バイオ切断可能リンカー／テザー
リンカーは、分子の２つの部分、例えば、ビス（ｓｉＲＮＡ）を生成する２つの個別のｓｉＲＮＡ分子の一方又は両方の鎖を連結する、ヌクレオチド及び非ヌクレオチドリンカー又はそれらの組み合わせであるバイオ切断可能リンカーも含み得る。一部の実施形態では、２つの個別のｓｉＲＮＡ間の単なる静電又はスタッキング相互作用が、リンカーを表し得る。非ヌクレオチドリンカーは、単糖類、二糖類、オリゴ糖、及びそれらの誘導体、脂肪族、脂環式、複素環式、及びそれらの組み合わせから誘導されるテザー又はリンカーを含む。
一部の実施形態では、リンカー（テザー）の少なくとも１つは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ジスルフィド、アミド、ガラクトサミン、グルコサミン、グルコース、ガラクトース、及びマンノースの官能化単糖又はオリゴ糖、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるバイオ切断可能リンカーである。
一実施形態では、バイオ切断可能糖質リンカーは、２つのｓｉＲＮＡ単位を連結することが可能な少なくとも１つの芳香族連結を有する１〜１０の糖単位を有し得る。２つ以上の糖が存在する場合、これらの単位は、１〜３、１〜４、又は１〜６の糖連結を介して、又はアルキル鎖を介して連結され得る。
例示的なバイオ切断可能リンカーとしては、
Figure 2021522810
Figure 2021522810
Figure 2021522810
 が挙げられる。
さらなる例示的なバイオ切断可能リンカーが、スキーム２８〜３０に示される。
バイオ切断可能リンカーについてのさらなる説明は、参照により全内容が本明細書に組み入れられる、２０１８年１月１８日出願の、“Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ Ｃｌｅａｖａｂｌｅ Ｌｉｎｋｅｒｓ”という名称のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１８／１４２１３号明細書に見出され得る。
担体
特定の実施形態では、親油性部分は、１つ以上のヌクレオチドを置換する担体を介して、ｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされる。
担体は、環状基又は非環状基であり得る。一実施形態では、環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル、及びデカリンからなる群から選択される。一実施形態では、非環状基は、セリノール骨格又はジエタノールアミン骨格に基づく部分である。
一部の実施形態では、担体は、二本鎖ｉＲＮＡ剤の内部位置において１つ以上のヌクレオチドを置換する。
他の実施形態では、担体は、センス鎖又はアンチセンス鎖の末端においてヌクレオチドを置換する。一実施形態では、担体は、センス鎖の３’末端において末端ヌクレオチドを置換し、それによって、センス鎖の３’末端を保護するエンドキャップとして機能する。一実施形態では、担体は、アミンを有する環状基であり、例えば、担体は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、又はデカリニルであり得る。
サブユニットのリボース糖がこのように置換されたリボヌクレオチドサブユニットは、リボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と呼ばれる。担体は、環状又は非環状部分であってもよく、２つの「骨格付着点」（例えば、ヒドロキシル基）及びリガンド（例えば、親油性部分）を含む。親油性部分は、担体に直接結合されるか、又は上述されるように、介在リンカー／テザーによって間接的に担体に結合され得る。
Figure 2021522810
リガンド−コンジュゲートモノマーサブユニットは、ｉＲＮＡ分子の５’又は３’末端サブユニットであってもよく、即ち、２つの「Ｗ」基の一方が、ヒドロキシル基であり得、他方の「Ｗ」基が、２つ以上の非修飾又は修飾リボヌクレオチドの鎖であり得る。或いは、リガンド−コンジュゲートモノマーサブユニットは、内部位置を占めてもよく、両方の「Ｗ」基は、１つ以上の非修飾又は修飾リボヌクレオチドであり得る。２つ以上のリガンド−コンジュゲートモノマーサブユニットが、ｉＲＮＡ剤中に存在し得る。
糖置換に基づくモノマー、例えば、リガンド−コンジュゲートモノマー（環状）
環状糖置換に基づくモノマー、例えば、置換に基づくリガンド−コンジュゲートモノマーは、本明細書では、ＲＲＭＳモノマー化合物とも呼ばれる。担体は、以下に示される一般式（ＬＣＭ−２）を有し得る（その構造において、好ましい骨格付着点が、Ｒ１又はＲ２；Ｒ３又はＲ４；又はＹがＣＲ９Ｒ１０である場合Ｒ９及びＲ１０から選択され得る（２つの位置が、２つの骨格付着点、例えば、Ｒ１及びＲ４、又はＲ４及びＲ９を生じるように選択される））。好ましいテザー付着点は、Ｒ７；ＸがＣＨ２である場合Ｒ５又はＲ６を含む。担体は、鎖に組み込まれ得る物質として後述される。したがって、構造は、付着点の１つ（末端位置の場合）又は２つ（内部位置の場合）、例えば、Ｒ１又はＲ２；Ｒ３又はＲ４；又はＲ９又はＲ１０（ＹがＣＲ９Ｒ１０である場合）が、リン酸塩、又は修飾リン酸塩、例えば、硫黄含有骨格に連結される場合も包含することが理解される。例えば、上に挙げたＲ基の１つは、−ＣＨ２−であり得、ここで、１つの結合が、担体に連結され、１つが、骨格原子、例えば、連結酸素又は中央リン原子に連結される。
Figure 2021522810
 式中：
Ｘは、Ｎ（ＣＯ）Ｒ７、ＮＲ７又はＣＨ２であり；
Ｙは、ＮＲ８、Ｏ、Ｓ、ＣＲ９Ｒ１０であり；
Ｚは、ＣＲ１１Ｒ１２であるか又は存在せず；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、及びＲ１０のそれぞれは、独立に、Ｈ、ＯＲａ、又は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、及びＲ１０のうちの少なくとも２つが、ＯＲａ及び／又は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１１、及びＲ１２のそれぞれは、独立に、リガンド、Ｈ、１〜３つのＲ１３で、任意選択で置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、又はＣ（Ｏ）ＮＨＲ７であり；又はＲ５及びＲ１１は、一緒に、Ｒ１４で、任意選択で置換されるＣ３〜Ｃ８シクロアルキルであり；
Ｒ７は、リガンドであり得、例えば、Ｒ７は、Ｒｄであり得、又はＲ７は、例えば、テザー部分を介して、担体に間接的に連結されるリガンド、例えば、ＮＲｃＲｄで置換されるＣ１〜Ｃ２０アルキル；又はＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄで置換されるＣ１〜Ｃ２０アルキルであり得；
Ｒ８は、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ１３は、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、又はハロであり；
Ｒ１４は、ＮＲｃＲ７であり；
Ｒ１５は、シアノで、任意選択で置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、又はＣ２〜Ｃ６アルケニルであり；
Ｒ１６は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり；
Ｒ１７は、液相又は固相担体試薬であり；
Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＣ（Ｏ）−、又は−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＳ−であり；
Ｒａは、保護基、例えば、ＣＡｒ３；（例えば、ジメトキシトリチル基）又はＳｉ（Ｘ５’）（Ｘ５”）（Ｘ５”’）であり、ここで、（Ｘ５’），（Ｘ５”）、及び（Ｘ５”’）は、上述される通りである。
Ｒｂは、Ｐ（Ｏ）（Ｏ−）Ｈ、Ｐ（ＯＲ１５）Ｎ（Ｒ１６）２又はＬ−Ｒ１７であり；
Ｒｃは、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒｄは、Ｈ又はリガンドであり；
Ａｒのそれぞれは、独立に、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシで、任意選択で置換されるＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｎは、１〜４であり；ｑは、０〜４である。
例示的な担体としては、例えば、Ｘが、Ｎ（ＣＯ）Ｒ７又はＮＲ７であり、Ｙが、ＣＲ９Ｒ１０であり、Ｚが存在せず；又はＸが、Ｎ（ＣＯ）Ｒ７又はＮＲ７であり、Ｙが、ＣＲ９Ｒ１０であり、Ｚが、ＣＲ１１Ｒ１２であり；又はＸが、Ｎ（ＣＯ）Ｒ７又はＮＲ７であり、Ｙが、ＮＲ８であり、Ｚが、ＣＲ１１Ｒ１２であり；又はＸが、Ｎ（ＣＯ）Ｒ７又はＮＲ７であり、ＹがＯであり、Ｚが、ＣＲ１１Ｒ１２であり；又はＸが、ＣＨ２であり；Ｙが、ＣＲ９Ｒ１０であり；Ｚが、ＣＲ１１Ｒ１２であり、Ｒ５及びＲ１１が、一緒に、Ｃ６シクロアルキル（Ｈ、ｚ＝２）、又はインダン環系を形成し、例えば、Ｘが、ＣＨ２であり；Ｙが、ＣＲ９Ｒ１０であり；Ｚが、ＣＲ１１Ｒ１２であり、Ｒ５及びＲ１１が、一緒に、Ｃ５シクロアルキル（Ｈ、ｚ＝１）を形成するものが挙げられる。
特定の実施形態では、担体は、ピロリン環系又は４−ヒドロキシプロリン環系に基づいていてもよく、例えば、Ｘは、Ｎ（ＣＯ）Ｒ７又はＮＲ７であり、Ｙは、ＣＲ９Ｒ１０であり、Ｚは、存在しない（Ｄ）。
Figure 2021522810
 ＯＦＧ１は、好ましくは、５員環中の炭素（Ｄ中の−ＣＨ２ＯＦＧ１）の１つに連結された、一次炭素、例えば、環外アルキレン基、例えば、メチレン基に結合される。ＯＦＧ２は、好ましくは、５員環中の炭素（Ｄ中の−ＯＦＧ２）の１つに直接結合される。ピロリン系担体については、−ＣＨ２ＯＦＧ１は、Ｃ−２に結合されてもよく、ＯＦＧ２は、Ｃ−３に結合されてもよく；又は−ＣＨ２ＯＦＧ１は、Ｃ−３に結合されてもよく、ＯＦＧ２は、Ｃ−４に結合されてもよい。特定の実施形態では、ＣＨ２ＯＦＧ１及びＯＦＧ２は、上記の炭素の１つにジェミナルに置換され得る（ｇｅｍｉｎａｌｌｙ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）。３−ヒドロキシプロリン系担体については、−ＣＨ２ＯＦＧ１は、Ｃ−２に結合されてもよく、ＯＦＧ２は、Ｃ−４に結合されてもよい。したがって、ピロリン系及び４−ヒドロキシプロリン系モノマーは、結合回転がその特定の結合の周りに制限される（例えば環の存在に起因する制限）結合（例えば、炭素−炭素結合）を含み得る。したがって、ＣＨ２ＯＦＧ１及びＯＦＧ２は、上で説明される対のいずれにおいても互いに対してシス又はトランスであり得る。したがって、全てのシス／トランス異性体が明示的に含まれる。モノマーはまた、１つ以上の不斉中心を含んでもよく、したがって、ラセミ化合物及びラセミ混合物、単一の鏡像異性体、個々のジアステレオマー及びジアステレオマー混合物として存在してもよい。モノマーの全てのこのような異性体が明示的に含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＦＧ１及びＯＦＧ２を有する中心が両方ともＲ配置を有するか；又は両方ともＳ配置を有するか；又は一方の中心が、Ｒ配置を有し得、他方の中心が、Ｓ配置を有し得、逆もまた同様である）。テザー付着点は、好ましくは、窒素である。担体Ｄの好ましい例としては、以下：
Figure 2021522810
 が挙げられる。
特定の実施形態では、担体は、ピペリジン環系（Ｅ）に基づいていてもよく、例えば、Ｘは、Ｎ（ＣＯ）Ｒ７又はＮＲ７であり、Ｙは、ＣＲ９Ｒ１０であり、Ｚは、ＣＲ１１Ｒ１２である。
Figure 2021522810
 ＯＦＧ１は、好ましくは、六員環中の炭素［Ｅ中の−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１］の１つに連結された、一次炭素、例えば、環外アルキレン基、例えば、メチレン基（ｎ＝１）又はエチレン基（ｎ＝２）に結合される。ＯＦＧ２は、好ましくは、六員環中の炭素（Ｅ中の−ＯＦＧ２）の１つに直接結合される。−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１及びＯＦＧ２は、環上でジェミナルに配置されてもよく、即ち、両方の基が、同じ炭素に、例えば、Ｃ−２、Ｃ−３、又はＣ−４で結合され得る。或いは、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１及びＯＦＧ２は、環上でビシナルに配置されてもよく、即ち、両方の基が、隣接する環炭素原子に結合されてもよく、例えば、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１は、Ｃ−２に結合されてもよく、ＯＦＧ２は、Ｃ−３に結合されてもよく；−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１は、Ｃ−３に結合されてもよく、ＯＦＧ２は、Ｃ−２に結合されてもよく；−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１は、Ｃ−３に結合されてもよく、ＯＦＧ２は、Ｃ−４に結合されてもよく；又は−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１は、Ｃ−４に結合されてもよく、ＯＦＧ２は、Ｃ−３に結合されてもよい。したがって、ピペリジン系モノマーは、結合回転がその特定の結合の周りに制限される（例えば環の存在に起因する制限）結合（例えば、炭素−炭素結合）を含み得る。したがって、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１及びＯＦＧ２は、上で説明される対のいずれにおいても互いに対してシス又はトランスであり得る。したがって、全てのシス／トランス異性体が明示的に含まれる。モノマーはまた、１つ以上の不斉中心を含んでもよく、したがって、ラセミ化合物及びラセミ混合物、単一の鏡像異性体、個々のジアステレオマー及びジアステレオマー混合物として存在してもよい。モノマーの全てのこのような異性体が明示的に含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＦＧ１及びＯＦＧ２を有する中心が両方ともＲ配置を有するか；又は両方ともＳ配置を有するか；又は一方の中心が、Ｒ配置を有し得、他方の中心が、Ｓ配置を有し得、逆もまた同様である）。テザー付着点は、好ましくは、窒素である。
特定の実施形態では、担体は、ピペラジン環系（Ｆ）に基づいていてもよく、例えば、Ｘは、Ｎ（ＣＯ）Ｒ７又はＮＲ７であり、Ｙは、ＮＲ８であり、Ｚは、ＣＲ１１Ｒ１２、又はモルホリン環系（Ｇ）であり、例えば、Ｘは、Ｎ（ＣＯ）Ｒ７又はＮＲ７であり、Ｙは、Ｏであり、Ｚは、ＣＲ１１Ｒ１２である。
Figure 2021522810
 ＯＦＧ１は、好ましくは、六員環中の炭素（Ｆ又はＧ中の−ＣＨ２ＯＦＧ１）の１つに連結された、一次炭素、例えば、環外アルキレン基、例えば、メチレン基に結合される。ＯＦＧ２は、好ましくは、六員環中の炭素（Ｆ又はＧ中の−ＯＦＧ２）の１つに直接結合される。Ｆ及びＧの両方について、−ＣＨ２ＯＦＧ１は、Ｃ−２に結合されてもよく、ＯＦＧ２は、Ｃ−３に結合されてもよく；又は逆もまた同様である。特定の実施形態では、ＣＨ２ＯＦＧ１及びＯＦＧ２は、上記の炭素の１つにジェミナルに置換され得る。したがって、ピペラジン系及びモルホリン系モノマーは、結合回転がその特定の結合の周りに制限される（例えば環の存在に起因する制限）結合（例えば、炭素−炭素結合）を含み得る。したがって、ＣＨ２ＯＦＧ１及びＯＦＧ２は、上で説明される対のいずれにおいても互いに対してシス又はトランスであり得る。したがって、全てのシス／トランス異性体が明示的に含まれる。モノマーはまた、１つ以上の不斉中心を含んでもよく、したがって、ラセミ化合物及びラセミ混合物、単一の鏡像異性体、個々のジアステレオマー及びジアステレオマー混合物として存在してもよい。モノマーの全てのこのような異性体が明示的に含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＦＧ１及びＯＦＧ２を有する中心が両方ともＲ配置を有するか；又は両方ともＳ配置を有するか；又は一方の中心が、Ｒ配置を有し得、他方の中心が、Ｓ配置を有し得、逆もまた同様である）。Ｒ’’’は、例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、好ましくは、ＣＨ３であり得る。テザー付着点は、好ましくは、Ｆ及びＧの両方の中の窒素である。
特定の実施形態では、担体は、デカリン環系に基づいていてもよく、例えば、Ｘは、ＣＨ２であり；Ｙは、ＣＲ９Ｒ１０であり；Ｚは、ＣＲ１１Ｒ１２であり、Ｒ５及びＲ１１は、一緒に、Ｃ６シクロアルキル（Ｈ、ｚ＝２）、又はインダン環系を形成し、例えば、Ｘは、ＣＨ２であり；Ｙは、ＣＲ９Ｒ１０であり；Ｚは、ＣＲ１１Ｒ１２であり、Ｒ５及びＲ１１は、一緒に、Ｃ５シクロアルキル（Ｈ、ｚ＝１）を形成する。
Figure 2021522810
 ＯＦＧ１は、好ましくは、Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、又はＣ−５［Ｈ中の−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１］の１つに連結された一次炭素、例えば、環外メチレン基（ｎ＝１）又はエチレン基（ｎ＝２）に結合される。ＯＦＧ２は、好ましくは、Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、又はＣ−５（Ｈ中の−ＯＦＧ２）の１つに直接結合される。−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１及びＯＦＧ２は、環上でジェミナルに配置されてもよく、即ち、両方の基が、同じ炭素に、例えば、Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、又はＣ−５で結合され得る。或いは、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１及びＯＦＧ２は、環上でビシナルに配置されてもよく、即ち、両方の基が、隣接する環炭素原子に結合されてもよく、例えば、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１は、Ｃ−２に結合されてもよく、ＯＦＧ２は、Ｃ−３に結合されてもよく；−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１は、Ｃ−３に結合されてもよく、ＯＦＧ２は、Ｃ−２に結合されてもよく；−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１は、Ｃ−３に結合されてもよく、ＯＦＧ２は、Ｃ−４に結合されてもよく；又は−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１は、Ｃ−４に結合されてもよく、ＯＦＧ２は、Ｃ−３に結合されてもよく；−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１は、Ｃ−４に結合されてもよく、ＯＦＧ２は、Ｃ−５に結合されてもよく；又は−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１は、Ｃ−５に結合されてもよく、ＯＦＧ２は、Ｃ−４に結合されてもよい。したがって、デカリン又はインダン系モノマーは、結合回転がその特定の結合の周りに制限される（例えば環の存在に起因する制限）結合（例えば、炭素−炭素結合）を含み得る。したがって、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１及びＯＦＧ２は、上で説明される対のいずれにおいても互いに対してシス又はトランスであり得る。したがって、全てのシス／トランス異性体が明示的に含まれる。モノマーはまた、１つ以上の不斉中心を含んでもよく、したがって、ラセミ化合物及びラセミ混合物、単一の鏡像異性体、個々のジアステレオマー及びジアステレオマー混合物として存在してもよい。モノマーの全てのこのような異性体が明示的に含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＦＧ１及びＯＦＧ２を有する中心が両方ともＲ配置を有するか；又は両方ともＳ配置を有するか；又は一方の中心が、Ｒ配置を有し得、他方の中心が、Ｓ配置を有し得、逆もまた同様である）。好ましい実施形態では、Ｃ−１及びＣ−６における置換基が、互いに対してトランスである。テザー付着点は、好ましくは、Ｃ−６又はＣ−７である。
他の担体は、３−ヒドロキシプロリン（Ｊ）に基づくものを含み得る。
Figure 2021522810
 したがって、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１及びＯＦＧ２は、互いに対してシス又はトランスであり得る。したがって、全てのシス／トランス異性体が明示的に含まれる。モノマーはまた、１つ以上の不斉中心を含んでもよく、したがって、ラセミ化合物及びラセミ混合物、単一の鏡像異性体、個々のジアステレオマー及びジアステレオマー混合物として存在してもよい。モノマーの全てのこのような異性体が明示的に含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＦＧ１及びＯＦＧ２を有する中心が両方ともＲ配置を有するか；又は両方ともＳ配置を有するか；又は一方の中心が、Ｒ配置を有し得、他方の中心が、Ｓ配置を有し得、逆もまた同様である）。テザー付着点は、好ましくは、窒素である。
より代表的な環状の糖置換に基づく担体についての詳細が、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、米国特許第７，７４５，６０８号明細書及び同第８，０１７，７６２号明細書に見出される。
糖置換に基づくモノマー（非環状）
非環状の糖置換に基づくモノマー、例えば、糖置換に基づくリガンド−コンジュゲートモノマーは、本明細書ではリボース置換モノマーサブユニット（ＲＲＭＳ）モノマー化合物とも呼ばれる。好ましい非環状担体は、式ＬＣＭ−３又はＬＣＭ−４：
Figure 2021522810
 を有し得る。
一部の実施形態では、ｘ、ｙ、及びｚのそれぞれは、互いに独立に、０、１、２、又は３であり得る。式ＬＣＭ−３において、ｙ及びｚが異なる場合、第３級炭素は、Ｒ又はＳ配置のいずれかを有し得る。好ましい実施形態では、式ＬＣＭ−３（例えば、セリノールに基づく）において、ｘは０であり、ｙ及びｚはそれぞれ、１であり、式ＬＣＭ−３において、ｙ及びｚはそれぞれ、１である。下式ＬＣＭ−３又はＬＣＭ−４のそれぞれは、例えば、ヒドロキシ、アルコキシ、ペルハロアルキルで、任意選択で置換され得る。
より代表的な非環状の糖置換に基づく担体についての詳細が、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、米国特許第７，７４５，６０８号明細書及び同第８，０１７，７６２号明細書に見出される。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、センス鎖の５’末端又はアンチセンス鎖の５’末端にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分を含む。
特定の実施形態では、親油性部分は、担体及び／又はリンカーを介して、鎖の５’末端にコンジュゲートされる。一実施形態では、親油性部分は、式：
Figure 2021522810
 の担体を介して、鎖の５’末端にコンジュゲートされる。Ｒは、親油性部分などのリガンドである。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、センス鎖の３’末端又はアンチセンス鎖の３’末端にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分を含む。
特定の実施形態では、親油性部分は、担体及び／又はリンカーを介して、鎖の３’末端にコンジュゲートされる。一実施形態では、親油性部分は、式：
Figure 2021522810
 の担体を介して、鎖の３’末端にコンジュゲートされる。Ｒは、親油性部分などのリガンドである。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、センス鎖の両端にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分を含む。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の両端にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分を含む。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、センス鎖の５’末端又は３’末端にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分、及びアンチセンス鎖の５’末端又は３’末端にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分を含む。
一部の実施形態では、親油性部分は、１つ以上のリンカー（テザー）及び／又は担体を介して、鎖の末端にコンジュゲートされる。
一実施形態では、親油性部分は、１つ以上のリンカー（テザー）を介して、鎖の末端にコンジュゲートされる。
一実施形態では、親油性部分は、環状担体、任意選択で、１つ以上の介在リンカー（テザー）を介して、センス鎖の５’末端又はアンチセンス鎖にコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、親油性部分は、少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置にコンジュゲートされる。鎖の内部位置は、鎖の３’末端及び５’末端から末端の位置を除く（例えば、２つの位置：３’末端から数えて１位及び５’末端から数えて１位を除く）、鎖の任意の位置にあるヌクレオチドを指す。
一実施形態では、親油性部分は、鎖の各末端から末端の２つの位置を除く全ての位置を含む、少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置（例えば、４つの位置：３’末端から数えて１及び２位並びに５’末端から数えて１及び２位を除く）にコンジュゲートされる。一実施形態では、親油性部分は、鎖の各末端から末端の３つの位置を除く全ての位置を含む、少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置（例えば、６つの位置：３’末端から数えて１、２、及び３位並びに５’末端から数えて１、２、及び３位を除く）にコンジュゲートされる。
一実施形態では、親油性部分は、センス鎖の切断部位領域を除く、少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置にコンジュゲートされ、例えば、親油性部分は、センス鎖の５’末端から数えて９〜１２位にコンジュゲートされず、例えば、親油性部分は、センス鎖の５’末端から数えて９〜１１位にコンジュゲートされない。或いは、内部位置は、センス鎖の３’末端から数えて１１〜１３位を除く。
一実施形態では、親油性部分は、アンチセンス鎖の切断部位領域を除く、少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置にコンジュゲートされる。例えば、内部位置は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて１２〜１４位を除く。
一実施形態では、親油性部分は、３’末端から数えてセンス鎖上の１１〜１３位、及び５’末端から数えてアンチセンス鎖上の１２〜１４位を除く、少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置にコンジュゲートされる。
一実施形態では、１つ以上の親油性部分は、以下の内部位置の１つ以上：各鎖の５’末端から数えて、センス鎖上の４〜８及び１３〜１８位、並びにアンチセンス鎖上の６〜１０及び１５〜１８位にコンジュゲートされる。
一実施形態では、１つ以上の親油性部分は、以下の内部位置の１つ以上：各鎖の５’末端から数えて、センス鎖上の５、６、７、１５、及び１７位、並びにアンチセンス鎖上の１５及び１７位にコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、親油性部分は、二本鎖ｉＲＮＡ剤の核酸塩基、糖部分、又はヌクレオシド間結合にコンジュゲートされる。
定義
特定の定義が示されない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、及び医学・薬化学に関連して用いられる命名法、及び分析化学、合成有機化学、及び医学・薬化学の手順及び技術は、当分野で周知であり、一般的に使用されるものである。標準的な技術が、化学合成、及び化学分析に使用され得る。いくつかのこのような技術及び手順が、例えば、“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓａｎｇｖｉ ａｎｄ Ｃｏｏｋ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，１９９４；“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０；及び“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓｔａｎｌｅｙ Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．；及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９に見出され、これらは、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられる。許容される場合、本開示を通して言及される全ての特許、出願、公開出願及び他の刊行物及び他のデータは、参照により全内容が本明細書に組み入れられる。
特に示されない限り、以下の語は、以下の意味を有する。
本明細書で使用される「標的核酸」という語は、発現又は活性がｓｉＲＮＡ化合物によって調節されることが可能である任意の核酸分子を指す。標的核酸としては、限定されるものではないが、標的タンパク質をコードするＤＮＡから転写されるＲＮＡ（限定されるものではないが、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ及びｍＲＮＡ又はその部分を含む）、及びさらにこのようなＲＮＡから得られるｃＤＮＡ、及びｍｉＲＮＡが挙げられる。例えば、標的核酸は、その発現が特定の障害若しくは病態に関連している細胞遺伝子（又はその遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）であり得る。一部の実施形態では、標的核酸は、感染因子由来の核酸分子であり得る。
本明細書で使用される「ｉＲＮＡ」という語は、ＲＮＡ転写物の標的切断を媒介する作用剤を指す。これらの作用剤は、ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られている細胞質多タンパク質複合体と結合する。ＲＮＡ干渉を誘導する際に有効な作用剤は、本明細書において、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ剤、又はｉＲＮＡ剤とも呼ばれる。したがって、これらの語は、本明細書において同義的に使用され得る。本明細書で使用されるｉＲＮＡという語は、マイクロＲＮＡ及びｐｒｅ−マイクロＲＮＡを含む。さらに、本明細書で使用される本発明の「化合物」又は「複数の化合物」も、ｉＲＮＡ剤を指し、ｉＲＮＡ剤と同義的に使用され得る。
ｉＲＮＡ剤は、標的遺伝子に対して十分に相同の領域を含み、ヌクレオチドについて十分な長さのものであるべきであり、それによって、ｉＲＮＡ剤、又はそのフラグメントは、標的遺伝子の下方制御を媒介することができる。（説明を容易にするために、ヌクレオチド又はリボヌクレオチドという語は、本明細書において、ｉＲＮＡ剤の１つ以上のモノマーサブユニットに関連して使用されることがある。本明細書における「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」という語の使用が、修飾ＲＮＡ又はヌクレオチドサロゲートの場合、修飾ヌクレオチド、又は１つ以上の位置におけるサロゲート置換部分も指し得ることが、本明細書において理解されよう）。したがって、ｉＲＮＡ剤は、少なくとも部分的に、及び一部の実施形態では完全に、標的ＲＮＡに相補的な領域であるか又はそれを含む。ｉＲＮＡ剤と標的との間に完全な相補性がある必要はないが、一致は、ｉＲＮＡ剤、又はその切断産物が、例えば、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡのＲＮＡｉ切断によって、配列特異的サイレンシングを指令するのを可能にするのに十分でなければならない。標的鎖との相補性、又は相同の程度は、アンチセンス鎖において最も重要である。完全な相補性が、特にアンチセンス鎖において、望ましいことが多いが、一部の実施形態は、特にアンチセンス鎖において、１つ以上、又は例えば、６、５、４、３、２、又はそれ以下のミスマッチ（標的ＲＮＡに対して）を含み得る。センス鎖は、分子の全体的な二本鎖の性質を維持するのに十分に、アンチセンス鎖と相補的でありさえすればよい。
ｉＲＮＡ剤としては、インターフェロン応答を引き起こすのに十分に長く（Ｄｉｃｅｒによって切断され得る（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２００１．Ｎａｔｕｒｅ，４０９：３６３−３６６）、ＲＩＳＣに入る分子（ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体））；及び、インターフェロン応答を引き起こさないほど十分に短い分子（この分子はまた、Ｄｉｃｅｒによって切断されるか、及び／又はＲＩＳＣに入り得る）、例えば、ＲＩＳＣへの進入を可能にするサイズの分子、例えば、Ｄｉｃｅｒ切断産物に類似する分子が挙げられる。インターフェロン応答を引き起こさないほど十分に短い分子は、本明細書では、ｓｉＲＮＡ剤又は短鎖ｉＲＮＡ剤と呼ばれる。本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ剤又は短鎖ｉＲＮＡ剤」は、ヒト細胞内での有害なインターフェロン応答を誘導しないほど十分に短いｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡ剤又は一本鎖剤を指し、例えば、それは、６０、５０、４０、又は３０未満のヌクレオチド対の二重鎖領域を有する。ｓｉＲＮＡ剤、又はその切断産物は、例えば、標的ＲＮＡに対してＲＮＡｉを誘導することによって、標的遺伝子を下方制御することができ、ここで、標的は、内因性又は病原体標的ＲＮＡを含み得る。
本明細書で使用される「一本鎖ｉＲＮＡ剤」は、単一の分子から構成されるｉＲＮＡ剤である。それは、鎖内の対合によって形成される二重鎖領域を含んでもよく、例えば、それは、ヘアピン又はパンハンドル構造であり得るか、又はそれを含み得る。一本鎖ｉＲＮＡ剤は、標的分子に対してアンチセンスであり得る。一本鎖ｉＲＮＡ剤は、ＲＩＳＣに入り、標的ｍＲＮＡのＲＩＳＣ媒介切断に関与し得るのに十分に長いことがある。一本鎖ｉＲＮＡ剤は、少なくとも１４、及び他の実施形態では、少なくとも１５、２０、２５、２９、３５、４０、又は５０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、それは、２００、１００、又は６０ヌクレオチド長未満である。
ループは、ｉＲＮＡ鎖の部分が別の鎖又は同じ鎖の別の部分と共に塩基対を形成する場合、二重鎖内の対向するヌクレオチドと対合しないｉＲＮＡ鎖の領域を指す。
ヘアピンｉＲＮＡ剤は、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、若しくは２５ヌクレオチド対に等しいか又は少なくともそのようなヌクレオチド対の二重鎖領域を有する。二重鎖領域は、２００、１００、又は５０以下の長さであり得る。特定の実施形態では、二重鎖領域の範囲は、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、及び１９〜２１ヌクレオチド対の長さである。ヘアピンは、一部の実施形態では３’に、及び特定の実施形態では、ヘアピンのアンチセンス側に、一本鎖オーバーハング又は末端非対合領域を有する。一部の実施形態では、オーバーハングは、２〜３ヌクレオチド長である。
本明細書で使用される「二本鎖（ｄｓ）ｉＲＮＡ剤」は、鎖間のハイブリダイゼーションにより二重鎖構造の領域が形成され得る、２つ以上、場合によっては２つの鎖を含むｉＲＮＡ剤である。
本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ活性」及び「ＲＮＡｉ活性」という語は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子サイレンシングを指す。
本明細書で使用される、ＲＮＡ干渉分子による「遺伝子サイレンシング」は、標的遺伝子について、ｍｉＲＮＡ又はＲＮＡ干渉分子が存在しない細胞に見出されるｍＲＮＡレベルの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、１００％までを含む少なくとも約９９％、及びこれらの間のあらゆる整数％の、細胞内のｍＲＮＡレベルの減少を指す。好ましい一実施形態では、ｍＲＮＡレベルは、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、１００％までを含む少なくとも約９９％及び５％〜１００％の間のあらゆる整数％の減少である。
本明細書で使用される「遺伝子発現を調節する」という語は、１つ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現、又はＲＮＡ分子若しくは均等なＲＮＡ分子のレベルを、上方制御又は下方制御して、発現、レベル、又は活性が、モジュレーターの非存在下で観察されるものより高く又は低くなるようにすることを意味する。例えば、「調節する」という語は、「阻害する」を意味し得るが、「調節する」という語の使用は、この定義に限定されない。
本明細書で使用される遺伝子発現調節は、１つ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現、又はＲＮＡ分子若しくは均等なＲＮＡ分子のレベルが、ｓｉＲＮＡ、例えば、ＲＮＡｉ剤の非存在下で観察されるものと少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍又はそれ以上異なる場合に起こる。％及び／又は倍率差は、対照又は非対照に対して、例えば、以下のように計算され得る。
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本明細書で使用される、遺伝子発現に関して、「阻害する」、「下方制御する」、又は「低下させる」という語は、１つ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現、又はＲＮＡ分子若しくは均等なＲＮＡ分子のレベル、又は１つ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が、モジュレーターの非存在下で観察されるものより低く低下されることを意味する。１つ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現、又はＲＮＡ分子若しくは均等なＲＮＡ分子のレベル、又は１つ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が、対応する非調節対照と比べて少なくとも１０％低く、好ましくは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は最も好ましくは、１００％（即ち、遺伝子発現なし）低く低下される場合、遺伝子発現は下方制御される。
本明細書で使用される、遺伝子発現に関して、「増加させる」又は「上方制御する」という語は、１つ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現、又はＲＮＡ分子若しくは均等なＲＮＡ分子のレベル、又は１つ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が、モジュレーターの非存在下で観察されるものより高く増加されることを意味する。１つ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードする遺伝子の発現、又はＲＮＡ分子若しくは均等なＲＮＡ分子のレベル、又は１つ以上のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が、対応する非調節対照と比べて、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、１００％、１．１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍又はそれ以上増加される場合、遺伝子発現は上方制御される。
本明細書で使用される「増加した」又は「増加させる」という語は、一般に、統計的に有意な量の増加を意味し；誤解を避けるために、「増加した」は、基準レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、基準サンプルと比較して少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％の増加又は１００％以下の増加又は１０〜１００％の間のあらゆる増加、或いは基準レベルと比較して少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍又は少なくとも約１０倍の増加、又は２倍〜１０倍以上のあらゆる増加を意味する。
本明細書で使用される「減少した」又は「減少させる」という語は、一般に、統計的に有意な量の減少を意味する。しかしながら、誤解を避けるために、「減少した」は、基準レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％の減少又は１００％以下の減少（即ち、基準サンプルと比較してゼロレベル）、又は基準レベルと比較して１０〜１００％の間のあらゆる減少を意味する。
二本鎖ｉＲＮＡは、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分に相補的な２つのオリゴヌクレオチド鎖を含む。一般に、二重鎖構造は、１５〜３０、より一般的には１８〜２５、さらにより一般的には１９〜２４、最も一般的には１９〜２１塩基対の長さである。一部の実施形態では、２５〜３０塩基対の長さのより長い二本鎖ｉＲＮＡが好ましい。一部の実施形態では、１０〜１５塩基対の長さのより短い二本鎖ｉＲＮＡが好ましい。別の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡは、少なくとも２１ヌクレオチド長である。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンスＲＮＡ鎖は、標的配列の少なくとも一部と相補的な相補性の領域を有し、二重鎖領域は、１４〜３０ヌクレオチド長である。同様に、標的配列に対する相補性の領域は、１４〜３０、より一般的には１８〜２５、さらにより一般的には１９〜２４、最も一般的には１９〜２１ヌクレオチド長である。
本明細書で使用される「アンチセンス鎖」という句は、目的とする標的配列に対して実質的に又は１００％相補的であるオリゴマー化合物を指す。「アンチセンス鎖」という句は、２つの別個の鎖から形成される両方のオリゴマー化合物のアンチセンス領域、並びにヘアピン又はダンベル型構造を形成することが可能な単分子オリゴマー化合物を含む。「アンチセンス鎖」及び「ガイド鎖」という語は、同義的に使用される。
「センス鎖」という句は、メッセンジャーＲＮＡ又はＤＮＡの配列などの標的配列と、全体的に又は部分的に同じヌクレオシド配列を有するオリゴマー化合物を指す。「センス鎖」及び「パッセンジャー鎖」という語は、同義的に使用される。
「特異的にハイブリダイズ可能な」及び「相補的な」とは、核酸が、ワトソン−クリック又は他の非伝統的タイプのいずれかにより、別の核酸配列と水素結合を形成し得ることを意味する。本発明の核酸分子に関連して、核酸分子とその相補的配列との結合自由エネルギーが、核酸の関連機能、例えば、ＲＮＡｉ活性を進行させるのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は、当分野において周知である（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８７，ＣＳＨ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，／．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照されたい）。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対合）を形成し得る核酸分子中の連続した残基のパーセンテージ（例えば、１０のうちの５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％相補的である）を示す。「完全に相補的」又は１００％の相補性は、核酸配列の連続した残基が全て、第２の核酸配列中の同数の連続した残基と水素結合することを意味する。完全ではない相補性は、２つの鎖の一部（全てではない）のヌクレオシド単位が、互いに水素結合し得る状況を指す。「実質的な相補性」は、非相補的であるように選択された、オーバーハングなどのポリヌクレオチド鎖の領域を除いて、９０％以上の相補性を示すポリヌクレオチド鎖を指す。特異的結合は、特異的結合が所望される条件下、即ち、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ若しくは治療的処置の場合、生理学的条件下で、又はｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合、アッセイが行われる条件下で、非標的配列へのオリゴマー化合物の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性を必要とする。非標的配列は、典型的に、少なくとも５ヌクレオチド異なる。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０若しくはそれ以上のヌクレオチド対の長さに等しいか又は少なくともそのようなヌクレオチド対の長さである。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０ヌクレオチド長に等しいか又は少なくともそのようなヌクレオチド長である。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０ヌクレオチド長に等しいか又は少なくともそのようなヌクレオチド長である。
一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖はそれぞれ、１５〜３０ヌクレオチド長である。
一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖はそれぞれ、１９〜２５ヌクレオチド長である。
一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖はそれぞれ、２１〜２３ヌクレオチド長である。
一部の実施形態では、１つの鎖は、二本鎖領域内に１〜５つの一本鎖ヌクレオチドの少なくとも１つの区間を有する。「二本鎖領域内の一本鎖ヌクレオチドの区間」とは、一本鎖区間の両端に少なくとも１つのヌクレオチド塩基対が存在することを意味する。一部の実施形態では、両方の鎖は、二本鎖領域内に１〜５つ（例えば、１、２、３、４、又は５つ）の一本鎖ヌクレオチドの少なくとも１つの区間を有する。両方の鎖が、二本鎖領域内に１〜５つ（例えば、１、２、３、４、又は５）の一本鎖ヌクレオチドの区間を有する場合、このような一本鎖ヌクレオチドは、高いに反対（例えば、ミスマッチの区間）であってもよく、又はそれらは、第２の鎖が、第１の鎖の一本鎖ｉＲＮＡと反対の一本鎖ヌクレオチドを有さないように配置され得、逆もまた同様である（例えば、一本鎖ループ）。一部の実施形態では、一本鎖ヌクレオチドは、いずれかの末端から８ヌクレオチド以内、例えば、２つの鎖の間の相補性の領域の５’又は３’末端のいずれかから８、７、６、５、４、３、又は２ヌクレオチドに存在する。
一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、末端の少なくとも１つに一本鎖オーバーハングを含む。一実施形態では、一本鎖オーバーハングは、１、２、又は３ヌクレオチド長である。
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、２１ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は、２３ヌクレオチド長であり、ここで、鎖は、３’末端に２ヌクレオチド長の一本鎖オーバーハングを有する２１の連続した塩基対の二本鎖領域を形成する。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡの各鎖は、参照により全内容が本明細書に組み入れられる、ＰＣＴ公開番号国際公開第２００４０８０４０６号パンフレットに記載されるものなどのＺＸＹ構造を有する。
特定の実施形態において、二本鎖オリゴマー化合物の２つの鎖が、互いに連結され得る。２つの鎖は、両端、又は一端のみで互いに連結され得る。一端で連結するとは、第１の鎖の５’末端が、第２の鎖の３’末端に連結されるか、又は第１の鎖の３’末端が、第２の鎖の５’末端に連結されることを意味する。２つの鎖が、両端で互いに連結される場合、第１の鎖の５’末端が、第２の鎖の３’末端に連結され、第１の鎖の３’末端が、第２の鎖の５’末端に連結される。２つの鎖は、限定されるものではないが、（Ｎ）ｎ（ここでＮは、独立に、修飾又は非修飾ヌクレオチドであり、ｎは、３〜２３である）を含むオリゴヌクレオチドリンカーによって互いに連結され得る。一部の実施形態では、ｎは、３〜１０、例えば、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドリンカーは、ＧＮＲＡ、（Ｇ）４、（Ｕ）４、及び（ｄＴ）４からなる群から選択され、ここで、Ｎは、修飾又は非修飾ヌクレオチドであり、Ｒは、修飾又は非修飾プリンヌクレオチドである。リンカー中のヌクレオチドの一部は、リンカー中の他のヌクレオチドとの塩基対合相互作用に関与し得る。２つの鎖はまた、非ヌクレオシドリンカー、例えば、本明細書に記載されるリンカーによって互いに連結され得る。本明細書に記載される任意のオリゴヌクレオチド化学修飾又は改変が、オリゴヌクレオチドリンカーに使用され得ることが、当業者によって理解されよう。
ヘアピン及びダンベル型オリゴマー化合物は、１４、１５、１５、１６、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、若しくは２５ヌクレオチド対に等しいか又は少なくともそのようなヌクレオチド対の二重鎖領域を有する。二重鎖領域は、２００、１００、又は５０以下の長さであり得る。一部の実施形態では、二重鎖領域の範囲は、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、及び１９〜２１ヌクレオチド対の長さである。
ヘアピンオリゴマー化合物は、一部の実施形態では３’に、及び一部の実施形態ではヘアピンのアンチセンス側に、一本鎖オーバーハング又は末端非対合領域を有し得る。一部の実施形態では、オーバーハングは、１〜４、より一般的には２〜３ヌクレオチド長である。ＲＮＡ干渉を誘導し得るヘアピンオリゴマー化合物は、本明細書では、「ｓｈＲＮＡ」とも呼ばれる。
特定の実施形態では、２つのオリゴマー鎖は、特異的結合が所望される条件下、即ち、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ若しくは治療的処置の場合、生理学的条件下で、及びｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合、アッセイが行われる条件下で、非標的核酸配列へのアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合に特異的にハイブリダイズする。
本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」又は「ストリンジェントな条件」は、アンチセンス化合物がその標的配列にハイブリダイズするが、最小数の他の配列にハイブリダイズする条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、様々な環境で異なり、アンチセンス化合物が標的配列にハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」は、アンチセンス化合物の性質及び組成並びにそれらが試験されるアッセイによって決定される。
ヌクレオチド親和性修飾の組み込みにより、非修飾化合物と比較してより多数のミスマッチを可能にし得ることが、当分野において理解される。同様に、特定のオリゴヌクレオチド配列は、他のオリゴヌクレオチド配列よりミスマッチに対してより耐性であり得る。当業者は、オリゴヌクレオチド間、又はオリゴヌクレオチドと標的核酸との間の適切な数のミスマッチを、例えば溶融温度（Ｔｍ）を決定することによって、決定することができる。Ｔｍ又はΔＴｍは、当業者に周知の技術によって計算され得る。例えば、Ｆｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５，２２：４４２９−４４４３）に記載される技術により、当業者は、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖の溶融温度を高める能力についてヌクレオチド修飾を評価することができる。
ｓｉＲＮＡ設計
一実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤は、１９ｎｔ長の平滑末端二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｄｅｄ ｂｌｕｎｔｍｅｒ）であり、ここで、センス鎖は、５’末端から７、８、９位に３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位に３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
一実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤は、２０ｎｔ長の平滑末端二本鎖であり、ここで、センス鎖は、５’末端から８、９、１０位に３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位に３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
一実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤は、２１ｎｔ長の平滑末端二本鎖であり、ここで、センス鎖は、５’末端から９、１０、１１位に３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位に３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
一実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤は、２１ヌクレオチド（ｎｔ）センス鎖及び２３ヌクレオチド（ｎｔ）アンチセンスを含み、ここで、センス鎖は、５’末端から９、１０、１１位に３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み；アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位に３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ここで、ｉＲＮＡの一方の末端が平滑である一方、他方の末端は、２ｎｔオーバーハングを含む。好ましくは、２ｎｔオーバーハングは、アンチセンスの３’末端にある。任意選択で、ｉＲＮＡ剤は、リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ３）をさらに含む。
一実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、２５〜３０ヌクレオチド残基長であり、５’末端ヌクレオチド（１位）を起点として、前記第１の鎖の１〜２３位が、少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６〜６６のヌクレオチド残基長であり、３’末端ヌクレオチドを起点として、センス鎖の１〜２３位と対合される位置に少なくとも８つのリボヌクレオチドを含んで、二重鎖を形成し；ここで、アンチセンス鎖の少なくとも３’末端ヌクレオチドが、センス鎖と対合されず、最大で６連続の３’末端ヌクレオチドが、センス鎖と対合されず、それによって、１〜６つのヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；ここで、アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対合されない１０〜３０連続ヌクレオチドを含み、それによって、１０〜３０ヌクレオチド一本鎖５’オーバーハングを形成し；ここで、少なくともセンス鎖５’末端及び３’末端ヌクレオチドは、センス鎖及びアンチセンス鎖が最大の相補性のために整列される場合、アンチセンス鎖のヌクレオチドと対合される塩基であり、それによって、センス鎖とアンチセンス鎖との間に実質的に二重鎖の領域を形成し；アンチセンス鎖は、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞中に導入されたときに標的遺伝子発現を低下させるように、アンチセンス鎖長の少なくとも１９個のリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに十分に相補的であり；ここで、センス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ここで、モチーフの少なくとも１つは、切断部位又はその近傍に存在する。アンチセンス鎖は、切断部位又はその近傍に３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
一実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、前記ｉＲＮＡ剤は、少なくとも２５且つ２９以下のヌクレオチド長を有する第１の鎖と、５’末端から１１、１２、１３位に３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む、３０ヌクレオチド長以下を有する第２の鎖とを含み；ここで、前記第１の鎖の前記３’末端及び前記第２の鎖の前記５’末端は、平滑末端を形成し、前記第２の鎖は、その３’末端で第１の鎖より１〜４ヌクレオチド長く、二重鎖領域は、少なくとも２５ヌクレオチド長であり、前記第２の鎖は、前記ｉＲＮＡ剤が哺乳動物細胞中に導入されたときに標的遺伝子発現を低下させるように、前記第２の鎖長の少なくとも１９ｎｔに沿って標的ｍＲＮＡに十分に相補的であり、前記ｉＲＮＡのダイサー切断（ｄｉｃｅｒ ｃｌｅａｖａｇｅ）が、前記第２の鎖の前記３’末端を含むｓｉＲＮＡを優先的にもたらし、それによって、哺乳動物における標的遺伝子の発現を低下させる。任意選択で、ｉＲＮＡ剤は、リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ３）をさらに含む。
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ここで、モチーフの１つは、センス鎖の切断部位に存在する。例えば、センス鎖は、５’末端から７〜１５位以内の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み得る。
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖も、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含むことができ、ここで、モチーフの１つは、アンチセンス鎖の切断部位又はその近傍に存在する。例えば、アンチセンス鎖は、５’末端から９〜１５位以内の３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含み得る。
１７〜２３ｎｔ長の二重鎖領域を有するｉＲＮＡ剤については、アンチセンス鎖の切断部位は、典型的に、５’末端から１０、１１及び１２位の付近である。したがって、３つの同一の修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の５’末端から１つ目のヌクレオチドから数え始めて、又は、アンチセンス鎖の５’末端から、二重鎖領域内の１つ目の対合ヌクレオチドから数え始めて、アンチセンス鎖の９、１０、１１位；１０、１１、１２位；１１、１２、１３位；１２、１３、１４位；又は１３、１４、１５位に存在し得る。アンチセンス鎖中の切断部位はまた、５’末端からｉＲＮＡの二重鎖領域の長さに応じて変化し得る。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、１４〜３０のヌクレオチドをそれぞれが有するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも２つのモチーフを含み、ここで、モチーフの少なくとも１つは、鎖内の切断部位又はその近傍に存在し、モチーフの少なくとも１つは、少なくとも１つのヌクレオチドによって切断部位におけるモチーフから隔てられた鎖の別の部分に存在する。一実施形態では、アンチセンス鎖も、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の少なくとも１つのモチーフを含むことができ、ここで、モチーフの少なくとも１つは、鎖内の切断部位又はその近傍に存在する。センス鎖中の切断部位又はその近傍に存在するモチーフにおける修飾は、アンチセンス鎖中の切断部位又はその近傍に存在するモチーフにおける修飾と異なる。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、１４〜３０ヌクレオチドをそれぞれが有するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、ここで、モチーフの少なくとも１つは、鎖の切断部位又はその近傍に存在する。一実施形態では、アンチセンス鎖も、切断部位又はその近傍に３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、１４〜３０ヌクレオチドをそれぞれが有するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、５’末端から９、１０、１１位に３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位に３連続ヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
一実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤は、標的とのミスマッチ、二重鎖内のミスマッチ、又はそれらの組み合わせを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域又は二重鎖領域に生じ得る。塩基対は、解離又は融解（例えば、特定の対合の結合又は解離の自由エネルギーに対するものであり、最も簡単な手法は、個々の対ごとに対を調べることであるが、類似の又は同様の分析も使用され得る）を促進するそれらの傾向に基づいて評価され得る。解離の促進に関して：Ａ：Ｕが、Ｇ：Ｃより好ましく；Ｇ：Ｕが、Ｇ：Ｃより好ましく；Ｉ：Ｃが、Ｇ：Ｃより好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば、非正準又は正準以外の対合（本明細書の他の箇所に記載される）が、正準な（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対合より好ましく；ユニバーサル塩基を含む対合が、正準な対合より好ましい。
一実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立に選択され得るアンチセンス鎖の５’末端から二重鎖領域内の最初の１、２、３、４、又は５つの塩基対のうちの少なくとも１つ、及び二重鎖の５’末端におけるアンチセンス鎖の解離を促進するためのミスマッチ対、例えば、非正準又は正準以外の対合又はユニバーサル塩基を含む対合を含む。
一実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端から二重鎖領域内の１位におけるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、及びｄＴからなる群から選択される。或いは、アンチセンス鎖の５’末端から二重鎖領域内の最初の１、２又は３つの塩基対のうちの少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端から二重鎖領域内の最初の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
一態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有する。ｄｓＲＮＡ剤は、式（Ｉ）によって表される：
Figure 2021522810
式（Ｉ）では、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’は、それぞれ独立に、２’−Ｏ−アルキル、２’−置換アルコキシ、２’−置換アルキル、２’−ハロ、ＥＮＡ、およびＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含むヌクレオチドである。一実施形態では、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’はそれぞれ、２’−ＯＭｅ修飾を含む。一実施形態では、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’はそれぞれ、２’−ＯＭｅ修飾または２’−Ｆ修飾を含む。一実施形態では、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’の少なくとも１つは、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）修飾を含む。
Ｃ１は、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２位〜８位）の反対側の部位にある熱不安定化ヌクレオチドである。例えば、Ｃ１は、アンチセンス鎖の５’末端の２位〜８位のヌクレオチドと対を形成するセンス鎖の位置にある。一例では、Ｃ１は、センス鎖の５’末端の１５位にある。Ｃ１ヌクレオチドは、脱塩基修飾；二重鎖の対向するヌクレオチドとのミスマッチ；および糖修飾、例えば、２’−デオキシ修飾または非環状ヌクレオチド、例えば、アンロック核酸（ＵＮＡ）またはグリセロール核酸（ＧＮＡ）を含み得る熱不安定化修飾を有する。一実施形態では、Ｃ１は、（ｉ）アンチセンス鎖の対向するヌクレオチドとのミスマッチ；（ｉｉ）以下からなる群から選択される脱塩基修飾：
Figure 2021522810
 ；および（ｉｉｉ）以下からなる群から選択される糖修飾：
Figure 2021522810
 （式中、Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基であり、Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３、またはアルキルであり；Ｒ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖である）からなる群から選択される熱不安定化修飾を有する。一実施形態では、Ｃ１の熱不安定化修飾は、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、およびＵ：Ｔからなる群から選択されるミスマッチであり；任意選択により、ミスマッチ対における少なくとも１つの核酸塩基が、２’−デオキシ−核酸塩基である。一例では、Ｃ１における熱不安定化修飾は、ＧＮＡまたは
Figure 2021522810
 である。
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’は、それぞれ独立に、２’−ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さをヌクレオチドに提供する修飾を含むヌクレオチドを表す。立体的嵩高さは、修飾の立体効果の総計を指す。ヌクレオチドの修飾の立体効果を決定する方法は、当業者に公知である。この修飾は、ヌクレオチドのリボース糖の２’位置での修飾、または非リボースヌクレオチド、非環状ヌクレオチド、もしくはリボース糖の２’位置と同様または同等のヌクレオチドの主鎖の修飾であり得、かつ２’−ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さ以下の立体嵩高さをヌクレオチドに提供する。例えば、Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’は、それぞれ独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’−Ｆ、および２’−Ｆ−５’−メチルから選択される。一実施形態では、Ｔ１はＤＮＡである。一実施形態では、Ｔ１’は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＬＮＡである。一実施形態では、Ｔ２’は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。一実施形態では、Ｔ３’は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
ｎ１、ｎ３、およびｑ１は独立に、４〜１５ヌクレオチド長である。
ｎ５、ｑ３、およびｑ７は独立に、１〜６ヌクレオチド長である。
ｎ４、ｑ２、およびｑ６は独立に、１〜３ヌクレオチド長である；あるいは、ｎ４は０である。
ｑ５は独立に、０〜１０ヌクレオチド長である。
ｎ２およびｑ４は独立に、０〜３ヌクレオチド長である。
あるいは、ｎ４は、０〜３ヌクレオチド長である。
一実施形態では、ｎ４は０であり得る。一例では、ｎ４は０であり、ｑ２およびｑ６は１である。別の例では、ｎ４は０であり、ｑ２およびｑ６は１であり、センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態では、ｎ４、ｑ２、およびｑ６はそれぞれ１である。
一実施形態では、ｎ２、ｎ４、ｑ２、ｑ４、およびｑ６はそれぞれ１である。
一実施形態では、センス鎖が１９〜２２ヌクレオチド長である場合は、Ｃ１は、センス鎖の５’末端の１４位〜１７位にあり、ｎ４は１である。一実施形態では、Ｃ１は、センス鎖の５’末端の１５位にある。
一実施形態では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端の２位で始まる。一例では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端の２位にあり、ｑ６は１に等しい。
一実施形態では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端の１４位で始まる。一例では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端の１４位にあり、ｑ２は１に等しい。
例示的な実施形態では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端の２位から始まり、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端の１４位から始まる。一例では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端の２位から始まり、ｑ６は１に等しく、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端の１４位から始まり、ｑ２は１に等しい。
一実施形態では、Ｔ１’およびＴ３’は、１１ヌクレオチド長離間している（即ち、Ｔ１’とＴ３’ヌクレオチドは数えていない）。
一実施形態では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端の１４位にある。一例では、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端の１４位にあり、ｑ２は１に等しく、修飾は、２’位にある、または２’−ＯＭｅリボースよりも小さい立体的嵩高さを提供する非リボース、非環状、もしくは主鎖の位置にある。
一実施形態では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端の２位にある。一例では、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端の２位にあり、ｑ６は１に等しく、修飾は、２’位にある、または２’−ＯＭｅリボースの立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さを提供する非リボース、非環状、もしくは主鎖の位置にある。
一実施形態では、Ｔ１は、センス鎖の切断部位にある。一例では、センス鎖が１９〜２２ヌクレオチド長である場合は、Ｔ１は、センス鎖の５’末端の１１位にあり、ｎ２は１である。例示的な一実施形態では、センス鎖が１９〜２２ヌクレオチド長である場合は、Ｔ１は、センス鎖の５’末端の１１位にあるセンス鎖の切断部位にあり、ｎ２は１である。
一実施形態では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端の６位から始まる。一例では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端の６位〜１０位であり、ｑ４は１である。
例示的な一実施形態では、Ｔ１は、センス鎖が１９〜２２ヌクレオチド長である場合は、例えばセンス鎖の５’末端の１１位にある、センス鎖の切断部位にあり、ｎ２は１であり；Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端の１４位にあり、ｑ２は１に等しく、そしてＴ１’の修飾は、リボース糖の２’位置にある、または２’−ＯＭｅリボースよりも小さい立体的嵩高さを提供する非リボース、非環状、もしくは主鎖の位置にあり；Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端の６位〜１０位に位置し、ｑ４は１であり；そしてＴ３’は、アンチセンス鎖の５’末端の２位にあり、ｑ６は１に等しく、そしてＴ３’の修飾は、２’位置にある、または２’−ＯＭｅリボースの立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さを提供する非リボース、非環状、もしくは主鎖の位置にある。
一実施形態では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端の８位で始まる。一例では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端の８位で始まり、ｑ４は２である。
一実施形態では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端の９位で始まる。一例では、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端の９位で始まり、ｑ４は１である。
一実施形態では、Ｂ１’は、２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は６であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態では、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は６であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は６であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は７であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は６であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は７であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は６であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は６であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は５であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；任意選択により、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２つの追加のＴＴを有する。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は５であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は１であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；任意選択により、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２つの追加のＴＴを有し；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。
このｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端にリン含有基を含み得る。５’末端リン含有基は、５’末端リン酸（５’−Ｐ）、５’末端ホスホロチオエート（５’−ＰＳ）、５’末端ホスホロジチオエート（５’−ＰＳ２）、５’末端ビニルホスホネート（５’−ＶＰ）、５’末端メチルホスホネート（ＭｅＰｈｏｓ）、または５’デオキシ５’−Ｃ−マロニル
Figure 2021522810
 であり得る。５’末端リン含有基が５’末端ビニルホスホネート（５−ＶＰ）である場合は、５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ異性体（即ち、トランス−ビニルホスフェート、
Figure 2021522810
 ）、または５’−Ｚ−ＶＰ異性体（即ち、シス−ビニルホスフェート、
Figure 2021522810
 ）のいずれか、またはこれらの混合物であり得る。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の５’末端にリン含有基を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の５’末端にリン含有基を含む。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐを含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖に５’−Ｐを含む。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳを含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖に５’−ＰＳを含む。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰを含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖に５’−ＶＰを含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖に５’−Ｅ−ＶＰを含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖に５’−Ｚ−ＶＰを含む。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖に５’−ＰＳ２を含む。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２を含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖に５’デオキシ５’−Ｃ−マロニルを含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせであり得る。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせであり得る。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせであり得る。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせであり得る。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせであり得る。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせであり得る。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせであり得る。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１である。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳも含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰも含む。５’−ＶＰは、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせであり得る。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２も含む。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルも含む。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤の１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、または３０％が修飾される。例えば、ｄｓＲＮＡ剤の５０％が修飾される場合は、ｄｓＲＮＡ剤中に存在する全てのヌクレオチドの５０％が、本明細書に記載のように修飾を含む。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ独立に、非環状ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−デオキシ、２’−フルオロ、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、または２’−ａｒａ−Ｆで修飾されている。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれは、少なくとも２つの異なる修飾を含む。
一実施形態では、式（Ｉ）のｄｓＲＮＡ剤は、１〜１０ヌクレオチド長の３’および／または５’オーバーハングをさらに含む。一例では、式（Ｉ）のｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における３’オーバーハングおよびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を含む。別の例では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の５’末端に５’オーバーハングを有する。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、２’−Ｆ修飾を一切含まない。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖は、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の１つ以上のブロックを含む。一例では、センス鎖は、２つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の１つのブロックを含む。一例では、アンチセンス鎖は、２つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の２つのブロックを含む。例えば、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の２つのブロックは、１６〜１８のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離されている。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれは、１５〜３０のヌクレオチドを有する。一例では、センス鎖は、１９〜２２のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は、１９〜２５のヌクレオチドを有する。別の例では、センス鎖は、２１のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は、２３のヌクレオチドを有する。
一実施形態では、二重鎖におけるアンチセンス鎖の５’末端の１位のヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される。一実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端からの第１、第２、および第３の塩基対の少なくとも１つが、ＡＵ塩基対である。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、標的ＲＮＡにハイブリダイズしてその発現をＲＮＡ干渉によって阻害するための標的ＲＮＡに対して１００％相補的である。別の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、標的ＲＮＡに対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、または少なくとも５０％相補的である。
一態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することができる、本明細書で定義されるｄｓＲＮＡ剤に関する。ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有する。センス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、前記熱不安定化ヌクレオチドの少なくとも１つは、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２位〜８位）の反対側の部位またはその近傍に存在する。式（Ｉ）によって表されるｄｓＲＮＡに関連する本明細書に記載の実施形態および態様のそれぞれは、熱不安定化ヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡにも適用することができる。
熱不安定化ヌクレオチドは、例えば、センス鎖が２１ヌクレオチド長である場合は、センス鎖の５’末端の１４位〜１７位の間に存在し得る。アンチセンス鎖は、立体的要求が高い２’−ＯＭｅ修飾よりも小さい少なくとも２つの修飾核酸を含む。好ましくは、立体的要求が高い２’−ＯＭｅよりも小さい２つの修飾核酸は、１１ヌクレオチド長離間している。例えば、２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２位および１４位にある。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つのＡＳＧＰＲリガンドをさらに含む。例えば、ＡＳＧＰＲリガンドは、二価または三価の分岐リンカー、例えば：
Figure 2021522810
 によって付加された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。一例では、ＡＳＧＰＲリガンドは、センス鎖の３’末端に付加される。
例えば、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ剤は、（ｉ）センス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端におけるリン含有基；（ｉｉ）センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾；ならびに（ｉｉｉ）センス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端または３’末端におけるリガンド、例えば、ＡＳＧＰＲリガンド（例えば、１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体）を含み得る。例えば、このリガンドは、センス鎖の３’末端に存在し得る。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰ（例えば、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせ）および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰ（例えば、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせ）および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−ＯＭｅであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰ（例えば、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせ）および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、Ｔ２’は２’−Ｆであり、ｑ４は２であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は５であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−Ｐおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＶＰ（例えば、５’−Ｅ−ＶＰ、５’−Ｚ−ＶＰ、またはこれらの組み合わせ）および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−ＰＳ２および標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態では、Ｂ１は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｎ１は８であり、Ｔ１は２’Ｆであり、ｎ２は３であり、Ｂ２は２’−ＯＭｅであり、ｎ３は７であり、ｎ４は０であり、Ｂ３は２’−ＯＭｅであり、ｎ５は３であり、Ｂ１’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ１は９であり、Ｔ１’は２’−Ｆであり、ｑ２は１であり、Ｂ２’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ３は４であり、ｑ４は０であり、Ｂ３’は２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆであり、ｑ５は７であり、Ｔ３’は２’−Ｆであり、ｑ６は１であり、Ｂ４’は２’−Ｆであり、ｑ７は１であり；センス鎖の１位〜５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾、ならびにアンチセンス鎖の１位および２位（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）にある２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾および１８位〜２３位の範囲内の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の修飾を有する。ｄｓＲＮＡ剤は、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルおよび標的リガンドも含む。一実施形態では、５’−デオキシ−５’−Ｃ−マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、標的リガンドは、センス鎖の３’末端にある。
特定の一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）任意選択で三価分岐リンカーによって付加された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む３’末端に付加されたＡＳＧＰＲリガンド；および
（ｉｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位〜１１位、１３位、１７位、１９位、および２１位（５’末端から数えて）における２’−Ｆ修飾、ならびに２位、４位、６位、８位、１２位、１４位〜１６位、１８位、および２０位における２’−ＯＭｅ修飾を有する、センス鎖；
ならびに
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１位、３位、５位、９位、１１位〜１３位、１５位、１７位、１９位、２１位、および２３位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに２位、４位、６位〜８位、１０位、１４位、１６位、１８位、２０位、および２２位における２’Ｆ修飾；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド２１位と２２位（５’末端から数えて）との間およびヌクレオチド２２位と２３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における２つのヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する、アンチセンス鎖を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）任意選択で三価分岐リンカーによって付加された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付加されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位〜１１位、１３位、１５位、１７位、１９位、および２１位（５’末端から数えて）における２’−Ｆ修飾、ならびに２位、４位、６位、８位、１２位、１４位、１６位、１８位、および２０位における２’−ＯＭｅ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間およびヌクレオチド２位と３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖；
ならびに
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位、１１位〜１３位、１５位、１７位、１９位、および２１位〜２３位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに２位、４位、６位、８位、１０位、１４位、１６位、１８位、および２０位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、およびヌクレオチド２２位と２３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における２つヌクレオチドのオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する、アンチセンス鎖を含む。
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）任意選択で三価分岐リンカーによって付加された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付加されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位〜６位、８位、１０位、および１２位〜２１位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、７位及び９位における２’−Ｆ修飾、ならびに１１位におけるデオキシ−ヌクレオチド（例えば、ｄＴ）；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間およびヌクレオチド２位と３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖；
ならびに
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１位、３位、７位、９位、１１位、１３位、１５位、１７位、および１９位〜２３位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに２位、４位〜６位、８位、１０位、１２位、１４位、１６位、および１８位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、およびヌクレオチド２２位と２３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における２つのヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）任意選択で三価分岐リンカーによって付加された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付加されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位〜６位、８位、１０位、１２位、１４位、および１６位〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに７位、９位、１１位、１３位、および１５位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間およびヌクレオチド２位と３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖；
ならびに
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１位、５位、７位、９位、１１位、１３位、１５位、１７位、１９位、および２１位〜２３位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに２位〜４位、６位、８位、１０位、１２位、１４位、１６位、１８位、および２０位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、およびヌクレオチド２２位と２３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における２つのヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）任意選択で三価分岐リンカーによって付加された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付加されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位〜９位および１２位〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに１０位および１１位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間およびヌクレオチド２位と３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖；
ならびに
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１位、５位、７位、９位、１１位〜１３位、１５位、１７位、１９位、および２１位〜２３位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに２位、４位、６位、８位、１０位、１４位、１６位、１８位、および２０位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、およびヌクレオチド２２位と２３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における２つのヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）任意選択で三価分岐リンカーによって付加された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付加されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位〜１１位、および１３位における２’−Ｆ修飾、ならびに２位、４位、６位、８位、１２位、１４位〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間およびヌクレオチド２位と３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖；
ならびに
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１位、３位、５位〜７位、９位、１１位〜１３位、１５位、１７位〜１９位、および２１位〜２３位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに２位、４位、８位、１０位、１４位、１６位、および２０位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、およびヌクレオチド２２位と２３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における２つのヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）任意選択で三価分岐リンカーによって付加された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付加されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位、２位、４位、６位、８位、１２位、１４位、１５位、１７位、および１９位〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに３位、５位、７位、９位〜１１位、１３位、１６位、および１８位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間およびヌクレオチド２位と３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖；
ならびに
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２５ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１位、４位、６位、７位、９位、１１位〜１３位、１５位、１７位、および１９位〜２３位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、２位、３位、５位、８位、１０位、１４位、１６位、および１８位における２’−Ｆ修飾、ならびに２４位および２５位におけるデオキシ−ヌクレオチド（例えば、ｄＴ）；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、およびヌクレオチド２２位と２３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における４つのヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）任意選択で三価分岐リンカーによって付加された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付加されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位〜６位、８位、および１２位〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに７位および９位〜１１位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間およびヌクレオチド２位と３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖；
ならびに
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１位、３位〜５位、７位、８位、１０位〜１３位、１５位、および１７位〜２３位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに２位、６位、８位、９位、１４位、および１６位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、およびヌクレオチド２２位と２３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における２つのヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）任意選択で三価分岐リンカーによって付加された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付加されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位〜６位、８位、および１２位〜２１位における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに７位および９位〜１１位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間およびヌクレオチド２位と３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖；
ならびに
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１位、３位〜５位、７位、１０位〜１３位、１５位、および１７位〜２３位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに２位、６位、８位、９位、１４位、および１６位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド２１位と２２位との間、およびヌクレオチド２２位と２３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における２つのヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は：
（ａ）センス鎖であって：
（ｉ）１９ヌクレオチド長；
（ｉｉ）任意選択で三価分岐リンカーによって付加された３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、３’末端に付加されたＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１位〜４位、６位、および１０位〜１９位における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに５位および７位〜９位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間およびヌクレオチド２位と３位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、センス鎖；
ならびに
（ｂ）アンチセンス鎖であって：
（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１位、３位〜５位、７位、１０位〜１３位、１５位、および１７位〜２１位（５’末端から数えて）における２’−ＯＭｅ修飾、ならびに２位、６位、８位、９位、１４位、および１６位における２’−Ｆ修飾；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド１位と２位（５’末端から数えて）との間、ヌクレオチド２位と３位との間、ヌクレオチド１９位と２０位との間、およびヌクレオチド２０位と２１位との間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における２つのヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）１８〜２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）７〜１５位における３つの連続した２’−Ｆ修飾を有する、センス鎖；並びに
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）１８〜２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）鎖のいずれかの箇所に少なくとも２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）最初の５つのヌクレオチド（５’末端から数えて）における少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの鎖における１つ以上の位置にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分を有し；アンチセンス鎖の３’末端における２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端；又は二重鎖の両端における平滑末端のいずれかを有する。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）１８〜２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）４つ未満の２’−Ｆ修飾を有する、センス鎖；
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）１８〜２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１２未満の２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）最初の５つのヌクレオチド（５’末端から数えて）における少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
このｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの鎖における１つ以上の位置にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分を有し；アンチセンス鎖の３’末端における２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端；又は二重鎖の両端における平滑末端のいずれかを有する。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）１９〜３５ヌクレオチド長；
（ｉｉ）４つ未満の２’−Ｆ修飾を有する、センス鎖；
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）１９〜３５ヌクレオチド長；
（ｉｉ）１２未満の２’−Ｆ修飾；及び
（ｉｉｉ）最初の５つのヌクレオチド（５’末端から数えて）における少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、アンチセンス鎖を含み；
ここで、二重鎖領域は、１９〜２５の塩基対（好ましくは、１９、２０、２１又は２２）であり；このｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの鎖における１つ以上の位置にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分を有し；アンチセンス鎖の３’末端における２つのヌクレオチドオーバーハング、及びアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端；又は二重鎖の両端における平滑末端のいずれかを有する。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、１５〜３０ヌクレオチドの長さを有するセンス鎖及びアンチセンス鎖；（５’末端から数えて）アンチセンス鎖上の最初の５つのヌクレオチドにおける少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、二重鎖領域は、１９〜２５の塩基対（好ましくは、１９、２０、２１又は２２）であり；このｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの鎖における１つ以上の位置にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分を有し；このｄｓＲＮＡ剤は、２０％未満、１５％未満及び１０％未満の非天然ヌクレオチドを有する。
非天然ヌクレオチドの例としては、非環状ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−デオキシ、２’−フルオロ、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、又は２’−ａｒａ−Ｆ、及びその他が挙げられる。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、１５〜３０ヌクレオチドの長さを有するセンス鎖及びアンチセンス鎖；（５’末端から数えて）アンチセンス鎖上の最初の５つのヌクレオチドにおける少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、二重鎖領域は、１９〜２５の塩基対（好ましくは、１９、２０、２１又は２２）であり；このｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの鎖における１つ以上の位置にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分を有し；このｄｓＲＮＡ剤は、８０％超、８５％超及び９０％超の天然ヌクレオチドを有し、例えば、２’−ＯＨ、２’−デオキシ及び２’−ＯＭｅが、天然ヌクレオチドである。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、１５〜３０ヌクレオチドの長さを有するセンス鎖及びアンチセンス鎖；（５’末端から数えて）アンチセンス鎖上の最初の５つのヌクレオチドにおける少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここで、二重鎖領域は、１９〜２５の塩基対（好ましくは、１９、２０、２１又は２２）であり；このｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの鎖における１つ以上の位置にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分を有し；このｄｓＲＮＡ剤は、１００％の天然ヌクレオチドを有し、例えば、２’−ＯＨ、２’−デオキシ及び２’−ＯＭｅが、天然ヌクレオチドである。
親油性部分の例としては、限定されるものではないが、脂質（飽和又は不飽和Ｃ４〜Ｃ３０炭化水素鎖、及びヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジド、及びアルキンからなる群から選択される任意選択の官能基）、コレステロール、レチノイン酸、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキサノール、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジンが挙げられる。
一部の実施形態では、親油性部分は、Ｃ６〜Ｃ３０酸（例えば、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸、オクタデカン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、シス−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサン酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ、コレステロールなど）又はＣ６〜Ｃ３０アルコール（例えば、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプタデカノール、オクタデカノール、オレイルアルコール、リノレイルアルコール、アラキドン酸アルコール、シス−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサノール、レチノール、ビタミンＥ、コレステロールなど）である。
一例では、親油性部分は、飽和又は不飽和Ｃ６〜Ｃ１８炭化水素鎖である。
一例では、親油性部分は、ドコサヘキサエン酸である。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、１４〜３０ヌクレオチドをそれぞれが有するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖配列は、式（Ｉ）によって表される：
５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’ （Ｉ）
式中：
ｉ及びｊは、それぞれ独立に、０又は１であり；
ｐ及びｑは、それぞれ独立に、０〜６であり；
各Ｎａは、独立に、０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂは、独立に、１、２、３、４、５、又は６つの修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ及びｎｑは、独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し；
Ｎｂ及びＹは、同じ修飾を有さず；
ＸＸＸ、ＹＹＹ及びＺＺＺは、それぞれ独立に、３連続ヌクレオチドにおける３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し；
このｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの鎖における１つ以上の位置にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分を有し；
ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８つのリン酸塩ヌクレオチド間結合によって隔てられる１つ、２つ又は３つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合の２つのブロックを含む。
様々な刊行物に、多量体ｓｉＲＮＡが記載されており、これらは全て本発明のｉＲＮＡと共に使用され得る。このような刊行物としては、参照により全内容が本明細書に組み入れられる、国際公開第２００７／０９１２６９号パンフレット、米国特許第７８５８７６９号明細書、国際公開第２０１０／１４１５１１号パンフレット、国際公開第２００７／１１７６８６号パンフレット、国際公開第２００９／０１４８８７号パンフレット及び国際公開第２０１１／０３１５２０号パンフレットが挙げられる。
一部の実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤の１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％又は３０％が修飾される。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれは、独立に、非環状ヌクレオチド、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−デオキシ、２’−フルオロ、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、又は２’−ａｒａ−Ｆで修飾される。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれは、少なくとも２つの異なる修飾を含む。
一部の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、任意の２’−Ｆを含まない。
一部の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１又は１２の２’−Ｆ修飾を含む。一例では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、９つ又は１０の２’−Ｆ修飾を含む。
本発明のｉＲＮＡ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含み得る。ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合修飾は、鎖のいずれかの位置のセンス鎖又はアンチセンス鎖又は両方の任意のヌクレオチドに存在し得る。例えば、ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖における全てのヌクレオチドに存在してもよく；各ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖又はアンチセンス鎖において交互のパターンで存在してもよく；又はセンス鎖又はアンチセンス鎖は、交互のパターンで両方のヌクレオチド間結合修飾を含み得る。センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じでも異なっても良く、センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互パターンに対してシフトを有しても良い。
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、オーバーハング領域にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含有し得る。ヌクレオチド間結合の修飾は、オーバーハングヌクレオチドを二重鎖領域内の末端の塩基対形成ヌクレオチドに結合させるために形成することもできる。例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、または全てのオーバーハングヌクレオチドを、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合によって結合することができ、任意選択で、オーバーハングヌクレオチドをその次の塩基対形成ヌクレオチドに結合する追加的なホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合が存在しても良い。例えば、末端の３つのヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホチオエートのヌクレオチド間結合が存在しても良く、この末端の３つのヌクレオチドのうちの２つは、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドの次の塩基対形成ヌクレオチドである。好ましくは、これらの末端の３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に存在し得る。
一部の実施形態では、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の１つ以上のブロックを含む。一例では、センス鎖は、２つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の１つのブロックを含む。一例では、アンチセンス鎖は、２つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の２つのブロックを含む。例えば、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合の２つのブロックは、１６〜１８のリン酸塩ヌクレオチド間結合によって隔てられる。
一部の実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、標的ＲＮＡにハイブリダイズするために及びＲＮＡ干渉によってその発現を阻害するために標的ＲＮＡに対して１００％相補的である。別の実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、標的ＲＮＡに対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、又は少なくとも５０％相補的である。
一態様では、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害することが可能なｉＲＮＡ剤に関する。ｉＲＮＡ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、各鎖は、１４〜４０のヌクレオチドを有する。センス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで、少なくとも１つの前記熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜８位）の反対側の部位又はその近傍に存在し、例えば、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖が２１ヌクレオチド長である場合、センス鎖の５’末端の１４〜１７位に存在する。アンチセンス鎖は、立体的に嵩高い２’−ＯＭｅ修飾より小さい少なくとも２つの修飾核酸を含む。好ましくは、立体的に嵩高い２’−ＯＭｅより小さい２つの修飾核酸は、１１ヌクレオチド長だけ隔てられている。例えば、２つの修飾核酸は、アンチセンス鎖の５’末端の２及び１４位にある。
一部の実施形態では、本明細書に開示される本発明の化合物は、ｍｉＲＮＡ模倣体である。１つの設計において、ｍｉＲＮＡ模倣体は、二本鎖分子（例えば、約１６〜約３１ヌクレオチド長の二重鎖領域を有する）であり、所与のｍｉＲＮＡの成熟鎖との同一性を有する１つ以上の配列を含む。二本鎖ｍｉＲＮＡ模倣体は、二本鎖ｉＲＮＡについて上述されるのと同様の設計を有する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ模倣体は、１６〜３１ヌクレオチドの二重鎖領域及び以下の化学修飾パターンの１つ以上を含む：センス鎖は、ヌクレオチド１及び２（センスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて）の２’−Ｏ−メチル修飾、並びにＣｓ及びＵｓの全てを含み；アンチセンス鎖修飾は、Ｃｓ及びＵｓの全ての２’Ｆ修飾、オリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸化、並びに２ヌクレオチド３’オーバーハングと結合された安定したヌクレオチド間結合を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される本発明の化合物は、アンチマー（ａｎｔｉｍｉｒ）である。一部の実施形態では、本発明の化合物は、ヌクレオチド系又は非ヌクレオチド系リンカー、例えば、本開示に記載されるリンカーを介して互いに共有結合されるか、又は互いに非共有結合された少なくとも２つのアンチマーを含む。「アンチマー」「マイクロＲＮＡ阻害剤」又は「ｍｉＲ阻害剤」という語は、同義であり、特定のｍｉＲＮＡの活性を妨げるオリゴヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチドを指す。阻害剤は、一本鎖、二本鎖（ＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖）、及びヘアピン設計を含む様々な形態を採ることができ、一般に、マイクロＲＮＡ阻害剤は、標的にされるｍｉＲＮＡの成熟鎖（又は複数の鎖）と相補的若しくは部分的に相補的な、１つ以上の配列又は配列の部分を含み、さらに、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、成熟ｍｉＲＮＡの逆相補体である配列に対して５’及び３’側に位置するさらなる配列も含み得る。さらなる配列は、それから成熟ｍｉＲＮＡが得られるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡにおける成熟ｍｉＲＮＡに隣接する配列の逆相補体であり得、又はさらなる配列は、任意の配列（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、又はｄＴの混合物を有する）であり得る。一部の実施形態では、さらなる配列の一方又は両方は、ヘアピンを形成することが可能な任意の配列である。したがって、一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡの逆相補体である配列には、５’側及び３’側にヘアピン構造が隣接している。マイクロＲＮＡ阻害剤は、二本鎖である場合、反対の鎖におけるヌクレオチド間にミスマッチを含み得る。さらに、マイクロＲＮＡ阻害剤は、１細胞内への阻害剤の取り込みを促進するために、コンジュゲート部分に連結され得る。
ヘアピンｍｉＲＮＡ阻害剤を含むマイクロＲＮＡ阻害剤が、参照によりそれぞれの全内容が本明細書に組み入れられる、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ａｒｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ Ｏｆ Ｐｏｔｅｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＲＩＳＣ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”，ＲＮＡ １３：７２３−７３０（２００７）及び国際公開第２００７／０９５３８７号パンフレット及び国際公開第２００８／０３６８２５号パンフレットに詳細に記載されている。当業者は、所望のｍｉＲＮＡのためにデータベースから配列を選択し、本明細書に開示される方法に有用な阻害剤を設計することができる。
一部の実施形態では、本明細書に開示される本発明の化合物は、アンタゴマー（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）である。一部の実施形態では、本発明の化合物は、ヌクレオチド系又は非ヌクレオチド系リンカー、例えば、本開示に記載されるリンカーを介して互いに共有結合されるか、又は互いに非共有結合された少なくとも２つのアンタゴマーを含む。アンタゴマーは、ＲＮＡｓｅ保護及び薬理特性、例えば、向上した組織及び細胞取り込みのために様々な修飾を有するＲＮＡ様オリゴヌクレオチドである。それらは、例えば、糖の完全な２’−Ｏ−メチル化、ホスホロチオエート糖間結合及び、例えば、３’末端におけるコレステロール部分によって、通常ＲＮＡと異なる。好ましい実施形態では、アンタゴマーは、全てのヌクレオチドにおける２’−Ｏ−メチル修飾、３’末端におけるコレステロール部分、５’末端における最初の２つの位置における２つのホスホロチオエート糖間結合及び分子の３’末端における４つのホスホロチオエート結合を含む。アンタゴマーを用いて、アンタゴマー及び内因性ｍｉＲＮＡを含む二重鎖を形成することによって内因性ｍｉＲＮＡを効率的にサイレンシングさせ、それによって、ｍｉＲＮＡ誘導遺伝子サイレンシングを防ぐことができる。アンタゴマー媒介性ｍｉＲＮＡサイレンシングの例は、参照により全内容が本明細書に明示的に組み入れられる、Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３８：６８５−６８９に記載される、ｍｉＲ−１２２のサイレンシングである。
最近の研究により、ｄｓＲＮＡがまた、「小ＲＮＡ誘導遺伝子活性化」又はＲＮＡａ（活性化ＲＮＡ）と呼ばれている機構である遺伝子発現を活性化し得ることが見出された。例えば、Ｌｉ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．（２００６），１０３（４６）：１７３３７−４２及びＬｉ Ｌ．Ｃ．（２００８）．“Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”．ＲＮＡ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｈｉｄｄｅｎ Ｌａｙｅｒ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ．Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．ＩＳＢＮ ９７８−１−９０４４５５−２５−７を参照されたい。ｄｓＲＮＡ標的化遺伝子プロモーターが、関連遺伝子の強力な転写活性化を誘導することが示されている。ＲＮＡａを引き起こす内因性ｍｉＲＮＡはまた、ヒトにおいて見られる。Ｃｈｅｃｋ Ｅ．Ｎａｔｕｒｅ（２００７）．４４８（７１５６）：８５５−８５８。
別の意外な観察結果は、ＲＮＡａによる遺伝子活性化が長続きすることである。遺伝子発現の誘導は、１０日間以上にわたって続くことが見られた。ＲＮＡａの持続効果は、ｄｓＲＮＡ標的部位における後成的変化に起因し得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ活性化因子は、遺伝子の発現を増加させ得る。一部の実施形態では、増加した遺伝子発現は、生存、成長発達、及び／又は生殖を阻害する。
したがって、一部の実施形態では、本明細書に開示される本発明の化合物は、活性化ＲＮＡである。一部の実施形態では、本発明の化合物は、ヌクレオチド系又は非ヌクレオチド系リンカー、例えば、本開示に記載されるリンカーを介して互いに共有結合されるか、又は互いに非共有結合された少なくとも２つの活性化ＲＮＡを含む。
したがって、一部の実施形態では、本明細書に開示される本発明の化合物は、三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）である。一部の実施形態では、本発明の化合物は、ヌクレオチド系又は非ヌクレオチド系リンカー、例えば、本開示に記載されるリンカーを介して互いに共有結合されるか、又は互いに非共有結合された少なくとも２つのＴＦＯを含む。最近の研究により、配列特異的に二本鎖らせんＤＮＡ中のポリプリン／ポリピリミジン領域を認識し、それに結合し得る三重鎖形成オリゴヌクレオチドが設計され得ることが示されている。これらの認識ルールが、Ｍａｈｅｒ ＩＩＩ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）ｖｏｌ．２４５，ｐｐ ７２５−７３０；Ｍｏｓｅｒ，Ｈ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）ｖｏｌ．２３８，ｐｐ ６４５−６３０；Ｂｅａｌ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）ｖｏｌ．２５１，ｐｐ １３６０−１３６３；Ｃｏｎｎｅｙ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）ｖｏｌ．２４１，ｐｐ ４５６−４５９及びＨｏｇａｎ，Ｍ．Ｅ．らのＥＰ公報３７５４０８号明細書によって概説されている。オリゴヌクレオチドの修飾、例えば、挿入剤の導入及び糖間結合置換、並びに結合条件（ｐＨ及びカチオン濃度）の最適化が、電荷斥力及び不安定性などのＴＦＯ活性に固有の障害を克服するのに役立っており、合成オリゴヌクレオチドが、特定の配列に標的化され得ることが最近示された（最近の概説については、Ｓｅｉｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００３；ｌ １２：４８７−９４を参照されたい）。一般に、三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、配列の一致を有する：
オリゴ ３’−ＡＧＧＴ
二重鎖 ５’−ＡＧＣＴ
二重鎖 ３’−ＴＣＧＡ
しかしながら、Ａ−ＡＴ及びＧ−ＧＣトリプレットが、最も高い三重らせん安定性を有することが示されている（Ｒｅｉｔｈｅｒ ａｎｄ Ｊｅｌｔｓｃｈ，ＢＭＣ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００２，Ｓｅρｔｌ２，Ｅｐｕｂ）。同じ著者が、Ａ−ＡＴ及びＧ−ＧＣルールにしたがって設計されたＴＦＯが、非特異的三重鎖を形成しないことを実証しており、これは、三重鎖形成が、実際に配列特異的であることを示す。
したがって、任意の所与の配列のために、三重鎖形成配列が考案され得る。三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも１５、より好ましくは、２５、さらにより好ましくは、３０以上のヌクレオチド長、最大で５０又は１００ヌクレオチドである。
標的ＤＮＡによる三重らせん構造の形成は、立体及び機能変化を誘導し、転写開始及び伸長をブロックし、内因性ＤＮＡの所望の配列変化の導入を可能にし、遺伝子発現の特異的な下方制御をもたらす。ＴＦＯで処理された細胞における遺伝子発現のこのような抑制の例としては、哺乳類細胞におけるエピソームｓｕｐＦＧｌ及び内因性ＨＰＲＴ遺伝子のノックアウト（Ｖａｓｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９；２７：１１７６−８１、及びＰｕｒｉ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００１；２７６：２８９９１−９８）、並びに前立腺癌病因において重要なＥｔｓ２転写因子（Ｃａｒｂｏｎｅ，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２００３；３１：８３３−４３）、及び炎症性ＩＣＡＭ−Ｉ遺伝子（Ｂｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００２；２７７：３２４７３−７９）の発現の配列特異的及び標的特異的な下方制御が挙げられる。さらに、Ｖｕｙｉｓｉｃｈ及びＢｅａｌは、配列特異的ＴＦＯが、ｄｓＲＮＡに結合することができ、ＲＮＡ依存性キナーゼなどのｄｓＲＮＡ依存性酵素の活性を阻害することを最近示した（Ｖｕｙｉｓｉｃｈ ａｎｄ Ｂｅａｌ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０００；２８：２３６９−７４）。
さらに、上記の原理にしたがって設計されるＴＦＯは、ＤＮＡ修復を行うことが可能な定方向突然変異誘発（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を誘導することができ、それによって、内因性遺伝子の発現の下方制御及び上方制御の両方を提供する（Ｓｅｉｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｌａｚｅｒ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００３；１１２：４８７−９４）。有効なＴＦＯの設計、合成及び投与の詳細な説明が、参照により全内容が本明細書に組み入れられる、Ｆｒｏｅｈｌｅｒらの米国特許出願公開第２００３ ０１７０６８号明細書及び同第２００３ ００９６９８０号明細書、並びにＥｍａｎｕｅｌｅらの同第２００２ ０１２８２１８号明細書及び同第２００２ ０１２３４７６号明細書、並びにＬａｗｎに付与された米国特許第５，７２１，１３８号明細書に見出される。
核酸修飾
一部の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、本明細書に記載される少なくとも１つの核酸修飾を含む。例えば、少なくとも１つの修飾は、修飾ヌクレオシド間結合、修飾核酸塩基、修飾糖、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。限定されるものではないが、このような修飾は、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤のいずれかの箇所に存在し得る。例えば、修飾は、ＲＮＡ分子の１つに存在し得る。
核酸修飾（核酸塩基）
ヌクレオシドの天然に存在する塩基部分は、典型的に、複素環式塩基である。このような複素環式塩基の２つの最も一般的な種類は、プリン及びピリミジンである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は、糖の２’、３’又は５’ヒドロキシル部分に連結され得る。オリゴヌクレオチドを形成する際、それらのリン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合させて、直鎖ポリマー化合物を形成する。オリゴヌクレオチド内で、リン酸基は、一般的に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するものとされる。ＲＮＡ及びＤＮＡの天然に存在する結合又は骨格は、３’−５’ホスホジエステル結合である。
プリン核酸塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、及びピリミジン核酸塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）などの「非修飾」又は「天然」核酸塩基に加えて、当業者に公知の多くの修飾核酸塩基又は核酸塩基模倣体が、本明細書に記載される化合物で使用可能である。非修飾又は天然核酸塩基は、改良された特性を有するｉＲＮＡを提供するために、修飾又は置換され得る。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、これらの塩基又は合成及び天然核酸塩基（例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、イソグアニシン、又はツベルシジン）並びに本明細書に記載されるオリゴマー修飾のいずれか１つを用いて調製され得る。或いは、上記の塩基及び「ユニバーサル塩基」のいずれかの置換又は修飾類似体が用いられ得る。天然塩基が、非天然及び／又はユニバーサル塩基で置換される場合、ヌクレオチドは、本明細書において、修飾核酸塩基及び／又は核酸塩基修飾を含むといわれる。修飾核酸塩基及び／又は核酸塩基修飾は、コンジュゲート部分、例えば、本明細書に記載されるリガンドを含む、天然、非天然及びユニバーサル塩基も含む。核酸塩基とのコンジュゲーションのために好ましいコンジュゲート部分は、カチオン性アミノ基を含み、これらは、適切なアルキル、アルケニル又はアミド結合を有するリンカーを介して、核酸塩基にコンジュゲートされ得る。
本明細書に記載されるオリゴマー化合物は、核酸塩基（当分野において単に「塩基」と呼ばれることが多い）修飾又は置換も含み得る。本明細書で使用される「非修飾」又は「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、及びピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。例示的な修飾核酸塩基としては、限定されるものではないが、他の合成及び天然核酸塩基、例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、イソグアニシン、ツベルシジン、２−（ハロ）アデニン、２−（アルキル）アデニン、２−（プロピル）アデニン、２−（アミノ）アデニン、２−（アミノアルキル）アデニン、２−（アミノプロピル）アデニン、２−（メチルチオ）−Ｎ６−（イソペンテニル）アデニン、６−（アルキル）アデニン、６−（メチル）アデニン、７−（デアザ）アデニン、８−（アルケニル）アデニン、８−（アルキル）アデニン、８−（アルキニル）アデニン、８−（アミノ）アデニン、８−（ハロ）アデニン、８−（ヒドロキシル）アデニン、８−（チオアルキル）アデニン、８−（チオール）アデニン、Ｎ６−（イソペンチル）アデニン、Ｎ６−（メチル）アデニン、Ｎ６、Ｎ６−（ジメチル）アデニン、２−（アルキル）グアニン、２−（プロピル）グアニン、６−（アルキル）グアニン、６−（メチル）グアニン、７−（アルキル）グアニン、７−（メチル）グアニン、７−（デアザ）グアニン、８−（アルキル）グアニン、８−（アルケニル）グアニン、８−（アルキニル）グアニン、８−（アミノ）グアニン、８−（ハロ）グアニン、８−（ヒドロキシル）グアニン、８−（チオアルキル）グアニン、８−（チオール）グアニン、Ｎ−（メチル）グアニン、２−（チオ）シトシン、３−（デアザ）−５−（アザ）シトシン、３−（アルキル）シトシン、３−（メチル）シトシン、５−（アルキル）シトシン、５−（アルキニル）シトシン、５−（ハロ）シトシン、５−（メチル）シトシン、５−（プロピニル）シトシン、５−（プロピニル）シトシン、５−（トリフルオロメチル）シトシン、６−（アゾ）シトシン、Ｎ４−（アセチル）シトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル、２−（チオ）ウラシル、５−（メチル）−２−（チオ）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）−２−（チオ）ウラシル、４−（チオ）ウラシル、５−（メチル）−４−（チオ）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）−４−（チオ）ウラシル、５−（メチル）−２，４−（ジチオ）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）−２，４−（ジチオ）ウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−（アルキル）ウラシル、５−（アルキニル）ウラシル、５−（アリルアミノ）ウラシル、５−（アミノアリル）ウラシル、５−（アミノアルキル）ウラシル、５−（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５−（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル、５−（シアノアルキル）ウラシル、５−（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５−（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５−（ハロ）ウラシル、５−（メトキシ）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル、５−（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル、５−（プロピニル）ウラシル、５−（プロピニル）ウラシル、５−（トリフルオロメチル）ウラシル、６−（アゾ）ウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ３−（メチル）ウラシル、５−ウラシル（即ち、プソイドウラシル）、２−（チオ）プソイドウラシル，４−（チオ）プソイドウラシル、２，４−（ジチオ）プソイドウラシル，５−（アルキル）プソイドウラシル、５−（メチル）プソイドウラシル、５−（アルキル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−４−（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−４−（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１−置換プソイドウラシル、１−置換２（チオ）−プソイドウラシル、１−置換４−（チオ）プソイドウラシル、１−置換２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１−（アミノカルボニルエチレニル）−プソイドウラシル、１−（アミノカルボニルエチレニル）−２（チオ）−プソイドウラシル、１−（アミノカルボニルエチレニル）−４−（チオ）プソイドウラシル、１−（アミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１−（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−プソイドウラシル、１−（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−２（チオ）−プソイドウラシル、１−（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−４−（チオ）プソイドウラシル、１−（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキル−ヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、１，３，５−（トリアザ）−２，６−（ジオキサ）−ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、イノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンズイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、３−（メチル）イソカルボスチリリル、５−（メチル）イソカルボスチリリル、３−（メチル）−７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、７−（アザ）インドリル、６−（メチル）−７−（アザ）インドリル、イミジゾピリジニル、９−（メチル）−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル−７−（アザ）インドリル、２，４，５−（トリメチル）フェニル、４−（メチル）インドリル、４，６−（ジメチル）インドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチベニル、テトラセニル、ペンタセニル、ジフルオロトリル、４−（フルオロ）−６−（メチル）ベンズイミダゾール、４−（メチル）ベンズイミダゾール、６−（アゾ）チミン、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、６−（アザ）ピリミジン、２−（アミノ）プリン、２，６−（ジアミノ）プリン、５−置換ピリミジン、Ｎ２−置換プリン、Ｎ６−置換プリン、Ｏ６−置換プリン、置換１，２，４−トリアゾール、ピロロ−ピリミジン−２−ｏｎ−３−イル、６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−ｏｎ−３−イル、パラ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−ｏｎ−３−イル、オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−ｏｎ−３−イル、ビス−オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−ｏｎ−３−イル、パラ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−ｏｎ−３−イル、オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−ｏｎ−３−イル、ビス−オルト−−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−ｏｎ−３−イル、ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−７−アミノ−ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−ピリドピリミジン−３−イル、又はそれらの任意のＯ−アルキル化若しくはＮ−アルキル化誘導体が挙げられる。或いは、上記の塩基及び「ユニバーサル塩基」のいずれかの置換又は修飾類似体が用いられ得る。
本明細書で使用されるユニバーサル核酸塩基は、融解挙動、細胞内酵素による認識又はｉＲＮＡ二重鎖の活性に実質的に影響を与えずに、４つの天然に存在する核酸塩基の全てと塩基対合し得る任意の核酸塩基である。一部の例示的なユニバーサル核酸塩基としては、限定されるものではないが、２，４−ジフルオロトルエン、ニトロピロリル、ニトロインドリル、８−アザ−７−デアザアデニン、４−フルオロ−６−メチルベンズイミダゾール、４−メチルベンズイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル、３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチリノリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチベニル、テトラセニル、ペンタセニル、及びそれらの構造的誘導体が挙げられる（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２４３７−２４４７を参照されたい）。
さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されるもの；２００９年３月２６日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３８４２５号明細書に開示されるもの；ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの；Ｅｎｇｌｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されるもの；Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｉｎ，Ｐ．Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８に開示されるもの；及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されるものが挙げられる。上記の内容は全て、参照により本明細書に組み入れられる。
特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、例えば、７−デアザプリン、５−メチルシトシン、又はＧ−クランプなどの親核酸塩基と構造がかなり類似する核酸塩基である。特定の実施形態では、核酸塩基模倣体は、例えば三環式フェノキサジン核酸塩基模倣体などのように、より複雑な構造を含む。上記の修飾核酸塩基の調製方法は、当業者に周知である。
核酸修飾（糖）
本明細書において提供される本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、修飾糖部分を有する、ヌクレオシド又はヌクレオチドを含む、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれ以上）のモノマーを含み得る。例えば、ヌクレオシドのフラノシル糖環は、限定されるものではないが、置換基の付加、２つの非ジェミナル環原子の架橋によるロックド核酸又は二環式核酸の形成を含むいくつかの方法で修飾され得る。特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、ＬＮＡである１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれ以上の）モノマーを含む。
ロックド核酸の一部の実施形態では、フラノシルの２’位は、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−Ｏ−、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−Ｎ（Ｒ１）−、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−Ｎ（Ｒ１）−Ｏ−、−［Ｃ（Ｒ１Ｒ２）］ｎ−Ｏ−Ｎ（Ｒ１）−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｃ（Ｒ２）−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ−Ｏ−、−Ｃ（＝ＮＲ１）−、−Ｃ（＝ＮＲ１）−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−、−Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒ１）２−、−Ｓ（＝Ｏ）ｘ−及び−Ｎ（Ｒ１）−から独立に選択されるリンカーによって４’位に連結され；
式中：
ｘは、０、１、又は２であり；
ｎは、１、２、３、又は４であり；
各Ｒ１及びＲ２は、独立に、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ２０アリール、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ５〜Ｃ７脂環式ラジカル、置換Ｃ５〜Ｃ７脂環式ラジカル、ハロゲン、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２−Ｊ１）、又はスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ１）であり；
各Ｊ１及びＪ２は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキル又は保護基である。
一部の実施形態では、ＬＮＡ化合物のリンカーのそれぞれは、独立に、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−Ｏ−、−Ｃ（Ｒ１Ｒ２）−Ｎ（Ｒ１）−Ｏ−又は−Ｃ（Ｒ１Ｒ２）−Ｏ−Ｎ（Ｒ１）−である。別の実施形態では、前記リンカーのそれぞれは、独立に、４’−ＣＨ２−２’、４’−（ＣＨ２）２−２’、４’−（ＣＨ２）３−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ１）−２’及び４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ１）−Ｏ−２’−であり、ここで、各Ｒ１は、独立に、Ｈ、保護基又はＣ１〜Ｃ１２アルキルである。
いくつかのＬＮＡは、特許文献並びに科学文献において調製及び開示されている（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６；Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２；国際公開第９４／１４２２６号パンフレット；国際公開第２００５／０２１５７０号パンフレット；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９；ＬＮＡを開示する交付済み米国特許及び公開出願の例としては、例えば、米国特許第７，０５３，２０７号明細書；同第６，２６８，４９０号明細書；同第６，７７０，７４８号明細書；同第６，７９４，４９９号明細書；同第７，０３４，１３３；及び６，５２５，１９１；及び米国特許出願公開第２００４−０１７１５７０号明細書；同第２００４−０２１９５６５号明細書；同第２００４−００１４９５９号明細書；同第２００３−０２０７８４１号明細書；同第２００４−０１４３１１４号明細書；及び同第２００３００８２８０７号明細書が挙げられる。
リボシル糖環の２’−ヒドロキシル基が、糖環の４’炭素原子に連結され、それによって、メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）結合を形成して、二環式糖部分を形成するＬＮＡも、本明細書において提供されている（Ｅｌａｙａｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｎｓ．Ｄｒｕｇｓ，２００１，２，５５８−５６１；Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００１，８ １−７；及びＯｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００１，３，２３９−２４３において概説され；米国特許第６，２６８，４９０号明細書及び同第６，６７０，４６１号明細書も参照されたい）。連結は、２’酸素原子及び４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）基であってもよく、メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡという語が、二環式部分に使用され；この位置にエチレン基がある場合、エチレンオキシ（４’−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡという語が使用される（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６：Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，１１，２２１１−２２２６）。メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ及び他の二環式糖類似体は、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡとの非常に高い二重鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０℃）、３’−エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性及び良好な溶解特性を示す。ＢＮＡを含む強力且つ非毒性アンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されている（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８）。
同様に説明されているメチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡの異性体は、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡであり、これは、３’−エキソヌクレアーゼに対する優れた安定性を有することが示されている。α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡは、アンチセンスギャップマー及びキメラに組み込まれて、これらは、強力なアンチセンス活性を示した（Ｆｒｉｅｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２１，６３６５−６３７２）。
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡモノマーアデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミン及びウラシルの合成及び調製は、それらのオリゴマー化、及び核酸認識特性と共に記載されている（Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０）。ＢＮＡ及びその調製も、国際公開第９８／３９３５２号パンフレット及び国際公開第９９／１４２２６号パンフレットに記載されている。
メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡの類似体、ホスホロチオエート−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ及び２’−チオ−ＬＮＡも調製されている（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２）。核酸ポリメラーゼの基質としてオリゴデオキシリボヌクレオチド二重鎖を含むロックドヌクレオシド類似体の調製も記載されている（Ｗｅｎｇｅｌらの国際公開第９９／１４２２６号パンフレット）。さらに、新規の配座固定された高親和性オリゴヌクレオチド類似体である、２’−アミノ−ＬＮＡの合成が、当分野において記載されている（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９）。さらに、２’−アミノ−及び２’−メチルアミノ−ＬＮＡが調製され、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ鎖とのそれらの二重鎖の熱安定性が既に報告されている。
修飾糖部分は、周知であり、その標的に対するアンチセンス化合物の親和性を改変する、典型的に増大する、及び／又はヌクレアーゼ耐性を増大するのに使用され得る。好ましい修飾糖の代表的なリストには、限定されるものではないが、メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ及びエチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’架橋）ＥＮＡを含む二環式修飾糖；置換された糖、特に、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３又は２’−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３置換基を有する２’−置換糖；及び４’−チオ修飾糖が含まれる。糖は、中でも特に、糖模擬基で置換することもできる。修飾糖の調製方法は、当業者に周知である。このような修飾糖の調製を教示するいくつかの代表的な特許及び刊行物としては、限定されるものではないが、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；同第５，１１８，８００号明細書；同第５，３１９，０８０号明細書；同第５，３５９，０４４号明細書；同第５，３９３，８７８号明細書；同第５，４４６，１３７号明細書；同第５，４６６，７８６号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５１９，１３４号明細書；同第５，５６７，８１１号明細書；同第５，５７６，４２７号明細書；同第５，５９１，７２２号明細書；同第５，５９７，９０９号明細書；同第５，６１０，３００号明細書；同第５，６２７，０５３号明細書；同第５，６３９，８７３号明細書；同第５，６４６，２６５号明細書；同第５，６５８，８７３号明細書；同第５，６７０，６３３号明細書；同第５，７９２，７４７号明細書；同第５，７００，９２０号明細書；同第６，５３１，５８４号明細書；及び同第６，６００，０３２号明細書；及び国際公開第２００５／１２１３７１号パンフレットが挙げられる。
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシ又はアリールオキシ（ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ、ｎ＝１〜５０；ヌクレオシドのフラノース部分が、フラノース環上の２つの炭素原子を連結する架橋を含み、それによって二環式環系を形成する「ロックド」核酸（ＬＮＡ）；Ｏ−ＡＭＩＮＥ又はＯ−（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ（ｎ＝１〜１０、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン又はポリアミノ）；及びＯ−ＣＨ２ＣＨ２（ＮＣＨ２ＣＨ２ＮＭｅ２）２が挙げられる。
「デオキシ」修飾としては、水素（即ち、一本鎖オーバーハングと特に関連するデオキシリボース糖）；ハロ（例えば、フルオロ）；アミノ（例えばＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、又はアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ）；−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖）；シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；チオアルキル；アルキル；シクロアルキル；アリール；アルケニル及びアルキニルが挙げられ、これらは、例えば、アミノ官能基で、任意選択で置換され得る。
他の好適な２’−修飾、例えば、修飾ＭＯＥが、参照によりその内容が本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２０１３０１３０３７８号明細書に記載されている。
２’位における修飾は、アラビノース立体配置に存在し得る。「アラビノース立体配置」という語は、アラビノースにおける２’−ＯＨと同じ立体配置でのリボースのＣ２’上の置換基の配置を指す。
糖は、糖の同じ炭素に２つの異なる修飾、例えば、ｇｅｍ修飾を含み得る。糖基は、リボースにおける対応する炭素の立体化学配置と反対の立体化学配置を有する１つ以上の炭素も含み得る。したがって、オリゴマー化合物は、例えば、糖としてアラビノースを含有する１つ以上のモノマーを含み得る。モノマーは、糖の１’位にα結合、例えば、α−ヌクレオシドを有し得る。モノマーはまた、４’位に反対の配置を有してもよく、例えば、Ｃ５’及びＨ４’又はそれらを置換する置換基が、相互に交換される。Ｃ５’及びＨ４’又はそれらを置換する置換基が、相互に交換される場合、糖は、４’位で修飾されているといわれる。
本明細書に開示される本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、脱塩基糖、即ち、Ｃ−１’に核酸塩基が欠如しているか又はＣ１’に核酸塩基の代わりに他の化学基を有する糖も含み得る。例えば、その全内容が本明細書に組み入れられる、米国特許第５，９９８，２０３号明細書を参照されたい。これらの脱塩基糖はまた、構成糖原子の１つ以上に修飾をさらに含み得る。本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、Ｌ異性体、例えばＬ−ヌクレオシドで１つ以上の糖も含み得る。糖基に対する修飾は、硫黄、任意選択で置換される窒素又はＣＨ２基による４’−Ｏの置換も含み得る。一部の実施形態では、Ｃ１’と核酸塩基との連結は、α立体配置にある。
糖修飾は、リボース炭素間のＣ−Ｃ結合（例えば、Ｃ１’−Ｃ２’、Ｃ２’−Ｃ３’、Ｃ３’−Ｃ４’、Ｃ４’−Ｏ４’、Ｃ１’−Ｏ４’）が存在しないか、及び／又はリボース炭素又は酸素（例えば、Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ３’、Ｃ４’又はＯ４’）の少なくとも１つが、独立に又は組み合わせで、ヌクレオチドに存在しない、非環状ヌクレオチドも含み得る。一部の実施形態では、非環状ヌクレオチドは、
Figure 2021522810
 であり、ここで、Ｂは、修飾又は非修飾核酸塩基であり、Ｒ１及びＲ２は、独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３、又はアルキルであり；Ｒ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖である）。
一部の実施形態では、糖修飾は、２’−Ｈ、２’−Ｏ−Ｍｅ（２’−Ｏ−メチル）、２’−Ｏ−ＭＯＥ（２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−Ｆ、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、２’−Ｓ−メチル、２’−Ｏ−ＣＨ２−（４’−Ｃ）（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−（４’−Ｃ）（ＥＮＡ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）及びアラビノース立体配置で２’−Ｏ−Ｍｅを有するｇｅｍ２’−ＯＭｅ／２’Ｆからなる群から選択される。
特定のヌクレオチドが、その２’位を介して次のヌクレオチドに連結される場合、本明細書に記載される糖修飾は、その特定のヌクレオチド、例えば、その２’位を介して連結されるヌクレオチドについて、糖の３’位に配置され得ることが理解されるべきである。３’位における修飾は、キシロース立体配置で存在し得る。「キシロース立体配置」という語は、キシロース糖における３’−ＯＨと同じ立体配置でのリボースのＣ３’上の置換基の配置を指す。
Ｃ４’及び／又はＣ１’に結合された水素は、直鎖又は分岐鎖の、任意選択で置換されるアルキル、任意選択で置換されるアルケニル、任意選択で置換されるアルキニルで置換され得、ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルの骨格は、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ’）、Ｃ（Ｏ）、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、ＣＨ（Ｚ’）、リン含有結合、任意選択で置換されるアリール、任意選択で置換されるヘテロアリール、任意選択で置換される複素環式又は任意選択で置換されるシクロアルキルの１つ以上を含有することができ、ここで、Ｒ’は、水素、アシル又は任意選択で置換される脂肪族であり、Ｚ’は、ＯＲ１１、ＣＯＲ１１、ＣＯ２Ｒ１１、
Figure 2021522810
 、ＮＲ２１Ｒ３１、ＣＯＮＲ２１Ｒ３１、ＣＯＮ（Ｈ）ＮＲ２１Ｒ３１、ＯＮＲ２１Ｒ３１、ＣＯＮ（Ｈ）Ｎ＝ＣＲ４１Ｒ５１、Ｎ（Ｒ２１）Ｃ（＝ＮＲ３１）ＮＲ２１Ｒ３１、Ｎ（Ｒ２１）Ｃ（Ｏ）ＮＲ２１Ｒ３１、Ｎ（Ｒ２１）Ｃ（Ｓ）ＮＲ２１Ｒ３１、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２１Ｒ３１、ＳＣ（Ｏ）ＮＲ２１Ｒ３１、Ｎ（Ｒ２１）Ｃ（Ｓ）ＯＲ１１、Ｎ（Ｒ２１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ１１、Ｎ（Ｒ２１）Ｃ（Ｏ）ＳＲ１１、Ｎ（Ｒ２１）Ｎ＝ＣＲ４１Ｒ５１、ＯＮ＝ＣＲ４１Ｒ５１、ＳＯ２Ｒ１１、ＳＯＲ１１、ＳＲ１１、及び置換又は非置換複素環式からなる群から選択され；Ｒ２１及びＲ３１は存在ごとに独立して、水素、アシル、非置換又は置換脂肪族、アリール、ヘテロアリール、複素環式、ＯＲ１１、ＣＯＲ１１、ＣＯ２Ｒ１１、又はＮＲ１１Ｒ１１’であり；又はＲ２１及びＲ３１は、それらが結合される原子と一緒になって、複素環を形成し；Ｒ４１及びＲ５１は存在ごとに独立して、水素、アシル、非置換又は置換脂肪族、アリール、ヘテロアリール、複素環式、ＯＲ１１、ＣＯＲ１１、又はＣＯ２Ｒ１１、又はＮＲ１１Ｒ１１’であり；Ｒ１１及びＲ１１’は、独立に、水素、脂肪族、置換脂肪族、アリール、ヘテロアリール、又は複素環式である。一部の実施形態では、５’末端ヌクレオチドのＣ４’に結合された水素は、置換されている。
一部の実施形態では、Ｃ４’及びＣ５’は一緒に、好ましくは、少なくとも１つの−ＰＸ（Ｙ）−を含む任意選択で置換される複素環式を形成し、ここで、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、ＯＭ、ＳＨ、任意選択で置換されるアルキル、任意選択で置換されるアルコキシ、任意選択で置換されるアルキルチオ、任意選択で置換されるアルキルアミノ又は任意選択で置換されるジアルキルアミノであり、ここで、Ｍは存在ごとに独立して、＋１の総電荷を有するアルキル金属又は遷移金属であり；Ｙは、Ｏ、Ｓ、又はＮＲ’であり、ここで、Ｒ’は、水素、任意選択で置換される脂肪族である。好ましくは、この修飾は、ｉＲＮＡの５末端にある。
特定の実施形態では、ＬＮＡは、式：
Figure 2021522810
 を有する二環式ヌクレオシドを含み、
式中：
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり；
Ｔ１は、Ｈ又はヒドロキシル保護基であり；
Ｔ２は、Ｈ、ヒドロキシル保護基又は反応性リン基であり；
Ｚは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アシル、置換アシル、又は置換アミドである。
一部の実施形態では、置換された基のそれぞれは、独立に、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２及びＣＮから独立に選択される任意選択で保護される置換基で一又は多置換され、ここで、各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＪ１である。
特定のこのような実施形態では、置換された基のそれぞれは、独立に、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、及びＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２ら独立に選択される置換基で一又は多置換され、ここで、各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、又は置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ又はＮＪ１である。
特定の実施形態では、Ｚ基は、１つ以上のＸｘで置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２又はＣＮであり；ここで、各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＪ１である。別の実施形態では、Ｚ基は、１つ以上のＸｘで置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシル、アルコキシ（例えば、ＣＨ３Ｏ−）、置換アルコキシ又はアジドである。
特定の実施形態では、Ｚ基は、−ＣＨ２Ｘｘであり、ここで、Ｘｘは、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２又はＣＮであり；ここで、各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＪ１である。別の実施形態では、Ｚ基は、−ＣＨ２Ｘｘであり、ここで、Ｘｘは、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシル、アルコキシ（例えば、ＣＨ３Ｏ−）又はアジドである。
特定のこのような実施形態では、Ｚ基は、（Ｒ）−配置：
Figure 2021522810
 にある。
特定のこのような実施形態では、Ｚ基は、（Ｓ）−配置：
Figure 2021522810
 にある。
特定の実施形態では、各Ｔ１及びＴ２は、ヒドロキシル保護基である。ヒドロキシル保護基の好ましいリストには、ベンジル、ベンゾイル、２，６−ジクロロベンジル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、メシレート、トシレート、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、９−フェニルキサンチン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）及び９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）が含まれる。特定の実施形態では、Ｔ１は、アセチル、ベンジル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル及びジメトキシトリチルから選択されるヒドロキシル保護基であり、ここで、より好ましいヒドロキシル保護基は、４，４’−ジメトキシトリチルであるＴ１である。
特定の実施形態では、Ｔ２は、反応性リン基であり、好ましい反応性リン基としては、ジイソプロピルシアノエトキシホスホラミダイト及びＨ−ホスホネートが挙げられる。特定の実施形態では、Ｔ１は、４，４’−ジメトキシトリチルであり、Ｔ２は、ジイソプロピルシアノエトキシホスホラミダイトである。
特定の実施形態では、本発明の化合物は、式：
Figure 2021522810
 又は式：
Figure 2021522810
 又は式：
Figure 2021522810
 の少なくとも１つのモノマーを含み、
式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり；
Ｔ３は、Ｈ、ヒドロキシル保護基、連結したコンジュゲート基、又はヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、モノマーサブユニット若しくはオリゴマー化合物に結合されたヌクレオシド間連結基であり；
Ｔ４は、Ｈ、ヒドロキシル保護基、連結したコンジュゲート基、又はヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、モノマーサブユニット若しくはオリゴマー化合物に結合されたヌクレオシド間連結基であり；
ここで、Ｔ３及びＴ４の少なくとも１つは、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、モノマーサブユニット若しくはオリゴマー化合物に結合されたヌクレオシド間連結基であり；
Ｚは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アシル、置換アシル、又は置換アミドである。
一部の実施形態では、置換された基のそれぞれは、独立に、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２及びＣＮから独立に選択される任意選択で保護される置換基で一又は多置換され、ここで、各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＪ１である。
一部の実施形態では、置換された基のそれぞれは、独立に、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、及びＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２から独立に選択される置換基で一又は多置換され、ここで、各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ又はＮＪ１である。
特定のこのような実施形態では、少なくとも１つのＺは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル又は置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。特定の実施形態では、各Ｚは、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキル又は置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。特定の実施形態では、少なくとも１つのＺは、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。特定の実施形態では、各Ｚは、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。特定の実施形態では、少なくとも１つのＺは、メチルである。特定の実施形態では、各Ｚは、メチルである。特定の実施形態では、少なくとも１つのＺは、エチルである。特定の実施形態では、各Ｚは、エチルである。特定の実施形態では、少なくとも１つのＺは、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。特定の実施形態では、各Ｚは、独立に、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。特定の実施形態では、少なくとも１つのＺは、置換メチルである。特定の実施形態では、各Ｚは、置換メチルである。特定の実施形態では、少なくとも１つのＺは、置換エチルである。特定の実施形態では、各Ｚは、置換エチルである。
特定の実施形態では、少なくとも１つの置換基は、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシである（例えば、少なくとも１つのＺは、１つ以上のＣ１〜Ｃ６アルコキシで置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルである）。別の実施形態では、各置換基は、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシである（例えば、各Ｚは、独立に、１つ以上のＣ１〜Ｃ６アルコキシで置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルである）。
特定の実施形態では、少なくとも１つのＣ１〜Ｃ６アルコキシ置換基は、ＣＨ３Ｏ−である（例えば、少なくとも１つのＺは、ＣＨ３ＯＣＨ２−である）。別の実施形態では、各Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ置換基は、ＣＨ３Ｏ−である（例えば、各Ｚは、ＣＨ３ＯＣＨ２−である）。
特定の実施形態では、少なくとも１つの置換基は、ハロゲンである（例えば、少なくとも１つのＺは、１つ以上のハロゲンで置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルである）。特定の実施形態では、各置換基は、独立に、ハロゲンである（例えば、各Ｚは、独立に、１つ以上のハロゲンで置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルである）。特定の実施形態では、少なくとも１つのハロゲン置換基は、フルオロである（例えば、少なくとも１つのＺは、ＣＨ２ＦＣＨ２−、ＣＨＦ２ＣＨ２−又はＣＦ３ＣＨ２−である）。特定の実施形態では、各ハロ置換基は、フルオロである（例えば、各Ｚは、独立に、ＣＨ２ＦＣＨ２−、ＣＨＦ２ＣＨ２−又はＣＦ３ＣＨ２−である）。
特定の実施形態では、少なくとも１つの置換基は、ヒドロキシルである（例えば、少なくとも１つのＺは、１つ以上のヒドロキシルで置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルである）。特定の実施形態では、各置換基は、独立に、ヒドロキシルである（例えば、各Ｚは、独立に、１つ以上のヒドロキシルで置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルである）。特定の実施形態では、少なくとも１つのＺは、ＨＯＣＨ２−である。別の実施形態では、各Ｚは、ＨＯＣＨ２−である。
特定の実施形態では、少なくとも１つのＺは、ＣＨ３−、ＣＨ３ＣＨ２−、ＣＨ２ＯＣＨ３−、ＣＨ２Ｆ−又はＨＯＣＨ２−である。特定の実施形態では、各Ｚは、独立に、ＣＨ３−、ＣＨ３ＣＨ２−、ＣＨ２ＯＣＨ３−、ＣＨ２Ｆ−又はＨＯＣＨ２−である。
特定の実施形態では、少なくとも１つのＺ基は、１つ以上のＸｘで置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２又はＣＮであり；ここで、各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＪ１である。別の実施形態では、少なくとも１つのＺ基は、１つ以上のＸｘで置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシル、アルコキシ（例えば、ＣＨ３Ｏ−）又はアジドである。
特定の実施形態では、各Ｚ基は、独立に、１つ以上のＸｘで置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２又はＣＮであり；ここで、各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＪ１である。別の実施形態では、各Ｚ基は、独立に、１つ以上のＸｘで置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシル、アルコキシ（例えば、ＣＨ３Ｏ−）又はアジドである。
特定の実施形態では、少なくとも１つのＺ基は、−ＣＨ２Ｘｘであり、ここで、Ｘｘは、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２又はＣＮであり；ここで、各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＪ１である。特定の実施形態では、少なくとも１つのＺ基は、−ＣＨ２Ｘｘであり、ここで、Ｘｘは、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシル、アルコキシ（例えば、ＣＨ３Ｏ−）又はアジドである。
特定の実施形態では、各Ｚ基は、独立に、−ＣＨ２Ｘｘであり、ここで、各Ｘｘは、独立に、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２又はＣＮであり；ここで、各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、独立に、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮＪ１である。別の実施形態では、各Ｚ基は、独立に、−ＣＨ２Ｘｘ、ここで、各Ｘｘは、独立に、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシル、アルコキシ（例えば、ＣＨ３Ｏ−）又はアジドである。
特定の実施形態では、少なくとも１つのＺは、ＣＨ３−である。別の実施形態では、各Ｚは、ＣＨ３−である。
特定の実施形態では、少なくとも１つのモノマーのＺ基は、式：
Figure 2021522810
 又は式：
Figure 2021522810
 又は式：
Figure 2021522810
 によって表される（Ｒ）−配置にある。
特定の実施形態では、式の各モノマーのＺ基は、（Ｒ）−配置にある。
特定の実施形態では、少なくとも１つのモノマーのＺ基は、式：
Figure 2021522810
 又は式：
Figure 2021522810
 又は式：
Figure 2021522810
 によって表される（Ｓ）−配置にある。
特定の実施形態では、式の各モノマーのＺ基は、（Ｓ）−配置にある。
特定の実施形態では、Ｔ３は、Ｈ又はヒドロキシル保護基である。特定の実施形態では、Ｔ４は、Ｈ又はヒドロキシル保護基である。さらなる実施形態では、Ｔ３は、ヌクレオシド、ヌクレオチド又はモノマーサブユニットに結合されるヌクレオシド間連結基である。特定の実施形態では、Ｔ４は、ヌクレオシド、ヌクレオチド又はモノマーサブユニットに結合されるヌクレオシド間連結基である。特定の実施形態では、Ｔ３は、オリゴヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドに結合されるヌクレオシド間連結基である。特定の実施形態では、Ｔ４は、オリゴヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドに結合されるヌクレオシド間連結基である。特定の実施形態では、Ｔ３は、オリゴマー化合物に結合されるヌクレオシド間連結基である。特定の実施形態では、Ｔ４は、オリゴマー化合物に結合されるヌクレオシド間連結基である。特定の実施形態では、Ｔ３及びＴ４の少なくとも１つは、ホスホジエステル又はホスホロチオエートから選択されるヌクレオシド間連結基を含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、式：
Figure 2021522810
 又は式：
Figure 2021522810
 又は式：
Figure 2021522810
 の少なくとも２つの連続したモノマーの少なくとも１つの領域を含む。
特定のこのような実施形態では、ＬＮＡとしては、限定されるものではないが、以下に示されるように、（Ａ）α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、（Ｂ）β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、（Ｃ）エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＬＮＡ及び（Ｅ）オキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＬＮＡが挙げられる。
Figure 2021522810
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、上の式の少なくとも２つの連続したモノマーの少なくとも２つの領域を含む。特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、ギャップモチーフを含む。特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、約８〜約１４の連続したβ−Ｄ−２’−デオキシリボフラノシルヌクレオシドの少なくとも１つの領域を含む。特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、約９〜約１２の連続したβ−Ｄ−２’−デオキシリボフラノシルヌクレオシドの少なくとも１つの領域を含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、式：
Figure 2021522810
 （式中、Ｂｘは、複素環式塩基部分である）
の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれ以上）の（Ｓ）−ｃＥｔモノマーを含む。
特定の実施形態では、モノマーは、糖模倣体を含む。特定のこのような実施形態では、模倣体が、糖又は糖−ヌクレオシド間結合組み合わせの代わりに使用され、核酸塩基は、選択された標的とのハイブリダイゼーションのために維持される。糖模倣体の代表例としては、限定されるものではないが、シクロヘキセニル又はモルホリノが挙げられる。糖−ヌクレオシド間結合組み合わせの模倣体の代表例としては、限定されるものではないが、非荷電アキラル結合によって連結されたペプチド核酸（ＰＮＡ）及びモルホリノ基が挙げられる。一部の例では、模倣体が、核酸塩基の代わりに使用される。代表的な核酸塩基模倣体は、当分野で周知であり、限定されるものではないが、三環式フェノキサジン類似体及びユニバーサル塩基（参照により本明細書に組み入れられる、Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２０００，２８：２９１１−１４）が挙げられる。糖、ヌクレオシド及び核酸塩基模倣体の合成方法は、当業者に周知である。
核酸修飾（糖間結合）
モノマー（限定されるものではないが、修飾及び非修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドを含む）を互いに連結し、それによってオリゴマー化合物、例えば、オリゴヌクレオチドを形成する連結基が、本明細書に記載される。このような連結基は、糖間結合とも呼ばれる。２つの主なクラスの連結基は、リン原子の存在又は非存在によって規定される。代表的なリン含有結合としては、限定されるものではないが、ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホラミデート、及びホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）が挙げられる。代表的な非リン含有連結基としては、限定されるものではないが、メチレンメチルイミノ（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−）、チオジエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−）、チオノカルバメート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）−Ｓ−）；シロキサン（−Ｏ−Ｓｉ（Ｈ）２−Ｏ−）；及びＮ，Ｎ’−ジメチルヒドラジン（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−）が挙げられる。天然ホスホジエステル結合と比較して、修飾された結合は、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を改変、典型的に増大するのに使用され得る。特定の実施形態では、キラル原子を有する結合は、別個の鏡像異性体として、ラセミ混合物として調製され得る。代表的なキラル結合としては、限定されるものではないが、アルキルホスホネート及びホスホロチオエートが挙げられる。リン含有及び非リン含有結合の調製方法は、当業者に周知である。
連結基中のリン酸基は、酸素の１つを異なる置換基で置換することによって修飾され得る。この修飾の１つの結果は、核酸分解に対するオリゴヌクレオチドの耐性増大であり得る。修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸塩、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキル又はアリールホスホネート及びホスホトリエステルが挙げられる。一部の実施形態では、連結における非架橋リン酸塩酸素原子の１つは、以下：Ｓ、Ｓｅ、ＢＲ３（Ｒは、水素、アルキル、アリールである）、Ｃ（即ち、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（Ｒは、水素、任意選択で置換されるアルキル、アリールである）、又はＯＲ（Ｒは、任意選択で置換されるアルキル又はアリールである）のいずれかで置換され得る。非修飾リン酸基中のリン原子は、アキラルである。しかしながら、上記の原子又は原子団の１つによる非架橋酸素の１つの置換は、リン原子をキラルにし；言い換えると、このように修飾されたリン酸基中のリン原子は、立体中心である。立体形成性リン原子は、「Ｒ」配置（本明細書では、Ｒｐ）又は「Ｓ」配置（本明細書では、Ｓｐ）のいずれかを有し得る。
ホスホロジチオエートは、硫黄によって置換された両方の非架橋酸素を有する。ホスホロジチオエート中のリン中心は、オリゴヌクレオチドジアステレオマーの形成を妨げるキラルである。したがって、理論に拘束されることを望むものではないが、両方の非架橋酸素に対する修飾は、不斉中心、例えばホスホロジチオエート形成をなくし、それらがジアステレオマー混合物を生成することができないことから、望ましい場合がある。したがって、非架橋酸素は、独立に、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、又はＯＲ（Ｒは、アルキル又はアリールである）のいずれか１つであり得る。
リン酸塩リンカーはまた、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）及び炭素（架橋メチレンホスホネート）による、架橋酸素、（即ち、リン酸塩をモノマーの糖に連結する酸素）の置換によって修飾され得る。この置換は、連結酸素のいずれか一方又は両方の連結酸素において起こり得る。架橋酸素が、ヌクレオシドの３’−酸素である場合、炭素による置換が好ましい。架橋酸素、ヌクレオシドの５’−酸素である場合、窒素による置換が好ましい。
リン酸塩に連結された酸素の少なくとも１つが置換されているか、又はリン酸基が非リン基によって置換されている修飾リン酸塩結合は、「非ホスホジエステル糖間結合」又は「非ホスホジエステルリンカー」とも呼ばれる。
特定の実施形態では、リン酸基は、非リン含有コネクター、例えばデホスホリンカーによって置換され得る。デホスホリンカーは、本明細書では、非ホスホジエステルリンカーと呼ばれる。理論に拘束されることを望むものではないが、荷電ホスホジエステル基が核酸分解の反応中心であるため、中性構造模倣体によるその置換が、向上したヌクレアーゼ安定性を付与するはずであると考えられる。やはり、理論に拘束されることを望むものではないが、一部の実施形態では、荷電リン酸基が中性部分によって置換される改変を導入することが望ましい場合がある。
リン酸基を置換し得る部分の例としては、限定されるものではないが、アミド（例えばアミド−３（３’−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−５’）及びアミド−４（３’−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−５’））、ヒドロキシルアミノ、シロキサン（ジアルキルシロキサン）、カルボキサミド、炭酸塩、カルボキシメチル、カルバメート、カルボン酸エステル、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、硫化物、スルホン酸塩、スルホンアミド、スルホン酸エステル、チオホルムアセタール（３’−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−５’）、ホルムアセタール（３’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−５’）、オキシム、メチレンイミノ、メチレンカルボニルアミノ、メチレンメチルイミノ（ＭＭＩ、３’−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−５’）、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノ、エーテル（Ｃ３’−Ｏ−Ｃ５’）、チオエーテル（Ｃ３’−Ｓ−Ｃ５’）、チオアセトアミド（Ｃ３’−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−Ｓ−Ｃ５’、Ｃ３’−Ｏ−Ｐ（Ｏ）−Ｏ−ＳＳ−Ｃ５’、Ｃ３’−ＣＨ２−ＮＨ−ＮＨ−Ｃ５’、３’−ＮＨＰ（Ｏ）（ＯＣＨ３）−Ｏ−５’及び３’−ＮＨＰ（Ｏ）（ＯＣＨ３）−Ｏ−５’及び混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成部分を含む非イオン性結合が挙げられる。例えば、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ ａｎｄ Ｐ．Ｄ．Ｃｏｏｋ Ｅｄｓ．ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０；Ｃｈａｐｔｅｒｓ ３及び４，（ｐｐ．４０−６５）を参照されたい。好ましい実施形態としては、メチレンメチルイミノ（ＭＭＩ）、メチレンカルボニルアミノ、アミド、カルバメート及びエチレンオキシドリンカーが挙げられる。
当業者は、特定の例では、非架橋酸素の置換が、隣接する２’−ＯＨによる糖間結合の切断の増強をもたらし得るため、多くの場合、非架橋酸素の修飾が、２’−ＯＨの修飾、例えば、隣接する糖間結合、例えば、アラビノース糖、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、ＬＮＡ及びＥＮＡの切断に関与しない修飾を必要とし得ることを十分に認識している。
好ましい非ホスホジエステル糖間結合は、ホスホロチオエート、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％ ９５％又はそれ以上の鏡像体過剰率のＳｐ異性体を含むホスホロチオエート、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％ ９５％又はそれ以上の鏡像体過剰率のＲｐ異性体を含むホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキル−ホスホネート（例えば、メチル−ホスホネート）、セレノホスフェート、ホスホラミデート（例えば、Ｎ−アルキルホスホラミデート）、及びボラノホスホネートを含む。
一部の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれ以上及び最大で全てを含む）の修飾又は非ホスホジエステル結合を含む。一部の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれ以上及び最大で全てを含む）のホスホロチオエート結合を含む。
リン酸塩リンカー及び糖がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド又はヌクレオチドサロゲートによって置換される、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤を構築することもできる。理論に拘束されることを望むものではないが、繰り返し荷電された骨格の非存在は、ポリアニオンを認識するタンパク質（例えばヌクレアーゼ）に対する結合を弱めると考えられる。やはり、理論に拘束されることを望むものではないが、一部の実施形態では、塩基が中性サロゲート骨格によって連結される改変を導入するのが望ましい場合がある。例としては、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、アミノエチルグリシルＰＮＡ（ａｅｇＰＮＡ）及び骨格伸張ピロリジンＰＮＡ（ｂｅｐＰＮＡ）ヌクレオシドサロゲートが挙げられる。好ましいサロゲートは、ＰＮＡサロゲートである。
本明細書に記載される本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、１つ以上の不斉中心を含むことができ、したがって、鏡像異性体、ジアステレオマー、及び絶対立体化学に関して、糖アノマーなどの場合、（Ｒ）若しくは（Ｓ）として、又はアミノ酸などの場合、（Ｄ）若しくは（Ｌ）として規定され得る他の立体異性体配置を生じる。本明細書において提供される本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤には、全てのこのような可能な異性体、並びにそれらのラセミ形態及び光学的に純粋な形態が含まれる。
核酸修飾（末端修飾
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の５’末端にリン酸塩又はリン酸塩模倣体をさらに含む。一実施形態では、リン酸塩模倣体は、５’−ビニルホスホネート（ＶＰ）である。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の５’末端は、５’−ビニルホスホネート（ＶＰ）を含まない。
本発明のｉＲＮＡ剤の末端は、修飾され得る。このような修飾は、一方の末端又は両方の末端にあり得る。例えば、ｉＲＮＡの３’及び／又は５’末端は、標識部分、例えば、フルオロフォア（例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３又はＣｙ５色素）又は保護基（例えば、硫黄、ケイ素、ホウ素若しくはエステル系）などの他の機能分子実体にコンジュゲートされ得る。機能分子実体は、リン酸基及び／又はリンカーを介して、糖に結合され得る。リンカーの末端原子は、リン酸基の連結原子又は糖のＣ−３’若しくはＣ−５’Ｏ、Ｎ、Ｓ若しくはＣ基に連結するか、又はそれを置換することができる。或いは、リンカーは、ヌクレオチドサロゲート（例えば、ＰＮＡ）の末端原子に連結するか、又はそれを置換することができる。
リンカー／リン酸塩−機能分子実体−リンカー／リン酸塩アレイが、二本鎖オリゴマー化合物の２つの鎖の間に配置される場合、このアレイは、ヘアピン型オリゴマー化合物中のヘアピンループの代わりになり得る。
活性を調節するのに有用な末端修飾は、リン酸塩又はリン酸塩類似体によるｉＲＮＡの５’末端の修飾を含む。特定の実施形態では、ｉＲＮＡの５’末端は、リン酸化されているか、又はホスホリル類似体を含む。例示的な５’−リン酸修飾としては、ＲＩＳＣ媒介性遺伝子サイレンシングに適合する修飾が挙げられる。５’末端における修飾はまた、対象の免疫系を刺激又は阻害するのに有用であり得る。一部の実施形態では、オリゴマー化合物の５’末端は、修飾
Figure 2021522810
 を含み、式中、Ｗ、Ｘ及びＹは、それぞれ、独立に、Ｏ、ＯＲ（Ｒは、水素、アルキル、アリールである）、Ｓ、Ｓｅ、ＢＲ３（Ｒは、水素、アルキル、アリールである）、ＢＨ３ −、Ｃ（即ち、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（Ｒは、水素、アルキル、アリールである）、又はＯＲ（Ｒは、水素、アルキル又はアリールである）からなる群から選択され；Ａ及びＺはそれぞれ、存在ごとに独立して、存在しないか、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、ＮＲ（Ｒは、水素、アルキル、アリールである）、又は任意選択で置換されるアルキレンであり、ここで、アルキレンの骨格は、内部に及び／又は末端に、Ｏ、Ｓ、ＳＳ及びＮＲ（Ｒは、水素、アルキル、アリールである）の１つ以上を含むことができ；ｎは、０〜２である。一部の実施形態では、ｎは、１又は２である。Ａは、糖の５’炭素に連結された酸素を置換することが理解される。ｎが０である場合、Ｗ及びＹは、それらが結合されるＰと一緒に、任意選択で置換される５〜８員複素環式を形成することができ、ここで、Ｗ及びＹは、それぞれ、独立に、Ｏ、Ｓ、ＮＲ’又はアルキレンである。好ましくは、複素環式は、アリール又はヘテロアリールで置換される。一部の実施形態では、５’末端ヌクレオチドのＣ５’上の一方又は両方の水素が、ハロゲン、例えば、Ｆで置換される。
例示的な５’−修飾としては、限定されるものではないが、５’−一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モノチオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−モノジチオリン酸（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；５’−α−チオ三リン酸；５’−β−チオ三リン酸；５’−γ−チオ三リン酸；５’−ホスホラミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）が挙げられる。他の５’−修飾としては、５’−アルキルホスホネート（Ｒ（ＯＨ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’、Ｒ＝アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど）、５’−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ（ＯＨ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’、Ｒ＝アルキルエーテル、例えば、メトキシメチル（ＣＨ２ＯＭｅ）、エトキシメチルなど）が挙げられる。他の例示的な５’−修飾としては、Ｚが、任意選択で少なくとも１回置換されるアルキルであるもの、例えば、（（ＨＯ）２（Ｘ）Ｐ−Ｏ［−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、（（ＨＯ）２（Ｘ）Ｐ−Ｏ［−（ＣＨ２）ａ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、（（ＨＯ）２（Ｘ）Ｐ−［−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’；ジアルキル末端リン酸塩及びリン酸塩模倣体：ＨＯ［−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、Ｈ２Ｎ［−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、Ｈ［−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、Ｍｅ２Ｎ［−（ＣＨ２）ａ−Ｏ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、ＨＯ［−（ＣＨ２）ａ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、Ｈ２Ｎ［−（ＣＨ２）ａ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、Ｈ［−（ＣＨ２）ａ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’、Ｍｅ２Ｎ［−（ＣＨ２）ａ−Ｐ（Ｘ）（ＯＨ）−Ｏ］ｂ−５’が挙げられ、ここで、ａ及びｂは、それぞれ、独立に、１〜１０である。他の実施形態は、ＢＨ３、ＢＨ３ −及び／又はＳｅによる酸素及び／又は硫黄の置換を含む。
末端修飾はまた、分布を監視するのに有用であり得、このような場合、付加されるのに好ましい基としては、フルオロフォア、例えば、フルオレセイン又はＡｌｅｘａ色素、例えば、Ａｌｅｘａ ４８８が挙げられる。末端修飾はまた、取り込みを促進するのに有用であり得、このための有用な修飾は、標的化リガンドを含む。末端修飾はまた、オリゴヌクレオチドを別の部分に架橋するのに有用であり得；このための有用な修飾は、マイトマイシンＣ、ソラレン、及びそれらの誘導体を含む。
熱不安定化修飾
ｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ剤などの、本発明の化合物は、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域（即ち、アンチセンス鎖の５’末端の２位〜８位）の反対側の部位でセンス鎖に熱不安定化修飾を導入してｉＲＮＡ二重鎖の解離または溶解の性質を強める（二重鎖の結合の自由エネルギーを減少させる）ことによってＲＮＡ干渉を最適化することができる。この修飾は、アンチセンス鎖のｓｅｅｄ領域における二重鎖の解離または溶解の性質を強めることができる。
熱不安定化修飾は、脱塩基修飾；対向する鎖における対向するヌクレオチドとのミスマッチ；および糖修飾、例えば、２’−デオキシ修飾または非環状ヌクレオチド、例えば、アンロック核酸（ＵＮＡ）またはグリセロール核酸（ＧＮＡ）を含み得る。
例示的な脱塩基修飾は、以下の通りである：
Figure 2021522810
例示的な糖修飾は、以下の通りである：
Figure 2021522810
「非環状ヌクレオチド」という語は、例えば、リボースの炭素（例えば、Ｃ１’−Ｃ２’、Ｃ２’−Ｃ３’、Ｃ３’−Ｃ４’、Ｃ４’−Ｏ４’、もしくはＣ１’−Ｏ４’）間の結合が全く存在しない、かつ／またはリボースの炭素若しくは酸素（例えば、Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ３’、Ｃ４’、もしくはＯ４’）の少なくとも１つが、単独でまたは組み合わせでヌクレオチドに存在しない非環状リボース糖を有する任意のヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、非環状ヌクレオチドは、以下の通りであり、
Figure 2021522810
 式中、Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基であり、Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３、またはアルキル；Ｒ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖である。「ＵＮＡ」という語は、糖の全ての結合が除去されてアンロック「糖」残基が形成されている、アンロック非環状核酸を指す。一例では、ＵＮＡは、Ｃ１’−Ｃ４’間の結合（即ち、Ｃ１’とＣ４’炭素間の炭素−酸素−炭素の共有結合）が除去された単量体も含む。別の例では、糖のＣ２’−Ｃ３’結合（即ち、Ｃ２’とＣ３’炭素間の炭素−炭素の共有結合）が除去される（参照によりそれぞれの全内容が本明細書に組み入れられる、Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６ （１７）：２０５９ （１９８５）；およびＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，１０：１０３９ （２００９）を参照されたい）。非環状誘導体は、ワトソン・クリック塩基対形成に影響を与えることなく、主鎖のより高い柔軟性を提供する。非環状ヌクレオチドは、２’−５’または３’−５’結合によって連結することができる。
「ＧＮＡ」という語は、ＤＮＡまたはＲＮＡに類似したポリマーであるが、ホスホジエステル結合によって連結された反復グリセロール単位からなるためその「主鎖」の組成が異なるグリコール核酸を指す：
Figure 2021522810
熱不安定化修飾は、熱不安定化ヌクレオチドとｄｓＲＮＡ二重鎖内の対向する鎖における対向するヌクレオチドとのミスマッチ（即ち、非相補的な塩基対）であり得る。例示的なミスマッチ塩基対としては、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、Ｕ：Ｔ、またはこれらの組み合わせが挙げられる。当分野で公知の他のミスマッチ塩基対合も本発明に適している。ミスマッチは、天然に存在するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドであるヌクレオチド間で起こり得る、即ち、ミスマッチ塩基対合は、ヌクレオチドのリボース糖における修飾とは無関係のそれぞれのヌクレオチドからの核酸塩基間で起こり得る。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ又はｉＲＮＡ剤などの、本発明の化合物は、２’−デオキシ核酸塩基である少なくとも１つの核酸塩基をミスマッチ対合中に含み；例えば、２’−デオキシ核酸塩基は、センス鎖中にある。
脱塩基ヌクレオチド、非環状ヌクレオチド修飾（ＵＮＡおよびＧＮＡを含む）、およびミスマッチ修飾のさらなる例は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる国際公開第２０１１／１３３８７６号パンフレットに詳細に記載されている。
熱不安定化修飾は、対向する塩基と水素結合を形成する能力が低下又は喪失したユニバーサル塩基、およびリン酸修飾を含み得る。
対抗する鎖における塩基と水素結合を形成する能力が低下した又は完全に喪失した核酸塩基修飾を、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる国際公開第２０１０／００１１８９５号パンフレットに記載されているｄｓＲＮＡ剤二重鎖の中心領域の不安定化について評価した。例示的な核酸塩基修飾は、次の通りである：
Figure 2021522810
天然のホスホジエステル結合と比較してｄｓＲＮＡ二重鎖の熱安定性を低下させることが知られている例示的なリン酸修飾は、次の通りである：
Figure 2021522810
一部の実施形態では、本発明の化合物は、２’−５’結合（２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅを伴う、且つＰ＝Ｏ又はＰ＝Ｓを伴う）を含み得る。例えば、２’−５’結合の修飾は、ヌクレアーゼ耐性を高めるため、若しくはセンス鎖のアンチセンス鎖への結合を阻害するために使用され得、又はＲＩＳＣによるセンス鎖の活性化を避けるためにセンス鎖の５’末端で使用され得る。
別の実施形態では、本発明の化合物は、Ｌ糖（例えば、Ｌリボース、２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅを含むＬ−アラビノース）を含み得る。例えば、これらのＬ糖修飾は、ヌクレアーゼ耐性を高めるため、若しくはセンス鎖のアンチセンス鎖への結合を阻害するために使用され得、又はＲＩＳＣによるセンス鎖の活性化を避けるためにセンス鎖の５’末端で使用され得る。
一実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤は、担体を介してリガンドにコンジュゲートし、この担体は、環状基または非環状基であり得；好ましくは、環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル、およびデカリンから選択され；好ましくは、非環状基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される本発明のｉＲＮＡ剤の少なくとも１つの鎖は、５’リン酸化されるか、又は５’末端にホスホリル類似体を含む。５’−リン酸修飾は、ＲＩＳＣ媒介性遺伝子サイレンシングに適合する修飾を含む。適切な修飾としては：５’−一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モノチオホスフェート（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−モノジチオホスフェート（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄置換一リン酸、二リン酸、および三リン酸（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸など）、５’−ホスホラミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、５’−アルケニルホスホネート（即ち、ビニル、置換ビニル）、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）の任意のさらなる組み合わせが挙げられる。
標的遺伝子
限定されるものではないが、ｓｉＲＮＡの標的遺伝子としては、限定されるものではないが、不要な細胞増殖を促進する遺伝子、増殖因子遺伝子、増殖因子受容体遺伝子、遺伝子発現キナーゼ、アダプタータンパク質遺伝子、Ｇプロテインスーパーファミリー分子をコードする遺伝子、転写因子をコードする遺伝子、血管新生を媒介する遺伝子、ウイルス遺伝子、ウイルス複製に必要な遺伝子、ウイルス機能を媒介する細胞遺伝子、細菌性病原体の遺伝子、アメーバ性病原体の遺伝子、寄生体病原体の遺伝子、真菌性病原体の遺伝子、不要な免疫応答を媒介する遺伝子、疼痛のプロセシングを媒介する、神経疾患を媒介する遺伝子、ヘテロ接合性喪失によって特徴付けられる細胞に見出される対立遺伝子、又は多型遺伝子の１つの対立遺伝子が挙げられる。
ｓｉＲＮＡの特定の例示的な標的遺伝子としては、限定されるものではないが、ＰＣＳＫ−９、ＡｐｏＣ３、ＡＴ３、ＡＧＴ、ＡＬＡＳ１、ＴＭＰＲ、ＨＡＯ１、ＡＧＴ、Ｃ５、ＣＣＲ−５、ＰＤＧＦ ｂｅｔ遺伝子；Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子；ＣＲＫ遺伝子；ＧＲＢ２遺伝子；ＲＡＳ遺伝子；ＭＥＫＫ遺伝子；ＪＮＫ遺伝子；ＲＡＦ遺伝子；Ｅｒｋ１／２遺伝子；ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子；ＭＹＢ遺伝子；ｃ−ＭＹＣ遺伝子；ＪＵＮ遺伝子；ＦＯＳ遺伝子；ＢＣＬ−２遺伝子；サイクリンＤ遺伝子；ＶＥＧＦ遺伝子；ＥＧＦＲ遺伝子；サイクリン遺伝子；サイクリンＥ遺伝子；ＷＮＴ−１遺伝子；β−カテニン遺伝子；ｃ−ＭＥＴ遺伝子；ＰＫＣ遺伝子；ＮＦＫＢ遺伝子；ＳＴＡＴ３遺伝子；サバイビン遺伝子；Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子；トポイソメラーゼＩ遺伝子；トポイソメラーゼＩＩ α遺伝子；ｐ７３遺伝子；ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子；ＰＰＭ１Ｄ遺伝子；カベオリンＩ遺伝子；ＭＩＢ Ｉ遺伝子；ＭＴＡＩ遺伝子；Ｍ６８遺伝子；腫瘍抑制遺伝子；ｐ５３遺伝子；ＤＮ−ｐ６３遺伝子；ｐＲｂ腫瘍抑制遺伝子；ＡＰＣ１腫瘍抑制遺伝子；ＢＲＣＡ１腫瘍抑制遺伝子；ＰＴＥＮ腫瘍抑制遺伝子；ＭＬＬ融合遺伝子、例えば、ＭＬＬ−ＡＦ９、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子；ＴＥＬ／ＡＭＬ１融合遺伝子；ＥＷＳ／ＦＬＩ１融合遺伝子；ＴＬＳ／ＦＵＳ１融合遺伝子；ＰＡＸ３／ＦＫＨＲ融合遺伝子；ＡＭＬ１／ＥＴＯ融合遺伝子；α ｖ−インテグリン遺伝子；Ｆｌｔ−１受容体遺伝子；チューブリン遺伝子；ヒトパピローマウイルス遺伝子、ヒトパピローマウイルス複製に必要な遺伝子、ヒト免疫不全ウイルス遺伝子、ヒト免疫不全ウイルス複製に必要な遺伝子、Ａ型肝炎ウイルス遺伝子、Ａ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、Ｄ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｄ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、Ｅ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｅ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、Ｆ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｆ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、Ｇ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｇ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、Ｈ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｈ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、呼吸器合胞体ウイルス遺伝子、呼吸器合胞体ウイルス複製に必要な遺伝子、単純ヘルペスウイルス遺伝子、単純ヘルペスウイルス複製に必要な遺伝子、ヘルペスサイトメガロウイルス遺伝子、ヘルペスサイトメガロウイルス複製に必要な遺伝子、ヘルペスエプスタインバーウイルス遺伝子、ヘルペスエプスタインバーウイルス複製に必要な遺伝子、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス遺伝子、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス複製に必要な遺伝子、ＪＣウイルス遺伝子、ＪＣウイルス複製に必要なヒト遺伝子、ミクソウイルス遺伝子、ミクソウイルス遺伝子複製に必要な遺伝子、ライノウイルス遺伝子、ライノウイルス複製に必要な遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コロナウイルス複製に必要な遺伝子、ウエストナイルウイルス遺伝子、ウエストナイルウイルス複製に必要な遺伝子、セントルイス脳炎遺伝子、セントルイス脳炎複製に必要な遺伝子、ダニ媒介性脳炎ウイルス遺伝子、ダニ媒介性脳炎ウイルス複製に必要な遺伝子、マリーバレー脳炎ウイルス遺伝子、マリーバレー脳炎ウイルス複製に必要な遺伝子、デングウイルス遺伝子、デングウイルス遺伝子複製に必要な遺伝子、シミアンウイルス４０遺伝子、シミアンウイルス４０複製に必要な遺伝子、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス遺伝子、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス複製に必要な遺伝子、モロニー−マウス白血病ウイルス遺伝子、モロニー−マウス白血病ウイルス複製に必要な遺伝子、脳心筋炎ウイルス遺伝子、脳心筋炎ウイルス複製に必要な遺伝子、麻疹ウイルス遺伝子、麻疹ウイルス複製に必要な遺伝子、水痘・帯状疱疹ウイルス遺伝子、水痘・帯状疱疹ウイルス複製に必要な遺伝子、アデノウイルス遺伝子、アデノウイルス複製に必要な遺伝子、黄熱病ウイルス遺伝子、黄熱病ウイルス複製に必要な遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ポリオウイルス複製に必要な遺伝子、ポックスウイルス遺伝子、ポックスウイルス複製に必要な遺伝子、プラスモジウム（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）遺伝子、プラスモジウム（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）遺伝子複製に必要な遺伝子、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）遺伝子、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）複製に必要な遺伝子、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）遺伝子、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複製に必要な遺伝子、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）遺伝子、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）複製に必要な遺伝子、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）遺伝子、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）複製に必要な遺伝子、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）遺伝子、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）複製に必要な遺伝子、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）遺伝子、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）複製に必要な遺伝子、クラミジア肺炎菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）遺伝子、クラミジア肺炎菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）複製に必要な遺伝子、マイコプラズマ肺炎菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）遺伝子、マイコプラズマ肺炎菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）複製に必要な遺伝子、インテグリン遺伝子、セレクチン遺伝子、補体系遺伝子、ケモカイン遺伝子、ケモカイン受容体遺伝子、ＧＣＳＦ遺伝子、Ｇｒｏ１遺伝子、Ｇｒｏ２遺伝子、Ｇｒｏ３遺伝子、ＰＦ４遺伝子、ＭＩＧ遺伝子、前血小板塩基性タンパク質遺伝子、ＭＩＰ−１Ｉ遺伝子、ＭＩＰ−１Ｊ遺伝子、ＲＡＮＴＥＳ遺伝子、ＭＣＰ−１遺伝子、ＭＣＰ−２遺伝子、ＭＣＰ−３遺伝子、ＣＭＢＫＲ１遺伝子、ＣＭＢＫＲ２遺伝子、ＣＭＢＫＲ３遺伝子、ＣＭＢＫＲ５ｖ、ＡＩＦ−１遺伝子、Ｉ−３０９遺伝子、イオンチャネルの構成要素の遺伝子、神経伝達物質受容体の遺伝子、神経伝達物質リガンドの遺伝子、アミロイドファミリー遺伝子、プレセニリン遺伝子、ＨＤ遺伝子、ＤＲＰＬ遺伝子、ＳＣＡ１遺伝子、ＳＣＡ２遺伝子、ＭＪＤ１遺伝子、ＣＡＣＮＬ１Ａ４遺伝子、ＳＣＡ７遺伝子、ＳＣＡ８遺伝子、ヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）細胞に見出される対立遺伝子、多型遺伝子の１つの対立遺伝子及びそれらの組み合わせが挙げられる。
ヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）は、ＬＯＨの領域に、配列、例えば、遺伝子へのヘミ接合をもたらし得る。これは、正常細胞と疾患状態の細胞、例えば、癌細胞との間に有意な遺伝的差異が生じさせ得、正常細胞と疾患状態の細胞、例えば、癌細胞との間の有用な差異を提供する。この差異は、遺伝子又は他の配列が、二倍体細胞においてヘテロ接合性であるが、ＬＯＨを有する細胞ではヘミ接合性であるため、起こり得る。ＬＯＨの領域は、多くの場合、喪失によって不要な増殖を促進する遺伝子、例えば、腫瘍抑制遺伝子、及び例えば、他の遺伝子、一部の例では、正常な機能、例えば、成長に不可欠な遺伝子を含む他の配列を含む。本発明の方法は、部分的に、本発明の組成物による必須遺伝子の１つの対立遺伝子の特異的な調節に依拠するものである。
特定の実施形態では、本発明は、マイクロＲＮＡを調節する本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤を提供する。
中枢神経系のターゲティング
一部の実施形態では、本発明は、早期発症型家族性アルツハイマー病のためにＡＰＰ、脊髄小脳失調２及びＡＬＳのためにＡＴＸＮ２、並びに筋萎縮性側索硬化症及び前頭側頭認知症のためにＣ９ｏｒｆ７２を標的とする二本鎖ｉＲＮＡ剤を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ＡＬＳのためにＴＡＲＤＢＰ、前頭側頭認知症のためにＭＡＰＴ（タウ）、及びハンチントン病のためにＨＴＴを標的とする二本鎖ｉＲＮＡ剤を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、パーキンソン病のためにＳＮＣＡ、ＡＬＳのためにＦＵＳ、脊髄小脳失調３のためにＡＴＸＮ３、ＳＣＡ１のためにＡＴＸＮ１、ＳＣＡ７及びＳＣＡ８のために遺伝子、ＤＲＰＬＡのためにＡＴＮ１、ＸＬＭＲのためにＭｅＣＰ２、プリオン病、劣性中枢神経系疾患：ラフォラ病のためにＰＲＮＰ、ＤＭ１のためにＤＭＰＫ（中枢神経系及び骨格筋）、及びｈＡＴＴＲのためにＴＴＲ（中枢神経系、眼内及び全身）を標的とする二本鎖ｉＲＮＡ剤を提供する。
脊髄小脳失調は、遺伝性脳機能障害である。ＳＣＡ１−８などの優性遺伝型の脊髄小脳失調は、疾患修飾治療のない重篤な疾患である。例示的な標的としては、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、及びＳＣＡ１が挙げられる。
ＳＣＡ２のためのＡＴＸＮ２のターゲティング
進行性失調症である脊髄小脳失調２（ＳＣＡ２）は、２番目に多いＳＣＡである。この標的に関連する別の疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。これらの疾患は、疾患修飾治療のない、消耗性の、最終的には致死性の疾患である。ＳＣＡの有病率は、１００，０００人当たり２〜６人であり；ＡＴＸＮ２は、世界のＳＣＡ人口の１５％及び一部の国、特にキューバ（１００，０００人当たり４０人）でははるかに多いＳＣＡ人口を引き起こす。ヒト分子遺伝学によるＡＴＸＮ２のターゲティングが優良であり得、例えば、ＡＴＸＮ２におけるコードＣＡＧリピート伸長が、家族性及び孤発性ＳＣＡ及びＡＬＳで、脊髄、脳幹、又は小脳などの組織において発見された。このターゲティングのメカニズムは、ＡＴＸＮ２の常染色体優性コードＣＡＧ伸長が、有害なミスフォールドタンパク質の発現及びプルキンエ細胞及び神経細胞死を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡの７０％のノックダウン（ＫＤ）によって示され；ｍＡＴＸＮ２マウスＫＤ ＰＯＣが実証された。安全性に関して、ｍＡＴＸＮ２ノックアウト（ＫＯ）マウスは、健常であると報告された。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ＣＡＧ ｍＲＮＡ及びペプチドリピートタンパク質が挙げられる。
ＳＣＡ３のためのＡＴＸＮ３のターゲティング
進行性失調症である脊髄小脳失調３（ＳＣＡ３）は、世界で最も多いＳＣＡである。この疾患は、疾患修飾治療のない、消耗性の、最終的に致死性の疾患である。それは、ＳＣＡの最も多い原因であり、ＳＣＡの有病率は、１００，０００人当たり２〜６人であり；ＡＴＸＮ３は、米国のＳＣＡ人口の２１％を引き起こし、欧州、特にポルトガルではるかに多い。ヒト分子遺伝学によるＡＴＸＮ３のターゲティングが優良であり得、例えば、ＡＴＸＮ３におけるコードＣＡＧリピート伸長が、家族性及び孤発性ＳＣＡで、脊髄、脳幹、又は小脳などの組織において発見された。このターゲティングのメカニズムは、ＡＴＸＮ３の常染色体優性コードＣＡＧ伸長が、有害なミスフォールドタンパク質の発現、プルキンエ細胞及び神経細胞死を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、ＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡの７０％のＫＤによって示され；ｍＡＴＸＮ３ ＫＤマウスＰＯＣが実証された。安全性に関して、ｍＡＴＸＮ３ ＫＯマウスは、健常であると報告された。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ＣＡＧ ｍＲＮＡ及びペプチドリピートタンパク質が挙げられる。
ＳＣＡ１のためのＡＴＸＮ１のターゲティング
進行性失調症である脊髄小脳失調１（ＳＣＡ１）は、１９９３年に発見された最初のＳＣＡ遺伝子である。この疾患は、疾患修飾治療のない、消耗性の、最終的に致死性の疾患である。ＳＣＡの有病率は、１００，０００人当たり２〜６人であり；ＡＴＸＮ１は、米国及び世界のＳＣＡ人口の６％を引き起こし、一部の国（日本では２５％）、特にポーランド（６４％）及びシベリア（１００％）でははるかに多い。ヒト分子遺伝学によるＡＴＸＮ１のターゲティングが優良であり得、例えば、ＡＴＸＮ１におけるコードＣＡＧリピート伸長が、家族性及び孤発性ＳＣＡで、脊髄、脳幹、又は小脳などの組織において発見された。このターゲティングのメカニズムは、ＡＴＸＮ１の常染色体優性コードＣＡＧ伸長が、有害なミスフォールドタンパク質の発現、プルキンエ細胞及び神経細胞死を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、ＡＴＸＮ１ ｍＲＮＡの７０％のＫＤによって示され；ｍＡＴＸＮ１マウスＰＯＣが実証された。安全性に関して、ｍＡＴＸＮ１ ＫＯマウスは、健常であると報告された。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ＣＡＧ ｍＲＮＡ及びペプチドリピートタンパク質が挙げられる。
ＳＣＡ７のためのＡＴＸＮ７のターゲティング
脊髄小脳失調７（ＳＣＡ７）は、進行性失調症及び網膜変性を引き起こす。この疾患は、疾患修飾治療のない、消耗性の、最終的に致死性の網膜及び小脳疾患である。ＳＣＡの有病率は、１００，０００人当たり２〜６人であり；ＡＴＸＮ７は、世界のＳＣＡ人口の５％を引き起こし、一部の国、特に南アフリカでははるかに多い。ヒト分子遺伝学によるＡＴＸＮ７のターゲティングが優良であり得、例えば、ＡＴＸＮ７におけるコードＣＡＧリピート伸長が、家族性及び孤発性ＳＣＡで、脊髄、脳幹、小脳、又は網膜などの組織において発見された。このターゲティングのメカニズムは、ＡＴＸＮ１の常染色体優性コードＣＡＧ伸長が、有害なミスフォールドタンパク質の発現、原因となる錐体杆体変性、プルキンエ細胞及び神経細胞致死を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、、髄腔内（ＩＴ）及び硝子体内（ＩＶＴ）投与による、ＡＴＸＮ１ ｍＲＮＡの７０％のＫＤによって示された。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ＣＡＧ ｍＲＮＡ及びペプチドリピートタンパク質が挙げられる。
ＳＣＡ８のためのＡＴＸＮ８のターゲティング
脊髄小脳失調８（ＳＣＡ８）、進行性神経変性失調は、ＡＴＸＮ８におけるＣＴＧリピート伸長によって引き起こされる。この疾患は、疾患修飾治療のない、消耗性の、最終的に致死性の疾患である。有病率：ＳＣＡは、１００，０００人当たり２〜６人であり；ＡＴＸＮ８は、世界のＳＣＡ人口の３％を引き起こし、一部の国、特にフィンランドでははるかに多い。ヒト分子遺伝学によるＡＴＸＮ８のターゲティングが優良であり得、例えば、ＡＴＸＮ８におけるコードＣＴＧリピート伸長が、家族性及び孤発性ＳＣＡで、脊髄、脳幹、又は小脳などの組織において発見された。このターゲティングのメカニズムは、ＡＴＸＮ８の常染色体優性コードＣＴＧ伸長が、有害なミスフォールドタンパク質の発現、原因となるプルキンエ細胞及び神経細胞致死を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、ＡＴＸＮ８ ｍＲＮＡの７０％のＫＤによって示された。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ＣＴＧ ｍＲＮＡ及びペプチドリピートタンパク質が挙げられる。
ＳＣＡ６のためのＣＡＣＮＡ１Ａのターゲティング
脊髄小脳失調６（ＳＣＡ６）は、進行性失調症である。この疾患は、疾患修飾治療のない、消耗性の、最終的に致死性の疾患である。ＳＣＡの有病率は、１００，０００人当たり２〜６人であり；ＣＡＣＮＡ１Ａは、世界のＳＣＡ人口の１５％を引き起こす。ヒト分子遺伝学によるＣＡＣＮＡ１Ａのターゲティングが優良であり得、例えば、ＣＡＣＮＡ１ＡにおけるコードＣＡＧリピート伸長が、家族性及び孤発性ＳＣＡで、脊髄、脳幹、又は小脳などの組織において発見された。このターゲティングのメカニズムは、ＣＡＣＮＡ１Ａの常染色体優性コードＣＡＧ伸長が、有害なミスフォールドタンパク質の発現及びプルキンエ細胞及び神経細胞死を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、ＣＡＣＮＡ１Ａ ＣＡＧ伸長の７０％のＫＤによって示された。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ＣＡＧ ｍＲＮＡ及びペプチドリピートタンパク質が挙げられる。
遺伝性ポリグルタミン障害の例示的な標的は、ハンチントン病（ＨＤ）を含む。
ハンチントン病のためのＨＴＴのターゲティング
ハンチントン病突然変異は、進行性中枢神経系変性疾患であるＨＤを引き起こす。この疾患は、疾患修飾治療のない、消耗性の、最終的に致死性の疾患である。ＨＤの有病率は、世界的に１００，０００人当たり５〜１０人であり、いくつかの国、特にベネズエラでははるかに多い。ヒト分子遺伝学によるＨＴＴのターゲティングが優良であり得、例えば、ＨＴＴにおけるコードＣＡＧリピート伸長が、家族性及び孤発性ＨＤで、線条体、又は大脳皮質などの組織において発見された。このターゲティングのメカニズムは、ＨＴＴの常染色体優性コードＣＡＧ伸長が、有害なミスフォールドタンパク質の発現及び神経細胞死を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、ＨＴＴ ＣＡＧ伸長のみの７０％のＫＤによって示され；マウスＰＯＣが実証された。安全性に関して、マウスにおけるＨＴＴのＫＯは、致死的であり得；ヒトにおけるＫＤが実証された。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ｍＲＮＡ及びペプチドリピートタンパク質が挙げられる。
ＤＲＰＬＡのためのＡＴＮ１のターゲティング
アトロフィン１突然変異は、ＨＤと類似の進行性脊髄小脳疾患である、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）を引き起こす。この疾患は、疾患修飾治療のない、消耗性の、最終的に致死性の疾患である。ＤＲＰＬＡの有病率は、日本で１，０００，０００人当たり２〜７人である。ヒト分子遺伝学によるＡＴＮ１のターゲティングが優良であり得、例えば、ＡＴＮ１におけるコードＣＡＧリピート伸長が、家族性及び孤発性ＳＣＡで、脊髄、脳幹、小脳、又は大脳皮質などの組織において発見された。このターゲティングのメカニズムは、ＡＴＮ１の常染色体優性コードＣＡＧ伸長が、有害なミスフォールドタンパク質の発現及び神経細胞死を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、ＡＴＮ１の７０％のＫＤによって示された。安全性に関して、ＡＴＮ１ ＫＯマウスは、健常であると報告された。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ＣＡＧ ｍＲＮＡ及びペプチドリピートタンパク質が挙げられる。
球脊髄性筋萎縮症のためのＡＲのターゲティング
アンドロゲン受容体突然変異は、進行性筋肉消耗疾患である球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ、ケネディ病）、及び他の疾患を引き起こす。この疾患は、疾患修飾治療のない、消耗性の、最終的に致死性の疾患である。ＳＢＭＡの有病率は、男性１００，０００人当たり２人であり；女性は、軽度の表現型を有する。ヒト分子遺伝学によるＡＲのターゲティングが優良であり得、例えば、ＡＲにおけるコードＣＡＧリピート伸長が、家族性ＳＢＭＡで、脊髄、又は脳幹などの組織において発見された。このターゲティングのメカニズムは、ＡＲのＸ連鎖コードＣＡＧ伸長が、有害な機能獲得及び運動ニューロン致死を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、ＡＲの７０％のＫＤによって示された。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ＣＡＧ ｍＲＮＡ及びペプチドリピートタンパク質が挙げられる。
フリードライヒ運動失調症のためのＦＸＮのターゲティング
ＦＸＮの劣性機能喪失型ＧＡＡ伸長は、進行性変性運動失調であるフリードライヒ運動失調症（ＦＡ）を引き起こす。この疾患は、疾患修飾治療のない、消耗性の、最終的に致死性の疾患である。ＦＡの有病率は、世界的に１００，０００人当たり２人である。ヒト分子遺伝学によるＦＸＮのターゲティングが優良であり得、例えば、ＦＸＮにおけるイントロンＧＡＡリピート伸長が、家族性ＦＡで、脊髄、小脳、又はおそらく網膜及び心臓などの組織において発見された。このターゲティングのメカニズムは、ＦＸＮの常染色体劣性非コードＦＡＡ伸長が、重要なミトコンドリアタンパク質であるＦＸＮの発現の低下を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、ＦＸＮイントロンＧＡＳ伸長の７０％のＫＤによって示された。安全性に関して、イントロンＧＡＡのＫＤは、マウスにおいて、安全で且つ有効である。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ｍＲＮＡ及びペプチドリピートタンパク質が挙げられる。
ＦＸＴＡＳのためのＦＭＲ１のターゲティング
成人の運動失調及び認知障害の進行性疾患である脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）は、ＦＭＲ１過剰発現によって引き起こされる。この疾患は、疾患修飾治療のない、重篤な疾患である。ＦＭＲ１前突然変異の有病率は、男性５００人当たり１人である。ヒト分子遺伝学によるＦＭＲ１のターゲティングが優良であり得、例えば、ＦＭＲ１におけるコードＣＣＧリピート伸長前突然変異が、ＦＸＴＡＳで、脊髄、小脳、又は大脳皮質などの組織において発見された。このターゲティングのメカニズムは、ＦＭＲ１のＸ連鎖コードＣＣＧ伸長が、毒性ｍＲＮＡを引き起こすことによるものであり得る。有効性は、毒性ｍＲＮＡの７０％のＫＤによって示された。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ｍＲＮＡ及びペプチドリピートタンパク質が挙げられる。
脆弱性Ｘ症候群のためのＦＭＲ１の上流のターゲティング
精神遅滞の進行性疾患である脆弱性Ｘ症候群（ＦＲＡＸＡ）は、ＦＭＲ１の上流ｍＲＮＡを標的にすることによって治療され得る。この疾患は、疾患修飾治療のない、消耗性の疾患である。ＦＲＡＸＡの有病率は、男性４，０００人当たり１人及び女性８，０００人当たり１人である。ヒト分子遺伝学によるＦＭＲ１のターゲティングが優良であり得、例えば、ＦＭＲ１におけるコードＣＣＧリピート伸長が、ＦＲＡＸＡで、中枢神経系などの組織において発見された。このターゲティングのメカニズムは、ＦＭＲ１のＸ連鎖コードＣＣＧ伸長が、ＬＯＦを引き起こすことによるものであり得；正常なＦＭＲ１は、特異的ｍＲＮＡを核から輸送するように機能する。有効性は、毒性ｍＲＮＡの７０％のＫＤによって示された。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ｍＲＮＡ及びペプチドリピートタンパク質が挙げられる。
優性遺伝性筋萎縮性側索硬化症は、疾患修飾治療のない重篤な疾患である。例示的な標的は、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＡＴＸＮ２（ＳＣＡ２も引き起こす）、及びＭＡＰＴを含む。
ＡＬＳのためのＣ９ｏｒｆ７２のターゲティング
Ｃ９ｏｒｆ７２は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び前頭側頭認知症（ＦＴＤ）の最も多い原因である。これらの疾患は、疾患修飾治療のない、運動ニューロンの致死性疾患である。ＡＬＳの有病率は、１００，０００人当たり２〜５人であり（１０％は家族性である）；Ｃ９ｏｒｆ７２は、米国及び欧州の家族性ＡＬＳの３９％及び孤発性ＡＬＳの７％を引き起こす。ヒト分子遺伝学によるＣ９ｏｒｆ７２のターゲティングが優良であり得、例えば、ヘキサヌクレオチド伸長が、家族性及び孤発性ＡＬＳで、上位及び下位運動ニューロン（ＡＬＳについて）；又は大脳皮質（ＦＴＤについて）などの組織において発見された。このターゲティングのメカニズムは、常染色体優性ヘキサヌクレオチド伸長が、毒性のジペプチドリピートタンパク質のリピート関連非ＡＵＧ依存性翻訳及び神経細胞致死を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、Ｃ９ｏｒｆ７２の７０％のＫＤによって示された。安全性に関して、Ｃ９ｏｒｆ７２のへテロ接合ＬＯＦ突然変異は、ヒト及びマウスにおいて安全であるようである。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦヘキサヌクレオチドリピートｍＲＮＡ及びジペプチドリピートタンパク質が挙げられる。
ＡＬＳのためのＴＡＲＤＢＰのターゲティング
ＴＡＲＤＢＰ突然変異は、ＡＬＳ及び前頭側頭認知症（ＦＴＤ）を引き起こす。これらの疾患は、疾患修飾治療のない、運動ニューロンの致死性疾患である。ＡＬＳの有病率は、１００，０００人当たり２〜５人であり（１０％は家族性である）；ＴＡＲＤＢＰは、家族性ＡＬＳの５％及び孤発性ＡＬＳの１．５％を引き起こす。ヒト分子遺伝学によるＴＡＲＤＢＰのターゲティングが優良であり得、例えば、突然変異が、家族性及び孤発性ＡＬＳで、上位及び下位運動ニューロン（ＡＬＳについて）；又は大脳皮質（ＦＴＤについて）などの組織において発見された。このターゲティングのメカニズムは、常染色体優性ＴＲＤＢＰ突然変異が、有害なＴＲＤＢＰタンパク質及び神経細胞致死を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、ＴＡＲＤＢＰ変異対立遺伝子の７０％のＫＤによって示された。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦタンパク質が挙げられる。
ＡＬＳのためのＦＵＳのターゲティング
ＦＵＳ突然変異は、ＡＬＳ及びＦＴＤを引き起こす。これらの疾患は、疾患修飾治療のない、運動ニューロンの致死性疾患である。ＡＬＳの有病率は、１００，０００人当たり２〜５であり（１０％は家族性である）；ＦＵＳは、家族性ＡＬＳの５％を引き起こし；ＦＵＳ封入体が、多くの場合、孤発性ＡＬＳにおいて見られる。ヒト分子遺伝学によるＦＵＳのターゲティングが優良であり得、例えば、突然変異が、家族性ＡＬＳで、ＡＬＳについて上位及び下位運動ニューロンなどの組織において発見された。このターゲティングのメカニズムは、常染色体優性ＦＵＳ突然変異は、異常なタンパク質フォールディング及び神経細胞致死を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、ＦＵＳ変異対立遺伝子の７０％のＫＤによって示された。安全性に関して、ＫＯマウスは、悶え反応を示すが生存し、ＡＤＨＤ表現型を有する。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦタンパク質が挙げられる。
ＡＬＳのためのＳＯＤ１のターゲティング
ＳＯＤ１の優性及び劣性突然変異は、ＡＬＳを引き起こす。この疾患は、疾患修飾治療のない、運動ニューロンの致死性疾患である。ＡＬＳの有病率は、１００，０００人当たり２〜５人であり（１０％は家族性である）；ＳＯＤ１は、家族性ＡＬＳの５〜２０％を引き起こす。ヒト分子遺伝学によるＳＯＤ１のターゲティングが優良であり得、例えば、多くのＳＯＤ１突然変異が、ＡＬＳについて上位及び下位運動ニューロンなどの組織において、家族性のＡＤ及びＡＲ ＡＬＳと関連している。このターゲティングの有効性は、突然変異特異的ＫＤを必要とし得る。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。バイオマーカーは、突然変異特異的であり得る。
優性遺伝性前頭側頭認知症及び進行性核上性まひ。標的は、ＭＡＰＴを含むが、これは、ＭＡＰＴが、ＡＤ、又はＣ９ｏｒｆ７２にとって重要であり得るためである。
ＦＴＤ−１７及びＰＳＰのための微小管結合タンパク質タウのターゲティング
１７番染色体に連鎖する家族性ＦＴＤである家族性前頭側頭認知症１７（ＦＴＤ−１７）、及び家族性進行性核上性まひは、ＭＡＰＴ突然変異によって引き起こされ得、ＭＡＰＴ突然変異は、珍しい型の進行性核上性まひ、大脳皮質基底核変性症、呼吸不全を伴うタウオパチー、発作を伴う認知症も引き起こし得る。これらの疾患は、疾患修飾治療のない、致死性の神経変性疾患である。ＦＴＤの有病率は、１００，０００人当たり１５〜２２であり；オランダにおけるＦＴＤ−１７の有病率は、人口１，０００，０００人当たり１人である。ヒト分子遺伝学によるＭＡＰＴのターゲティングが優良であり得、例えば、ＭＡＰＴのＧＯＦ点及びスプライス部位突然変異が、家族性及び孤発性ＦＴＤで、前頭葉又は側頭葉などの組織において発見された。このターゲティングのメカニズムは、ＭＡＰＴの常染色体優性ＧＯＦ突然変異が、有害なタウペプチド及び神経細胞死を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、ＭＡＰＴの７０％のＫＤによって示された。安全性に関して、ＭＡＰＴ ＫＯマウスは、健常であると報告された。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦタウｍＲＮＡ及びタンパク質が挙げられる。
ＦＴＤ及びＡＬＳのためのセクエストソーム１のターゲティング
孤発性ＦＴＤ／ＡＬＳは、優性ＳＱＳＴＭ１突然変異と関連している。この疾患は、疾患修飾治療のない、致死性の神経変性疾患である。これは、極めて希少な疾患である。ヒト分子の遺伝的関連によるセクエストソーム１のターゲティングは、孤発性の症例で、前頭葉及び側頭葉、又は小脳及び脊髄などの組織において、合理的である。可能性のある診断は、遺伝子検査；早期症状を含む。
優性遺伝性パーキンソン病は、疾患修飾治療のない重篤な疾患である。標的は、ＳＮＣＡを含む。
パーキンソン病のためのＳＮＣＡのターゲティング
αシヌクレイン突然変異は、家族性パーキンソン病（ＰＤ）及びレビー小体型認知症を引き起こす。これらの疾患は、疾患修飾治療のない、致死性の神経変性疾患である。ＰＤの有病率は、世界で４００万人であり；ＰＤの１／３が家族性であり；ｆＰＤの１％が、ＳＮＣＡによって引き起こされる。ヒト分子遺伝学によるＳＮＣＡのターゲティングが優良であり得、例えば、ＳＮＣＡ点突然変異及び重複が、延髄；又は中脳の黒質などの組織において、家族性ＰＤを引き起こす。このターゲティングのメカニズムは、過剰発現又は異常なＳＮＣＡタンパク質の発現が、毒性ペプチド及び神経細胞死を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、ＳＮＣＡの７０％のＫＤによって示された。安全性に関して、ＳＮＣＡ ＫＯマウスは、健常である。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ及びタンパク質が挙げられる。
パーキンソン病のためのＬＲＲＫ２のターゲティング
ロイシンリッチリピートキナーゼ２突然変異は、家族性パーキンソン病を引き起こす。この疾患は、疾患修飾治療のない、致死性の神経変性疾患である。ＰＤの有病率は、世界で４００万人であり；ＰＤの１／３が家族性であり；ｆＰＤの３〜７％が、ＬＲＲＫ２によって引き起こされる。ヒト分子遺伝学によるＬＲＲＫ２のターゲティングが優良であり得、例えば、ＬＲＲＫ２点突然変異が、延髄；又は中脳の黒質などの組織において、家族性ＰＤを引き起こす。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ｍＲＮＡ及びタンパク質が挙げられる。
脊髄性筋萎縮症ＶのためのＧＡＲＳのターゲティング
常染色体優性Ｇｌｙｃｙｌ−ｔＲＮＡシンテターゼ突然変異は、脊髄性筋萎縮症Ｖ（ＳＭＡＶ）又は遠位遺伝性運動神経障害Ｖａを引き起こす。これらの疾患は、疾患修飾治療のない、神経変性疾患である。これらは、極めて希少な疾患である。ヒト分子遺伝学によるＧＡＲのターゲティングは良好であり得、例えば、ＧＡＲＳ点突然変異が、脊髄などの組織において、家族性ＳＭＡを引き起こす。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；早期症状を含む。
脊髄性筋萎縮症のためのセイピンのターゲティング
常染色体優性セイピン突然変異は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）又は遠位遺伝性運動神経障害を引き起こす。これらの疾患は、疾患修飾治療のない、神経変性疾患である。これらは、極めて希少な疾患である。ヒト分子遺伝学によるセイピンのターゲティングは良好であり得、例えば、セイピン点突然変異が、脊髄などの組織において、家族性ＳＭＡを引き起こす。このターゲティングのメカニズムは、おそらくＧＯＦ及び毒性ペプチドである。有効性は、５０％のＫＤによって示された。安全性に関して、劣性ＬＯＦ突然変異が、リポジストロフィーを伴うか又は伴わない進行性脳症を引き起こす。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。
優性遺伝性アルツハイマー病は、疾患修飾治療のない重篤な疾患である。標的は、家族性疾患における中心的な機構的役割及び一般的なＡＤにおける役割の可能性のため、ＡＰＰを含む。
アルツハイマー病のためのＡＰＰのターゲティング
アミロイド前駆体タンパク質突然変異は、早期発症型家族性アルツハイマー病（ＥＯＦＡＤ）；ダウン症におけるＡＤ；又はＡＤを引き起こす。これらの疾患は、疾患修飾治療のない、致死性の神経変性疾患である。ＥＯＦＡＤ−ＡＰＰの有病率は、１％のＡＤであり；２１トリソミーの有病率は、１％のＡＤであり；ＡＤの有病率は、米国で約２５０万〜５００万人である。ヒト分子遺伝学によるＡＰＰのターゲティングが優良であり得、例えば、ＡＰＰ重複及び点突然変異が、大脳皮質又は海馬などの組織において、ＥＯＦＡＤを引き起こす。このターゲティングのメカニズムは、ＡＰＰ過剰発現又は毒性代謝産物の発現が、進行性神経細胞死を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、ＡＰＰの７０％のＫＤによって示された。安全性に関して、ＫＤマウスは、いくらかの行動異常があるものの健常であると報告され；ＫＤマウスは、いくらかの空間記憶欠陥があるものの健常であると報告された。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；早期症状；又はＭＲＩを含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ＡＰＰ ｍＲＮＡ及びペプチドが挙げられる。
アルツハイマー病のためのＰＳＥＮ１のターゲティング
プレセニリン１突然変異は、早期発症型家族性アルツハイマー病（ＥＯＦＡＤ）；又はＡＤを引き起こす。これらの疾患は、疾患修飾治療のない、致死性の神経変性疾患である。ヒト分子遺伝学によるＰＳＥＮ１のターゲティングが優良であり得、例えば、ＰＳＥＮ１点突然変異が、大脳皮質；又は海馬などの組織において、ＥＯＦＡＤを引き起こす。このターゲティングのメカニズムは、ＰＳＥＮ１の常染色体優性突然変異が、異常なＡＰＰ代謝を引き起こし、毒性ペプチドが、進行性神経細胞死を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、ＡＰＰ ＫＤがＰＳＥＮ１特異的治療の必要性をなくし得ることによって示された。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；早期症状；又はＭＲＩを含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ＰＳＥＮ１及びＡＰＰペプチドが挙げられる。
アルツハイマー病のためのＰＳＥＮ２のターゲティング
プレセニリン２突然変異は、早期発症型家族性アルツハイマー病（ＥＯＦＡＤ）；又はＡＤを引き起こす。これらの疾患は、疾患修飾治療のない、致死性の神経変性疾患である。ヒト分子遺伝学によるＰＳＥＮ２のターゲティングが優良であり得、例えば、ＰＳＥＮ２点突然変異は、大脳皮質又は海馬などの組織において、ＥＯＦＡＤを引き起こす。このターゲティングのメカニズムは、ＰＳＥＮ２の常染色体優性突然変異が、異常なＡＰＰ代謝を引き起こし、毒性ペプチドが、進行性神経細胞死を引き起こすことによるものであり得る。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；早期症状；又はＭＲＩを含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ＰＳＥＮ２及びＡＰＰペプチドが挙げられる。
アルツハイマー病のためのＡｐｏ Ｅのターゲティング
アポリポタンパク質Ｅ４は、高齢者の孤発性ＡＤに関連している。この疾患は、疾患修飾治療のない、致死性の神経変性疾患である。ＡＤの有病率は、米国で２５０万〜５００万人である。ＡｐｏＥ４とＡＤとの間の関連を裏付けるゲノム的証拠が、多くの集団において優良であるため、Ａｐｏ Ｅのターゲティングは、有効であり得る。標的組織は、大脳皮質であり得る。多くの集団における強い関連にかかわらず、Ａｐｏ Ｅ４がＡＤの発症に寄与するかどうかはまだ明らかでない。これまでのところ、データは、Ａｐｏ Ｅ４ホモ接合性が、高齢者のＡＤの増加したリスクを示すが、高齢者においてさえ、ＡＤを引き起こすのに十分でないことを示す。安全性に関して、中枢神経系におけるＡｐｏ ＥのＫＤは、Ａｐｏ ＥにおけるヒトＬＯＦ突然変異が明らかな神経学的異常に関連していないため、安全であり得るが、全身暴露は、ＩＩＩ型高リポタンパク血症を引き起こし得る。可能性のある診断は、ＡＤの臨床診断；ＥＯＦＡＤ突然変異の除外；Ａｐｏ Ｅ４遺伝子型についての遺伝子検査を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ＡＰＰ、タウｍＲＮＡ及びペプチドが挙げられる。
中枢神経系遺伝子重複障害。半分の一貫したＫＤは、これらの障害を改善し得る。標的は、ＭｅＣＰ２を含む。
Ｘ連鎖精神遅滞のためのＭｅＣＰ２のターゲティング
メチルＣｐＧ結合タンパク質２遺伝子重複は、Ｘ連鎖精神遅滞（ＸＬＭＲ）を引き起こす。この疾患は、疾患修飾治療のない、致死性の認知障害である。Ｘ連鎖ＭＲの１〜１５％が、ＭｅＣＰ２重複によって引き起こされ；集団の２〜３％が、ＭＲを有する。ヒト分子遺伝学によるＭｅＣＰ２のターゲティングが優良であり得、例えば、ＭｅＣＰ２重複が、大脳皮質などの組織において、ＸＬＭＲを引き起こす。このターゲティングのメカニズムは、ＭｅＣＰ２過剰発現が、他の遺伝子の調節異常及び神経変性を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、ＭｅＣＰ２の５０％のＫＤによって示され；マウスモデルにおけるＡＳＯ ＫＤは、表現型を逆転させる。安全性に関して、ＭｅＣＰ２ ＬＯＦ突然変異は、レット症候群を引き起こし得る。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ＭｅＣＰ２ ｍＲＮＡ及びペプチドが挙げられる。
優性遺伝性脳アミロイド血管症は、疾患修飾治療のない重篤な疾患である。標的は、ＴＴＲを含む。
ｈＡＴＴＲ ＣＡＡのためのＴＴＲのターゲティング
このターゲティングは、中枢神経系ｓｉＲＮＡへの手低リスクの導入であり得る。脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）及び髄膜アミロイドは、疾患修飾治療のない、致死性疾患である。ヒト遺伝学及び薬理学によるＴＴＲのターゲティングが優良であり得る。標的組織は、中枢神経系血管系、又は中枢神経系であり得る。このターゲティングのメカニズムは、変異タンパク質が血管外膜に蓄積し、中枢神経系の出血を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、ＴＴＲの７０％のＫＤによって示された。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ｍＲＮＡ及びタンパク質が挙げられる。
ＣＡＡのためのＩＴＭ２Ｂのターゲティング
内在性膜タンパク質２Ｂ突然変異は、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、英国型又は家族性英国型認知症（ＦＢＤ）を引き起こす。特異的突然変異は、優性網膜変性も引き起こし得る。この疾患は、疾患修飾治療のない、致死性疾患である。これは、希少疾患である。ヒト分子遺伝学によるＩＴＭ２Ｂのターゲティングが優良であり得る。標的組織は、中枢神経系血管系、又は中枢神経系であり得る。このターゲティングのメカニズムは、おそらくＧＯＦ突然変異に関与する。有効性は、ＩＴＭ２Ｂ変異対立遺伝子の７０％のＫＤによって示された。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ｍＲＮＡ及び可能性のあるタンパク質が挙げられる。
ＣＡＡのためのＣＳＴ３のターゲティング
シスタチンＣ突然変異は、アイスランド型家族性脳アミロイド血管症を引き起こす。この疾患は、疾患修飾治療のない、致死性疾患である。これは、アイスランド及びデンマークを除いて、希少疾患である。ヒト遺伝学によるＣＳＴ３のターゲティングが優良であり得る。標的組織は、中枢神経系血管系であり得る。このターゲティングのメカニズムは、変異タンパク質が、血管外膜に蓄積し、中枢神経系の出血を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、おそらく、変異対立遺伝子の７０％のＫＤによって示された。安全性に関して、ＣＳＴ３ ＫＯマウスは、関節炎のリスクを有し得る。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ｍＲＮＡ及び可能性のあるタンパク質が挙げられる。
痙性対麻痺のためのＳＰＡＳＴのターゲティング
ＳＰＡＳＴＩＮ突然変異は、認知障害を伴う痙性対麻痺（ＳＰ）４を引き起こす。この疾患は、疾患修飾治療のない、下位運動神経変性疾患である。ＳＰの有病率は、人口１００，０００人当たり５人であり；ＳＰ４は、優性ＳＰの４５％である。ヒト分子遺伝学によるＳＰＡＳＴのターゲティングが優良であり得、例えば、ＳＰＡＳＴトリヌクレオチド突然変異は、脊髄；又は中枢神経系などの組織において、家族性ＳＰを引き起こす。このターゲティングのメカニズムは、ナンセンス及び推定ドミナントネガティブ型突然変異が、異常な微小管代謝及び神経変性を引き起こすことによるものであり得る。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ＳＰＡＳＴ ｍＲＮＡ及び可能性のあるタンパク質が挙げられる。
痙性対麻痺のためのＫＩＦ５Ａのターゲティング
キネシンファミリーメンバー５Ａ突然変異は、末梢神経障害及び他の疾患を伴う痙性対麻痺（ＳＰ）１０を引き起こす。この疾患は、疾患修飾治療のない、下位運動神経変性疾患である。ＳＰの有病率は、１００，０００人当たり５人であり；ＳＰ１０は、１，０００，０００人当たり１人である。ヒト分子遺伝学によるＫＩＦ５Ａのターゲティングが優良であり得、例えば、ＫＩＦ５Ａアミノ末端ミスセンス突然変異が、ＳＰ１０を引き起こし；ＫＩＦ５Ａが、中枢神経系において発現され、微小管モータータンパク質をコードする。標的組織は、脊髄であり得る。このターゲティングのメカニズムは、常染色体優性ミスセンス突然変異は、ＳＰ１０がおそらくモーターへの微小管の結合に影響を与えること引き起こすことによるものであり得る。有効性は、変異対立遺伝子のおそらくＫＤによって提供され得る。安全性に関して、ＫＩＦ５Ａフレームシフト型突然変異が、新生児難治性ミオクローヌスを引き起こし、スプライス部位突然変異が、おそらくＬＯＦ機構を介して、家族性ＡＬＳに関連している。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ｍＲＮＡ及び可能性のあるタンパク質が挙げられる。
痙性対麻痺のためのＡＴＬ１のターゲティング
アトラスチン突然変異は、痙性対麻痺３Ａ及び感覚神経障害１Ｄ、遺伝性感覚神経障害（ＨＳＮ）を引き起こす。この疾患は、疾患修飾治療のない、下位運動神経変性疾患である。ＳＰの有病率は、１００，０００人当たり５人であり；ＳＰ３Ａは、希少優性型である。ヒト分子遺伝学によるＡＴＬ１のターゲティングが優良であり得、例えば、ＡＴＬ１点突然変異は、家族性ＳＰを引き起こす。標的組織は、脊髄であり得る。このターゲティングのメカニズムは、ドミナントネガティブ型ＡＴＬ１タンパク質の常染色体優性発現が、ＳＰ３Ａを引き起こすが；ＬＯＦ突然変異が、感覚神経障害１Ｄを引き起こすことによるものであり得る。有効性は、特異的ＡＴＬ１対立遺伝子の７０％のＫＤによって示された。安全性に関して、ＡＴＬ１へテロ接合ＬＯＦ突然変異は、ＨＳＮ１Ｄを引き起こす。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ＡＴＬ１ ｍＲＮＡ及びタンパク質が挙げられる。
痙性対麻痺のためのＮＩＰＡ１のターゲティング
ＬＯＦ ＮＩＰＡ１突然変異は、てんかん及び発作を伴う痙性対麻痺６を引き起こす。この疾患は、疾患修飾治療のない、下位運動神経変性疾患である。ＳＰの有病率は、１００，０００人当たり５人であり；ＳＰ６は、希少優性型である。ヒト分子遺伝学によるＮＩＰＡ１のターゲティングが優良であり得、例えば、ＮＩＰＡ１点突然変異は、家族性ＳＰを引き起こす。標的組織は、脊髄；又は中枢神経系であり得る。このターゲティングのメカニズムは、欠陥膜タンパク質の常染色体優性発現が、ＳＰ３Ａ；及びおそらくＬＯＦを引き起こすことによるものであり得る。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ｍＲＮＡ及び可能性のあるタンパク質が挙げられる。
優性遺伝性筋強直性ジストロフィーは、中枢神経系及び全身治療を必要とする、中枢神経系、骨格筋及び心筋の疾患である。標的は、ＤＭ１についてはＭＰＫを含む。
筋強直性ジストロフィー１のためのＤＭＰＫのターゲティング
中枢神経系及び全身治療が、筋緊張性異栄養症プロテインキナーゼを標的とする有効な治療に必要とされた。筋強直性ジストロフィー１（ＤＭ１）は、筋肉及び中枢神経系の変性疾患である。それは、疾患修飾治療のない、致死性疾患である。ＤＭ１の有病率は、世界的に８，０００人当たり１人である。ヒト分子遺伝学によるＤＭＰＫのターゲティングが優良であり得、例えば、ＤＭＰＫ ＣＴＧリピート伸長は、家族性ＤＭ１を引き起こす。標的組織は、骨格筋、心筋、又は中枢神経系であり得る。このターゲティングのメカニズムは、常染色体優性非コードＣＴＧリピートが、異常なＲＮＡプロセシング及びドミナントネガティブ効果を引き起こし；極端な伸長からの予測が、早期発症型の疾患を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、ＤＭＰＫの７０％によって示され；ＡＳＯ有効性が、マウスにおいて実証された。マウスにおける安全性が、ＫＯ及びＡＳＯ ＫＤにより実証された。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、血液及びＣＳＦ ｍＲＮＡ及びタンパク質が挙げられる。
筋強直性ジストロフィー２のためのＺＮＦ９のターゲティング
亜鉛フィンガータンパク質９突然変異は、骨格筋の変性疾患である筋強直性ジストロフィー２（ＤＭ２）を引き起こす。これは、疾患修飾治療のない、重篤な疾患である。ＤＭ２の有病率は、世界で８，０００人当たり１人であり；それは、成人において最も多い筋ジストロフィーである。ヒト分子遺伝学によるＺＮＦ９のターゲティングが優良であり得、例えば、イントロン１におけるＺＮＦ９ ＣＴＴＧリピート伸長が、家族性ＤＭ２を引き起こす。標的組織は、骨格筋、又は心筋であり得る。このターゲティングのメカニズムは、イントロン１における常染色体優性ＣＴＴＧリピート伸長が、異常なＲＮＡ代謝及びドミナントネガティブ効果を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、ＺＮＦ９の７０％によって示された。マウスにおける安全なＫＤが実証された。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、血液ｍＲＮＡ及びタンパク質が挙げられる。
優性遺伝性プリオン病は、遺伝性、孤発性及び伝染性ＰＲＮＰ疾患である。標的は、ＰＲＮＰを含む。
筋強直性プリオン病のためのＰＲＮＰのターゲティング
筋強直性プリオン病は、ＰＲＮＰ関連脳アミロイド血管症、ゲルストマン・ストロイスラー病（ＧＳＤ）、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、ハンチントン病様１（ＨＤＬ１）、及びクールーへの感受性を含む優性遺伝性プリオン病である。これらの疾患は、疾患修飾治療のない、致死性の神経変性疾患である。このタイプの疾患の有病率は、１，０００，０００人当たり１人である。ヒト分子遺伝学によるＰＲＮＰのターゲティングが優良であり得、例えば、ＰＲＮＰ突然変異は、家族性及び孤発性プリオン病を引き起こす。標的組織は、中枢神経系であり得る。このターゲティングのメカニズムは、常染色体優性タンパク質ミスフォールディングが、神経毒性を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、７０％のＰＲＮＰ ＫＤによって示され；ＰＲＮＰ多型は、クールーに対して保護的であるようである。安全性に関して、ＰＲＮＰ ＫＯマウスは、健常であると報告された。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ｍＲＮＡ及びタンパク質が挙げられる。
ラフォラ病のミオクローヌスてんかんのためのグリコーゲンシンターゼのターゲティング
ラフォリン（ＥＰＭ２Ａ）遺伝子突然変異は、ＡＲミオクローヌスてんかん、遺伝性進行性発作性疾患を引き起こす。この疾患は、疾患修飾治療のない、発作及び認知低下を伴う致死性疾患である。この疾患の有病率は、１，０００，０００人当たり４人である。ヒト分子遺伝学によるグリコーゲンシンターゼのターゲティングが優良であり得、例えば、突然変異は、ラフォラ病のＡＲ家族性ミオクローヌスてんかんを引き起こす。標的組織は中枢神経系であり得る。このターゲティングのメカニズムは、ラフォリンの常染色体劣性機能障害が、グリコーゲンのミスフォールディング及び発作の焦点を引き起こすことによるものであり得る。有効性は、グリコーゲンシンターゼＧＹＳ１の７０％のＫＤによって示された。安全性に関して、ＧＹＳ１欠損が、骨格筋及び心筋グリコーゲン欠損を引き起こし；生存するＧＹＳ１マウスは、筋肉異常を有する。可能性のある診断は、家族歴；遺伝子検査；又は早期症状を含む。使用され得るバイオマーカーとしては、例えば、ＣＳＦ ｍＲＮＡ及びタンパク質が挙げられる。
一部の実施形態では、本発明は、限定されるものではないが、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）（ドライ型及びウェット型）、バードショット脈絡網膜炎、優性網膜色素変性症４、フックスジストロフィー、ｈＡＴＴＲアミロイド症、遺伝性及び散発性緑内障、及びシュタルガルト病を含む疾患の遺伝子を標的とする二本鎖ｉＲＮＡ剤を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ウェット型（又は滲出性）ＡＭＤのためのＶＥＧＦを標的とする二本鎖ｉＲＮＡ剤を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ドライ型（又は非滲出性）ＡＭＤのためのＣ３を標的とする二本鎖ｉＲＮＡ剤を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ドライ型（又は非滲出性）ＡＭＤのためのＣＦＢを標的とする二本鎖ｉＲＮＡ剤を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、緑内障のためのＭＹＯＣを標的とする二本鎖ｉＲＮＡ剤を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、緑内障のためのＲＯＣＫ２を標的とする二本鎖ｉＲＮＡ剤を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、緑内障のためのＡＤＲＢ２を標的とする二本鎖ｉＲＮＡ剤を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、緑内障のためのＣＡ２を標的とする二本鎖ｉＲＮＡ剤を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、白内障のためのＣＲＹＧＣを標的とする二本鎖ｉＲＮＡ剤を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ドライアイ症候群のためのＰＰＰ３ＣＢを標的とする二本鎖ｉＲＮＡ剤を提供する。
リガンド
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、１つ以上のコンジュゲート基の共有結合によってさらに修飾される。一般に、コンジュゲート基は、限定されるものではないが、薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞取り込み、電荷及びクリアランスを含む、本発明の結合された二本鎖ｉＲＮＡ剤の１つ以上の特性を調節する。コンジュゲート基は、化学分野で日常的に使用されており、オリゴマー化合物などの親化合物に、直接又は任意選択の連結部分若しくは連結基を介して連結される。コンジュゲート基の好ましいリストには、限定されるものではないが、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸塩、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン及び色素が含まれる。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、特定の中枢神経系組織への送達を媒介する受容体を標的とする標的化リガンドをさらに含む。これらの標的化リガンドは、特異的な髄腔内及び全身送達を可能にするために、親油性部分と組み合わせてコンジュゲートされ得る。
中枢神経系組織への受容体媒介性送達を標的とする例示的な標的化リガンドは、Ａｎｇｉｏｐｅｐ−２などのペプチドリガンド、リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）リガンド、ｂＥｎｄ．３細胞結合リガンド；トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）リガンド（脳内の鉄輸送系及び脳実質へのカーゴ輸送を用いることができる）；マンノース受容体リガンド（嗅神経鞘細胞、グリア細胞を標的とする）、グルコーストランスポータータンパク質、及びＬＤＬ受容体リガンドである。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、特定の眼組織への送達を媒介する受容体を標的とする標的化リガンドをさらに含む。これらの標的化リガンドは、特異的な硝子体内及び全身送達を可能にするために、親油性部分と組み合わせてコンジュゲートされ得る。眼組織への受容体媒介性送達を標的とする例示的な標的化リガンドは、オールトランスレチノール（レチノイン酸受容体を標的とする）などの親油性リガンド；Ｈ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−ＯＨ又はＣｙｃｌｏ（−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＣｙｓなどのＲＧＤペプチド（網膜色素上皮細胞を標的とする）；ＬＤＬ受容体リガンド；及び糖質系リガンド（後眼部の内皮細胞を標的とする）である。
本発明に適した好ましいコンジュゲート基としては、コレステロール部分などの脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３）；コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４，１０５３）；チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５）；チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３）；脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，１１１；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９）；リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム−１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７）；ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９）；アダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１）；パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４、２２９）；又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３）が挙げられる。
一般に、多種多様な実体、例えば、リガンドが、本明細書に記載されるオリゴマー化合物に結合され得る。リガンドは、天然に存在する分子、又は組換え若しくは合成分子を含み得る。例示的なリガンドとしては、限定されるものではないが、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、例えば、ＰＥＧ−２Ｋ、ＰＥＧ−５Ｋ、ＰＥＧ−１０Ｋ、ＰＥＧ−１２Ｋ、ＰＥＧ−１５Ｋ、ＰＥＧ−２０Ｋ、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、ポリホスファジン、ポリエチレンイミン、カチオン性基、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬似ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、アプタマー、アシアロフェチュイン、ヒアルロナン、プロコラーゲン、免疫グロブリン（例えば、抗体）、インスリン、トランスフェリン、アルブミン、糖−アルブミンコンジュゲート、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えばソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（例えば、ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子（例えば、ステロイド、胆汁酸、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、若しくはフェノキサジン）、ペプチド（例えば、αらせんペプチド、両親媒性ペプチド、ＲＧＤペプチド、細胞透過ペプチド、エンドソーム溶解／融合ペプチド）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、ナプロキセン、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、ＡＰ、抗体、ホルモン及びホルモン受容体、レクチン、糖質、多価糖質、ビタミン（例えば、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン及びピリドキサール）、ビタミン補因子、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化因子、ＮＦ−κＢの活性化因子、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトルンクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、ミオセルビン、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β、γインターフェロン、天然若しくは組換え低密度リポタンパク（ＬＤＬ）、天然若しくは組換え高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、及び細胞透過剤（例えば、αらせん状細胞透過剤）が挙げられる。
ペプチド及びペプチド模倣リガンドとしては、天然又は修飾ペプチド、例えば、Ｄ若しくはＬペプチド；α、β、若しくはγペプチド；Ｎ−メチルペプチド；アザペプチド；１つ以上のアミドを有するペプチド、即ち、ペプチド、１つ以上の尿素、チオ尿素、カルバメート、又はスルホニル尿素結合で置換された結合；又は環状ペプチドを有するものが挙げられる。ペプチド模倣体（本明細書では、オリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然ペプチドに類似した明確な３次元構造にフォールディングすることが可能な分子である。ペプチド又はペプチド模倣リガンドは、約５〜５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０アミノ酸長であり得る。
例示的な両親媒性ペプチドとしては、限定されるものではないが、セクロピン、リコトキシン（ｌｙｃｏｔｏｘｉｎ）、パラダキシン（ｐａｒａｄａｘｉｎ）、ブフォリン、ＣＰＦ、ボンビニン−様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシジン、セラトトキシン（ｃｅｒａｔｏｔｏｘｉｎ）、エボヤ（Ｓ．ｃｌａｖａ）ペプチド、メクラウナギ腸抗菌ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン、ブレビニン−２、デルマセプチン、メリチン、プレウロシジン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエルペプチド、エスクレンチニス−１（ｅｓｃｕｌｅｎｔｉｎｉｓ−１）、及びカエリンが挙げられる。
本明細書で使用される「エンドソーム溶解リガンド」という語は、エンドソーム溶解特性を有する分子を指す。エンドソーム溶解リガンドは、本発明の組成物、若しくはその成分の溶解及び／又は本発明の組成物、若しくはその成分の、エンドソーム、リソソーム、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、微小管、ペロキシソーム、又は細胞内の他の小胞体などの細胞区画から、細胞の細胞質への輸送を促進する。いくつかの例示的なエンドソーム溶解リガンドとしては、限定されるものではないが、イミダゾール、ポリ又はオリゴイミダゾール、直鎖若しくは分岐鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖若しくは分岐鎖ポリアミン、例えばスペルミン、カチオン性直鎖及び分岐鎖ポリアミン、ポリカルボキシレート、ポリカチオン、マスクオリゴ若しくはポリカチオン又はアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール／ポリケタール、オルトエステル、マスク若しくは非マスクカチオン又はアニオン電荷を有する直鎖若しくは分岐鎖ポリマー、マスク若しくは非マスクカチオン又はアニオン電荷を有するデンドリマー、ポリアニオン性ペプチド、ポリアニオン性ペプチド模倣薬、ｐＨ感受性ペプチド、天然及び合成融合性脂質、天然及び合成カチオン性脂質が挙げられる。
例示的なエンドソーム溶解／融合性ペプチドとしては、限定されるものではないが、ＡＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡＡＡＡＧＧＣ（ＧＡＬＡ）；ＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＡＡＡＧＧＣ（ＥＡＬＡ）；ＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡ；ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＷＤＹＧ（ＩＮＦ−７）；ＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧ（Ｉｎｆ ＨＡ−２）；ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＣＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤ ＧＷＹＧＣ（ｄｉＩＮＦ−７）；ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＧＣＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＧＣ（ｄｉＩＮＦ−３）；ＧＬＦＧＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＨＬＡＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＡＧＧＳＣ（ＧＬＦ）；ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＬＡＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＡＧＧＳＣ（ＧＡＬＡ−ＩＮＦ３）；ＧＬＦ ＥＡＩ ＥＧＦＩ ＥＮＧＷ ＥＧｎＩ ＤＧ Ｋ ＧＬＦ ＥＡＩ ＥＧＦＩ ＥＮＧＷ ＥＧｎＩ ＤＧ（ＩＮＦ−５、ｎはノルロイシンである）；ＬＦＥＡＬＬＥＬＬＥＳＬＷＥＬＬＬＥＡ（ＪＴＳ−１）；ＧＬＦＫＡＬＬＫＬＬＫＳＬＷＫＬＬＬＫＡ（ｐｐＴＧ１）；ＧＬＦＲＡＬＬＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＬＲＡ（ｐｐＴＧ２０）；ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＡＣＥＡ（ＫＡＬＡ）；ＧＬＦＦＥＡＩＡＥＦＩＥＧＧＷＥＧＬＩＥＧＣ（ＨＡ）；ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（Ｍｅｌｉｔｔｉｎ）；Ｈ５ＷＹＧ；及びＣＨＫ６ＨＣが挙げられる。
理論に拘束されることを望むものではないが、融合性脂質は、膜と融合し、その結果、膜を不安定化する。融合性脂質は、通常、小さい頭部基及び不飽和アシル鎖を有する。例示的な融合性脂質としては、限定されるものではないが、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−オール（Ｄｉ−Ｌｉｎ）、Ｎ−メチル（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）メタンアミン（ＤＬｉｎ−ｋ−ＤＭＡ）及びＮ−メチル−２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）エタンアミン（本明細書では、ＸＴＣとも呼ばれる）が挙げられる。
本発明に適したエンドソーム溶解活性を有する合成ポリマーが、参照により全内容が本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２００９／００４８４１０号明細書；同第２００９／００２３８９０号明細書；同第２００８／０２８７６３０号明細書；同第２００８／０２８７６２８号明細書；同第２００８／０２８１０４４号明細書；同第２００８／０２８１０４１号明細書；同第２００８／０２６９４５０号明細書；同第２００７／０１０５８０４号明細書；同第２００７００３６８６５号明細書；及び同第２００４／０１９８６８７号明細書に記載されている。
例示的な細胞透過性ペプチドとしては、限定されるものではないが、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（ペネトラチン）；ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ（Ｔａｔ断片４８〜６０）；ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（シグナル配列ベースのペプチド）；ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ（ＰＶＥＣ）；ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（トランスポルタン）；ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（両親媒性モデルペプチド）；ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（Ａｒｇ９）；ＫＦＦＫＦＦＫＦＦＫ（細菌細胞壁透過性ペプチド）；ＬＬＧＤＦＦＲＫＳＫＥＫＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥＳ（ＬＬ−３７）；ＳＷＬＳＫＴＡＫＫＬＥＮＳＡＫＫＲＩＳＥＧＩＡＩＡＩＱＧＧＰＲ（セクロピンＰ１）；ＡＣＹＣＲＩＰＡＣＩＡＧＥＲＲＹＧＴＣＩＹＱＧＲＬＷＡＦＣＣ（α−デフェンシン）；ＤＨＹＮＣＶＳＳＧＧＱＣＬＹＳＡＣＰＩＦＴＫＩＱＧＴＣＹＲＧＫＡＫＣＣＫ（β−デフェンシン）；ＲＲＲＰＲＰＰＹＬＰＲＰＲＰＰＰＦＦＰＰＲＬＰＰＲＩＰＰＧＦＰＰＲＦＰＰＲＦＰＧＫＲ−ＮＨ２（ＰＲ−３９）；ＩＬＰＷＫＷＰＷＷＰＷＲＲ−ＮＨ２（インドリシジン）；ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（ＲＦＧＦ）；ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（ＲＦＧＦ類似体）；及びＲＫＣＲＩＶＶＩＲＶＣＲ（バクテネシン）が挙げられる。
例示的なカチオン性基としては、限定されるものではないが、例えば、Ｏ−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）；アミノアルコキシ、例えば、Ｏ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ、（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）；アミノ（例えばＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、又はアミノ酸）；及びＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ）から得られるプロトン化アミノ基が挙げられる。
本明細書で使用される「標的化リガンド」という語は、選択された標的、例えば、細胞、細胞型、組織、器官、体の領域、又は区画、例えば、細胞、組織若しくは器官の区画に対する増大した親和性を提供する任意の分子を指す。いくつかの例示的な標的化リガンドとしては、限定されるものではないが、抗体、抗原、葉酸塩、受容体リガンド、糖質、アプタマー、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ及びＨＤＬリガンドが挙げられる。
糖質系標的化リガンドとしては、限定されるものではないが、Ｄ−ガラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、多価ＧａｌＮＡｃ、例えばＧａｌＮＡｃ２及びＧａｌＮＡｃ３（ＧａｌＮＡｃ及び多価ＧａｌＮＡｃは、本明細書では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートと総称される）；Ｄ−マンノース、多価マンノース、多価ラクトース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、グルコース、多価グルコース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸及びレクチンが挙げられる。多価という語は、２つ以上の単糖単位が存在することを示す。このような単糖サブユニットは、グリコシド結合を介して互いに連結されるか、又は骨格分子に連結され得る。
リガンドとして、本発明に適したいくつかの葉酸塩及び葉酸塩類似体が、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、米国特許第２，８１６，１１０号明細書；同第５，５５２，５４５号明細書；同第６，３３５，４３４号明細書及び同第７，１２８，８９３号明細書に記載されている。
本明細書で使用される「ＰＫ調節リガンド」及び「ＰＫモジュレーター」という語は、本発明の組成物の薬剤動態を調節し得る分子を指す。いくつかの例示的なＰＫモジュレーターとしては、限定されるものではないが、親油性分子、胆汁酸、ステロール、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ビタミン、脂肪酸、フェノキサジン、アスピリン、ナプロキセン、イブプロフェン、スプロフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ＰＥＧ、ビオチン、及びトランスサイレチン結合リガンド（例えば、テトラヨードチロ酢酸、２、４、６−トリヨードフェノール及びフルフェナム酸）が挙げられる。いくつかのホスホロチオエート糖間結合を含むオリゴマー化合物は、血清タンパク質と結合することも知られており、したがって、短いオリゴマー化合物、例えば、約５〜３０ヌクレオチド（例えば、５〜２５ヌクレオチド、好ましくは、５〜２０ヌクレオチド、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチド）を含み、骨格に複数のホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドも、リガンドとして（例えば、ＰＫ調節リガンドとして）本発明に適している。ＰＫ調節オリゴヌクレオチドは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれ以上のホスホロチオエート及び／又はホスホロジチオエート結合を含み得る。一部の実施形態では、ＰＫ調節オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート及び／又はホスホロジチオエート結合である。さらに、血清成分（例えば血清タンパク質）に結合するアプタマーも、ＰＫ調節リガンドとして、本発明に適している。血清成分（例えば、血清タンパク質）への結合は、Ｏｒａｖｃｏｖａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ（１９９６），６７７：１−２７に記載されるものなどのアルブミン結合アッセイから予測され得る。
２つ以上のリガンドが存在する場合、リガンドは、全て同じ特性を有してもよく、全てが異なる特性を有するか、又は一部のリガンドが、同じ特性を有する一方、他のリガンドは、異なる特性を有してもよい。例えば、リガンドは、標的化特性を有するか、エンドソーム溶解活性を有するか、又はＰＫ調節特性を有し得る。好ましい実施形態では、リガンドは全て、異なる特性を有する。
リガンド又は連結配位子は、モノマーが、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤の構成要素（例えば、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤又はリンカー）に組み込まれる場合、前記モノマー上に存在し得る。一部の実施形態では、リガンドは、「前駆体」モノマーが、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤の構成要素（例えば、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤又はリンカー）に組み込まれた後、カップリングによって前記「前駆体」モノマーに組み込まれ得る。例えば、アミノ末端テザー（即ち、リガンドが結合していない）を有するモノマー、例えば、モノマー−リンカー−ＮＨ２は、本発明の化合物の構成要素（例えば、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤又はリンカー）に組み込まれ得る。次の操作において、即ち、本発明の化合物の構成要素（例えば、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤又はリンカー）への前駆体モノマーの組み込みの後、求電子基、例えば、ペンタフルオロフェニルエステル又はアルデヒド基を有するリガンドが、リガンドの求電子基と前駆体モノマーのテザーの末端求核基とのカップリングによって、前駆体モノマーに結合され得る。
別の例では、クリック化学反応に参加するのに適した化学基を有するモノマーを、例えば、末端がアジドまたはアルキンのテザー／リンカーに組み込むことができる。これに続く作業、即ち、前駆体モノマーが鎖に組み込まれた後で、相補的な化学基、例えば、アルキンまたはアジドを有するリガンドを、アルキンおよびアジドを共に結合することによって前駆体モノマーに結合することができる。
一部の実施形態では、リガンドは、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤の核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間結合にコンジュゲートすることができる。プリン核酸塩基またはその誘導体に対するコンジュゲーションは、環内原子および環外原子を含む任意の位置に生じ得る。一部の実施形態では、プリン核酸塩基の２位、６位、７位、または８位が、コンジュゲート部分に結合している。また、ピリミジン核酸塩基またはその誘導体に対するコンジュゲーションは、どの位置で生じても良い。一部の実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２位、５位、および６位を、コンジュゲート部分と置換することができる。リガンドが、核酸塩基にコンジュゲートされる場合、好ましい位置は、ハイブリダイゼーションを妨げない、即ち、塩基対合に必要な水素結合相互作用を妨げない位置である。
ヌクレオシドの糖部分に対するコンジュゲーションは、どの炭素原子で生じても良い。コンジュゲート部分に結合することができる糖部分の炭素原子の例には、２’、３’、および５’炭素原子が挙げられる。１’位も、コンジュゲート部分、例えば、脱塩基残基に結合することができる。ヌクレオシド間結合も、コンジュゲート部分を保持することができる。リン含有結合（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオテート、およびホスホロアミデートなど）の場合、コンジュゲート部分は、リン原子に直接結合する、またはリン原子に結合しているＯ、Ｎ、またはＳ原子に結合することができる。アミンまたはアミドを含有するヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）の場合、コンジュゲート部分は、アミンまたはアミドの窒素原子に、または隣接する炭素原子に結合することができる。
オリゴヌクレオチドのコンジュゲートを調製するための多くの方法がある。一般に、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの反応性基（例えば、ＯＨ、ＳＨ、アミン、カルボキシル、アルデヒドなど）をコンジュゲート部分の反応性基と接触させることによって、コンジュゲート部分に結合される。一部の実施形態では、一方の反応性基が求電子性であり、他方が求核性である。
例えば、求電子基は、カルボニル含有官能基であってよく、求核基は、アミン又はチオールであり得る。連結基を用いる及び用いない核酸及び関連オリゴマー化合物のコンジュゲーションのための方法は、例えば、参照により全内容が本明細書に組み入れられる、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ ａｎｄ ＬｅＢｌｅｕ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９９３，Ｃｈａｐｔｅｒ １７などの文献に十分に記載されている。
リガンドは、リンカー又は担体モノマー、例えば、リガンド担体を介して、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤に結合される。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格付着点」、好ましくは、２つの「骨格付着点」及び（ｉｉ）少なくとも１つの「テザー付着点」を含む。本明細書で使用される「骨格付着点」は、官能基、例えばヒドロキシル基、又は一般に、オリゴヌクレオチドの骨格、例えば、リン酸塩の骨格、若しくは例えば、硫黄を含有する修飾リン酸塩の骨格への担体モノマーの組み込みに利用可能であり、且つ適した結合を指す。「テザー付着点」（ＴＡＰ）は、選択された部分を接続する担体モノマーの原子、例えば、炭素原子又はヘテロ原子（骨格付着点を提供する原子とは異なる）を指す。選択された部分は、例えば、糖質、例えば単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖及び多糖であり得る。任意選択で、選択された部分は、介在テザーによって担体モノマーに接続される。したがって、担体は、しばしば、官能基、例えば、アミノ基を含む、又は一般に、別の化学物質、例えば、リガンドの構成原子への組み込み又は連結に適した結合を可能にする。
核酸のコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；同第４，９４８，８８２号明細書；同第５，２１８，１０５号明細書；同第５，５２５，４６５号明細書；同第５，５４１，３１３号明細書；同第５，５４５，７３０号明細書；同第５，５５２，５３８号明細書；同第５，５７８，７１７号明細書、同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５９１，５８４号明細書；同第５，１０９，１２４号明細書；同第５，１１８，８０２号明細書；同第５，１３８，０４５号明細書；同第５，４１４，０７７号明細書；同第５，４８６，６０３号明細書；同第５，５１２，４３９号明細書；同第５，５７８，７１８号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第４，５８７，０４４号明細書；同第４，６０５，７３５号明細書；同第４，６６７，０２５号明細書；同第４，７６２，７７９号明細書；同第４，７８９，７３７号明細書；同第４，８２４，９４１号明細書；同第４，８３５，２６３号明細書；同第４，８７６，３３５号明細書；同第４，９０４，５８２号明細書；同第４，９５８，０１３号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，１４９，７８２号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，２４５，０２２号明細書；同第５，２５４，４６９号明細書；同第５，２５８，５０６号明細書；同第５，２６２，５３６号明細書；同第５，２７２，２５０号明細書；同第５，２９２，８７３号明細書；同第５，３１７，０９８号明細書；同第５，３７１，２４１号明細書、同第５，３９１，７２３号明細書；同第５，４１６，２０３号明細書、同第５，４５１，４６３号明細書；同第５，５１０，４７５号明細書；同第５，５１２，６６７号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５６５，５５２号明細書；同第５，５６７，８１０号明細書；同第５，５７４，１４２号明細書；同第５，５８５，４８１号明細書；同第５，５８７，３７１号明細書；同第５，５９５，７２６号明細書；同第５，５９７，６９６号明細書；同第５，５９９，９２３号明細書；同第５，５９９，９２８号明細書；同第５，６７２，６６２号明細書；同第５，６８８，９４１号明細書；同第５，７１４，１６６号明細書；同第６，１５３，７３７号明細書；同第６，１７２，２０８号明細書；同第６，３００，３１９号明細書；同第６，３３５，４３４号明細書；同第６，３３５，４３７号明細書；同第６，３９５，４３７号明細書；同第６，４４４，８０６号明細書；同第６，４８６，３０８号明細書；同第６，５２５，０３１号明細書；同第６，５２８，６３１号明細書；同第６，５５９，２７９号明細書が挙げられる。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、肝組織を標的とする標的化リガンドをさらに含む。一部の実施形態では、標的化リガンドは、糖質系リガンドである。一実施形態では、標的化リガンドは、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートである。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、以下に示される構造を有するリガンド：
Figure 2021522810
 をさらに含み、
式中：
ＬＧは存在ごとに独立して、リガンド、例えば、糖質、例えば単糖、二糖、三糖、四糖、多糖であり；
Ｚ’、Ｚ”、Ｚ”’及びＺ””はそれぞれ、存在ごとに独立して、Ｏ又はＳである。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）又は（Ｖ）：
Figure 2021522810
 のリガンドを含み、
式中：
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ及びｑ５Ｃは存在ごとに独立して、０〜２０を表し、反復単位は、同じか又は異なっていてもよく；
Ｑ及びＱ’はそれぞれ、存在ごとに独立して、存在しないか、−（Ｐ７−Ｑ７−Ｒ７）ｐ−Ｔ７−又は−Ｔ７−Ｑ７−Ｔ７’−Ｂ−Ｔ８’−Ｑ８−Ｔ８であり；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｐ７、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃ、Ｔ７、Ｔ７’、Ｔ８及びＴ８’はそれぞれ、存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ又はＣＨ２Ｏであり；
Ｂは、−ＣＨ２−Ｎ（ＢＬ）−ＣＨ２−であり；
ＢＬは、−ＴＢ−ＱＢ−ＴＢ’−Ｒｘであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃ、Ｑ７、Ｑ８及びＱＢは存在ごとに独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンであり、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’）、Ｃ≡Ｃ又はＣ（Ｏ）の１つ以上によって中断又は終了させることができ；
ＴＢ及びＴＢ’はそれぞれ、存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ又はＣＨ２Ｏであり；
Ｒｘは、親油部（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン）、ビタミン（例えば、葉酸塩、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビオチン、ピリドキサール）、ペプチド、糖質（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖）、エンドソーム溶解成分、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、又はカチオン性脂質であり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃ、Ｒ７はそれぞれ、存在ごとに独立して、存在しないか、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
Figure 2021522810
 、又はヘテロシクリルであり；
Ｌ１、Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃはそれぞれ、存在ごとに独立して、糖質、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖及び多糖であり；
Ｒ’及びＲ”は、それぞれ、独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＯＨ、ＳＨ、又はＮ（ＲＮ）２であり；
ＲＮは存在ごとに独立して、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル又はベンジルであり；
Ｒａは、Ｈ又はアミノ酸側鎖であり；
Ｚ’、Ｚ”、Ｚ”’及びＺ””はそれぞれ、存在ごとに独立して、Ｏ又はＳであり；
ｐは存在ごとに独立して、０〜２０を表す。
上述されるように、リガンドが、リンカー又は担体を介してｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされ得るため、及びリンカー又は担体が、分岐リンカーを含み得るため、ｉＲＮＡ剤は、担体への同じか若しくは異なる骨格付着点を介して、又は分岐リンカーを介して、複数のリガンドを含み得る。例えば、分岐リンカーの分岐点は、二価、三価、四価、五価、若しくは六価の原子、又はそのような多価を示す基であってもよい。特定の実施形態では、分岐点は、−Ｎ、−Ｎ（Ｑ）−Ｃ、−Ｏ−Ｃ、−Ｓ−Ｃ、−ＳＳ−Ｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−Ｃ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−Ｃ、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）−Ｃ、又は−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃであり；ここで、Ｑは存在ごとに独立して、Ｈ又は任意選択で置換されるアルキルである。他の実施形態では、分岐点は、グリセロール又はグリセロール誘導体である。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
例示的なリガンドモノマー
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含む。
一部の実施形態では、両方のＬ２Ａ及びＬ２Ｂは異なる。
一部の好ましい実施形態では、両方のＬ３Ａ及びＬ３Ｂは同じである。
一部の実施形態では、両方のＬ３Ａ及びＬ３Ｂは異なる。
一部の好ましい実施形態では、両方のＬ４Ａ及びＬ４Ｂは同じである。
一部の実施形態では、両方のＬ４Ａ及びＬ４Ｂは異なる。
一部の好ましい実施形態では、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃは全て同じである。
一部の実施形態では、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃのうちの２つが同じである。
一部の実施形態では、Ｌ５Ａ及びＬ５Ｂは同じである。
一部の実施形態では、Ｌ５Ａ及びＬ５Ｃは同じである。
一部の実施形態では、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃは同じである。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含み、式中、Ｙは、Ｏ又はＳであり、ｎは、１〜６である。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含み、式中、Ｙは、Ｏ又はＳであり、ｎは、１〜６であり、Ｒは、水素又は核酸であり、Ｒ’は核酸である。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含み、式中、Ｙは、Ｏ又はＳであり、ｎは、１〜６である。
特定の実施形態では、限定されるものではないが、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤を含む、本明細書に記載されるオリゴマー化合物は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含み、式中、Ｙは、Ｏ又はＳであり、ｎは、２〜６であり、ｘは、１〜６であり、Ａは、Ｈ又はリン酸塩結合である。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 の少なくとも１、２、３又は４つのモノマーを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含み、式中、Ｘは、Ｏ又はＳである。
特定の実施形態では、限定されるものではないが、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤を含む、本明細書に記載されるオリゴマー化合物は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含み、式中、ｘは、１〜１２である。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含み、式中、Ｒは、ＯＨ又はＮＨＣＯＣＨ３である。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含み、式中、Ｒは、ＯＨ又はＮＨＣＯＣＨ３である。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含み、式中、Ｒは、Ｏ又はＳである。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含み、式中、Ｒは、ＯＨ又はＮＨＣＯＣＨ３である。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含み、式中、Ｒは、ＯＨ又はＮＨＣＯＣＨ３である。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含み、式中、Ｒは、ＯＨ又はＮＨＣＯＣＨ３である。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含み、式中、Ｒは、ＯＨ又はＮＨＣＯＣＨ３である。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含み、式中、Ｒは、ＯＨ又はＮＨＣＯＣＨ３である。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含む。
上述したモノマーにおいて、Ｘ及びＹはそれぞれ、存在ごとに独立して、Ｈ、保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体担体、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−ヌクレオシド、−Ｐ（Ｚ’）（Ｚ”）Ｏ−オリゴヌクレオチド、脂質、ＰＥＧ、ステロイド、ポリマー、ヌクレオチド、ヌクレオシド、又はオリゴヌクレオチドであり；Ｚ’及びＺ”はそれぞれ、存在ごとに独立して、Ｏ又はＳである。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドにコンジュゲートされる。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のリガンドを含む。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、構造：
Figure 2021522810
 のモノマーを含む。上述したリガンド及びモノマーの合成は、例えば、参照により全内容が本明細書に組み入れられる、米国特許第８，１０６，０２２号明細書に記載されている。
候補のｉＲＮＡの評価
作用剤又は修飾分子及び対照分子を、適切な条件に曝し、選択された特性の存在を評価することによって、選択された特性について、候補のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ＲＮＡを評価することができる。例えば、分解剤に対する耐性が、以下のように評価され得る。候補の修飾ＲＮＡ（及び対照分子、通常、非修飾形態）が、分解条件に曝され、例えば、分解剤、例えば、ヌクレアーゼを含む環境に曝され得る。例えば、生体サンプル、例えば、治療的使用の際に直面し得る環境、例えば、血液又は細胞分画に類似したもの、例えば、無細胞のホモジネート又は破壊細胞を使用することができる。次に、候補及び対照は、いくつかの手法のいずれかによって、分解に対する耐性について評価され得る。例えば、候補及び対照は、例えば、放射性若しくは酵素標識、又は蛍光標識、例えば、Ｃｙ３又はＣｙ５による暴露の前に標識され得る。対照及び修飾ＲＮＡは、分解剤、及び任意選択で、対照、例えば、不活性化、例えば、熱で不活性化された分解剤と共にインキュベートされ得る。次に、修飾及び対照分子の物理的パラメータ、例えば、サイズが決定される。それらは、物理的方法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はサイジングカラム（ｓｉｚｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ）によって、分子がその元の長さを維持しているかどうかを評価するために決定され、又は機能的に評価され得る。或いは、ノーザンブロット分析が、標識されていない修飾分子の長さをアッセイするのに使用され得る。
機能的アッセイも、候補の作用剤を評価するのに使用され得る。機能的アッセイは、最初に適用されるか又は前の非機能的アッセイ（例えば、分解に対する耐性のためのアッセイ）の後に適用されて、修飾が、遺伝子発現をサイレンシングする分子の能力を改変するかどうかを決定することができる。例えば、細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、マウス又はヒト細胞が、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰを発現するプラスミド、及び蛍光タンパク質をコードする転写物と相同な候補のＲＮＡ剤と共トランスフェクトされ得る（例えば、国際公開第００／４４９１４号パンフレットを参照されたい）。例えば、ＧＦＰ ｍＲＮＡと相同な修飾ｄｓｉＲＮＡが、対照細胞と比較した、細胞の蛍光の減少について監視することによって、ＧＦＰ発現を阻害する能力についてアッセイされ得、ここで、トランスフェクションは、候補のｄｓｉＲＮＡ、例えば、作用剤が加えられていない対照及び／又は非修飾ＲＮＡが加えられた対照を含んでいなかった。遺伝子発現に対する候補の作用剤の有効性は、修飾及び非修飾ｄｓｓｉＲＮＡ化合物の存在下で細胞の蛍光を比較することによって評価され得る。
代替的な機能性アッセイにおいて、内因性マウス遺伝子、例えば、母方で発現した遺伝子、例えばｃ−ｍｏｓと相同な候補のｄｓｓｉＲＮＡ化合物が、ｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子発現を阻害する作用剤の能力を評価するために、未熟マウス卵母細胞に注入され得る（例えば、国際公開第０１／３６６４６号パンフレットを参照されたい）。卵母細胞の表現型、例えば、分裂中期ＩＩにおいて停止を維持する能力は、作用剤が発現を阻害している指標として監視され得る。例えば、ｄｓｓｉＲＮＡ化合物によるｃ−ｍｏｓ ｍＲＮＡの切断によって、卵母細胞は、分裂中期停止を終了し、単為発生を開始する（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３７０：６５−６８，１９９４；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３７０：６８−７１，１９９４）。標的ＲＮＡレベルに対する修飾作用剤の効果を、ノーザンブロットによって検証して、陰性対照と比較して、標的ｍＲＮＡのレベルの低下についてアッセイするか、又はウエスタンブロットによって検証して、標的タンパク質のレベルの低下をアッセイすることができる。対照は、作用剤が加えられていない細胞及び／又は非修飾ＲＮＡが加えられた細胞を含み得る。
生理学的効果
本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ化合物は、治療毒性の決定が、ヒト及び非ヒト動物配列の両方に対する、ｓｉＲＮＡの相補性によって容易になるように設計され得る。これらの方法によって、ｓｉＲＮＡは、ヒトからの核酸配列及び少なくとも１つの非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物、例えば、げっ歯類、反すう動物又は霊長類からの核酸配列に完全に相補的な配列からなり得る。例えば、非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、サル、ボノボ（Ｐａｎ ｐａｎｉｓｃｕｓ）、チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔｏ）、又はカニクイザルであり得る。ｓｉＲＮＡ化合物の配列が、非ヒト哺乳動物及びヒトの相同の遺伝子、例えば、癌遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子内の配列に相補的であり得る。非ヒト哺乳動物におけるｓｉＲＮＡ化合物の毒性を決定することによって、ヒトにおけるｓｉＲＮＡ化合物の毒性を推定することができる。より厳しい毒性試験について、ｓｉＲＮＡは、ヒト及び２つ以上、例えば、２つ又は３つ以上の非ヒト動物に相補的であり得る。
本明細書に記載される方法は、ヒトに対するｓｉＲＮＡ化合物の任意の生理学的効果、例えば、毒性作用などの任意の望ましくない効果、又は任意のプラス効果、又は所望の効果を関連付けるのに使用され得る。
ｓｉＲＮＡの細胞取り込みの増加
細胞取り込みを増加させる共有結合されたコンジュゲートを含む様々なｓｉＲＮＡ組成物及び／又はｓｉＲＮＡの細胞内標的化が、本明細書に記載される。
細胞へのｓｉＲＮＡの取り込みに影響を与えるｓｉＲＮＡ化合物及び薬物を投与するステップを含む本発明の方法がさらに提供される。薬物は、ｓｉＲＮＡ化合物が投与される前、後、又は同じ時点で投与され得る。薬物は、ｓｉＲＮＡ化合物に共有結合又は非共有結合され得る。薬物は、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化因子、又はＮＦ−κＢの活性化因子であり得る。薬物は、細胞に一時的な影響を及ぼし得る。薬物は、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、及び／又は中間径フィラメントを破壊することによって、細胞へのｓｉＲＮＡ化合物の取り込みを増加させることができる。薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトルンクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、又はミオセルビンであり得る。薬物はまた、例えば、炎症反応を活性化することによって、所与の細胞又は組織へのｓｉＲＮＡ化合物の取り込みを増加させることができる。このような効果を有し得る例示的な薬物としては、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β、ＣｐＧモチーフ、γインターフェロン又はより一般的にｔｏｌｌ様受容体を活性化する作用剤が挙げられる。
ｓｉＲＮＡ産生
ｓｉＲＮＡは、様々な方法によって、例えば、大量に産生され得る。例示的な方法としては、有機合成及びＲＮＡ切断、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断が挙げられる。
有機合成。ｓｉＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ分子、又は二本鎖ＲＮＡ分子の各それぞれの鎖を別々に合成することによって作製され得、その後、構成鎖をアニールすることができる。
大型生物反応器、例えば、ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ ＩＩ ｆｒｏｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ Ｓｗｅｄｅｎ）が、所与のｓｉＲＮＡのための大量の特定のＲＮＡ鎖を産生するのに使用され得る。ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔＩＩ反応器は、１．５モル過剰のみのホスホラミダイトヌクレオチドを用いてヌクレオチドを効率的にカップリングすることができる。ＲＮＡ鎖を作製するために、リボヌクレオチドアミダイトが使用される。ｓｉＲＮＡのための２１〜２３ヌクレオチド鎖を合成するために、モノマー添加の標準的なサイクルが使用され得る。典型的に、２つの相補鎖が、別々に産生され、次に、例えば、固体担体からの放出及び脱保護の後にアニールされる。
別個のｓｉＲＮＡ種を産生するために、有機合成が使用され得る。特定の標的遺伝子に対する種の相補性は、正確に指定され得る。例えば、種は、多型、例えば、一塩基ヌクレオチド多型を含む領域に相補的であり得る。さらに、多型の位置は、正確に規定され得る。一部の実施形態では、多型は、内部領域、例えば、末端の一方又は両方から少なくとも４、５、７、又は９ヌクレオチドに位置する。
ｄｓｉＲＮＡ切断。ｓｉＲＮＡはまた、より大きいｓｉＲＮＡを切断することによって作製され得る。切断は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで媒介され得る。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの切断によってｉＲＮＡを産生するために、以下の方法が使用され得る。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写。ｄｓｉＲＮＡは、両方の方向に核酸（ＤＮＡ）セグメントを転写することによって産生される。例えば、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）ＲＮＡｉ転写キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）は、ｐベクター及びＴ７プロモーターによっていずれの側にも隣接する位置においてベクターにクローン化される核酸セグメントのためにｄｓｉＲＮＡを産生するための方法を提供する。別々の鋳型が、ｄｓｉＲＮＡのための２つの相補鎖のＴ７転写のために生成される。鋳型は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの添加によってｉｎ ｖｉｔｒｏで転写され、ｄｓｉＲＮＡが産生される。ＰＣＲ及び／又は他のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３若しくはＳＰ６ポリメラーゼ）を用いた同様の方法も、組み換え酵素の調製物を汚染し得る内毒素である可能性がある。
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ切断。ｄｓｉＲＮＡは、例えば、Ｄｉｃｅｒ又は同等のＲＮＡｓｅ ＩＩＩベースの活性を用いて、ｓｉＲＮＡにｉｎ ｖｉｔｒｏで切断される。例えば、ｄｓｉＲＮＡは、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）からのｉｎ ｖｉｔｒｏ抽出物中で又は精製された成分、例えば、精製されたＲＮＡｓｅ又はＲＩＳＣ複合体（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）を用いてインキュベートされ得る。例えば、Ｋｅｔｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２００１ Ｏｃｔ １５；１５（２０）：２６５４−９、及びＨａｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１ Ａｕｇ １０；２９３（５５３２）：１１４６−５０を参照されたい。
ｄｓｉＲＮＡ切断は、一般に、複数のｓｉＲＮＡ種を産生し、それぞれは、元のｄｓｉＲＮＡ分子の特定の２１〜２３ｎｔ断片である。例えば、元のｄｓｉＲＮＡ分子の重複領域及び隣接領域に相補的な配列を含むｓｉＲＮＡが存在し得る。
合成の方法にかかわらず、ｓｉＲＮＡ調製物は、製剤に適切な溶液（例えば、水溶液及び／又は有機溶液）中で調製され得る。例えば、ｓｉＲＮＡ調製物は、純粋な２回蒸留水中で沈殿及び再溶解され、凍結乾燥され得る。次に、乾燥ｓｉＲＮＡは、目的とする製剤化プロセスに適切な溶液中で再懸濁され得る。
親油性部分にコンジュゲートされた二本鎖ｉＲＮＡ剤の作製
一部の実施形態では、親油性部分は、核酸塩基、糖部分、又はヌクレオシド間結合を介して、二本鎖ｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされる。
プリン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーションは、環内原子及び環外原子を含む任意の位置に生じ得る。一部の実施形態では、プリン核酸塩基の２位、６位、７位、又は８位が、コンジュゲート部分に結合される。ピリミジン核酸塩基又はその誘導体へのコンジュゲーションは、任意の位置に生じ得る。一部の実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２位、５位、及び６位が、コンジュゲート部分で置換され得る。親油性部分が、核酸塩基にコンジュゲートされる場合、好ましい位置は、ハイブリダイゼーションを妨げない位置、即ち、塩基対合に必要な水素結合相互作用を妨げない位置である。一実施形態では、親油性部分は、アルキル、アルケニル又はアミド結合を含むリンカーを介して、核酸塩基にコンジュゲートされ得る。核酸塩基への親油性部分の例示的なコンジュゲーションが、図１及び実施例７に示される。
ヌクレオシドの糖部分へのコンジュゲーションは、任意の炭素原子に生じ得る。親油性部分が結合され得る糖部分の例示的な炭素原子としては、２’、３’、及び５’炭素原子が挙げられる。親油性部分はまた、脱塩基残基などにおける、１’位に結合され得る。一実施形態では、親油性部分は、リンカーを用いて又は用いずに、２’−Ｏ修飾を介して、糖部分にコンジュゲートされ得る。（２’−Ｏ修飾を介した）糖部分への親油性部分の例示的なコンジュゲーションが、図１及び実施例１、２、３、及び６に示される。
ヌクレオシド間結合も、親油性部分も有し得る。リン含有結合（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏｔａｔｅ）、ホスホロアミデートなど）の場合、親油性部分は、リン原子に直接結合されるか、又はリン原子に結合されたＯ、Ｎ、若しくはＳ原子に結合され得る。アミン又はアミドを含有するヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）の場合、親油性部分は、アミン若しくはアミドの窒素原子に、又は隣接する炭素原子に結合され得る。
オリゴヌクレオチドのコンジュゲートを調製するための多くの方法がある。一般に、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの反応性基（例えば、ＯＨ、ＳＨ、アミン、カルボキシル、アルデヒドなど）をコンジュゲート部分の反応性基と接触させることによって、コンジュゲート部分に結合される。一部の実施形態では、一方の反応性基が求電子性であり、他方が求核性である。
例えば、求電子基は、カルボニル含有官能基であってよく、求核基は、アミン又はチオールであり得る。連結基を用いる及び用いない核酸及び関連オリゴマー化合物のコンジュゲーションのための方法は、例えば、参照により全内容が本明細書に組み入れられる、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ ａｎｄ ＬｅＢｌｅｕ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９９３，Ｃｈａｐｔｅｒ １７などの文献に十分に記載されている。
一実施形態では、第１の（相補的）ＲＮＡ鎖及び第２の（センス）ＲＮＡ鎖が、別々に合成され得、ＲＮＡ鎖の一方が、ペンダント親油性部分を含み、第１及び第２のＲＮＡ鎖が、混合されて、ｄｓＲＮＡを形成し得る。ＲＮＡ鎖を合成するステップは、好ましくは、固相合成を含み、ここで、個々のヌクレオチドが、連続した合成サイクルにおいて、ヌクレオチド間３’−５’ホスホジエステル結合の形成によって、末端間で結合される。
一実施形態では、ホスホラミダイト基を有する親油性分子が、最後の合成サイクルにおいて、第１の（相補的）又は第２の（センス）ＲＮＡ鎖のいずれかの３’末端又は５’末端に結合される。ＲＮＡの固相合成において、ヌクレオチドは、最初は、ヌクレオシドホスホラミダイトの形態である。各合成サイクルにおいて、さらなるヌクレオシドホスホラミダイトが、予め組み込まれたヌクレオチドの−ＯＨ基に連結される。親油性分子が、ホスホラミダイト基を有する場合、それは、ヌクレオシドホスホラミダイトと同様の方法で、固相合成において予め合成されたＲＮＡの遊離ＯＨ末端に結合され得る。合成は、従来のＲＮＡ合成装置を用いて、自動化及び標準化された方法で行われ得る。ホスホラミダイト基を有する親油性分子の合成は、ホスホラミダイト基を生成するための遊離ヒドロキシルのホスフィチル化を含み得る。
親油性部分がコンジュゲートしたホスホラミダイトの合成手順が、実施例１、２、４、５、６、及び７に例示されている。親油性部分又は他のリガンドの合成後コンジュゲーションの手順の例が、実施例３に示されている。
一般に、オリゴヌクレオチドは、例えば、参照によりそれぞれの全内容が本明細書に組み入れられる、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９２）２１１：３−１９；国際公開第９９／５４４５９号パンフレット；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９５）２３：２６７７−２６８４；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，（１９９７）７４：５９；Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９９８）６１：３３−４５；及び米国特許第６，００１，３１１号明細書に記載されるように、当分野で公知のプロトコルを用いて合成され得る。一般に、オリゴヌクレオチドの合成は、５’末端におけるジメトキシトリチル、及び３’末端におけるホスホラミダイトなどの従来の核酸保護及びカップリング基を必要とする。非限定的な例において、小規模の合成が、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｓｈｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．）によって販売されるリボヌクレオシドホスホラミダイトを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって販売されるＥｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９ ＲＮＡ合成装置において行われる。或いは、合成は、Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）によって製造される機器などの９６ウェルプレート合成装置において、又は参照によりそれぞれの全内容が本明細書に組み入れられる、Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８７）１０９：７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０）１８：５４３３；Ｗｉｎｃｏｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０）２３：２６７７−２６８４；及びＷｉｎｃｏｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．（１９９７）７４：５９に記載されるものなどの方法によって行われ得る。
本発明の核酸分子は、別々に合成され、例えば、ライゲーションによって（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：９９２３；国際公開第９３／２３５６９号パンフレット；Ｓｈａｂａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９：４２４７；Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９９７）１６：９５１；Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（１９９７）８：２０４；又は合成及び／又は脱保護の後のハイブリダイゼーションによって、合成後に互いに結合され得る。核酸分子は、従来の方法を用いたゲル電気泳動によって精製され得、又は高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；参照により全内容が本明細書に組み入れられる、Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．、上記を参照されたい）によって精製され得、水中で再懸濁され得る。
医薬組成物
一態様では、本発明は、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物へとプロセシングされ得る、より大きいｓｉＲＮＡ化合物、又は標的ＲＮＡに相補的な、例えば、実質的に及び／又は正確に相補的なヌクレオチド配列を含む、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物、又はその前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。標的ＲＮＡは、内因性ヒト遺伝子の転写物であり得る。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物は、（ａ）１９〜２５ヌクレオチド長、例えば、２１〜２３ヌクレオチド長であり、（ｂ）内因性標的ＲＮＡに相補的であり、且つ、任意選択で、（ｃ）１〜５ｎｔ長の少なくとも１つの３’オーバーハングを含む。一実施形態では、医薬組成物は、エマルション、マイクロエマルション、クリーム、ゼリー、又はリポソームであり得る。
一例では、医薬組成物は、局所送達剤と混合されたｓｉＲＮＡ化合物を含む。局所送達剤は、複数の微細小胞であり得る。微細小胞は、リポソームであり得る。一部の実施形態では、リポソームは、カチオン性リポソームである。
別の態様では、医薬組成物は、局所浸透促進剤と混合された、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物へとプロセシングされ得る、より大きいｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物、又はその前駆体をコードするＤＮＡ）を含む。一実施形態では、局所浸透促進剤は、脂肪酸である。脂肪酸は、アラキドン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、若しくはＣ１〜１０アルキルエステル、モノグリセリド、ジグリセリド又はそれらの薬学的に許容される塩であり得る。
別の実施形態では、局所浸透促進剤は、胆汁酸塩である。胆汁酸塩は、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル又はそれらの薬学的に許容される塩であり得る。
別の実施形態では、浸透促進剤は、キレート剤である。キレート剤は、ＥＤＴＡ、クエン酸、サリチレート、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、β−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体又はそれらの混合物であり得る。
別の実施形態では、浸透促進剤は、界面活性剤、例えば、イオン性又は非イオン性界面活性剤である。界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル、ペルフルオロケミカルエマルション又はそれらの混合物であり得る。
別の実施形態では、浸透促進剤は、不飽和環状尿素、１−アルキル−アルコン、１−アルケニルアザシクロ−アラカノン、ステロイド性抗炎症薬及びそれらの混合物からなる群から選択され得る。さらに別の実施形態では、浸透促進剤は、グリコール、ピロール、アゾン、又はテルペンであり得る。
一態様では、本発明は、経口送達に適した形態で、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物へとプロセシングされ得る、より大きいｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物、又はその前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、経口送達は、ｓｉＲＮＡ化合物組成物を、胃腸管、例えば、小腸、結腸（例えば、結腸癌を治療するために）などの細胞又は領域に送達するために使用され得る。経口送達形態は、錠剤、カプセル又はゲルカプセルであり得る。一実施形態では、医薬組成物のｓｉＲＮＡ化合物は、細胞接着タンパク質の発現を調節し、細胞増殖速度を調節し、又は真核病原体若しくはレトロウイルスに対する生物活性を有する。別の実施形態では、医薬組成物は、哺乳動物の胃において錠剤、カプセル又はゲルカプセルの溶解を実質的に防止する腸溶材料を含む。一部の実施形態では、腸溶材料は、コーティングである。コーティングは、酢酸フタル酸、プロピレングリコール、モノオレイン酸ソルビタン、トリメリト酸酢酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート又は酢酸フタル酸セルロースであり得る。
別の実施形態では、医薬組成物の経口剤形は、浸透促進剤を含む。浸透促進剤は、胆汁酸塩又は脂肪酸であり得る。胆汁酸塩はまた、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、及びそれらの塩であり得る。脂肪酸は、カプリン酸、ラウリン酸、及びそれらの塩であり得る。
別の実施形態では、医薬組成物の経口剤形は、賦形剤を含む。一例では、賦形剤は、ポリエチレングリコールである。別の例では、賦形剤は、プレシロールである。
別の実施形態では、医薬組成物の経口剤形は、可塑剤を含む。可塑剤は、フタル酸ジエチル、セバシン酸トリアセチンジブチル、フタル酸ジブチル又はクエン酸トリエチルであり得る。
一態様では、本発明は、ｓｉＲＮＡ化合物及び送達ビヒクルを含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物は、（ａ）１９〜２５ヌクレオチド長、例えば、２１〜２３ヌクレオチドであり、（ｂ）内因性標的ＲＮＡに相補的であり、且つ、任意選択で、（ｃ）１〜５ヌクレオチド長の少なくとも１つの３’オーバーハングを含む。
一実施形態では、送達ビヒクルは、局所投与経路によって、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物へとプロセシングされ得る、より大きいｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物、又はその前駆体をコードするＤＮＡ）を細胞に送達することができる。送達ビヒクルは、微細小胞であり得る。一例では、微細小胞は、リポソームである。一部の実施形態では、リポソームは、カチオン性リポソームである。別の例では、微細小胞は、ミセルである。一態様では、本発明は、注射可能な剤形で、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物へとプロセシングされ得る、より大きいｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物、又はその前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、医薬組成物の注射可能な剤形は、滅菌水溶液又は分散液及び滅菌粉末を含む。一部の実施形態では、滅菌溶液は、水；生理食塩溶液；固定油、ポリエチレングリコール、グリセロール、又はプロピレングリコールなどの希釈剤を含み得る。
一態様では、本発明は、経口剤形で、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物へとプロセシングされ得る、より大きいｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物、又はその前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、経口剤形は、錠剤、カプセル及びゲルカプセルからなる群から選択される。別の実施形態では、医薬組成物は、哺乳動物の胃において錠剤、カプセル又はゲルカプセルの溶解を実質的に防止する腸溶材料を含む。一部の実施形態では、腸溶材料は、コーティングである。コーティングは、酢酸フタル酸、プロピレングリコール、モノオレイン酸ソルビタン、トリメリト酸酢酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート又は酢酸フタル酸セルロースであり得る。一実施形態では、医薬組成物の経口剤形は、浸透促進剤、例えば、本明細書に記載される浸透促進剤を含む。
別の実施形態では、医薬組成物の経口剤形は、賦形剤を含む。一例では、賦形剤は、ポリエチレングリコールである。別の例では、賦形剤は、プレシロールである。
別の実施形態では、医薬組成物の経口剤形は、可塑剤を含む。可塑剤は、フタル酸ジエチル、トリアセチンセバシン酸ジブチル、フタル酸ジブチル又はクエン酸トリエチルであり得る。
一態様では、本発明は、経直腸剤形で、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物へとプロセシングされ得る、より大きいｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物、又はその前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、経直腸剤形は、かん腸剤である。別の実施形態では、経直腸剤形は、坐剤である。
一態様では、本発明は、経膣剤形で、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物へとプロセシングされ得る、より大きいｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物、又はその前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、経膣剤形は、坐剤である。別の実施形態では、経膣剤形は、フォーム、クリーム、又はゲルである。
一態様では、本発明は、経肺又は経鼻剤形で、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物へとプロセシングされ得る、より大きいｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物、又はその前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物は、粒子、例えば、マクロ粒子、例えば、マイクロスフェアに組み込まれる。粒子は、噴霧乾燥、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、又はそれらの組み合わせによって生成され得る。マイクロスフェアは、懸濁液、粉末、又は埋め込み可能な固体として製剤化され得る。
治療方法及び送達経路
本発明の別の態様は、細胞内での標的遺伝子の発現を低下させる方法であって、前記細胞を、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤と接触させるステップを含む、方法に関する。一実施形態では、細胞は、肝臓外細胞である。
本発明の別の態様は、対象における標的遺伝子の発現を低下させる方法であって、本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤を対象に投与するステップを含む、方法に関する。
本発明の別の態様は、中枢神経系疾患に罹患している対象を治療する方法であって、治療有効量の本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤を対象に投与し、それによって、対象を治療するステップを含む、方法に関する。本発明の方法によって治療され得る例示的な中枢神経系疾患としては、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭認知症、ハンチントン病、パーキンソン病、脊髄小脳失調、プリオン病、及びラフォラ病が挙げられる。
本発明の二本鎖ｉＲＮＡ剤は、標的とされる遺伝子のタイプ及び治療される疾患のタイプに応じて、様々な経路によって、対象に送達され得る。一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、眼内投与（例えば、硝子体内投与）又は髄腔内投与などのように、肝臓外で投与される。
一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、髄腔内に投与される。二本鎖ｉＲＮＡ剤の髄腔内投与によって、本方法は、脳又は脊椎組織、例えば、大脳皮質、小脳、頚椎、腰椎、及び胸椎における標的遺伝子の発現を低下させることができる。
一部の実施形態では、例示的な標的遺伝子は、ＡＰＰ、ＡＴＸＮ２、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＴＡＲＤＢＰ、ＭＡＰＴ（タウ）、ＨＴＴ、ＳＮＣＡ、ＦＵＳ、ＡＴＸＮ３、ＡＴＸＮ１、ＳＣＡ１、ＳＣＡ７、ＳＣＡ８、ＭｅＣＰ２、ＰＲＮＰ、ＳＯＤ１、ＤＭＰＫ、及びＴＴＲである。対象におけるこれらの標的遺伝子の発現を低下させるために、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、硝子体内に投与され得る。二本鎖ｉＲＮＡ剤の硝子体内投与によって、本方法は、眼組織における標的遺伝子の発現を低下させることができる。
説明を簡単にするために、この項の製剤、組成物及び方法は、主に、修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して説明される。しかしながら、これらの製剤、組成物及び方法は、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、非修飾ｓｉＲＮＡ化合物で実施することができ、このような実施は本発明の範囲内であることが理解され得る。ｉＲＮＡを含む組成物は、様々な経路によって、対象に送達され得る。例示的な経路としては、静脈内、局所、経直腸、経肛門、経膣、経鼻、経肺、眼内が挙げられる。
本発明のｉＲＮＡ分子は、投与に適した医薬組成物に含めることができる。このような組成物は、典型的には、１種以上のｉＲＮＡおよび薬学的に許容され得る担体を含む。本明細書で使用される「薬学的に許容され得る担体」という語は、医薬品投与に適合したあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などを含むものとする。薬学的に活性な物質用のこのような媒体および作用剤の使用は、当分野で周知である。あらゆる従来の媒体または作用剤が活性化合物と適合性でない場合を除き、その組成物中での使用が想定される。補助活性化合物を組成物に含めても良い。
本発明の医薬組成物は、局所治療または全身治療が望ましいか否か、および治療される領域に基づいて様々な方式で投与することができる。投与は、局所（眼、膣、直腸、鼻、経皮を含む）、経口、または非経口とすることができる。非経口投与としては、点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射、または気管支内もしくは脳室内投与が挙げられる。
投与の経路および部位は、標的化を強めるために選択することができる。例えば、筋細胞を標的とするためには、目的の筋肉内への筋肉注射は、論理的な選択であろう。肺細胞は、ｉＲＮＡを噴霧形態で投与することによって標的とすることができる。血管内皮細胞は、バルーンカテーテルをｉＲＮＡでコーティングして、ＤＮＡを機械的に導入することによって標的とすることができる。
局所投与用の製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴、坐剤、スプレー、液体及び粉末が挙げられる。従来の医薬担体、水性基剤、粉末状基剤又は油性基剤、増粘剤などが必要であるか又は望ましいことがある。被覆されたコンドーム、手袋なども有用であり得る。
経口投与用の組成物としては、粉末若しくは顆粒、水中の懸濁液若しくは溶液、シロップ、エリキシル剤又は非水性溶媒、錠剤、カプセル、舐剤、又はトローチが挙げられる。錠剤の場合、使用され得る担体としては、ラクトース、クエン酸ナトリウム及びリン酸塩が挙げられる。デンプンなどの様々な崩壊剤、並びにステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルクなどの潤滑剤が、一般的に錠剤に使用される。カプセル形態での経口投与のために、有用な希釈剤は、ラクトース及び高分子量ポリエチレングリコールである。水性懸濁液が経口使用に必要とされる場合、核酸組成物は、乳化剤及び懸濁化剤と組み合わされ得る。必要に応じて、特定の甘味剤及び／又は着香剤が添加され得る。
髄腔内又は脳室内投与用の組成物は、緩衝剤、希釈剤及び他の適切な添加剤も含み得る滅菌水溶液を含み得る。
非経口投与用の製剤は、緩衝剤、希釈剤及び他の適切な添加剤も含み得る滅菌水溶液を含み得る。脳室内注入は、例えば、リザーバに取り付けられた脳室内カテーテルによって促進され得る。静脈内使用のために、溶質の総濃度は、調製物を等張性にするように制御され得る。
眼内投与のために、軟膏又は点滴液体が、アプリケータ又は点眼器などの、当分野で公知の眼内送達システムによって送達され得る。このような組成物は、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はポリ（ビニルアルコール）などの粘液模倣物、ソルビン酸、ＥＤＴＡ又は塩化ベンジルクロム（ｂｅｎｚｙｌｃｈｒｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）などの防腐剤、並びに通常の量の希釈剤及び／又は担体を含み得る。
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物、組成物の投与は、非経口、例えば、静脈内（例えば、ボーラスとして又は拡散注入として）、皮内、腹腔内、筋肉内、髄腔内、脳室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、頬側、舌下、内視鏡、直腸、経口、膣、局所、肺、鼻、尿道又は眼内である。投与は、対象によって、又は別の人間、例えば、医療提供者によって行うことができる。薬物治療は、測定した用量で、又は測定した用量を送達するディスペンサーで行うことができる。選択される送達方式は、以下に詳細に説明される。
髄腔内投与。一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、髄腔内注入（即ち、脳及び脊髄組織を浸している髄液への注入）によって送達される。髄液へのｉＲＮＡ剤の髄腔内注入は、ボーラス注入法として又は皮膚の下に埋め込まれ得るミニポンプによって行うことができ、髄液へのｓｉＲＮＡの規則的な及び定量の送達を提供する。髄液が産生される脈絡叢からの髄液は、脊髄及び後根神経節の周りに下り、続いて小脳を通り過ぎて上り、大脳皮質にわたって、くも膜顆粒へと循環し、ここで、髄液は中枢神経系を出ることができ、注入される化合物のサイズ、安定性、及び溶解度に応じて、髄腔内に送達される分子が、中枢神経系全体にわたって標的に到達し得る。
一部の実施形態では、髄腔内投与は、ポンプを用いたものである。ポンプは、外科的に埋め込まれた浸透圧ポンプであり得る。一実施形態では、浸透圧ポンプは、髄腔内投与を容易にするために、脊柱管のくも膜下腔に埋め込まれる。
一部の実施形態では、髄腔内投与は、薬剤の体積を含むリザーバを含む、薬剤のための髄腔内送達系、及びリザーバに含まれる薬剤の分量を送達するように構成されたポンプを用いたものである。この髄腔内送達系についてのさらなる詳細は、参照により全内容が組み入れられる、２０１５年１月２８日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１３２５３号明細書に見出され得る。
髄腔内に注入されるｉＲＮＡ剤の量は、１つの標的遺伝子と別の標的遺伝子とで異なり得、適用される必要のある適切な量は、各標的遺伝子について個別に決定される必要があり得る。典型的に、この量は、１０μｇ〜２ｍｇ、好ましくは、５０μｇ〜１５００μｇ、より好ましくは、１００μｇ〜１０００μｇの範囲である。
直腸投与。本発明は、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ化合物の直腸投与又は送達のための、方法、組成物、及びキットも提供する。
したがって、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物へとプロセシングされ得る、より大きいｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物、又はその前駆体をコードするＤＮＡ）、例えば、治療有効量の、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ化合物、例えば、４０未満、及び、例えば、３０未満のヌクレオチドの二本鎖領域を有し、且つ１つ又は２つの、１〜３ヌクレオチド一本鎖３’オーバーハングを有するｓｉＲＮＡ化合物が、直腸投与され、例えば、直腸を介して下部又は上部結腸に導入され得る。この手法は、炎症性疾患、不要な細胞増殖によって特徴付けられる疾患、例えば、ポリープ、又は結腸癌の治療に特に有用である。
薬剤は、分注デバイス、例えば、薬剤の送達のための手段を含む、結腸の視診又はポリープの除去に使用されるものと同様のフレキシブルなカメラ誘導デバイスを導入することによって、結腸内の部位に送達され得る。
ｓｉＲＮＡ化合物の直腸投与は、かん腸剤を用いる。かん腸剤のｓｉＲＮＡ化合物は、生理食塩水又は緩衝液に溶解され得る。直腸投与はまた、他の成分、例えば、賦形剤、例えば、カカオ脂又はヒドロキシプロピルメチルセルロースを含み得る、坐剤を用いることができる。
眼内送達。本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤は、眼組織に投与され得る。例えば、薬剤は、眼組織又は周囲組織、例えば、眼瞼の内側の表面に適用され得る。それらは、例えば、噴霧することによって、点滴剤中で、洗眼液として、又は軟膏として、局所的に適用され得る。投与は、対象によって、又は別の人、例えば、医療提供者によって提供され得る。薬物治療は、測定した用量で、又は測定した用量を送達するディスペンサーで行うことができる。薬物治療はまた、眼内に投与することもでき、薬物を選択された範囲又は構造に導入することができる、針又は他の送達デバイスによって導入することができる。眼治療は、眼組織又は周囲組織の炎症を治療するのに特に望ましい。
特定の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、眼組織注入、例えば、周囲、結膜、テノン嚢下、前房内、硝子体内、眼内、前部若しくは後部強膜近傍（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｏｒ ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｊｕｘｔａｓｃｌｅｒａｌ）、網膜下、結膜下、眼球後、若しくは管内注入によって、眼に直接送達されるか；カテーテル又は他の留置デバイス例えば、網膜ペレット（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｅｌｌｅｔ）、眼内挿入物、坐剤又は多孔質、非多孔質、若しくはゼラチン状材料を含むインプラントを用いた、眼への直接適用によって；局所点眼剤若しくは軟膏によって；又は結膜嚢における持続放出デバイスによって送達されるか、又は強膜に隣接して（経強膜）若しくは強膜の中に（強膜内）若しくは眼内に埋め込まれ得る。前房内注入は、角膜を介して、前眼房へと行われ、薬剤を小柱網に到達させ得る。管内注入は、静脈集合路（ｖｅｎｏｕｓ ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ ｃｈａｎｎｅｌ）内へと行われ、シュレム管から又はシュレム管からへと排液することができる。
一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、眼内に、例えば、医療関係者による使用のために注射の準備が整った形態の予め充填された注射器などによる硝子体内注入によって眼の硝子体腔に投与され得る。
眼内送達のために、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、眼科学的に許容される防腐剤、共溶媒、界面活性剤、粘度向上剤、浸透促進剤、緩衝剤、塩化ナトリウム、又は水と組み合わされて、水性、滅菌眼用懸濁剤又は液剤を形成し得る。液剤は、生理学的に許容される等張性の水性緩衝液にコンジュゲートを溶解させることによって調製され得る。さらに、液剤は、二本鎖ｉＲＮＡ剤を溶解させるのを助けるために許容される界面活性剤を含み得る。ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの粘度向上剤が、二本鎖ｉＲＮＡ剤の滞留性を改善するために医薬組成物に添加され得る。
滅菌眼用軟膏製剤を調製するために、二本鎖ｉＲＮＡ剤は、適切なビヒクル、例えば、鉱油、液体ラノリン、又は白色ワセリン中で防腐剤と組み合わされる。滅菌眼用ゲル製剤は、当分野で公知の方法にしたがって、例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）−９４０（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ，Ｎ．Ｃ．）などの組み合わせから調製される親水性基剤中で二本鎖ｉＲＮＡ剤を懸濁させることによって調製され得る。
局所送達。本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ化合物はいずれも、皮膚に直接投与され得る。例えば、薬剤は、局所的に適用されるか、又は例えば、皮膚は貫通するが、例えば、下層の筋組織は貫通しないマイクロニードル又は一連のマイクロニードルの使用によって、皮膚の層に送達され得る。ｓｉＲＮＡ化合物組成物の投与は、局所的であり得る。局所適用は、例えば、対象の真皮又は表皮に組成物を送達することができる。局所投与は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴、坐剤、スプレー、液体又は粉末の形態であり得る。局所投与用の組成物は、リポソーム、ミセル、エマルション、又は他の親油性分子集合体として製剤化され得る。経皮投与は、イオントフォレーシス、フォノフォレーシス、及びソノフォレーシスなどの少なくとも１つの浸透促進剤を用いて適用され得る。
説明を簡単にするために、この項の製剤、組成物及び方法は、主に、修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して説明される。しかしながら、これらの製剤、組成物及び方法は、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、非修飾ｓｉＲＮＡ化合物で実施することができ、このような実施は本発明の範囲内であることが理解され得る。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物へとプロセシングされ得る、より大きいｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物、又はその前駆体をコードするＤＮＡ）が、局所投与によって対象に送達される。「局所投与」は、製剤を対象の表面に直接接触させることによる、対象への送達を指す。最も一般的な形態の局所送達は、皮膚への送達であるが、本明細書に開示される組成物はまた、身体の他の表面、例えば、眼、粘膜、体腔の表面又は内面に直接適用され得る。上述されるように、最も一般的な局所送達は、皮膚への送達である。この用語は、限定されるものではないが、局所及び経皮を含むいくつかの投与経路を包含する。これらの投与方法は、典型的に、皮膚の透過障壁への浸透及び標的組織又は層への効率的な送達を含む。局所投与は、表皮及び真皮に浸透し、最終的に組成物の全身送達を達成するための手段として使用され得る。局所投与は、対象の表皮若しくは真皮、又はその特定の層、又は下層組織にオリゴヌクレオチドを選択的に送達するための手段としても使用され得る。
本明細書で使用される「皮膚」という語は、動物の表皮及び／又は真皮を指す。哺乳動物の皮膚は、２つの主要な異なる層からなる。皮膚の外層は、表皮と呼ばれる。表皮は、角質層、顆粒層、有棘層、及び基底層から構成され、角質層は、皮膚の表面にあり、基底層は、表皮の最深部分にある。表皮は、身体上のその位置に応じて、５０μｍ〜０．２ｍｍの厚さである。
表皮の下には、表皮よりはるかに厚い真皮がある。真皮は、主に、繊維束の形態のコラーゲンから構成される。コラーゲン束は、とりわけ、血管、毛細リンパ管、腺、神経終末、及び免疫学的に活性な細胞に対する支持を提供する。
器官としての皮膚の主要な機能のうちの１つは、体内に物質が入ることを制御することである。皮膚の主要な透過障壁は、分化の様々な状態で細胞の多くの層から形成される角質層によって提供される。角質層層中の細胞間の空間は、皮膚の透過障壁をさらに強化するための密閉を提供する、格子状の構造に配列された異なる脂質で充填される。
皮膚によって提供される透過障壁は、約７５０Ｄａを超える分子量を有する分子に概して不浸透性であるような障壁である。より大きい分子が皮膚の透過障壁を通過するために、通常の浸透作用以外の機構が使用されなければならない。
いくつかの要因が、投与された作用剤に対する皮膚の透過性を決定する。これらの要因としては、治療された皮膚の特徴、送達剤の特徴、薬物と送達剤との間及び薬物と皮膚との間の両方の相互作用、適用される薬物の投与量、治療形態、及び治療後レジメンが挙げられる。表皮及び真皮を選択的に標的化するために、予め選択された層に対する薬物の浸透を可能にする１つ以上の浸透促進剤を含む組成物を製剤化することが可能である場合がある。
経皮送達は、脂溶性治療薬の投与に有益な経路である。真皮は、表皮より透過性であり、したがって、吸収は、擦りむいた皮膚、火傷した皮膚、又は剥離された皮膚を通じてはるかに急速である。炎症及び皮膚への血流量を増加させる他の生理学的条件もまた、経皮吸収を促進する。この経路を介した吸収は、油性媒体（塗擦）の使用によって、又は１つ以上の浸透促進剤の使用によって促進され得る。経皮経路を介して本明細書に開示される組成物を送達する他の有効な方法としては、皮膚の水和及び制御放出局所パッチの使用が挙げられる。経皮経路は、全身及び／又は局所療法のために本明細書に開示される組成物を送達するための潜在的に有効な手段を提供する。
さらに、イオントフォレーシス（電場の影響下での生体膜を通じたイオン性溶質の輸送）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．１６３）、フォノフォレーシス又はソノフォレーシス（生体膜特に皮膚及び角膜にわたる様々な治療剤の吸収を促進するための超音波の使用）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．１６６）、及び投与部位における用量状態及び滞留性に対する媒体特徴の最適化（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．１６８）が、皮膚及び粘膜部にわたる局所的に適用される組成物の輸送を促進するための有用な方法であり得る。
提供される組成物及び方法はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養又は保存真皮組織中で、及び動物において、様々なタンパク質及び遺伝子の機能を調べるために使用され得る。したがって、本発明は、任意の遺伝子の機能を調べるために適用され得る。本発明の方法はまた、治療的又は予防的に使用され得る。例えば、乾癬、扁平苔癬、中毒性表皮壊死症、多形性紅斑、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、悪性黒色腫、パジェット病、カポジ肉腫、肺線維症、ライム病並びに皮膚のウイルス感染、真菌感染、及び細菌感染などの疾病に罹患していることが既知であるか、又はその疑いがある動物の治療に使用され得る。
経肺送達。本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ化合物はいずれも、肺系統に投与され得る。経肺投与は、吸入によって、又は肺系統への送達デバイスの導入によって、例えば、薬剤を分注し得る送達デバイスの導入によって達成され得る。特定の実施形態は、吸入による経肺送達の方法を使用し得る。薬剤は、例えば、湿潤又は乾燥した薬剤を送達するディスペンサーで、それが吸入され得るのに十分に小さい形態で提供され得る。デバイスは、測定した用量の薬剤を送達し得る。対象、又は別の人間が、薬剤を投与することができる。経肺送達は、肺組織を直接侵す疾患だけでなく、他の組織を侵す疾患にも有効である。ｓｉＲＮＡ化合物は、経肺送達のための液体又は非液体、例えば、粉末、結晶、又はエアロゾルとして製剤化され得る。
説明を簡単にするために、この項の製剤、組成物及び方法は、主に、修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して説明される。しかしながら、これらの製剤、組成物及び方法は、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、非修飾ｓｉＲＮＡ化合物で実施することができ、このような実施は本発明の範囲内であることが理解され得る。ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物へとプロセシングされ得る、より大きいｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物、又はその前駆体をコードするＤＮＡ）を含む組成物が、経肺送達によって対象に投与され得る。経肺送達組成物は、分散剤中の組成物、例えば、ｉＲＮＡが、肺に達することができ、肺内で肺胞領域を通じて血液循環に直接容易に吸収されることができるように、分散剤の患者による吸収によって送達され得る。経肺送達は、全身送達及び肺疾患を治療するための局所送達の両方に有効であり得る。
経肺送達は、ネブライザー、エアロゾル、ミセル及び乾燥粉末ベースの製剤の使用を含む、異なる手法によって達成され得る。送達は、液体ネブライザー、エアロゾル吸入器、及び乾燥粉末分散装置を用いて達成され得る。定量デバイスが使用されてもよい。アトマイザー又は吸入器を使用する利点の１つは、デバイスが内蔵式であるため、汚染の可能性が最小限に抑えられることである。乾燥粉末分散装置は、例えば、乾燥粉末として容易に製剤化され得る薬物を送達する。ｉＲＮＡ組成物は、単独で、又は適切な粉末担体と組み合わせて、凍結乾燥又は噴霧乾燥粉末として安定的に保存され得る。吸入のための組成物の送達は、投薬タイミング要素によって媒介され得、投薬タイミング要素としては、デバイスに組み込まれた場合に、エアロゾル薬剤の投与中に患者に対する用量追跡、コンプライアンス監視、及び／又は用量トリガーを可能にする、タイマー、用量カウンター、時間測定デバイス、又は時間指示器が挙げられ得る。
「粉末」という語は、自由流動性であり、吸入デバイス内で容易に分散され、続いて対象によって吸入され、粒子が肺に達し、肺胞への浸透を可能にすることができる、微細分散した固体粒子からなる組成物を意味する。したがって、粉末は、「呼吸に適している」と考えられる。例えば、平均粒径は、直径が約１０μｍ未満であり、比較的均一な球状の分布を有する。一部の実施形態では、直径は、約７．５μｍ未満であり、一部の実施形態では、約５．０μｍ未満である。通常、粒度分布は、直径が約０．１μｍ〜約５μｍであり、場合により、約０．３μｍ〜約５μｍである。
「乾燥」という語は、組成物が、約１０重量％（％ｗ）未満の水、通常、約５％ｗ未満、ある場合に、約３％ｗ未満の水分含量を有することを意味する。乾燥組成物は、粒子が、エアロゾルを形成するために吸入デバイス内で容易に分散可能であるような組成物であり得る。
「治療有効量」という語は、予測される生理学的反応をもたらすために、治療されている対象において所望のレベルの薬物を提供するために必要な組成物中に存在する量である。
「生理学的有効量」という語は、所望の緩和又は治療効果をもたらすために対象に送達される量である。
「薬学的に許容される担体」という語は、肺への有意な有害毒性作用を伴わずに、担体を肺に取り込むことができることを意味する。
担体として有用な医薬品賦形剤の種類としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの安定剤、糖質、アミノ酸及びポリペプチドなどの増量剤；ｐＨ調整剤又は緩衝剤；塩化ナトリウムなどの塩などが挙げられる。これらの担体は、結晶性又は非晶質形態であってもよく、又は２つの混合物であってもよい。
特に有益な増量剤としては、適合する糖質、ポリペプチド、アミノ酸又はそれらの組み合わせが挙げられる。適切な糖質としては、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどの単糖類；ラクトース、トレハロースなどの二糖類；２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン；及びラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなどの多糖類；マンニトール、キシリトールなどのアルジトールが挙げられる。糖質の群としては、ラクトース、トレハロース、ラフィノースマルトデキストリン、及びマンニトールが挙げられる。適切なポリペプチドとしては、アスパルテームが挙げられる。アミノ酸としては、アラニン及びグリシンが挙げられ、一部の実施形態では、グリシンが使用される。
本発明の組成物の微量構成成分である添加剤は、噴霧乾燥中の構造安定性及び粉末の分散性の改善のために含まれてもよい。これらの添加剤としては、トリプトファン、チロシン、ロイシン、フェニルアラニンなどの疎水性アミノ酸が挙げられる。
適切なｐＨ調整剤又は緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなどの有機酸及び塩基から調製される有機塩が挙げられ；一部の実施形態では、クエン酸ナトリウムが使用され得る。
ミセルｉＲＮＡ製剤の経肺投与は、テトラフルオロエタン、ヘプタフルオロエタン、ジメチルフルオロプロパン、テトラフルオロプロパン、ブタン、イソブタン、ジメチルエーテル並びに他の非ＣＦＣ及びＣＦＣ噴射剤などの噴射剤を用いた定量噴霧デバイスによって達成され得る。
経口又は経鼻送達。本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ化合物はいずれも、例えば、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、舐剤、トローチ又は液体シロップの形態で、経口投与され得る。さらに、組成物は、口腔の表面に局所的に適用され得る。
本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ化合物はいずれも、経鼻投与され得る。経鼻投与は、鼻への送達デバイスの導入によって、例えば、薬剤を分注し得る送達デバイスの導入によって達成され得る。経鼻送達の方法としては、例えば、点鼻剤による、又は鼻腔の表面への局所投与による、スプレー、エアロゾル、液体が挙げられる。薬剤は、例えば、湿潤又は乾燥した薬剤を送達するディスペンサーで、それが吸入され得るのに十分に小さい形態で提供され得る。デバイスは、測定した用量の薬剤を送達することができる。対象、又は別の人間が、薬剤を投与することができる。
経鼻送達は、鼻腔組織を直接侵す疾患だけでなく、他の組織を侵す疾患にも有効である。ｓｉＲＮＡ化合物は、液体又は非液体、例えば、粉末、結晶として、又は経鼻送達用に製剤化され得る。本明細書で使用される「結晶性」という語は、結晶の構造又は特徴を有する固体、即ち、平面が明確な角度で交差し、且つ規則正しい内部構造がある三次元構造の粒子を表す。本発明の組成物は、様々な結晶形態を有し得る。結晶形態は、例えば、噴霧乾燥を含む様々な方法によって調製され得る。
説明を簡単にするために、この項の製剤、組成物及び方法は、主に、修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して説明される。しかしながら、これらの製剤、組成物及び方法は、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、非修飾ｓｉＲＮＡ化合物で実施することができ、このような実施は本発明の範囲内であることが理解され得る。口膜及び鼻粘膜の両方は、他の投与経路に優る利点を提供する。例えば、これらの膜を通して投与される薬物は、作用の急速な発現を有し、治療血漿レベルを提供し、肝代謝の初回通過効果を回避し、好ましくない胃腸（ＧＩ）環境への薬物の暴露を回避する。さらなる利点としては、薬剤が容易に適用、局所化、及び除去され得るような、膜部位への容易なアクセスが挙げられる。
経口送達において、組成物は、口腔の表面、例えば、舌の腹側表面の膜及び口底を含む舌下粘膜又は頬の内面を構成する頬粘膜に標的化され得る。舌下粘膜は、比較的透過性であり、したがって、多くの薬物の急速な吸収及び許容可能なバイオアベイラビリティをもたらす。さらに、舌下粘膜は、便利で、許容可能で、且つ容易にアクセス可能である。
分子が口腔粘膜に浸透する能力は、分子量、脂溶性及びペプチドタンパク質イオン化に関連するようである。１０００ダルトン未満の小分子は、急速に粘膜を横断するようである。分子量が増加するにつれて、透過性は急速に低下する。脂溶性化合物は、非脂溶性分子より透過性である。最大吸収は、分子がイオン化されていないか、又は電荷において中性である場合に生じる。したがって、荷電分子は、口腔粘膜を介した吸収にとって最大の課題を示す。
ｉＲＮＡの医薬組成物はまた、上記の混合ミセル医薬品製剤及び噴射剤を定量噴霧ディスペンサーから吸入なしで口腔に噴霧することによって、ヒトの口腔に投与されてもよい。一実施形態では、ディスペンサーは、医薬製剤及び噴射剤を口腔に噴霧する前に最初に振とうされる。例えば、薬剤は、口腔に噴霧されるか、又は例えば、液体、固体、若しくはゲル形態で、口腔の表面に直接適用され得る。この投与は、口腔、例えば、歯茎又は舌の炎症の治療に特に望ましく、例えば、一実施形態では、口腔投与は、ディスペンサー、例えば、医薬組成物及び噴射剤を分注する定量噴霧ディスペンサーから、例えば吸入なしで口腔に噴霧することによって行われる。
本発明の一態様はまた、オリゴヌクレオチドを、髄腔内送達によって中枢神経系に又は硝子体内で眼組織に送達する方法にも関する。
一部の実施形態は、細胞内での標的遺伝子の発現を低下させる方法であって、前記細胞を、任意選択で、リンカー又は担体を介して、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分を有するオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含む、方法に関する。一実施形態では、細胞は、中枢神経系中の細胞である。一実施形態では、細胞は、眼細胞である。
一部の実施形態は、対象における標的遺伝子の発現を低下させる方法であって、任意選択で、リンカー又は担体を介して、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分を有するオリゴヌクレオチドを対象に投与するステップを含む、方法に関する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、（脳又は脊椎組織における標的遺伝子の発現を低下させるために）髄腔内に投与される。一実施形態では、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、（眼組織における標的遺伝子の発現を低下させるために）硝子体内に投与される。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、二本鎖である。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子に相補的なアンチセンス鎖及び前記アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含む二本鎖ｉＲＮＡ剤である。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖である。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスである。
一部の実施形態では、親油性部分は、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、親油性部分は、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの鎖上の１つ以上の末端位置にコンジュゲートされる。
キット
特定の他の態様では、本発明は、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物（例えば、前駆体、例えば、ｓｓｉＲＮＡ化合物へとプロセシングされ得る、より大きいｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、又はｓｓｉＲＮＡ化合物、又はそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の医薬製剤を含む適切な容器を含むキットを提供する。特定の実施形態では、医薬製剤の個々の成分は、１つの容器中で提供され得る。或いは、２つ以上の容器中で別個に、例えば、ｓｉＲＮＡ化合物の調製のために１つの容器、及び担体化合物のために少なくとももう１つの容器で、医薬製剤の成分を提供することが望ましいことがある。キットは、１つの箱の中の１つ以上の容器などのいくつかの異なる形態で包装され得る。異なる成分が、例えば、キットと共に提供される使用説明書にしたがって組み合わされ得る。成分は、例えば、医薬組成物を調製及び投与するために、本明細書に記載される方法にしたがって組み合わされ得る。キットは、送達デバイスも含み得る。
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、これらの実施例は、さらなる限定と解釈されるべきものではない。本出願で言及される全ての参照文献、出願中の特許出願及び公開特許の内容は、参照により本明細書に明確に組み入れられるものとする。
ここで、本発明が、一般に説明され、以下の実施例を参照してより容易に理解されるが、これらの実施例は、本発明の特定の態様及び実施形態の例示を目的として含まれるに過ぎず、本発明を限定することは意図されていない。
実施例１：親油性コンジュゲートの合成のためのヌクレオシドホスホラミダイトの合成
Figure 2021522810
 化合物２０１の合成：水素化ナトリウム（ＮａＨ）（２１ｇ）を、乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１５００ｍｌ）中の２，６−ジアミノ９−（Ｂ−Ｄ−リボフラノシル）プリン２００（１０５ｇ）に加えた。３０分間撹拌した後、１−ブロモヘキサデカン（１５０ｍｌ）を加えた。溶液を室温で一晩撹拌し、次に、エタノール（ＥｔＯＨ）（５０ｍｌ）の添加によってクエンチした。反応混合物を減圧下で蒸発させ、残留物を塩化メチレン中で懸濁させ、溶離剤として５〜１０％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。生成物含有画分をプールし、溶媒を取り除いて、粗製の発泡体２０１（９５ｇ）を得た。
化合物２０３の合成：上記の発泡体（９５ｇ）及びアデノシンデアミナーゼ（２０００ｍｇ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｔｙｐｅ ＩＩ）を、０．１Ｍのｔｒｉｓ緩衝液（１５００ｍｌ、ｐＨ７．４）、ＤＭＳＯ（１０００ｍｌ）、及び０．１Ｍのナトリウムリン酸緩衝液（１００ｍｌ）中で、室温で一晩撹拌した。０．１Ｍのリン酸緩衝液（３０ｍｌ）及びＤＭＳＯ（２０ｍｌ）中のアデノシンデアミナーゼ（１４０ｍｇ）のさらなるアリコートを加え、反応物を１０日間にわたって撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物を、０〜１０％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いてシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーにかけた。生成物含有画分を減圧下で蒸発させて、固体２０３（３５ｇ）を得た。
化合物２０４の合成：ピリジン（５００ｍｌ）中の上記の固体（３５ｇ）を、氷浴中で冷却し、トリメチルシリルクロリド（８４ｍｌ）を加えた。反応混合物を３０分間撹拌し、塩化イソブチリル（５８ｍｌ）を加えた。溶液を４時間撹拌して、室温にした。溶液を、Ｈ２Ｏ（１００ｍｌ）を加えながら冷却し、溶液をさらに３０分間撹拌した。濃ＮＨ４−ＯＨ（１００ｍｌ）を加え、溶液を減圧下で蒸発させた。残留物を０〜５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭを用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、生成物を溶離させた。生成物含有画分を蒸発させて、２５ｇの生成物を発泡体２０４として得た。
化合物２０５の合成：Ｎ２−イソブチリル−２’−Ｏ−ヘキサデシルグアノシン２０４（２５ｇ）をピリジンと同時蒸発させ、ピリジン（１８０ｍｌ）に溶解させた。ジメトキシトリチルクロリド（２０ｇ）及びジメチルアミノピリジン（５０ｍｇ）を、室温で撹拌しながら加えた。反応混合物を一晩撹拌し、減圧下で蒸発させた。残留物を、ＣＨ２Ｃ１２／ＮａＨＣＯ３水溶液に分けた。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、蒸発させた。残留物を、シリカゲルクロマトグラフィー（１：１のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、３０ｇの生成物２０５を得た。
化合物２０６の合成：上記の固体２０５（３０ｇ）、ビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエチルホスファイト（２０ｇ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（１０ｇ）を室温で一晩撹拌した。溶液を、ＮａＨＣＯ３水溶液に対して分け、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物を、シリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ中１％のＴＥＡ）によって精製して、２９ｇの生成物２０６を発泡体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ ７．８４（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．４５（ｄｄ，Ｊ＝７．７、５．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．３３（ｄｄ，Ｊ＝９．０、７．１Ｈｚ、４Ｈ）、７．２７（ｍ，２Ｈ）、７．２２（ｄｄ，Ｊ＝８．５、６．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．８３（ｍ，４Ｈ）、５．８９（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．６４（ｍ，１Ｈ）、４．４７（ｍ，１Ｈ）、４．２７（ｍ，１Ｈ）、３．９２−３．７７（ｍ，１Ｈ）、３．７５（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ、６Ｈ）、３．７２−３．６６（ｍ，１Ｈ）、３．６２（ｍ，３Ｈ）、３．４９（ｍ，１Ｈ）、３．３７（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．３３（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ、１Ｈ）、２．６７（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ、１Ｈ）、２．５８−２．４１（ｍ，２Ｈ）、１．４８（ｍ，２Ｈ）、１．３４−１．１４（ｍ，３５Ｈ）、１．１４−１．０２（ｍ，９Ｈ）、０．８８（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、３Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ １５１．１１、１５０．９３．
Figure 2021522810
 化合物２０８の合成：水素化ナトリウム（ＮａＨ）（２５ｇ）を、乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１５００ｍｌ）中の２，６−ジアミノ９−（Ｂ−Ｄ−リボフラノシル）プリン２０７（１２５ｇ）に加えた。３０分間撹拌した後、１−ブロモヘキサデカン（１８０ｇｌ）を加えた。溶液を室温で一晩撹拌し、次に、エタノール（ＥｔＯＨ）（５０ｍｌ）の添加によってクエンチした。反応混合物を減圧下で蒸発させ、残留物を塩化メチレン中で懸濁させ、溶離剤として０〜１０％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。生成物含有画分をプールし、溶媒を取り除いて、生成物２０８を発泡体（３６ｇ）として得た。
化合物２０９の合成：ピリジン（５００ｍｌ）中の上記の固体２０８（３６ｇ）を氷浴中で冷却し、トリメチルシリルクロリド（３０ｍｌ）を加えた。反応混合物を３０分間撹拌し、塩化ベンゾイル（２０ｍｌ）を加えた。溶液を４時間撹拌して、室温にした。溶液を、Ｈ２Ｏ（１００ｍｌ）を加えながら冷却し、溶液をさらに３０分間撹拌した。濃ＮＨ４−ＯＨ（１００ｍｌ）を加え、溶液を減圧下で蒸発させた。残留物を、０〜５％のＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、生成物を溶離させた。生成物含有画分を蒸発させて、３２ｇの生成物２０９を発泡体として得た。
化合物２１０の合成：Ｎ２−ベンゾイル−２’−Ｏ−ヘキサデシルアデノシン２０９（３２ｇ）をピリジンと同時蒸発させ、次に、ピリジン（１８０ｍｌ）に溶解させた。ジメトキシトリチルクロリド（２０ｇ）及びジメチルアミノピリジン（５０ｍｇ）を、室温で撹拌しながら加えた。反応混合物を一晩撹拌し、減圧下で蒸発させた。残留物を、ＤＣＭ／ＮａＨＣＯ３水溶液に分けた。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、蒸発させた。残留物を、シリカゲルクロマトグラフィー（１：１のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、３５ｇの生成物２１０を得た。
化合物２１１の合成：上記の固体２１０（３５ｇ）、ビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエチルホスファイト（２０ｇ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（１０ｇ）を室温で一晩撹拌した。溶液を、ＮａＨＣＯ３水溶液に対して分け、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物を、シリカゲルクロマトグラフィー（１：１のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、３７ｇの生成物２１１を発泡体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ ９．３７（ｓ，１Ｈ）、８．５７（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ、１Ｈ）、８．２７（ｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．９９（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．６１（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．５２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．４２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、７．３４−７．１６（ｍ，７Ｈ）、６．８５−６．７７（ｍ，４Ｈ）、６．１１（ｄｄ，Ｊ＝５．０、２．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．８０（ｍ，１Ｈ）、４．６９（ｍ，１Ｈ）、４．３２（ｍ，１Ｈ）、３．９７−３．７８（ｍ，１Ｈ）、３．７４（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ、７Ｈ）、３．６４（ｍ，４Ｈ）、３．５６−３．４０（ｍ，２Ｈ）、３．３３（ｍ，１Ｈ）、２．７３−２．５９（ｍ，１Ｈ）、２．５０（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、１．５２−１．４５（ｍ，２Ｈ）、１．３３−１．１２（ｍ，３７Ｈ）、１．０９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ）、０．８７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ １５１．１９、１５０．７８．
Figure 2021522810
 ２１３の合成：アルゴン雰囲気下で、無水ピリジン（１２０ｍＬ）中の無水化合物２１２（２４．０ｇ、０．１ｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．１６ｇ、１．３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＤＰＳＣｌ（２８ｍＬ、０．１１ｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で２４時間撹拌し、その後、顕著な量の出発材料２１２は、ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール５：１）によって観察されなかった。ピリジンを減圧下で除去し、残留物を、酢酸エチルと１０％のリン酸とに分けた。有機相を分離し、５％のＮａＣｌ水溶液及び飽和ＮａＣｌで連続的に洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。水性洗浄中に結晶化が開始したら、限られた量のＤＣＭを加えて、固体を溶解させた。硫酸ナトリウムの濾過の後、溶液を蒸発させ、残留物を、２日間にわたって８００ｍＬのジエチルエーテルと共に撹拌した。白色の沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで１回洗浄し、乾燥させて、４０．８ｇ（８５％）の２１３を白色の結晶性固体として得た。
化合物２１５ｆ及び２１５ｇの合成：０．３６ｍｏｌのヘキサデカン−１−オール又はオレイルアルコールを、磁気撹拌子、ガス入口、還流冷却器、油加熱浴、滴下漏斗、及び冷却器の上のバブラーを備えた丸底フラスコ中で、フラスコにＡｒが充填された状態で、約４０分間にわたって高真空下で乾燥させた。無水ジグリム（６５ｍＬ）を加えた後、ヘプタン（５５ｍＬ、０．１１ｍｍｏｌ）中のＡｌＭｅ３の２Ｍ溶液を滴下して加えた。混合物を１１０℃に加熱し、反応の完了を、メタン発生の終了によって監視した。混合物をＡｒ下で室温に冷却し、次に、無水ヌクレオシド２１３（２３．２ｇ、５０ｍｍｏｌ）を加え、油浴を１４５℃で一晩加熱した。混合物をＡｒ下で室温に冷却し、１０％のＨ３ＰＯ４（５００ｍＬ）と酢酸エチル（２５０ｍＬ）とに分けた。有機層を分離し、ＮａＣｌ水溶液（５％）及び飽和ＮａＣｌで連続的に洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、残留物をＴＨＦ（２００ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（３３ｍＬ、０．２ｍｏｌ）で処理した。混合物を、３日間にわたってＡｒ下で撹拌し、５％のＮａＣｌ水溶液（３００ｍＬ）と酢酸エチル（３００ｍＬ）とに分けた。有機相を分離し、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、溶媒を蒸発させた。残留物をヘキサン（８００ｍＬ）に溶解させ、９０％のＭｅＯＨ水溶液（２×８００ｍＬ）で抽出した。組み合わされたメタノール抽出物を蒸発させ、残留物を、酢酸エチルと飽和ＮａＣｌ水溶液とに分けた。有機相を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、残留物を、ＤＣＭ中３％〜１０％のメタノールの勾配を用いたシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによって精製して、１０．９ｇ（４７％）の２１５ｆ（Ｒ＝Ｃ１６Ｈ３３）、又は１３．７ｇ（５５％）の２１５ｇ（Ｒ＝Ｃ１８Ｈ３５、オレイル）を得た。
化合物２１６ｆの合成：アルゴン雰囲気下で、無水ピリジン（７０ｍＬ）中の無水化合物２１５ｆ（１０．６１ｇ、２２．６ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（．５５０ｇ、４．４ｍｍｏｌ）、及びＤＭＴｒＣｌ（９．７６ｇ、２９ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（４．１ｍＬ、２９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌し、１ｍＬのＭｅＯＨの添加によってクエンチした。ピリジンを減圧下で除去し、残留物を、酢酸エチルと５％のＮａＣｌ水溶液とに分けた。有機相を分離し、飽和ＮａＣｌで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、ヘキサン中の酢酸エチルの勾配（３５〜６０％）を用いたシリカゲルのカラム上での残留物のクロマトグラフィーによって生成物を単離して、１４．８９ｇ（８６％）の２１６ｆを黄色がかった非晶質の発泡体として得た。
化合物２１７ｆの合成：化合物２１６ｆ（２５ｇ）、ビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエチルホスファイト（１５ｇ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（７．５ｇ）を室温で一晩撹拌した。溶液を、ＮａＨＣＯ３水溶液に対して分け、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物を、シリカゲルクロマトグラフィー（１：１のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、２７ｇの生成物を発泡体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ ９．０２（ｓ，１Ｈ）、７．７７（ｄｄ，Ｊ＝４３．４、８．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．４９−７．４０（ｍ，２Ｈ）、７．３６−７．２９（ｍ，６Ｈ）、７．２６（ｍ，１Ｈ）、６．８８（ｄｄ，Ｊ＝８．７、６．４Ｈｚ、４Ｈ）、５．８５（ｄｄ，Ｊ＝７．５、３．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．２２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．４４（ｍ，１Ｈ）、４．１４（ｍ，１Ｈ）、４．０７−３．９９（ｍ，１Ｈ）、３．８６（ｍ，１Ｈ）、３．７７（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ、７Ｈ）、３．６３（ｍ，５Ｈ）、３．４５−３．３３（ｍ，２Ｈ）、２．６６（ｍ，１Ｈ）、２．５２（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ）、１．５５（ｍ，２Ｈ）、１．２６（ｓ，２６Ｈ）、１．１６（ｄｄ，Ｊ＝１１．０、６．７Ｈｚ、９Ｈ）、１．０５（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ）、０．８８（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ １５１．０１、１５０．６１．
化合物２１６ａの合成：２１６ｆに記載される手順を用いて、化合物２１６ａを合成した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ １１．３７（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ、１Ｈ）、７．７１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．３９−７．３４（ｍ，２Ｈ）、７．３１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．２８−７．２０（ｍ，５Ｈ）、６．９４−６．８３（ｍ，４Ｈ）、５．２８（ｄｄ，Ｊ＝８．１、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．１１（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．１６（ｍ，１Ｈ）、４．０１−３．９２（ｍ，１Ｈ）、３．８９（ｔ，Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．７３（ｓ，６Ｈ）、３．５５（ｍ，２Ｈ）、３．３０−３．１８（ｍ，２Ｈ）、１．５４−１．４３（ｍ，２Ｈ）、１．３３−１．１５（ｍ，６Ｈ）、０．８３（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、３Ｈ）．
化合物２１７ａの合成：化合物２１６ａ（４．０ｇ、６．３５ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発材料をジクロロメタンに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（２．２１ｍｌ、１２．７ｍｍｏｌ）をシリンジによって加えた。２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（２．１２ｍｌ、９．５３ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応を、ＴＬＣ（７０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、反応物を減圧下で濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。次に、有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾過して取り出し、母液を濃縮した。残留物を、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（３０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して、（３．４２ｇ、６５％）の２１６ａを得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ ８．９８（ｓ，１Ｈ）、７．８６−７．６６（ｍ，１Ｈ）、７．４９−７．３９（ｍ，２Ｈ）、７．３９−７．２１（ｍ，７Ｈ）、６．９３−６．８３（ｍ，４Ｈ）、５．８５（ｄｄ，Ｊ＝６．２、３．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．２２（ｄｄ，Ｊ＝８．２、６．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．４４（ｍ，１Ｈ）、４．２０−３．９８（ｍ，２Ｈ）、３．９３−３．８２（ｍ，１Ｈ）、３．７７（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ、７Ｈ）、３．７１−３．５５（ｍ，５Ｈ）、３．４７−３．３２（ｍ，２Ｈ）、２．７２−２．６１（ｍ，１Ｈ）、２．５２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、１．６２−１．４９（ｍ，２Ｈ）、１．４１−１．２３（ｍ，６Ｈ）、１．１７（ｄｄ，Ｊ＝８．８、６．８Ｈｚ、９Ｈ）、１．０５（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ）、０．８８（ｍ，３Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ １４９．６３、１４９．２６．
化合物２１６ｂの合成：２１６ｆに記載される手順を用いて、化合物２１６ｂを合成した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ １１．３６（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．７１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．４１−７．３５（ｍ，２Ｈ）、７．３１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．２３（ｍ，５Ｈ）、６．９４−６．８２（ｍ，４Ｈ）、５．７９（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ、１Ｈ）、５．２８（ｄｄ，Ｊ＝８．１、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．１１（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．１６（ｍ，１Ｈ）、３．９９−３．９２（ｍ，１Ｈ）、３．８９（ｍ，１Ｈ）、３．７３（ｓ，６Ｈ）、３．５５（ｍ，２Ｈ）、３．３０−３．１７（ｍ，２Ｈ）、１．４９（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ）、１．３０−１．１９（ｍ，１０Ｈ）、０．８９−０．７９（ｍ，３Ｈ）．
化合物２１７ｂの合成：化合物２１６ｂ（４．０ｇ、６．０８ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発材料をジクロロメタンに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（２．１２ｍｌ、１２．１６ｍｍｏｌ）をシリンジによって加えた。２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（２．０３ｍｌ、９．１２ｍｍｏｌ）を加え、室温で２．５時間撹拌した。反応を、ＴＬＣ（７０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、反応物を減圧下で濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。次に、有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾過して取り出し、母液を濃縮した。残留物を、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（３０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して、（３．５５ｇ、６８％）の２１７ｂを得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ ９．１２（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．８５−７．６８（ｍ，１Ｈ）、７．４４（ｍ，２Ｈ）、７．３７−７．２８（ｍ，６Ｈ）、７．２６（ｍ，１Ｈ）、６．９３−６．８３（ｍ，４Ｈ）、５．８８−５．８０（ｍ，１Ｈ）、５．２９−５．２０（ｍ，１Ｈ）、４．４５（ｍ，１Ｈ）、４．１５（ｍ，１Ｈ）、４．０９−４．０１（ｍ，１Ｈ）、３．９９−３．８２（ｍ，１Ｈ）、３．８３−３．７１（ｍ，８Ｈ）、３．７３−３．５５（ｍ，５Ｈ）、３．４６−３．３３（ｍ，２Ｈ）、２．６６（ｍ，１Ｈ）、２．５２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、１．９７（ｓ，１Ｈ）、１．５６（ｍ，２Ｈ）、１．３９−１．２４（ｍ，１０Ｈ）、１．２４−１．１０（ｍ，９Ｈ）、１．０６（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、３Ｈ）、０．９１−０．８４（ｍ，３Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ １４９．６４、１４９．２５．
化合物２１６ｃの合成：２１６ｆに記載される手順を用いて、化合物２１６ｃを合成した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ １１．３６（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．７１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．４１−７．３５（ｍ，２Ｈ）、７．３１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．２７−７．１９（ｍ，５Ｈ）、６．９２−６．８６（ｍ，４Ｈ）、５．７９（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ、１Ｈ）、５．２８（ｄｄ，Ｊ＝８．１、２．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．１１（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．１６（ｍ，１Ｈ）、３．９５（ｍ，１Ｈ）、３．８９（ｍ，１Ｈ）、３．７３（ｓ，６Ｈ）、３．５５（ｍ，２Ｈ）、３．３０−３．１８（ｍ，２Ｈ）、１．４９（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ）、１．２３（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ、１３Ｈ）、０．８３（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、３Ｈ）．
化合物２１７ｃの合成：化合物２１６ｃ（４．０ｇ、５．８３ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発材料をジクロロメタンに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（２．０４ｍｌ、１１．６６ｍｍｏｌ）をシリンジによって加えた。２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（１．９５ｍｌ、８．７５ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間撹拌した。反応を、ＴＬＣ（７０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、反応物を減圧下で濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。次に、有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾過して取り出し、母液を濃縮した。残留物を、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（３０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して、（４．２０ｇ、８１％）の２１７ｃを得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ ９．０２（ｓ，１Ｈ）、７．７７（ｄｄ，Ｊ＝３５．４、８．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．４９−７．３９（ｍ，２Ｈ）、７．３９−７．２１（ｍ，７Ｈ）、６．９３−６．８３（ｍ，４Ｈ）、５．８５（ｄｄ，Ｊ＝６．１、３．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．２２（ｄｄ，Ｊ＝８．２、６．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．１５（ｍ，１Ｈ）、４．０３（ｍ，１Ｈ）、３．７７（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ、７Ｈ）、３．６９−３．５３（ｍ，４Ｈ）、３．４７−３．３２（ｍ，２Ｈ）、２．７１−２．６１（ｍ，１Ｈ）、２．５２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、１．５６（ｍ，２Ｈ）、１．３８−１．２４（ｍ，１４Ｈ）、１．１６（ｄｄ，Ｊ＝８．８、６．８Ｈｚ、９Ｈ）、１．０５（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、３Ｈ）、０．９２−０．８３（ｍ，３Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ １４９．６３、１４９．２５．
化合物２１６ｄの合成：２１６ｆに記載される手順を用いて、化合物２１６ｄを合成した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ １１．３６（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．７１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．４１−７．３４（ｍ，２Ｈ）、７．３１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．２８−７．１９（ｍ，５Ｈ）、６．９４−６．８１（ｍ，４Ｈ）、５．７９（ｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ、１Ｈ）、５．２８（ｄｄ，Ｊ＝８．１、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．１１（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．１６（ｍ，１Ｈ）、３．９５（ｍ，１Ｈ）、３．８９（ｍ，１Ｈ）、３．７３（ｓ，７Ｈ）、３．５５（ｍ，２Ｈ）、３．３０−３．１７（ｍ，２Ｈ）、１．４９（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、１．２２（ｓ，１９Ｈ）、０．８８−０．７９（ｍ，３Ｈ）．
化合物２１７ｄの合成：化合物２１６ｄ（５．０ｇ、６．９９ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発材料をジクロロメタンに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（２．４４ｍｌ、１４ｍｍｏｌ）をシリンジによって加えた。２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（２．３４ｍｌ、１０．５０ｍｍｏｌ）を加え、反応物室温で３時間撹拌した。反応を、ＴＬＣ（７０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、反応物を減圧下で濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。次に、有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾過して取り出し、母液を濃縮した。残留物を、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（３０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して、（４．５４ｇ、７３％）の２１７ｄを得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）δ ８．１５（ｓ，１Ｈ）、８．０１（ｄｄ，Ｊ＝４４．６、８．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．４３−７．３４（ｍ，２Ｈ）、７．３４−７．２１（ｍ，７Ｈ）、６．８４（ｍ，３Ｈ）、５．９５（ｄｄ，Ｊ＝２１．０、２．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．２１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．２９−４．１７（ｍ，１Ｈ）、４．００（ｍ，１Ｈ）、３．９７−３．８６（ｍ，１Ｈ）、３．８０（ｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ、６Ｈ）、３．７７−３．６４（ｍ，２Ｈ）、３．６５−３．５２（ｍ，４Ｈ）、３．４４（ｍ，１Ｈ）、２．６３（ｍ，１Ｈ）、２．４２（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ、１Ｈ）、１．６０（ｄｄ，Ｊ＝７．２、４．５Ｈｚ、２Ｈ）、１．３９−１．２１（ｍ，１７Ｈ）、１．２１−１．１２（ｍ，８Ｈ）、１．０４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ）、０．８７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）δ １５０．１０２、１５０．０７．
化合物２１６ｅの合成：２１６ｆに記載される手順を用いて、化合物２１６ｅを合成した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ １１．３６（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．７１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．３７（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、７．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．２７−７．２０（ｍ，５Ｈ）、６．９３−６．８２（ｍ，４Ｈ）、５．７９（ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．２７（ｄｄ，Ｊ＝８．１、２．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．１１（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．１６（ｍ，１Ｈ）、３．９５（ｍ，１Ｈ）、３．８９（ｍ，１Ｈ）、３．７３（ｓ，６Ｈ）、３．５５（ｍ，２Ｈ）、３．３０−３．１８（ｍ，２Ｈ）、１．４９（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ）、１．２１（ｓ，２２Ｈ）、０．８３（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ、３Ｈ）．
化合物２１７ｅの合成：化合物２１６ｅ（５．０ｇ、６．７３ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発材料をジクロロメタンに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（２．３５ｍｌ、１３．４６ｍｍｏｌ）をシリンジによって加えた。２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（２．２５ｍｌ、１０．１０ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で３時間撹拌した。反応を、ＴＬＣ（７０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、反応物を減圧下で濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。次に、有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾過して取り出し、母液を濃縮した。残留物を、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（３０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して、（４．８６ｇ、７７％）の２１７ｅを得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）δ ８．４９（ｓ，１Ｈ）、８．０１（ｄｄ，Ｊ＝４５．８、８．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．３９（ｄｄ，Ｊ＝１７．７、７．３Ｈｚ、２Ｈ）、７．３４−７．２１（ｍ，８Ｈ）、６．８８−６．７９（ｍ，４Ｈ）、５．９６（ｄｄ，Ｊ＝２１．６、２．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．２２（ｄｄ，Ｊ＝８．２、６．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．２９−４．１７（ｍ，１Ｈ）、４．０４−３．８７（ｍ，２Ｈ）、３．８０（ｄｄ，Ｊ＝３．６、１．４Ｈｚ、８Ｈ）、３．７６−３．６４（ｍ，２Ｈ）、３．６４−３．５３（ｍ，５Ｈ）、３．４５（ｍ，１Ｈ）、２．６３（ｍ，１Ｈ）、２．４２（ｓ，１Ｈ）、１．５９（ｍ，３Ｈ）、１．４０−１．２９（ｍ，４Ｈ）、１．２５（ｓ，２１Ｈ）、１．２２−１．１０（ｍ，１１Ｈ）、１．０４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、４Ｈ）、０．８８（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ、３Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）δ １５０．１３、１５０．０６．
化合物２１６ｇの合成：２１６ｆに記載される手順を用いて、化合物２１６ｇを合成した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ １１．３６（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．７１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．４０−７．２９（ｍ，４Ｈ）、７．２３（ｍ，５Ｈ）、６．９３−６．８５（ｍ，４Ｈ）、５．７８（ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．３５−５．２３（ｍ，３Ｈ）、５．１０（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．１５（ｍ，１Ｈ）、３．９５（ｍ，１Ｈ）、３．８８（ｔ，Ｊ＝４．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．７３（ｓ，６Ｈ）、３．５４（ｍ，２Ｈ）、３．３０−３．１６（ｍ，２Ｈ）、１．９６（ｍ，４Ｈ）、１．４９（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、１．３２−１．１５（ｍ，２１Ｈ）、０．８７−０．７９（ｍ，３Ｈ）．
化合物２１７ｇの合成：化合物２１６ｇ（５．０ｇ、６．２８ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発材料をジクロロメタンに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（２．１９ｍｌ、１２．５６ｍｍｏｌ）をシリンジによって加えた。２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（２．０９ｍｌ、９．４２ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で３時間撹拌した。反応を、ＴＬＣ（７０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、反応物を減圧下で濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。次に、有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾過して取り出し、母液を濃縮した。残留物を、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（３０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して、（４．８３ｇ、７７．１％）の２１７ｇを得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）δ ８．３８（ｓ，１Ｈ）、８．０２（ｄｄ，Ｊ＝３５．６、８．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．４４−７．３５（ｍ，２Ｈ）、７．２８（ｍ，７Ｈ）、６．８４（ｍ，４Ｈ）、５．９５（ｄｄ，Ｊ＝１６．６、２．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．３４（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ、２Ｈ）、５．２１（ｄｄ，Ｊ＝８．１、５．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．３０−４．１７（ｍ，１Ｈ）、４．００（ｍ，１Ｈ）、３．８０（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ、６Ｈ）、３．７７−３．６５（ｍ，２Ｈ）、３．５９（ｍ，４Ｈ）、３．４５（ｍ，１Ｈ）、２．６３（ｍ，１Ｈ）、２．４２（ｓ，１Ｈ）、２．００（ｍ，４Ｈ）、１．５９（ｍ，３Ｈ）、１．３０（ｄｄ，Ｊ＝２２．５、８．３Ｈｚ、２１Ｈ）、１．２２−１．１３（ｍ，８Ｈ）、１．０４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ）、０．８８（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、３Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、クロロホルム−ｄ）δ １５０．１２、１５０．０７．
Figure 2021522810
 化合物２１８ｆの合成：ＤＭＴヌクレオシド２１７ｆ（３０ｇ）を、無水ピリジン（３００ｍｌ）に溶解させた。トリメチルシリルクロリド（２０ｍｌ）を加え、混合物を３０分間撹拌した。トリアゾール（３０ｇ）及びトリエチルアミン（８０ｍｌ）を加え、０℃に冷却した。ＰＯＣｌ３（９ｍｌ）を加え、混合物を０℃で２時間撹拌した。濃アンモニア（１００ｍｌ）を加え、１時間撹拌した。水５００ｍｌを加え、混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２×５００ｍｌ）で抽出した。組み合わされた有機層を蒸発させ、残留物を、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した。所望の生成物２１８ｆを、メタノール／ＣＨ２Ｃｌ２（０〜５％）で溶離させた。収量：２４ｇ。
化合物２１９ｆの合成：上記の固体２１８ｆ（２４ｇ）を、ＤＭＦ（２００ｍｌ）に溶解させ、無水酢酸（６ｍｌ）を加えた。溶液を２４時間撹拌した。水（５００ｍｌ）を加え、混合物をジクロロメタン（５００ｍｌ）で抽出した。有機層を蒸発させ、残留物を、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した。所望の生成物２１９ｆを、メタノール／ＣＨ２Ｃｌ２（０〜５％）で溶離させた。収量：２１ｇ。
化合物２２０ｆの合成：上記の化合物２１９ｆ（２１ｇ）、ビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエチルホスファイト（１４ｇ）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（７ｇ）を室温で一晩撹拌した。溶液を、ＮａＨＣＯ３水溶液に対して分け、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物を、シリカゲルクロマトグラフィー（１：１のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、２２ｇの生成物を発泡体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ ９．１５（ｓ，１Ｈ）、８．４６（ｄｄ，Ｊ＝４５．６、７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．９５（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．６３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．５７−７．４１（ｍ，５Ｈ）、７．４１−７．３１（ｍ，６Ｈ）、７．２８（ｍ，１Ｈ）、７．０４（ｄ，Ｊ＝１５．８Ｈｚ、１Ｈ）、６．９０（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ、４Ｈ）、５．９０（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．５１（ｍ，１Ｈ）、４．２０（ｄｄ，Ｊ＝１０．６、８．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．０４（ｄｄ，Ｊ＝３１．３、４．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．９１−３．８１（ｍ，２Ｈ）、３．７９（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ、６Ｈ）、３．７４（ｍ，２Ｈ）、３．６９−３．４１（ｍ，６Ｈ）、２．６７−２．５９（ｍ，１Ｈ）、２．５４−２．４８（ｍ，１Ｈ）、１．５８（ｍ，２Ｈ）、１．３６（ｍ，２Ｈ）、１．２５（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ、２６Ｈ）、１．２１−１．０９（ｍ，１０Ｈ）、１．０４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ）、０．８７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ １５１．１０、１５０．１９．
実施例２：オリゴヌクレオチド合成後に親油性コンジュゲートを導入するために前駆体として使用されるヌクレオシドホスホラミダイトの合成
Figure 2021522810
 化合物２２２：化合物２２１（６ｇ、８．９８ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、ＤＣＭに溶解させた。反応物を撹拌し、トリメチルアミン（４．８９ｍｌ、３５．９２ｍｍｏｌ）をシリンジによって加えた。トリフルオロ酢酸エチル（３．１９ｇ、２２．４５ｍｍｏｌ）を反応に滴下して加えた。反応を、ＴＬＣ（５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、リンモリブデン酸を用いて発色させ、反応物を減圧下で濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。次に、有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾過して取り出し、母液を濃縮し、高真空下に置いて、（４．９６ｇ ７２％）の２２２を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ９．３６（ｓ，１Ｈ）、８．２６（ｓ，１Ｈ）、８．０９（ｓ，１Ｈ）、７．４１−７．３３（ｍ，２Ｈ）、７．３１（ｓ，２Ｈ）、７．２４（ｍ，６．８Ｈｚ、７Ｈ）、６．８８−６．７９（ｍ，４Ｈ）、６．０１（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．１８（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．５７（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．３８（ｍ，１Ｈ）、４．０７（ｍ，１Ｈ）、３．７３（ｓ，６Ｈ）、３．５８（ｍ，１Ｈ）、３．４３（ｍ，１Ｈ）、３．２４（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．１２（ｍ，２Ｈ）、１．４１（ｍ，４Ｈ）、１．１８（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ、４Ｈ）．Ｃ３９Ｈ４３Ｆ３Ｎ６Ｏ７に対する質量計算値：７６４．８０、実測値：７６５．３（Ｍ＋Ｈ）。
化合物２２３：化合物２２２（４．９６ｇ、６．４９ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。出発材料をジメチルホルムアミドに溶解させ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（４．３１ｍｌ、３２．４５ｍｍｏｌ）をシリンジによって加えた。反応物を、３時間にわたって油浴中で６０℃に加熱した。反応を、ＴＬＣ（５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、減圧下で濃縮し、高真空下で一晩乾燥させた。残留物を、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（０％〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して、（５．２１ｇ、９８％）の２２３を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ９．３５（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．９１（ｓ，１Ｈ）、８．３７（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．４１−７．３３（ｍ，２Ｈ）、７．３１−７．１６（ｍ，７Ｈ）、６．８９−６．７８（ｍ，４Ｈ）、６．０７（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．２０（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．６１（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．３９（ｍ，１Ｈ）、４．０９（ｍ，１Ｈ）、３．７３（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ、６Ｈ）、３．５８（ｍ，１Ｈ）、３．４３（ｍ，１Ｈ）、３．２５（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．２０（ｓ，３Ｈ）、３．１３（ｓ，３Ｈ）、３．１０（ｍ，２Ｈ）、１．４１（ｍ，４Ｈ）、１．１７（ｍ，４Ｈ）．Ｃ４２Ｈ４８Ｆ３Ｎ７Ｏ７に対する質量計算値：８１９．８８、実測値：８２０．４（Ｍ＋Ｈ）。
化合物２２４：化合物２２３（５．２１ｇ、６．３６ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発材料をジクロロメタンに溶解させ及びジイソプロピルエチルアミン（２．２１ｍｌ、１２．７２ｍｍｏｌ）をシリンジによって加えた。２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（２．１２ｍｌ、９．５４ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で１時間撹拌した。反応を、ＴＬＣ（１００％のＥｔＯＡｃ）によって確認し、反応物を減圧下で濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。次に、有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾過して取り出し、母液を濃縮した。残留物を、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（１０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して、（５．０２ｇ、７７％）の２２４を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ ８．８９（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ、１Ｈ）、８．３５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ、１Ｈ）、８．１０（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．５７（ｓ，１Ｈ）、７．４２（ｍ，２Ｈ）、７．３４−７．１５（ｍ，７Ｈ）、６．８１（ｍ，４Ｈ）、６．０９−６．０１（ｍ，１Ｈ）、４．８３−４．６２（ｍ，２Ｈ）、４．２８（ｍ，Ｊ＝１６．１、４．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．１５−３．９８（ｍ，１Ｈ）、３．９４−３．７７（ｍ，２Ｈ）、３．７５（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ、６Ｈ）、３．６９−３．５５（ｍ，４Ｈ）、３．５５−３．３７（ｍ，３Ｈ）、３．３０（ｍ，１Ｈ）、３．１６（ｄ，Ｊ＝９．９Ｈｚ、７Ｈ）、２．７５（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、２．７２−２．６３（ｍ，１Ｈ）、２．５０（ｓ，１Ｈ）、１．４７（ｍ，２Ｈ）、１．３８（ｓ，１Ｈ）、１．２７−１．１１（ｍ，１９Ｈ）、１．０８（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、４Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ １５１．０８、１５０．７２ １９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ −７７．０４（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ）．
Figure 2021522810
 化合物２２６：化合物２２５（６ｇ、９．３１ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。出発材料をジクロロメタンに溶解させ及びトリメチルアミン（５．０８ｍｌ、３７．２４ｍｍｏｌ）をシリンジによって加えた。トリフルオロ酢酸エチル（３．３１ｇ、２３．２８ｍｍｏｌ）を反応に滴下して加えた。反応を、ＴＬＣ（１００％の酢酸エチル）によって確認し、リンモリブデン酸を用いて発色させ、減圧下で濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。次に、有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾過して取り出し、母液を濃縮した。残留物を、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（１０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して、（４．２２ｇ、６１．２％）の２２６を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ９．４０（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．７９（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．４３−７．３７（ｍ，２Ｈ）、７．３３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．３０−７．２３（ｍ，５Ｈ）、７．１８（ｄ，Ｊ＝１６．４Ｈｚ、２Ｈ）、６．９５−６．８６（ｍ，４Ｈ）、５．８２（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．５０（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．０１（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．１７（ｍ，１Ｈ）、３．９６（ｄｄ，Ｊ＝７．２、３．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．７５（ｓ，６Ｈ）、３．７３（ｄｄ，Ｊ＝５．０、２．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．６２（ｍ，２Ｈ）、３．２７（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．１７（ｍ，２Ｈ）、１．５０（ｍ，４Ｈ）、１．２９（ｍ，４Ｈ）．Ｃ３８Ｈ４３Ｆ３Ｎ４Ｏ８に対する質量計算値：７４０．７８、実測値：７３９．２（Ｍ−Ｈ）。
化合物２２７：化合物２２６（４．２２ｇ、５．７ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。出発材料をジメチルホルムアミドに溶解させ及び安息香酸無水物（１．４２ｇ、６．２７ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を室温で一晩撹拌した。反応を、ＴＬＣ（５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、リンモリブデン酸を用いて発色させ、減圧下で濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾過して取り出し、母液を濃縮した。残留物を、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（０％〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して、（３．４１ｇ、７１％）の２２７を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ １１．２９（ｓ，１Ｈ）、９．４０（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ、１Ｈ）、８．４１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、８．０４−７．９３（ｍ，２Ｈ）、７．６８−７．５９（ｍ，１Ｈ）、７．５２（ｄｄ，Ｊ＝８．３、７．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．４５−７．３９（ｍ，２Ｈ）、７．３５（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．２９（ｄｄ，Ｊ＝７．８、５．４Ｈｚ、５Ｈ）、７．１６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、６．９８−６．８９（ｍ，４Ｈ）、５．８４（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．１１（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．２９（ｍ，１Ｈ）、４．０６（ｍ，１Ｈ）、３．８９−３．８２（ｍ，１Ｈ）、３．７７（ｓ，７Ｈ）、３．７２−３．６１（ｍ，１Ｈ）、３．３８（ｍ，２Ｈ）、３．１８（ｍ，２Ｈ）、１．５３（ｍ，４Ｈ）、１．３３（ｍ，４Ｈ）．Ｃ４５Ｈ４７Ｆ３Ｎ４Ｏ９に対する質量計算値：８４４．８９、実測値：８４３．３（Ｍ−Ｈ）。
化合物２２８：化合物２２７（３．４１ｇ、４．０４ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発材料をジクロロメタンに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（１．４ｍｌ、８．０８ｍｍｏｌ）をシリンジによって加えた。２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（１．３５ｍｌ、６．０６ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で１時間撹拌した。反応を、ＴＬＣ（２／１のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、減圧下で濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾過して取り出し、母液を濃縮した。残留物を、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（１０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して、（３．８１ｇ、９０．３％）の２２８を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ ９．１５（ｓ，１Ｈ）、８．４８（ｄｄ，Ｊ＝３５．８、７．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．９８−７．９０（ｍ，２Ｈ）、７．６２（ｍ，２Ｈ）、７．５６−７．４２（ｍ，５Ｈ）、７．４１−７．２３（ｍ，８Ｈ）、７．０４（ｓ，１Ｈ）、６．９４−６．８５（ｍ，４Ｈ）、５．９０（ｄｄ，Ｊ＝６．４、１．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．５２（ｍ，１Ｈ）、４．２４−３．９７（ｍ，４Ｈ）、３．９２−３．８１（ｍ，２Ｈ）、３．８１−３．７７（ｍ，６Ｈ）、３．７７−３．６６（ｍ，３Ｈ）、３．６６−３．４１（ｍ，６Ｈ）、３．２５（ｍ，２Ｈ）、２．７５（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ）、２．６４（ｍ，１Ｈ）、２．５６（ｓ，１Ｈ）、２．５０（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ、０Ｈ）、２．１６（ｓ，２Ｈ）、１．９７（ｓ，０Ｈ）、１．５６（ｍ，５Ｈ）、１．３７（ｍ，５Ｈ）、１．２９−１．０９（ｍ，１６Ｈ）、１．０３（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、４Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ １５１．１６、１５０．１８．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ −７７．０４（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ）．
Figure 2021522810
 化合物２３０：化合物２２９（２．５ｇ、６．５４ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、最小限の水に溶解させ、メタノールで希釈した。反応物を０℃に冷却し、トリメチルアミン（１４．２７ｍｌ、１０４．６４ｍｍｏｌ）をシリンジによって加えた。トリフルオロ酢酸エチル（９．３ｇ、６５．４ｍｍｏｌ）を加え、ｐＨを監視し、ｐＨ約９に調整し、反応物を３日間撹拌した。反応を、ＴＬＣ（１５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、Ｈｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させ、減圧下で濃縮した。残留物を、４５分間にわたって５％〜３５％のＡＣＮ／Ｈ２Ｏの方法を用いて、逆相分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を、約２５分間溶離させた。生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮し、凍結乾燥させて、（０．６６１ｇ、２１．１％）の２３０を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ １０．６４（ｓ，１Ｈ）、９．３６（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．９６（ｓ，１Ｈ）、６．４５（ｓ，２Ｈ）、５．７７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．１４−５．０４（ｍ，２Ｈ）、４．２３（ｍ，２Ｈ）、３．８８（ｍ，１Ｈ）、３．５３（ｍ，２Ｈ）、３．３４（ｍ，３Ｈ）、３．１０（ｍ，２Ｈ）、１．３９（ｍ，４Ｈ）、１．１６（ｍ，４Ｈ）．Ｃ１８Ｈ２５Ｆ３Ｎ６Ｏ６に対する質量計算値：４７８．４３、実測値：４７９．２（Ｍ＋Ｈ）。
化合物２３１：化合物２３０（０．６５ｇ、１．３６ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。出発材料をジメチルホルムアミドに溶解させ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（０．９０３ｍｌ、６．８ｍｍｏｌ）をシリンジによって加えた。反応物を、２．５時間にわたって油浴中で６０℃に加熱した。反応を、ＴＬＣ（７％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、減圧下で濃縮し、高真空下で一晩乾燥させた。残留物を、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（０％〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して、（０．５０４ｇ、６９．５％）の２３１を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ １１．３７（ｓ，１Ｈ）、９．３６（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．５２（ｓ，１Ｈ）、８．０８（ｓ，１Ｈ）、５．８７（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．１５（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．０７（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．３５−４．２０（ｍ，２Ｈ）、３．９１（ｍ，１Ｈ）、３．６８−３．４９（ｍ，３Ｈ）、３．３７（ｍ，１Ｈ）、３．１４（ｓ，３Ｈ）、３．１０（ｍ，２Ｈ）、３．０２（ｓ，３Ｈ）、１．３９（ｍ，４Ｈ）、１．１６（ｄｄ，Ｊ＝８．７、５．０Ｈｚ、４Ｈ）．Ｃ２１Ｈ３０Ｆ３Ｎ７Ｏ６に対する質量計算値：５３３．５１、実測値：５３４．３（Ｍ＋Ｈ）。
化合物２３２：化合物２３１（０．５ｇ、０．９３８ｍｍｏｌ）及び５ｍｌの無水ピリジンを反応フラスコに加えた。ピリジンを減圧下で取り除いた。これを３回繰り返し、反応混合物を、高真空下で一晩乾燥させた。翌日、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（０．０１１ｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）及び無水ピリジンを反応フラスコに加えた。反応物を、氷浴を用いて０℃に冷却した。反応フラスコを排気し、アルゴンでパージした。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（０．３５２ｇ、１．０４ｍｍｏｌ）を無水ピリジンに溶解させ、得られた溶液を、シリンジを介して反応フラスコに加えた。反応物を、室温にさせ、一晩撹拌した。反応を、ＴＬＣ（５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ染色を用いて発色させた。メタノールを加えて、反応をクエンチし、反応混合物を減圧下で濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾過して取り出し、母液を濃縮した。残留物を、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（０％〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して、（０．６２１ｇ、７９％）の２３２を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ １１．４０（ｓ，１Ｈ）、９．３７（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．４８（ｓ，１Ｈ）、７．９３（ｓ，１Ｈ）、７．３９−７．３１（ｍ，２Ｈ）、７．３０−７．１６（ｍ，７Ｈ）、６．８８−６．７８（ｍ，４Ｈ）、５．９２（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．１９（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．３０（ｍ，２Ｈ）、４．０１（ｍ，１Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．５７（ｍ，１Ｈ）、３．４５（ｍ，１Ｈ）、３．２５（ｄｄ，Ｊ＝１０．５、６．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．１７−３．１０（ｍ，２Ｈ）、３．０９（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ、４Ｈ）、３．０１（ｓ，３Ｈ）、１．４１（ｍ，４Ｈ）、１．１９（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、３Ｈ）．Ｃ４２Ｈ４８Ｆ３Ｎ７Ｏ８に対する質量計算値：８３５．８８、実測値：８３６．４（Ｍ＋Ｈ）。
化合物２３３：化合物２３２（１．２０ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発材料をジクロロメタンに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（０．５ｍｌ、２．８８ｍｍｏｌ）をシリンジによって加えた。２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（０．３８５ｍｌ、１．７３ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で３時間撹拌した。反応を、ＴＬＣ（１００％のＥｔＯＡｃ）によって確認し、減圧下で濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。次に、有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾過して取り出し、母液を濃縮した。残留物を、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（１０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して、（１．２１ｇ、８１．２％）の２３３を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ ９．３６（ｓ，１Ｈ）、８．４９（ｓ，１Ｈ）、７．７３（ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．６４（ｄ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．４７−７．３７（ｍ，２Ｈ）、７．３５−７．１６（ｍ，７Ｈ）、６．８３（ｍ，４Ｈ）、５．９７（ｄｄ，Ｊ＝５．４、２．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．６１−４．４４（ｍ，２Ｈ）、４．３０−４．１８（ｍ，１Ｈ）、４．１５−３．９８（ｍ，２Ｈ）、３．７６（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ、６Ｈ）、３．７１−３．５５（ｍ，４Ｈ）、３．５５−３．４１（ｍ，２Ｈ）、３．３８−３．２８（ｍ，２Ｈ）、３．１８（ｍ，２Ｈ）、３．０８−３．０１（ｍ，５Ｈ）、２．７５（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ、１Ｈ）、２．６５（ｍ，１Ｈ）、２．４６（ｓ，１Ｈ）、１．５２−１．３４（ｍ，４Ｈ）、１．２７−１．１１（ｍ，１８Ｈ）、１．０３（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ、４Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（２０２ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ １５０．９５．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ −７７．０４．
Figure 2021522810
 化合物２３５：化合物２３４（５ｇ、７．７５ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えた。出発材料をジクロロメタンに溶解させ、トリメチルアミン（４．２３ｍｌ、３１ｍｍｏｌ）をシリンジによって加えた。トリフルオロ酢酸エチル（２．７５ｇ、１９．３８ｍｍｏｌ）を反応に滴下して加えた。反応を、ＴＬＣ（５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって確認し、リンモリブデン酸を用いて発色させ、減圧下で濃縮した。残留物をジクロロメタンに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾過して取り出し、母液を濃縮し、高真空下に置いて、（４．３２ｇ ７５％）の２３５を得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ １１．３６（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ、２Ｈ）、９．３６（ｓ，１Ｈ）、７．７１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ、２Ｈ）、７．３６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、４Ｈ）、７．３１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ、４Ｈ）、７．２７−７．２０（ｍ，１０Ｈ）、６．８９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ、８Ｈ）、５．７８（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ、２Ｈ）、５．２７（ｄｄ，Ｊ＝８．１、２．１Ｈｚ、２Ｈ）、５．１０（ｄｄ，Ｊ＝６．７、２．７Ｈｚ、２Ｈ）、４．１６（ｍ，２Ｈ）、３．９５（ｍ，２Ｈ）、３．８８（ｍ，２Ｈ）、３．７３（ｓ，１３Ｈ）、３．５５（ｍ，４Ｈ）、３．３６（ｍ，１Ｈ）、３．２８（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．２２（ｄｄ，Ｊ＝１０．９、２．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．１４（ｍ，３Ｈ）、２．１１（ｓ，２Ｈ）、１．４８（ｍ，８Ｈ）、１．３６−１．１９（ｍ，８Ｈ）．Ｃ３８Ｈ４２Ｆ３Ｎ３Ｏ９に対する質量計算値：７４１．７６、実測値：７４０．２（Ｍ−Ｈ）。
化合物２３６：化合物２３５（４．３ｇ、５．８ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、排気し、アルゴンでパージした。出発材料をジクロロメタンに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（２．０２ｍｌ、１１．６ｍｍｏｌ）をシリンジによって加えた。２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（１．９３ｍｌ、８．７ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で１〜２時間撹拌した。反応を、ＴＬＣ（７５％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって確認し、減圧下で濃縮した。残留物を酢酸エチルに溶解させ、分液漏斗に加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄した。有機層を分離し、塩水溶液で洗浄した。次に、有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。固体を濾過して取り出し、母液を濃縮した。残留物を、シリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィー（１０％〜１００％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、生成物画分を組み合わせて、減圧下で濃縮して、（４．６２ｇ、８５％）の２３６を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ ９．０６（ｓ，１Ｈ）、７．７４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．４９−７．３９（ｍ，２Ｈ）、７．３９−７．２１（ｍ，７Ｈ）、６．９３−６．８３（ｍ，４Ｈ）、５．８４（ｄｄ，Ｊ＝７．０、３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．２１（ｍ，１Ｈ）、４．４５（ｍ，１Ｈ）、４．２０−３．９７（ｍ，３Ｈ）、３．９１−３．７９（ｍ，１Ｈ）、３．７７（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ、７Ｈ）、３．６３（ｍ，４Ｈ）、３．４８−３．３１（ｍ，３Ｈ）、３．２３（ｍ，１Ｈ）、２．６７（ｍ，１Ｈ）、２．５２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、２．０８（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ、１Ｈ）、１．６４−１．４５（ｍ，４Ｈ）、１．４２−１．２８（ｍ，４Ｈ）、１．２７−１．０９（ｍ，９Ｈ）、１．０５（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ、３Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ １４９．５３、１４９．０６．１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ、アセトニトリル−ｄ３）δ −８３．４３、−８３．８９（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ）．
実施例３：ｓｉＲＮＡへのリガンド（例えば、親油性部分）の合成後コンジュゲーション
Figure 2021522810
 様々な親油性部分を含む様々なリガンドが、スキーム９及び１０に示されるように、合成後コンジュゲーション方法によって、ｓｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされ得る。
実施例４：５’−コンジュゲーションのための親油性ホスホラミダイトの合成
Figure 2021522810
 化合物１０１ａ〜ｇ：化合物１００（１ｇ）を、ペプチドカップリング条件下で、アルキルカルボン酸で処理した。アルキルカルボン酸をジクロロメタンに取り込み、数分間にわたってＨＢＴＵ及びＤＩＥＡで処理した。アミンを反応混合物に加え、２時間撹拌した。反応をＴＬＣによって監視し、重炭酸塩水溶液及び塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、化合物１０１ａ〜ｇを得た。これらの分子のホスホラミダイトを、化合物１０２ａ〜ｇを生成するために、実施例１（スキーム４）に示されるようにＤＩＥＡの存在下で、それをアミダイト試薬で処理することによって作製した。
Figure 2021522810
 スキーム１２に示されるように、化合物１０４ａ〜ｇを生成するために、実施例１に示されるように、ホスホラミダイトを、アルコールをホスホラミダイト試薬で処理することによって調製した。
実施例５：チオコレステロールアミダイト及びＣＰＧの合成
Figure 2021522810
 Ｎ−（６−｛２−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル｝−６−オキソ−ヘキシル）−３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）−プロピオンアミド（７）
スキーム１３に示されるように、アミン５（７．７ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）を、無水ジクロロメタン（４０ｍＬ）に溶解させ、０℃に冷却した。溶液に、トリエチルアミン（３．０ｇ、４．２ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）及び３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）−プロピオン酸コハク酸エステル６（ＳＰＤＰ）（４．５ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）を連続して加えた。反応温度を周囲温度にし、１６時間にわたってさらに撹拌した。反応の完了を、ＴＬＣ（１０％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３、Ｒｆ＝０．６）によって確認した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３、水、続いて塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、粗生成物を得た。化合物７（１０．５８ｇ、７８％）が、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーの後、白色の泡状の固体として得られた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．４５（ｄ，１Ｈ）、７．９（ｍ，１Ｈ）、７．８（ｍ，１Ｈ）、７．７６（ｍ，１Ｈ）、７．３（ｍ，４Ｈ）、７．１８（ｍ，５Ｈ）、６．８６（ｍ，４Ｈ）、４．９８（ｄ，−ＯＨ、１Ｈ）、４．３８（ｍ，１Ｈ）、４．１（ｍ，１Ｈ）（ｓ，６Ｈ）、３．５６（ｍ，１Ｈ）、３．４６（ｍ，１Ｈ）、３．２１−３．３４（ｍ，３Ｈ）、３．１４（ｍ，１Ｈ）、３（ｍ，２Ｈ）、２．４８（ｍ，２Ｈ）、２．２（ｍ，２Ｈ）、１．８−２．０２（ｍ，２Ｈ）、１．１−１．５（４Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ．１７１．３２、１６９．９７、１５９．３６、１５８．３１、１５８．１８、１４９．８０、１４５．２７、１３８．０８、１３６．１、１３５．９、１２９．８、１２８．０、１２７．７、１２１．４、１１９．３、１１３．３、８５．３３８、６８．７、５５．３、３４．７５、３４．２８、２９．１、２６．３、２４．３６．
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリノール−チオコレステロール−ＤＭＴ−アルコール（８）
化合物７（７．５ｇ、１０．２８ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で無水ジクロロメタン（７５ｍＬ）に溶解させ、０℃に冷却した。この溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（２．７１ｇ、３．６６ｍＬ、２１ｍｍｏｌ）を加えた後、チオコレステロール（４．１４５ｇ、１０．２８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を周囲温度にし、１６時間にわたってさらに撹拌した。反応の完了を、ＴＬＣ（１００％の酢酸エチル、Ｒｆ＝０．６）によって確認した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残留物を、シリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーにかけた。４Ｌの酢酸エチルで溶離させた後、カラムを、５％のＭｅＯＨ／ジクロロメタン（２Ｌ）で溶離させて、化合物８を白色の泡状の固体（８ｇ、７６％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ７．８８（ｍ，１Ｈ）、７．３（ｍ，４Ｈ）、７．１７（ｍ，５Ｈ）、６．８４（ｍ，４Ｈ）、５．３（ｂｓ、１Ｈ）、４．８９（ｄ，−ＯＨ）、４．３８（ｍ，１Ｈ）、４．１（ｍ，１Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．５６（ｍ，１Ｈ）、３．３２（ｍ，１Ｈ）、３．１４（ｍ，１Ｈ）、３（ｍ，３Ｈ）、２．８４（ｍ，２Ｈ）、２．６４（ｍ，１Ｈ）、２．４２（ｍ，２Ｈ）、２．２（ｍ，３Ｈ）、１．８−２．０（ｍ，７Ｈ）、０．８−１．５４（ｍ，３５Ｈ）、０．６２（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １７０．８、１５８．０、１５７．９、１５５．６、１４５．０、１３９．７、１３５．８、１３５．７、１２９．５、１２７．７、１２７．５、１２１．７、１１３．１、１１３．０、８５．７、８５．１、７２．７、６８．５、６３．３、６０．７２、５６．１、５５．５、５５．２８、５４．９、４９．４、４１．８、３６．５、３５．２、３１．３、３０．３５、２７．７、２７．３、２６．０、２４．１、２３．８、２３．２、２２．６、２２．３、２１．１１、２０．５、１９．４３、１８．９、１８．５、１４．４、１１．６．
４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリノール−チオコレステロールホスホラミダイト（９）
化合物８（５．７ｇ、５．５８ｍｍｏｌ）を、無水トルエン（５０ｍＬ）と同時蒸発させた。残留物に、Ｎ，Ｎ−テトライソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．３１５ｇ、２．７９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を、４０℃で一晩、真空オーブン中で、Ｐ２Ｏ５上で乾燥させた。反応混合物をジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解させ、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホラミダイト（２．４８ｇ、２．７２ｍＬ、８．２５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を周囲温度で一晩撹拌した。反応の完了を、ＴＬＣ（酢酸エチル中Ｒｆ＝０．９）によって確認した。反応混合物をジクロロメタン（５０ｍＬ）で希釈し、５％のＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）及び塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残留物を、シリカゲル（５０：４９：１、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン：トリエチルアミン）上で精製して、９を白色の泡状の固体（６．１ｇ、８９％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｃ６Ｄ６）：δ ７．６２（ｍ，２Ｈ）、７．４５（ｍ，５Ｈ）、７．２４（ｍ，２Ｈ）、７．１（ｍ，１Ｈ）、６．８２（ｍ，４Ｈ）、５．６４（ｍ，１Ｈ）、５．３８（ｍ，１Ｈ）、４．７（ｍ，１Ｈ）、４．５４（ｍ，２Ｈ）、３．７８（ｍ，２Ｈ）、３．５（ｍ，３Ｈ）、３．３６（ｍ，９Ｈ）、３．２２（ｍ，４Ｈ）、３．０６（ｍ，３Ｈ）、２．７２（ｍ，１Ｈ）、２．３２−２．５４（ｍ，５Ｈ）、１．８−２．２（ｍ，１０Ｈ）、１．０８−１．７４（ｍ，２８Ｈ）、１．３（ｍ，６Ｈ）、０．９４（ｍ，１２Ｈ）、０．６７（ｓ，３Ｈ）．３１Ｐ ＮＭＲ（１６１．８２ＭＨｚ、Ｃ６Ｄ６）：δ １４６．０５、１４５．９１、１４５．６６、１４５．１６ １３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、Ｃ６Ｄ６）：δ １７１．４３、１７１．２５、１６９．８７、１５９．２５、１５９．１１、１４６．０８、１４１．５９、１３６．６６、１３６．６、１３０．６２、１３０．５４、１２８．６３、１２７．５３、１２７．０２、１２１．５３、１１７．７３、１１７．５７、１１３．６６、１１３．５７、８６．５９、８６．５４、６４．３６、５８．５６、５８．３７、５８．３０、５６．９６、５６．５１、５６．０７、５４．８６、５４．７７、５０．５７、５０．２７、４３．４８、４３．３５、４２．５５、４０．１３、３９．９、３９．７５、３９．５６、３８．７０、３６．９４、３６．６４、３６．２９、３６．１９、３５．９０、３４．５８、３２．２４、３２．０８、２９．４８、２９．０３、２８．９８、２８．６、２８．３８、２６．５４、２４．６８、２４．６１、２４．５４、２３．６、２３．０、２２．７４、２１．２６、２０．０３、１９．９、１９．３８、１９．０１、１２．０６．
Figure 2021522810
 ４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリノール−チオコレステロール−スクシネート（１０）
スキーム１４に示されるように、化合物８（２．２ｇ、２．１５ｍｍｏｌ）を、無水コハク酸（０．３２３ｇ、３．２３ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．０２６ｇ、０．２１５ｍｍｏｌ）と混合し、４０℃で一晩、減圧下で乾燥させた。混合物を無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させた。次に、トリエチルアミン（０．７０８ｇ、０．９７６ｍＬ、７ｍｍｏｌ）を加え、溶液を、１６時間にわたってアルゴン雰囲気下で、室温で撹拌した。次に、それをジクロロメタン（５０ｍＬ）で希釈し、氷冷クエン酸水溶液（５重量％、２５ｍＬ）及び水（２×２５ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮乾固させた。粗生成物を、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物１０を白色の泡状の固体（２．２ｇ、９２％の収率；１０％のＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３中Ｒｆ＝０．６ｓ）として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １２．２２（ｂｓ、１Ｈ）、７．８４（ｍ，１Ｈ）、７．２５（ｍ，４Ｈ）、７．２（ｍ，５Ｈ）、６．８６（ｍ，４Ｈ）、５．３６（ｍ，２Ｈ）、４．１８（ｂｓ、１Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．４−３．６（ｍ，２Ｈ）、３．２（ｍ，１Ｈ）、３．０（ｍ，４Ｈ）、２．８４（ｍ，２Ｈ）、２．６４（ｍ，２Ｈ）、２．４−２．５２（ｍ，１２Ｈ）、２．２（ｍ，６Ｈ）、１．９（ｍ，８Ｈ）、０．８−１．５２（ｍ，２８Ｈ）、０．６５（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １７３．３５、１７１．９４、１７０．６３、１６９．６４、１５７．９９、１４４．９６、１４１．０２、１３５．７２、１２９．６１、１２７．８１、１２７．５５、１１３．１２、５６．１５、５４．９９、５２．２８、４９．５８、４９．０６、４１．８２、３６．１７、３４．９７、３３．４１、３３．０９、３１．３２、２７．３９、２３．１６、２２．６８、２２．３９、２０．５６、１８．９５、１８．５４、１１．６６、６．０２、５．０
チオコレステロール（１１）で固定された固体担体
スクシネート１０（２．１ｇ、１．９ｍｍｏｌ）を、ジクロロエタン（８ｍＬ）に溶解させた。その溶液に、ＤＭＡＰ（０．２２８ｇ、１．９ｍｍｏｌ）を加えた。アセトニトリル／ジクロロエタン（３：１、８ｍＬ）中の２，２’−ジチオ−ビス（５−ニトロピリジン）（０．５８ｇ、１．９ｍｍｏｌ）を連続して加えた。得られた溶液に、アセトニトリル（４ｍｌ）中のトリフェニルホスフィン（０．４９ｇ、１．９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物は、明るいオレンジ色に変化した。溶液を、リストアクションシェーカーを用いて短時間撹拌した（５分間）。長鎖アルキルアミン−ＣＰＧ（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）（１２ｇ、１８６０μモル、１５５μｍ／ｇ）を加えた。懸濁液を４時間撹拌した。ＣＰＧを、焼結漏斗に通して濾過し、アセトニトリル、ジクロロメタン、及びエーテルで連続して洗浄した。未反応アミノ基を、無水酢酸／ピリジンを用いてマスクした。ＣＰＧ １１の担持容量を、ＵＶ測定を取ることによって測定した。（５７μＭ／ｇ）。
実施例６：クリック化学による２’−Ｏ親油性コンジュゲートの合成
Figure 2021522810
 化合物２２ａの合成：市販のプロパルギルＵ ２０ａ（５．８ｇ、１０ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解させ、及びｔｅｒｔ−ブタノール（４０ｍＬ）を加えた後、硫酸銅（１ｇ）を加えた。この混合物に、アスコルビン酸ナトリウムの水溶液を加えた後、ヘキシルアジドを加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。反応のＴＬＣは、翌日、完了を示し、反応物を、ロータリーエバポレータ中で濃縮した。残留物をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させ、溶液をセライトに通して濾過し、濃縮後の濾液及びカラム精製により、純粋な生成物２２ａ（６．９９ｇ、９６％）が白色の固体として得られた。
化合物２２ｂの合成：Ｕに使用される同様の手順を用いて、プロパルギルＣ ２０ｂ（６．２ｇ、１０ｍｍｏｌ）が、白色の固体として対応するクリック生成物２２ｂ（５．９ｇ、７８％）に変換された。
化合物２２ｃの合成：Ｕに使用される同様の手順を用いて、プロパルギルＡ ２０ｃ（７．１ｇ、１０ｍｍｏｌ）が、白色の固体として対応するクリック生成物２２ｃ（７．９ｇ、９６％）に変換された。
化合物２２ｄの合成：Ｕについて記載される同様の手順を用いて、プロパルギルＧ ２２ｄ（６．９ｇ、１０ｍｍｏｌ）が、オフホワイトの粉末として対応するクリック生成物２２ｄ（７．９ｇ、９６％）に変換された。
ホスホラミダイト２３ａ〜ｄの合成：化合物２２ａ〜ｄを、ＤＩＥＡの存在下で、ホスホラミダイト試薬で処理して、２３ａ〜ｄを生成した。
実施例７：核酸塩基修飾コンジュゲート（ピリミジン）の合成
１．５−ヨードウリジン誘導体の合成
Figure 2021522810
 ２’−Ｏ−メチル−５−ヨードウリジン（２）
ＩＣｌ（８．６ｍＬ、１７４ｍｍｏｌ）を、室温でＭｅＯＨ（４００ｍＬ）中の２’−Ｏ−メチルウリジン１（２５．０ｇ、９６．８ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合物を１５時間還流させた。得られた混合物を減圧下で濃縮した。ＤＣＭ（２００ｍＬ）を、得られた粗残留物（５８．１ｇ）に加え、次に、沈殿物を、濾過によって収集し、ＤＣＭで洗浄して、化合物２（３６．７ｇ、９９％）を白色の粉末として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：３．３１（ｓ，２Ｈ）、３．３７（ｓ，３Ｈ）、３．５３−３．５９（ｍ，１Ｈ）、３．６７−３．７２（ｍ，１Ｈ）、３．７８（ｔ，Ｊ＝４．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．８５（ｑｕ、Ｊ＝３．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．１０（ｑ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．１２（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．３０（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．７８（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．５２（ｓ，１Ｈ）、１１．６９（ｓ，１Ｈ）．
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−５−ヨードウリジン（３）
Ａｒ雰囲気下で、ＤＭＴｒＣｌ（３３．９ｇ、１００ｍｍｏｌ）を、０℃で無水ピリジン（４００ｍＬ）中の化合物３（３６．６ｇ、９５．３ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合物を室温で１４時間撹拌した。次に、反応物をＭｅＯＨでクエンチし、ＥｔＯＡｃで希釈した。有機層を水及び塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗残留物（１０８ｇ）を、カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン中０〜５０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、化合物３（５３．４ｇ、８２％）を白色の発泡体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：３．１７（ｄｄ，Ｊ＝３．０、１０．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．１７（ｄｄ，Ｊ＝５．０、１０．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．３９（ｓ，３Ｈ）、３．７３（ｓ，６Ｈ）、３．９１−３．９７（ｍ，２Ｈ）、４．１５（ｑ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．１９（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．７８（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．８７−７．４１（ｍ，１３Ｈ）、７．９９（ｓ，１Ｈ）、１１．７７（ｓ，１Ｈ）．
３’−Ｏ−［２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−５−ヨードウリジン（４）
Ａｒ雰囲気下で、ＤＩＰＥＡ（１．２ｍＬ、７．３０ｍｍｏｌ）及びｉ−Ｐｒ２ＮＰ（Ｃｌ）Ｏ（ＣＨ２）２ＣＮ（０．３９ｍＬ、１．７５ｍｍｏｌ）を、０℃で無水ＤＣＭ（１５ｍＬ）中の化合物３（１．００ｇ、１．４６ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応物を、飽和ＮａＨＣＯ３でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。組み合わされた有機層を水及び塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗残留物（１．４６ｇ）を、カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン中６０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、化合物４（８４１ｍｇ、６５％）を白色の発泡体として得た。
Figure 2021522810
 ２’−デオキシ−２’−（Ｒ）−フルオロ−５−ヨードウリジン（６）
ＩＣｌ（７．３ｍＬ、１４６ｍｍｏｌ）を、室温でＭｅＯＨ（４００ｍＬ）中の２’−デオキシ−２’−フルオロウリジン５（２０．０ｇ、８１．２ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合物を１７時間還流させた。得られた混合物を減圧下で濃縮した。ＤＣＭ（２００ｍＬ）を、得られた粗残留物（４９．１ｇ）に加え、次に、沈殿物を、濾過によって収集し、ＤＣＭで洗浄して、化合物６（２９．６ｇ、９７％）を白色の粉末として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：３．５６−３．６１（ｍ，１Ｈ）、３．７７−３．８２（ｍ，１Ｈ）、３．８６−３．８９（ｍ，１Ｈ）、４．０９−４．２１（ｍ，１Ｈ）、５．０１（ｄｄｄ，Ｊ＝１．５、５．０、５３．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．３７（ｔ，Ｊ＝４．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．５８（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．８４（ｄｄ，Ｊ＝１．５、１７．０Ｈｚ、１Ｈ）、８．５１（ｓ，１Ｈ）、１１．７１（ｓ，１Ｈ）．
２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−（Ｒ）−フルオロ−５−ヨードウリジン（７）
Ａｒ雰囲気下で、ＤＭＴｒＣｌ（２８．１ｇ、８３．０ｍｍｏｌ）を、０℃で無水ピリジン（４００ｍＬ）中の化合物６（２９．４ｇ、７９．０ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。次に、反応物を、ＭｅＯＨによってクエンチし、ＥｔＯＡｃで希釈した。有機層を水及び塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗残留物（９８．８ｇ）を、カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン中０〜５０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、化合物７（４９．５ｇ、９３％）を黄色の発泡体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：３．２０−３．２５（ｍ，２Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．９７−４．０１（ｍ，１Ｈ）、４．２６−４．３６（ｍ，１Ｈ）、５．１６（ｄｄ，Ｊ＝４．５、５３．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．６０（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．８２（ｄ，Ｊ＝２０．５Ｈｚ、１Ｈ）、６．８５−７．４１（ｍ，１３Ｈ）、８．０６（ｓ，１Ｈ）、１１．８１（ｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：５５．０、６２．４、６８．１（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ）、６９．７、８１．３、８５．６、８９．４（ｄ，Ｊ＝２８．０Ｈｚ）、９３．３（ｄ，Ｊ＝１４６Ｈｚ）、１１３．２、１２６．７、１２７．６、１２７．９、１２９．７、１３５．３、１３５．４、１４４．７、１４５．０、１４９．８、１５８．０、１５８．１、１６０．６；ＨＲＭＳ Ｃ３０Ｈ２９ＦＩＮ２Ｏ７（ＭＨ＋）に対する計算値６７５．０９９８。
３’−Ｏ−［２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−（Ｒ）−フルオロ−５−ヨードウリジン（８）
Ａｒ雰囲気下で、ＤＩＰＥＡ（１．５ｍＬ、８．９０ｍｍｏｌ）及びｉ−Ｐｒ２ＮＰ（Ｃｌ）Ｏ（ＣＨ２）２ＣＮ（０．４８ｍＬ、２．１４ｍｍｏｌ）を、０℃で無水ＤＣＭ（１５ｍＬ）中の化合物７（１．２０ｇ、１．７８ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。次に、反応物を、飽和ＮａＨＣＯ３でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。組み合わされた有機層を水及び塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗残留物（１．７１ｇ）を、カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン中６０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、化合物８（１．２９ｇ、８３％）を白色の発泡体として得た。
Figure 2021522810
 化合物１２の合成：化合物１２（ＬＮＡ誘導体）を、スキーム２における化合物８と同様の手順によって合成した。
２．５−ヨードシチジン誘導体の合成
Figure 2021522810
 ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−５−ヨードシチジン（１３）
Ａｒ雰囲気下で、Ｅｔ３Ｎ（８．１ｍＬ、５８．２ｍｍｏｌ）及びＴＭＳＣｌ（１．８ｍＬ、１４．６ｍｍｏｌ）を、０℃で無水ＭｅＣＮ（５０ｍＬ）中の３（５．００ｇ、７．２８ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合物を室温で１８時間撹拌した。次に、反応混合物を減圧下で濃縮した。残留物をＤＣＭに溶解させ、水及び塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒の蒸発により、発泡体（６．２１ｇ）が形成され、それを、Ａｒ雰囲気下で無水ＭｅＣＮ（５０ｍＬ）に溶解させた。次に、Ｅｔ３Ｎ（１５．３ｍＬ、１１０ｍｍｏｌ）、１，２，４−トリアゾール（５．０４ｇ、７３．０ｍｍｏｌ）、及びＰＯＣｌ３（１．３ｍＬ、１４．６ｍｍｏｌ）を、−４０℃でこの溶液に加えた。反応混合物を０℃で３時間撹拌し、飽和ＮａＨＣＯ３でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。次に、２８％のＮＨ３水溶液（３．０ｍＬ）を、室温でＴＨＦ（１８ｍＬ）中の得られた粗材料（６．３２ｇ）の溶液に加えた。反応混合物を室温で１５時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭに溶解させた。有機層を水及び塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗残留物（６．１０ｇ）を、カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０〜１０％のＭｅＯＨ）によって精製して、化合物１３（３．２９ｇ、３工程で６６％）を白色の発泡体として得た。
Ｎ４−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−５−ヨードシチジン（１４）
Ａｒ雰囲気下で、Ｂｚ２Ｏ（１．０２ｇ、４．４９ｍｍｏｌ）を、室温で無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の化合物１３（２．８０ｇ、４．０８ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合物を室温で１５時間撹拌した。次に、反応混合物を減圧下で濃縮した。粗残留物（４．１４ｇ）を、カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン中３０〜５０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、化合物１４（１．８４ｇ、５７％）を黄色の発泡体として得た。
Ｎ４−ベンゾイル−３’−Ｏ−［２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−５−ヨードシチジン（１５）
Ａｒ雰囲気下で、ＤＩＰＥＡ（０．５４ｍＬ、３．１７ｍｍｏｌ）及びｉ−Ｐｒ２ＮＰ（Ｃｌ）Ｏ（ＣＨ２）２ＣＮ（０．１７ｍＬ、０．７６９ｍｍｏｌ）を、０℃で無水ＤＣＭ（５．０ｍＬ）中の化合物１４（５００ｍｇ、０．６３３ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌した。次に、反応物を飽和ＮａＨＣＯ３でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。組み合わされた有機層を水及び塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗残留物（６７７ｍｇ）を、カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン中２０〜４０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、化合物１５（４００ｍｇ、６４％）を白色の発泡体として得た。
Figure 2021522810
 ２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−（Ｒ）−フルオロ−５−ヨードシチジン（１６）
Ａｒ雰囲気下で、Ｅｔ３Ｎ（３．５ｍＬ、２４．９ｍｍｏｌ）及びＴＭＳＣｌ（０．７９ｍＬ、６．２３ｍｍｏｌ）を、０℃で無水ＭｅＣＮ（２０ｍＬ）中の７（２．１０ｇ、３．１１ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合物を室温で１５時間撹拌した。次に、反応混合物を減圧下で濃縮した。残留物をＤＣＭに溶解させ、水及び塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた、溶媒の蒸発により、発泡体（２．５０ｇ）が形成され、それを、Ａｒ雰囲気下で無水ＭｅＣＮ（２０ｍＬ）に溶解させた。次に、Ｅｔ３Ｎ（６．５ｍＬ、４６．７ｍｍｏｌ）、１，２，４−トリアゾール（２．１５ｇ、３１．１ｍｍｏｌ）及びＰＯＣｌ３（０．５７ｍＬ、６．２３ｍｍｏｌ）を、−４０℃でこの溶液に加えた。反応混合物を０℃で３時間撹拌し、飽和ＮａＨＣＯ３でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。次に、２８％のＮＨ３水溶液（１．５ｍＬ）を、室温でＴＨＦ（９．０ｍＬ）中の得られた粗材料（２．４９ｇ）の溶液に加えた。反応混合物を室温で１５時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭに溶解させた。有機層を水及び塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗残留物（２．８８ｇ）を、カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中０〜１０％のＭｅＯＨ）によって精製して、化合物１６（１．４８ｇ、３工程で７０％）を褐色の発泡体として得た。
Ｎ４−ベンゾイル−２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−（Ｒ）−フルオロ−５−ヨードシチジン（１７）
Ａｒ雰囲気下で、Ｂｚ２Ｏ（４８０ｍｇ、２．１２ｍｍｏｌ）を、室温で無水ＤＭＦ（８．０ｍＬ）中の化合物１６（１．３０ｇ、１．９３ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合物を室温で１５時間撹拌した。次に、反応混合物を減圧下で濃縮した。粗残留物（２．００ｇ）を、カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン３０〜５０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、化合物１７を黄色の発泡体（８８９ｍｇ、５９％）として得た。
Ｎ４−ベンゾイル−３’−Ｏ−［２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−（Ｒ）−フルオロ−５−ヨード−シチジン（１８）
Ａｒ雰囲気下で、ＤＩＰＥＡ（０．２９ｍＬ、１．６７ｍｍｏｌ）及びｉ−Ｐｒ２ＮＰ（Ｃｌ）Ｏ（ＣＨ２）２ＣＮ（９０μＬ、０．４０１ｍｍｏｌ）を、０℃で無水ＤＣＭ（５．０ｍＬ）中の化合物１７（２６０ｍｇ、０．３３４ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌した。次に、反応物を、飽和ＮａＨＣＯ３でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。組み合わされた有機層を水及び塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗残留物（３７５ｍｇ）を、カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン中２０〜４０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、化合物１８（２８０ｍｇ、８６％）を白色の発泡体として得た。
Figure 2021522810
 化合物２１の合成：化合物２１を、スキーム２０における化合物１８と同様の手順を用いて合成した。
３．リガンド−コンジュゲートボロン酸エステルの合成
Figure 2021522810
 （Ｅ）−ｔｅｒｔ−ブチル３−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）アリルカルバメート（２２）
Ａｒ雰囲気下で、無水ＤＣＭ（１００ｍＬ）中のプロパルギルアミン（５．０ｇ、９０．８ｍｍｏｌ）を、０℃で無水ＤＣＭ（２００ｍＬ）中のＥｔ３Ｎ（２５．３ｍＬ、１８２ｍｍｏｌ）及び二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（２２．９ｍＬ、９９．９ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌した。次に、反応物を、飽和ＮＨ４Ｃｌでクエンチし、ＥｔＯＡｃで希釈した。有機層を飽和ＮＨ４Ｃｌ及び塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗製のＮ−Ｂｏｃ−プロパルギルアミン（１２．６ｇ）を褐色の油として得た。次に、Ａｒ雰囲気下で、ピナコールボラン（１７．８ｍＬ、１２３ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（１．１ｍＬ、８．１８ｍｍｏｌ）、及びＺｒＣｐ２ＨＣｌ（２．１１ｇ、８．１８ｍｍｏｌ）を、室温でこの粗材料に加えた。反応混合物を１５時間還流させた、次に、反応物を、０℃で、飽和ＮＨ４Ｃｌでクエンチし、この得られた混合物を、ＥｔＯＡｃで希釈した。有機層を、飽和ＮＨ４Ｃｌ及び塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗残留物（３５．９ｇ）を、カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン中１０〜２０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、化合物２２（１４．０ｇ、２工程で５４％）を黄色の油として得た。
Figure 2021522810
 （Ｅ）−コレステリル３−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）アリルカルバメート（２４）
化合物２２（２．６０ｇ、９．１８ｍｍｏｌ）を、ＣＦ３ＣＯＯＨ／ＤＣＭ（９：１、１００ｍＬ）に溶解させ、室温で３時間撹拌した。次に、得られた混合物を減圧下で濃縮し、残りのＣＦ３ＣＯＯＨを、同時蒸発（３×トルエン、３×ＤＣＭ）によって除去して、粗製のＴＦＡアンモニウム塩（３．０１ｇ）を褐色の油として得た。Ａｒ雰囲気下で、Ｅｔ３Ｎ（３．８ｍＬ、２７．５ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸コレステリル（４．３３ｇ、９．６４ｍｍｏｌ）を、室温で無水ＤＣＭ（５０ｍＬ）中のこの粗製アミンの溶液に加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌した。次に、反応物を、飽和ＮａＨＣＯ３でクエンチした。有機層を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗残留物（６．９０ｇ）を、カラムクロマトグラフィー（シリカ１００ｇ；溶媒：ｎ−ヘキサン中１０〜２０％のＥｔＯＡｃ）によって精製して、化合物２４を白色の発泡体（４．７６ｇ、２工程で８７％）として得た。
Figure 2021522810
 ４．鈴木−宮浦クロスカップリングによるコンジュゲーション
Figure 2021522810
 スキーム２５〜２６に示されるように、オリゴヌクレオチドの一本鎖を、リガンド（親油性部分など）にコンジュゲートし、産物を精製した後、相補鎖にハイブリダイゼーションして、ｓｉＲＮＡコンジュゲートを得た。
Figure 2021522810
 スキーム２７は、リガンド（親油性部分など）を、ＣＰＧに結合されたＲＮＡにコンジュゲートする手順を示す。
実施例８：官能化されたバイオ切断可能リンカー及びホスホラミダイト
Figure 2021522810
Figure 2021522810
 図３に示されるように、ｓｉＲＮＡコンジュゲートを、スキーム２８に示される切断可能リンカーの１つ以上の逐次添加により固体担体上で合成し他後、相補鎖にハイブリダイゼーションした。
実施例９．官能化された切断可能リンカー及びホスホラミダイト
Figure 2021522810
 図３に示されるように、ｓｉＲＮＡコンジュゲートを、スキーム２９に示される切断可能リンカーの１つ以上の逐次添加により固体担体上で合成した後、相補鎖にハイブリダイゼーションした。
実施例１０：官能化されたプロテアーゼ切断可能リンカー及びホスホラミダイト
Figure 2021522810
 図３に示されるように、ｓｉＲＮＡコンジュゲートを、スキーム３０に示される切断可能リンカーの１つ以上の逐次添加により固体担体上で合成した後、相補鎖にハイブリダイゼーションした。
実施例１１：マウスの眼におけるｍＲＮＡノックダウン
βカテニン遺伝子サイレンシングを、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）において表１ａに列挙されるｓｉＲＮＡコンジュゲートを用いて調べた後、７．５μｇ／眼（１．５μＬ）を硝子体内注入し、マウスを１４日目に殺処分した。結果が、図４に示される。
Figure 2021522810
Figure 2021522810
Figure 2021522810
Figure 2021522810
実施例１２：中枢神経系におけるｍＲＮＡノックダウン
Figure 2021522810
Figure 2021522810
 スプラーグドーリーラットの大脳皮質におけるＳＯＤ１ ｍＲＮＡ（平均±ＳＤレベル）の遺伝子サイレンシングを、内在性コントロール及びβカテニン処理群と比較して、０．９ｍｇの用量での単回髄腔内注入後に、表２に列挙されるｓｉＲＮＡコンジュゲートを用いて調べた。結果が、図５に示される。
スプラーグドーリーラットの小脳におけるＳＯＤ１ ｍＲＮＡ（平均±ＳＤレベル）の遺伝子サイレンシングを、内在性コントロール及びβカテニン処理群と比較して、０．９ｍｇの用量での単回髄腔内注入後に、表２に列挙されるｓｉＲＮＡコンジュゲートを用いて調べた。結果が、図６に示される。
スプラーグドーリーラットの頚椎におけるＳＯＤ１ ｍＲＮＡ（平均±ＳＤレベル）の遺伝子サイレンシングを、内在性コントロール及びβカテニン処理群と比較して、０．９ｍｇの用量での単回髄腔内注入後に、表２に列挙されるｓｉＲＮＡコンジュゲートを用いて調べた。結果が、図７に示される。
スプラーグドーリーラットの腰椎におけるＳＯＤ１ ｍＲＮＡ（平均±ＳＤレベル）の遺伝子サイレンシングを、内在性コントロール及びβカテニン処理群と比較して、０．９ｍｇの用量での単回髄腔内注入後に、表２に列挙されるｓｉＲＮＡコンジュゲートを用いて調べた。結果が、図８に示される。
スプラーグドーリーラットの胸椎におけるＳＯＤ１ ｍＲＮＡ（平均±ＳＤレベル）の遺伝子サイレンシングを、内在性コントロール及びβカテニン処理群と比較して、０．９ｍｇの用量での単回髄腔内注入後に、表２に列挙されるｓｉＲＮＡコンジュゲートを用いて調べた。結果が、図９に示される。
実施例１３：ｓｉＲＮＡ配列にわたる親油性修飾（Ｃ１６）の位置的影響
センス鎖及びアンチセンス鎖の両方における全ｓｉＲＮＡ配列にわたる親油性修飾の位置の影響を、ＧａｌＮＡｃコンジュゲート（表３に示される２つのＦ１２配列に基づく）を用いてマウス肝細胞において評価した。細胞を、自然取り込み（トランスフェクション剤を用いない）のために２．５及び２５０ｎＭの濃度の各ｓｉＲＮＡコンジュゲート（表３に列挙される）と共にインキュベートし、Ｆ１２ ｍＲＮＡを、ＲＴ−ｑＰＣＲによって２４時間後に測定した（図１０及び図１１に示されるように）。ウェル当たり２．５μＬの、表３からの各ｓｉＲＮＡを、３８４ウェルプレート中で約５×１０３ ＰＭＨ細胞を含む４０μＬのＷｉｌｌｉａｍ’ｓ Ｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に加えた。細胞を、ＲＮＡ精製の前に、２４時間にわたって５％のＣＯ２で、３７℃でインキュベートした。値が、非処理の対照細胞に対する割合としてプロットされる。各サンプルを技術的反復で電気泳動にかけ、各点は、２つの生体サンプルの平均±誤差％を表す。ＧＡＰＤＨが、内部対照として使用し、残りのＦ１２ ｍＲＮＡの値を、非処理の対照に対してプロットした。初代カニクイザル肝細胞の内部位置の１つにＣ１６修飾を有するＦ１２ ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性は、Ｃ１６−コンジュゲートが耐容性を示し、且つ全ての位置が等しく活性ではない、ｓｉＲＮＡ二重鎖中の領域が存在することを示した。
Figure 2021522810
Figure 2021522810
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Figure 2021522810
Figure 2021522810
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Figure 2021522810
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 実施例１４．Ｃ１６ ｓｉＲＮＡコンジュゲートの血漿タンパク質結合。
親油性修飾を有するｓｉＲＮＡ二重鎖のタンパク質（ヒト血清アルブミンを用いる）結合特性を、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を用いて決定した。二重鎖を、ヒト血清アルブミン及と共にインキュベートし、非結合分画を決定した。プロトコルについての詳細は以下の通りである。１０μＭのストック濃度の二重鎖を、１×ＰＢＳ中の０、２０、又は９０％の血清を含有する０．５μＭの最終濃度（２０μＬの総体積）に希釈した。サンプルを混合し、３０秒間にわたって遠心分離させ、次に、室温で１０分間にわたってインキュベートした。インキュベーションが完了した後、４μＬの６×ＥＭＳＡゲル−ローディング溶液を、各サンプルに加え、３０秒間にわたって遠心分離させ、１２μＬの各サンプルを、２６ウェルＢｉｏＲａｄ １０％ ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）に充填した。ゲルを、１００ボルトで１時間にわたって電気泳動にかけた。電気泳動の完了の後、ゲルを、ケーシングから取り出し、５０ｍＬの１０％のＴＢＥ（Ｔｒｉｓベース、ホウ酸及びＥＤＴＡ）で洗浄した。洗浄が完了した後、５μＬのＳＹＢＲ Ｇｏｌｄをゲルに加え、室温で１０分間にわたってインキュベートさせ、ゲルを、５０ｍＬの１０％のＴＢＥで再度洗浄した。Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＸＲ＋ゲルドキュメンテーションシステムを用いて、以下のパラメータを用いてゲルを読み取った：イメージングアプリケーションを、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄにセットし、サイズをＢｉｏ−Ｒａｄ基準ゲルに設定し、露光を、強いバンドのために自動に設定し、ハイライト飽和ピクセル（ｈｉｇｈｌｉｇｈｔ ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｐｉｘｅｌ）を１にし、色を灰色に設定した。検出、分子量分析、及び出力を全て無効にした。ゲルの透明の写真が得られたら、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ ５．２を用いて、画像を処理した。レーン及びバンドを、バンド強度を測定するために、手動で設定した。各サンプルのバンド強度を、非結合ｓｉＲＮＡに対する割合を得るために、ＰＢＳに対して正規化した。この測定から、相対的な疎水性を決定し、図１２にプロットした。二重鎖のいくつかの領域が、中程度のタンパク質結合を示し、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのより良好な活性につながった（実施例１３を参照）。
実施例１５：血漿タンパク質結合（疎水性との相関についてのＫｄ値の決定−より低い数値は、強力な結合を示す。
オリゴヌクレオチドに対するヒト血清アルブミンのＫｄ決定のための手順：ＢｉｏＲａｄ １０％ ＴＢＥゲルを、２０分間にわたって１００ボルトで予め電気泳動にかけた。１０μＭのストック濃度の二重鎖を、様々な濃度のヒト血清アルブミン（１００の増分で０μＭ〜１０００μＭ）を含有する０．５μＭの最終濃度（２０μＬの総体積）に希釈した。サンプルを混合し、３０秒間にわたって遠心分離させ、次に、室温で１０分間にわたってインキュベートした。インキュベーションが完了した後、４μＬの６×ＥＭＳＡゲル−ローディング溶液を、各サンプルに加え、３０秒間にわたって遠心分離させ、１２μＬの各サンプルを、２６ウェルＢｉｏＲａｄ １０％ ＴＢＥゲルに充填した。ゲルを、約２０分間にわたって５０ボルトで電気泳動にかけて、全サンプルをゲルに充填した。サンプルが完全に充填されたら、ゲルを、１００ボルトで１時間にわたって電気泳動にかけた。電気泳動の完了の後、ゲルを、ケーシングから取り出し、５０ｍＬの１０％のＴＢＥで洗浄した。洗浄が完了した後、５μＬのＳＹＢＲ Ｇｏｌｄをゲルに加え、室温で１０分間にわたってインキュベートさせ、ゲルを、５０ｍＬの１０％のＴＢＥで再度洗浄した。Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＸＲ＋ゲルドキュメンテーションシステムを用いて、以下のパラメータを用いてゲルを読み取った：イメージングアプリケーションを、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄにセットし、サイズをＢｉｏ−Ｒａｄ基準ゲルに設定し、露光を、強いバンドのために自動に設定し、ハイライト飽和ピクセルを１にし、色を灰色に設定した。検出、分子量分析、及び出力を全て無効にした。ゲルの透明の写真が得られたら、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ ５．２を用いて、画像を処理した。レーン及びバンドを、バンド強度を測定するために、手動で設定した。各サンプルのバンド強度を、ＨＳＡの濃度に対する結合ｓｉＲＮＡの割合を得るためにＨＳＡを含まない二重鎖のものに対して正規化した。結果が、表４〜５に示される。
Figure 2021522810
Figure 2021522810
実施例１６：ラットにおけるｓｉＲＮＡコンジュゲートの髄腔内送達（ＩＴ）−単回投与経時変化
Figure 2021522810
ラットにおけるＳＯＤ１遺伝子サイレンシング及びβ−カテニン遺伝子サイレンシングを、０．９ｍｇの用量での単回髄腔内注入後に、上のスキーム１６−Ａに示される表に列挙されるｓｉＲＮＡコンジュゲートを用いて調べた。結果が、図１３〜１５に示される。
図１３Ｂは、試験される脳及び脊髄の全ての領域を示す。図１３Ａ及び１３Ｃは、図１３Ｂに示される様々な領域におけるラットにおけるｓｉＲＮＡ二重鎖の単回ＩＴ投与後の、ＳＯＤ１のサイレンシングの結果を示す。図１３Ａ及び１３Ｃに示されるように、持続的なＳＯＤ１ ｍＲＮＡサイレンシングが、試験される脳及び脊髄の全ての領域において見られる。図１４Ａ〜１４Ｂは、単回ＩＴ投与後の、β−カテニンのサイレンシングの結果を示す。図１４Ａ〜１４Ｂに示されるように、持続的なβ−カテニンサイレンシングが、試験される脳及び脊髄の全ての領域において見られる図１５は、様々な領域におけるラットにおけるｓｉＲＮＡ二重鎖の単回ＩＴ投与後の、ＳＯＤ１のサイレンシングの結果を示す。図１５Ａは、非コンジュゲートｓｉＲＮＡレベルと比較した、ＣＳＦにおけるコンジュゲートｓｉＲＮＡレベルを示す。図に示されるように、ＣＳＦからの迅速なｓｉＲＮＡクリアランスが、コンジュゲートｓｉＲＮＡについて見られる。図１５Ｂは、非コンジュゲートｓｉＲＮＡレベルと比較した、脳におけるコンジュゲートｓｉＲＮＡレベルを示す。図に示されるように、コンジュゲートｓｉＲＮＡが、非コンジュゲートｓｉＲＮＡにわたって脳における優れた取り込み及び安定性を有することが分かる。図１５Ｃは、非コンジュゲートｓｉＲＮＡレベル及び対照ｓｉＲＮＡレベルと比較した、小脳におけるコンジュゲートｓｉＲＮＡレベルを示す。図に示されるように、コンジュゲートｓｉＲＮＡの脳における増加した取り込みが、ｍＲＮＡノックダウンの著しい改善をもたらし、これは、標的化されたサイレンシングを示している。図１５Ａ〜１５Ｃは、ＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡコンジュゲートを用いた脳において観察されるより高い薬物レベル及び堅固なサイレンシングを示す。
実施例１７：ＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡのさらなる精製
Figure 2021522810
表６は、異なる化学で修飾されたＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡを示す。対照はＣＳＦである。図１６Ａ〜１６Ｂは、様々な用量の異なる化学で修飾されたＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡを有するＳＯＤ１のサイレンシングの結果を示す。図１６Ａ〜１６Ｂに示されるように、優れたサイレンシングが、１０倍低い投与量レベルで、親ＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡと比較して、修飾ＳＯＤ１ ｓｉＲＮＡにより達成された。
実施例１８：非ヒト霊長類（ＮＨＰ）への中枢神経系ｓｉＲＮＡコンジュゲート送達の翻訳−単回投与ＮＨＰ設計の評価
Figure 2021522810
非ヒト霊長類におけるβ−カテニン遺伝子サイレンシングを、７２ｍｇのボーラス投与での単回髄腔内注入の後、上のスキーム１８−Ａに示される表に列挙されるｓｉＲＮＡコンジュゲートにより調べた。結果が、図１７〜２３に示される。
図１７は、例示的なｓｉＲＮＡ二重鎖の単回髄腔内（ＩＴ）投与後、３１日目における非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の様々な脊髄及び脳領域におけるβ−カテニンｓｉＲＮＡレベルを示す。図は、３１日の時点で、有意なｓｉＲＮＡレベルが、試験される全ての組織にわたって依然として存在していたが、ｓｉＲＮＡ取り込みは、様々な中枢神経系領域間で様々であり、ｓｉＲＮＡが肝臓においても見られたことを示す。図１８は、３１日目におけるＮＨＰにおける例示的なｓｉＲＮＡ二重鎖の単回髄腔内投与後の、β−カテニンｍＲＮＡのサイレンシングの結果を示す。図に示されるように、β−カテニンを標的とするｓｉＲＮＡコンジュゲートは、３１日の時点で、中枢神経系（脊髄及び脳領域全体）にわたって堅固なノックダウンを生じた。図１９は、単回ＩＴ投与後の、非ヒト霊長類の中枢神経系全体にわたるβ−カテニンｓｉＲＮＡの分布を示す画像を示す。図２０は、ニューロンにおけるｓｉＲＮＡ取り込みを示す画像を示す。図に示されるように、ＭＡＰ２が、ニューロンマーカーであり、β−カテニン（ＣＴＮＮＢ）ｓｉＲＮＡを、ｓｉＲＮＡ抗体により調べた。図２１は、単回ＩＴ投与後の、ミクログリアに局在するｓｉＲＮＡコンジュゲートを示す画像を示す。図に示されるように、Ｉｂａ１が、ミクログリアマーカーであり、β−カテニン（ＣＴＮＮＢ）ｓｉＲＮＡを、ｓｉＲＮＡ抗体により調べた。図２２は、単回ＩＴ投与後の、星状膠細胞に局在するｓｉＲＮＡコンジュゲートを示す画像を示す。図に示されるように、ＧＦＡＰが、星状膠細胞マーカーであり、β−カテニン（ＣＴＮＮＢ）ｓｉＲＮＡを、ｓｉＲＮＡ抗体により調べた。図２３は、区画で測られる用量で、ラット及びＮＨＰにおいて観察される遺伝子サイレンシング活性を比較する。
要約すると、標的ｍＲＮＡの持続的なサイレンシングが、ＩＴ投与後の、ラット及びＮＨＰの中枢神経系にわたって観察された。サイレンシングは、試験の最後まで延長された。異なる化学を有するｓｉＲＮＡのさらなる最適化された設計は、１０倍超改善された効力をもたらした。組織取り込みが、ｎｇ／ｇ〜ｍｇ／ｇ範囲の薬物レベルで調べられた全ての中枢神経系組織において観察された。ラット及びＮＨＰ試験の両方において、新規なｓｉＲＮＡコンジュゲートの髄腔内投与が、一般に良好な耐容性を示すことが分かった。
実施例１９：ｓｉＲＮＡへの親油部の内部コンジュゲーション
Figure 2021522810
 スキーム３１は、ｓｉＲＮＡ二重鎖への親油部の内部コンジュゲーションのための合成プロトコルを示す。スキーム３１において、親油性部分、Ｒは、Ｃ６〜Ｃ３０アルコール（例えば、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプタデカノール、オクタデカノール、オレイルアルコール、リノレイルアルコール、アラキドン酸アルコール、シス−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサノール、レチノール、ビタミンＥ、コレステロールなど）であり得る。
Figure 2021522810
 スキーム３２は、ｓｉＲＮＡ二重鎖への親油部の内部コンジュゲーションのための代替的な合成プロトコルを示す。スキーム３２において、親油性部分、Ｒは、Ｃ６〜Ｃ３０アルコール（例えば、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプタデカノール、オクタデカノール、オレイルアルコール、リノレイルアルコール、アラキドン酸アルコール、シス−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサノール、レチノール、ビタミンＥ、コレステロールなど）であり得る。
実施例２０：ｓｉＲＮＡへの親油性部分の合成後コンジュゲーション
Figure 2021522810
 スキーム３３は、ｓｉＲＮＡ二重鎖への親油部の合成後内部コンジュゲーションのためのプロトコルを示す。スキーム３３において、Ｒ又はＣＯＲ＝Ｃ６〜Ｃ３０酸（例えば、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸、オクタデカン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、シス−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサン酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ、コレステロールなどである。ＣＯＯＲ＝Ｃ６〜Ｃ３０アルコール（例えば、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプタデカノール、オクタデカノール、オレイルアルコール、リノレイルアルコール、アラキドン酸アルコール、シス−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサノール、レチノール、ビタミンＥ、コレステロールなど）である。
Figure 2021522810
 スキーム３４は、ｓｉＲＮＡ二重鎖への親油部の合成後内部コンジュゲーションのための代替的なプロトコルを示す。スキーム３４において、Ｒ、ＣＯＲ、又はＣＯＯＲ＝Ｃ６〜Ｃ３０酸（例えば、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、トリデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸、オクタデカン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、シス−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサン酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ、コレステロールなど）。ＣＯＯＲ＝Ｃ６〜Ｃ３０アルコール（例えば、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプタデカノール、オクタデカノール、オレイルアルコール、リノレイルアルコール、アラキドン酸アルコール、シス−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサノール、レチノール、ビタミンＥ、コレステロールなど）である。
実施例２１：マウスにおける内部脂質コンジュゲートのＳＡＲ
親油性の内部コンジュゲーションを有するｓｉＲＮＡの構造活性関係を、マウスにおいて調べた。この実施例における配列は、以下の表７に示される。
Figure 2021522810
Figure 2021522810
Figure 2021522810
 マウス＃１における内部脂質コンジュゲートのＳＡＲ。図２４は、３μｇ又は７．５μｇの投与量で、表７に示される様々な例示的なｓｉＲＮＡ二重鎖を投与した後の、１４日目におけるマウスの眼におけるＴＴＲ ｍＲＮＡレベルの結果を示す。上記の表７に示されるように、ｓｉＲＮＡは、センス鎖の内部位置に親油性部分（オレイル、Ｃ１６、Ｃ１４、Ｃ１２、又はＣ１０）をコンジュゲートすることによって修飾される。図２４に示されるように、親油性コンジュゲーションを有するｓｉＲＮＡのＴＴＲノックダウン能力は、オレイル（Ｃ１８）≧Ｃ１６＞Ｃ１４＞Ｃ１２＞Ｃ１０である。この結果は、ｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性に対する疎水性の影響を示す。
Figure 2021522810
マウス＃２における内部脂質コンジュゲートのＳＡＲ。図２５は、７．５μｇの投与量で、表７に示される様々な例示的なｓｉＲＮＡ二重鎖を投与した後の、１４日目におけるマウスの眼におけるＴＴＲ ｍＲＮＡレベルの結果を示す。図２５に示されるように、オレイル（Ｃ１８）、アラキドン酸、及びビタミンＡコンジュゲートとコンジュゲートされたｓｉＲＮＡは、他のコンジュゲートより良好なＴＴＲノックダウン能力を有していた。
Figure 2021522810
マウスにおける内部Ｃ１６コンジュゲートを伴う５’ＡＳ鎖ＳＡＲ。図２６は、７．５μｇの投与量で、表７に示される様々な例示的なｓｉＲＮＡ二重鎖の硝子体内の投与後の、１４日目におけるマウスの眼におけるＴＴＲ ｍＲＮＡレベルの結果を示す。上記の表７に示されるように、ｓｉＲＮＡは、センス鎖の内部位置に親油性部分（Ｃ１６）、及びアンチセンス鎖の５’末端に様々な修飾（例えば、２キラルＰＳ；２’−ＯＭｅ；ＶＰ；１キラルＰＳ；ＰＯ３；ＤＮＡ；ＲＮＡ；２’−Ｆ；リン酸塩プロドラッグ）をコンジュゲートすることによって修飾される。
Figure 2021522810
引用文献
以下の列挙される項目を含む、本明細書で言及した全ての刊行物及び特許は、各個々の刊行物又は特許が具体的に且つ個別に参照により組み入れられていることが示されているかのように、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられる。矛盾がある場合、本明細書中の任意の定義を含む本出願が優先される。

Claims (56)

  1. 標的遺伝子に相補的なアンチセンス鎖；
    前記アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖；及び
    任意選択でリンカー又は担体を介して、少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分
    を含む二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  2. ｌｏｇＫｏｗによって測定される、前記親油性部分の親油性が、０を超える、請求項１に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  3. 前記二本鎖ｉＲＮＡ剤の血漿タンパク質結合アッセイにおいて非結合分画によって測定される、前記二本鎖ｉＲＮＡ剤の疎水性が、０．２を超える、請求項１に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  4. 前記血漿タンパク質結合アッセイが、ヒト血清アルブミンタンパク質を用いた電気泳動移動度シフトアッセイである、請求項３に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  5. 前記内部位置が、前記鎖の各末端から末端の２つの位置を除く全ての位置を含む、請求項１に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  6. 前記内部位置が、前記鎖の各末端から末端の３つの位置を除く全ての位置を含む、請求項５に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  7. 前記内部位置が、前記センス鎖の切断部位領域を除く、請求項５又は６に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  8. 前記内部位置が、前記センス鎖の５’末端から数えて９〜１２位を除く、請求項７に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  9. 前記内部位置が、前記センス鎖の３’末端から数えて１１〜１３位を除く、請求項７に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  10. 前記内部位置が、前記アンチセンス鎖の切断部位領域を除く、請求項５又は６に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  11. 前記内部位置が、前記アンチセンス鎖の５’末端から数えて１２〜１４位を除く、請求項１０に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  12. 前記内部位置が、３’末端から数えて、前記センス鎖の１１〜１３位、及び５’末端から数えて、前記アンチセンス鎖の１２〜１４位を除く、請求項５又は６に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  13. １つ以上の親油性部分が、以下の内部位置：各鎖の５’末端から数えて、前記センス鎖上の４〜８及び１３〜１８位、並びに前記アンチセンス鎖上の６〜１０及び１５〜１８位のうちの１つ以上にコンジュゲートされる、請求項１に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  14. １つ以上の親油性部分が、以下の内部位置：各鎖の５’末端から数えて、前記センス鎖上の５、６、７、１５、及び１７位、並びに前記アンチセンス鎖上の１５及び１７位のうちの１つ以上にコンジュゲートされる、請求項１３に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  15. 前記センス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ、１５〜３０ヌクレオチド長である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  16. 前記センス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ、１９〜２５ヌクレオチド長である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  17. 前記センス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれ、２１〜２３ヌクレオチド長である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  18. 前記センス鎖が、２１ヌクレオチド長であり、前記アンチセンス鎖が、２３ヌクレオチド長であり、ここで、前記鎖が、３’末端に２ヌクレオチド長の一本鎖オーバーハングを有する２１の連続した塩基対の二本鎖領域を形成する、請求項１７に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  19. 前記親油性部分が、脂肪族、脂環式、又は多脂環式化合物である、請求項１に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  20. 前記親油性部分が、脂質、コレステロール、レチノイン酸、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキサノール、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジンである、請求項１９に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  21. 前記親油性部分が、飽和又は不飽和Ｃ４〜Ｃ３０炭化水素鎖、並びにヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジド、及びアルキンからなる群から選択される任意選択の官能基を含有する、請求項１９に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  22. 前記親油性部分が、飽和又は不飽和Ｃ６〜Ｃ１８炭化水素鎖を含有する、請求項２１に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  23. 前記親油性部分が、飽和又は不飽和Ｃ１６炭化水素鎖を含有する、請求項２２に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  24. 前記親油性部分が、前記内部位置において１つ以上のヌクレオチドを置換する担体を介してコンジュゲートされる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  25. 前記担体が、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、及びデカリニルからなる群から選択される環状基であるか；又はセリノール骨格若しくはジエタノールアミン骨格に基づく非環状部分である、請求項２４に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  26. 前記親油性部分が、エーテル、チオエーテル、尿素、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド−チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホンアミド結合、クリック反応の生成物、又はカルバメートを含むリンカーを介して、前記二本鎖ｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  27. 前記ｉＲＮＡ剤が、末端の少なくとも１つに一本鎖オーバーハングを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  28. 前記一本鎖オーバーハングが、１、２又は３ヌクレオチド長である、請求項２７に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  29. 前記親油性部分が、核酸塩基、糖部分、又はヌクレオシド間結合にコンジュゲートされる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  30. 前記アンチセンス鎖の５’末端にリン酸塩又はリン酸塩模倣体をさらに含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  31. 前記リン酸塩模倣体が、５’−ビニルホスホネート（ＶＰ）である、請求項３０に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  32. 中枢神経系組織への送達を媒介する受容体を標的とする標的化リガンドをさらに含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  33. 前記標的化リガンドが、Ａｎｇｉｏｐｅｐ−２、リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）リガンド、ｂＥｎｄ．３細胞結合リガンド、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）リガンド、マンノース受容体リガンド、グルコーストランスポータータンパク質、及びＬＤＬ受容体リガンドからなる群から選択される、請求項３２に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  34. 眼組織への送達を媒介する受容体を標的とする標的化リガンドをさらに含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  35. 前記標的化リガンドが、トランス−レチノール、ＲＧＤペプチド、ＬＤＬ受容体リガンド、及び糖質系リガンドからなる群から選択される、請求項３４に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  36. 前記ＲＧＤペプチドが、Ｈ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−ＯＨ又はＣｙｃｌｏ（−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ）である、請求項３５に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  37. 肝組織を標的とする標的化リガンドをさらに含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  38. 前記標的化リガンドが、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートである、請求項３７に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  39. 前記親油性部分又は標的化リガンドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ジスルフィド、アミド、ガラクトサミン、グルコサミン、グルコース、ガラクトース、マンノースの官能化単糖又はオリゴ糖、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるバイオ切断可能リンカーを介してコンジュゲートされる、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  40. 前記センス鎖の３’末端が、アミンを有する環状基であるエンドキャップを介して保護され、前記環状基が、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、及びデカリニルからなる群から選択される、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  41. 細胞内での標的遺伝子の発現を低下させる方法であって、前記細胞を、
    標的遺伝子に相補的なアンチセンス鎖；
    前記アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖；及び
    任意選択でリンカー又は担体を介して、少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分
    を含む二本鎖ｉＲＮＡ剤と接触させるステップを含む、方法。
  42. 前記細胞が、肝臓外細胞である、請求項４１に記載の方法。
  43. ｌｏｇＫｏｗによって測定される、前記親油性部分の親油性が、０を超える、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記二本鎖ｉＲＮＡ剤の血漿タンパク質結合アッセイにおいて非結合分画によって測定される、前記二本鎖ｉＲＮＡ剤の疎水性が、０．２を超える、請求項４１に記載の方法。
  45. 前記血漿タンパク質結合アッセイが、ヒト血清アルブミンタンパク質を用いた電気泳動移動度シフトアッセイである、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記親油性部分が、飽和又は不飽和Ｃ１６炭化水素鎖を含有する、請求項４１に記載の方法。
  47. 対象における標的遺伝子の発現を低下させる方法であって、
    標的遺伝子に相補的なアンチセンス鎖；
    前記アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖；及び
    任意選択でリンカー又は担体を介して、少なくとも１つの鎖上の１つ以上の内部位置にコンジュゲートされた１つ以上の親油性部分
    を含む二本鎖ｉＲＮＡ剤を前記対象に投与するステップを含む、方法。
  48. 前記二本鎖ｉＲＮＡ剤が、肝臓外で投与される、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記二本鎖ｉＲＮＡ剤が、髄腔内に投与される、請求項４８に記載の方法。
  50. 脳又は脊椎組織における標的遺伝子の発現を低下させる、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記脳又は脊椎組織が、大脳皮質、小脳、頚椎、腰椎、及び胸椎からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記標的遺伝子が、ＡＰＰ、ＡＴＸＮ２、Ｃ９ｏｒｆ７２、ＴＡＲＤＢＰ、ＭＡＰＴ（タウ）、ＨＴＴ、ＳＮＣＡ、ＦＵＳ、ＡＴＸＮ３、ＡＴＸＮ１、ＳＣＡ１、ＳＣＡ７、ＳＣＡ８、ＭｅＣＰ２、ＰＲＮＰ、ＳＯＤ１、ＤＭＰＫ、及びＴＴＲからなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
  53. 前記二本鎖ｉＲＮＡ剤が、硝子体内に投与される、請求項５２に記載の方法。
  54. 眼組織内での標的遺伝子の発現を低下させる、請求項５３に記載の方法。
  55. 中枢神経系疾患に罹患している対象を治療する方法であって、
    治療有効量の請求項１〜４０のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤を前記対象に投与し、それによって前記対象を治療するステップを含む、方法。
  56. 前記中枢神経系疾患が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭認知症、ハンチントン病、パーキンソン病、脊髄小脳失調、プリオン病、及びラフォラ病の群から選択される、請求項５５に記載の方法。
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