CN112400018A - 肝外递送 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因沉默的方法，该方法包括向有需要的细胞或受试者施用治疗有效量的任选地经由接头或载体在至少一个链上的一个或多个内部位置处缀合了亲脂性部分的双链iRNA。

Description

肝外递送
本申请要求于2018年5月7日提交的美国临时申请号62/668,072；于2018年9月28日提交的美国临时申请号62/738,747；以及于2018年11月29日提交的美国临时申请号62/773,082的优先权，将其均通过引用以其整体并入本文。
背景技术
在体内将iRNA剂递送至细胞需要特异性靶向以及来自细胞外环境，特别是血清蛋白的实质性保护。基于RNAi的疗法显示用于治疗肝脏相关障碍的有前景的临床数据。然而，将siRNA递送至肝外组织仍是障碍，限制基于siRNA的疗法的使用。
限制在体内iRNA剂的实验及治疗应用的因素之一是有效递送完整siRNA的能力。特定困难已与非病毒基因在体内转移至视网膜中相关。挑战之一是克服阻碍视网膜转染的内界膜。另外，已显示玻璃体的带负电荷的糖与阳性DNA-转染剂复合物相互作用，促进其聚集，这阻碍扩散及细胞摄取。
由于游离寡核苷酸无法穿过的血脑屏障(BBB)，寡核苷酸向中枢神经系统(CNS)的递送引起特定问题。将寡核苷酸递送至CNS中的一种方式是通过鞘内递送。然而，寡核苷酸也需要有效内化至CNS的靶细胞中以实现期望的治疗效果。先前的研究通常使用诸如脂质体、阳离子脂质及纳米颗粒形成复合物的递送试剂，以帮助寡核苷酸细胞内内化至神经元起源的细胞中。
因此，持续需要用于在体内递送siRNA分子而不使用组织递送试剂的新的改进的方法，以实现及增强iRNA剂的治疗潜力。
发明内容
本发明的一个方面提供了双链iRNA剂，该iRNA剂包含：与靶基因互补的反义链；与所述反义链互补的有义链；以及任选地经由接头或载体与至少一个链上的一个或多个内部位置缀合的一个或多个亲脂部分。
在一些实施例中，通过辛醇-水分配系数logKow测量的亲脂性部分的亲脂性超过0。亲脂性部分的logKow可超过1、超过1.5、超过2、超过3、超过4、超过5或超过10。
在一些实施例中，通过双链iRNA剂的血浆蛋白结合测定中的未结合分数测量的双链iRNA剂的疏水性超过0.2。在一个实施例中，测定的血浆蛋白结合测定是使用人类血清白蛋白的电泳迁移率变化测定(EMSA)。通过结合测定中未结合的siRNA的分数测量的双链iRNA剂的疏水性超过0.15、超过0.2、超过0.25、超过0.3、超过0.35、超过0.4、超过0.45或超过0.5以增强siRNA的体内递送。
在一些实施例中，亲脂性部分为脂肪族、环状诸如脂环族、或多环，诸如聚脂环化合物，诸如类固醇(例如固醇)或直链或支链脂肪族烃。示例性亲脂性部分是脂质、胆固醇、视黄酸、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、布洛芬、萘普生、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪。
适合的亲脂性部分也包括含有饱和或不饱和C4-C30烃链(例如C4-C30烷基或烯基)及选自由以下组成的组的任选的官能团的亲脂性部分：羟基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、叠氮基及炔烃。这些官能团可用于将亲脂性部分附接至iRNA剂。在一些实施例中，亲脂性部分含有饱和或不饱和C6-C18烃链(例如直链C6-C18烷基或烯基)。在一个实施例中，亲脂性部分含有饱和或不饱和C16烃链(例如直链C16烷基或烯基)。
在一些实施例中，亲脂性部分为C6-C30酸(例如，己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、维生素A、维生素E、胆固醇等)或C6-C30醇(例如，己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇、十三烷醇、十四烷醇、十五烷醇、十六烷醇、十七烷醇、十八烷醇、油醇、亚麻醇、花生四烯醇、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯醇、视黄醇、维生素E、胆固醇等)。
亲脂性部分可经由直接附接于iRNA剂的核糖而与iRNA剂缀合。可替代地，亲脂性部分可经由接头或载体与iRNA剂缀合。
在某些实施例中，亲脂性部分经由一个或多个接头(系链)与iRNA剂缀合。
在一些实施例中，亲脂性部分经由接头与双链iRNA剂缀合，该接头含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、酰胺、马来酰亚胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺酰胺键、点击反应的产物(例如，来自叠氮化物-炔烃环加成的三唑)或氨基甲酸酯。
在一些实施例中，至少一个接头(系链)是氧化还原可裂解接头(诸如还原可裂解接头，例如二硫化物基团)、酸可裂解接头(例如，腙基、酯基、缩醛基或缩酮基)、酯酶可裂解接头(例如，酯基)、磷酸酶可裂解接头(例如，磷酸酯)或肽酶可裂解接头(例如，肽键)。
在其他实施例中，至少一个接头(系链)是生物可裂解接头，该生物可裂解接头选自由以下组成的组：DNA，RNA，二硫化物，酰胺，半乳糖胺、葡糖胺、葡萄糖、半乳糖、甘露糖的官能化单糖或寡糖及其组合。
在某些实施例中，亲脂性部分经由替换一个或多个核苷酸的载体与双链iRNA剂缀合。载体可以是环状基团或非环状基团。在一个实施例中，环状基团选自由以下组成的组：吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基及十氢化萘。在一个实施例中，非环状基团为基于丝氨醇主链或二乙醇胺主链的部分。
在一些实施例中，载体替换双链iRNA剂的内部位置中的一个或多个核苷酸。
在其他实施例中，载体替换有义链或反义链末端的核苷酸。在一个实施例中，载体替换有义链3’端上的末端核苷酸，从而充当保护有义链3’端的端帽。在一个实施例中，载体为具有胺的环状基团，例如，载体可以是吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基或十氢化萘基。
在一个实施例中，亲脂性部分与至少一个链上的一个或多个内部位置缀合，其包括除链各端的末端两个位置之外的所有位置。在一个实施例中，亲脂性部分与至少一个链上的一个或多个内部位置缀合，其包括除链各端的末端三个位置之外的所有位置。
在一个实施例中，至少一个亲脂性部分与双螺旋区的至少一端的一个或多个位置缀合，其包括双螺旋区内的所有位置，但不包括突出端区或替换了有义链3’端的末端核苷酸的载体。
在一个实施例中，至少一个亲脂性部分缀合在双螺旋区的反义链5’端的前五个碱基对内的有义链上。
在一个实施例中，至少一个亲脂性部分缀合在双螺旋区的反义链5’端的前四个碱基对内的有义链上。
在一个实施例中，至少一个亲脂性部分缀合在双螺旋区的反义链5’端的前三个碱基对内的有义链上。
在一个实施例中，至少一个亲脂性部分缀合在双螺旋区的反义链5’端的前两个碱基对内的有义链上。
在一个实施例中，至少一个亲脂性部分缀合在双螺旋区的反义链5’端的第一碱基对上的有义链上。
在一个实施例中，亲脂性部分与至少一个链上的一个或多个内部位置缀合，其不包括有义链的裂解位点区。举例而言，内部位置不包括自有义链5’端计数的位置9-12。例如，内部位置不包括自有义链5’端计数的位置9-11。可替代地，内部位置不包括自有义链3’端计数的位置11-13。
在一个实施例中，亲脂性部分与至少一个链上的一个或多个内部位置缀合，其不包括反义链的裂解位点区。举例而言，内部位置不包括自有义链5’端计数的位置12-14。
在一个实施例中，亲脂性部分与至少一个链上的一个或多个内部位置缀合，其不包括有义链上自3’端计数的位置11-13及反义链上自5’端计数的位置12-14。
在一个实施例中，一个或多个亲脂性部分与以下内部位置中的一个或多个缀合：从各链的5’端计数，有义链上的位置4-8和13-18，以及反义链上的位置6-10和15-18。
在一个实施例中，一个或多个亲脂性部分与以下内部位置中的一个或多个缀合：从各链的5’端计数，有义链上的位置5、6、7、15和17，以及反义链上的位置15和17。
在一些实施例中，双链iRNA剂的有义链及反义链的长度各自为15至30个核苷酸。
在一个实施例中，双链iRNA剂的有义链及反义链的长度各自为19至25个核苷酸。
在一个实施例中，双链iRNA剂的有义链及反义链的长度各自为21至23个核苷酸。
在一些实施例中，双链iRNA剂包含至少一个末端上的单链突出端，例如长度为1-10个核苷酸的3’和/或5’突出端，例如1、2、3、4、5或6个核苷酸的突出端。在一些实施例中，两个链在双链区中具有至少一段1-5(例如，1、2、3、4或5)个单链核苷酸。在一个实施例中，单链突出端长度为1、2或3个核苷酸。在一些实施例中，双链iRNA剂也可具有平端，位于反义链的5’端(或有义链的3’端)，或反之亦然。在一个实施例中，双链iRNA剂在反义链的3’端包含3’突出端，并且任选地在反义链的5’端包含平端。在一个实施例中，双链iRNA剂在有义链的5’端具有5’突出端，并且任选地在反义链的5’端具有平端。在一个实施例中，双链iRNA剂在iRNA双链体的两端具有两个平端。
在一个实施例中，双链iRNA剂的有义链长度为21个核苷酸，并且反义链长度为23个核苷酸，其中这些链形成21个连续碱基对的双链区且在3’端具有2个核苷酸长的单链突出端。
在一些实施例中，亲脂性部分与双链iRNA剂的核碱基、糖部分或核苷间键缀合。
在一些实施例中，双链iRNA剂进一步包含在反义链的5’端的磷酸酯或磷酸酯模拟物。在一个实施例中，磷酸酯模拟物为5’-乙烯基膦酸酯(VP)。
在一些实施例中，双链iRNA剂的反义链的5’端不含有5’-乙烯基膦酸酯(VP)。
在一些实施例中，双链iRNA剂进一步包含至少一个末端手性磷原子。
核苷酸间键的位点特异性手性修饰可发生在链的5’端、3’端或5’端及3’端。其在本文中称为“末端”手性修饰。末端修饰可发生在末端区的3’或5’末端位置，例如在链的末端核苷酸上或在最后2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸内的位置。手性修饰可发生在有义链、反义链或有义链及反义链。每个手性纯磷原子可呈Rp构型或Sp构型及其组合。关于手性修饰及经手性修饰的dsRNA剂的更多详情可见于2018年12月21日提交的名称为“经手性修饰的双链RNA剂(Chirally-Modified Double-Stranded RNA Agents)”的PCT/US 18/67103，将其通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，双链iRNA剂进一步包含在反义链3’端的第一核苷酸间键处发生的具有Sp构型的键联磷原子的末端手性修饰；在反义链5’端的第一核苷酸间键处发生的具有Rp构型的键联磷原子的末端手性修饰；以及在有义链5’端的第一核苷酸间键处发生的具有Rp构型或Sp构型的键联磷原子的末端手性修饰。
在一个实施例中，双链iRNA剂进一步包含在反义链3’端的第一及第二核苷酸间键处发生的具有Sp构型的键联磷原子的末端手性修饰；在反义链5’端的第一核苷酸间键处发生的具有Rp构型的键联磷原子的末端手性修饰；以及在有义链5’端的第一核苷酸间键处发生的具有Rp或Sp构型的键联磷原子的末端手性修饰。
在一个实施例中，双链iRNA剂进一步包含在反义链3’端的第一、第二及第三核苷酸间键处发生的具有Sp构型的键联磷原子的末端手性修饰；在反义链5’端的第一核苷酸间键处发生的具有Rp构型的键联磷原子的末端手性修饰；以及在有义链5’端的第一核苷酸间键处发生的具有Rp或Sp构型的键联磷原子的末端手性修饰。
在一个实施例中，双链iRNA剂进一步包含在反义链3’端的第一及第二核苷酸间键处发生的具有Sp构型的键联磷原子的末端手性修饰；在反义链3’端的第三核苷酸间键处发生的具有Rp构型的键联磷原子的末端手性修饰；在反义链5’端的第一核苷酸间键处发生的具有Rp构型的键联磷原子的末端手性修饰；以及在有义链5’端的第一核苷酸间键处发生的具有Rp或Sp构型的键联磷原子的末端手性修饰。
在一个实施例中，双链iRNA剂进一步包含在反义链3’端的第一及第二核苷酸间键处发生的具有Sp构型的键联磷原子的末端手性修饰；在反义链5’端的第一及第二核苷酸间键处发生的具有Rp构型的键联磷原子的末端手性修饰；以及在有义链5’端的第一核苷酸间键处发生的具有Rp或Sp构型的键联磷原子的末端手性修饰。
在一些实施例中，双链iRNA剂在反义链上的前五个核苷酸处具有至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)。
在一些实施例中，反义链包含被1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个磷酸酯核苷酸间键分开的具有一个、两个或三个硫代磷酸酯核苷酸间键的两个嵌段。
在一些实施例中，双链iRNA剂进一步包含靶向配体，该靶向配体靶向介导递送至特定CNS组织的受体。在一个实施例中，靶向配体选自由以下组成的组：血管肽-2(Angiopep-2)、脂蛋白受体相关蛋白(LRP)配体、bEnd.3细胞结合配体、运铁蛋白受体(TfR)配体、甘露糖受体配体、葡萄糖转运蛋白及LDL受体配体。
在一些实施例中，双链iRNA剂进一步包含靶向配体，该靶向配体靶向介导递送至眼组织的受体。在一个实施例中，靶向配体选自由以下组成的组：反式视黄醇、RGD肽、LDL受体配体及基于碳水化合物的配体。在一个实施例中，靶向配体为RGD肽，诸如H-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-Cys-OH或Cyclo(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)。
在一些实施例中，双链iRNA剂进一步包含靶向肝组织的靶向配体。在一些实施例中，靶向配体为基于碳水化合物的配体。在一个实施例中，靶向配体为GalNAc缀合物。
所有上述方面及实施例将适用于具有与寡核苷酸上的一个或多个内部位置缀合的一个或多个亲脂性部分的寡核苷酸。在一些实施例中，100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％的寡核苷酸经修饰。例如，当50％的寡核苷酸经修饰时，寡核苷酸中存在的所有核苷酸的50％含有如本文所述的修饰。
在一个实施例中，寡核苷酸为双链dsRNA剂，并且双链dsRNA剂的至少50％的核苷酸独立地经2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-脱氧或2’-氟修饰。
在一个实施例中，寡核苷酸为反义的，并且反义的至少50％的核苷酸独立地经LNA、CeNA、2’-甲氧基乙基或2’-脱氧修饰。
在一些实施例中，双链iRNA剂在有义链上具有少于12个、少于10个、少于8个、少于6个、少于4个、少于2个或不具有2’-F修饰。在一些实施例中，双链iRNA剂在反义链上具有少于12个、少于10个、少于8个、少于6个、少于4个、少于2个或不具有2’-F修饰。
在一些实施例中，双链iRNA剂在有义链或反义链的任何位置上具有一个或多个2’-F修饰。
在一些实施例中，双链iRNA剂具有少于20％、少于15％、少于10％、少于5％的非天然核苷酸，或基本上不含非天然核苷酸。非天然核苷酸的实例包括无环核苷酸、LNA、HNA、CeNA、2’-O-甲氧基烷基(例如，2’-O-甲氧基甲基、2’-O-甲氧基乙基或2’-O-2-甲氧基丙基)、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-氟、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-ara-F、L-核苷修饰(诸如2’-修饰的L-核苷，例如2’-脱氧-L-核苷)、BNA无碱基糖、无碱基环状及开链烷基。
在一些实施例中，双链iRNA剂具有大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或几乎100％的天然核苷酸。出于这些实施例的目的，天然核苷酸可以包括具有2’-OH、2’-脱氧及2’-OMe的天然核苷酸。
在一个实施例中，双链iRNA剂包含各自具有15-30个核苷酸的长度的有义链及反义链；在反义链上的前五个核苷酸处的至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；其中双螺旋区在19至25个碱基对之间(优选地19、20、21或22个)；其中双链iRNA剂具有少于20％、少于15％、少于10％、少于5％的非天然核苷酸，或基本上不具有非天然核苷酸。
在一个实施例中，双链iRNA剂包含各自具有15-30个核苷酸的长度的有义链及反义链；在反义链上的前五个核苷酸处的至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；其中双螺旋区在19至25个碱基对之间(优选地19、20、21或22个)；其中双链iRNA剂具有大于80％、大于85％、大于95％或几乎100％的天然核苷酸，诸如具有2’-OH、2’-脱氧或2’-OMe的天然核苷酸。
本发明的另一方面涉及降低细胞中的靶基因表达的方法，该方法包括使所述细胞与双链iRNA剂接触，该双链iRNA剂包含与靶基因互补的反义链；与所述反义链互补的有义链；以及任选地经由接头或载体与至少一个链上的一个或多个内部位置缀合的一个或多个亲脂部分。
在涉及双链iRNA剂的本发明的第一方面中，涉及亲脂性部分及其与双链iRNA剂的缀合的所有上述实施例适合于与降低细胞中的靶基因表达的方法相关的本发明的此方面。
在一个实施例中，细胞为肝外细胞。
本发明的另一方面涉及降低受试者体内的靶基因表达的方法，该方法包括向该受试者施用双链iRNA剂，包括使所述细胞与双链iRNA剂接触，该双链iRNA剂包含与靶基因互补的反义链；与所述反义链互补的有义链；以及任选地经由接头或载体与至少一个链上的一个或多个内部位置缀合的一个或多个亲脂部分。
在涉及双链iRNA剂的本发明的第一方面中，涉及亲脂性部分及其与双链iRNA剂的缀合的所有上述实施例适合于与降低受试者中的靶基因表达的方法相关的本发明的此方面。
在一些实施例中，将双链iRNA剂肝外施用。
在一个实施例中，将双链iRNA剂鞘内施用。通过鞘内施用双链iRNA剂，该方法可降低脑或脊柱组织(例如皮质、小脑、颈椎、腰椎及胸椎)中的靶基因表达。
在一些实施例中，示例性靶基因为APP、ATXN2、C9orf72、TARDBP、MAPT(Tau)、HTT、SNCA、FUS、ATXN3、ATXN1、SCA1、SCA7、SCA8、MeCP2、PRNP、SOD1、DMPK及TTR。为了降低受试者体内的这些靶基因的表达，可玻璃体内施用双链iRNA剂。通过玻璃体内施用双链iRNA剂，该方法可降低眼组织中的靶基因的表达。
本发明的另一方面涉及治疗患有CNS障碍的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的双链RNAi剂，从而治疗该受试者。双链RNAi剂包含与靶基因互补的反义链；与所述反义链互补的有义链；以及任选地经由接头或载体与至少一个链上的一个或多个内部位置缀合的一个或多个亲脂部分。
在涉及双链iRNA剂的本发明的第一方面中，涉及亲脂性部分及其与双链iRNA剂的缀合的所有上述实施例适合于与治疗患有CNS障碍的受试者的方法相关的本发明的此方面。可通过本发明的方法治疗的示例性CNS障碍包括阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞叶型痴呆、亨廷顿病(huntington)、帕金森病(Parkinson)、脊髓小脑病、朊病毒病及拉福拉病(lafora)。
附图说明
图1是显示在有义链或反义链的内部位置(即，siRNA序列内的某处)与siRNA缀合的配体(诸如亲脂性部分)的示意图。
图2是显示在有义链或反义链的3’和/或5’端通过接头或载体与siRNA缀合的配体(诸如亲脂性部分)的示意图。
图3是显示经由生物可裂解接头与siRNA缀合的配体(诸如亲脂性部分)的示意图。
图4是显示在小鼠通过玻璃体内注射各种示例性siRNA缀合物使β联蛋白基因(眼CTNNB1)沉默的结果的图。
图5是显示通过在斯普拉-道来大鼠(Sprague Dawley Rat)的皮质中单次鞘内注射各种示例性siRNA缀合物使SOD1 mRNA沉默的结果的图。
图6是显示通过在斯普拉-道来大鼠的小脑中单次鞘内注射各种示例性siRNA缀合物使SOD1 mRNA沉默的结果的图。
图7是显示通过在斯普拉-道来大鼠的颈椎中单次鞘内注射各种示例性siRNA缀合物使SOD1 mRNA沉默的结果的图。
图8是显示通过在斯普拉-道来大鼠的腰椎中单次鞘内注射各种示例性siRNA缀合物使SOD1 mRNA沉默的结果的图。
图9是显示通过在斯普拉-道来大鼠的胸椎中单次鞘内注射各种示例性siRNA缀合物使SOD1 mRNA沉默的结果的图。
图10显示在2.5及250nM浓度下与通过在反义链及有义链的各位置缀合亲脂性部分(C16)而修饰的F12 siRNA孵育的细胞的初级食蟹猴肝细胞(PCH)自由摄取(无转染剂)的结果，该结果是通过在24小时后使用RT-qPCR测量F12 mRNA水平所得。
图11显示在2.5及250nM浓度下与通过在反义链及有义链的各位置缀合亲脂性部分(C16)而修饰的F12 siRNA孵育的细胞的初级食蟹猴肝细胞(PCH)自由摄取(无转染剂)的结果，该结果是通过在24小时后使用RT-qPCR测量F12 mRNA水平所得。
图12显示通过在反义链及有义链的各位置缀合亲脂性部分(C16)而修饰的siRNA双链体的反义链及有义链的各位置的相对疏水性结果，其是通过在用人类血清白蛋白孵育各siRNA缀合物后使用电泳迁移率变化测定测量未结合分数来确定。
图13A-13C显示在所测试的脑及脊髓的所有区域中均观察到持久的SOD1 mRNA沉默。图13A显示在大鼠中通过单次鞘内注射各种示例性siRNA缀合物而分别在腰椎、胸椎及颈椎区域中使SOD1 mRNA沉默的结果。图13B是显示在大鼠CNS中测试的各种组织的示意图。图13C显示在大鼠中通过单次鞘内注射各种示例性siRNA缀合物而分别在小脑、额叶皮质及其余脑区域中使SOD1 mRNA沉默的结果。
图14A-14B显示在单次鞘内剂量后使β-联蛋白沉默的结果。图14A显示在大鼠中分别在腰椎、胸椎及颈椎区域中各种示例性siRNA缀合物使β-联蛋白沉默的结果。图14B显示在大鼠中分别在小脑、额叶皮质及其余脑区域中各种示例性siRNA缀合物使β-联蛋白沉默的结果。
图15A-15C显示在大鼠中在示例性siRNA双链体的单次鞘内给药后使SOD1沉默的结果，表明在具有SOD1 siRNA缀合物的脑中观察到更高的药物水平及稳固的沉默。图15A显示与未缀合的siRNA水平相比，CSF中的缀合的siRNA水平。图15B显示与未缀合的siRNA水平相比，脑中的缀合的siRNA水平。图15C显示与未缀合的siRNA水平及对照siRNA水平相比，小脑中的缀合的siRNA水平。
图16A-16B显示在不同剂量下在不同化学修饰下使SOD1沉默的结果。图16A显示在大鼠中分别在腰椎、胸椎及颈椎区域中使SOD1沉默的结果。图16B显示在大鼠中分别在小脑、额叶皮质及其余脑区域中使SOD1沉默的结果。
图17显示在示例性siRNA双链体的单次鞘内(IT)给药后，在第31天在非人类灵长类动物(NHP)的各种区域中的β-联蛋白siRNA水平的结果。
图18显示在第31天，在各种组织中β-联蛋白mRNA的稳固基因沉默的结果。
图19显示说明在单次IT给药后，在NHP中分布在整个CNS中的siRNA的图片。
图20显示说明在单次IT给药后，定位于神经元的siRNA缀合物的图片。MAP2为神经元标志物。
图21显示说明在单次IT给药后，定位于小胶质细胞的siRNA缀合物的图片。Iba1为小胶质细胞标志物。
图22显示说明在单次IT给药后，定位于星形胶质细胞的siRNA缀合物的图片。
图23显示比较在大鼠及NHP中在区室标度剂量下观察到的基因沉默活性的图。
图24显示在以3μg或7.5μg的剂量施用表7中所示的各种示例性siRNA双链体后，在第14天小鼠眼中TTR mRNA水平的结果。
图25显示在以7.5μg的剂量施用表7中所示的各种示例性siRNA双链体后，在第14天小鼠眼中TTR mRNA水平的结果。
图26显示在以7.5μg的剂量玻璃体内施用表7中所示的各种示例性siRNA双链体后，在第14天小鼠眼中TTR mRNA水平的结果。
具体实施方式
本发明人尤其发现，将亲脂性部分与双链iRNA剂的至少一个链上的一个或多个内部位置缀合为在体内玻璃体内递送及鞘内递送双链iRNA提供令人惊讶的良好结果，使得有效进入CNS组织及眼组织且有效内化至CNS系统及眼系统的细胞中。
本发明的一个方面提供了双链iRNA剂，该iRNA剂包含：与靶基因互补的反义链；与所述反义链互补的有义链；以及任选地经由接头或载体与至少一个链上的一个或多个内部位置缀合的一个或多个亲脂部分。
术语“亲脂体”或“亲脂性部分”广义上是指对脂质具有亲和力的任何化合物或化学部分。表征亲脂性部分的亲脂性的一种方式是通过辛醇-水分配系数logKow，其中Kow为二相系统在平衡时化学物质在辛醇相中的浓度与其在水相中的浓度的比率。辛醇-水分配系数为实验室测量的物质特性。然而，其也可通过使用归因于化学物质的结构组分的系数来预测，这些系数是使用第一原理或经验方法计算的(参见例如Tetko等人,J.Chem.Inf.Comput.Sci.[化学信息与计算机科学杂志]41:1407-21(2001)，将其通过引用以其全文并入本文)。其提供物质偏好非水性或油性环境而不是水的倾向的热力学量度(即其亲水性/亲脂性平衡)。原则上，当logKow超过0时，化学物质具有亲脂性。通常，亲脂性部分的logKow超过1、超过1.5、超过2、超过3、超过4、超过5或超过10。举例而言，预测例如6-氨基己醇的logKow为约0.7。使用相同方法，预测胆固醇基N-(己-6-醇)氨基甲酸酯的logKow为10.7。
分子的亲脂性可相对于其携带的官能团而改变。举例而言，在亲脂性部分的末端添加羟基或胺基可增加或降低亲脂性部分的分配系数(例如logKow)值。
可替代地，与一个或多个亲脂性部分缀合的双链iRNA剂的疏水性可通过其蛋白质结合特征来测量。举例而言，可以确定双链iRNA剂的血浆蛋白结合测定中的未结合分数与双链iRNA剂的相对疏水性正相关，其可以与双链iRNA剂的沉默活性正相关。
在一个实施例中，测定的血浆蛋白结合测定是使用人类血清白蛋白的电泳迁移率变化测定(EMSA)。此结合测定的示例性方案详细说明于实例14中。通过结合测定中未结合的siRNA的分数测量的双链iRNA剂的疏水性超过0.15、超过0.2、超过0.25、超过0.3、超过0.35、超过0.4、超过0.45或超过0.5以增强siRNA的体内递送。
因此，将亲脂性部分与双链iRNA剂的一个或多个内部位置缀合为增强siRNA的体内递送提供最佳疏水性。
在某些实施例中，亲脂性部分为脂肪族、环状诸如脂环族、或多环诸如聚脂环化合物，诸如类固醇(例如固醇)或直链或支链脂肪族烃。亲脂性部分可一般包含烃链，该烃链可以是环状或非环状的。烃链可包含各种取代基和/或一个或多个杂原子，诸如氧或氮原子。此类亲脂性脂肪族部分包括但不限于饱和或不饱和C4-C30烃(例如C6-C18烃)、饱和或不饱和脂肪酸、蜡(例如脂肪酸及脂肪二酰胺的一元醇酯)、萜烯(例如，C10萜烯、C15倍半萜烯、C20二萜烯、C30三萜烯及C40四萜烯)及其他聚脂环烃。举例而言，亲脂性部分可含有C4-C30烃链(例如C4-C30烷基或烯基)。在一些实施例中，亲脂性部分含有饱和或不饱和C6-C18烃链(例如直链C6-C18烷基或烯基)。在一个实施例中，亲脂性部分含有饱和或不饱和C16烃链(例如直链C16烷基或烯基)。
亲脂性部分可通过本领域已知的任何方法附接至iRNA剂，包括经由已存在于亲脂性部分中或引入iRNA剂中的官能团，诸如羟基(例如-CO-CH2-OH)。已存在于亲脂性部分中或引入iRNA剂中的官能团包括但不限于羟基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、叠氮基及炔烃。
iRNA剂与亲脂性部分的缀合可例如通过在羟基与烷基R-、烷酰基RCO-或经取代的氨基甲酰基RNHCO-之间形成醚或羧基或氨基甲酰基酯键来发生。烷基R可以是环状的(例如环己基)或非环状的(例如直链或支链的；及饱和或不饱和的)。烷基R可以是丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基或十八烷基或其类似基团。
在一些实施例中，亲脂性部分经由接头与双链iRNA剂缀合，该接头含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、酰胺、马来酰亚胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺酰胺键、点击反应的产物(例如，来自叠氮化物-炔烃环加成的三唑)或氨基甲酸酯。
在另一个实施例中，亲脂性部分为类固醇，诸如固醇。类固醇为含有全氢-1,2-环戊菲环系统的多环化合物。类固醇包括但不限于胆汁酸(例如胆酸、去氧胆酸及脱氢胆酸)、可的松、地高辛(digoxigenin)、睾酮、胆固醇及阳离子类固醇，诸如可的松。“胆固醇衍生物”是指例如通过取代、添加或移除取代基衍生自胆固醇的化合物。
在另一个实施例中，亲脂性部分为芳族部分。在此上下文中，术语“芳族”泛指单芳烃及多芳烃。芳基包括但不限于包含一至三个芳环的C6-C14芳基部分，其可以任选地经取代；包含与烷基共价连接的芳基的“芳烷基”或“芳基烷基”，其中的任一个可独立地任选地经取代或未经取代；及“杂芳基”。如本文所用，术语“杂芳基”是指具有5至14个环原子，优选地5、6、9或10个环原子；具有在环阵列中共享的6、10或14个π电子，并且除碳原子外具有一至约三个选自由氮(N)、氧(O)及硫(S)组成的组的杂原子的基团。
如本文所用，“经取代的”烷基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基为具有一至约四个、优选地一至约三个、更优选地一或两个非氢取代基的基团。适合的取代基包括但不限于卤基、羟基、硝基、卤代烷基、烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、烷氧基、芳氧基、氨基、酰氨基、烷基氨基甲酰基、芳基氨基甲酰基、氨基烷基、烷氧基羰基、羧基、羟烷基、烷磺酰基、芳磺酰基、烷磺酰胺基、芳磺酰胺基、芳磺酰胺基、烷基羰基、酰氧基、氰基及脲基。
在一些实施例中，亲脂性部分为芳烷基，例如2-芳基丙酰基部分。选择芳烷基的结构特征使得亲脂性部分在体内将结合至少一种蛋白质。在某些实施例中，选择芳烷基的结构特征使得亲脂性部分结合血清、血管或细胞蛋白。在某些实施例中，芳烷基的结构特征促进与白蛋白、免疫球蛋白、脂蛋白、α-2-巨球蛋白或α-1-糖蛋白的结合。
在某些实施例中，配体为萘普生或萘普生的结构衍生物。合成萘普生的方法可见于美国专利号3,904,682及美国专利号4,009,197，将其通过引用以其全文并入本文。萘普生的化学名称为(S)-6-甲氧基-α-甲基-2-萘乙酸，并且结构为
Figure BDA0002885421910000161
在某些实施例中，配体是布洛芬或布洛芬的结构衍生物。合成布洛芬的方法可见于美国专利号3,228,831，将其通过引用以其全文并入本文。布洛芬的结构为
Figure BDA0002885421910000171
额外的示例性芳烷基在美国专利号7,626,014中说明，将其通过引用以其全文并入本文。
在另一个实施例中，适合的亲脂性部分包括脂质、胆固醇、视黄酸、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、布洛芬、萘普生、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪。
在一些实施例中，亲脂性部分为C6-C30酸(例如，己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、维生素A、维生素E、胆固醇等)或C6-C30醇(例如，己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇、十三烷醇、十四烷醇、十五烷醇、十六烷醇、十七烷醇、十八烷醇、油醇、亚麻醇、花生四烯醇、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯醇、视黄醇、维生素E、胆固醇等)。
在某些实施例中，多于一个亲脂性部分可并入双链iRNA剂中，特别是当亲脂性部分具有低亲脂性或疏水性时。在一个实施例中，两个或更多个亲脂性部分并入双链iRNA剂的同一个链中。在一个实施例中，双链iRNA剂的各链具有一个或多个并入的亲脂性部分。在一个实施例中，两个或更多个亲脂性部分并入双链iRNA剂的相同位置(即，相同核碱基、相同糖部分或相同核苷间键)。这可以通过例如以下来达成：经由载体缀合两个或更多个亲脂性部分，和/或经由支链接头缀合两个或更多个亲脂性部分，和/或经由一个或多个接头缀合两个或更多个亲脂性部分，使得一个或多个接头连续连接亲脂性部分。
亲脂性部分可经由直接附接于iRNA剂的核糖而与iRNA剂缀合。可替代地，亲脂性部分可经由接头或载体与双链iRNA剂缀合。
在某些实施例中，亲脂性部分可经由一个或多个接头(系链)与iRNA剂缀合。
在一个实施例中，亲脂性部分经由接头与双链iRNA剂缀合，该接头含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、酰胺、马来酰亚胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺酰胺键、点击反应的产物(例如，来自叠氮化物-炔烃环加成的三唑)或氨基甲酸酯。一些示例性键联在图1、实例2、3、5、6及7中示出。
接头/系链
接头/系链在“系链附接点(TAP)”处与亲脂性部分连接。接头/系链可以包括任何C1-C100含碳部分(例如C1-C75、C1-C50、C1-C20、C1-C10；C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10)，并且可具有至少一个氮原子。在某些实施例中，氮原子在接头/系链上形成末端氨基或酰胺基(NHC(O)-)的一部分，该部分可充当亲脂性部分的连接点。接头/系链(加下划线)的非限制性实例包括TAP-(CH2)nNH-；TAP-C(O)(CH2)nNH-；TAP-NR””(CH2)nNH-；TAP-C(O)-(CH2)n-C (O)-；TAP-C(O)-(CH2)n-C(O)O-；TAP-C(O)-O-；TAP-C(O)-(CH2)n-NH-C(O)-；TAP-C(O)- (CH2)n-；TAP-C(O)-NH-；TAP-C(O)-；TAP-(CH2)n-C(O)-；TAP-(CH2)n-C(O)O-；TAP-(CH2)n-；或TAP-(CH2)n-NH-C(O)-；其中n为1-20(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)并且R””为C1-C6烷基。优选地，n是5、6或11。在其他实施例中，氮可形成末端氧基氨基例如-ONH2或肼基-NHNH2的一部分。接头/系链可任选地例如被羟基、烷氧基、全卤代烷基取代，和/或任选地插入有一个或多个额外杂原子，例如N、O或S。优选的系链配体可以包括例如TAP-(CH2)nNH(配体)；TAP-C(O)(CH2)nNH(配体)；TAP-NR””(CH2)nNH(配体)；TAP- (CH2)nONH(配体)；TAP-C(O)(CH2)nONH(配体)；TAP-NR””(CH2)nONH(配体)；TAP-(CH2)nNHNH2 (配体)；TAP-C(O)(CH2)nNHNH2(配体)；TAP-NR””(CH2)nNHNH2(配体)；TAP-C(O)-(CH2)n-C(O) (配体)；TAP-C(O)-(CH2)n-C(O)O(配体)；TAP-C(O)-O(配体)；TAP-C(O)-(CH2)n-NH-C(O)(配 体)；TAP-C(O)-(CH2)n(配体)；TAP-C(O)-NH(配体)；TAP-C(O)(配体)；TAP-(CH2)n-C(O)(配 体)；TAP-(CH2)n-C(O)O(配体)；TAP-(CH2)n(配体)；或TAP-(CH2)n-NH-C(O)(配体)。在一些实施例中，氨基封端的接头/系链(例如NH2、ONH2、NH2NH2)可以与配体形成亚氨基键(即，C＝N)。在一些实施例中，氨基封端的接头/系链(例如NH2、ONH2、NH2NH2)可例如用C(O)CF3酰化。
在一些实施例中，接头/系链可用巯基(即SH)或烯烃(例如CH＝CH2)封端。例如，系链可以是TAP-(CH2)n-SH、TAP-C(O)(CH2)nSH、TAP-(CH2)n-(CH＝CH2)或TAP-C(O)(CH2)n(CH＝ CH2)，其中n可如别处所述。系链可任选地例如被羟基、烷氧基、全卤代烷基取代，和/或任选地插入有一个或多个额外杂原子，例如N、O或S。双键可以是顺式或反式或者E或Z。
在其他实施例中，接头/系链可以包括亲电子部分，优选地在接头/系链的末端位置。示例性亲电子部分包括例如醛、烷基卤化物、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、硝基苯磺酸酯或溴苯磺酸酯，或活化的羧酸酯，例如NHS酯或五氟苯酯。优选的接头/系链(加下划线)包括TAP- (CH2)nCHO；TAP-C(O)(CH2)nCHO；或TAP-NR””(CH2)nCHO，其中n为1-6且R””为C1-C6烷基；或TAP-(CH2)nC(O)ONHS；TAP-C(O)(CH2)nC(O)ONHS；或TAP-NR””(CH2)nC(O)ONHS，其中n为1-6且R””为C1-C6烷基；TAP-(CH2)nC(O)OC6F5 ；TAP-C(O)(CH2)nC(O)OC6F5 ；或TAP-NR””(CH2)nC(O) OC6F5 ，其中n为1-11且R””为C1-C6烷基；或-(CH2)nCH2LG；TAP-C(O)(CH2)nCH2LG；或TAP-NR”” (CH2)nCH2LG，其中n可如别处所述且R””为C1-C6烷基(LG可以是离去基团，例如卤化物、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、硝基苯磺酸酯、溴苯磺酸酯)。系链连接可通过使配体的亲核基团(例如硫醇或氨基)与系链上的亲电子基团偶联来进行。
在其他实施例中，可能需要单体在接头/系链的末端位置包括苯二酰亚氨基(K)。
Figure BDA0002885421910000201
在其他实施例中，其他受保护的氨基可在接头/系链的末端位置，例如烯丙氧羰基、单甲氧基三苯甲基(MMT)、三氟乙酰基、Fmoc或芳基磺酰基(例如，芳基部分可以是邻硝基苯基或邻、对-二硝基苯基)。
本文所述的任何接头/系链可以进一步包括一个或多个额外的连接基团，例如-O-(CH2)n-、-(CH2)n-SS-、-(CH2)n-或-(CH＝CH)-。
可裂解接头/系链
在一些实施例中，接头/系链中的至少一个可以是氧化还原可裂解接头、酸可裂解接头、酯酶可裂解接头、磷酸酶可裂解接头或肽酶可裂解接头。
在一个实施例中，接头/系链中的至少一个可以是还原可裂解接头(例如二硫化物基团)。
在一个实施例中，接头/系链中的至少一个可以是酸可裂解接头(例如，腙基、酯基、缩醛基或缩酮基)。
在一个实施例中，接头/系链中的至少一个可以是酯酶可裂解接头(例如酯基)。
在一个实施例中，接头/系链中的至少一个可以是磷酸酶可裂解接头(例如磷酸酯)。
在一个实施例中，接头/系链中的至少一个可以是肽酶可裂解接头(例如肽键)。
可裂解连接基团易受裂解剂(例如pH、氧化还原电位或降解分子的存在)的影响。一般而言，裂解剂在细胞内比在血清或血液中更普遍或以更高水平或活性发现。此类降解剂的实例包括：选择用于特定底物或不具有底物特异性的氧化还原剂，包括例如细胞中存在的氧化或还原酶或还原剂，诸如硫醇，其可通过还原降解氧化还原可裂解连接基团；酯酶；可产生酸性环境的内体或试剂，例如导致pH为5或更低的内体或试剂；可通过充当一般酸、肽酶(其可以是底物特异性的)及磷酸酶水解或降解酸可裂解连接基团的酶。
可裂解连接基团(诸如二硫键)可对pH敏感。人类血清的pH为7.4，而平均细胞内pH略微较低，范围介于约7.1-7.3。内体具有在5.5-6.0范围内的更酸的pH，并且溶酶体具有约为5.0的甚至更酸的pH。一些系链将具有在优选的pH下裂解的连接基团，从而自细胞内的配体(例如，靶向或细胞渗透性配体，诸如胆固醇)释放iRNA剂，或进入细胞的所需区室。
将配体与iRNA剂连接的化学连接点(chemical junction)(例如，连接基团)可以包括二硫键。当iRNA剂/配体复合物通过内吞作用吸收至细胞中时，内体的酸性环境将导致二硫键裂解，从而从配体释放iRNA剂(Quintana等人,Pharm Res.[药物研究]19:1310-1316,2002；Patri等人,Curr.Opin.Curr.Biol.[化学生物当前观点]6:466-471,2002)。配体可以是靶向配体或第二治疗剂，其可补充iRNA剂的治疗效果。
系链可以包括通过特定酶可裂解的连接基团。并入系链中的连接基团的类型可视iRNA剂所靶向的细胞而定。例如，靶向肝细胞中的mRNA的iRNA剂可以与包括酯基的系链缀合。肝细胞富含酯酶，并且因此系链在肝细胞中将比在不富含酯酶的细胞类型中更有效地裂解。系链的裂解从附接至系链远端的配体释放iRNA剂，从而潜在地增强iRNA剂的沉默活性。富含酯酶的其他细胞类型包括肺、肾皮质及睾丸的细胞。
含有肽键的系链可以与靶向富含肽酶的细胞类型(诸如肝细胞及滑膜细胞)的iRNA剂缀合。例如，靶向滑膜细胞诸如用于治疗炎性疾病(例如类风湿性关节炎)的iRNA剂可以与含有肽键的系链缀合。
一般而言，可通过测试降解剂(或条件)裂解候选连接基团的能力来评估候选可裂解连接基团的适合性。还将希望，另外测试候选可裂解连接基团在血液中或当与其他非靶组织(例如当向受试者施用时，iRNA剂将暴露于其中的组织)接触时抵抗裂解的能力。因此，可以确定第一与第二条件之间对裂解的相对易感性，其中选择第一条件以指示靶细胞中的裂解，并且选择第二条件以指示其他组织或生物流体(例如血液或血清)中的裂解。评估可在无细胞系统、细胞、细胞培养物、器官或组织培养物或整个动物中进行。在无细胞或培养条件中进行初始评估且通过在整个动物中进一步评估进行确认可以是有用的。在优选的实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在选择用于模拟细胞内条件的体外条件下)的裂解比在血液或血清(或在选择用于模拟细胞外条件的体外条件下)中快至少2、4、10或100倍。
氧化还原可裂解连接基团
一类可裂解连接基团是氧化还原可裂解连接基团，其在还原或氧化时裂解。还原可裂解连接基团的实例为二硫化物连接基团(-S-S-)。为了确定候选可裂解连接基团是否为适合的“还原可裂解连接基团”或例如是否适合与特定iRNA部分及特定靶向剂一起使用，可考虑本文所述的方法。例如，候选物可通过使用本领域已知的试剂，与二硫苏糖醇(DTT)或其他还原剂一起孵育来评估，其模拟将在细胞(例如靶细胞)中观察到的裂解速率。候选物也可在选择用于模拟血液或血清条件的条件下进行评估。在优选的实施例中，候选化合物在血液中裂解至多10％。在优选的实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在选择用于模拟细胞内条件的体外条件下)的降解比在血液(或在选择用于模拟细胞外条件的体外条件下)中快至少2、4、10或100倍。候选化合物的裂解速率可在选择用于模拟细胞内介质的条件下使用标准酶动力学测定来测定，并且与选择用于模拟细胞外介质的条件进行比较。
基于磷酸酯的可裂解连接基团
基于磷酸酯的连接基团通过降解或水解磷酸酯的试剂来裂解。裂解细胞中磷酸酯基的试剂的实例为细胞中的酶，诸如磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例为-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。优选的实施例为-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。一优选的实施例为-O-P(O)(OH)-O-。这些候选物可使用与上文所述类似的方法评估。
酸可裂解连接基团
酸可裂解连接基团为在酸性条件下裂解的连接基团。在优选的实施例中，酸可裂解连接基团在pH为约6.5或更低(例如，约6.0、5.5、5.0或更低)的酸性环境中，或通过诸如可充当一般酸的酶的试剂来裂解。在细胞中，特定的低pH细胞器，诸如内体及溶酶体，可为酸可裂解连接基团提供裂解环境。酸可裂解连接基团的实例包括但不限于腙、缩酮、缩醛、酯及氨基酸的酯。酸可裂解基团可具有通式-C═NN-、C(O)O或-OC(O)。优选的实施例是当附接至酯的氧(烷氧基)的碳为芳基、经取代的烷基或三级烷基，诸如二甲基戊基或叔丁基时。这些候选物可使用与上文所述类似的方法评估。
基于酯的连接基团
基于酯的连接基团通过细胞中诸如酯酶及酰胺酶的酶来裂解。基于酯的可裂解连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基及亚炔基的酯。酯可裂解连接基团具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。这些候选物可使用与上文所述类似的方法评估。
基于肽的裂解基团
基于肽的连接基团是通过细胞中诸如肽酶及蛋白酶的酶来裂解。基于肽的可裂解连接基团是在氨基酸之间形成以产生寡肽(例如二肽、三肽等)及多肽的肽键。基于肽的可裂解基团不包括酰胺基(-C(O)NH-)。酰胺基可在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成以产生肽及蛋白质的特殊类型的酰胺键。基于肽的裂解基团一般限于在产生肽及蛋白质的氨基酸之间形成的肽键(即酰胺键)，并且不包括整个酰胺官能团。肽可裂解的连接基团具有通式-NHCHR1C(O)NHCHR2C(O)-，其中R1及R2是两个相邻氨基酸的R基团。这些候选物可使用与上文所述类似的方法评估。
生物可裂解接头/系链
接头也可以包括生物可裂解接头，该生物可裂解接头为核苷酸及非核苷酸接头或其组合，该生物可裂解接头连接分子的两个部分，例如两个单独siRNA分子的一个或两个链以产生双(siRNA)。在一些实施例中，仅两个单独siRNA之间的静电或堆栈相互作用可表示接头。非核苷酸接头包括衍生自单糖、二糖、寡糖及其衍生物、脂肪族、脂环族、杂环及其组合的系链或接头。
在一些实施例中，接头(系链)中的至少一个是生物可裂解接头，该选自由以下组成的组：DNA，RNA，二硫化物，酰胺，半乳糖胺、葡糖胺、葡萄糖、半乳糖及甘露糖的官能化单糖或寡糖及其组合。
在一个实施例中，生物可裂解的碳水化合物接头可具有1至10个糖单元，其具有能够连接两个siRNA单元的至少一个变旋异构异头键。当存在两种或更多种醣时，这些单元可经由1-3、1-4或1-6个糖键联或经由烷基链连接。
示例性生物可裂解接头包括：
Figure BDA0002885421910000251
Figure BDA0002885421910000261
Figure BDA0002885421910000271
额外示例性生物可裂解接头在方案28-30中说明。
关于生物可裂解接头的更多论述可见于2018年1月18日提交的名称为“内体可裂解接头(Endosomal Cleavable Linkers)”的PCT申请号PCT/US 18/14213，将其内容通过引用以其全文并入本文。
载体
在某些实施例中，亲脂性部分经由替换一个或多个核苷酸的载体与iRNA剂缀合。
载体可以是环状基团或非环状基团。在一个实施例中，环状基团选自由以下组成的组：吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基及十氢化萘。在一个实施例中，非环状基团为基于丝氨醇主链或二乙醇胺主链的部分。
在一些实施例中，载体替换双链iRNA剂的内部位置中的一个或多个核苷酸。
在其他实施例中，载体替换有义链或反义链末端的核苷酸。在一个实施例中，载体替换有义链3’端上的末端核苷酸，从而充当保护有义链3’端的端帽。在一个实施例中，载体为具有胺的环状基团，例如，载体可以是吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基或十氢化萘基。
其中亚单元的核糖已如此替换的核糖核苷酸亚单元在本文中称为核糖替换修饰亚单元(RRMS)。载体可以是环状或非环状部分，并且包括两个“主链附接点”(例如羟基)及配体(例如亲脂性部分)。亲脂性部分可以直接附接至载体或通过插入的接头/系链间接附接至载体，如上所述。
Figure BDA0002885421910000281
配体缀合的单体亚单元可以是iRNA分子的5’或3’末端亚单元，即两个“W”基团中的一个可以是羟基，并且另一个“W”基团可以是两个或更多个未修饰或经修饰的核糖核苷酸的链。可替代地，配体缀合的单体亚单元可占据内部位置，并且两个“W”基团均可以是一个或多个未修饰或经修饰的核糖核苷酸。多于一个配体缀合的单体亚单元可存在于iRNA剂中。
基于糖替换的单体，例如配体缀合的单体(环状)
基于糖替换的环状单体，例如基于糖替换的配体缀合的单体在本文中也称为RRMS单体化合物。载体可具有下面提供的通式(LCM-2)(在该结构中，优选的主链附接点可选自R1或R2；R3或R4；或者如果Y为CR9R10，则R9及R10(选择两个位置以给出两个主链附接点，例如R1及R4或R4及R9))。优选的系链附接点包括R7；当X为CH2时，R5或R6。载体在下文描述为实体，其可并入链中。因此，应理解，该结构也涵盖如下情形，其中一个(在末端位置的情况下)或两个(在内部位置的情况下)附接点，例如R1或R2；R3或R4；或R9或R10(当Y为CR9R10时)，与例如含硫主链的磷酸酯或经修饰的磷酸酯连接。例如，上述R基团中的一个可以是-CH2-，其中一个键与载体连接并且一个键与主链原子(例如连接氧或中心磷原子)连接。
Figure BDA0002885421910000291
其中：
X为N(CO)R7、NR7或CH2；
Y为NR8、O、S、CR9R10；
Z为CR11R12或不存在；
R1、R2、R3、R4、R9及R10中的每个独立地是H、ORa或(CH2)nORb，其条件为R1、R2、R3、R4、R9及R10中的至少两个为ORa和/或(CH2)nORb；
R5、R6、R11及R12中的每个独立地是配体、H、任选地经1-3个R13取代的C1-C6烷基、或C(O)NHR7；或R5与R11一起为任选地经R14取代的C3-C8环烷基；
R7可以是配体，例如R7可以是Rd，或R7可以是例如通过系链部分(例如经NRcRd取代的C1-C20烷基)间接系留于载体的配体；或经NHC(O)Rd取代的C1-C20烷基；
R8为H或C1-C6烷基；
R13为羟基、C1-C4烷氧基或卤基；
R14为NRcR7；
R15为任选地经氰基取代的C1-C6烷基，或C2-C6烯基；
R16为C1-C10烷基；
R17为液相或固相支持试剂；
L为-C(O)(CH2)qC(O)-或-C(O)(CH2)qS-；
Ra为保护基，例如CAr3；(例如二甲氧基三苯甲基)或Si(X5’)(X5”)(X5’”)，其中(X5’)、(X5”)及(X5’”)如别处所述。
Rb为P(O)(O-)H、P(OR15)N(R16)2或L-R17；
Rc为H或C1-C6烷基；
Rd为H或配体；
每个Ar独立地是任选地经C1-C4烷氧基取代的C6-C10芳基；
n为1-4；并且q是0-4。
示例性载体包括以下那些：其中例如X为N(CO)R7或NR7，Y为CR9R10并且Z不存在；或X为N(CO)R7或NR7，Y为CR9R10且Z为CR11R12；或X为N(CO)R7或NR7，Y为NR8且Z为CR11R12；或X为N(CO)R7或NR7，Y为O且Z为CR11R12；或X为CH2；Y为CR9R10；Z为CR11R12，并且R5与R11一起形成C6环烷基(H，z＝2)或茚满环系统，例如X为CH2；Y为CR9R10；Z为CR11R12，并且R5与R11一起形成C5环烷基(H，z＝1)。
在某些实施例中，载体可基于吡咯啉环系统或4-羟脯氨酸环系统，例如X为N(CO)R7或NR7，Y为CR9R10并且Z不存在(D)。
Figure BDA0002885421910000301
OFG1优选地附接至与五元环中的一个碳连接的伯碳，例如环外亚烷基，例如亚甲基(D中的-CH2OFG1)。OFG2优选地直接附接至五元环中的一个碳(D中的-OFG2)。对于基于吡咯啉的载体，-CH2OFG1可以附接至C-2并且OFG2可以附接至C-3；或-CH2OFG1可以附接至C-3并且OFG2可以附接至C-4。在某些实施例中，CH2OFG1及OFG2可经偕位取代至上文提及的碳中的一个。对于基于3-羟脯氨酸的载体，-CH2OFG1可以附接至C-2并且OFG2可以附接至C-4。基于吡咯啉及4-羟脯氨酸的单体可因此含有键联(例如碳-碳键)，其中键旋转围绕该特定键联被限制，例如由于环存在产生的限制。因此，CH2OFG1及OFG2在上文描述的任何配对中可相对于彼此为顺式或反式的。因此，明确地包括所有顺式/反式异构体。单体也可含有一个或多个不对称中心，并且因此以外消旋体及外消旋混合物、单一对映异构体、个别非对映异构体及非对映异构体混合物形式存在。明确地包括单体的所有此类异构形式(例如，带有CH2OFG1及OFG2的中心均可具有R构型；或均具有S构型；或一个中心可具有R构型且另一个中心可具有S构型，反之亦然)。系链附接点优选地为氮。载体D的优选的实例包括以下：
Figure BDA0002885421910000311
在某些实施例中，载体可基于哌啶环系统(E)，例如X为N(CO)R7或NR7，Y为CR9R10且Z为CR11R12。
Figure BDA0002885421910000312
OFG1优选地附接至与六元环中的一个碳连接的伯碳，例如环外亚烷基，例如亚甲基(n＝1)或亚乙基(n＝2)[E中的-(CH2)nOFG1]。OFG2优选地直接附接至六元环中的一个碳(E中的-OFG2)。-(CH2)nOFG1及OFG2可以偕位方式安置于环上，即两个基团可以附接至相同碳上，例如C-2、C-3或C-4。可替代地，-(CH2)nOFG1及OFG2可以邻位方式安置于环上，即两个基团可以附接至相邻环碳原子，例如-(CH2)nOFG1可以附接至C-2并且OFG2可以附接至C-3；-(CH2)nOFG1可以附接至C-3并且OFG2可以附接至C-2；-(CH2)nOFG1可以附接至C-3并且OFG2可以附接至C-4；或-(CH2)nOFG1可以附接至C-4并且OFG2可以附接至C-3。基于哌啶的单体可因此含有键联(例如碳-碳键)，其中键旋转围绕该特定键联被限制，例如由于环存在产生的限制。因此，-(CH2)nOFG1及OFG2在上文描述的任何配对中可相对于彼此为顺式或反式的。因此，明确地包括所有顺式/反式异构体。单体也可含有一个或多个不对称中心，并且因此以外消旋体及外消旋混合物、单一对映异构体、个别非对映异构体及非对映异构体混合物形式存在。明确地包括单体的所有此类异构形式(例如，带有CH2OFG1及OFG2的中心均可具有R构型；或均具有S构型；或一个中心可具有R构型且另一个中心可具有S构型，反之亦然)。系链附接点优选地为氮。
在某些实施例中，载体可基于哌嗪环系统(F)，例如X为N(CO)R7或NR7，Y为NR8且Z为CR11R12，或吗啉环系统(G)，例如X为N(CO)R7或NR7，Y为O且Z为CR11R12。
Figure BDA0002885421910000321
OFG1优选地附接至与六元环中的一个碳连接的伯碳，例如环外亚烷基，例如亚甲基(F或G中的-CH2OFG1)。OFG2优选地直接附接至六元环中的一个碳(F或G中的-OFG2)。对于F及G两者，-CH2OFG1可以附接至C-2并且OFG2可以附接至C-3；或反之亦然。在某些实施例中，CH2OFG1及OFG2可经偕位取代至上文提及的碳中的一个。基于哌嗪及吗啉的单体可因此含有键联(例如碳-碳键)，其中键旋转围绕该特定键联被限制，例如由于环存在产生的限制。因此，CH2OFG1及OFG2在上文描述的任何配对中可相对于彼此为顺式或反式的。因此，明确地包括所有顺式/反式异构体。单体也可含有一个或多个不对称中心，并且因此以外消旋体及外消旋混合物、单一对映异构体、个别非对映异构体及非对映异构体混合物形式存在。明确地包括单体的所有此类异构形式(例如，带有CH2OFG1及OFG2的中心均可具有R构型；或均具有S构型；或一个中心可具有R构型且另一个中心可具有S构型，反之亦然)。R’”可以是例如C1-C6烷基，优选地CH3。系链附接点优选地为F及G中的氮。
在某些实施例中，载体可基于十氢化萘环系统，例如X为CH2；Y为CR9R10；Z为CR11R12，并且R5与R11一起形成C6环烷基(H，z＝2)或茚满环系统，例如X为CH2；Y为CR9R10；Z为CR11R12，并且R5与R11一起形成C5环烷基(H，z＝1)。
Figure BDA0002885421910000331
OFG1优选地附接至伯碳，例如与C-2、C-3、C-4或C-5中的一个连接的环外亚甲基(n＝1)或亚乙基(n＝2)[H中的-(CH2)nOFG1]。OFG2优选地直接附接至C-2、C-3、C-4或C-5中的一个(H中的-OFG2)。-(CH2)nOFG1及OFG2可以偕位方式安置于环上，即两个基团可以附接至相同碳上，例如C-2、C-3、C-4或C-5。可替代地，-(CH2)nOFG1及OFG2可以邻位方式安置于环上，即两个基团可以附接至相邻环碳原子，例如-(CH2)nOFG1可以附接至C-2并且OFG2可以附接至C-3；-(CH2)nOFG1可以附接至C-3并且OFG2可以附接至C-2；-(CH2)nOFG1可以附接至C-3并且OFG2可以附接至C-4；或-(CH2)nOFG1可以附接至C-4并且OFG2可以附接至C-3；-(CH2)nOFG1可以附接至C-4并且OFG2可以附接至C-5；或-(CH2)nOFG1可以附接至C-5并且OFG2可以附接至C-4。基于十氢化萘或茚满的单体可因此含有键联(例如碳-碳键)，其中键旋转围绕该特定键联被限制，例如由于环存在产生的限制。因此，-(CH2)nOFG1及OFG2在上文描述的任何配对中可相对于彼此为顺式或反式的。因此，明确地包括所有顺式/反式异构体。单体也可含有一个或多个不对称中心，并且因此以外消旋体及外消旋混合物、单一对映异构体、个别非对映异构体及非对映异构体混合物形式存在。明确地包括单体的所有此类异构形式(例如，带有CH2OFG1及OFG2的中心均可具有R构型；或均具有S构型；或一个中心可具有R构型且另一个中心可具有S构型，反之亦然)。在优选的实施例中，C-1及C-6处的取代基相对于彼此为反式。系链附接点优选地为C-6或C-7。
其他载体可以包括基于3-羟脯氨酸的载体(J)。
Figure BDA0002885421910000341
因此，-(CH2)nOFG1及OFG2可相对于彼此为顺式或反式的。因此，明确地包括所有顺式/反式异构体。单体也可含有一个或多个不对称中心，并且因此以外消旋体及外消旋混合物、单一对映异构体、个别非对映异构体及非对映异构体混合物形式存在。明确地包括单体的所有此类异构形式(例如，带有CH2OFG1及OFG2的中心均可具有R构型；或均具有S构型；或一个中心可具有R构型且另一个中心可具有S构型，反之亦然)。系链附接点优选地为氮。
关于更具代表性的基于糖替换的环状载体的细节可见于美国专利号7,745,608及8,017,762，将其通过引用以其全文并入本文。
基于糖替换的单体(非环状)
基于糖替换的非环状单体，例如基于糖替换的配体缀合的单体，在本文中也称为核糖替换单体亚单元(RRMS)单体化合物。优选的非环状载体可具有式LCM-3或LCM-4：
Figure BDA0002885421910000342
在一些实施例中，x、y和z中的每个可彼此独立地是0、1、2或3。在式LCM-3中，当y与z不同时，则三级碳可具有R或S构型。在优选的实施例中，式LCM-3中的x为零且y与z各自为1(例如基于丝氨醇)，式LCM-3中的y与z各自为1。下式LCM-3或LCM-4中的每个可任选地例如经羟基、烷氧基、全卤代烷基取代。
关于更具代表性的基于糖替换的非环状载体的细节可见于美国专利号7,745,608及8,017,762，将其通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，双链iRNA剂包含与有义链的5’端或反义链的5’端缀合的一个或多个亲脂性部分。
在某些实施例中，亲脂性部分经由载体和/或接头与链的5’端缀合。在一个实施例中，亲脂性部分经由下式的载体与链的5’端缀合：
Figure BDA0002885421910000351
Figure BDA0002885421910000352
R为配体，诸如亲脂性部分。
在一些实施例中，双链iRNA剂包含与有义链的3’端或反义链的3’端缀合的一个或多个亲脂性部分。
在某些实施例中，亲脂性部分经由载体和/或接头与链的3’端缀合。在一个实施例中，亲脂性部分经由下式的载体与链的3’端缀合：
Figure BDA0002885421910000353
Figure BDA0002885421910000361
R为配体，诸如亲脂性部分。
在一些实施例中，双链iRNA剂包含与有义链的两端缀合的一个或多个亲脂性部分。
在一些实施例中，双链iRNA剂包含与反义链的两端缀合的一个或多个亲脂性部分。
在一些实施例中，双链iRNA剂包含与有义链的5′端或3′端缀合的一个或多个亲脂性部分，以及与反义链的5′端或3′端缀合的一个或多个亲脂性部分，
在一些实施例中，亲脂性部分经由一个或多个接头(系链)和/或载体与链的末端缀合。
在一个实施例中，亲脂性部分经由一个或多个接头(系链)与链的末端缀合。
在一个实施例中，亲脂性部分经由环状载体，任选地经由一个或多个插入接头(系链)与有义链或反义链的5’端缀合。
在一些实施例中，亲脂性部分与至少一个链上的一个或多个内部位置缀合。链的内部位置是指链的任何位置上的核苷酸，链的3’端及5’端的末端位置除外(例如，不包括2个位置：从3’端计数的位置1及从5’端计数的位置1)。
在一个实施例中，亲脂性部分与至少一个链上的一个或多个内部位置缀合，这些位置包括除链的各端的末端两个位置以外的所有位置(例如，不包括4个位置：从3’端计数的位置1和2以及从5’端计数的位置1和2)。在一个实施例中，亲脂性部分与至少一个链上的一个或多个内部位置缀合，这些位置包括除链各端的末端三个位置以外的所有位置(例如，不包括6个位置：从3’端计数的位置1、2和3以及从5’端计数的位置1、2和3)。
在一个实施例中，亲脂性部分与至少一个链上的一个或多个内部位置缀合，有义链的裂解位点区除外，例如，亲脂性部分不与从有义链的5’端计数的位置9-12缀合，例如，亲脂性部分不与从有义链的5’端计数的位置9-11缀合。可替代地，内部位置不包括自有义链3’端计数的位置11-13。
在一个实施例中，亲脂性部分与至少一个链上的一个或多个内部位置缀合，其不包括反义链的裂解位点区。举例而言，内部位置不包括自有义链5’端计数的位置12-14。
在一个实施例中，亲脂性部分与至少一个链上的一个或多个内部位置缀合，其不包括有义链上自3’端计数的位置11-13及反义链上自5’端计数的位置12-14。
在一个实施例中，一个或多个亲脂性部分与以下内部位置中的一个或多个缀合：从各链的5’端计数，有义链上的位置4-8和13-18，以及反义链上的位置6-10和15-18。
在一个实施例中，一个或多个亲脂性部分与以下内部位置中的一个或多个缀合：从各链的5’端计数，有义链上的位置5、6、7、15和17，以及反义链上的位置15和17。
在一些实施例中，亲脂性部分与双链iRNA剂的核碱基、糖部分或核苷间键缀合。
定义
除非提供具体定义，否则本文所述的结合分子生物学、分析化学、合成有机化学以及医学及药物化学所用的命名法及这些学科的方法及技术是本领域熟知且常用的那些命名法以及方法及技术。标准技术可用于化学合成及化学分析。某些此类技术及方法可见于例如“Carbohydrate Modifications in Antisense Research[反义研究中的碳水化合物修饰]”由Sangvi及Cook编,American Chemical Society[美国化学学会],华盛顿,1994；“Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明顿氏药物科学],”Mack Publishing Co.[麦克出版公司],Easton,Pa.,[宾夕法尼亚州伊斯顿]第18版,1990；以及“Antisense DrugTechnology,Principles,Strategies,and Applications[反义药物技术、原理、策略和应用]”由Stanley T.Crooke编,CRC Press[CRC出版社],Boca Raton,Fla.[佛罗里达州波卡拉顿]；以Sambrook等人,“Molecular Cloning,A laboratory Manual,[分子克隆：实验室手册]”第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室],1989，将其通过引用并入用于任何目的。在允许的情况下，本披露通篇引用的所有专利、申请、公开申请以及其他出版物及其他数据以全文引用的方式并入。
除非另外指明，否则以下术语具有以下含义：
如本文所用，术语“靶核酸”是指其表达或活性能够由siRNA化合物调节的任何核酸分子。靶核酸包括但不限于由编码靶蛋白DNA的转录的RNA(包括但不限于mRNA前体及mRNA或其部分)，以及衍生自此类RNA的cDNA，及miRNA。例如，靶核酸可以是细胞基因(或自基因转录的mRNA)，其表达与特定障碍或疾病状态相关联。在一些实施例中，靶核酸可以是来自感染物的核酸分子。
如本文所用，术语“iRNA”是指介导RNA转录物的靶向裂解的试剂。这些试剂与称为RNAi诱导型沉默复合物(RISC)的细胞质多蛋白复合物缔合。有效诱导RNA干扰的试剂在本文中也称为siRNA、RNAi剂或iRNA剂。因此，这些术语在本文中可互换使用。如本文所用，术语iRNA包括微RNA及微RNA前体。此外，如本文所用的本发明的“化合物(compound或compounds)”也指iRNA剂，并且可以与iRNA剂互换使用。
iRNA剂应包括与靶基因具有足够同源性并且在核苷酸方面具有足够长度的区域，使得iRNA剂或其片段可介导靶基因的下调。(为了便于说明，术语核苷酸或核糖核苷酸有时在本文中用于指iRNA剂的一个或多个单体亚单元。在本文中应理解，在本文中术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”可在经修饰的RNA或核苷酸替代物的情况下使用，也指在一个或多个位置的经修饰的核苷酸或替代替换部分。)因此，iRNA剂是或包括至少部分地、并且在一些实施例中完全地与靶RNA互补的区域。iRNA剂与靶标之间不必具有完美的互补性，但对应性必须足以使iRNA剂或其裂解产物能够指导序列特异性沉默，例如通过RNAi裂解靶RNA，例如mRNA。与靶链的互补性或同源性程度为反义链中最关键的。虽然通常需要完美的互补性，特别是在反义链中，但一些实施例可以包括，特别是在反义链中，一个或多个或例如6个、5个、4个、3个、2个或更少的错配(相对于靶RNA)。有义链仅需要与反义链充分互补以维持分子的整体双链特征。
iRNA剂包括：足够长的分子以触发干扰素反应(这些分子可被Dicer裂解(Bernstein等人2001.Nature[自然],409:363-366)且进入RISC(RNAi诱导型沉默复合物))；以及足够短的分子，这些分子不会触发干扰素反应(这些分子也可由Dicer裂解和/或进入RISC)，例如具有允许进入RISC的尺寸的分子，例如类似Dicer裂解产物的分子。足够短以至于不触发干扰素反应的分子在本文中称为siRNA剂或较短的iRNA剂。如本文所用，“siRNA剂或较短的iRNA剂”是指足够短以至于其不在人类细胞中诱导有害的干扰素反应的iRNA剂，例如双链RNA剂或单链剂，例如其具有少于60、50、40或30个核苷酸对的双螺旋区。siRNA剂或其裂解产物可下调靶基因，例如通过相对于靶RNA诱导RNAi，其中该靶可包含内源性或病原体靶RNA。
如本文所用，“单链iRNA剂”是由单分子构成的iRNA剂。其可以包括由链内配对形成的双螺旋区，例如，其可以是或包括发夹或锅-柄(pan-handle)结构。相对于靶分子，单链iRNA剂可以是反义的。单链iRNA剂可足够长以至于其可进入RISC并且参与RISC介导的靶mRNA的裂解。单链iRNA剂的长度为至少14，并且在其他实施例中至少15、20、25、29、35、40或50个核苷酸。在某些实施例中，其长度小于200、100或60个核苷酸。
环是指当iRNA链的一部分与另一个链或与同一个链的另一部分形成碱基对时，iRNA链与双链体中相对核苷酸未配对的区域。
发夹iRNA剂将具有等于或至少17、18、19、29、21、22、23、24或25个核苷酸对的双螺旋区。双螺旋区的长度可等于或小于200、100或50。在某些实施例中，双螺旋区的长度范围为15-30、17至23、19至23及19至21个核苷酸对。发夹可具有单链突出端或末端未配对区，在一些实施例中在3’，并且在某些实施例中在发夹的反义侧。在一些实施例中，突出端长度为2-3个核苷酸。
如本文所用，“双链(ds)iRNA剂”为包括多于一个链，并且在一些情况下两个链的iRNA剂，其中链间杂交可形成双螺旋结构区。
如本文所用，术语“siRNA活性”及“RNAi活性”是指通过siRNA的基因沉默。
如本文所用，通过RNA干扰分子的“基因沉默”是指靶基因的细胞中mRNA水平的降低是无miRNA或RNA干扰分子存在下细胞中发现的mRNA水平的至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％直至且包括100％，及其间的任何整数。在一个优选实施例中，mRNA水平降低至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约99％直至且包括100％，以及5％与100％之间的任何整数。
如本文所用，术语“调节基因表达”意指基因的表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚单元的RNA分子或等效RNA分子的水平被上调或下调，以使得表达、水平或活性大于或小于在调节剂不存在下所观察到的。例如，术语“调节”可意指“抑制”，但词语“调节”的使用不限于此定义。
如本文所用，当基因的表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚单元的RNA分子或等效RNA分子的水平是在siRNA(例如RNAi剂)不存在下观察到的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍或更多不同时，发生基因表达调节。可相对于对照或非对照计算％和/或倍数差异，例如，
Figure BDA0002885421910000401
或
Figure BDA0002885421910000411
如本文所用，与基因表达相关的术语“抑制”、“下调”或“降低”意指基因表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚单元的RNA分子或等效RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚单元的活性降低至低于在调节剂不存在下所观察到的。当基因表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚单元的RNA分子或等效RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚单元的活性相对于相应非调节对照降低至少10％，并且优选地至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或最佳100％(即无基因表达)时，基因表达下调。
如本文所用，与基因表达相关的术语“增加”或“上调”意指基因的表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚单元的RNA分子或等效RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚单元的活性增加至高于在调节剂不存在下所观察到的。当基因表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚单元的RNA分子或等效RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚单元的活性相对于相应非调节对照增加至少10％，并且优选地至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、100％、1.1倍、1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍数、100倍或更多时，基因表达上调。
如本文所用，术语“增加(increased或increase)”通常意指增加静态上显著的量；为避免任何疑问，“增加”意指与参考水平相比增加了至少10％，例如与参考水平相比增加了至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或直至且包括100％或10％-100％之间的任何增加，或与参考水平相比增加至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍或2倍与10倍之间的任何增加或更大。
如本文所用，术语“降低(reduced或reduce)”通常意指降低统计学上显著的量。然而，为了避免疑问，“降低”意指与参考水平相比降低了至少10％，例如与参考水平相比降低了至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或直至并且包括100％(即，与参考样品相比不存在水平)，或10％-100％之间的任何降低。
双链iRNA包含两个寡核苷酸链，其充分互补以杂交形成双螺旋结构。通常，双螺旋结构的长度为15至30个、更通常18至25个、还更通常19至24个、并且最通常19至21个碱基对。在一些实施例中，25至30个碱基对长度的较长双链iRNA为优选的。在一些实施例中，10至15个碱基对长度的较短双链iRNA为优选的。在另一个实施例中，双链iRNA为至少21个核苷酸长。
在一些实施例中，双链iRNA包含有义链及反义链，其中反义RNA链具有与靶序列的至少一部分互补的互补区，并且双螺旋区长度为14-30个核苷酸。类似地，靶序列的互补区的长度为14至30个、更通常18至25个、还更通常19至24个、并且最通常19至21个核苷酸。
如本文所用，短语“反义链”是指与感兴趣的靶序列基本上或100％互补的寡聚化合物。短语“反义链”包括由两个单独链形成的两种寡聚化合物的反义区以及能够形成发夹或哑铃型结构的单分子寡聚化合物。术语“反义链”及“引导链”在本文中可互换使用。
短语“有义链”是指具有与靶序列(诸如信使RNA或DNA序列)的全部或部分相同的核苷序列的寡聚化合物。术语“有义链”及“随从链”在本文中可互换使用。
通过“可特异性杂交”及“互补”意指核酸可通过传统沃森-克里克(Watson-Crick)或其他非传统类型与另一种核酸序列形成氢键。关于本发明的核分子，核酸分子与其互补序列的结合自由能足以允许进行核酸的相关功能，例如RNAi活性。核酸分子的结合自由能的测定是本领域熟知的(参见例如Turner等人,1987,CSH Symp.Quant.Biol.[冷泉港定量生物学研讨会]LII第123-133页；Frier等人,1986,Proc.Nat.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]83:9373-9377；Turner等人,1987,/.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]109:3783-3785)。百分比互补性指示核酸分子中可以与第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的连续残基的百分比(例如，10个中的5、6、7、8、9、10个为50％、60％、70％、80％、90％及100％互补)。“完美互补”或100％互补性意指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中的相同数目的连续残基氢键结合。不够完美互补性是指两个链中的一些而非全部核苷单元可以彼此氢键结合的情形。“显著互补性”是指多核苷酸链展现90％或更高的互补性，不包括经选择从而是非互补的多核苷酸链的区域，诸如突出端。特异性结合需要足够程度的互补性以避免寡聚化合物与非靶序列在需要特异性结合的条件下，即在体内测定或治疗性治疗的情况下在生理条件下，或在体外测定的情况下在进行测定的条件下的非特异性结合。非靶序列通常相差至少5个核苷酸。
在一些实施例中，双链iRNA剂的双链区的长度等于或至少为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸对。
在一些实施例中，双链iRNA剂的反义链的长度等于或至少为14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
在一些实施例中，双链iRNA剂的有义链的长度等于或至少为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
在一个实施例中，双链iRNA剂的有义链及反义链的长度各自为15至30个核苷酸。
在一个实施例中，双链iRNA剂的有义链及反义链的长度各自为19至25个核苷酸。
在一个实施例中，双链iRNA剂的有义链及反义链的长度各自为21至23个核苷酸。
在一些实施例中，一个链在双链区中具有至少一段1-5个单链核苷酸。“双链区中的单链核苷酸段”意指在单嵌段的两端存在至少一个核苷酸碱基对。在一些实施例中，两个链在双链区中具有至少一段1-5(例如，1、2、3、4或5)个单链核苷酸。当两个链在双链区中具有一段1-5(例如，1、2、3、4或5)个单链核苷酸时，此类单链核苷酸可以彼此相反(例如，一段错配)或其可被定位以使得第二个链不具有与第一个链的单链iRNA相反的单链核苷酸，反之亦然(例如，单链环)。在一些实施例中，单链核苷酸存在于任一端的8个核苷酸内，例如两个链之间互补区的5’或3’端的8、7、6、5、4、3或2个核苷酸。
在一个实施例中，双链iRNA剂在至少一个末端包含单链突出端。在一个实施例中，单链突出端长度为1、2或3个核苷酸。
在一个实施例中，iRNA剂的有义链长度为21个核苷酸，并且反义链长度为23个核苷酸，其中这些链形成21个连续碱基对的双链区(在3’端具有2个核苷酸长的单链突出端)。
在一些实施例中，双链iRNA的各链具有ZXY结构，诸如PCT公开号2004080406中所述，将其通过引用以其全文并入本文。
在特定实施例中，双链寡聚化合物的两个链可以连接在一起。两个链可在两端彼此连接，或仅在一端连接。在一端连接意指第一个链的5’端与第二个链的3’端连接或第一个链的3’端与第二个链的5’端连接。当两个链在两端彼此连接时，第一个链的5’端与第二个链的3’端连接并且第一个链的3’端与第二个链的5’端连接。两个链可以通过寡核苷酸接头连接在一起，该寡核苷酸接头包括但不限于(N)n；其中N独立地是经修饰或未修饰的核苷酸并且n使3-23。在一些实施例中，n为3-10，例如3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施例中，寡核苷酸接头选自由以下组成的组：GNRA、(G)4、(U)4及(dT)4，其中N为经修饰或未修饰的核苷酸且R为经修饰或未修饰的嘌呤核苷酸。接头中的一些核苷酸可涉及接头中的其他核苷酸的碱基对相互作用。两个链也可通过非核苷接头连接在一起，例如本文所述的接头。本领域技术人员应了解，本文描述的任何寡核苷酸化学修饰或变化均可用于寡核苷酸接头。
发夹及哑铃型寡聚化合物具有等于或至少14、15、15、16、17、18、19、29、21、22、23、24或25个核苷酸对的双螺旋区。双螺旋区的长度可等于或小于200、100或50。在一些实施例中，双螺旋区的长度范围为15-30、17至23、19至23及19至21个核苷酸对。。
发夹寡聚化合物可以具有单链突出端或末端未配对区，在一些实施例中在3’，并且在一些实施例中在发夹的反义侧。在一些实施例中，突出端长度为1-4、更通常2-3个核苷酸。可以诱导RNA干扰的发夹寡聚化合物在本文中也称为“shRNA”。
在某些实施例中，两个寡聚链在存在足够程度的互补性时特异性杂交，以避免反义化合物与非靶序列在需要特异性结合的条件下即在体内测定或治疗性治疗的情况下在生理条件下，以及在体外测定的情况下在进行测定的条件下的非特异性结合。
如本文所用，“严格杂交条件”或“严格条件”是指反义化合物将与其靶序列杂交但与最少数目的其他序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同情况下使不同的，并且反义化合物与靶序列杂交的“严格条件”是由反义化合物的性质及组成以及对其进行研究的测定来决定。
本领域中应理解，与未修饰的化合物相比，并入核苷酸亲和力修饰可允许更大数目的错配。类似地，某些寡核苷酸序列可比其他寡核苷酸序列对错配更具耐受性。本领域普通技术人员能够确定寡核苷酸之间、或寡核苷酸与靶核酸之间的适当数目的错配，诸如通过测定解链温度(Tm)。Tm或ΔTm可通过本领域普通技术人员熟悉的技术来计算。例如，Freier等人(Nucleic Acids Research[核酸研究],1997,25,22:4429-4443)中所述的技术允许本领域普通技术人员评估核苷酸修饰增加RNA:DNA双螺旋的解链温度的能力。
siRNA设计
在一个实施例中，本发明的iRNA剂为19nt长的双端平端子，其中有义链在5’端的位置7、8、9处的三个连续核苷酸上含有至少一个具有三个2’-F修饰的基序。反义链在5’端的位置11、12、13处的三个连续核苷酸上含有至少一个具有三个2’-O-甲基修饰的基序。
在一个实施例中，本发明的iRNA剂为20nt长的双端平端子，其中有义链在5’端的位置8、9、10处的三个连续核苷酸上含有至少一个具有三个2’-F修饰的基序。反义链在5’端的位置11、12、13处的三个连续核苷酸上含有至少一个具有三个2’-O-甲基修饰的基序。
在一个实施例中，本发明的iRNA剂为21nt长的双端平端子，其中有义链在5’端的位置9、10、11处的三个连续核苷酸上含有至少一个具有三个2’-F修饰的基序。反义链在5’端的位置11、12、13处的三个连续核苷酸上含有至少一个具有三个2’-O-甲基修饰的基序。
在一个实施例中，本发明的iRNA剂包含21个核苷酸(nt)有义链及23个核苷酸(nt)反义链，其中有义链在5’端的位置9、10、11处的三个连续核苷酸上含有至少一个具有三个2’-F修饰的基序；反义链在5’端的位置11、12、13处的三个连续核苷酸上含有至少一个具有三个2’-O-甲基修饰的基序，其中iRNA的一端为平端，而另一端包含2nt突出端。优选地，2nt突出端位于反义的3’端。任选地，iRNA剂进一步包含配体(例如GalNAc3)。
在一个实施例中，本发明的iRNA剂包含有义链及反义链，其中：有义链的长度为25-30个核苷酸残基，其中自所述第一个链的5’末端核苷酸(位置1)位置1至23开始包含至少8个核糖核苷酸；反义链的长度为36-66个核苷酸残基，并且自3’末端核苷酸开始，在与有义链的位置1-23配对的位置包含至少8个核糖核苷酸以形成双链体；其中至少反义链的3’末端核苷酸与有义链未配对，并且至多6个连续3’末端核苷酸与有义链未配对，从而形成1-6个核苷酸的3’单链突出端；其中反义链的5’端包含10-30个与有义链未配对的连续核苷酸，从而形成10-30个核苷酸单链5’突出端；其中当比对有义链及反义链的最大互补性时，至少有义链5’末端及3’末端核苷酸与反义链的核苷酸碱基配对，从而在有义链与反义链之间形成基本上双螺旋区；且当所述双链核酸引入哺乳动物细胞中时，反义链与靶RNA沿着至少19个核糖核苷酸的反义链长度充分互补以减少靶基因表达；并且其中有义链在三个连续核苷酸上含有至少一个具有三个2’-F修饰的基序，其中至少一个基序出现在裂解位点处或附近。反义链在裂解位点处或附近的三个连续核苷酸上含有至少一个具有三个2’-O-甲基修饰的基序。
在一个实施例中，本发明的iRNA剂包含有义链及反义链，其中所述iRNA剂包含长度为至少25且至多29个核苷酸的第一个链及长度为至多30个核苷酸且在自5’端的位置11、12、13处的三个连续核苷酸上具有至少一个具有三个2’-O-甲基修饰的基序的第二个链；其中所述第一个链的所述3’端及所述第二个链的所述5’端形成平端并且所述第二个链在其3’端比第一个链长1-4个核苷酸，其中双螺旋区长度为至少25个核苷酸，并且当所述iRNA剂引入哺乳动物细胞中时，所述第二个链与靶mRNA沿着所述第二个链的至少19nt的长度充分互补以降低靶基因表达，并且其中所述iRNA的dicer裂解优选地产生包含所述第二个链的所述3’端的siRNA，从而降低哺乳动物中的靶基因表达。任选地，iRNA剂进一步包含配体(例如GalNAc3)。
在一个实施例中，iRNA剂的有义链在三个连续核苷酸上含有至少一个具有三个同一修饰的基序，其中一个基序出现在有义链的裂解位点。举例而言，有义链可在5’端的7-15个位置内的三个连续核苷酸上含有至少一个具有三个2’-F修饰的基序。
在一个实施例中，iRNA剂的反义链也可在三个连续核苷酸上含有至少一个具有三个同一修饰的基序，其中一个基序出现在反义链的裂解位点处或附近。举例而言，反义链可在5’端的9-15个位置内的三个连续核苷酸上含有至少一个具有三个2’-O-甲基修饰的基序。
对于具有长度为17-23nt的双螺旋区的iRNA剂，反义链的裂解位点通常在5’端的10、11及12位附近。因此，具有三个同一修饰的基序可以出现在反义链的9、10、11位；10、11、12位；11、12、13位；12、13、14位；或13、14、15位，自反义链的5’端的第1个核苷酸开始计数，或自反义链的5’端的双螺旋区内的第1个配对核苷酸开始计数。反义链中的裂解位点也可根据iRNA的双螺旋区距离5’端的长度而改变。
在一些实施例中，iRNA剂包含各自具有14至30个核苷酸的有义链及反义链，其中有义链在三个连续核苷酸上含有至少两个具有三个同一修饰的基序，其中至少一个基序出现在链内的裂解位点处或附近，并且至少一个基序出现在链的另一部分(该基序与裂解位点处的基序分隔至少一个核苷酸)。在一个实施例中，反义链也在三个连续核苷酸上含有至少一个具有三个同一修饰的基序，其中至少一个基序出现在链内的裂解位点处或附近。在有义链中的裂解位点处或附近出现的基序中的修饰不同于在反义链中的裂解位点处或附近出现的基序中的修饰。
在一些实施例中，iRNA剂包含各自具有14至30个核苷酸的有义链及反义链，其中有义链在三个连续核苷酸上含有至少一个具有三个2’-F修饰的基序，其中至少一个基序出现在链中的裂解位点处或附近。在一个实施例中，反义链也在裂解位点处或附近的三个连续核苷酸上含有至少一个具有三个2’-O-甲基修饰的基序。
在一些实施例中，iRNA剂包含各自具有14至30个核苷酸的有义链及反义链，其中有义链在5’端的位置9、10、11处的三个连续核苷酸上含有至少一个具有三个2’-F修饰的基序，并且其中反义链在5’端的位置11、12、13处的三个连续核苷酸上含有至少一个具有三个2’-O-甲基修饰的基序。
在一个实施例中，本发明的iRNA剂包含与靶、双链体内或其组合的错配。错配可发生在突出端区或双螺旋区中。碱基对可基于其促进解离或解链的倾向排序(例如，基于特定配对的缔合或解离的自由能，最简单的方法为在单个对的基础上检查配对，但也可使用下一个邻近或类似分析)。在促进解离方面：A:U优于G:C；G:U优于G:C；并且I:C优于G:C(I＝肌苷)。错配(例如非典型或不是典型配对(如本文别处所述))优于典型(A:T、A:U、G:C)配对；且包括通用碱基的配对优于典型配对。
在一个实施例中，本发明的iRNA剂包含在反义链的5’端的双螺旋区内的前1、2、3、4或5个碱基对中的至少一个，其可独立地选自以下的组：A:U、G:U、I:C及错配对(例如非典型配对或不是典型配对或包括通用碱基的配对)促进反义链在双链体的5’端处的解离。
在一个实施例中，反义链中5’端双螺旋区内的1位核苷酸选自由以下组成的组：A、dA、dU、U及dT。可替代地，反义链的5’端的双螺旋区内的前1、2或3个碱基对中的至少一个为AU碱基对。例如，反义链的5’端的双螺旋区内的第一个碱基对为AU碱基对。
在一个方面中，本发明涉及用于抑制靶基因表达的双链RNA(dsRNA)剂。dsRNA剂包含有义链及反义链，每个链具有14至40个核苷酸。dsRNA剂由式(I)表示：
Figure BDA0002885421910000491
在式(I)中，B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’及B4’各自独立地是含有选自由以下组成的组的修饰的核苷酸：2’-O-烷基、2’-取代的烷氧基、2’-取代的烷基、2’-卤基、ENA及BNA/LNA。在一个实施例中，B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’及B4’各自含有2’-OMe修饰。在一个实施例中，B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’及B4’各自含有2’-OMe或2’-F修饰。在一个实施例中，B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’及B4’中的至少一个含有2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)修饰。
C1是位于与反义链种子区相对的位点(即，在反义链的5’端的位置2-8处)的热去稳定化核苷酸。例如，C1位于有义链的位置，其与反义链的5’端的位置2-8处的核苷酸配对。在一个实例中，C1位于有义链的5’端的位置15处。C1核苷酸具有热去稳定化修饰，其可以包括无碱基修饰；与双链体中相对的核苷酸错配；及糖修饰，诸如2’-脱氧修饰或非环状核苷酸，例如解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)。在一个实施例中，C1具有选自由以下组成的组的热去稳定化修饰：i)与反义链中相对的核苷酸错配；ii)选自由以下组成的组的无碱基修饰：
Figure BDA0002885421910000501
及iii)选自由以下组成的组的糖修饰：
Figure BDA0002885421910000502
Figure BDA0002885421910000503
其中B为经修饰或未修饰的核碱基，R1及R2独立地是H、卤素、OR3或烷基；并且R3为H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖。在一个实施例中，C1中的热去稳定化修饰为选自由以下组成的组的错配：G:G、G:A、G:U、G:T、A:A、A:C、C:C、C:U、C:T、U:U、T:T及U:T；并且任选地，错配对中的至少一个核碱基为2’-脱氧核碱基。在一个实例中，C1中的热去稳定化修饰为GNA或
Figure BDA0002885421910000504
T1、T1’、T2’及T3’各自独立地表示包含修饰的核苷酸，该修饰为核苷酸提供小于或等于2’-OMe修饰的空间体积的空间体积。空间体积是指修饰的空间效应的总和。用于确定核苷酸修饰的空间效应的方法是本领域技术人员已知的。修饰可在核苷酸的核糖的2’位置，或是对非核糖核苷酸、非环状核苷酸或与核糖的2’位置类似或等效的核苷酸的主链的修饰，并且为核苷酸提供小于或等于2’-OMe修饰的空间体积的空间体积。例如，T1、T1’、T2’及T3’各自独立地选自DNA、RNA、LNA、2’-F及2’-F-5’-甲基。在一个实施例中，T1为DNA。在一个实施例中，T1’是DNA、RNA或LNA。在一个实施例中，T2’为DNA或RNA。在一个实施例中，T3’为DNA或RNA。
n1、n3及q1的长度独立地是4至15个核苷酸。
n5、q3及q7的长度独立地是1-6个核苷酸。
n4、q2及q6的长度独立地是1-3个核苷酸；可替代地，n4是0。q5的长度独立地是0-10个核苷酸。
n2及q4的长度独立地是0-3个核苷酸。
可替代地，n4的长度为0-3个核苷酸。
在一个实施例中，n4可以是0。在一个实例中，n4是0，并且q2和q6是1。在另一个实例中，n4是0，并且q2及q6是1，其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。
在一个实施例中，n4、q2和q6各自为1。
在一个实施例中，n2、n4、q2、q4和q6各自为1。
在一个实施例中，当有义链长度为19-22个核苷酸并且n4为1时，C1位于有义链的5’端的位置14-17处。在一个实施例中，C1位于有义链的5’端的位置15处。
在一个实施例中，T3’始于反义链的5’端的位置2处。在一个实例中，T3’位于反义链的5’端的位置2处并且q6等于1。
在一个实施例中，T1’始于反义链的5’端的位置14处。在一个实例中，T1’位于反义链的5’端的位置14处并且q2等于1。
在示例性实施例中，T3’始于反义链的5’端的位置2处并且T1’始于反义链的5’端的位置14处。在一个实例中，T3’始于反义链的5’端的位置2处并且q6等于1，并且T1’始于反义链的5’端的位置14处并且q2等于1。
在一个实施例中，T1’及T3’被长度为11个核苷酸分隔(即不计数T1’及T3’核苷酸)。
在一个实施例中，T1’位于反义链的5’端的位置14处。在一个实例中，T1’位于反义链的5’端的位置14处并且q2等于1，并且在2’位置或非核糖、非环状或主链中的位置处的修饰提供比2’-OMe核糖小的空间体积。
在一个实施例中，T3’位于反义链的5’端的位置2处。在一个实例中，T3’位于反义链的5’端的位置2处并且q6等于1，并且在2’位置或非核糖、非环状或主链中的位置处的修饰提供小于或等于2’-OMe核糖的空间体积。
在一个实施例中，T1位于有义链的裂解位点。在一个实例中，当有义链长度为19-22个核苷酸并且n2为1时，T1位于有义链的5’端的位置11处。在示例性实施例中，当有义链长度为19-22个核苷酸并且n2为1时，T1位于有义链的5’端的位置11处的有义链的裂解位点，
在一个实施例中，T2’始于反义链的5’端的位置6处。在一个实例中，T2’位于反义链的5’端的位置6-10处，并且q4为1。
在示例性实施例中，当有义链长度为19-22个核苷酸并且n2为1时，T1位于有义链的裂解位点，例如有义链的5’端的位置11处；T1’位于反义链的5’端的位置14处并且q2等于1，并且对T1’的修饰位于核糖的2’位置或非核糖、非环状或主链中的位置处，该修饰提供比2’-OMe核糖小的空间体积；T2’位于反义链的5’端的位置6-10处并且q4为1；并且T3’位于反义链的5’端的位置2处并且q6等于1，对T3’的修饰位于2’位置或非核糖、非环状或主链中的位置处，该修饰提供小于或等于2’-OMe核糖的空间体积。
在一个实施例中，T2’始于反义链的5’端的位置8处。在一个实例中，T2’始于反义链的5’端的位置8处，并且q4为2。
在一个实施例中，T2’始于反义链的5’端的位置9处。在一个实例中，T2’位于反义链的5’端的位置9处，并且q4为1。
在一个实施例中，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是1，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是6，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。
在一个实施例中，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是1，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是6，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是6，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是7，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是6，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是7，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是1，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是6，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是1，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是6，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是5，T2’是2’-F，q4是1，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；任选地，在反义链的3’端具有至少2个额外的TT。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是5，T2’是2’-F，q4是1，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；任选地，在反义链的3’端具有至少2个额外的TT；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自5’端计数)。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。
dsRNA剂可在有义链或反义链的5’端包含含磷基团。5’端含磷基团可以是5’端磷酸酯(5’-P)、5’端硫代磷酸酯(5’-PS)、5’端二硫代磷酸酯(5’-PS2)、5’端乙烯基膦酸酯基(5’-VP)、5’端甲基膦酸酯基(MePhos)或5’-脱氧-5’-C-丙二酰基
Figure BDA0002885421910000571
当5’端含磷基团为5’端乙烯基膦酸酯基(5’-VP)时，5’-VP可以是5’-E-VP异构体(即，反式乙烯基磷酸酯，
Figure BDA0002885421910000572
)、5’-Z-VP异构体(即，顺式乙烯基磷酸酯，
Figure BDA0002885421910000573
)或其混合物。
在一个实施例中，dsRNA剂在有义链的5’端包含含磷基团。在一个实施例中，dsRNA剂在反义链的5’端包含含磷基团。
在一个实施例中，dsRNA剂包含5’-P。在一个实施例中，dsRNA剂在反义链中包含5’-P。
在一个实施例中，dsRNA剂包含5’-PS。在一个实施例中，dsRNA剂在反义链中包含5’-PS。
在一个实施例中，dsRNA剂包含5’-VP。在一个实施例中，dsRNA剂在反义链中包含5’-VP。在一个实施例中，dsRNA剂在反义链中包含5’-E-VP。在一个实施例中，dsRNA剂在反义链中包含5’-Z-VP。
在一个实施例中，dsRNA剂包含5’-PS2。在一个实施例中，dsRNA剂在反义链中包含5’-PS2。
在一个实施例中，dsRNA剂包含5’-PS2。在一个实施例中，dsRNA剂在反义链中包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1。dsRNA剂还包含5’-PS。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1。dsRNA剂还包含5’-P。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1。dsRNA剂还包含5’-VP。5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1。dsRNA剂还包含5’-PS2。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1。dsRNA剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-P。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-PS。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-VP。5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-PS2。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1。dsRNA剂还包含5’-P。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1。dsRNA剂还包含5’-PS。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1。dsRNA剂还包含5’-VP。5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1。dsRNA剂还包含5’-PS2。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1。dsRNA剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-P。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-PS。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-VP。5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-PS2。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1。dsRNA剂还包含5’-P。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1。dsRNA剂还包含5’-PS。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1。dsRNA剂还包含5’-VP。5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1。dsRNA剂还包含5’-PS2。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1。dsRNA剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-P。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-PS。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-VP。5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-PS2。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1。dsRNA剂还包含5’-P。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1。dsRNA剂还包含5’-PS。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1。dsRNA剂还包含5’-VP。5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1。dsRNA剂还包含5’-PS2。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1。dsRNA剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-P。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-PS。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-VP。5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-PS2。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在一个实施例中，100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％的本发明的dsRNA剂经修饰。例如，当50％的dsRNA剂经修饰时，dsRNA剂中存在的所有核苷酸的50％含有如本文所述的修饰。
在一个实施例中，dsRNA剂的有义链及反义链中的每个独立地经非环状核苷酸、LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、2’-氟、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)或2’-ara-F修饰。
在一个实施例中，dsRNA剂的有义链及反义链中的每个含有至少两个不同的修饰。
在一个实施例中，式(I)的dsRNA剂进一步包含长度为1-10个核苷酸的3’和/或5’突出端。在一个实例中，式(I)的dsRNA剂包含处于反义链的3’端的3’突出端及处于反义链的5’端的平端。在另一个实例中，dsRNA剂在有义链的5’端具有5’突出端。
在一个实施例中，本发明的dsRNA剂不含有任何2’-F修饰。
在一个实施例中，dsRNA剂的有义链和/或反义链包含具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的一个或多个嵌段。在一个实例中，有义链包含具有两个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的一个嵌段。在一个实例中，反义链包含具有两个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段。例如，具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段被16-18个磷酸酯核苷酸间键分隔开。
在一个实施例中，dsRNA剂的有义链及反义链中的每个具有15-30个核苷酸。在一个实例中，有义链具有19-22个核苷酸，并且反义链具有19-25个核苷酸。在另一个实例中，有义链具有21个核苷酸，并且反义链具有23个核苷酸。
在一个实施例中，双链体反义链的5’端的位置1处的核苷酸选自由A、dA、dU、U及dT组成的组。在一个实施例中，来自反义链的5’端的第一、第二及第三碱基对中的至少一个为AU碱基对。
在一个实施例中，本发明的dsRNA剂的反义链与靶RNA 100％互补以与其杂交并且通过RNA干扰抑制其表达。在另一个实施例中，本发明的dsRNA剂的反义链与靶RNA至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％或至少50％互补。
在一个方面中，本发明涉及能够抑制靶基因表达的如本文所定义的dsRNA剂。dsRNA剂包含有义链及反义链，每个链具有14至40个核苷酸。有义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中至少一个所述热去稳定化核苷酸出现在与反义链的种子区相对的位点处或附近(即在反义链的5’端的位置2-8处)。本说明书中描述的与由式(I)表示的dsRNA相关的各实施例及方面也可适用于含有热去稳定化核苷酸的dsRNA。
当有义链长度为21个核苷酸时，热去稳定化核苷酸可以出现在例如有义链的5’端的位置14-17之间。反义链含有至少两个经修饰的核酸，其小于空间上苛刻的2’-OMe修饰。优选地，小于空间上苛刻的2’-OMe的两个经修饰的核酸被11个核苷酸长分隔。例如，两个经修饰的核酸位于反义链的5’端的位置2及14处。
在一个实施例中，dsRNA剂进一步包含至少一种ASGPR配体。例如，ASGPR配体是通过二价或三价支链接头连接的一种或多种GalNAc衍生物，诸如：
Figure BDA0002885421910000691
在一个实例中，ASGPR配体附接至有义链的3’端。
例如，如本文所定义的dsRNA剂可包含i)在有义链或反义链的5’端处的含磷基团；ii)在有义链的位置1-5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(自有义链的5’端计数)，以及在反义链的位置1及2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰及在位置18-23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(自反义链的5’端计数)；以及iii)配体，诸如在有义链或反义链的5’端或3’端的ASGPR配体(例如，一种或多种GalNAc衍生物)。举例而言，配体可处于有义链的3’端。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-P及靶向配体。在一个实施例中，5’-P处于反义链的5’端，并且靶向配体处于有义链的3’端。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-PS及靶向配体。在一个实施例中，5’-PS处于反义链的5’端，并且靶向配体处于有义链的3’端。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-VP(例如，5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合)及靶向配体。在一个实施例中，5’-VP处于反义链的5’端，并且靶向配体处于有义链的3’端。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-PS2及靶向配体。在一个实施例中，5’-PS2处于反义链的5’端，并且靶向配体处于有义链的3’端。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基及靶向配体。在一个实施例中，5’-脱氧-5’-C-丙二酰基处于反义链的5’端，并且靶向配体处于有义链的3’端。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-P及靶向配体。在一个实施例中，5’-P处于反义链的5’端，并且靶向配体处于有义链的3’端。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-PS及靶向配体。在一个实施例中，5’-PS处于反义链的5’端，并且靶向配体处于有义链的3’端。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-VP(例如，5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合)及靶向配体。在一个实施例中，5’-VP处于反义链的5’端，并且靶向配体处于有义链的3’端。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-PS2及靶向配体。在一个实施例中，5’-PS2处于反义链的5’端，并且靶向配体处于有义链的3’端。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基及靶向配体。在一个实施例中，5’-脱氧-5’-C-丙二酰基处于反义链的5’端，并且靶向配体处于有义链的3’端。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-P及靶向配体。在一个实施例中，5’-P处于反义链的5’端，并且靶向配体处于有义链的3’端。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-PS及靶向配体。在一个实施例中，5’-PS处于反义链的5’端，并且靶向配体处于有义链的3’端。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-VP(例如，5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合)及靶向配体。在一个实施例中，5’-VP处于反义链的5’端，并且靶向配体处于有义链的3’端。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-PS2及靶向配体。在一个实施例中，5’-PS2处于反义链的5’端，并且靶向配体处于有义链的3’端。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基及靶向配体。在一个实施例中，5’-脱氧-5’-C-丙二酰基处于反义链的5’端，并且靶向配体处于有义链的3’端。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-P及靶向配体。在一个实施例中，5’-P处于反义链的5’端，并且靶向配体处于有义链的3’端。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-PS及靶向配体。在一个实施例中，5’-PS处于反义链的5’端，并且靶向配体处于有义链的3’端。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-VP(例如，5’-E-VP、5’-Z-VP或其组合)及靶向配体。在一个实施例中，5’-VP处于反义链的5’端，并且靶向配体处于有义链的3’端。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-PS2及靶向配体。在一个实施例中，5’-PS2处于反义链的5’端，并且靶向配体处于有义链的3’端。
在一个实施例中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F并且q7是1；其中两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在有义链的位置1-5内(自有义链的5’端计数)，并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在反义链的位置1及2处并且两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在位置18-23内(自反义链的5’端计数)。dsRNA剂还包含5’-脱氧-5’-C-丙二酰基及靶向配体。在一个实施例中，5’-脱氧-5’-C-丙二酰基处于反义链的5’端，并且靶向配体处于有义链的3’端。
在一个特别的实施例中，本发明的dsRNA剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)任选地附接于3’端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；以及
(iii)在位置1、3、5、7、9至11、13、17、19及21处的2’-F修饰，以及在位置2、4、6、8、12、14至16、18及20处的2’-OMe修饰(自5’端计数)；
以及
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3、5、9、11至13、15、17、19、21及23处的2’-OMe修饰，以及在位置2、4、6至8、10、14、16、18、20及22处的2’F修饰(自5’端计数)；以及
(iii)在核苷酸位置21与22之间，以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
其中dsRNA剂具有在反义链的3’端处的两个核苷酸突出端，及在反义链的5’端处的平端。
在另一特别的实施例中，本发明的dsRNA剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)任选地附接于3’端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置1、3、5、7、9至11、13、15、17、19及21处的2’-F修饰，以及在位置2、4、6、8、12、14、16、18及20处的2’-OMe修饰(自5’端计数)；以及
(iv)在核苷酸位置1与2之间，以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
以及
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3、5、7、9、11至13、15、17、19及21至23处的2’-OMe修饰，以及在位置2、4、6、8、10、14、16、18及20处的2’-F修饰(自5’端计数)；以及
(iii)在核苷酸位置1与2之间，在核苷酸位置2与3之间，在核苷酸位置21与22之间，及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
其中dsRNA剂具有在反义链的3’端处的两个核苷酸突出端，及在反义链的5’端处的平端。
在另一特别的实施例中，本发明的dsRNA剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)任选地附接于3’端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置1至6、8、10及12至21处的2’-OMe修饰，在位置7及9处的2’-F修饰，及在位置11处的脱氧核苷酸(例如dT)(自5’端计数)；以及
(iv)在核苷酸位置1与2之间，以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
以及
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3、7、9、11、13、15、17及19至23处的2’-OMe修饰，以及在位置2、4至6、8、10、12、14、16及18处的2’-F修饰(自5’端计数)；以及
(iii)在核苷酸位置1与2之间，在核苷酸位置2与3之间，在核苷酸位置21与22之间，及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
其中dsRNA剂具有在反义链的3’端处的两个核苷酸突出端，及在反义链的5’端处的平端。
在另一特别的实施例中，本发明的dsRNA剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)任选地附接于3’端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置1至6、8、10、12、14及16至21处的2’-OMe修饰，以及在位置7、9、11、13及15处的2’-F修饰；以及
(iv)在核苷酸位置1与2之间，以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
以及
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、5、7、9、11、13、15、17、19及21至23处的2’-OMe修饰，以及在位置2至4、6、8、10、12、14、16、18及20处的2’-F修饰(自5’端计数)；以及
(iii)在核苷酸位置1与2之间，在核苷酸位置2与3之间，在核苷酸位置21与22之间，及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
其中dsRNA剂具有在反义链的3’端处的两个核苷酸突出端，及在反义链的5’端处的平端。
在另一特别的实施例中，本发明的dsRNA剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)任选地附接于3’端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置1至9及12至21处的2’-OMe修饰，以及在位置10及11处的2’-F修饰；以及
(iv)在核苷酸位置1与2之间，以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
以及
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3、5、7、9、11至13、15、17、19及21至23处的2’-OMe修饰，以及在位置2、4、6、8、10、14、16、18及20处的2’-F修饰(自5’端计数)；以及
(iii)在核苷酸位置1与2之间，在核苷酸位置2与3之间，在核苷酸位置21与22之间，及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
其中dsRNA剂具有在反义链的3’端处的两个核苷酸突出端，及在反义链的5’端处的平端。
在另一特别的实施例中，本发明的dsRNA剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)任选地附接于3’端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置1、3、5、7、9至11及13处的2’-F修饰，以及在位置2、4、6、8、12及14至21处的2’-OMe修饰；以及
(iv)在核苷酸位置1与2之间，以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
以及
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3、5至7、9、11至13、15、17至19及21至23处的2’-OMe修饰，以及在位置2、4、8、10、14、16及20处的2’-F修饰(自5’端计数)；以及
(iii)在核苷酸位置1与2之间，在核苷酸位置2与3之间，在核苷酸位置21与22之间，及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
其中dsRNA剂具有在反义链的3’端处的两个核苷酸突出端，及在反义链的5’端处的平端。
在另一特别的实施例中，本发明的dsRNA剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)任选地附接于3’端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置1、2、4、6、8、12、14、15、17及19至21处的2’-OMe修饰，以及在位置3、5、7、9至11、13、16及18处的2’-F修饰；以及
(iv)在核苷酸位置1与2之间，以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
以及
(b)反义链，其具有：
(i)25个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、4、6、7、9、11至13、15、17及19至23处的2’-OMe修饰，在位置2、3、5、8、10、14、16及18处的2’-F修饰，以及在位置24及25处的脱氧核苷酸(例如dT)(自5’端计数)；以及
(iii)在核苷酸位置1与2之间，在核苷酸位置2与3之间，在核苷酸位置21与22之间，及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
其中dsRNA剂具有在反义链的3’端处的四个核苷酸突出端，及在反义链的5’端处的平端。
在另一特别的实施例中，本发明的dsRNA剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)任选地附接于3’端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置1至6、8及12至21处的2’-OMe修饰，以及在位置7及9至11处的2’-F修饰；以及
(iv)在核苷酸位置1与2之间，以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
以及
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3至5、7、8、10至13、15及17至23处的2’-OMe修饰，以及在位置2、6、9、14及16处的2’-F修饰(自5’端计数)；以及
(iii)在核苷酸位置1与2之间，在核苷酸位置2与3之间，在核苷酸位置21与22之间，及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
其中dsRNA剂具有在反义链的3’端处的两个核苷酸突出端，及在反义链的5’端处的平端。
在另一特别的实施例中，本发明的dsRNA剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)任选地附接于3’端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置1至6、8及12至21处的2’-OMe修饰，以及在位置7及9至11处的2’-F修饰；以及
(iv)在核苷酸位置1与2之间，以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
以及
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3至5、7、10至13、15及17至23处的2’-OMe修饰，以及在位置2、6、8、9、14及16处的2’-F修饰(自5’端计数)；以及
(iii)在核苷酸位置1与2之间，在核苷酸位置2与3之间，在核苷酸位置21与22之间，及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
其中dsRNA剂具有在反义链的3’端处的两个核苷酸突出端，及在反义链的5’端处的平端。
在另一特别的实施例中，本发明的dsRNA剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)19个核苷酸的长度；
(ii)任选地附接于3’端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置1至4、6及10至19处的2’-OMe修饰，以及在位置5及7至9处的2’-F修饰；以及
(iv)在核苷酸位置1与2之间，以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
以及
(b)反义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3至5、7、10至13、15及17至21处的2’-OMe修饰，以及在位置2、6、8、9、14及16处的2’-F修饰(自5’端计数)；以及
(iii)在核苷酸位置1与2之间，在核苷酸位置2与3之间，在核苷酸位置19与20之间，及在核苷酸位置20与21之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
其中dsRNA剂具有在反义链的3’端处的两个核苷酸突出端，及在反义链的5’端处的平端。
在一个实施例中，本发明的dsRNA剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)18-23个核苷酸的长度；
(ii)在位置7-15处的三个连续2’-F修饰；以及
(b)反义链，其具有：
(i)18-23个核苷酸的长度；
(ii)在该链上任何地方的至少2’-F修饰；以及
(iii)在前五个核苷酸处的至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
其中dsRNA剂具有与至少一个链上的一个或多个位置缀合的一个或多个亲脂性部分；并且具有在反义链的3’端处的两个核苷酸突出端，及在反义链的5’端处的平端；或双链体两端均为平端。
在一个实施例中，本发明的dsRNA剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)18-23个核苷酸的长度；
(ii)少于四个2’-F修饰；
(b)反义链，其具有：
(i)18-23个核苷酸的长度；
(ii)少于十二个2’-F修饰；以及
(iii)在前五个核苷酸处的至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
其中dsRNA剂具有与至少一个链上的一个或多个位置缀合的一个或多个亲脂性部分；并且具有在反义链的3’端处的两个核苷酸突出端，及在反义链的5’端处的平端；或双链体两端均为平端。
在一个实施例中，本发明的dsRNA剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)19-35个核苷酸的长度；
(ii)少于四个2’-F修饰；
(b)反义链，其具有：
(i)19-35个核苷酸的长度；
(ii)少于十二个2’-F修饰；以及
(iii)在前五个核苷酸处的至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；
其中双螺旋区在19至25个碱基对之间(优选地19、20、21或22个)；并且其中这些dsRNA剂具有与至少一个链上的一个或多个位置缀合的一个或多个亲脂性部分；并且具有在反义链的3’端处的两个核苷酸突出端，及在反义链的5’端处的平端；或双链体两端均为平端。
在一个实施例中，本发明的dsRNA剂的包含有义链及反义链，该dsRNA剂的长度为15-30个核苷酸；在反义链上的前五个核苷酸处的至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；其中双螺旋区在19至25个碱基对之间(优选地19、20、21或22个)；其中dsRNA剂具有与至少一个链上的一个或多个位置缀合的一个或多个亲脂性部分；并且其中dsRNA剂具有少于20％、少于15％及少于10％的非天然核苷酸。
非天然核苷酸的实例包括非环状核苷酸、LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、2’-氟、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)或2’-ara-F等等。
在一个实施例中，本发明的dsRNA剂的包含有义链及反义链，该dsRNA剂的长度为15-30个核苷酸；在反义链上的前五个核苷酸处的至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；其中双螺旋区在19至25个碱基对之间(优选地19、20、21或22个)；其中dsRNA剂具有与至少一个链上的一个或多个位置缀合的一个或多个亲脂性部分；并且其中dsRNA剂具有大于80％、大于85％及大于90％的天然核苷酸，诸如2’-OH、2’-脱氧及2’-OMe为天然核苷酸。
在一个实施例中，本发明的dsRNA剂的包含有义链及反义链，该dsRNA剂的长度为15-30个核苷酸；在反义链上的前五个核苷酸处的至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键(自5’端计数)；其中双螺旋区在19至25个碱基对之间(优选地19、20、21或22个)；其中dsRNA剂具有与至少一个链上的一个或多个位置缀合的一个或多个亲脂性部分；并且其中dsRNA剂具有100％天然核苷酸，诸如2’-OH、2’-脱氧及2’-OMe为天然核苷酸。
亲脂性部分的实例包括但不限于脂质(饱和或不饱和C4-C30烃链，以及选自由以下组成的组的任选的官能团：羟基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、叠氮基及炔烃)、胆固醇、视黄酸、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪。
在一些实施例中，亲脂性部分为C6-C30酸(例如，己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、维生素A、维生素E、胆固醇等)或C6-C30醇(例如，己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇、十三烷醇、十四烷醇、十五烷醇、十六烷醇、十七烷醇、十八烷醇、油醇、亚麻醇、花生四烯醇、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯醇、视黄醇、维生素E、胆固醇等)。
在一个实例中，亲脂性部分为饱和或不饱和C6-C18烃链。
在一个实例中，亲脂性部分为二十二碳六烯酸。
在一个实施例中，本发明的dsRNA剂包含有义链及反义链，每个链具有14至30个核苷酸，其中有义链序列由式(I)表示：
5’np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3’
(I)
其中：
i及j各自独立地是0或1；
p及q各自独立地是0-6；
每个Na独立地表示包含0-25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
每个Nb独立地表示包含1、2、3、4、5或6个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np及nq独立地表示突出端核苷酸；
其中Nb及Y不具有相同的修饰；
其中XXX、YYY及ZZZ各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个同一修饰的一个基序；
其中其中dsRNA剂具有与至少一个链上的一个或多个位置缀合的一个或多个亲脂性部分；以及
其中dsRNA的反义链包含被1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个磷酸酯核苷酸间键分开的两个具有一个、两个或三个硫代磷酸酯核苷酸间键的嵌段。
各种公开描述多聚体siRNA，并且全部可以与本发明的iRNA一起使用。此类公开文件包括WO 2007/091269、美国专利号7858769、WO 2010/141511、WO 2007/117686、WO 2009/014887及WO 2011/031520，将其通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％的本发明的iRNA剂经修饰。
在一些实施例中，iRNA剂的有义链及反义链中的每个独立地经非环状核苷酸、LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、2’-氟、2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)或2’-ara-F修饰。
在一些实施例中，iRNA剂的有义链及反义链中的每个含有至少两个不同的修饰。
在一些实施例中，本发明的双链iRNA剂不含有任何2’-F修饰。
在一些实施例中，本发明的双链iRNA剂含有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个2’-F修饰。在一个实例中，本发明的双链iRNA剂含有九或十个2’-F修饰。
本发明的iRNA剂可以进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰可以出现在链中任何位置的有义链或反义链或两个的任何核苷酸上。举例而言，核苷酸间键修饰可以出现在有义链或反义链上的每一核苷酸上；各核苷酸间键修饰可以交替模式出现在有义链或反义链上；或有义链或反义链可以交替模式含有两个核苷酸间键修饰。有义链上的核苷酸间键修饰的交替模式可以与反义链相同或不同，并且有义链上的核苷酸间键修饰的交替模式可相对于反义链上的核苷酸间键修饰的交替模式具有迁移。
在一个实施例中，iRNA在突出端区域中包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如，突出端区域可含有两个核苷酸，在该两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。也可进行核苷酸间键修饰以将突出端核苷酸与双螺旋区内的末端配对核苷酸连接。例如，至少2、3、4个或所有突出端核苷酸可通过硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键连接，并且任选地，可存在将突出端核苷酸与紧邻突出端核苷酸的配对核苷酸连接的额外硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。举例而言，在末端三个核苷酸之间可存在至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中三个核苷酸中的两个为突出端核苷酸，并且第三个为紧邻突出端核苷酸的配对核苷酸。优选地，这些末端三个核苷酸可处于反义链的3’端。
在一些实施例中，iRNA剂的有义链和/或反义链包含具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的一个或多个嵌段。在一个实例中，有义链包含具有两个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的一个嵌段。在一个实例中，反义链包含具有两个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段。例如，具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段被16-18个磷酸酯核苷酸间键分隔开。
在一些实施例中，本发明的iRNA剂的反义链与靶RNA100％互补以与其杂交且通过RNA干扰抑制其表达。在另一个实施例中，本发明的iRNA剂的反义链与靶RNA至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％或至少50％互补。
在一个方面中，本发明涉及能够抑制靶基因表达的iRNA剂。iRNA剂包含有义链及反义链，每个链具有14至40个核苷酸。有义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中至少一个所述热去稳定化核苷酸出现在与反义链的种子区相对的位点处或附近(即在反义链的5’-端的位置2-8处)，例如，当有义链长度为21个核苷酸时，热去稳定化核苷酸出现在有义链的5’端的位置14-17之间。反义链含有至少两个经修饰的核酸，其小于空间上苛刻的2’-OMe修饰。优选地，小于空间上苛刻的2’-OMe的两个经修饰的核酸被11个核苷酸长分隔。例如，两个经修饰的核酸位于反义链的5’端的位置2及14处。
在一些实施例中，本文披露的本发明化合物为miRNA模拟物。在一种设计中，miRNA模拟物为双链分子(例如，具有约16至约31个核苷酸长度的双螺旋区)并且含有与给定miRNA的成熟链具有同一性的一个或多个序列。双链miRNA模拟物具有与如上关于双链iRNA所述类似的设计。在一些实施例中，miRNA模拟物包含16至31个核苷酸的双螺旋区及以下化学修饰模式中的一个或多个：有义链含有核苷酸1和2的2’-O-甲基修饰(自有义寡核苷酸的5’端计数)以及所有C及U；反义链修饰可包含所有C和U的2’F修饰、寡核苷酸5’端的磷酸化以及与2个核苷酸3’突出端相关的稳定的核苷酸间键。
在一些实施例中，本文披露的本发明化合物为抗mir(antimir)。在一些实施例中，本发明化合物包含至少两个经由基于核苷酸或非基于核苷酸的接头，例如本披露中所述的接头彼此共价连接，或彼此非共价连接的抗mir。术语“抗mir”、“微RNA抑制剂”或“miR抑制剂”是同义的并且是指干扰特定miRNA活性的寡核苷酸或经修饰的寡核苷酸。抑制剂可采用多种构型，包括单链、双链(RNA/RNA或RNA/DNA双链体)及发夹设计，一般而言，微RNA抑制剂包含与待靶向的miRNA的成熟链互补或部分互补的一个或多个序列或序列部分，另外，miRNA抑制剂也可包含位于成熟miRNA的反向互补序列的5’及3’的额外序列。额外序列可以是与成熟miRNA来源的pri-miRNA中的成熟miRNA相邻序列的反向互补序列，或额外序列可以是任意序列(具有A、G、C、U或dT的混合物)。在一些实施例中，额外序列中的一或两个是能够形成发夹的任意序列。因此，在一些实施例中，作为miRNA的反向互补序列的序列通过发夹结构侧接在5’侧及3’侧。当双链时，微RNA抑制剂可以包括相反链上的核苷酸之间的错配。此外，微RNA抑制剂可以与缀合物部分连接，以促进将抑制剂摄入细胞中。
微RNA抑制剂(包括发夹miRNA抑制剂)详细描述于Vermeulen等人,“Double-Stranded Regions Are Essential Design Components Of Potent Inhibitors of RISCFunction[双链区是有效的RISC功能抑制剂的基本设计组分],”RNA 13:723-730(2007)以及WO 2007/095387及WO 2008/036825中，将其各自通过引用以其全文并入本文。本领域普通技术人员可从数据库选择序列用于所需miRNA，并且设计可用于本文所披露的方法的抑制剂。
在一些实施例中，本文披露的本发明化合物为拮抗mir(antagomir)。在一些实施例中，本发明化合物包含至少两个经由基于核苷酸或非基于核苷酸的接头，例如本披露中所述的接头彼此共价连接，或彼此非共价连接的拮抗mir。拮抗mir是RNA样寡核苷酸，其具有用于RNA酶保护及药理学特性的各种修饰，诸如增强组织及细胞摄取。其与正常RNA的不同的处在于例如糖的完全2’-O-甲基化、硫代磷酸酯糖间键及例如在3’端的胆固醇部分。在优选的实施例中，拮抗mir包含在分子的所有核苷酸处的2’-O-甲基修饰、在3’端处的胆固醇部分、在5’端前两个位置处的两个硫代磷酸酯糖间键及在3’端处的四个硫代磷酸酯键。通过形成包含拮抗mir及内源性miRNA的双链体，拮抗mir可用于有效沉默内源性miRNA，从而防止miRNA诱导的基因沉默。拮抗mir介导的miRNA沉默的实例为miR-122的沉默，描述于Krutzfeldt等人,Nature[自然],2005,438:685-689中，将其明确地通过引用以其全文并入本文。
近期研究已发现，dsRNA也可活化基因表达，该机制是已称为“小RNA诱导的基因活化”或RNAa(活化RNA)的机制。参见例如Li,L.C.等人Proc Natl Acad Sci USA.[美国国家科学院院刊](2006),103(46):17337-42及Li L.C.(2008).“Small RNA-Mediated GeneActivation[小RNA介导的基因活化]”.RNA and the Regulation of Gene Expression:AHidden Layer of Complexity.[RNA和基因表达的调节：复杂的隐藏层]Caister AcademicPress.[凯斯特学术出版社]ISBN 978-1-904455-25-7。已显示靶向基因启动子的dsRNA诱导相关基因的有效转录活化。在人类中也已发现引起RNAa的内源性miRNA。查阅E.Nature[自然](2007).448(7156):855-858。
另一个令人惊讶的观察结果为通过RNAa的基因活化为持久的。已发现基因表达的诱导持续超过十天。RNAa的延长效应可归因于dsRNA靶位点处的表观遗传变化。在一些实施例中，RNA活化因子可增加基因的表达。在一些实施例中，增加的基因表达抑制活力、生长发育和/或繁殖。
因此，在一些实施例中，本文披露的本发明化合物为活化RNA。在一些实施例中，本发明的化合物包含至少两个经由基于核苷酸或非基于核苷酸的接头(例如本披露中所述的接头)彼此共价连接，或彼此非共价连接的活化RNA。
因此，在一些实施例中，本文披露的本发明化合物为形成三螺旋体的寡核苷酸(TFO)。在一些实施例中，本发明的化合物包含至少两个经由基于核苷酸或非基于核苷酸的接头(例如本披露中所述的接头)彼此共价连接，或彼此非共价连接的TFO。近期研究表明，可设计形成三螺旋体的寡核苷酸，该寡核苷酸可以序列特异性方式识别并且结合双链螺旋DNA中的多嘌呤/多嘧啶区。这些识别规则由Maher III,L.J.等人,Science[科学](1989)第245卷,第725-730页；Moser,H.E.等人,Science[科学](1987)第238卷,第645-630页；Beal,P.A.等人,Science[科学](1992)第251卷,第1360-1363页；Conney,M.等人,Science[科学](1988)第241卷,第456-459页及Hogan,M.E.等人,EP公开375408概述。寡核苷酸的修饰(诸如嵌入剂及糖间键取代的引入)以及结合条件(pH及阳离子浓度)的优化有助于克服TFO活性的固有障碍，诸如电荷排斥及不稳定性，并且最近显示合成寡核苷酸可靶向特定序列(关于最新的综述，参见Seidman及Glazer,J Clin Invest[临床研究杂志]2003；l 12:487-94)。一般而言，形成三螺旋体的寡核苷酸具有序列对应关系：
寡核苷酸3’-A G G T
双链体5’-A G C T
双链体3’-T C G A
然而，已显示A-AT及G-GC三联体具有最大的三螺旋稳定性(Reither及Jeltsch,BMC Biochem[BMC生物化学],2002,Seρtl2，电子版)。同一作者已证明，根据A-AT及G-GC规则设计的TFO不形成非特异性三螺旋体，表明三链体形成确实为序列特异性的。
因此，对于任何给定的序列，可设计三螺旋体形成序列。形成三螺旋体的寡核苷酸的长度优选地为至少15、更优选地25、再更优选地30或更多个核苷酸，至多50或100个核苷酸。
用靶DNA形成三螺旋结构诱导空间及功能变化，阻断转录起始及延伸，允许将所需序列变化引入内源性DNA中且导致基因表达的特异性下调。在用TFO处理的细胞中此类基因表达抑制的实例包括在哺乳动物细胞中剔除附加型supFGl及内源性HPRT基因(Vasquez等人,Nucl Acids Res.[核酸研究]1999；27:1176-81及Puri等人,J Biol Chem[生物化学杂志],2001；276:28991-98)，以及前列腺癌病因中重要的Ets2转录因子(Carbone等人,NuclAcid Res.[核酸研究]2003；31:833-43)及促炎性ICAM-I基因(Besch等人,J Biol Chem[生物化学杂志],2002；277:32473-79)的表达的序列及靶特异性下调。另外，Vuyisich及Beal最近表明，序列特异性TFO可以与dsRNA结合，抑制dsRNA依赖性酶诸如RNA依赖性激酶的活性(Vuyisich及Beal,Nuc.Acids Res[核酸研究]2000；28:2369-74)。
另外，根据上述原理设计的TFO可以诱导能够实现DNA修复的定向突变诱变，从而提供内源基因表达的下调及上调(Seidman及Glazer,J Clin Invest[临床研究杂志]2003；112:487-94)。有效TFO的设计、合成及施用的详细描述可见于Froehler等人的美国专利申请号2003 017068及2003 0096980，Emanuele等人的美国专利申请号2002 0128218及20020123476，以及Lawn的美国专利号5,721,138，将其内容以其整体并入本文中。
核酸修饰
在一些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含至少一种本文所述的核酸修饰。例如，至少一种修饰选自由经修饰的核苷间键、经修饰的核碱基、经修饰的糖及其任何组合组成的组。在没有限制的情况下，此类修饰可存在于本发明的双链iRNA剂中的任何位置。例如，修饰可存在于RNA分子中的一个中。
核酸修饰(核碱基)
核苷的天然存在的碱基部分通常为杂环碱基。此类杂环碱基的两种最常见的类别为嘌呤及嘧啶。对于包括呋喃戊醣基糖的那些核苷，磷酸酯基团可连接于糖的2′、3′或5′羟基部分。在形成寡核苷酸时，那些磷酸酯将相邻的核苷彼此共价连接以形成线性聚合化合物。在寡核苷酸内，磷酸酯通常称为形成寡核苷酸的核苷间主链。RNA及DNA的天然存在的键或主链为3′至5′磷酸二酯键。
除“未修饰”或“天然”核碱基(诸如嘌呤核碱基腺嘌呤(A)及鸟嘌呤(G)，以及嘧啶核碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U))之外，本领域技术人员已知的许多经修饰的核碱基或核碱基模拟物适用于本文所述的化合物。未修饰或天然的核碱基可经修饰或替换以提供具有改进的特性的iRNA。例如，可用这些碱基或用合成及天然核碱基(例如，肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、水粉蕈素(nubularine)、异鸟苷(isoguanisine)或杀结核菌素(tubercidine))及本文所述的寡聚物修饰中的任一个来制备核酸酶抗性寡核苷酸。可替代地，可采用任何上述碱基及“通用碱基”的经取代或经修饰的类似物。当天然碱基经非天然和/或通用碱基替换时，该核苷酸称为包含本文中的经修饰的核碱基和/或核碱基修饰。经修饰的核碱基和/或核碱基修饰也包括天然、非天然及通用碱基，其包含缀合部分，例如本文所述的配体。用于与核碱基缀合的优选的缀合部分包括阳离子氨基，其可经由适当烷基、烯基或具有酰胺键的接头与核碱基缀合。
本文所述的寡聚化合物也可以包括核碱基(本领域通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未修饰”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)及鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。示例性经修饰的核碱基包括但不限于其他合成及天然核碱基，诸如肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、水粉蕈素、异鸟苷、杀结核菌素、2-(卤基)腺嘌呤、2-(烷基)腺嘌呤、2-(丙基)腺嘌呤、2-(氨基)腺嘌呤、2-(氨基烷基)腺嘌呤、2-(氨基丙基)腺嘌呤、2-(甲硫基)-N6-(异戊烯基)腺嘌呤、6-(烷基)腺嘌呤、6-(甲基)腺嘌呤、7-(去氮)腺嘌呤、8-(烯基)腺嘌呤、8-(烷基)腺嘌呤、8-(炔基)腺嘌呤、8-(氨基)腺嘌呤、8-(卤基)腺嘌呤、8-(羟基)腺嘌呤、8-(硫代烷基)腺嘌呤、8-(硫醇)腺嘌呤、N6-(异戊基)腺嘌呤、N6-(甲基)腺嘌呤、N6,N6-(二甲基)腺嘌呤、2-(烷基)鸟嘌呤、2-(丙基)鸟嘌呤、6-(烷基)鸟嘌呤、6-(甲基)鸟嘌呤、7-(烷基)鸟嘌呤、7-(甲基)鸟嘌呤、7-(去氮)鸟嘌呤、8-(烷基)鸟嘌呤、8-(烯基)鸟嘌呤、8-(炔基)鸟嘌呤、8-(氨基)鸟嘌呤、8-(卤基)鸟嘌呤、8-(羟基)鸟嘌呤、8-(硫代烷基)鸟嘌呤、8-(硫醇)鸟嘌呤、N-(甲基)鸟嘌呤、2-(硫基)胞嘧啶、3-(去氮)-5-(氮杂)胞嘧啶、3-(烷基)胞嘧啶、3-(甲基)胞嘧啶、5-(烷基)胞嘧啶、5-(炔基)胞嘧啶、5-(卤基)胞嘧啶、5-(甲基)胞嘧啶、5-(丙炔基)胞嘧啶、5-(丙炔基)胞嘧啶、5-(三氟甲基)胞嘧啶、6-(偶氮基)胞嘧啶、N4-(乙酰基)胞嘧啶、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿嘧啶、2-(硫基)尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫基)尿嘧啶、5-(甲氨基甲基)-2-(硫基)尿嘧啶、4-(硫基)尿嘧啶、5-(甲基)-4-(硫基)尿嘧啶、5-(甲氨基甲基)-4-(硫基)尿嘧啶、5-(甲基)-2,4-(二硫基)尿嘧啶、5-(甲氨基甲基)-2,4-(二硫基)尿嘧啶、5-(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-(烷基)尿嘧啶、5-(炔基)尿嘧啶、5-(烯丙基氨基)尿嘧啶、5-(氨基烯丙基)尿嘧啶、5-(氨基烷基)尿嘧啶、5-(胍烷基)尿嘧啶、5-(1,3-二唑-1-烷基)尿嘧啶、5-(氰基烷基)尿嘧啶、5-(二烷基氨基烷基)尿嘧啶、5-(二甲基氨基烷基)尿嘧啶、5-(卤基)尿嘧啶、5-(甲氧基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸、5-(甲氧基羰基甲基)-2-(硫基)尿嘧啶、5-(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶、5-(丙炔基)尿嘧啶、5-(丙炔基)尿嘧啶、5-(三氟甲基)尿嘧啶、6-(偶氮基)尿嘧啶、二氢尿嘧啶、N3-(甲基)尿嘧啶、5-尿嘧啶(即假尿嘧啶)、2-(硫基)假尿嘧啶、4-(硫基)假尿嘧啶、2,4-(二硫基)假尿嘧啶、5-(烷基)假尿嘧啶、5-(甲基)假尿嘧啶、5-(烷基)-2-(硫基)假尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫基)假尿嘧啶、5-(烷基)-4-(硫基)假尿嘧啶、5-(甲基)-4-(硫基)假尿嘧啶、5-(烷基)-2,4-(二硫基)假尿嘧啶、5-(甲基)-2,4-(二硫基)假尿嘧啶、1-取代的假尿嘧啶、1-取代的2(硫基)-假尿嘧啶、1-取代的4-(硫基)假尿嘧啶、1-取代的2,4-(二硫基)假尿嘧啶、1-(氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1-(氨基羰基乙烯基)-2(硫基)-假尿嘧啶、1-(氨基羰基乙烯基)-4-(硫基)假尿嘧啶、1-(氨基羰基乙烯基)-2,4-(二硫基)假尿嘧啶、1-(氨基烷氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1-(氨基烷氨基-羰基乙烯基)-2(硫基)-假尿嘧啶、1-(氨基烷氨基羰基乙烯基)-4-(硫基)假尿嘧啶、1-(氨基烷氨基羰基乙烯基)-2,4-(二硫基)假尿嘧啶、1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-啡噻嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-啡噻嗪-1-基、7-取代的1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-取代的1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-啡噻嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-啡噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-啡噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-啡噻嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-(胍烷基-羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-啡噻嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫基)-3-(氮杂)-啡噻嗪-1-基、1,3,5-(三氮杂)-2,6-(二氧杂)-萘、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、水粉蕈素、杀结核菌素、异鸟苷、肌苷基、2-氮杂-肌苷基、7-去氮-肌苷基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、氨基吲哚基、吡咯并嘧啶基、3-(甲基)异喹诺酮基、5-(甲基)异喹诺酮基、3-(甲基)-7-(丙炔基)异喹诺酮基、7-(氮杂)吲哚基、6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基、咪唑并吡啶基、9-(甲基)-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、异喹诺酮基、7-(丙炔基)异喹诺酮基、丙炔基-7-(氮杂)吲哚基、2,4,5-(三甲基)苯基、4-(甲基)吲哚基、4,6-(二甲基)吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、芪基、并四苯基、并五苯基、二氟甲苯基、4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑、4-(甲基)苯并咪唑、6-(偶氮基)胸腺嘧啶、2-吡啶酮、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、6-(氮杂)嘧啶、2-(氨基)嘌呤、2,6-(二氨基)嘌呤、5-取代的嘧啶、N2-取代的嘌呤、N6-取代的嘌呤、O6-取代的嘌呤、经取代的1,2,4-三唑、吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、对取代的6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、邻取代的6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、双邻取代的6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、对(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、邻(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、双邻(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-吡啶并嘧啶-3-基或其任何O-烷基化或N-烷基化衍生物。可替代地，可采用任何上述碱基及“通用碱基”的经取代或经修饰的类似物。
如本文所用，通用核碱基为可以与所有四种天然存在的核碱基碱基配对而基本上不影响解链行为、细胞内酶识别或iRNA双链体的活性的任何核碱基。一些示例性通用核碱基包括但不限于2,4-二氟甲苯、硝基吡咯基、硝基吲哚基、8-氮杂-7-去氮腺嘌呤、4-氟-6-甲基苯并咪唑、4-甲基苯并咪唑、3-甲基异喹诺酮基、5-甲基异喹诺酮基、3-甲基-7-丙炔基异喹诺酮基、7-氮杂吲哚基、6-甲基-7-氮杂吲哚基、咪唑并吡啶基、9-甲基-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、异喹诺酮基、7-丙炔基异喹诺酮基、丙炔基-7-氮杂吲哚基、2,4,5-三甲基苯基、4-甲基吲哚基、4,6-二甲基吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、芪基、并四苯基、并五苯基及其结构衍生物(参见例如Loakes,2001,Nucleic Acids Research[核酸研究],29,2437-2447)。
其他核碱基包括美国专利号3,687,808中所披露的核碱基；2009年3月26日提交的国际申请号PCT/US 09/038425中所披露的核碱基；Concise Encyclopedia Of PolymerScience And Engineering[高分子科学与工程简明百科全书],第858-859页,Kroschwitz,J.I.编,John Wiley&Sons[约翰·威利父子出版公司],1990中所披露的核碱基；English等人,Angewandte Chemie[德国应用化学],国际版,1991,30,613中所披露的核碱基；Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine[生物化学、生物技术和医学中的经修饰核苷],Herdewijin,P.编Wiley-VCH[威利出版公司],2008中所披露的核碱基；及Sanghvi,Y.S.,第15章,dsRNA Research and Applications[dsRNA研究与应用],第289-302页,Crooke,S.T.及Lebleu,B.编,CRC Press[CRC出版公司],1993中所披露的核碱基。所有上述内容通过引用并入本文中。
在某些实施例中，经修饰的核碱基为在结构上与亲本核碱基非常相似的核碱基，诸如7-去氮嘌呤、5-甲基胞嘧啶或G形夹。在某些实施例中，核碱基模拟物包括更复杂的结构，诸如三环吩噁嗪核碱基模拟物。制备上述经修饰的核碱基的方法是本领域技术人员所熟知的。
核酸修饰(糖)
本文所提供的本发明的双链iRNA剂可包含一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多种)单体，包括具有经修饰的糖部分的核苷或核苷酸。例如，核苷的呋喃糖基糖环可以多种方式修饰，包括但不限于添加取代基、桥连两个非偕位环原子以形成锁核酸或双环核酸。在某些实施例中，寡聚化合物包含一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多种)单体，其为LNA。
在锁核酸的一些实施例中，呋喃糖基的2’位置通过独立地选自以下的接头连接至4’位置：-[C(R1)(R2)]n-、-[C(R1)(R2)]n-O-、-[C(R1)(R2)]n-N(R1)-、-[C(R1)(R2)]n-N(R1)-O-、-[C(R1R2)]n-O-N(R1)-、-C(R1)＝C(R2)-O-、-C(R1)＝N-、-C(R1)＝N-O-、-C(═NR1)-、-C(═NR1)-O-、-C(═O)-、-C(═O)O-、-C(═S)-、-C(═S)O-、-C(═S)S-、-O-、-Si(R1)2-、-S(═O)x-及-N(R1)-；
其中：
x是0、1或2；
n是1、2、3或4；
每个R1及R2独立地是H、保护基、羟基、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、经取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、经取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、经取代的C5-C20芳基、杂环基、经取代的杂环基、杂芳基、经取代的杂芳基、C5-C7脂环基、经取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(═O)-H)、经取代的酰基、CN、磺酰基(S(═O)2-J1)或磺基(S(═O)-J1)；并且
每个J1及J2独立地是H、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、经取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、经取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、经取代的C5-C20芳基、酰基(C(═O)-H)、经取代的酰基、杂环基、经取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、经取代的C1-C12氨基烷基或保护基。
在一些实施例中，LNA化合物的每个接头独立地是-[C(R1)(R2)]n-、-[C(R1)(R2)]n-O-、-C(R1R2)-N(R1)-O-或-C(R1R2)-O-N(R1)-。在另一个实施例中，所述接头中的每个独立地是4′-CH2-2′、4′-(CH2)2-2′、4′-(CH2)3-2′、4′-CH2-O-2′、4′-(CH2)2-O-2′、4′-CH2-O-N(R1)-2′及4′-CH2-N(R1)-O-2′-，其中每个R1独立地是H、保护基或C1-C12烷基。
某些LNA已经制备并且披露于专利文献以及科学文献中(Singh等人,Chem.Commun.[化学通讯],1998,4,455-456；Koshkin等人,Tetrahedron[四面体],1998,54,3607-3630；Wahlestedt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊],2000,97,5633-5638；Kumar等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机与药物化学快报],1998,8,2219-2222；WO 94/14226；WO 2005/021570；Singh等人,J.Org.Chem.[有机化学杂志],1998,63,10035-10039；披露LNA的颁布的美国专利及公开的申请的实例包括例如美国专利号7,053,207；6,268,490；6,770,748；6,794,499；7,034,133；和6,525,191；以及美国预授予公开号2004-0171570；2004-0219565；2004-0014959；2003-0207841；2004-0143114；以及20030082807。
本文也提供LNA，其中核糖基糖环的2′-羟基与糖环的4′碳原子连接，从而形成亚甲基氧基(4′-CH2-O-2′)键联以形成双环糖部分(综述于Elayadi等人,Curr.OpinionInvens.Drugs[研究药物的最新意见],2001,2,558-561；Braasch等人,Chem.Biol.[生物化学],2001,8 1-7；及Orum等人,Curr.Opinion Mol.Ther.[分子治疗学的最新观点],2001,3,239-243；也参见美国专利号6,268,490及6,670,461)。键联可以是桥连2′氧原子及4′碳原子的亚甲基(-CH2-)，其中术语亚甲基氧基(4′-CH2-O-2′)LNA用于双环部分；在此位置是亚乙基的情况下，使用术语亚乙基氧基(4′-CH2CH2-O-2′)LNA(Singh等人,Chem.Commun.[化学通讯],1998,4,455-456:Morita等人,Bioorganic Medicinal Chemistry[生物有机与药物化学],2003,11,2211-2226)。亚甲基氧基(4′-CH2-O-2′)LNA及其他双环糖类似物显示具有互补DNA及RNA的极高的双链体热稳定性(Tm＝+3至+10℃)，朝向3’-核酸外切降解的稳定性及良好的溶解特性。已描述包含BNA的有效且无毒的反义寡核苷酸(Wahlestedt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊],2000,97,5633-5638)。
也已论述的亚甲基氧基(4′-CH2-O-2′)LNA的异构体为α-L-亚甲基氧基(4′-CH2-O-2′)LNA，其已显示具有针对3′-核酸外切酶的优良稳定性。将α-L-亚甲基氧基(4′-CH2-O-2′)LNA并入反义缺口体(gapmer)及显示有效反义活性的嵌合体中(Frieden等人,NucleicAcids Research[核酸研究],2003,21,6365-6372)。
已描述亚甲基氧基(4′-CH2-O-2′)LNA单体腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶的合成及制备，以及其寡聚化及核酸识别特性(Koshkin等人,Tetrahedron[四面体],1998,54,3607-3630)。BNA及其制备也描述于WO 98/39352及WO 99/14226中。
也已制备亚甲基氧基(4′-CH2-O-2′)LNA的类似物硫代磷酸酯-亚甲基氧基(4′-CH2-O-2′)LNA及2′-硫基-LNA(Kumar等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机与药物化学快报],1998,8,2219-2222)。也已描述包含寡脱氧核苷酸双链体作为核酸聚合酶底物的锁核苷类似物的制备(Wengel等人,WO 99/14226)。此外，本领域已描述2′-氨基-LNA的合成，其是一种新颖的构形受限的高亲和力寡核苷酸类似物(Singh等人,J.Org.Chem.[有机化学杂志],1998,63,10035-10039)。另外，已制备2′-氨基-及2′-甲氨基-LNA，并且先前已报导其与互补RNA及DNA链的双链体的热稳定性。
经修饰的糖部分是熟知的，并且可用以改变，通常增加反义化合物对其靶标的亲和力和/或增加核酸酶抗性。优选的经修饰的糖的代表性清单包括但不限于经双环修饰的糖，包括亚甲基氧基(4′-CH2-O-2′)LNA及亚乙基氧基(4′-(CH2)2-O-2′桥键)ENA；经取代的糖，尤其具有2′-F、2′-OCH3或2′-O(CH2)2-OCH3取代基的2′-取代的糖；及经4′-硫基修饰的糖。糖也可经糖模拟基团以及其他替换。用于制备经修饰的糖的方法是本领域技术人员熟知的。教示此类经修饰的糖的制备的一些代表性专利及公开包括但不限于美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；5,700,920；6,531,584；和6,600,032；以及WO 2005/121371。
“氧基”-2′羟基修饰的实例包括烷氧基或芳氧基(OR，例如R＝H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH2CH2O)nCH2CH2OR，n＝1-50；“锁”核酸(LNA)，其中核苷的呋喃醣部分包括连接呋喃醣环上的两个碳原子的桥键，从而形成双环系统；O-胺或O-(CH2)n胺(n＝1-10，胺＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)；及O-CH2CH2(NCH2CH2NMe2)2。
“脱氧”修饰包括氢(即脱氧核糖，其与单链突出端特别相关)；卤基(例如氟)；氨基(例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-胺(胺＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基)；-NHC(O)R(R＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；氰基；巯基；烷基-硫基-烷基；硫代烷氧基；硫代烷基；烷基；环烷基；芳基；烯基及炔基，其可任选地经例如氨基官能团取代。
其他适合的2’-修饰(例如经修饰的MOE)描述于美国专利申请公开号20130130378中，将其内容通过引用以其全文并入本文。
在2’位置处的修饰可存在于阿拉伯糖构型中。术语“阿拉伯糖构型”是指取代基在核糖的C2’上的位置与2’-OH在阿拉伯糖中的构型相同。
糖可在糖中的相同碳处包含两种不同的修饰，例如偕位修饰。糖基也可含有一个或多个碳，其具有与核糖中的相应碳相反的立体化学构型。因此，寡聚化合物可以包括一种或多种含有例如阿拉伯糖作为糖的单体。单体可在糖的1’位置处具有α键，例如α-核苷。单体也可在4’-位置处具有相反的构型，例如C5’及H4’或替换其的取代基彼此互换。当C5’及H4’或替换其的取代基彼此互换时，糖称为在4’位置处经修饰。
本文所披露的本发明的双链iRNA剂也可以包括无碱基糖，即在C-1′处缺乏核碱基或在C1’处具有其他化学基团代替核碱基的糖。参见例如美国专利号5,998,203，将其内容以其整体并入本文中。这些无碱基(abasic)糖也可以进一步在组成性糖原子中的一个或多个处含有修饰。本发明的双链iRNA剂也可含有一种或多种呈L异构体的糖，例如L-核苷。对糖基的修饰也可以包括用硫、任选地经取代的氮或CH2基团替换4’-O。在一些实施例中，C1’与核碱基之间的键呈α构型。
糖修饰也可以包括非环状核苷酸，其中核糖碳之间的C-C键(例如，C1’-C2’、C2’-C3’、C3’-C4’、C4’-O4’、C1’-O4’)不存在和/或核糖碳或氧中的至少一个(例如，C1’、C2’、C3’、C4’或O4’)独立地或组合地不存在于核苷酸。在一些实施例中，非环状核苷酸是
Figure BDA0002885421910001011
其中B是经修饰或未修饰的核碱基，R1及R2独立地是H、卤素、OR3或烷基；并且R3为H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)。
在一些实施例中，糖修饰选自由以下组成的组：2’-H、2′-O-Me(2′-O-甲基)、2′-O-MOE(2′-O-甲氧基乙基)、2’-F、2′-O-[2-(甲氨基)-2-氧代乙基](2′-O-NMA)、2’-S-甲基、2’-O-CH2-(4’-C)(LNA)、2’-O-CH2CH2-(4’-C)(ENA)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)及偕位2’-OMe/2’F，其在阿拉伯糖构型中具有2’-O-Me。
应理解，当特定核苷酸通过其2’-位置与下一个核苷酸连接时，本文所述的糖修饰可置于该特定核苷酸(例如通过其2’-位置连接的核苷酸)的糖的3’-位置。3’位置处的修饰可以木糖构型存在。术语“木糖构型”是指取代基在核糖的C3’上的位置与3’-OH在木糖中的构型相同。
附接至C4’和/或C1’的氢可经直链或支链的任选地经取代的烷基、任选地经取代的烯基、任选地经取代的炔基替换，其中烷基、烯基及炔基的主链可含有O、S、S(O)、SO2、N(R’)、C(O)、N(R’)C(O)O、OC(O)N(R’)、CH(Z’)、含磷键、任选地经取代的芳基、任选地经取代的杂芳基、任选地经取代的杂环或任选地经取代的环烷基中的一个或多个，其中R’为氢、酰基或任选地经取代的脂肪族，Z’选自由以下组成的组：OR11、COR11、CO2R11、
Figure BDA0002885421910001021
NR21R31、CONR21R31、CON(H)NR21R31、ONR21R31、CON(H)N＝CR41R51、N(R21)C(＝NR31)NR21R31、N(R21)C(O)NR21R31、N(R21)C(S)NR21R31、OC(O)NR21R31、SC(O)NR21R31、N(R21)C(S)OR11、N(R21)C(O)OR11、N(R21)C(O)SR11、N(R21)N＝CR41R51、ON＝CR41R51、SO2R11、SOR11、SR11及经取代或未经取代的杂环；R21和R31在每次出现时独立地是氢、酰基、未经取代或经取代的脂肪族基、芳基、杂芳基、杂环基、OR11、COR11、CO2R11或NR11R11’；或R21和R31与其所附接的原子一起形成杂环；R41和R51在每次出现时独立地是氢、酰基、未经取代或经取代的脂肪族基、芳基、杂芳基、杂环基、OR11、COR11或CO2R11或NR11R11’；并且R11和R11’独立地是氢、脂肪族基、经取代的脂肪族基、芳基、杂芳基或杂环基。在一些实施例中，附接至5’末端核苷酸的C4’的氢被替换。
在一些实施例中，C4’及C5’一起形成任选地经取代的杂环基，其优选地包含至少一个-PX(Y)-，其中X为H、OH、OM、SH、任选地经取代的烷基、任选地经取代的烷氧基、任选地经取代的烷硫基、任选地经取代的烷基氨基或任选地经取代的二烷基氨基，其中M在每次出现时独立地是总电荷为+1的碱金属或过渡金属；并且Y为O、S或NR’，其中R’为氢、任选地经取代的脂肪族基。优选地，此修饰处于iRNA的5末端。
在某些实施例中，LNA包括具有下式的双环核苷：
Figure BDA0002885421910001031
其中：
Bx为杂环碱基部分；
T1为H或羟基保护基；
T2为H、羟基保护基或反应性磷基团；
Z为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、经取代的C1-C6烷基、经取代的C2-C6烯基、经取代的C2-C6炔基、酰基、经取代的酰基或经取代的酰胺。
在一些实施例中，经取代的基团的每个独立地经任选地受保护的取代基单或多取代，这些取代基独立地选自卤素、氧代、羟基、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(═X)J1、OC(═X)NJ1J2、NJ3C(═X)NJ1J2及CN，其中每个J1、J2及J3独立地是H或C1-C6烷基，并且X为O、S或NJ1。
在某些此类实施例中，经取代的基团的每个独立地经取代基单或多取代，这些取代基独立地选自卤素、氧代、羟基、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(═X)J1及NJ3C(═X)NJ1J2，其中每个J1、J2及J3独立地是H、C1-C6烷基或经取代的C1-C6烷基，并且X为O或NJ1。
在某些实施例中，Z基团为经一个或多个Xx取代的C1-C6烷基，其中每个Xx独立地是OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(═X)J1、OC(═X)NJ1J2、NJ3C(═X)NJ1J2或CN；其中每个J1、J2及J3独立地是H或C1-C6烷基，并且X为O、S或NJ1。在另一个实施例中，Z基团为经一个或多个Xx取代的C1-C6烷基，其中每个Xx独立地是卤基(例如氟)、羟基、烷氧基(例如CH3O-)、经取代的烷氧基或叠氮基。
在某些实施例中，Z基团为-CH2Xx，其中Xx为OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(═X)J1、OC(═X)NJ1J2、NJ3C(═X)NJ1J2或CN；其中每个J1、J2及J3独立地是H或C1-C6烷基，并且X为O、S或NJ1。在另一个实施例中，Z基团为-CH2Xx，其中Xx为卤基(例如氟)、羟基、烷氧基(例如CH3O-)或叠氮基。
在某些此类实施例中，Z基团呈(R)-构型：
Figure BDA0002885421910001041
在某些此类实施例中，Z基团呈(S)-构型：
Figure BDA0002885421910001042
在某些实施例中，每个T1及T2为羟基保护基。羟基保护基的优选的清单包括苄基、苯甲酰基、2,6-二氯苄基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、二甲氧基三苄基(DMT)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)及9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。在某些实施例中，T1是选自乙酰基、苄基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基及二甲氧基三苄基的羟基保护基，其中更优选的羟基保护基为T1为4,4′-二甲氧基三苄基。
在某些实施例中，T2为反应性磷基团，其中优选的反应性磷基团包括二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺及H-膦酸酯。在某些实施例中，T1为4,4′-二甲氧基三苯甲基并且T2为二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺。
在某些实施例中，本发明化合物包含至少一种下式的单体：
Figure BDA0002885421910001051
或具有下式：
Figure BDA0002885421910001052
或具有下式：
Figure BDA0002885421910001053
其中
Bx为杂环碱基部分；
T3为H、羟基保护基、连接的缀合物基团或附接至核苷、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、单体亚单元或寡聚化合物的核苷间连接基团；
T4为H、羟基保护基、连接的缀合物基团或附接至核苷、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、单体亚单元或寡聚化合物的核苷间连接基团；
其中T3及T4中的至少一个为附接至核苷、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、单体亚单元或寡聚化合物的核苷间连接基团；并且
Z为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、经取代的C1-C6烷基、经取代的C2-C6烯基、经取代的C2-C6炔基、酰基、经取代的酰基或经取代的酰胺。
在一些实施例中，经取代的基团的每个独立地经任选地受保护的取代基单或多取代，这些取代基独立地选自卤素、氧代、羟基、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(═X)J1、OC(═X)NJ1J2、NJ3C(═X)NJ1J2及CN，其中每个J1、J2及J3独立地是H或C1-C6烷基，并且X为O、S或NJ1。
在一些实施例中，经取代的基团的每个独立地经取代基单或多取代，这些取代基独立地选自卤素、氧代、羟基、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(═X)J1及NJ3C(═X)NJ1J2，其中每个J1、J2及J3独立地是H或C1-C6烷基，并且X为O或NJ1。
在某些此类实施例中，至少一个Z为C1-C6烷基或经取代的C1-C6烷基。在某些实施例中，每个Z独立地是C1-C6烷基或经取代的C1-C6烷基。在某些实施例中，至少一个Z为C1-C6烷基。在某些实施例中，每个Z独立地是C1-C6烷基。在某些实施例中，至少一个Z为甲基。在某些实施例中，每个Z为甲基。在某些实施例中，至少一个Z为乙基。在某些实施例中，每个Z为乙基。在某些实施例中，至少一个Z为经取代的C1-C6烷基。在某些实施例中，每个Z独立地是经取代的C1-C6烷基。在某些实施例中，至少一个Z为经取代的甲基。在某些实施例中，每个Z为经取代的甲基。在某些实施例中，至少一个Z为经取代的乙基。在某些实施例中，每个Z为经取代的乙基。
在某些实施例中，至少一个取代基为C1-C6烷氧基(例如，至少一个Z为经一个或多个C1-C6烷氧基取代的C1-C6烷基)。在另一个实施例中，每个取代基独立地是C1-C6烷氧基(例如，每个Z独立地是经一个或多个C1-C6烷氧基取代的C1-C6烷基)。
在某些实施例中，至少一个C1-C6烷氧基取代基为CH3O-(例如，至少一个Z为CH3OCH2-)。在另一个实施例中，每个C1-C6烷氧基取代基为CH3O-(例如，每个Z为CH3OCH2-)。
在某些实施例中，至少一个取代基为卤素(例如，至少一个Z为经一个或多个卤素取代的C1-C6烷基)。在某些实施例中，每个取代基独立地是卤素(例如，每个Z独立地是经一个或多个卤素取代的C1-C6烷基)。在某些实施例中，至少一个卤素取代基为氟(例如，至少一个Z为CH2FCH2-、CHF2CH2-或CF3CH2-)。在某些实施例中，每个卤基取代基为氟(例如，每个Z独立地是CH2FCH2-、CHF2CH2-或CF3CH2-)。
在某些实施例中，至少一个取代基为羟基(例如，至少一个Z为经一个或多个羟基取代的C1-C6烷基)。在某些实施例中，每个取代基独立地是羟基(例如，每个Z独立地是经一个或多个羟基取代的C1-C6烷基)。在某些实施例中，至少一个Z为HOCH2-。在另一个实施例中，每个Z为HOCH2-。
在某些实施例中，至少一个Z为CH3-、CH3CH2-、CH2OCH3-、CH2F-或HOCH2-。在某些实施例中，每个Z独立地是CH3-、CH3CH2-、CH2OCH3-、CH2F-或HOCH2-。
在某些实施例中，至少一个Z基团为经一个或多个Xx取代的C1-C6烷基，其中每个Xx独立地是OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(═X)J1、OC(═X)NJ1J2、NJ3C(═X)NJ1J2或CN；其中每个J1、J2及J3独立地是H或C1-C6烷基，并且X为O、S或NJ1。在另一个实施例中，至少一个Z基团为经一个或多个Xx取代的C1-C6烷基，其中每个Xx独立地是卤基(例如氟)、羟基、烷氧基(例如CH3O-)或叠氮基。
在某些实施例中，每个Z基团独立地是经一个或多个Xx取代的C1-C6烷基，其中每个Xx独立地是OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(═X)J1、OC(═X)NJ1J2、NJ3C(═X)NJ1J2或CN；其中每个J1、J2及J3独立地是H或C1-C6烷基，并且X为O、S或NJ1。在另一个实施例中，每个Z基团独立地是经一个或多个Xx取代的C1-C6烷基，其中每个Xx独立地是卤基(例如氟)、羟基、烷氧基(例如CH3O-)或叠氮基。
在某些实施例中，至少一个Z基团为-CH2Xx，其中Xx为OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(═X)J1、OC(═X)NJ1J2、NJ3C(═X)NJ1J2或CN；其中每个J1、J2及J3独立地是H或C1-C6烷基，并且X为O、S或NJ1。在某些实施例中，至少一个Z基团为-CH2Xx，其中Xx为卤基(例如氟)、羟基、烷氧基(例如CH3O-)或叠氮基。
在某些实施例中，每个Z基团独立地是-CH2Xx，其中每个Xx独立地是OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(═X)J1、OC(═X)NJ1J2、NJ3C(═X)NJ1J2或CN；其中每个J1、J2及J3独立地是H或C1-C6烷基，并且X为O、S或NJ1。在另一个实施例中，每个Z基团独立地是-CH2Xx，其中每个Xx独立地是卤基(例如氟)、羟基、烷氧基(例如CH3O-)或叠氮基。
在某些实施例中，至少一个Z为CH3-。在另一个实施例中，每个Z为CH3-。
在某些实施例中，至少一种单体的Z基团呈(R)-构型，其由下式表示：
Figure BDA0002885421910001081
或下式：
Figure BDA0002885421910001082
或下式：
Figure BDA0002885421910001083
在某些实施例中，式的每个单体的Z基团呈(R)-构型。
在某些实施例中，至少一种单体的Z基团呈(S)-构型，其由下式表示：
Figure BDA0002885421910001084
或下式：
Figure BDA0002885421910001085
或下式：
Figure BDA0002885421910001091
在某些实施例中，式的每个单体的Z基团呈(S)-构型。
在某些实施例中，T3为H或羟基保护基。在某些实施例中，T4为H或羟基保护基。在另一个实施例中，T3为附接至核苷、核苷酸或单体亚单元的核苷间连接基团。在某些实施例中，T4为附接至核苷、核苷酸或单体亚单元的核苷间连接基团。在某些实施例中，T3为附接至寡核苷或寡核苷酸的核苷间连接基团。在某些实施例中，T4为附接至寡核苷或寡核苷酸的核苷间连接基团。在某些实施例中，T3为附接至寡聚化合物的核苷间连接基团。在某些实施例中，T4为附接至寡聚化合物的核苷间连接基团。在某些实施例中，T3及T4中的至少一个包含选自磷酸二酯或硫代磷酸酯的核苷间连接基团。
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含具有至少两个连续单体的至少一个区域，这些单体具有下式：
Figure BDA0002885421910001092
或具有下式：
Figure BDA0002885421910001093
或具有下式：
Figure BDA0002885421910001094
在某些此类实施例中，LNA包括但不限于(A)α-L-亚甲基氧基(4′-CH2-O-2′)LNA，(B)β-D-亚甲基氧基(4′-CH2-O-2′)LNA，(C)亚乙基氧基(4′-(CH2)2-O-2′)LNA，(D)胺氧基(4′-CH2-O-N(R)-2′)LNA及(E)氧氨基(4′-CH2-N(R)-O-2′)LNA，如下所示：
Figure BDA0002885421910001101
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含具有至少两个连续的上式单体的至少两个区域。在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含有缺口的基序。在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含至少一个具有约8至约14个连续的β-D-2′-脱氧呋喃核糖基核苷的区域。在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含至少一个具有约9至约12个连续的β-D-2′-脱氧呋喃核糖基核苷的区域。
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含至少一个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个)包含至少一个下式的(S)-cEt单体：
Figure BDA0002885421910001111
其中Bx为杂环碱基部分。
在某些实施例中，单体包括糖模拟物。在某些此类实施例中，使用模拟物代替糖或糖-核苷间键组合，并且保持核碱基以便与选定的靶标杂交。糖模拟物的代表性实例包括但不限于环己烯基或N-吗啉基。糖-核苷间键组合的模拟物的代表性实例包括但不限于通过不带电荷的非手性键连接的肽核酸(PNA)及N-吗啉基。在一些情况下，使用模拟物代替核碱基。代表性核碱基模拟物是本领域熟知的，并且包括但不限于三环吩噁嗪类似物及通用碱基(Berger等人,Nuc Acid Res.[核酸研究]2000,28:2911-14，将其以引用的方式并入本文中)。糖、核苷及核碱基模拟物的合成方法是本领域技术人员熟知的。
核酸修饰(糖间键)
本文描述的是将单体(包括但不限于经修饰及未修饰的核苷及核苷酸)连接在一起的连接基团，从而形成寡聚化合物，例如寡核苷酸。此类连接基团也称为糖间键。两种主要类别的连接基团是由磷原子的存在或不存在来定义。代表性含磷键包括但不限于磷酸二酯(P═O)、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯及硫代磷酸酯(P═S)。代表性不含磷的连接基团包括但不限于亚甲基甲基亚胺基(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、硫代二酯(-O-C(O)-S-)、硫代氨基甲酸酯(-O-C(O)(NH)-S-)；硅氧烷(-O-Si(H)2-O-)；及N,N’-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)。与天然磷酸二酯键相比，经修饰的键可用于改变，通常增加寡核苷酸的核酸酶抗性。在某些实施例中，具有手性原子的键可制备为外消旋混合物，制备为单独的对映异构体。代表性手性键包括但不限于烷基膦酸酯及硫代磷酸酯。含磷及不含磷的键的制备方法是本领域技术人员熟知的。
连接基团中的磷酸酯可通过用不同取代基替换一个氧来修饰。此修饰的一种结果可以是增加寡核苷酸对溶核分解的抗性。经修饰的磷酸酯的实例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯及磷酸三酯。在一些实施例中，键联中的非桥连磷酸氧原子中的一个可经以下中的任一个替换：S、Se、BR3(R为氢、烷基、芳基)、C(即烷基、芳基等……)、H、NR2(R为氢、任选地经取代的烷基、芳基)或OR(R为任选地经取代的烷基或芳基)。未修饰的磷酸酯中的磷原子为非手性的。然而，用上述原子或原子团中的一个替换非桥连氧中的一个使得磷原子呈手性；换言之，以此方式修饰的磷酸酯中的磷原子为立体对称中心。立体对称磷原子可具有“R”构型(本文中为Rp)或“S”构型(本文中为Sp)。
二硫代磷酸酯具有被硫替换的两个非桥连氧。二硫代磷酸酯中的磷中心为非手性的，其杜绝寡核苷酸非对映异构体的形成。因此，尽管不希望受理论束缚，但对两个非桥连氧的修饰消除手性中心(例如二硫代磷酸酯形成)可以是合乎需要的，因为其无法产生非对映异构体混合物。因此，非桥连氧可独立地是O、S、Se、B、C、H、N或OR(R为烷基或芳基)中的任一个。
磷酸酯接头也可通过用氮(桥连氨基磷酸酯)、硫(桥连硫代磷酸酯)及碳(桥连亚甲基膦酸酯)替换桥连氧(即连接磷酸酯与单体的糖的氧)来修饰。替换可发生在任一连接氧或两个连接氧处。当桥连氧为核苷的3’-氧时，用碳替换优选的。当桥连氧为核苷的5’-氧时，用氮替换优选的。
经修饰的磷酸酯键，其中至少一个与磷酸酯连接的氧已经替换或磷酸酯已被非磷基团替换，也称为“非磷酸二酯糖间键”或“非磷酸二酯接头”。
在某些实施例中，磷酸酯可经不含磷的连接体替换，例如去磷接头。去磷接头在本文中也称为非磷酸二酯接头。尽管不希望受理论束缚，但据信由于带电荷的磷酸二酯基为溶核降解的反应中心，因此其用中性结构模拟物替换应赋予增强的核酸酶稳定性。同样，尽管不希望受理论束缚，但在一些实施例中，可能需要引入其中带电荷的磷酸酯经中性部分替换的改变。
可替换磷酸酯基团的部分的实例包括但不限于酰胺(例如酰胺-3(3’-CH2-C(＝O)-N(H)-5’)及酰胺-4(3’-CH2-N(H)-C(＝O)-5’))、羟基氨基、硅氧烷(二烷基硅氧烷)、甲酰胺、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、羧酸酯、硫醚、环氧乙烷接头、硫化物、磺酸酯、磺酰胺、磺酸酯、硫代甲缩醛(3’-S-CH2-O-5’)、甲缩醛(3’-O-CH2-O-5’)、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基羰氨基、亚甲基甲基亚氨基(MMI，3’-CH2-N(CH3)-O-5’)、亚甲基肼、亚甲基二甲基肼、亚甲氧基甲基亚氨基、醚(C3’-O-C5’)、硫醚(C3’-S-C5’)、硫代乙酰胺(C3’-N(H)-C(＝O)-CH2-S-C5’、C3’-O-P(O)-O-SS-C5’、C3’-CH2-NH-NH-C5’、3’-NHP(O)(OCH3)-O-5’及3’-NHP(O)(OCH3)-O-5’及含有混合的N、O、S及CH2组成部分的非离子键。参见例如CarbohydrateModifications in Antisense Research[反义研究中的碳水化合物修饰]；Y.S.Sanghvi及P.D.Cook编ACS Symposium Series[ACS研讨会系列]580；第3章及第4章,(第40-65页)。优选的实施例包括亚甲基甲基亚氨基(MMI)、亚甲基羰氨基、酰胺、氨基甲酸酯及环氧乙烷接头。
本领域技术人员充分意识到，在某些情况下，非桥连氧的替换会引起相邻2’-OH对糖间键的增强的裂解，因此在许多情况下，非桥连氧的修饰可能需要修饰2’-OH，例如不参与相邻糖间键的裂解的修饰，例如阿拉伯糖、2’-O-烷基、2’-F、LNA及ENA。
优选的非磷酸二酯糖间键包括硫代磷酸酯、具有至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多对映异构体过量的Sp异构体的硫代磷酸酯、具有至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多对映异构体过量的Rp异构体的硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、烷基-膦酸酯(例如甲基-膦酸酯)、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯(例如N-烷基氨基磷酸酯)及硼烷膦酸酯。
在一些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含至少一个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个且至多包括所有)经修饰的或非磷酸二酯键。在一些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含至少一个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个且至多包括所有)硫代磷酸酯键。
也可构筑本发明的双链iRNA剂，其中磷酸酯接头及糖经核酸酶抗性核苷或核苷酸替代物替换。尽管不希望受理论束缚，但据信不存在重复带电的主链减少了与识别聚阴离子的蛋白质(例如核酸酶)的结合。同样，尽管不希望受理论束缚，但在一些实施例中，可能需要引入其中碱基通过中性替代主链束缚的改变。实例包括N-吗啉基、环丁基、吡咯啶、肽核酸(PNA)、氨基乙基甘氨酰PNA(aegPNA)及主链延伸的吡咯啶PNA(bepPNA)核苷替代物。优选的替代物为PNA替代物。
本文所述的本发明的双链iRNA剂可含有一个或多个不对称中心，并且因此产生对映异构体、非对映异构体及其他立体异构构型，就绝对立体化学而言，可定义为(R)或(S)，诸如对于糖端基异构体，或定义为(D)或(L)，诸如对于氨基酸等。本文提供的本发明的双链iRNA剂包括所有此类可能的异构体，以及其外消旋及光学纯形式。
核酸修饰(末端修饰
在一些实施例中，双链iRNA剂进一步包含在反义链的5’端的磷酸酯或磷酸酯模拟物。在一个实施例中，磷酸酯模拟物为5’-乙烯基膦酸酯(VP)。
在一些实施例中，双链iRNA剂的反义链的5’端不含有5’-乙烯基膦酸酯(VP)。
本发明的iRNA剂的末端可经修饰。此类修饰可在一端或两端。例如，iRNA的3′和/或5′端可以与其他功能性分子实体缀合，诸如标记部分，例如荧光团(例如，芘、TAMRA、荧光素、Cy3或Cy5染料)或保护基(基于例如硫、硅、硼或酯)。功能性分子实体可通过磷酸酯和/或接头附接至糖。接头的末端原子可连接至或替换磷酸酯或糖的C-3′或C-5′O、N、S或C基团的连接原子。可替代地，接头可连接至或替换核苷酸替代物(例如PNA)的末端原子。
当接头/磷酸酯-功能性分子实体-接头/磷酸酯阵列插入双链寡聚化合物的两个链之间时，此阵列可取代发夹型寡聚化合物中的发夹环。
可用于调节活性的末端修饰包括用磷酸酯或磷酸酯类似物修饰iRNA的5’端。在某些实施例中，iRNA的5’端经磷酸化或包括磷酰基类似物。示例性5’-磷酸酯修饰包括与RISC介导的基因沉默相容的那些修饰。在5’末端处的修饰也可用于刺激或抑制受试者的免疫系统。在一些实施例中，寡聚化合物的5’端包含修饰
Figure BDA0002885421910001151
其中W、X及Y各自独立地选自由以下组成的组：O、OR(R为氢、烷基、芳基)、S、Se、BR3(R为氢、烷基、芳基)、BH3-、C(即烷基、芳基等……)、H、NR2(R为氢、烷基、芳基)或OR(R为氢、烷基或芳基)；A及Z在每次出现时各自独立地是不存在、O、S、CH2、NR(R为氢、烷基、芳基)或任选地经取代的亚烷基，其中亚烷基的主链可在内部和/或末端包含O、S、SS及NR(R为氢、烷基、芳基)中的一个或多个；并且n是0-2。在一些实施例中，n为1或2。应理解，A替换与糖的5’碳连接的氧。当n是0时，W和Y与其所附接的P一起可形成任选地经取代的5-8元杂环，其中W及Y各自独立地是O、S、NR’或亚烷基。优选地，杂环经芳基或杂芳基取代。在一些实施例中，5’末端核苷酸的C5’上的一个或两个氢经卤素(例如F)替换。
示例性5’-修饰包括但不限于5’-单磷酸酯((HO)2(O)P-O-5’)；5’-二磷酸酯((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-三磷酸酯((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-单硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)2(S)P-O-5’)；5’-单二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5’)、5’-硫代磷酸酯((HO)2(O)P-S-5’)；5’-α-硫代三磷酸酯；5’-β-硫代三磷酸酯；5’-γ-硫代三磷酸酯；5’-氨基磷酸酯((HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’)。其他5’-修饰包括5’-烷基膦酸酯(R(OH)(O)P-O-5’，R＝烷基，例如甲基、乙基、异丙基、丙基等……)、5’-烷基醚膦酸酯(R(OH)(O)P-O-5’，R＝烷基醚，例如甲氧基甲基(CH2OMe)、乙氧基甲基等……)。其他示例性5’-修饰包括其中Z被任选地经取代的烷基至少一次，例如((HO)2(X)P-O[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5’、((HO)2(X)P-O[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5’、((HO)2(X)P-[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5’；二烷基末端磷酸酯及磷酸酯模拟物：HO[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5’、H2N[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5’、H[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5’、Me2N[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5’、HO[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5’、H2N[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5’、H[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5’、Me2N[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5’，其中a及b各自独立地是1-10。其他实施例包括用BH3、BH3 -和/或Se替换氧和/或硫。
末端修饰也可用于监测分布，并且在此类情况下，待添加的优选的基团包括荧光团，例如荧光素或Alexa染料，例如Alexa 488。末端修饰也可用于增强摄取，对此有用的修饰包括靶向配体。末端修饰也可用于将寡核苷酸与另一部分交联；对此有用的修饰包括丝裂霉素C、补骨脂素及其衍生物。
热去稳定化修饰
本发明化合物(诸如iRNA或dsRNA剂)可通过在有义链中在反义链的种子区相对的位点处(即，在反义链的5’端的位置2-8处)引入热去稳定化修饰增加iRNA双链体解离或解链的倾向(降低双链体缔合的自由能)而经优化用于RNA干扰。此修饰可增加双链体在反义链的种子区中解离或解链的倾向。
热去稳定化修饰可以包括无碱基修饰；与相对链中的相对核苷酸错配；及糖修饰，诸如2’-脱氧修饰或非环状核苷酸，例如解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)。
例示性无碱基修饰为：
Figure BDA0002885421910001171
例示性糖修饰为：
Figure BDA0002885421910001172
术语“非环状核苷酸”是指具有非环状核糖的任何核苷酸，例如，其中核糖碳之间的任何键(例如，C1’-C2’、C2’-C3’、C3’-C4’、C4’-O4’或C1’-O4’)不存在和/或核糖碳或氧中的至少一个(例如，C1’、C2’、C3’、C4’或O4’)独立地或组合地不存在于核苷酸中。在一些实施例中，非环状核苷酸为
Figure BDA0002885421910001173
Figure BDA0002885421910001174
其中B为经修饰或未修饰的核碱基，R1及R2独立地是H、卤素、OR3或烷基；并且R3为H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)。术语“UNA”是指解锁的非环状核酸，其中糖的任何键已移除，形成解锁的“糖”残基。在一个实例中，UNA也涵盖移除C1’-C4’之间的键(即C1’与C4’碳之间的共价碳-氧-碳键)的单体。在另一个实例中，移除糖的C2’-C3’键(即C2’与C3’碳之间的共价碳-碳键)(参见Mikhailov等人,Tetrahedron Letters[四面体通讯],26(17):2059(1985)；及Fluiter等人,Mol.Biosyst.[分子生物系统],10:1039(2009)，将其特此以全文引用的方式并入)。非环状衍生物提供更大的主链挠曲性而不影响沃森-克里克配对。非环状核苷酸可经由2’-5’或3’-5’键连接。
术语’GNA’是指二醇核酸，其为与DNA或RNA类似，但其“主链”组成不同的聚合物，其由通过磷酸二酯键连接的重复甘油单元构成：
Figure BDA0002885421910001181
热去稳定化修饰可以是dsRNA双链体内的热去稳定化核苷酸与相对链中的相对核苷酸之间的错配(即，非互补碱基对)。示例性错配碱基配对包括G:G、G:A、G:U、G:T、A:A、A:C、C:C、C:U、C:T、U:U、T:T、U:T或其组合。本领域已知的其他错配碱基配对也适用于本发明。错配可发生在核苷酸(天然存在的核苷酸或经修饰的核苷酸的)之间，即，错配碱基配对可发生在相应核苷酸的核碱基之间，而与核苷酸的核糖上的修饰无关。在某些实施例中，本发明的化合物(诸如siRNA或iRNA剂)在错配配对中含有至少一个核碱基，即2’-脱氧核碱基；例如2’-脱氧核碱基在有义链中。
无碱基核苷酸、非环状核苷酸修饰(包括UNA及GNA)及错配修饰的更多实例已详细描述于WO 2011/133876中，将其通过引用以其全文并入本文。
热去稳定化修饰也可以包括具有降低或消除与相对碱基形成氢键的能力的通用碱基，以及磷酸酯修饰。
已针对dsRNA双链体中心区的去稳定化评估具有受损或完全消除的与相对链中的碱基形成氢键的能力的核碱基修饰，如WO 2010/0011895中所述，将其通过引用以其全文并入本文。示例性核碱基修饰为：
Figure BDA0002885421910001191
与天然磷酸二酯键相比，已知降低dsRNA双链体的热稳定性的示例性磷酸酯修饰为：
Figure BDA0002885421910001192
在一些实施例中，本发明化合物可包含2’-5’键(具有2’-H、2’-OH及2’-OMe且具有P＝O或P＝S)。例如，2’-5’键修饰可用于促进核酸酶抗性或抑制有义链与反义链的结合，或可在有义链的5’端使用以避免RISC的有义链活化。
在另一个实施例中，本发明化合物可包含L糖(例如，L核糖、具有2’-H、2’-OH及2’-OMe的L-阿拉伯糖)。例如，这些L糖修饰可用于促进核酸酶抗性或抑制有义链与反义链的结合，或可在有义链的5’端使用以避免RISC的有义链活化。
在一个实施例中，本发明的iRNA剂经由载体与配体缀合，其中载体可以是环状基团或非环状基团；优选地，环状基团系选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基及十氢化萘；优选地，非环状基团系选自丝氨醇主链或二乙醇胺主链。
在一些实施例中，本文披露的本发明的iRNA剂的至少一个链经5’磷酸化或在5’末端包括磷酰基类似物。5’-磷酸酯修饰包括与RISC介导的基因沉默相容的那些修饰。适合的修饰包括：5’-单磷酸酯((HO)2(O)P-O-5’)；5’-二磷酸酯((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-三磷酸酯((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-鸟苷帽(7-甲基化或非甲基化)(7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-腺苷帽(Appp)及任何经修饰或未修饰的核苷酸帽结构(N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-单硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)2(S)P-O-5’)；5’-单二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5’)、5’-硫代磷酸酯((HO)2(O)P-S-5’)；任何额外的氧/硫替换的单磷酸酯、二磷酸酯及三磷酸酯的组合(例如5’-α-硫代三磷酸酯、5’-γ-硫代三磷酸酯等)、5’-氨基磷酸酯((HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’)、5’-烷基膦酸酯(R＝烷基＝甲基、乙基、异丙基、丙基等，例如RP(OH)(O)-O-5’-、5’-烯基膦酸酯(即乙烯基、经取代的乙烯基)、(OH)2(O)P-5’-CH2-)、5’-烷基醚膦酸酯(R＝烷基醚＝甲氧基甲基(MeOCH2-)、乙氧基甲基等，例如RP(OH)(O)-O-5’-)。
靶基因
在没有限制的情况下，siRNA的靶基因包括但不限于促进不需要的细胞增殖的基因、生长因子基因、生长因子受体基因、表达激酶的基因、接附蛋白基因、编码G蛋白超家族分子的基因、编码转录因子的基因、介导血管生成的基因、病毒基因、病毒复制所需的基因、介导病毒功能的细胞基因、细菌病原体的基因、变形虫病原体的基因、寄生病原体的基因、真菌病原体的基因、介导不需要的免疫反应的基因、介导疼痛处理的基因、介导神经疾病的基因、在以杂合性缺失为特征的细胞中发现的等位基因或多形性基因的一个等位基因。
siRNA的具体示例性靶基因包括但不限于PCSK-9、ApoC3、AT3、AGT、ALAS1、TMPR、HAO1、AGT、C5、CCR-5、PDGFβ基因；Erb-B基因、Src基因；CRK基因；GRB2基因；RAS基因；MEKK基因；JNK基因；RAF基因；Erk1/2基因；PCNA(p21)基因；MYB基因；c-MYC基因；JUN基因；FOS基因；BCL-2基因；细胞周期素D基因；VEGF基因；EGFR基因；细胞周期素A基因；细胞周期素E基因；WNT-1基因；β-联蛋白基因；c-MET基因；PKC基因；NFKB基因；STAT3基因；存活素基因；Her2/Neu基因；拓朴异构酶I基因；拓朴异构酶IIα基因；p73基因；p21(WAF1/CIP1)基因、p27(KIP1)基因；PPM1D基因；小窝蛋白I基因；MIB I基因；MTAI基因；M68基因；肿瘤抑制基因；p53基因；DN-p63基因；pRb肿瘤抑制基因；APC1肿瘤抑制基因；BRCA1肿瘤抑制基因；PTEN肿瘤抑制基因；MLL融合基因，例如MLL-AF9、BCR/ABL融合基因；TEL/AML1融合基因；EWS/FLI1融合基因；TLS/FUS1融合基因；PAX3/FKHR融合基因；AML1/ETO融合基因；αv-整合素基因；Flt-1受体基因；微管蛋白基因；人类乳头状瘤病毒基因、人类乳头状瘤病毒复制所需的基因、人类免疫缺陷病毒基因、人类免疫缺陷病毒复制所需的基因、甲型肝炎病毒基因、甲型肝炎病毒复制所需的基因、乙型肝炎病毒基因、乙型肝炎病毒复制所需的基因、丙型肝炎病毒基因、丙型肝炎病毒复制所需的基因、丁型肝炎病毒基因、丁型肝炎病毒复制所需的基因、戊型肝炎病毒基因、戊型肝炎病毒复制所需的基因、己型肝炎病毒基因、己型肝炎病毒复制所需的基因、庚型肝炎病毒基因、庚型肝炎病毒复制所需的基因、重型肝炎(HepatitisH)病毒基因、重型肝炎病毒复制所需的基因、呼吸道合胞病毒基因、呼吸道合胞病毒复制所需的基因、单纯疱疹病毒基因、单纯疱疹病毒复制所需的基因、疱疹巨细胞病毒基因、疱疹巨细胞病毒复制所需的基因、疱疹埃-巴二氏病毒(Epstein Barr Virus)基因、疱疹埃-巴二氏病毒复制所需的基因、卡波西肉瘤(Kaposi’s Sarcoma)相关疱疹病毒基因、卡波西肉瘤相关疱疹病毒复制所需的基因、JC病毒基因、JC病毒复制所需的人类基因、黏液病毒基因、黏液病毒基因复制所需的基因、鼻病毒基因、鼻病毒复制所需的基因、冠状病毒基因、冠状病毒复制所需的基因、西尼罗河病毒基因、西尼罗河病毒复制所需的基因、圣路易脑炎(St.Louis Encephalitis)基因、圣路易脑炎复制所需的基因、森林脑炎病毒基因、森林脑炎病毒复制所需的基因、墨莱溪谷脑炎(Murray Valley encephalitis)病毒基因、墨莱溪谷脑炎病毒复制所需的基因、登革热病毒基因、登革热病毒基因复制所需的基因、猿猴病毒40基因、猿猴病毒40复制所需的基因、人类T细胞嗜淋巴细胞病毒基因、人类T细胞嗜淋巴细胞病毒复制所需的基因、莫罗尼小鼠(Moloney-Murine)白血病病毒基因、莫罗尼小鼠白血病病毒复制所需的基因、脑心肌炎病毒基因、脑心肌炎病毒复制所需的基因、麻疹病毒基因、麻疹病毒复制所需的基因、水痘带状疱疹病毒基因、水痘带状疱疹病毒复制所需的基因、腺病毒基因、腺病毒复制所需的基因、黄热病病毒基因、黄热病病毒复制所需的基因、脊髓灰质炎病毒基因、脊髓灰质炎病毒复制所需的基因、痘病毒基因、痘病毒复制所需的基因、疟原虫基因、疟原虫基因复制所需的基因、溃疡分枝杆菌基因、溃疡分枝杆菌复制所需的基因、结核分枝杆菌基因、结核分枝杆菌复制所需的基因、麻风分支杆菌基因、麻风分支杆菌复制所需的基因、金黄色葡萄球菌基因、金黄色葡萄球菌复制所需的基因、肺炎链球菌基因、肺炎链球菌复制所需的基因、化脓性链球菌基因、化脓性链球菌复制所需的基因、肺炎衣原体基因、肺炎衣原体复制所需的基因、肺炎支原体基因、肺炎支原体复制所需的基因、整合素基因、选择素基因、补体系统基因、趋化因子基因、趋化因子受体基因、GCSF基因、Gro1基因、Gro2基因、Gro3基因、PF4基因、MIG基因、前血小板碱性蛋白基因、MIP-1I基因、MIP-1J基因、RANTES基因、MCP-1基因、MCP-2基因、MCP-3基因、CMBKR1基因、CMBKR2基因、CMBKR3基因、CMBKR5v、AIF-1基因、I-309基因、离子通道的组分的基因、神经传递质受体基因、神经传递质配体基因、类淀粉蛋白家族基因、早老素基因、HD基因、DRPLA基因、SCA1基因、SCA2基因、MJD1基因、CACNL1A4基因、SCA7基因、SCA8基因、杂合性缺失(LOH)细胞中发现的等位基因、多形性基因的一个等位基因、及其组合。
杂合性缺失(LOH)可导致LOH区域中序列(例如基因)的半合子性。这可导致正常细胞与病态细胞(例如癌细胞)之间的显著基因差异，并且提供正常细胞与病态细胞(例如癌细胞)之间的有用差异。此差异可以是因为基因或其他序列在二倍体细胞中是杂合的，但在具有LOH的细胞中为半合子的而产生。LOH区通常包括基因，其缺失引起不需要的增殖，例如肿瘤抑制基因；及其他序列，包括例如其他基因，在一些情况下为正常功能(例如生长)所必需的基因。本发明的方法部分依赖于用本发明的组合物对必需基因的一个等位基因的特异性调节。
在某些实施例中，本发明提供调节微RNA的本发明的双链iRNA剂。
靶向CNS
在一些实施例中，本发明提供双链iRNA剂，其靶向早发性家族性阿尔茨海默病的APP、脊髓小脑共济失调2及ALS的ATXN2、以及肌萎缩侧索硬化症及额颞叶型痴呆的C9orf72。
在一些实施例中，本发明提供双链iRNA剂，其靶向ALS的TARDBP、额颞叶型痴呆的MAPT(Tau)及亨廷顿病的HTT。
在一些实施例中，本发明提供双链iRNA剂，其靶向帕金森病的SNCA、ALS的FUS，脊髓小脑共济失调3的ATXN3，SCA1的ATXN1，SCA7及SCA8的基因，DRPLA的ATN1，XLMR的MeCP2，朊病毒疾病、隐性CNS障碍：拉福拉病的PRNP、DM1(CNS及骨骼肌)的DMPK，及hATTR(CNS、眼及全身)的TTR。
脊髓小脑共济失调是遗传性脑功能障碍。显性遗传形式的脊髓小脑共济失调(诸如SCA1-8)是没有疾病改善疗法的破坏性障碍。示例性靶标包括SCA2、SCA3及SCA1。
靶向SCA2的ATXN2
脊髓小脑共济失调2(SCA2)，一种进行性共济失调，是第二常见的SCA。与此靶标相关的另一种疾病为肌萎缩侧索硬化症(ALS)。这些疾病是使人衰弱且最终致死的疾病，没有疾病改善疗法。SCA的患病率为每100,000人中有2-6人；ATXN2造成全球15％的SCA人口且在一些国家中SCA人口多得多，尤其是古巴(每100,000人中有40人)。经由人类分子遗传学靶向ATXN2可以是优异的，例如，在家族性及偶发性SCA及ALS中，在诸如脊髓、脑干或小脑的组织中发现ATXN2中的编码CAG重复扩增。此靶向的机制可以是因为ATXN2的常染色体显性编码CAG扩增导致有毒、错误折叠的蛋白质的表达以及浦金埃氏细胞(Purkinje cell)及神经元死亡。已通过ATXN2 mRNA的70％敲低(KD)显示功效；且已证实mATXN2小鼠KD POC。关于安全性，已报告mATXN2基因剔除(KO)小鼠是健康的。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF CAG mRNA及肽重复蛋白
靶向SCA3的ATXN3
脊髓小脑共济失调3(SCA3)，一种进行性共济失调，是全球最常见的SCA。此疾病是使人衰弱且最终致死的疾病，没有疾病改善疗法。其为SCA的最常见病因，并且SCA的患病率为每100,000人中有2-6人；ATXN3在美国造成21％的SCA人口且在欧洲(尤其在葡萄牙)多得多。经由人类分子遗传学靶向ATXN3可以是优异的，例如，在家族性及偶发性SCA中，在诸如脊髓、脑干或小脑的组织中发现ATXN3中的编码CAG重复扩增。此靶向的机制可以是因为ATXN3的常染色体显性编码CAG扩增导致有毒、错误折叠的蛋白质的表达、浦金埃氏细胞及神经元死亡。已通过ATXN3 mRNA的70％KD显示功效；且已证实mATXN3 KD小鼠POC。关于安全性，已报告mATXN3 KO小鼠是健康的。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF CAG mRNA及肽重复蛋白。
靶向SCA1的ATXN1
脊髓小脑共济失调1(SCA1)，一种进行性共济失调，是1993年发现的第一个SCA基因。此疾病是使人衰弱且最终致死的疾病，没有疾病改善疗法。SCA的患病率为每100,000人中有2-6人；ATXN1在美国及全球造成6％的SCA人口，并且在一些国家多得多(在日本为25％)，尤其在波兰(64％)及西伯利亚(100％)。经由人类分子遗传学靶向ATXN1可以是优异的，例如，在家族性及偶发性SCA中，在诸如脊髓、脑干或小脑的组织中发现ATXN1中的编码CAG重复扩增。此靶向的机制可以是因为ATXN1的常染色体显性编码CAG扩增导致有毒、错误折叠的蛋白质的表达、浦金埃氏细胞及神经元死亡。已通过ATXN1 mRNA的70％KD显示功效；且已证实mATXN1小鼠POC。关于安全性，已报告mATXN1 KO小鼠是健康的。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF CAG mRNA及肽重复蛋白。
靶向SCA7的ATXN7
脊髓小脑共济失调7(SCA7)造成进行性共济失调及视网膜变性。此疾病是使人衰弱且最终致死的视网膜及小脑障碍，没有疾病改善疗法。SCA的患病率为每100,000人中有2-6人；ATXN7造成全球5％的SCA人口，并且在一些国家(尤其在南非)多得多。经由人类分子遗传学靶向ATXN7可以是优异的，例如，在家族性及偶发性SCA中，在诸如脊髓、脑干、小脑或视网膜的组织中发现ATXN7中的编码CAG重复扩增。此靶向的机制可以是因为ATXN1的常染色体显性编码CAG扩增导致有毒、错误折叠的蛋白质的表达，从而引发视锥及视杆变性、浦金埃氏细胞及神经元致死性。经由鞘内(IT)及玻璃体内(IVT)施用，已通过ATXN1 mRNA的70％KD显示功效。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF CAG mRNA及肽重复蛋白。
靶向SCA8的ATXN8
脊髓小脑共济失调8(SCA8)，一种进行性神经退化性共济失调，是由ATXN8中的CTG重复扩增引起。此疾病是使人衰弱且最终致死的疾病，没有疾病改善疗法。患病率：SCA是每100,000人中有2-6人；ATXN8造成全球3％的SCA人口，并且在一些国家(尤其在芬兰)多得多。经由人类分子遗传学靶向ATXN8可以是优异的，例如，在家族性及偶发性SCA中，在诸如脊髓、脑干或小脑的组织中发现ATXN8中的编码CTG重复扩增。此靶向的机制可以是因为ATXN8的常染色体显性编码CTG扩增导致有毒、错误折叠的蛋白质的表达，从而引发浦金埃氏细胞及神经元致死性。已通过ATXN8 mRNA的70％KD显示功效。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF CTG mRNA及肽重复蛋白。
靶向SCA6的CACNA1A
脊髓小脑共济失调6(SCA6)是进行性共济失调。此疾病是使人衰弱且最终致死的疾病，没有疾病改善疗法。SCA的患病率为每100,000人中有2-6人；且CACNA1A造成全球15％的SCA人口。经由人类分子遗传学靶向CACNA1A可以是优异的，例如，在家族性及偶发性SCA中，在诸如脊髓、脑干或小脑的组织中发现CACNA1A中的编码CAG重复扩增。此靶向的机制可以是因为CACNA1A的常染色体显性编码CAG扩增导致有毒、错误折叠的蛋白质的表达以及浦金埃氏细胞及神经元死亡。已通过CACNA1A CAG扩增的70％KD显示功效。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF CAG mRNA及肽重复蛋白。
遗传性聚谷氨酰胺障碍的示例性靶标包括亨廷顿病(HD)。
靶向亨廷顿病的HTT
亨廷顿突变导致HD，一种进行性CNS退化疾病。此疾病是使人衰弱且最终致死的疾病，没有疾病改善疗法。全球HD的患病率为每100,000人中有5-10人，并且在某些国家(尤其在委内瑞拉)更加常见。经由人类分子遗传学靶向HTT可以是优异的，例如，在家族性及偶发性HD中，在诸如纹状体或皮质的组织中发现的HTT中的编码CAG重复扩增。此靶向的机制可以是因为HTT的常染色体显性编码CAG扩增导致有毒、错误折叠的蛋白质的表达及神经元死亡。已通过仅HTT CAG扩增的70％KD显示功效；且已证实小鼠POC。关于安全性，小鼠HTT的KO可以是致死性的；已证实人类的KD。可能的诊断包括家族病史；基因测试；早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF mRNA及肽重复蛋白。
靶向DRPLA的ATN1
Atrophin 1突变导致齿状核红核苍白球路易体萎缩症(DRPLA)，其是与HD类似的进行性脊髓小脑障碍。此疾病是使人衰弱且最终致死的疾病，没有疾病改善疗法。在日本，DRPLA的患病率为每1,000,000人中有2-7人。经由人类分子遗传学靶向ATN1可以是优异的，例如，在家族性及偶发性SCA中，在诸如脊髓、脑干、小脑或皮质的组织中发现ATN1中的编码CAG重复扩增。此靶向的机制可以是因为ATN1的常染色体显性编码CAG扩增导致有毒、错误折叠的蛋白质的表达及神经元死亡。已通过ATN1的70％KD显示功效。关于安全性，已报告ATN1 KO小鼠是健康的。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF CAG mRNA及肽重复蛋白。
靶向脊髓延髓肌肉萎缩的AR
雄激素受体突变导致脊髓和延髓肌肉萎缩(SBMA，肯尼迪病(Kennedy disease))，一种进行性肌肉萎缩疾病，及其他疾病。此疾病是使人衰弱且最终致死的疾病，没有疾病改善疗法。SBMA的患病率为每100,000个男性中有2例；女性有轻微表型。经由人类分子遗传学靶向AR可以是优异的，例如，在家族性SBMA中，在诸如脊髓或脑干的组织中发现的AR中的编码CAG重复扩增。此靶向的机制可以是因为AR的X连锁的编码CAG扩增导致毒性功能获得性(gain-or-function)及运动神经元致死性。已通过AR的70％KD显示功效。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF CAG mRNA及肽重复蛋白。
靶向弗里德里希共济失调(Friedrich Ataxia)的FXN
FXN的隐性功能丧失GAA扩增导致弗里德里希共济失调(FA)，一种进行性退化性共济失调。此疾病是使人衰弱且最终致死的疾病，没有疾病改善疗法。FA的患病率为全球每100,000人中有2人。经由人类分子遗传学靶向FXN可以是优异的，例如，在家族性FA中，在诸如脊髓、小脑或可能视网膜及心脏的组织中发现FXN中的内含子GAA重复扩增。此靶向的机制可以是因为FXN的常染色体隐性非编码FAA扩增导致FXN(重要的粒线体蛋白)的死亡表达。已通过FXN内含子GAS扩增的70％KD显示功效。关于安全性，内含子GAA的KD在小鼠中是安全且有效的。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF mRNA及肽重复蛋白。
靶向FXTAS的FMR1
脆性X相关性震颤/共济失调综合征(FXTAS)，一种成人进行性共济失调及认知丧失障碍，由FMR1过表达引起。此疾病是使人衰弱的疾病，没有疾病改善疗法。FMR1预突变的患病率为500个男性中有1个。经由人类分子遗传学靶向FMR1可以是优异的，例如在FXTAS中，在诸如脊髓、小脑或皮质的组织中发现FMR1中的编码CCG重复扩增预突变。此靶向的机制可以是因为FMR1的X连锁的编码CCG扩增导致毒性mRNA。已通过毒性mRNA的70％KD显示功效。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSFmRNA及肽重复蛋白。
靶向脆性X综合征的FMR1的上游
脆性X综合征(FRAXA)，一种进行性智力迟钝障碍，可通过靶向FMR1的上游mRNA来治疗。此疾病是使人衰弱的疾病，没有疾病改善疗法。FRAXA的患病率为每4,000个男性中有1个及每8,000个女性中有1个。经由人类分子遗传学靶向FMR1可以是优异的，例如，在FRAXA中，在诸如CNS的组织中发现FMR1中的编码CCG重复扩增。此靶向的机制可以是因为FMR1的X连锁的编码CCG扩增导致LOF；且正常FMR1用于自细胞核转运特异性mRNA。已通过毒性mRNA的70％KD显示功效。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF mRNA及肽重复蛋白。
显性遗传性肌萎缩侧索硬化症为破坏性障碍，没有疾病改善疗法。示例性靶标包括C9orf72、ATXN2(也造成SCA2)及MAPT。
靶向ALS的C9orf72
C9orf72为肌萎缩侧索硬化症(ALS)及额颞叶型痴呆(FTD)的最常见病因。这些疾病是运动神经元的致死性障碍，没有疾病改善疗法。ALS的患病率为每100,000人中有2-5人(10％为家族性)；C9orf72造成美国及欧洲39％的家族性ALS及7％的偶发性ALS。经由人类分子遗传学靶向C9orf72可以是优异的，例如，在家族性及偶发性ALS中，在诸如上部及下部运动神经元(对于ALS)；或皮质(对于FTD)的组织中发现六核苷酸扩增。此靶向的机制可以是因为常染色体显性六核苷酸扩增导致毒性二肽重复蛋白的重复相关的非AUG依赖性转译及神经元致死性。已通过C9orf72的70％KD显示功效。关于安全性，C9orf72的杂合LOF突变似乎在人类及小鼠中为安全的。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF六核苷酸重复mRNA及二肽重复蛋白。
靶向ALS的TARDBP
TARDBP突变导致ALS及额颞叶型痴呆(FTD)。这些疾病是运动神经元的致死性障碍，没有疾病改善疗法。ALS的患病率为每100,000人中有2-5人(10％为家族性)；TARDBP造成5％的家族性ALS及1.5％的偶发性ALS。经由人类分子遗传学靶向TARDBP可以是优异的，例如，在家族性及偶发性ALS中，在诸如上部及下部运动神经元(对于ALS)；或皮质(对于FTD)的组织中发现突变。此靶向的机制可以是因为常染色体显性TRDBP突变导致毒性TRDBP蛋白及神经元致死性。已通过TARDBP突变等位基因的70％KD显示功效。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF蛋白。
靶向ALS的FUS
FUS突变导致ALS及FTD。这些疾病为运动神经元的致死性障碍，没有疾病改善疗法。ALS的患病率为每100,000人中有2-5人(10％为家族性)；FUS造成5％的家族性ALS；FUS内含物常见于偶发性ALS。经由人类分子遗传学靶向FUS可以是优异的，例如，在家族性ALS中，在诸如对于ALS的上部及下部运动神经元的组织中发现突变。此靶向的机制可以是因为常染色体显性FUS突变导致异常蛋白质折叠及神经元致死性。已通过FUS突变等位基因的70％KD显示功效。关于安全性，KO小鼠挣扎但存活且具有ADHD表型。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF蛋白。
靶向ALS的SOD1
SOD1的显性及隐性突变导致ALS。此疾病为运动神经元的致死性障碍，没有疾病改善疗法。ALS的患病率为每100,000人中有2-5人(10％为家族性)；SOD1造成5％-20％的家族性ALS。经由人类分子遗传学靶向SOD1可以是优异的，例如，在诸如对于ALS的上部及下部运动神经元的组织中，许多SOD1突变与家族中的AD及AR ALS相关。此靶向的功效可能需要突变特异性KD。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。生物标志物可以是突变特异性的。
显性遗传性额颞叶型痴呆及进行性核上麻痹。靶标包括MAPT(因为其对于AD可以是重要的)或C9orf72。
靶向FTD-17及PSP的微管相关蛋白Tau
家族性额颞叶型痴呆17(FTD-17)，一种排列于染色体17的家族性FTD形式，及家族性进行性核上麻痹可能由MAPT突变引起，其也可引起罕见形式的进行性核上麻痹、皮质基底核退化症、伴有呼吸衰竭的Tau蛋白病、伴有癫痫的痴呆。这些疾病为致死性神经退化性障碍，没有疾病改善疗法。FTD的患病率为每100,000人中有15-22人；荷兰的FTD-17患病率为1,000,000人口中有1人。经由人类分子遗传学靶向MAPT可以是优异的，例如，在家族性及偶发性FTD中，在诸如额叶或颞叶皮质的组织中发现MAPT的GOF点突变及剪接位点突变。此靶向的机制可以是因为MAPT的常染色体显性GOF突变导致毒性Tau肽及神经元死亡。已通过MAPT的70％KD显示功效。关于安全性，已报告MAPT KO小鼠是健康的。可能的诊断包括家族病史；基因测试；早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF Tau mRNA及蛋白质。
靶向FTD及ALS的死骨片(Sequestosome)1
偶发性FTD/ALS与显性SQSTM1突变相关。此疾病为致死性神经退化性障碍，没有疾病改善疗法。这是一种非常罕见的疾病。在散发病例中，在诸如额叶及颞叶皮质、或小脑及脊髓的组织中，经由人类分子基因关联靶向死骨片1是合理的。可能的诊断包括基因测试；早期症状。
显性遗传性帕金森病为破坏性障碍，没有疾病改善疗法。靶标包括SNCA。
靶向帕金森病的SNCA
α突触核蛋白突变导致家族性帕金森病(PD)及路易体性痴呆(Lewy bodydementia)。这些疾病为致死性神经退化性障碍，没有疾病改善疗法。PD的患病率为全球4百万；1/3的PD为家族性的；1％的fPD由SNCA引起。经由人类分子遗传学靶向SNCA可以是优异的，例如，在诸如延髓；或中脑的黑质的组织中，SNCA点突变及重复引起家族性PD。此靶向的机制可以是因为异常SNCA蛋白的过表达或表达导致毒性肽及神经元死亡。已通过SNCA的70％KD显示功效。关于安全性，SNCA KO小鼠是健康的。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF SNCA mRNA及蛋白质。
靶向帕金森病的LRRK2
富含亮氨酸的重复激酶2突变导致家族性帕金森病。此疾病为致死性神经退化性障碍，没有疾病改善疗法。PD的患病率为全球4百万；1/3的PD为家族性的；3％-7％的fPD由LRRK2引起。经由人类分子遗传学靶向LRRK2可以是优异的，例如，在诸如延髓；或中脑的黑质的组织中，LRRK2点突变引起家族性PD。可能的诊断包括家族病史；基因测试；早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF mRNA及蛋白质。
靶向脊髓性肌萎缩V的GARS
常染色体显性甘氨酰-tRNA合成酶突变导致脊髓性肌萎缩V(SMAV)或远程遗传性运动神经病Va。这些疾病为神经退化性障碍，没有疾病改善疗法。这些为非常罕见的疾病。经由人类分子遗传学靶向GARs可以是良好的，例如，在诸如脊髓的组织中，GARS点突变引起家族性SMA。可能的诊断包括家族病史；基因测试；早期症状。
靶向脊髓性肌萎缩的Seipin
常染色体显性Seipin突变导致脊髓性肌萎缩(SMA)或远程遗传性运动神经病。这些疾病为神经退化性障碍，没有疾病改善疗法。这些为非常罕见的疾病。经由人类分子遗传学靶向Seipin可以是良好的，例如，在诸如脊髓的组织中，Seipin点突变引起家族性SMA。此靶向的机制可能为GOF及毒性肽。已通过50％KD显示功效。关于安全性，隐性LOF突变导致伴有或不伴有脂质营养不良的进行性脑病。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。
显性遗传性阿尔茨海默病为破坏性障碍，没有疾病改善疗法。由于在家族性疾病中的中心机制作用及在常见AD中的可能作用，靶标包括APP。
靶向阿尔茨海默病的APP
类淀粉前体蛋白质突变导致早发性家族性阿尔茨海默病(EOFAD)；唐氏综合征中的AD；或AD。这些疾病为致死性神经退化性障碍，没有疾病改善疗法。EOFAD-APP的患病率为1％AD；21三体症的患病率为1％AD；且在美国，AD的患病率为约2.5-5百万。经由人类分子遗传学靶向APP可以是优异的，例如，在诸如大脑皮质或海马体的组织中，APP重复及点突变导致EOFAD。此靶向的机制可以是因为APP过表达或毒性代谢物的表达引起进行性神经元死亡。已通过APP的70％KD显示功效。关于安全性，已报告KD小鼠是健康的，有一些行为异常；已报告KD小鼠是健康的，有一些空间记忆影响。可能的诊断包括家族病史；基因测试；早期症状；或MRI。可以使用的生物标志物包括例如CSF APP mRNA及肽。
靶向阿尔茨海默病的PSEN1
早老素1突变导致早发性家族性阿尔茨海默病(EOFAD)；或AD。这些疾病是致死性神经退化性障碍，没有疾病改善疗法。经由人类分子遗传学靶向PSEN1可以是优异的，例如，在诸如大脑皮质或海马体的组织中，PSEN1点突变导致EOFAD。此靶向的机制可以是因为PSEN1的常染色体显性突变引起异常APP代谢且毒性肽引起进行性神经元死亡。已通过APPKD可免除对PSEN1特异性疗法的需求来显示功效。可能的诊断包括家族病史；基因测试；早期症状；或MRI。可以使用的生物标志物包括例如CSF PSEN1及APP肽。
靶向阿尔茨海默病的PSEN2
早老素2突变导致早发性家族性阿尔茨海默病(EOFAD)；或AD。这些疾病是致死性神经退化性障碍，没有疾病改善疗法。经由人类分子遗传学靶向PSEN2可以是优异的，例如，在诸如大脑皮质或海马体的组织中，PSEN2点突变导致EOFAD。此靶向的机制可以是因为PSEN2的常染色体显性突变引起异常APP代谢且毒性肽引起进行性神经元死亡。可能的诊断包括家族病史；基因测试；早期症状；或MRI。可以使用的生物标志物包括例如CSF PSEN2及APP肽。
靶向阿尔茨海默病的Apo E
载脂蛋白E4与老年人偶发性AD相关联。此疾病为致死性神经退化性障碍，没有疾病改善疗法。在美国，AD的患病率为2.5-5百万。靶向Apo E可以是有效的，因为支持ApoE4与AD之间关联的基因组证据在许多群体中是优异的。靶组织可以是大脑皮质。尽管在许多群体中存在强烈关联，但尚不清楚Apo E4是否促成AD的发病机制。迄今为止，数据表明Apo E4纯合子指示老年人AD风险增加，但即使在老年人中仍不足以引起AD。关于安全性，CNS中ApoE的KD可以是安全的，因为Apo E中的人类LOF突变与明显的神经缺陷无关，尽管全身暴露可能引起III型高脂蛋白血症。可能的诊断包括AD的临床诊断；排除EOFAD突变；Apo E4基因型的基因测试。可以使用的生物标志物包括例如CSF APP、Tau mRNA及肽。
CNS基因重复障碍。一致的KD减半可改善这些障碍。靶标包括MeCP2。
靶向X连锁的智力迟钝的MeCP2
甲基CpG结合蛋白2基因重复导致X连锁的智力迟钝(XLMR)。此疾病为致死性认知障碍，没有疾病改善疗法。1％-15％的X连锁的MR由MeCP2重复引起；2％-3％的人口患有MR。经由人类分子遗传学靶向MeCP2可以是优异的，例如，在诸如大脑皮质的组织中，MeCP2重复导致XLMR。此靶向的机制可以是因为MeCP2过表达导致其他基因的调节异常及神经退化。已通过MeCP2的50％KD显示功效；且小鼠模型中的ASO KD逆转表型。关于安全性，MeCP2 LOF突变可能引起雷特氏综合征(Rett syndrome)。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF MeCP2 mRNA及肽。
显性遗传性脑类淀粉蛋白血管病为破坏性障碍，没有疾病改善疗法。靶标包括TTR。
靶向hATTR CAA的TTR
此靶向可以是CNS siRNA的低风险引入。脑类淀粉蛋白血管病(CAA)及脑膜类淀粉蛋白为致死性障碍，没有疾病改善疗法。经由人类遗传学及药理学靶向TTR可以是优异的。靶组织可以是CNS血管系统或CNS。此靶向的机制可以是因为突变蛋白在血管外膜中积聚，引起CNS出血。已通过TTR的70％KD显示功效。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF mRNA及蛋白质。
靶向CAA的ITM2B
整合膜蛋白2B突变导致脑类淀粉蛋白血管病(CAA)、英国型或家族性英国痴呆(FBD)。特异性突变也可导致显性视网膜变性。此疾病为致死性障碍，没有疾病改善疗法。此为一种罕见的疾病。经由人类分子遗传学靶向ITM2B可以是优异的。靶组织可以是CNS血管系统或CNS。此靶向的机制可能涉及GOF突变。已通过ITM2B突变等位基因的70％KD显示功效。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSFmRNA及可能的蛋白质。
靶向CAA的CST3
血清胱抑素C突变导致冰岛型家族性脑类淀粉蛋白血管病。此疾病为致死性障碍，没有疾病改善疗法。除冰岛及丹麦外，此为一种罕见的疾病。经由人类遗传学靶向CST3可以是优异的。靶组织可以是CNS血管系统。此靶向的机制可以是因为突变蛋白在血管外膜中积聚，引起CNS出血。已通过突变等位基因的可能70％KD显示功效。关于安全性，CST3 KO小鼠可能有患关节炎的风险。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF mRNA及可能的蛋白质。
靶向痉挛性截瘫的SPAST
SPASTIN突变导致伴有认知丧失的痉挛性截瘫(SP)4。此疾病是下部运动神经退化性障碍，没有疾病改善疗法。SP的患病率为每100,000人口中有5人；SP4是45％的显性SP。经由人类分子遗传学靶向SPAST可以是优异的，例如，在诸如脊髓；或CNS的组织中，SPAST三核苷酸突变导致家族性SP。此靶向的机制可以是因为无义及可能的显性负突变引起异常微管代谢及神经退化。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF SPAST mRNA及可能的蛋白质。
靶向痉挛性截瘫的KIF5A
驱动蛋白家族成员5A突变导致伴有周围神经病变及其他障碍的痉挛性截瘫(SP)10。此疾病是下部运动神经退化性障碍，没有疾病改善疗法。SP的患病率为每100,000人中有5人；SP10为每1,000,000人中有1人。经由人类分子遗传学靶向KIF5A可以是优异的，例如，KIF5A氨基端错义突变导致SP10；并且KIF5A在CNS中表达且编码微管运动蛋白。靶组织可以是脊髓。此靶向的机制可以是因为常染色体显性错义突变导致可能影响与运动神经结合的微管的SP10。功效可通过突变等位基因的可能KD提供。关于安全性，KIF5A移码突变导致新生儿难治性肌阵挛，并且剪接位点突变可能通过LOF机制与家族性ALS相关联。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF mRNA及可能的蛋白质。
靶向痉挛性截瘫的ATL1
Atlastin突变导致痉挛性截瘫3A及感觉神经病1D、遗传性感觉神经病(HSN)。此疾病为下部运动神经退化性障碍，没有疾病改善疗法。SP的患病率为每100,000人中有5人；SP3A为一种罕见的显性形式。经由人类分子遗传学靶向ATL1可以是优异的，例如，ATL1点突变导致家族性SP。靶组织可以是脊髓。此靶向的机制可以是因为显性负ATL1蛋白的常染色体显性表达导致SP3A；然而，LOF突变导致感觉神经病1D。已通过特异性ATL1等位基因的70％KD显示功效。关于安全性，ATL1杂合LOF突变导致HSN1D。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF ATL1 mRNA及蛋白质。
靶向痉挛性截瘫的NIPA1
LOF NIPA1突变导致伴有癫痫症及癫痫发作的痉挛性截瘫6。此疾病是下部运动神经退化性障碍，没有疾病改善疗法。SP的患病率为每100,000人中有5人；SP6为一种罕见的显性形式。经由人类分子遗传学靶向NIPA1可以是优异的，例如，NIPA1点突变导致家族性SP。靶组织可以是脊髓；或CNS。此靶向的机制可以是因为缺陷膜蛋白的常染色体显性表达导致SP3A；且可能为LOF。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF mRNA及可能的蛋白质。
显性遗传性肌紧张性营养障碍为需要CNS及全身性疗法的CNS、骨骼肌及心肌障碍。靶标包括DM1的MPK。
靶向肌紧张性营养障碍1的DMPK
靶向肌紧张性营养障碍蛋白激酶的有效疗法需要CNS及全身性疗法。肌紧张性营养障碍1(DM1)为肌肉及CNS的退化性障碍。其为致死性障碍，没有疾病改善疗法。DM1的患病率为全球每8,000人中有1人。经由人类分子遗传学靶向DMPK可以是优异的，例如，DMPK CTG重复扩增导致家族性DM1。靶组织可以是骨骼肌、心肌或CNS。此靶向的机制可以是因为常染色体显性非编码CTG重复导致异常RNA加工及显性负效应；极端扩增的预期导致早发性疾病。已通过70％的DMPK显示功效；且已在小鼠中证实ASO功效。已在KO及ASO KD小鼠中证明安全性。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如血液及CSF mRNA及蛋白质。
靶向肌紧张性营养障碍2的ZNF9
锌指蛋白9突变导致肌紧张性营养障碍2(DM2)，一种骨骼肌的退化性障碍。此为严重障碍，没有疾病改善疗法。DM2的患病率为全球每8,000人中有1人；其是成人中最常见的肌营养不良症。经由人类分子遗传学靶向ZNF9可以是优异的，例如，内含子1中的ZNF9 CTTG重复扩增导致家族性DM2。靶组织可以是骨骼肌或心肌。此靶向的机制可以是因为内含子1中的常染色体显性CTTG重复扩增导致异常RNA代谢及显性负效应。已通过70％的ZNF9显示功效。已证实小鼠中的安全KD。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如血液mRNA及蛋白质。
显性遗传性朊病毒疾病为遗传性、偶发性及传染性PRNP障碍。靶标包括PRNP。
靶向肌紧张性朊病毒疾病的PRNP
肌紧张性朊病毒疾病为显性遗传性朊病毒疾病，包括PRNP相关的脑类淀粉蛋白血管病、吉斯氏病(Gerstmann-Straussler Disease，GSD)、库贾氏病(Creutzfeldt-JakobDisease，CJD)、致死性家族性失眠(FFI)、类亨廷顿病1(HDL1)及库鲁易感性(Kurususceptibility)。这些疾病为致死性神经退化性障碍，没有疾病改善疗法。此类疾病的患病率为每1,000,000人中有1人。经由人类分子遗传学靶向PRNP可以是优异的，例如，PRNP突变导致家族性及偶发性朊病毒疾病。靶组织可以是CNS。此靶向的机制可以是因为常染色体显性蛋白中折叠(mid-folding)导致神经毒性。已通过70％的PRNP KD显示功效；并且PRNP多态性似乎对库鲁病有保护作用。关于安全性，已报告PRNP KO小鼠是健康的。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF mRNA及蛋白质。
靶向拉福拉的肌痉挛癫痫症的糖原合成酶
Laforin(EPM2A)基因突变导致AR肌痉挛癫痫症，一种遗传性进行性癫痫发作障碍。此疾病为癫痫发作及认知减退的致死性障碍，没有疾病改善疗法。此疾病的患病率为每1,000,000人中有4人。经由人类分子遗传学靶向糖原合成酶可以是优异的，例如，突变导致拉福拉的AR家族性肌痉挛癫痫症。靶组织可以是CNS。此靶向的机制可以是因为Laforin的常染色体隐性功能障碍导致糖原的错误折叠及癫痫发作的病灶。已通过糖原合成酶GYS1的70％KD显示功效。关于安全性，GYS1缺乏导致骨骼肌及心肌糖原缺乏；存活的GYS1小鼠具有肌肉缺陷。可能的诊断包括家族病史；基因测试；或早期症状。可以使用的生物标志物包括例如CSF mRNA及蛋白质。
在一些实施例中，本发明提供了靶向疾病基因的双链iRNA剂，这些疾病包括但不限于年龄相关性黄斑变性(AMD)(干性及湿性)、鸟枪弹样脉络膜视网膜病变、显性色素性视网膜炎4、富克氏营养不良(Fuch’s dystrophy)、hATTR淀粉样变性、遗传性及偶发性青光眼以及斯特格特氏病(stargardt’s disease)。
在一些实施例中，本发明提供了靶向湿性(或渗出性)AMD的VEGF的双链iRNA剂。
在一些实施例中，本发明提供了靶向干性(或非渗出性)AMD的C3的双链iRNA剂。
在一些实施例中，本发明提供了靶向干性(或非渗出性)AMD的CFB的双链iRNA剂。
在一些实施例中，本发明提供了靶向青光眼的MYOC的双链iRNA剂。
在一些实施例中，本发明提供了靶向青光眼的ROCK2的双链iRNA剂。
在一些实施例中，本发明提供了靶向青光眼的ADRB2的双链iRNA剂。
在一些实施例中，本发明提供了靶向青光眼的CA2的双链iRNA剂。
在一些实施例中，本发明提供了靶向白内障的CRYGC的双链iRNA剂。
在一些实施例中，本发明提供了靶向干眼综合征的PPP3CB的双链iRNA剂。
配体
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂通过共价附接一个或多个缀合物基团来进一步修饰。一般而言，缀合物基团调节所附接的本发明的双链iRNA剂的一个或多个特性，包括但不限于药效学、药代动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷及清除。缀合物基团通常用于化学技术，并且直接或经由任选的连接部分或连接基团连接至母体化合物，诸如寡聚化合物。缀合物基团的优选的清单包括但不限于嵌入剂、报导分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、硫代胆固醇、胆酸部分、叶酸、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷、吖啶、荧光素、若丹明、香豆素及染料。
在一些实施例中，双链iRNA剂进一步包含靶向配体，该靶向配体靶向介导递送至特定CNS组织的受体。这些靶向配体可以与亲脂性部分组合缀合，以实现特异性鞘内及全身递送。
靶向介导递送至CNS组织的受体的示例性靶向配体为肽配体，诸如血管肽-2、脂蛋白受体相关蛋白(LRP)配体、bEnd.3细胞结合配体；运铁蛋白受体(TfR)配体(其可利用脑中的铁转运系统且负荷转运至脑实质中)；甘露糖受体配体(其靶向嗅鞘细胞、胶细胞)、葡萄糖转运蛋白及LDL受体配体。
在一些实施例中，双链iRNA剂进一步包含靶向配体，其靶向介导递送至特定眼组织的受体。这些靶向配体可以与亲脂性部分组合缀合，以实现特异性玻璃体内及全身递送。靶向介导递送至眼组织的受体的示例性靶向配体为亲脂性配体，诸如全反式视黄醇(其靶向视黄酸受体)；RGD肽(其靶向视网膜色素上皮细胞)，诸如H-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-Cys-OH或Cyclo(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys；LDL受体配体；和基于碳水化合物的配体(其靶向后眼中的内皮细胞)。
适用于本发明的优选的缀合物基团包括脂质部分，诸如胆固醇部分(Letsinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],1989,86,6553)；胆酸(Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机与药物化学快报],1994,4,1053)；硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年报],1992,660,306；Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Let.[生物有机化学与药物化学通讯],1993,3,2765)；硫代胆固醇(Oberhauser等人,Nucl.Acids Res.[核酸研究],1992,20,533)；脂肪族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志],1991,10,111；Kabanov等人,FEBS Lett.[欧洲生化学会联盟通讯],1990,259,327；Svinarchuk等人,Biochimie[生物化学],1993,75,49)；磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙铵-1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油基-3-H-膦酸酯(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.[四面体通讯],1995,36,3651；Shea等人,Nucl.Acids Res.[核酸研究],1990,18,3777)；聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,Nucleosides&Nucleotides[核苷与核苷酸],1995,14,969)；金刚烷乙酸(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.[四面体通讯],1995,36,3651)；棕榈基部分(Mishra等人,Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学学报],1995,1264,229)；或十八基胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分(Crooke等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.[药理学与实验疗法杂志],1996,277,923)。
一般而言，广泛多种实体(例如配体)可以与本文所述的寡聚化合物偶联。配体可以包括天然存在的分子，或重组或合成分子。示例性配体包括但不限于聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG，例如PEG-2K、PEG-5K、PEG-10K、PEG-12K、PEG-15K、PEG-20K、PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物、聚磷嗪、聚乙烯亚胺、阳离子基团、精胺、亚精胺、聚胺、伪肽-聚胺、肽模拟物聚胺、树枝状聚合物聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐、促甲状腺激素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白、糖基化聚氨基酸、运铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸盐、聚天冬氨酸、适体、去唾液酸胎球蛋白、透明质酸、前胶原、免疫球蛋白(例如抗体)、胰岛素、运铁蛋白、白蛋白、糖-白蛋白缀合物、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(例如TPPC4、德卟啉(texaphyrin)、赛卟啉(Sapphyrin))、多环芳烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如EDTA)、亲脂性分子(例如类固醇、胆汁酸、胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-邻(十六烷基)甘油、香叶氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、肽(例如α螺旋肽、两亲性肽、RGD肽、细胞渗透肽、内体裂解/膜融合肽)、烷基化剂、磷酸酯、氨基、巯基、聚氨基、烷基、经取代的烷基、放射性标记的标志物、酶、半抗原(例如生物素)、转运/吸收促进剂(例如萘普生、阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如咪唑、双咪唑、组织胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+复合物)、二硝基苯基、HRP、AP、抗体、激素及激素受体、凝集素、碳水化合物、多价碳水化合物、维生素(例如维生素A、维生素E、维生素K、维生素B，例如叶酸、B12、核黄素、生物素及吡哆醛)、维生素辅因子、脂多醣、p38 MAP激酶的活化因子、NF-κB的活化因子、塔克酮(taxon)、长春新碱、长春花碱、细胞松弛素、诺考达唑(nocodazole)、杰普肯立德(japlakinolide)、拉春库林A(latrunculin A)、鬼笔环肽(phalloidin)、斯文霍立德A(swinholide A)、引达喏新(indanocine)、美瑟文(myoservin)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-1β、γ干扰素、天然或重组低密度脂蛋白(LDL)、天然或重组高密度脂蛋白(HDL)及细胞渗透剂(例如螺旋细胞渗透剂)。
肽及肽模拟物配体包括具有天然存在或经修饰的肽的配体，例如D或L肽；α、β或γ肽；N-甲基肽；氮杂肽；具有一个或多个酰胺的肽，即键经一个或多个脲、硫脲、氨基甲酸酯或磺酰脲键替换的肽；或环肽。肽模拟物(在本文中也称为寡肽模拟物)为能够折叠成与天然肽类似的确定三维结构的分子。肽或肽模拟物配体可以是约5-50个氨基酸长，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
示例性两亲性肽包括但不限于天蚕抗菌肽(cecropin)、洛克托辛(lycotoxin)、帕拉达辛(paradaxin)、蟾蜍苷元(buforin)、CPF、铃蟾抗菌肽样肽(bombinin-like peptide，BLP)、抗菌肽(cathelicidin)、克拉托辛(ceratotoxin)、柄海鞘(S.clava)肽、八目鳗肠道抗微生物肽(hagfish intestinal antimicrobial peptide，HFIAP)、爪蟾抗菌肽(magainine)、林蛙抗菌肽-2(brevinin-2)、德玛普汀(dermaseptin)、蜂毒肽(melittin)、普洛西汀(pleurocidin)、H2A肽、非洲爪蟾(Xenopus)肽、艾库尼丝-1(esculentini-1)及卡厄林(caerin)。
如本文所用，术语“内体裂解配体”是指具有内体裂解特性的分子。内体裂解配体促进本发明的组合物或其组分的溶解和/或自细胞内的细胞区室，诸如内体、溶酶体、内质网(ER)、高尔基体、微管、过氧化体或其他囊泡体转运至细胞的细胞质。一些示例性内体裂解配体包括但不限于咪唑、聚咪唑或寡聚咪唑、直链或支链聚乙烯亚胺(PEI)、直链及支链聚胺(例如精胺、阳离子直链及支链聚胺)、聚羧酸酯、聚阳离子、经掩蔽的寡聚或聚阳离子或阴离子、缩醛、聚缩醛、缩酮/聚缩酮、原酸酯、具有经掩蔽或未掩蔽的阳离子或阴离子电荷的直链或支链聚合物、具有经掩蔽或未掩蔽的阳离子或阴离子电荷的树枝状聚合物、聚阴离子肽、聚阴离子肽模拟物、pH敏感肽、天然及合成膜融合脂质、天然及合成阳离子脂质。
示例性内体裂解/膜融合肽包括但不限于AALEALAEALEALAEALEALAEAAAAGGC(GALA)；AALAEALAEALAEALAEALAEALAAAAGGC(EALA)；ALEALAEALEALAEA；GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYG(INF-7)；GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG(Inf HA-2)；GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGCGLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC(diINF-7)；GLFEAIEGFIENGWEGMIDGGCGLFEAIEGFIENGWEGMIDGGC(diINF-3)；GLFGALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAAGGSC(GLF)；GLFEAIEGFIENGWEGLAEALAEALEALAAGGSC(GALA-INF3)；GLF EAI EGFI ENGW EGnI DG K GLF EAI EGFIENGW EGnI DG(INF-5，n为正亮氨酸)；LFEALLELLESLWELLLEA(JTS-1)；GLFKALLKLLKSLWKLLLKA(ppTG1)；GLFRALLRLLRSLWRLLLRA(ppTG20)；WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(KALA)；GLFFEAIAEFIEGGWEGLIEGC(HA)；GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(蜂毒肽)；H5WYG；及CHK6HC。
不希望受理论所束缚，膜融合脂质与膜融合且因此使膜不稳定。膜融合脂质通常具有小的头部基团及不饱和酰基链。示例性膜融合脂质包括但不限于1,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-醇(Di-Lin)、N-甲基(2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)-1,3-二氧戊环-4-基)甲胺(DLin-k-DMA)及N-甲基-2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)-1,3-二氧戊环-4-基)乙胺(在本文中也称为XTC)。
适用于本发明的具有内体裂解活性的合成聚合物描述于美国专利申请公开号2009/0048410；2009/0023890；2008/0287630；2008/0287628；2008/0281044；2008/0281041；2008/0269450；2007/0105804；20070036865；及2004/0198687中，将其内容特此以全文引用的方式并入。
示例性细胞渗透肽包括但不限于RQIKIWFQNRRMKWKK(穿膜肽)；GRKKRRQRRRPPQC(Tat片段48-60)；GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV(基于信号序列的肽)；LLIILRRRIRKQAHAHSK(PVEC)；GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL(转运肽)；KLALKLALKALKAALKLA(两亲性模型肽)；RRRRRRRRR(Arg9)；KFFKFFKFFK(细菌细胞壁渗透肽)；LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES(LL-37)；SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR(杀菌肽P1)；ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC(α-防御素)；DHYNCVSSGGQCLYSACPIFTKIQGTCYRGKAKCCK(β-防御素)；RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFPGKR-NH2(PR-39)；ILPWKWPWWPWRR-NH2(肽抗生素)；AAVALLPAVLLALLAP(RFGF)；AALLPVLLAAP(RFGF类似物)；及RKCRIVVIRVCR(牛抗菌肽)。
示例性阳离子基团包括但不限于质子化氨基，其衍生自例如O-胺(胺＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基)；氨基烷氧基，例如O(CH2)n胺(例如胺＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基)；氨基(例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；及NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-胺(胺＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基)。
如本文所用，术语“靶向配体”是指对所选靶标提供增强的亲和力的任何分子，所选靶标例如细胞、细胞类型、组织、器官、身体区域或区室，例如细胞、组织或器官区室。一些示例性靶向配体包括但不限于抗体、抗原、叶酸、受体配体、碳水化合物、适体、整合素受体配体、趋化因子受体配体、运铁蛋白、生物素、血清素受体配体、PSMA、内皮素、GCPII、生长抑素、LDL及HDL配体。
基于碳水化合物的靶向配体包括但不限于D-半乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)、多价GalNAc，例如GalNAc2及GalNAc3(GalNAc及多价GalNAc在本文中统称为GalNAc缀合物)；D-甘露糖、多价甘露糖、多价乳糖、N-乙酰基-葡糖胺、葡萄糖、多价葡萄糖、多价海藻糖、经糖基化的聚氨基酸及凝集素。术语多价指示存在多于一个单糖单元。此类单糖亚单元可通过糖苷键彼此连接或连接至骨架分子。
作为配体适用于本发明的许多叶酸及叶酸类似物描述于美国专利号2,816,110；5,552,545；6,335,434及7,128,893中，将其内容通过引用以其全文并入本文。
如本文所用，术语“PK调节配体”及“PK调节剂”是指可调节本发明组合物的药代动力学的分子。一些示例性PK调节剂包括但不限于亲脂性分子、胆汁酸、固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、维生素、脂肪酸、吩噁嗪、阿司匹林、萘普生、布洛芬、舒洛芬、酮洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、PEG、生物素及甲状腺素转运蛋白结合配体(例如四碘甲状腺乙酸、2,4,6-三碘苯酚及氟芬那酸)。也已知包含多个硫代磷酸酯糖间键的寡聚化合物与血清蛋白结合，因此短寡聚化合物，例如包含约5至30个核苷酸(例如，5至25个核苷酸，优选地5至20个核苷酸，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸)并且在主链中包含多个硫代磷酸酯键的寡核苷酸也作为配体(例如作为PK调节配体)适用于本发明。PK调节寡核苷酸可包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯键。在一些实施例中，PK调节寡核苷酸中的所有核苷酸间键为硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯键。另外，结合血清组分(例如血清蛋白)的适体也作为PK调节配体适用于本发明。可以从白蛋白结合测定预测与血清组分(例如血清蛋白)的结合，诸如Oravcova等人,Journal of Chromatography B[药物与生物医学分析杂志](1996),677:1-27中所述的测定。
当存在两个或更多个配体时，配体可皆具有相同特性，皆具有不同特性，或一些配体具有相同特性而其他配体具有不同特性。例如，配体可具有靶向特性，具有内体裂解活性或具有PK调节特性。在优选的实施例中，所有配体皆具有不同特性。
当单体并入本发明的双链iRNA剂的组分(例如本发明的双链iRNA剂或接头)中时，配体或系链配体可存在于所述单体上。在一些实施例中，在“前体”单体已并入本发明的双链iRNA剂的组分(例如本发明的双链iRNA剂或接头)中后，配体可经由偶联并入所述“前体”单体。例如，具有例如氨基封端的系链(即，无相关配体)的单体，例如单体-接头-NH2可并入本发明化合物的组分(例如本发明的双链iRNA剂或接头)中。在后续操作中，即在前体单体并入本发明化合物的组分(例如本发明的双链iRNA剂或接头)之后，具有亲电子基团的配体，例如五氟苯基酯或醛基，可随后通过将配体的亲电子基团与前体单体的系链的末端亲核基团偶联而附接至前体单体。
在另一个实例中，可并入具有适于参与点击化学反应的化学基团的单体，例如叠氮基或炔烃封端的系链/接头。在后续操作中，即在将前体单体并入链中之后，可通过将炔烃及叠氮基偶联在一起而将具有互补化学基团(例如炔烃或叠氮基)的配体附接至前体单体。
在一些实施例中，配体可以与本发明的双链iRNA剂的核碱基、糖部分或核苷间键缀合。与嘌呤核碱基或其衍生物的缀合可发生在包括内环及环外原子的任何位置。在一些实施例中，嘌呤核碱基的2-、6-、7-或8-位置附接至缀合物部分。与嘧啶核碱基或其衍生物的缀合也可发生在任何位置。在一些实施例中，嘧啶核碱基的2-、5-及6-位置可经缀合物部分取代。当配体与核碱基缀合时，优选的位置为不干扰杂交，即不干扰碱基配对所需的氢键相互作用的位置。
与核苷的糖部分的缀合可发生在任何碳原子处。可以附接至缀合物部分的糖部分的例示性碳原子包括2’、3’及5’碳原子。1’位置也可附接至缀合物部分，诸如在无碱基残基中。核苷间键也可带有缀合物部分。对于含磷键(例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、硫代磷酸二酯、磷酰氨酸及其类似物)，缀合物部分可直接附接至磷原子或与磷原子键连的O、N或S原子。对于含有胺或酰胺的核苷间键(例如PNA)，缀合物部分可以附接至胺或酰胺的氮原子或相邻碳原子。
存在许多制备寡核苷酸缀合物的方法。一般而言，通过使寡核苷酸上的反应性基团(例如OH、SH、胺、羧基、醛及其类似基团)与缀合物部分上的反应性基团接触而将寡核苷酸附接至缀合物部分。在一些实施例中，一个反应性基团为亲电子的且其他为亲核的。
例如，亲电子基团可以是含羰基的官能团且亲核基团可以是胺或硫醇。在存在及不存在连接基团的情况下用于缀合核酸及相关寡聚化合物的方法充分描述于文献中，诸如Manoharan，在Antisense Research and Applications[反义研究和应用]中,Crooke及LeBleu编,CRC Press[CRC出版社],Boca Raton,Fla.[佛罗里达州博卡拉顿],1993,第17章，将其通过引用以其全文并入本文。
配体可经由接头或载体单体(例如配体载体)附接至本发明的双链iRNA剂。载体包括(i)至少一个“主链附接点”，优选地两个“主链附接点”及(ii)至少一个“系链附接点”。如本文所用，“主链附接点”是指可用于且适用于将载体单体并入主链(例如寡核苷酸的磷酸酯或经修饰的磷酸酯，例如含硫主链)的官能团，例如羟基，或通常是键。“系链附接点”(TAP)是指连接选定部分的载体单体的原子，例如碳原子或杂原子(不同于提供主链附接点的原子)。选定部分可以是例如碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖、寡醣及多醣。任选地，选定部分通过插入的系链连接至载体单体。因此，载体将通常包括官能团，例如氨基，或通常提供键，其适于将另一种化学实体(例如配体)并入或系栓至组成原子。
教示核酸缀合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,149,782；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599；923；5,599,928；5,672,662；5,688,941；5,714,166；6,153,737；6,172,208；6,300,319；6,335,434；6,335,437；6,395,437；6,444,806；6,486,308；6,525,031；6,528,631；6,559,279；将其内容通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，双链iRNA剂进一步包含靶向肝组织的靶向配体。在一些实施例中，靶向配体为基于碳水化合物的配体。在一个实施例中，靶向配体为GalNAc缀合物。
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂进一步包含具有如下所示的结构的配体：
Figure BDA0002885421910001501
其中：
LG在每次出现时独立地是配体，例如碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖、多醣；并且
Z’、Z”、Z’”及Z””在每次出现时各自独立地是O或S。
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含式(II)、(III)、(IV)或(V)的配体：
Figure BDA0002885421910001502
其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B及q5C在每次出现时独立地表示0-20且其中重复单元可相同或不同；
Q及Q’在每次出现时独立地是不存在、-(P7-Q7-R7)p-T7-或-T7-Q7-T7’-B-T8’-Q8-T8；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、P7、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C、T7、T7’、T8及T8’在每次出现时各自独立地是不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
B为-CH2-N(BL)-CH2-；
BL是-TB-QB-TB’-Rx；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C、Q7、Q8及QB在每次出现时独立地是不存在、亚烷基、经取代的亚烷基，并且其中一个或多个亚甲基可以被O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)＝C(R’)、C≡C或C(O)中的一个或多个间隔或由其封端；
TB及TB’在每次出现时各自独立地是不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、OC(O)O、NHC(O)、NHC(O)NH、NHC(O)O、CH2、CH2NH或CH2O；
Rx为亲脂体(例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、维生素(例如，叶酸、维生素A、维生素E、生物素、吡哆醛)、肽、碳水化合物(例如，单糖、二糖、三糖、四糖、寡醣、多醣)、内体裂解组分、类固醇(例如，熊果醇、海柯皂苷元(hecigenin)、薯蓣皂苷配基(diosgenin))、萜烯(例如三萜，例如萨洒皂苷配基(sarsasapogenin)、无羁萜(Friedelin)、表无羁萜醇(epifriedelanol)衍生的石胆酸)或阳离子脂质；
R1、R2、R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C、R7在每次出现时各自独立地是不存在的、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH＝N-O、
Figure BDA0002885421910001521
Figure BDA0002885421910001522
或杂环基；
L1、L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B及L5C在每次出现时各自独立地是碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖、寡醣及多醣；
R’及R”各自独立地是H、C1-C6烷基、OH、SH或N(RN)2；
RN在每次出现时独立地是H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基或苄基；
Ra为H或氨基酸侧链；
Z’、Z”、Z’”及Z””在每次出现时各自独立地是O或S；
p在每次出现时独立地表示0-20。
如上文所论述，因为配体可经由接头或载体与iRNA剂缀合，并且因为接头或载体可含有支链接头，所以iRNA剂可随后经由载体的相同或不同主链附接点，或经由支链接头含有多个配体。举例而言，支链接头的分支点可以是二价、三价、四价、五价或六价原子，或呈现此类多价的基团。在某些实施例中，分支点为-N、-N(Q)-C、-O-C、-S-C、-SS-C、-C(O)N(Q)-C、-OC(O)N(Q)-C、-N(Q)C(O)-C或-N(Q)C(O)O-C；其中Q在每次出现时独立地是H或任选地经取代的烷基。在其他实施例中分支点为甘油或甘油衍生物。
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001523
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001531
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001532
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001533
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001534
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001535
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001536
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001541
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001542
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001543
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001544
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001551
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001552
示例性配体单体
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001553
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001554
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001561
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001562
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001563
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001564
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001565
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001566
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001571
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001572
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001573
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001574
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001575
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001576
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001577
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001581
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001582
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001583
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001584
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001585
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001586
在一些实施例中，L2A及L2B是不同的。
在一些优选的实施例中，L3A及L3B是相同的。
在一些实施例中，L3A及L3B是不同的。
在一些优选的实施例中，L4A及L4B是相同的。
在一些实施例中，L4A及L4B是不同的。
在一些优选的实施例中，L5A、L5B及L5C的全部都是相同的。
在一些实施例中，L5A、L5B及L5C中的两个是相同的。
在一些实施例中，L5A及L5B是相同的。
在一些实施例中，L5A及L5C是相同的。
在一些实施例中，L5B及L5C是相同的。
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001591
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001592
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001593
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001594
其中Y为O或S，并且n为1-6。
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001601
其中Y为O或S，n为1-6，R为氢或核酸，并且R’为核酸。
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001602
其中Y为O或S，并且n为1-6。
在某些实施例中，本文所述的寡聚化合物(包括但不限于本发明的双链iRNA剂)包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001603
其中Y为O或S，n为2-6，x为1-6，并且A为H或磷酸酯键。
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的至少1、2、3或4个单体：
Figure BDA0002885421910001604
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001611
其中X为O或S。
在某些实施例中，本文所述的寡聚化合物(包括但不限于本发明的双链iRNA剂)包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001612
其中x为1-12。
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001613
其中R为OH或NHCOCH3。
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001614
其中R为OH或NHCOCH3。
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001621
其中R为O或S。
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001622
其中R为OH或NHCOCH3。
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001623
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001624
其中R为OH或NHCOCH3。
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001625
其中R为OH或NHCOCH3。
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001631
其中R为OH或NHCOCH3。
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001632
其中R为OH或NHCOCH3。
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001633
在上述单体中，X及Y在每次出现时各自独立地是H、保护基、磷酸酯、磷酸二酯基、活化的磷酸酯、活化的亚磷酸酯、亚磷酰胺、固体支撑物、-P(Z’)(Z”)O-核苷、-P(Z’)(Z”)O-寡核苷酸、脂质、PEG、类固醇、聚合物、核苷酸、核苷或寡核苷酸；并且Z’及Z”在每次出现时各自独立地是O或S。
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂与以下结构的配体缀合：
Figure BDA0002885421910001634
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的配体：
Figure BDA0002885421910001641
在某些实施例中，本发明的双链iRNA剂包含以下结构的单体：
Figure BDA0002885421910001642
上述配体及单体的合成描述于例如美国专利号8,106,022中，将其内容通过引用以其全文并入本文。
候选iRNA的评估
我们可通过将试剂或经修饰的分子及对照分子暴露于适当条件且评估所选特性的存在来针对所选特性评估候选iRNA剂，例如经修饰的RNA。例如，可如下评估对降解剂的抗性。候选经修饰的RNA(及对照分子，通常为未修饰的形式)可暴露于降解条件，例如暴露于包括降解剂(例如核酸酶)的环境。例如，我们可使用生物样品，例如与治疗用途可能遇到的环境类似的生物样品，例如血液或细胞部分，例如无细胞匀浆或破碎的细胞。随后可通过多种方法中的任一个来评估候选物及对照物对降解的抗性。例如，候选物及对照物可在暴露之前，用例如放射性或酶标记物或荧光标记物(诸如Cy3或Cy5)来标记。对照及经修饰的RNA可以与降解剂及任选的对照(例如不活化，例如加热不活化)降解剂一起孵育。随后测定经修饰的分子及对照分子的物理参数，例如大小。其可通过物理方法来测定，例如通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或分级柱，以评定分子是否保持其原始长度，或在功能上评定。可替代地，可使用RNA印迹测定来测定未标记的经修饰的分子的长度。
功能测定也可用于评估候选试剂。功能测定可在最初或在较早的非功能性测定(例如，对降解的抗性的测定)之后应用，以确定修饰是否改变分子使基因表达沉默的能力。例如，细胞(例如哺乳动物细胞，诸如小鼠或人类细胞)可以与表达荧光蛋白(例如GFP)的质粒及与编码荧光蛋白的转录物同源的候选RNA剂共转染(参见例如WO 00/44914)。例如，与转染不包括候选dsiRNA的对照细胞(例如，未添加试剂的对照和/或添加未修饰的RNA的对照)相比，可通过监测细胞荧光的降低来测定与GFP mRNA同源的经修饰的dsiRNA抑制GFP表达的能力。可通过在经修饰及未修饰的dssiRNA化合物存在下比较细胞荧光来评定候选试剂对基因表达的功效。
在另一功能测定中，与内源性小鼠基因(例如母系表达的基因，诸如c-mos)同源的候选dssiRNA化合物可注射至未成熟的小鼠卵母细胞中，以评定试剂在体内抑制基因表达的能力(参见例如WO 01/36646)。可监测卵母细胞的表型(例如在中期II维持停滞的能力)作为该试剂抑制表达的指标。例如，通过dssiRNA化合物裂解c-mos mRNA将导致卵母细胞退出中期停滞且引发单性发育(Colledge等人Nature[自然]370:65-68,1994；Hashimoto等人Nature[自然],370:68-71,1994)。与阴性对照相比，经修饰的试剂对靶RNA水平的影响可通过RNA印迹测定靶mRNA的水平降低，或通过蛋白质印迹测定靶蛋白的水平降低来验证。对照可以包括其中未添加试剂的细胞和/或其中添加未修饰的RNA的细胞。
生理效应
本文所述的siRNA化合物可经设计以使得更容易通过siRNA与人类及非人类动物序列的互补性来确定治疗毒性。通过这些方法，siRNA可由与来自人类的核酸序列及来自至少一种非人类动物(例如，非人类哺乳动物，诸如啮齿动物、反刍动物或灵长类动物)的核酸序列完全互补的序列组成。例如，非人类哺乳动物可以是小鼠、大鼠、狗、猪、山羊、绵羊、牛、猴、倭黑猩猩、黑猩猩、恒河猴或食蟹猴。siRNA化合物的序列可以与非人类哺乳动物及人类的同源基因(例如致癌基因或肿瘤抑制基因)内的序列互补。通过确定siRNA化合物在非人类哺乳动物中的毒性，我们可以推断siRNA化合物在人类中的毒性。对于更繁重的毒性测试，siRNA可以与人类及多于一种(例如两种或三种或更多种)非人类动物互补。
本文所述的方法可用于关联siRNA化合物对人类的任何生理效应，例如任何不需要的效应，诸如毒性效应，或任何阳性或所需效应。
增加siRNA的细胞摄取
本文描述各种siRNA组合物，其含有共价附接的增加siRNA的细胞摄取和/或细胞内靶向的缀合物。
另外提供了本发明的方法，其包括施用siRNA化合物及影响siRNA摄入细胞的药物。可以在施用siRNA化合物之前、之后或同时施用药物。药物可以与siRNA化合物共价或非共价连接。药物可以是例如脂多醣、p38 MAP激酶的活化剂或NF-κB的活化剂。药物可对细胞具有短暂影响。药物可例如通过破坏细胞的细胞骨架，例如通过破坏细胞的微管、微丝和/或中间丝来增加siRNA化合物摄入细胞。药物可以是例如塔克酮、长春新碱、长春花碱、细胞松弛素、诺考达唑、杰普肯立德、拉春库林A、鬼笔环肽、斯文霍立德A、引达喏新或美瑟文。药物也可通过例如活化发炎反应来增加siRNA化合物摄入给定细胞或组织。具有此类效应的示例性药物包括肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-1β、CpG基序、γ干扰素或更通常为活化toll样受体的药剂。
siRNA产生
siRNA可例如通过多种方法大量产生。示例性方法包括：有机合成及RNA裂解，例如体外裂解。
有机合成。siRNA可通过分别合成单链RNA分子或双链RNA分子的各个链来制备，之后再对组成链进行退火。
大型生物反应器，例如来自药物生物技术公司(Pharmacia Biotec AB)(瑞典乌普萨拉(Uppsala Sweden))的OligoPilot II，可用于产生给定siRNA的大量特定RNA链。OligoPilotII反应器可仅使用1.5莫耳过量的亚磷酰胺核苷酸有效偶联核苷酸。为了制造RNA链，使用核糖核苷酸胺基酸酯。单体添加的标准循环可用于合成siRNA的21至23个核苷酸链。通常，两个互补链分开制备且随后退火，例如在自固体支撑物释放及去保护之后。
有机合成可用于产生离散的siRNA物种。可精确指定物种与特定靶基因的互补性。例如，物种可以与包括多态性(例如单核苷酸多态性)的区域互补。另外，可精确确定多态性的位置。在一些实施例中，多态性位于内部区域，例如来自一个或两个末端的至少4、5、7或9个核苷酸。
dsiRNA裂解。siRNA也可通过裂解较大siRNA来制备。可体外或在体内介导裂解。例如，为了通过体外裂解产生iRNA，可使用以下方法：
体外转录。dsiRNA是通过在两个方向上转录核酸(DNA)区段产生的。例如，HiScribeTM RNAi转录试剂盒(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)提供了用于产生核酸区段的dsiRNA的载体及方法，该核酸区段在任一侧与T7启动子侧接的位置处克隆至载体中。为dsiRNA的两条互补链的T7转录产生单独的模板。通过添加T7 RNA聚合酶体外转录模板且产生dsiRNA。使用PCR和/或其他RNA聚合酶(例如T3或SP6聚合酶)的类似方法也可以是可能污染重组酶制剂的毒素。
体外裂解。在一个实施例中，通过此方法产生的RNA经仔细纯化以移除末端siRNA，其例如使用Dicer或类似的基于RNA酶III的活性体外裂解成siRNA。例如，dsiRNA可在来自果蝇的体外提取物中或使用经纯化的组分(例如经纯化的RNA酶或RISC复合物(RNA诱导沉默复合物))来孵育。参见例如Ketting等人Genes Dev[基因与发育]2001年10月15日；15(20):2654-9.及Hammond Science[科学]2001年8月10日；293(5532):1146-50。
dsiRNA裂解一般产生多个siRNA物种，每个是源dsiRNA分子的特定21至23nt片段。例如，可存在包括与源dsiRNA分子的重叠区域及相邻区域互补的序列的siRNA。
无论合成方法如何，siRNA制剂可在适于配制品的溶液(例如水溶液和/或有机溶液)中制备。例如，siRNA制剂可沉淀且再溶解于双蒸溜水中，并且冻干。干燥的siRNA可随后再悬浮于适合于预期配制方法的溶液中。
制造与亲脂性部分缀合的双链iRNA剂
在一些实施例中，亲脂性部分经由核碱基、糖部分或核苷间键与双链iRNA剂缀合。
与嘌呤核碱基或其衍生物的缀合可发生在包括内环及环外原子的任何位置。在一些实施例中，嘌呤核碱基的2-、6-、7-或8-位置附接至缀合物部分。与嘧啶核碱基或其衍生物的缀合也可发生在任何位置。在一些实施例中，嘧啶核碱基的2-、5-及6-位置可经缀合物部分取代。当亲脂性部分与核碱基缀合时，优选的位置为不干扰杂交(即不干扰碱基配对所需的氢键相互作用)的位置。在一个实施例中，亲脂性部分可经由含有烷基、烯基或酰胺键的接头与核碱基缀合。亲脂性部分与核碱基的示例性缀合示于图1及实例7中。
与核苷的糖部分的缀合可发生在任何碳原子处。亲脂性部分可以附接的糖部分的示例性碳原子包括2’、3’及5’碳原子。亲脂性部分也可以附接至1’位置，诸如在无碱基残基中。在一个实施例中，亲脂性部分可在存在或不存在接头的情况下经由2’-O修饰与糖部分缀合。亲脂性部分与糖部分的示例性缀合(经由2’-O修饰)示于图1及实例1、2、3及6中。
核苷间键也可带有亲脂性部分。对于含磷键(例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、硫代磷酸二酯、磷酰氨酸及其类似物)，亲脂性部分可直接附接至磷原子或与磷原子键连的O、N或S原子。对于含有胺或酰胺的核苷间键(例如PNA)，亲脂性部分可以附接至胺或酰胺的氮原子或相邻碳原子。
存在许多制备寡核苷酸缀合物的方法。一般而言，通过使寡核苷酸上的反应性基团(例如OH、SH、胺、羧基、醛及其类似基团)与缀合物部分上的反应性基团接触而将寡核苷酸附接至缀合物部分。在一些实施例中，一个反应性基团为亲电子的且其他为亲核的。
例如，亲电子基团可以是含羰基的官能团且亲核基团可以是胺或硫醇。在存在及不存在连接基团的情况下用于缀合核酸及相关寡聚化合物的方法充分描述于文献中，诸如Manoharan，在Antisense Research and Applications[反义研究和应用]中,Crooke及LeBleu编,CRC Press[CRC出版社],Boca Raton,Fla.[佛罗里达州博卡拉顿],1993,第17章，将其通过引用以其全文并入本文。
在一个实施例中，可分别合成第一(互补)RNA链及第二(有义)RNA链，其中RNA链中的一个包含侧接亲脂性部分，并且第一及第二RNA链可以混合形成dsRNA。合成RNA链的步骤优选地涉及固相合成，其中各个核苷酸通过在连续合成循环中形成核苷酸间3′-5′磷酸二酯键而端与端相接。
在一个实施例中，具有亚磷酰胺基团的亲脂性分子在最后的合成循环中与第一(互补)或第二(有义)RNA链的3’端或5’端偶联。在RNA的固相合成中，核苷酸最初为核苷亚磷酰胺的形式。在每个合成循环中，另一个核苷亚磷酰胺与先前并入的核苷酸的-OH基团连接。如果亲脂性分子具有亚磷酰胺基团，则其可以类似于核苷亚磷酰胺的方式与先前在固相合成中合成的RNA的游离OH末端偶联。合成可使用常规的RNA合成仪以自动化及标准化方式进行。具有亚磷酰胺基团的亲脂性分子的合成可以包括游离羟基的亚磷酰化以产生亚磷酰胺基团。
亲脂性部分缀合的亚磷酰胺的合成方法例示于实例1、2、4、5、6及7中。在实例3中说明了亲脂性部分或其他配体的合成后缀合(post-synthesis conjugation)方法的实例。
一般而言，寡核苷酸可使用本领域已知的方案合成，例如，如Caruthers等人,Methods in Enzymology[酶学方法](1992)211:3-19；WO 99/54459；Wincott等人,Nucl.Acids Res.[核酸研究](1995)23:2677-2684；Wincott等人,Methods Mol.Bio.[分子生物学方法],(1997)74:59；Brennan等人,Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程](1998)61:33-45；以及美国专利号6,001,311中所述；将其各自通过引用以其全文并入本文。一般而言，寡核苷酸的合成涉及常规的核酸保护及偶联基团，诸如5′端处的二甲氧基三苯甲基及3′端处的亚磷酰胺。在一非限制性实例中，使用由奥德里奇化学基因公司(ChemGenes Corporation)(亚什兰马萨诸塞州(Ashland,Mass.))销售的核苷亚磷酰胺，在由应用生物系统公司(Applied Biosystems,Inc.)(德国威特史丹特(Weiterstadt,Germany))销售的Expedite 8909RNA合成仪上进行小规模合成。可替代地，合成可在96孔盘合成仪，诸如由Protogene公司(加利福尼亚帕洛阿尔托(Palo Alto,Calif.))生产的仪器上，或通过诸如Usman等人,J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志](1987)109:7845；Scaringe等人,Nucl.Acids Res.[核酸研究](1990)18:5433；Wincott等人,Nucl.Acids Res.[核酸研究](1990)23:2677-2684；及Wincott等人,Methods Mol.Bio.[分子生物学方法](1997)74:59中所述的方法来进行，将其各自通过引用以其全文并入本文。
本发明的核酸分子可单独合成并且在合成后相接在一起，例如在合成和/或去保护后通过连接(Moore等人,Science[科学](1992)256:9923；WO 93/23569；Shabarova等人,Nucl.Acids Res.[核酸研究](1991)19:4247；Bellon等人,Nucleosides&Nucleotides[核苷与核苷酸](1997)16:951；Bellon等人,Bioconjugate Chem.[生物缀合化学](1997)8:204；或通过杂交。核酸分子可通过使用常规方法的凝胶电泳纯化，或可通过高压液相纯化(HPLC；参见Wincott等人，见上文，将其全部以引用的方式并入本文中)纯化且再悬浮于水中。
药物组合物
在一个方面中，本发明的特征在于药物组合物，其包括siRNA化合物，例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前体，例如可加工成ssiRNA化合物的较大siRNA化合物，或编码siRNA化合物(例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前体)的DNA)，该化合物包括与靶RNA互补(例如基本上和/或精确互补)的核苷酸序列。靶RNA可以是内源性人类基因的转录物。在一个实施例中，siRNA化合物(a)为19-25个核苷酸长，例如21-23个核苷酸，(b)与内源性靶RNA互补，并且任选地，(c)包括至少一个1-5nt长的3’突出端。在一个实施例中，药物组合物可以是乳液、微乳液、乳膏、胶冻或脂质体。
在一个实例中，药物组合物包括与局部递送剂混合的siRNA化合物。局部递送剂可以是多个微观囊泡。微观囊泡可以是脂质体。在一些实施例中，脂质体为阳离子脂质体。
在另一个方面中，药物组合物包括siRNA化合物，例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前体，例如可加工成ssiRNA化合物的较大siRNA化合物，或编码siRNA化合物(例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前体)的DNA)与局部渗透增强剂混合。在一个实施例中，局部渗透增强剂为脂肪酸。脂肪酸可以是花生四烯酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱、或C1-10烷基酯、单甘油酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。
在另一个实施例中，局部渗透增强剂为胆汁盐。胆汁盐可以是胆酸、脱氢胆酸、去氧胆酸、谷氨胆酸、甘氨胆酸、甘氨去氧胆酸、牛胆酸、牛去氧胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、牛磺酸-24,25-二氢-夫西地酸钠、二醇二氢夫西地酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚或其药学上可接受的盐。
在另一个实施例中，渗透增强剂为螯合剂。螯合剂可以是EDTA、柠檬酸、水杨酸盐、胶原蛋白的N-酰基衍生物、月桂醇醚-9、β-二酮的N-氨基酰基衍生物或其混合物。
在另一个实施例中，渗透增强剂为表面活性剂，例如离子或非离子表面活性剂。表面活性剂可以是十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-十六烷基醚、全氟化学乳液或其混合物。
在另一个实施例中，渗透增强剂可选自由不饱和环脲、1-烷基-烷酮、1-烯基氮杂环-丙烷酮、类固醇抗炎剂及其混合物组成的组。在另一个实施例中，渗透增强剂可以是二醇、吡咯、氮酮或萜烯。
在一个方面中，本发明的特征在于呈适于口服递送的形式的药物组合物，其包括siRNA化合物，例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前体，例如可加工成ssiRNA化合物的较大siRNA化合物，或编码siRNA化合物(例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前体)的DNA)。在一个实施例中，口服递送可用于将siRNA化合物组合物递送至胃肠道的细胞或区域，例如小肠、结肠(例如治疗结肠癌)等等。口服递送形式可以是片剂、胶囊或凝胶胶囊。在一个实施例中，药物组合物的siRNA化合物调节细胞黏附蛋白的表达、调节细胞增殖速率、或具有针对真核病原体或反转录病毒的生物活性。在另一个实施例中，药物组合物包括肠溶材料，其基本上防止片剂、胶囊或凝胶胶囊在哺乳动物胃中溶解。在一些实施例中，肠溶材料为包衣。包衣可以是乙酸邻苯二甲酸酯、丙二醇、脱水山梨糖醇单油酸酯、乙酸偏苯三酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯或乙酸邻苯二甲酸纤维素。
在另一个实施例中，药物组合物的口服剂型包括渗透增强剂。渗透增强剂可以是胆汁盐或脂肪酸。胆汁盐可以是熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸及其盐。脂肪酸可以是癸酸、月桂酸及其盐。
在另一个实施例中，药物组合物的口服剂型包括赋形剂。在一个实例中，赋形剂为聚乙二醇。在另一个实例中，赋形剂为硬脂酸甘油酯(precirol)。
在另一个实施例中，药物组合物的口服剂型包括增塑剂。增塑剂可以是邻苯二甲酸二乙酯、三乙酸甘油酯癸二酸二丁酯、邻苯二甲酸二丁酯或柠檬酸三乙酯。
在一个方面中，本发明的特征在于包括siRNA化合物及递送媒介物的药物组合物。在一个实施例中，siRNA化合物(a)为19-25个核苷酸长，例如21-23个核苷酸，(b)与内源性靶RNA互补，并且任选地，(c)包括至少一个1-5个核苷酸长的3’突出端。
在一个实施例中，递送媒介物可通过局部施用途径将siRNA化合物，例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前体，例如可加工成ssiRNA化合物的较大siRNA化合物，或编码siRNA化合物(例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前体)的DNA)递送至细胞。递送媒介物可以是微观囊泡。在一个实例中，微观囊泡为脂质体。在一些实施例中，脂质体为阳离子脂质体。在另一个实例中，微观囊泡为微胞。在一个方面中，本发明的特征在于呈可注射剂型的药物组合物，其包括siRNA化合物，例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前体，例如可加工成ssiRNA化合物的较大siRNA化合物，或编码siRNA化合物(例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前体)的DNA)。在一个实施例中，药物组合物的可注射剂型包括无菌水溶液或分散液及无菌粉末。在一些实施例中，无菌溶液可以包括稀释剂，诸如水；生理食盐水溶液；不挥发性油、聚乙二醇、甘油或丙二醇。
在一个方面中，本发明的特征在于呈口服剂型的药物组合物，其包括siRNA化合物，例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前体，例如可加工成ssiRNA化合物的较大siRNA化合物，或编码siRNA化合物(例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前体)的DNA)。在一个实施例中，口服剂型选自由片剂、胶囊及凝胶胶囊组成的组。在另一个实施例中，药物组合物包括肠溶材料，其基本上防止片剂、胶囊或凝胶胶囊在哺乳动物胃中溶解。在一些实施例中，肠溶材料为包衣。包衣可以是乙酸邻苯二甲酸酯、丙二醇、脱水山梨糖醇单油酸酯、乙酸偏苯三酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯或乙酸邻苯二甲酸纤维素。在一个实施例中，药物组合物的口服剂型包括渗透增强剂，例如本文所述的渗透增强剂。
在另一个实施例中，药物组合物的口服剂型包括赋形剂。在一个实例中，赋形剂为聚乙二醇。在另一个实例中，赋形剂为硬脂酸甘油酯(precirol)。
在另一个实施例中，药物组合物的口服剂型包括增塑剂。增塑剂可以是邻苯二甲酸二乙酯、三乙酸甘油酯癸二酸二丁酯、邻苯二甲酸二丁酯或柠檬酸三乙酯。
在一个方面中，本发明的特征在于呈直肠剂型的药物组合物，其包括siRNA化合物，例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前体，例如可加工成ssiRNA化合物的较大siRNA化合物，或编码siRNA化合物(例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前体)的DNA)。在一个实施例中，直肠剂型为灌肠剂。在另一个实施例中，直肠剂型为栓剂。
在一个方面中，本发明的特征在于呈阴道剂型的药物组合物，其包括siRNA化合物，例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前体，例如可加工成ssiRNA化合物的较大siRNA化合物，或编码siRNA化合物(例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前体)的DNA)。在一个实施例中，阴道剂型为栓剂。在另一个实施例中，阴道剂型为泡沫、乳膏或凝胶。
在一个方面中，本发明的特征在于呈经肺或经鼻剂型的药物组合物，其包括siRNA化合物，例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前体，例如可加工成ssiRNA化合物的较大siRNA化合物，或编码siRNA化合物(例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前体)的DNA)。在一个实施例中，将siRNA化合物并入颗粒中，例如大颗粒，例如微球体。颗粒可通过喷雾干燥、冻干、蒸发、流化床干燥、真空干燥或其组合来产生。微球体可配制为悬浮液、粉末或可植入固体。
治疗方法及递送途径
本发明的另一方面涉及降低细胞中靶基因的表达的方法，该方法包括使所述细胞与本发明的双链iRNA剂接触。在一个实施例中，细胞为肝外细胞。
本发明的另一方面涉及降低受试者体内的靶基因表达的方法，该方法包括向该受试者施用本发明的双链iRNA剂。
本发明的另一方面涉及治疗患有CNS障碍的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的本发明的双链RNAi剂，从而治疗该受试者。可通过本发明的方法治疗的示例性CNS障碍包括阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞叶型痴呆、亨廷顿病(huntington)、帕金森病(Parkinson)、脊髓小脑病、朊病毒病及拉福拉病(lafora)。
本发明的双链iRNA剂可通过多种途径递送至受试者，这取决于所靶向的基因的类型及待治疗的障碍的类型。在一些实施例中，双链iRNA剂是肝外施用，诸如眼部施用(例如玻璃体内施用)或鞘内施用。
在一个实施例中，将双链iRNA剂鞘内施用。通过鞘内施用双链iRNA剂，该方法可降低脑或脊柱组织(例如皮质、小脑、颈椎、腰椎及胸椎)中的靶基因表达。
在一些实施例中，示例性靶基因为APP、ATXN2、C9orf72、TARDBP、MAPT(Tau)、HTT、SNCA、FUS、ATXN3、ATXN1、SCA1、SCA7、SCA8、MeCP2、PRNP、SOD1、DMPK及TTR。为了降低受试者体内的这些靶基因的表达，可玻璃体内施用双链iRNA剂。通过玻璃体内施用双链iRNA剂，该方法可降低眼组织中的靶基因的表达。
为了便于说明，此部分中的配制品、组合物及方法主要针对经修饰的siRNA化合物进行论述。然而，可理解，这些配制品、组合物及方法可用其他siRNA化合物(例如未修饰的siRNA化合物)加以实践，并且此类实践在本发明内。包括iRNA的组合物可通过多种途径递送至受试者。示例性途径包括：静脉内、局部、直肠、肛门、阴道、经鼻、经肺、经眼。
本发明的iRNA分子可并入适于施用的药物组合物中。此类组合物通常包括一个或多个iRNA物种及药学上可接受的载体。如本文所用，语言“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂及其类似物。此类介质及药剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除非任何常规的介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑将其用于组合物中。补充活性化合物也可并入组合物中。
本发明的药物组合物能以多种方式施用，这取决于是否需要局部或全身治疗及待治疗的区域。施用可以是局部(包括眼部、阴道、直肠、鼻内、经皮)、口服或肠胃外的。非经肠施用包括静脉内滴注，皮下、腹膜内或肌肉内注射，或鞘内或心室内施用。
可选择施用途径及位点以增强靶向。例如，为了靶向肌肉细胞，肌肉内注射至感兴趣的肌肉中将是合乎逻辑的选择。通过以气溶胶形式施用iRNA可靶向肺细胞。可通过用iRNA涂覆球囊导管且以机械方式引入DNA来靶向血管内皮细胞。
用于局部施用的配制品可以包括经皮贴片、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体及粉末。常规的药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂及其类似物可以是必需或合乎需要的。经涂覆的避孕套、手套及其类似物也可以是有用的。
用于口服施用的组合物包括粉末或颗粒、在水中的悬浮液或溶液、糖浆、酏剂或非水性介质、片剂、胶囊、锭剂或糖锭。在片剂的情况下，可使用的载体包括乳糖、柠檬酸钠及磷酸盐。各种崩解剂诸如淀粉及润滑剂诸如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠及滑石常用于片剂中。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂为乳糖及高分子量聚乙二醇。当口服使用需要水性悬浮液时，核酸组合物可以与乳化剂及悬浮剂组合。如果需要，可添加某些甜味剂和/或调味剂。
用于鞘内或心室内施用的组合物可以包括无菌水溶液，其也可含有缓冲液、稀释剂及其他适合的添加剂。
用于非经肠施用的配制品可以包括无菌水溶液，其也可含有缓冲液、稀释剂及其他适合的添加剂。心室内注射可通过例如附接至储集器的心室内导管来促进。对于静脉内使用，可控制溶质的总浓度以使制剂等渗。
对于眼部施用，软膏或可滴注液体可通过此项技术已知的眼部递送系统递送，诸如施加器或滴眼器。此类组合物可以包括黏液模拟物(mucomimetic)诸如透明质酸、硫酸软骨素、羟丙基甲基纤维素或聚(乙烯醇)，防腐剂诸如山梨酸、EDTA或苄基氯化铵，及常用量的稀释剂和/或载体。
在一个实施例中，siRNA化合物(例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物)、组合物的施用为肠胃外的，例如静脉内(例如，以推注或可扩散的输注形式)、皮内、腹膜内、肌肉内、鞘内、心室内、颅内、皮下、经黏膜、颊内、舌下、内视镜检、直肠、口服、阴道、局部、经肺、鼻内、尿道或眼部。施用可由受试者或另一个人(例如医疗服务人员)提供。药物可以测量的剂量或在分配器(递送计量的剂量)中提供。下文更详细地论述所选递送模式。
鞘内施用。在一个实施例中，将双链iRNA剂通过鞘内注射(即注射至沐浴脑及脊髓组织的脊髓液中)来递送。将iRNA剂鞘内注射至脊髓液中可以推注注射形式或经由微型泵来进行，这些微型泵可植入皮肤下方，从而提供将siRNA规律且恒定地递送至脊髓液中。脊髓液从产生其的脉络丛向下循环至脊髓及背根神经节周围且随后向上通过小脑及皮质达到蛛网膜颗粒，在此处液体可离开CNS，这取决于所注射的化合物的尺寸、稳定性及溶解度，鞘内递送的分子可在整个CNS中击中靶标。
在一些实施例中，鞘内施用经由泵。泵可以是手术植入的渗透泵。在一个实施例中，将渗透泵植入椎管的蛛网膜下腔以促进鞘内施用。
在一些实施例中，鞘内施用是经由用于药物的鞘内递送系统，该鞘内递送系统包括含有一定体积药剂的储集器以及配制以递送储集器中所含的一部分药剂的泵。关于此鞘内递送系统的更多细节可见于2015年1月28日提交的PCT/US 2015/013253，将其通过引用以其全文并入本文。
鞘内注射的iRNA剂的量可自一种靶基因至另一种靶基因而变化，并且必须针对各靶基因单独确定必须施用的适当量。通常，此量范围介于10μg至2mg，优选地50μg至1500μg，更优选地100μg至1000μg。
直肠施用。本发明也提供用于直肠施用或递送本文所述的siRNA化合物的方法、组合物及试剂盒。
因此，本文所述的siRNA化合物，例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前体，例如可加工成ssiRNA化合物的较大siRNA化合物，或编码siRNA化合物(例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前体)的DNA)，例如治疗有效量的本文所述的siRNA化合物，例如具有少于40且例如少于30个核苷酸的双链区且具有一或两个1-3个核苷酸的单链3’突出端的siRNA化合物可经直肠施用，例如通过直肠引入下结肠或上结肠。此方法特别适用于治疗发炎性障碍、以不需要的细胞增殖为特征的障碍，例如息肉或结肠癌。
药物可通过引入施配装置递送至结肠中的部位，该施配装置为例如与用于检查结肠或移除息肉类似的可挠性摄影机引导装置，其包括用于递送药物的构件。
siRNA化合物的直肠施用是通过灌肠剂的方式。灌肠剂的siRNA化合物可溶解于生理食盐水或缓冲溶液中。直肠施用也可通过栓剂的方式，其可以包括其他成分，例如赋形剂，例如可可脂或羟丙基甲基纤维素。
眼部递送。本文所述的iRNA剂可施用至眼组织。例如，药物可施用于眼睛表面或附近组织，例如眼睑内侧。其可例如通过喷雾、滴剂、作为洗眼剂或软膏局部施用。施用可由受试者或另一个人(例如医疗服务人员)提供。药物可以测量的剂量或在分配器(递送计量的剂量)中提供。药物也可施用至眼睛内部，并且可通过针或可将药物引入所选区域或结构的其他递送装置引入。眼部治疗特别适用于治疗眼睛或附近组织的炎症。
在某些实施例中，双链iRNA剂可通过眼组织注射，诸如眼周、结膜、筋膜下、前房内、玻璃体内、眼内、前或后近巩膜、视网膜下、结膜下、眼球后或小管内注射；通过使用导管或其他置放装置(诸如视网膜球粒、眼内插入物、栓剂或包含多孔、无孔或胶状材料的植入物)直接施用；通过局部眼滴剂或软膏；或通过盲管或邻近巩膜植入(经巩膜)或巩膜中(巩膜内)或眼内的缓慢释放装置直接递送至眼。前房内注射可通过角膜进入前房，以使药剂到达小梁网。小管内注射可进入静脉收集器通道，从而排出施累姆氏管(Schlemm’s canal)或进入施累姆氏管(Schlemm’s canal)。
在一个实施例中，双链iRNA剂可诸如使用以准备注射形式供医务人员使用的预填充注射器，通过玻璃体内注射施用至眼睛中，例如眼睛的玻璃体房。
对于眼科递送，双链iRNA剂可以与眼科学上可接受的防腐剂、共溶剂、表面活性剂、黏度增强剂、渗透增强剂、缓冲液、氯化钠或水组合以形成水性无菌眼用悬浮液或溶液。溶液配制品可通过将缀合物溶解于生理学上可接受的等渗水性缓冲液中来制备。另外，溶液可以包括可接受的表面活性剂以帮助溶解双链iRNA剂。可将黏度构成剂，诸如羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或其类似物添加至药物组合物中以改进的双链iRNA剂的保留。
为了制备无菌眼用软膏配制品，将双链iRNA剂与防腐剂在适当媒介物(诸如矿物油、液体羊毛蜡或白凡士林)中组合。无菌眼用凝胶配制品可根据本领域已知的方法，通过将双链iRNA剂悬浮于由例如
Figure BDA0002885421910001801
-940(百路驰公司(BF Goodrich)，加利福尼亚州福斯特市(Charlotte,N.C.))或其类似物的组合制备的亲水性基质中来制备。
局部递送。本文所述的任何siRNA化合物可直接施用至皮肤。例如，药物可局部施用或递送至皮肤层中，例如通过使用微针或一组微针，其穿透至皮肤中，但例如不进入下面的肌肉组织。siRNA化合物组合物的施用可以是局部的。局部施用可例如将组合物递送至受试者的真皮或表皮。局部施用可以是经皮贴片、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体或粉末形式。用于局部施用的组合物可配制为脂质体、微胞、乳液或其他亲脂性分子组装体。经皮施用可以与至少一种渗透增强剂一起应用，诸如离子导入疗法、超声波透入疗法及超声波电渗法。
为了便于说明，此部分中的配制品、组合物及方法主要针对经修饰的siRNA化合物进行论述。然而，可理解，这些配制品、组合物及方法可用其他siRNA化合物(例如未修饰的siRNA化合物)加以实践，并且此类实践在本发明内。在一些实施例中，将siRNA化合物，例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前体，例如可加工成ssiRNA化合物的较大siRNA化合物，或编码siRNA化合物(例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前体)的DNA)经由局部施用递送至受试者。“局部施用”是指通过使配制品直接与受试者表面接触而递送至受试者。最常见的局部递送形式系至皮肤，但本文所披露的组合物也可直接施用于身体的其他表面，例如眼睛、黏膜、体腔表面或内表面。如上文所提及，最常见的局部递送系至皮肤。该术语涵盖几种投药途径，包括但不限于局部及经皮。这些施用模式通常包括渗透皮肤的渗透性障壁并且有效递送至靶组织或层。局部施用可用作穿透表皮及真皮且最终实现组合物的全身递送的手段。局部施用也可用作将寡核苷酸选择性递送至受试者的表皮或真皮、或其特定层、或下层组织的手段。
如本文所用，术语“皮肤”是指动物的表皮和/或真皮。哺乳动物皮肤由两个主要的不同层组成。皮肤的外层称为表皮。表皮由角质层、颗粒层、棘层及基底层构成，其中角质层位于皮肤表并且基底层为表皮的最深部分。表皮的厚度在50μm与0.2mm之间，这取决于其在身体上的位置。
表皮下方为真皮，其明显比表皮厚。真皮主要由纤维束形式的胶原蛋白构成。胶原束尤其为血管、淋巴毛细管、腺体、神经末梢及免疫活性细胞提供支持。
皮肤作为器官的主要功能之一是调节物质进入体内。皮肤的主要渗透障壁由角质层提供，角质层由处于各种分化状态的多层细胞形成。角质层中的细胞间的空隙用不同的脂质填充，这些脂质以网格状形式排列，提供密封以进一步增强皮肤渗透性障壁。
由皮肤提供的渗透性障壁使其对分子量大于约750Da的分子很大程度上为不可渗透的。对于较大分子穿过皮肤的渗透性障壁，必须使用除正常渗透以外的机制。
几个因素决定皮肤对所施用的药剂的渗透性。这些因素包括经治疗的皮肤的特征、递送剂的特征、药物及递送剂与药物及皮肤之间的相互作用、所应用的药物的剂量、治疗形式及后治疗方案。为了选择性靶向表皮及真皮，有时可以配制包含一种或多种渗透增强剂的组合物，该一种或多种渗透增强剂使得药物能够渗透至预先选择的层中。
经皮传递是用于施用脂溶性治疗剂的有价值的途径。真皮比表皮更具渗透性，因此通过磨损、烧伤或裸露的皮肤吸收快得多。增加血液流向皮肤的炎症及其他生理条件也增强经皮吸附。经由此途径的吸收可通过使用油性媒介物(涂油)或通过使用一种或多种渗透增强剂来增强。经由经皮途径递送本文所披露的组合物的其他有效方式包括皮肤的水合及控制释放局部贴片的使用。经皮途径提供递送本文所披露的组合物用于全身和/或局部疗法的潜在有效手段。
另外，离子导入疗法(在电场影响下穿过生物膜转移离子溶质)(Lee等人,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems[治疗性药物载体系统的严格评论],1991,第163页)、超声波透入疗法或超声波电渗法(使用超声波增强各种治疗剂跨越生物膜，特别是皮肤及角膜的吸收)(Lee等人,Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems[治疗性药物载体系统的严格评论],1991,第166页)及相对于剂量位置及在施用部位处的保留的媒介物特征的优化(Lee等人,Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems[治疗性药物载体系统的严格评论],1991,第168页)可以是用于增强局部施用的组合物跨越皮肤及黏膜部位的转运的有用方法。
所提供的组合物及方法也可用于体外检查各种蛋白质及基因在培养或保存的真皮组织中及动物体内的功能。因此，本发明可用于检查任何基因的功能。本发明的方法也可在治疗上或预防上使用。例如，用于治疗已知或疑似患有以下疾病的动物：诸如牛皮癣、扁平苔癣、中毒性表皮坏死溶解、多形性红斑、基底细胞癌、鳞状细胞癌、恶性黑素瘤、佩吉特氏病(Paget’s disease)、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、肺纤维化、莱姆病(Lymedisease)及皮肤的病毒、真菌及细菌感染。
肺部递送。本文所述的任何siRNA化合物可施用至肺部系统。肺部施用可通过吸入或通过将递送装置引入肺部系统，例如通过引入可施配药物的递送装置来实现。某些实施例可使用通过吸入的肺部递送方法。药物可提供于分配器中，该分配器以足够小的形式递送药物(例如湿的或干的)，以使其可被吸入。该装置可递送计量剂量的药物。受试者或另一个人可以施用药物。肺部递送不仅对直接影响肺部组织的障碍有效，并且也对影响其他组织的障碍有效。siRNA化合物可配制为用于肺部递送的液体或非液体，例如粉末、晶体或气溶胶。
为了便于说明，此部分中的配制品、组合物及方法主要针对经修饰的siRNA化合物进行论述。然而，可理解，这些配制品、组合物及方法可用其他siRNA化合物(例如未修饰的siRNA化合物)加以实践，并且此类实践在本发明内。包括siRNA化合物，例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前体，例如可加工成ssiRNA化合物的较大siRNA化合物，或编码siRNA化合物(例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前体)的DNA)的组合物可通过肺部递送施用受试者。肺部递送组合物可通过患者吸入分散体来递送，使得分散体内的组合物(例如iRNA)可到达肺，在此处其可容易地通过肺泡区直接吸收至血液循环中。肺部递送对于全身递送及治疗肺病的局部递送可以是有效的。
肺部递送可通过不同方法来实现，包括使用基于雾化、气溶胶化、微胞化及干燥粉末的配制品。递送可通过液体喷雾器、基于气溶胶的吸入器及干粉分散装置来实现。可使用计量剂量装置。使用雾化器或吸入器的好处之一是将污染的可能性降至最低，因为这些装置为独立的。举例而言，干粉分散装置递送可容易地配制为干粉的药物。iRNA组合物可作为冻干或喷雾干燥粉末单独或与适合的粉末载体组合稳定地储存。用于吸入的组合物的递送可通过给药定时组件来介导，其可以包括定时器、剂量计数器、时间测量装置或时间指示器，当并入装置中时能够在气溶胶药物施用期间实现剂量追踪、顺应性监测和/或剂量触发患者。
术语“粉末”意指由细分散的固体颗粒组成的组合物，这些颗粒自由流动且能够容易地分散于吸入装置中并随后由受试者吸入，使得颗粒到达肺以允许渗透至肺泡中。因此，该粉末称为“可吸入的”。例如，平均粒度为直径小于约10μm，具有相对均一的球形分布。在一些实施例中，直径小于约7.5μm且在一些实施例中小于约5.0μm。通常，粒度分布为直径在约0.1μm与约5μm之间，有时为约0.3μm至约5μm。
术语“干燥”意指组合物的水分含量低于约10重量％(％w)水，通常低于约5％w并且在一些情况下低于约3％w。干燥组合物可使得颗粒易于分散在吸入装置中以形成气溶胶。
术语“治疗有效量”是组合物中存在的在待治疗的受试者中提供所需水平的药物以给出预期生理反应所需的量。
术语“生理学有效量”是递送至受试者以给出所需缓解性或治愈性效应的量。
术语“药学上可接受的载体”意指可进入肺而对肺没有显著不良毒理作用的载体。
可用作载体的药物赋形剂的类型包括稳定剂，诸如人类血清白蛋白(HSA)；膨胀剂，诸如碳水化合物、氨基酸及多肽；pH调节剂或缓冲液；盐，诸如氯化钠；及其类似物。这些载体可呈结晶或无定形形式，或可以是两个的混合物。
特别有价值的膨胀剂包括相容性碳水化合物、多肽、氨基酸或其组合。适合的碳水化合物包括单糖，诸如半乳糖、D-甘露糖、山梨糖及其类似物；二糖，诸如乳糖、海藻糖及其类似物；环糊精，诸如2-羟丙基-β-环糊精；及多糖，诸如棉子糖、麦芽糊精、葡聚糖及其类似物；醛醣醇，诸如甘露糖醇、木糖醇及其类似物。一组碳水化合物可以包括乳糖、海藻糖、棉子糖麦芽糊精及甘露糖醇。适合的多肽包括阿斯巴甜。氨基酸包括丙氨酸及甘氨酸，在一些实施例中使用甘氨酸。
可以包括添加剂(其为本发明组合物的次要组分)用于喷雾干燥期间的构形稳定性及改进的粉末的分散性。这些添加剂包括疏水性氨基酸，诸如色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及其类似物。
适合的pH调节剂或缓冲液包括由有机酸及碱制备的有机盐，诸如柠檬酸钠、抗坏血酸钠及其类似物；在一些实施例中可使用柠檬酸钠。
微胞iRNA配制品的肺部施用可通过计量剂量喷雾装置来实现，这些装置具有推进剂，诸如四氟乙烷、七氟乙烷、二甲基氟丙烷、四氟丙烷、丁烷、异丁烷、二甲醚及其他非CFC及CFC推进剂。
口服或经鼻递送。本文所述的任何siRNA化合物可例如以片剂、胶囊、凝胶胶囊、锭剂、糖锭或液体糖浆形式口服施用。另外，该组合物可局部施用于口腔表面。
本文所述的任何siRNA化合物可经鼻施用。经鼻施用可通过将递送装置引入鼻中来实现，例如通过引入可施配药物的递送装置。经鼻递送的方法包括喷雾剂、气溶胶、液体(例如通过滴剂)，或通过局部施用至鼻腔表面。药物可提供于分配器中，该分配器以足够小的形式递送药物(例如湿的或干的)，以使其可被吸入。该装置可递送计量剂量的药物。受试者或另一个人可以施用药物。
经鼻递送不仅对直接影响鼻组织的障碍有效，并且也对影响其他组织的障碍有效。siRNA化合物可配制为液体或非液体，例如粉末、晶体或用于经鼻递送。如本文所用，术语“结晶”描述具有晶体结构或特征的固体，即三维结构的颗粒，其中平面以特定角度相交并且其中存在规则的内部结构。本发明的组合物可具有不同的结晶型。结晶型可通过多种方法制备，包括例如喷雾干燥。
为了便于说明，此部分中的配制品、组合物及方法主要针对经修饰的siRNA化合物进行论述。然而，可理解，这些配制品、组合物及方法可用其他siRNA化合物(例如未修饰的siRNA化合物)加以实践，并且此类实践在本发明内。口腔膜及鼻膜均提供优于其他施用途径的优点。例如，通过这些膜施用的药物快速起效，提供治疗性血浆水平，避免肝脏代谢的首过效应并且避免药物暴露于恶劣的胃肠(GI)环境。额外优点包括容易进入膜位点，从而可容易地施用、定位及移除药物。
在口服递送中，组合物可靶向口腔表面，例如舌下黏膜，其包括舌头腹面的膜及口腔底部，或构成面颊内层的颊黏膜。舌下黏膜相对可渗透，因此许多药物具有快速吸收及可接受的生物利用度。另外，舌下黏膜方便，可接受且易于接近。
分子渗透通过口腔黏膜的能力似乎与分子大小、脂溶性及肽蛋白电离相关。小于1000道尔顿的小分子似乎迅速穿过黏膜。随着分子大小增加，渗透性迅速下降。脂溶性化合物比非脂溶性分子更具渗透性。当分子未电离或电荷中性时，发生最大吸收。因此带电分子对通过口腔黏膜的吸收提出最大的挑战。
iRNA的药物组合物也可通过从计量剂量喷雾分配器将如上所述的混合微胞药物配制品及推进剂喷雾至颊腔中而不吸入来施用至人类的颊腔。在一个实施例中，首先震荡分配器，随后将药物配制品及推进剂喷雾至颊腔中。例如，药物可喷雾至颊腔中或例如以液体、固体或凝胶形式直接施用至颊腔中的表面。此施用特别适用于治疗颊腔(例如牙龈或舌头)的炎症，例如在一个实施例中，颊内施用是通过从分配器，例如施配药物组合物及推进剂的计量剂量喷雾分配器喷雾至颊腔中而例如不吸入。
本发明的一个方面也涉及将寡核苷酸通过鞘内递送而递送至CNS中或通过玻璃体内递送至眼组织中的方法。
一些实施例涉及降低细胞中靶基因的表达的方法，该方法包括使所述细胞与具有一个或多个任选地经由接头或载体与寡核苷酸缀合的亲脂性部分的寡核苷酸接触。在一个实施例中，细胞为CNS系统中的细胞。在一个实施例中，细胞为眼细胞。
一些实施例涉及降低受试者体内的靶基因表达的方法，该方法包括向该受试者施用具有一个或多个任选地经由接头或载体与寡核苷酸缀合的亲脂性部分的寡核苷酸。在一个实施例中，寡核苷酸缀合物是鞘内施用(以降低脑或脊柱组织中靶基因的表达)。在一个实施例中，寡核苷酸缀合物是玻璃体内施用(以降低眼组织中靶基因的表达)。
在一些实施例中，寡核苷酸为双链的。在一个实施例中，寡核苷酸为双链iRNA剂，其包含与靶基因互补的反义链以及与所述反义链互补的有义链。
在一些实施例中，寡核苷酸为单链的。在一个实施例中，寡核苷酸为反义的。
在一些实施例中，亲脂性部分与寡核苷酸的至少一个链上的一个或多个内部位置缀合。在一些实施例中，亲脂性部分与寡核苷酸的至少一个链上的一个或多个末端位置缀合。
试剂盒
在某些其他方面中，本发明提供包括适合容器的试剂盒，该容器含有siRNA化合物，例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如前体，例如可加工成ssiRNA化合物的较大siRNA化合物，或编码siRNA化合物(例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前体)的DNA)的药物配制品。在某些实施例中，药物配制品的各个组分可提供于一个容器中。可替代地，可能需要分别在两个或更多个容器中提供药物配制品的组分，例如一个容器用于siRNA化合物制剂，并且至少另一个用于载体化合物。试剂盒能以许多不同的组态封装，诸如单盒中的一个或多个容器。可以例如根据试剂盒提供的说明书组合不同的组分。可以根据本文所述的方法组合组分，例如以制备及施用药物组合物。试剂盒也可以包括递送装置。
通过以下实例进一步说明本发明，这些实例不应理解为进一步限制性的。本申请通篇引用的所有参考文献、申请中的专利申请及公开专利的内容特此以引用的方式明确地并入。
实例
现已总体上描述本发明，参考以下实例将更容易理解本发明，这些实例仅用于说明本发明的某些方面及实施例的目的而包括，并且不旨在限制本发明。
实例1：用于合成亲脂性缀合物的核苷亚磷酰胺的合成
方案1
Figure BDA0002885421910001881
化合物201的合成：将氢化钠(NaH)(21g)添加至含2,6-二氨基9-(B-D-呋喃核糖基)嘌呤200(105g)的干二甲基甲酰胺(DMF)(1500ml)中。搅拌30分钟后，添加1-溴十六烷(150ml)。将溶液在室温下搅拌过夜，并且随后通过添加乙醇(EtOH)(50ml)淬灭。真空蒸发反应混合物，并且将残余物悬浮于二氯甲烷中并且使用5％-10％MeOH/CH2Cl2作为洗脱剂，通过硅胶色谱来纯化。合并含有产物的级分并且脱除溶剂，得到粗泡沫201(95g)。
化合物203的合成：将上述泡沫(95g)及腺苷脱氨酶(2000mg，西格玛公司II化学品(Sigma Chemicals Type II))在室温下在0.1M tris缓冲液(1500ml，pH 7.4)、DMSO(1000ml)及0.1M磷酸钠缓冲液(100ml)中搅拌过夜。再添加含腺苷脱氨酶(140mg)的0.1M磷酸盐缓冲液(30ml)及DMSO(20ml)的等分试样，并且将反应物搅拌10天。真空蒸发溶剂且使用0％-10％MeOH/CH2Cl2对残余物进行硅胶快速色谱。真空蒸发含有产物的级分，以给出固体203(35g)。
化合物204的合成：将含上述固体(35g)的吡啶(500ml)在冰浴中冷却并且添加氯化三甲基硅烷(84ml)。将反应混合物搅拌30分钟并且添加异丁酰氯(58ml)。将溶液搅拌4小时以达到室温。通过添加H2O(100ml)冷却溶液，并且将溶液再搅拌30分钟。添加浓NH4-OH(100ml)并且真空蒸发溶液。使用0％-5％MeOH/DCM，通过硅胶色谱纯化残余物，以洗脱产物。蒸发含产物的级分，得到25g呈泡沫状的产物204。
化合物205的合成：将N2-异丁酰基-2’-O-十六烷基鸟苷204(25g)与吡啶一起共蒸发并且随后溶解于吡啶(180ml)中。在室温下在搅拌下添加二甲氧基三苯甲基氯(20g)及二甲氨基吡啶(50mg)。将反应混合物搅拌过夜并且真空蒸发。使残余物分配于CH2C12/NaHCO3水溶液之间。将有机相干燥(MgSO4)且蒸发。通过硅胶色谱(1:1EtOAc/己烷)纯化残余物，得到30g产物205。
化合物206的合成：将上述固体205(30g)、双-(N,N-二异丙基氨基)-2-氰基乙基亚磷酸酯(20g)及N,N-二异丙基四唑铵(10g)在室温下搅拌过夜。将溶液相对于NaHCO3水溶液分配且经MgSO4干燥。真空蒸发溶剂且通过硅胶色谱(1％TEA在EtOAc中)纯化残余物，得到29g呈泡沫状的产物206。1H NMR(500MHz,乙腈-d3)δ7.84(d,J＝11.1Hz,1H),7.45(dd,J＝7.7,5.7Hz,2H),7.33(dd,J＝9.0,7.1Hz,4H),7.27(m,2H),7.22(dd,J＝8.5,6.0Hz,1H),6.83(m,4H),5.89(t,J＝5.7Hz,1H),4.64(m,1H),4.47(m,1H),4.27(m,1H),3.92-3.77(m,1H),3.75(d,J＝2.3Hz,6H),3.72-3.66(m,1H),3.62(m,3H),3.49(m,1H),3.37(d,J＝3.9Hz,1H),3.33(d,J＝4.0Hz,1H),2.67(d,J＝3.9Hz,1H),2.58-2.41(m,2H),1.48(m,2H),1.34-1.14(m,35H),1.14-1.02(m,9H),0.88(t,J＝6.7Hz,3H)。31P NMR(202MHz,乙腈-d3)δ151.11,150.93。
方案2
Figure BDA0002885421910001891
化合物208的合成：将氢化钠(NaH)(25g)添加至含2,6-二氨基9-(B-D-呋喃核糖基)嘌呤207(125g)的干二甲基甲酰胺(DMF)(1500ml)中。搅拌30分钟后，添加1-溴十六烷(180gl)。将溶液在室温下搅拌过夜，并且随后通过添加乙醇(EtOH)(50ml)淬灭。真空蒸发反应混合物，并且将残余物悬浮于二氯甲烷中并且使用0％-10％MeOH/CH2Cl2作为洗脱剂，通过硅胶色谱来纯化。合并含有产物的级分且脱除溶剂，得到呈泡沫状的产物208(36g)。
化合物209的合成：将含上述固体208(36g)的吡啶(500ml)在冰浴中冷却并且添加氯化三甲基硅烷(30ml)。将反应混合物搅拌30分钟并且添加苯甲酰氯(20ml)。将溶液搅拌4小时以达到室温。通过添加H2O(100ml)冷却溶液，并且将溶液再搅拌30分钟。添加浓NH4-OH(100ml)并且真空蒸发溶液。使用0％-5％MeOH/CH2Cl2，通过硅胶色谱纯化残余物，以洗脱产物。蒸发含有产物的级分，得到32g呈泡沫状的产物209。
化合物210的合成：将N2-苯甲酰基-2’-O-十六烷基腺苷209(32g)与吡啶一起共蒸发，并且随后溶解于吡啶(180ml)中。在室温下在搅拌下添加二甲氧基三苯甲基氯(20g)及二甲氨基吡啶(50mg)。将反应混合物搅拌过夜并且真空蒸发。使残余物分配于DCM/NaHCO3水溶液之间。将有机相干燥(MgSO4)且蒸发。通过硅胶色谱(1:1EtOAc/己烷)纯化残余物，得到35g产物210。
化合物211的合成：将上述固体210(35g)、双-(N,N-二异丙基氨基)-2-氰基乙基亚磷酸酯(20g)及N,N-二异丙基四唑铵(10g)在室温下搅拌过夜。将溶液相对于NaHCO3水溶液分配且经MgSO4干燥。真空蒸发溶剂并且通过硅胶色谱(1:1EtOAc/己烷)纯化残余物，得到37g呈泡沫状的产物211。1H NMR(500MHz,乙腈-d3)δ9.37(s,1H),8.57(d,J＝9.4Hz,1H),8.27(d,J＝10.3Hz,1H),7.99(d,J＝7.6Hz,2H),7.61(d,J＝7.4Hz,1H),7.52(t,J＝7.6Hz,2H),7.42(t,J＝7.3Hz,2H),7.34-7.16(m,7H),6.85-6.77(m,4H),6.11(dd,J＝5.0,2.5Hz,1H),4.80(m,1H),4.69(m,1H),4.32(m,1H),3.97-3.78(m,1H),3.74(d,J＝3.1Hz,7H),3.64(m,4H),3.56-3.40(m,2H),3.33(m,1H),2.73-2.59(m,1H),2.50(t,J＝6.0Hz,1H),1.52-1.45(m,2H),1.33-1.12(m,37H),1.09(d,J＝6.8Hz,3H),0.87(t,J＝6.8Hz,3H)。31P NMR(202MHz,乙腈-d3)δ151.19,150.78。
方案3
Figure BDA0002885421910001911
213的合成：在氩气气氛下，向脱水化合物212(24.0g，0.1mol)及DMAP(0.16g，1.3mmol)于无水吡啶(120mL)中的溶液中添加TBDPSCl(28mL，0.11mol)。将混合物在室温下搅拌24小时，之后可通过TLC(氯仿:甲醇5:1)观察到无显著量的起始材料212。在减压下移除吡啶，并且使残余物分配于乙酸乙酯与10％磷酸之间。分离有机相，依次用5％NaCl水溶液及饱和NaCl洗涤，并且经无水硫酸钠干燥。一旦在水性洗涤期间开始结晶，则添加有限量的DCM以溶解固体。过滤硫酸钠后，蒸发溶液，将残余物与800mL乙醚一起搅拌2天。过滤白色沉淀物，用乙醚洗涤一次且干燥，得到40.8g(85％)呈白色结晶固体状的213。
化合物215f及215g的合成：在装配有磁力棒、进气口、回流冷凝器、油加热浴、加料漏斗及冷凝器顶部的鼓泡器的圆底烧瓶中，在烧瓶充满Ar的情况下，在高真空下干燥0.36mol十六烷-1-醇或油醇约40分钟。添加无水二乙二醇二甲醚(65mL)，随后逐滴添加2MAlMe3的庚烷溶液(55mL，0.11mmol)。将混合物加热至110℃并且通过甲烷逸出结束监测反应的完全性。将混合物在Ar下冷却至室温，随后添加脱水核苷213(23.2g，50mmol)并且在145℃下加热油浴过夜。将混合物在Ar下冷却至室温且分配于10％H3PO4(500mL)与乙酸乙酯(250mL)之间。分离有机层，依次用NaCl水溶液(5％)及饱和NaCl洗涤，并且经无水Na2SO4干燥。真空移除溶剂，将残余物溶解于THF(200mL)中并且用三氢氟化三乙胺(33mL，0.2mol)处理。将混合物在Ar下搅拌3天且分配于5％NaCl水溶液(300mL)与乙酸乙酯(300mL)之间。分离有机相，用饱和NaCl水溶液洗涤且蒸发溶剂。将残余物溶解于己烷(800mL)中，并且用90％MeOH水溶液(2x800mL)萃取。蒸发合并的甲醇萃取物，并且将残余物分配于乙酸乙酯与饱和NaCl水溶液之间。分离有机相且经无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂且通过硅胶柱色谱，用3％-10％甲醇在DCM中的梯度纯化残余物，得到10.9g(47％)215f(R＝C16H33)或13.7g(55％)215g(R＝C18H35，油基)。
化合物216f的合成：在氩气气氛下，向脱水化合物215f(10.61g，22.6mmol)、DMAP(.550g，4.4mmol)及DMTrCl(9.76g，29mmol)于无水吡啶(70mL)中的溶液中添加三乙胺(4.1mL，29mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，通过添加1mL MeOH淬灭。真空移除吡啶，并且将残余物分配于乙酸乙酯与5％NaCl水溶液之间。分离有机相，用饱和NaCl洗涤并且经无水硫酸钠干燥。真空蒸发溶剂，并且在硅胶柱上用乙酸乙酯在己烷中的梯度(35％至60％)色谱残余物来分离产物，得到14.89g(86％)呈淡黄色无定形泡沫状的216f。
化合物217f的合成：将化合物216f(25g)、双-(N,N-二异丙基氨基)-2-氰基乙基亚磷酸酯(15g)及N,N-二异丙基四唑铵(7.5g)在室温下搅拌过夜。将溶液相对于NaHCO3水溶液分配且经MgSO4干燥。真空蒸发溶剂且通过硅胶色谱(1:1EtOAc/己烷)纯化残余物，得到27g呈泡沫状的产物。1H NMR(500MHz,乙腈-d3)δ9.02(s,1H),7.77(dd,J＝43.4,8.1Hz,1H),7.49-7.40(m,2H),7.36-7.29(m,6H),7.26(m,1H),6.88(dd,J＝8.7,6.4Hz,4H),5.85(dd,J＝7.5,3.4Hz,1H),5.22(t,J＝7.6Hz,1H),4.44(m,1H),4.14(m,1H),4.07-3.99(m,1H),3.86(m,1H),3.77(d,J＝3.1Hz,7H),3.63(m,5H),3.45-3.33(m,2H),2.66(m,1H),2.52(d,J＝5.9Hz,1H),1.55(m,2H),1.26(s,26H),1.16(dd,J＝11.0,6.7Hz,9H),1.05(d,J＝6.8Hz,3H),0.88(t,J＝6.8Hz,3H)。31P NMR(202MHz,乙腈-d3)δ151.01,150.61。
化合物216a的合成：使用对于216f所描述的方法，合成化合物216a。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.37(d,J＝2.3Hz,1H),7.71(d,J＝8.1Hz,1H),7.39-7.34(m,2H),7.31(t,J＝7.6Hz,2H),7.28-7.20(m,5H),6.94-6.83(m,4H),5.28(dd,J＝8.1,2.2Hz,1H),5.11(d,J＝6.5Hz,1H),4.16(m,1H),4.01-3.92(m,1H),3.89(t,J＝4.6Hz,1H),3.73(s,6H),3.55(m,2H),3.30-3.18(m,2H),1.54-1.43(m,2H),1.33-1.15(m,6H),0.83(t,J＝6.7Hz,3H)。
化合物217a的合成：将化合物216a(4.0g，6.35mmol)添加至反应烧瓶中，抽空并且用氩气净化。将起始材料溶解于二氯甲烷中，并且经由注射器添加二异丙基乙胺(2.21ml，12.7mmol)。添加N,N-二异丙基氯亚磷酰胺2-氰基乙酯(2.12ml，9.53mmol)并且在室温下搅拌3小时。通过TLC(70％EtOAc/己烷)检查反应物，并且减压浓缩反应物。将残余物溶解于二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，并且将有机层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。分离有机层并且用盐水溶液洗涤。随后分离有机层并且经硫酸钠干燥。滤出固体并且浓缩母液。通过硅胶快速色谱(30％至100％EtOAc/己烷)纯化残余物，合并产物级分并且减压浓缩，得到(3.42g，65％)216a。1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δ8.98(s,1H),7.86-7.66(m,1H),7.49-7.39(m,2H),7.39-7.21(m,7H),6.93-6.83(m,4H),5.85(dd,J＝6.2,3.5Hz,1H),5.22(dd,J＝8.2,6.3Hz,1H),4.44(m,1H),4.20-3.98(m,2H),3.93-3.82(m,1H),3.77(d,J＝2.4Hz,7H),3.71-3.55(m,5H),3.47-3.32(m,2H),2.72-2.61(m,1H),2.52(t,J＝6.0Hz,1H),1.62-1.49(m,2H),1.41-1.23(m,6H),1.17(dd,J＝8.8,6.8Hz,9H),1.05(d,J＝6.8Hz,3H),0.88(m,3H)。31P NMR(202MHz,乙腈-d3)δ149.63,149.26。
化合物216b的合成：使用对于216f所描述的方法，合成化合物216b。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.36(d,J＝2.2Hz,1H),7.71(d,J＝8.1Hz,1H),7.41-7.35(m,2H),7.31(t,J＝7.6Hz,2H),7.23(m,5H),6.94-6.82(m,4H),5.79(d,J＝3.9Hz,1H),5.28(dd,J＝8.1,2.2Hz,1H),5.11(d,J＝6.5Hz,1H),4.16(m,1H),3.99-3.92(m,1H),3.89(m,1H),3.73(s,6H),3.55(m,2H),3.30-3.17(m,2H),1.49(t,J＝6.9Hz,2H),1.30-1.19(m,10H),0.89-0.79(m,3H)。
化合物217b的合成：将化合物216b(4.0g，6.08mmol)添加至反应烧瓶中，抽空并且用氩气净化。将起始材料溶解于二氯甲烷中，并且经由注射器添加二异丙基乙胺(2.12ml，12.16mmol)。添加N,N-二异丙基氯亚磷酰胺2-氰基乙酯(2.03ml，9.12mmol)并且在室温下搅拌2.5小时。通过TLC(70％EtOAc/己烷)检查反应物，并且减压浓缩反应物。将残余物溶解于二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，并且将有机层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。分离有机层并且用盐水溶液洗涤。随后分离有机层并且经硫酸钠干燥。滤出固体并且浓缩母液。通过硅胶快速色谱(30％至100％EtOAc/己烷)纯化残余物，合并产物级分并且减压浓缩，得到(3.55g，68％)217b。1H NMR(500MHz,乙腈-d3)δ9.12(d,J＝4.5Hz,1H),7.85-7.68(m,1H),7.44(m,2H),7.37-7.28(m,6H),7.26(m,1H),6.93-6.83(m,4H),5.88-5.80(m,1H),5.29-5.20(m,1H),4.45(m,1H),4.15(m,1H),4.09-4.01(m,1H),3.99-3.82(m,1H),3.83-3.71(m,8H),3.73-3.55(m,5H),3.46-3.33(m,2H),2.66(m,1H),2.52(t,J＝6.0Hz,1H),1.97(s,1H),1.56(m,2H),1.39-1.24(m,10H),1.24-1.10(m,9H),1.06(d,J＝6.7Hz,3H),0.91-0.84(m,3H)。31P NMR(202MHz,乙腈-d3)δ149.64,149.25。
化合物216c的合成：使用对于216f所描述的方法，合成化合物216c。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.36(d,J＝2.2Hz,1H),7.71(d,J＝8.1Hz,1H),7.41-7.35(m,2H),7.31(t,J＝7.6Hz,2H),7.27-7.19(m,5H),6.92-6.86(m,4H),5.79(d,J＝3.9Hz,1H),5.28(dd,J＝8.1,2.1Hz,1H),5.11(d,J＝6.5Hz,1H),4.16(m,1H),3.95(m,1H),3.89(m,1H),3.73(s,6H),3.55(m,2H),3.30-3.18(m,2H),1.49(t,J＝6.9Hz,2H),1.23(d,J＝7.0Hz,13H),0.83(t,J＝6.6Hz,3H)。
化合物217c的合成：将化合物216c(4.0g，5.83mmol)添加至反应烧瓶中，抽空并且用氩气净化。将起始材料溶解于二氯甲烷中，并且经由注射器添加二异丙基乙胺(2.04ml，11.66mmol)。添加N,N-二异丙基氯亚磷酰胺2-氰基乙酯(1.95ml，8.75mmol)并且在室温下搅拌4小时。通过TLC(70％EtOAc/己烷)检查反应物，并且减压浓缩反应物。将残余物溶解于二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，并且将有机层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。分离有机层并且用盐水溶液洗涤。随后分离有机层并且经硫酸钠干燥。滤出固体并且浓缩母液。通过硅胶快速色谱(30％至100％EtOAc/己烷)纯化残余物，合并产物级分并且减压浓缩，得到(4.20g，81％)217c。1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δ9.02(s,1H),7.77(dd,J＝35.4,8.2Hz,1H),7.49-7.39(m,2H),7.39-7.21(m,7H),6.93-6.83(m,4H),5.85(dd,J＝6.1,3.5Hz,1H),5.22(dd,J＝8.2,6.3Hz,1H),4.15(m,1H),4.03(m,1H),3.77(d,J＝2.4Hz,7H),3.69-3.53(m,4H),3.47-3.32(m,2H),2.71-2.61(m,1H),2.52(t,J＝6.0Hz,1H),1.56(m,2H),1.38-1.24(m,14H),1.16(dd,J＝8.8,6.8Hz,9H),1.05(d,J＝6.7Hz,3H),0.92-0.83(m,3H)。31P NMR(202MHz,乙腈-d3)δ149.63,149.25。
化合物216d的合成：使用对于216f所描述的方法，合成化合物216d。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.36(d,J＝2.2Hz,1H),7.71(d,J＝8.1Hz,1H),7.41-7.34(m,2H),7.31(t,J＝7.6Hz,2H),7.28-7.19(m,5H),6.94-6.81(m,4H),5.79(d,J＝3.9Hz,1H),5.28(dd,J＝8.1,2.2Hz,1H),5.11(d,J＝6.5Hz,1H),4.16(m,1H),3.95(m,1H),3.89(m,1H),3.73(s,7H),3.55(m,2H),3.30-3.17(m,2H),1.49(t,J＝6.8Hz,2H),1.22(s,19H),0.88-0.79(m,3H)。
化合物217d的合成：将化合物216d(5.0g，6.99mmol)添加至反应烧瓶中，抽空并且用氩气净化。将起始材料溶解于二氯甲烷中，并且经由注射器添加二异丙基乙胺(2.44ml，14mmol)。添加N,N-二异丙基氯亚磷酰胺2-氰基乙酯(2.34ml，10.50mmol)并且在室温下搅拌反应物3小时。通过TLC(70％EtOAc/己烷)检查反应物，并且减压浓缩反应物。将残余物溶解于二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，并且将有机层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。分离有机层并且用盐水溶液洗涤。随后分离有机层并且经硫酸钠干燥。滤出固体并且浓缩母液。通过硅胶快速色谱(30％至100％EtOAc/己烷)纯化残余物，合并产物级分并且减压浓缩，得到(4.54g，73％)217d。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ8.15(s,1H),8.01(dd,J＝44.6,8.2Hz,1H),7.43-7.34(m,2H),7.34-7.21(m,7H),6.84(m,3H),5.95(dd,J＝21.0,2.6Hz,1H),5.21(t,J＝7.5Hz,1H),4.29-4.17(m,1H),4.00(m,1H),3.97-3.86(m,1H),3.80(d,J＝3.5Hz,6H),3.77-3.64(m,2H),3.65-3.52(m,4H),3.44(m,1H),2.63(m,1H),2.42(t,J＝6.3Hz,1H),1.60(dd,J＝7.2,4.5Hz,2H),1.39-1.21(m,17H),1.21-1.12(m,8H),1.04(d,J＝6.8Hz,3H),0.87(t,J＝6.8Hz,2H)。31P NMR(202MHz,氯仿-d)δ150.102,150.07。
化合物216e的合成：使用对于216f所描述的方法，合成化合物216e。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.36(d,J＝2.2Hz,1H),7.71(d,J＝8.1Hz,1H),7.37(d,J＝7.3Hz,2H),7.31(t,J＝7.5Hz,2H),7.27-7.20(m,5H),6.93-6.82(m,4H),5.79(d,J＝3.8Hz,1H),5.27(dd,J＝8.1,2.1Hz,1H),5.11(d,J＝6.5Hz,1H),4.16(m,1H),3.95(m,1H),3.89(m,1H),3.73(s,6H),3.55(m,2H),3.30-3.18(m,2H),1.49(t,J＝6.9Hz,2H),1.21(s,22H),0.83(t,J＝6.6Hz,3H)。
化合物217e的合成：将化合物216e(5.0g，6.73mmol)添加至反应烧瓶中，抽空并且用氩气净化。将起始材料溶解于二氯甲烷中，并且经由注射器添加二异丙基乙胺(2.35ml，13.46mmol)。添加N,N-二异丙基氯亚磷酰胺2-氰基乙酯(2.25ml，10.10mmol)并且在室温下搅拌反应物3小时。通过TLC(70％EtOAc/己烷)检查反应物，并且减压浓缩反应物。将残余物溶解于二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，并且将有机层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。分离有机层并且用盐水溶液洗涤。随后分离有机层并且经硫酸钠干燥。滤出固体并且浓缩母液。通过硅胶快速色谱(30％至100％EtOAc/己烷)纯化残余物，合并产物级分并且减压浓缩，得到(4.86g，77％)217e。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ8.49(s,1H),8.01(dd,J＝45.8,8.2Hz,1H),7.39(dd,J＝17.7,7.3Hz,2H),7.34-7.21(m,8H),6.88-6.79(m,4H),5.96(dd,J＝21.6,2.5Hz,1H),5.22(dd,J＝8.2,6.2Hz,1H),4.29-4.17(m,1H),4.04-3.87(m,2H),3.80(dd,J＝3.6,1.4Hz,8H),3.76-3.64(m,2H),3.64-3.53(m,5H),3.45(m,1H),2.63(m,1H),2.42(s,1H),1.59(m,3H),1.40-1.29(m,4H),1.25(s,21H),1.22-1.10(m,11H),1.04(d,J＝6.8Hz,4H),0.88(t,J＝6.9Hz,3H)。31P NMR(202MHz,氯仿-d)δ150.13,150.06。
化合物216g的合成：使用对于216f所描述的方法，合成化合物216g。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.36(d,J＝2.2Hz,1H),7.71(d,J＝8.1Hz,1H),7.40-7.29(m,4H),7.23(m,5H),6.93-6.85(m,4H),5.78(d,J＝3.8Hz,1H),5.35-5.23(m,3H),5.10(d,J＝6.5Hz,1H),4.15(m,1H),3.95(m,1H),3.88(t,J＝4.5Hz,1H),3.73(s,6H),3.54(m,2H),3.30-3.16(m,2H),1.96(m,4H),1.49(t,J＝6.8Hz,2H),1.32-1.15(m,21H),0.87-0.79(m,3H)。
化合物217g的合成：将化合物216g(5.0g，6.28mmol)添加至反应烧瓶中，抽空并且用氩气净化。将起始材料溶解于二氯甲烷中，并且经由注射器添加二异丙基乙胺(2.19ml，12.56mmol)。添加N,N-二异丙基氯亚磷酰胺2-氰基乙酯(2.09ml，9.42mmol)并且在室温下搅拌反应物3小时。通过TLC(70％EtOAc/己烷)检查反应物，并且减压浓缩反应物。将残余物溶解于二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，并且将有机层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。分离有机层并且用盐水溶液洗涤。随后分离有机层并且经硫酸钠干燥。滤出固体并且浓缩母液。通过硅胶快速色谱(30％至100％EtOAc/己烷)纯化残余物，合并产物级分并且减压浓缩，得到(4.83g，77.1％)217g。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.38(s,1H),8.02(dd,J＝35.6,8.1Hz,1H),7.44-7.35(m,2H),7.28(m,7H),6.84(m,4H),5.95(dd,J＝16.6,2.5Hz,1H),5.34(t,J＝4.9Hz,2H),5.21(dd,J＝8.1,5.5Hz,1H),4.30-4.17(m,1H),4.00(m,1H),3.80(d,J＝2.5Hz,6H),3.77-3.65(m,2H),3.59(m,4H),3.45(m,1H),2.63(m,1H),2.42(s,1H),2.00(m,4H),1.59(m,3H),1.30(dd,J＝22.5,8.3Hz,21H),1.22-1.13(m,8H),1.04(d,J＝6.8Hz,3H),0.88(t,J＝6.7Hz,3H)。31P NMR(202MHz,氯仿-d)δ150.12,150.07。
方案4
Figure BDA0002885421910001981
化合物218f的合成：将DMT核苷217f(30g)溶解于无水吡啶(300ml)中。添加氯化三甲基硅烷(20ml)并且将混合物搅拌30分钟。添加三唑(30g)及三乙胺(80ml)并且冷却至0℃。添加POCl3(9ml)并且将混合物在0℃下搅拌2小时。添加浓氨水(100ml)并且搅拌1小时。添加水500ml并且用CH2Cl2(2x500ml)萃取混合物。蒸发合并的有机层并且通过硅胶色谱纯化残余物。用甲醇/CH2Cl2(0％-5％)洗脱所需产物218f。产量：24g。
化合物219f的合成：将上述固体218f(24g)溶解于DMF(200ml)中并且添加乙酸酐(6ml)。搅拌溶液24小时。添加水(500ml)并且用二氯甲烷(500ml)萃取混合物。蒸发有机层并且通过硅胶色谱纯化残余物。用甲醇/CH2Cl2(0％-5％)洗脱所需产物219f。产量：21g。
化合物220f的合成：将上述化合物219f(21g)、双-(N,N-二异丙基氨基)-2-氰基乙基亚磷酸酯(14g)及N,N-二异丙基四唑铵(7g)在室温下搅拌过夜。将溶液相对于NaHCO3水溶液分配且经MgSO4干燥。真空蒸发溶剂且通过硅胶色谱(1:1EtOAc/己烷)纯化残余物，得到22g呈泡沫状的产物。1H NMR(500MHz,乙腈-d3)δ9.15(s,1H),8.46(dd,J＝45.6,7.5Hz,1H),7.95(d,J＝7.6Hz,2H),7.63(t,J＝7.5Hz,1H),7.57-7.41(m,5H),7.41-7.31(m,6H),7.28(m,1H),7.04(d,J＝15.8Hz,1H),6.90(t,J＝7.9Hz,4H),5.90(d,J＝7.8Hz,1H),4.51(m,1H),4.20(dd,J＝10.6,8.1Hz,1H),4.04(dd,J＝31.3,4.6Hz,1H),3.91-3.81(m,2H),3.79(d,J＝3.1Hz,6H),3.74(m,2H),3.69-3.41(m,6H),2.67-2.59(m,1H),2.54-2.48(m,1H),1.58(m,2H),1.36(m,2H),1.25(d,J＝4.7Hz,26H),1.21-1.09(m,10H),1.04(d,J＝6.8Hz,3H),0.87(t,J＝6.8Hz,3H)。31P NMR(202MHz,乙腈-d3)δ151.10,150.19。
实例2：作为前体用于在寡核苷酸合成后引入亲脂性缀合物的核苷亚磷酰胺的合成
方案5
Figure BDA0002885421910001991
化合物222：将化合物221(6g，8.98mmol)添加至反应烧瓶中并且溶解于DCM中。搅拌反应物并且经由注射器添加三甲胺(4.89ml，35.92mmol)。将三氟乙酸乙酯(3.19g，22.45mmol)逐滴添加至反应物中。通过TLC(5％MeOH/DCM)检查反应物，使用磷钼酸显色，并且减压浓缩反应物。将残余物溶解于二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，并且将有机层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。分离有机层并且用盐水溶液洗涤。随后分离有机层并且经硫酸钠干燥。滤出固体，浓缩母液并且置于高真空下，得到(4.96g 72％)222。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.36(s,1H),8.26(s,1H),8.09(s,1H),7.41-7.33(m,2H),7.31(s,2H),7.24(m,6.8Hz,7H),6.88-6.79(m,4H),6.01(d,J＝5.0Hz,1H),5.18(d,J＝6.0Hz,1H),4.57(t,J＝5.0Hz,1H),4.38(m,1H),4.07(m,1H),3.73(s,6H),3.58(m,1H),3.43(m,1H),3.24(d,J＝4.7Hz,2H),3.12(m,2H),1.41(m,4H),1.18(d,J＝5.5Hz,4H)。C39H43F3N6O7的质量计算值：764.80，实验值：765.3(M+H)。
化合物223：将化合物222(4.96g，6.49mmol)添加至反应烧瓶中。将起始材料溶解于二甲基甲酰胺中，并且经由注射器添加N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(4.31ml，32.45mmol)。将反应物在油浴中加热至60℃持续3小时。通过TLC(5％MeOH/DCM)检查反应物，减压浓缩并且高真空干燥过夜。通过硅胶快速色谱(0％至10％MeOH/DCM)纯化残余物，合并产物级分并且减压浓缩，得到(5.21g 98％)223。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.35(t,J＝5.5Hz,1H),8.91(s,1H),8.37(d,J＝4.8Hz,2H),7.41-7.33(m,2H),7.31-7.16(m,7H),6.89-6.78(m,4H),6.07(d,J＝5.1Hz,1H),5.20(d,J＝6.0Hz,1H),4.61(t,J＝5.1Hz,1H),4.39(m,1H),4.09(m,1H),3.73(d,J＝1.3Hz,6H),3.58(m,1H),3.43(m,1H),3.25(d,J＝4.7Hz,2H),3.20(s,3H),3.13(s,3H),3.10(m,2H),1.41(m,4H),1.17(m,4H)。C42H48F3N7O7的质量计算值：819.88，实验值：820.4(M+H)。
化合物224：将化合物223(5.21g，6.36mmol)添加至反应烧瓶中，抽空并且用氩气净化。将起始材料溶解于二氯甲烷中，并且经由注射器添加二异丙基乙胺(2.21ml，12.72mmol)。添加N,N-二异丙基氯亚磷酰胺2-氰基乙酯(2.12ml，9.54mmol)并且在室温下搅拌反应物1小时。通过TLC(100％EtOAc)检查反应物，并且减压浓缩反应物。将残余物溶解于二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，并且将有机层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。分离有机层并且用盐水溶液洗涤。随后分离有机层并且经硫酸钠干燥。滤出固体并且浓缩母液。通过硅胶快速色谱(10％至100％EtOAc/己烷)纯化残余物，合并产物级分并且减压浓缩，得到(5.02g，77％)224。1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δ8.89(d,J＝1.9Hz,1H),8.35(d,J＝8.3Hz,1H),8.10(d,J＝9.2Hz,1H),7.57(s,1H),7.42(m,2H),7.34-7.15(m,7H),6.81(m,4H),6.09-6.01(m,1H),4.83-4.62(m,2H),4.28(m,J＝16.1,4.2Hz,1H),4.15-3.98(m,1H),3.94-3.77(m,2H),3.75(d,J＝2.6Hz,6H),3.69-3.55(m,4H),3.55-3.37(m,3H),3.30(m,1H),3.16(d,J＝9.9Hz,7H),2.75(t,J＝6.0Hz,1H),2.72-2.63(m,1H),2.50(s,1H),1.47(m,2H),1.38(s,1H),1.27-1.11(m,19H),1.08(d,J＝6.7Hz,4H)。31P NMR(202MHz,乙腈-d3)δ151.08,150.72 19F NMR(376MHz,乙腈-d3)δ-77.04(d,J＝2.7Hz)。
方案6
Figure BDA0002885421910002011
化合物226：将化合物225(6g，9.31mmol)添加至反应烧瓶中。将起始材料溶解于二氯甲烷中并且经由注射器添加三甲胺(5.08ml，37.24mmol)。将三氟乙酸乙酯(3.31g，23.28mmol)逐滴添加至反应物中。通过TLC(100％乙酸乙酯)检查反应物，使用磷钼酸显色，并且减压浓缩。将残余物溶解于二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，并且将有机层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。分离有机层并且用盐水溶液洗涤。随后分离有机层并且经硫酸钠干燥。滤出固体并且浓缩母液。通过硅胶快速色谱(10％至100％EtOAc/己烷)纯化残余物，合并产物级分并且减压浓缩，得到(4.22g，61.2％)226。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.40(t,J＝5.5Hz,1H),7.79(d,J＝7.5Hz,1H),7.43-7.37(m,2H),7.33(t,J＝7.5Hz,2H),7.30-7.23(m,5H),7.18(d,J＝16.4Hz,2H),6.95-6.86(m,4H),5.82(d,J＝2.6Hz,1H),5.50(d,J＝7.5Hz,1H),5.01(d,J＝7.0Hz,1H),4.17(m,1H),3.96(dd,J＝7.2,3.4Hz,1H),3.75(s,6H),3.73(dd,J＝5.0,2.6Hz,1H),3.62(m,2H),3.27(d,J＝3.4Hz,2H),3.17(m,2H),1.50(m,4H),1.29(m,4H)。C38H43F3N4O8的质量计算值：740.78，实验值：739.2(M-H)。
化合物227：将化合物226(4.22g，5.7mmol)添加至反应烧瓶中。将起始材料溶解于二甲基甲酰胺中并且添加苯甲酸酐(1.42g，6.27mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。通过TLC(5％MeOH/DCM)检查反应物，使用磷钼酸显色，并且减压浓缩。将残余物溶解于二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，并且将有机层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。分离有机层并且用盐水溶液洗涤。分离有机层并且经硫酸钠干燥。滤出固体并且浓缩母液。通过硅胶快速色谱(0％至10％MeOH/DCM)纯化残余物，合并产物级分并且减压浓缩，得到(3.41g，71％)227。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.29(s,1H),9.40(t,J＝5.4Hz,1H),8.41(d,J＝7.5Hz,1H),8.04-7.93(m,2H),7.68-7.59(m,1H),7.52(dd,J＝8.3,7.0Hz,2H),7.45-7.39(m,2H),7.35(t,J＝7.7Hz,2H),7.29(dd,J＝7.8,5.4Hz,5H),7.16(d,J＝7.5Hz,1H),6.98-6.89(m,4H),5.84(d,J＝1.4Hz,1H),5.11(d,J＝7.3Hz,1H),4.29(m,1H),4.06(m,1H),3.89-3.82(m,1H),3.77(s,7H),3.72-3.61(m,1H),3.38(m,2H),3.18(m,2H),1.53(m,4H),1.33(m,4H)。C45H47F3N4O9的质量计算值：844.89，实验值：843.3(M-H)。
化合物228：将化合物227(3.41g，4.04mmol)添加至反应烧瓶中，抽空并且用氩气净化。将起始材料溶解于二氯甲烷中，并且经由注射器添加二异丙基乙胺(1.4ml，8.08mmol)。添加N,N-二异丙基氯亚磷酰胺2-氰基乙酯(1.35ml，6.06mmol)并且在室温下搅拌反应物1小时。通过TLC(2/1EtOAc/己烷)检查反应物并且减压浓缩。将残余物溶解于二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，并且将有机层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。分离有机层并且用盐水溶液洗涤。分离有机层并且经硫酸钠干燥。随后滤出固体并且浓缩母液。通过硅胶快速色谱(10％至100％EtOAc/己烷)纯化残余物，合并产物级分并且减压浓缩，得到(3.81g，90.3％)228。1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δ9.15(s,1H),8.48(dd,J＝35.8,7.5Hz,1H),7.98-7.90(m,2H),7.62(m,2H),7.56-7.42(m,5H),7.41-7.23(m,8H),7.04(s,1H),6.94-6.85(m,4H),5.90(dd,J＝6.4,1.2Hz,1H),4.52(m,1H),4.24-3.97(m,4H),3.92-3.81(m,2H),3.81-3.77(m,6H),3.77-3.66(m,3H),3.66-3.41(m,6H),3.25(m,2H),2.75(t,J＝5.9Hz,1H),2.64(m,1H),2.56(s,1H),2.50(d,J＝1.8Hz,0H),2.16(s,2H),1.97(s,0H),1.56(m,5H),1.37(m,5H),1.29-1.09(m,16H),1.03(d,J＝6.8Hz,4H)。31P NMR(202MHz,乙腈-d3)δ151.16,150.18。19F NMR(376MHz,乙腈-d3)δ-77.04(d,J＝2.7Hz)。
方案7
Figure BDA0002885421910002031
化合物230：将化合物229(2.5g，6.54mmol)添加至反应烧瓶中，溶解于最少的水中并且用甲醇稀释。将反应物冷却至0℃，并且经由注射器添加三甲胺(14.27ml，104.64mmol)。添加三氟乙酸乙酯(9.3g，65.4mmol)，监测pH并且调节至约pH 9，并将反应物搅拌3天。通过TLC(15％MeOH/DCM)检查反应物，使用Hessian染色显色，并且减压浓缩。通过反相制备型HPLC，使用5％至35％ACN/H2O的方法经45分钟纯化残余物。将产物洗脱约25分钟。合并产物级分，减压浓缩并且冻干，得到(0.661g，21.1％)230。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.64(s,1H),9.36(t,J＝5.8Hz,1H),7.96(s,1H),6.45(s,2H),5.77(d,J＝6.4Hz,1H),5.14-5.04(m,2H),4.23(m,2H),3.88(m,1H),3.53(m,2H),3.34(m,3H),3.10(m,2H),1.39(m,4H),1.16(m,4H)。C18H25F3N6O6的质量计算值：478.43，实验值：479.2(M+H)。
化合物231：将化合物230(0.65g，1.36mmol)添加至反应烧瓶中。将起始材料溶解于二甲基甲酰胺中，并且经由注射器添加N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(0.903ml，6.8mmol)。将反应物在油浴中加热至60℃持续2.5小时。通过TLC(7％MeOH/DCM)检查反应物，减压浓缩并且高真空干燥过夜。通过硅胶快速色谱(0％至10％MeOH/DCM)纯化残余物，合并产物级分并且减压浓缩，得到(0.504g，69.5％)231。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.37(s,1H),9.36(t,J＝5.8Hz,1H),8.52(s,1H),8.08(s,1H),5.87(d,J＝6.1Hz,1H),5.15(d,J＝5.0Hz,1H),5.07(t,J＝5.5Hz,1H),4.35-4.20(m,2H),3.91(m,1H),3.68-3.49(m,3H),3.37(m,1H),3.14(s,3H),3.10(m,2H),3.02(s,3H),1.39(m,4H),1.16(dd,J＝8.7,5.0Hz,4H)。C21H30F3N7O6的质量计算值：533.51，实验值：534.3(M+H)。
化合物232：将化合物231(0.5g，0.938mmol)及5ml无水吡啶添加至反应烧瓶中。减压脱除吡啶。将此举重复三次并且将反应混合物在高真空下干燥过夜。次日，将4-(二甲氨基)吡啶(0.011g，0.094mmol)及无水吡啶添加至反应烧瓶中。使用冰浴将反应物冷却至0℃。抽空反应闪蒸物并且用氩气净化。将4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(0.352g，1.04mmol)溶解于无水吡啶中，并且经由注射器将所得溶液添加至反应烧瓶中。使反应物达到室温且搅拌过夜。通过TLC(5％MeOH/DCM)检查反应物并且使用Hanessian染色显色。添加甲醇以淬灭反应物，并且减压浓缩反应混合物。将残余物溶解于二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，并且将有机层用饱和碳酸氢钠洗涤。分离有机层并且用盐水溶液洗涤。分离有机层并且经硫酸钠干燥。滤出固体并且浓缩母液。通过硅胶快速色谱(0％至10％MeOH/DCM)纯化残余物，合并产物级分并且减压浓缩，得到(0.621g，79％)232。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.40(s,1H),9.37(t,J＝5.7Hz,1H),8.48(s,1H),7.93(s,1H),7.39-7.31(m,2H),7.30-7.16(m,7H),6.88-6.78(m,4H),5.92(d,J＝5.0Hz,1H),5.19(d,J＝5.7Hz,1H),4.30(m,2H),4.01(m,1H),3.72(s,6H),3.57(m,1H),3.45(m,1H),3.25(dd,J＝10.5,6.0Hz,1H),3.17-3.10(m,2H),3.09(d,J＝5.5Hz,4H),3.01(s,3H),1.41(m,4H),1.19(d,J＝6.5Hz,3H)。C42H48F3N7O8的质量计算值：835.88，实验值：836.4(M+H)。
化合物233：将化合物232(1.20g，1.44mmol)添加至反应烧瓶中，抽空并且用氩气净化。将起始材料溶解于二氯甲烷中，并且经由注射器添加二异丙基乙胺(0.5ml，2.88mmol)。添加N,N-二异丙基氯亚磷酰胺2-氰基乙酯(0.385ml，1.73mmol)并且在室温下搅拌反应物3小时。通过TLC(100％EtOAc)检查反应物，并且减压浓缩。将残余物溶解于二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，并且将有机层用饱和碳酸氢钠洗涤。分离有机层并且用盐水溶液洗涤。随后分离有机层并且经硫酸钠干燥。滤出固体并且浓缩母液。通过硅胶快速色谱(10％至100％EtOAc/己烷)纯化残余物，合并产物级分并且减压浓缩，得到(1.21g，81.2％)233。1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δ9.36(s,1H),8.49(s,1H),7.73(d,J＝10.7Hz,1H),7.64(d,J＝13.4Hz,1H),7.47-7.37(m,2H),7.35-7.16(m,7H),6.83(m,4H),5.97(dd,J＝5.4,2.5Hz,1H),4.61-4.44(m,2H),4.30-4.18(m,1H),4.15-3.98(m,2H),3.76(d,J＝3.2Hz,6H),3.71-3.55(m,4H),3.55-3.41(m,2H),3.38-3.28(m,2H),3.18(m,2H),3.08-3.01(m,5H),2.75(t,J＝5.9Hz,1H),2.65(m,1H),2.46(s,1H),1.52-1.34(m,4H),1.27-1.11(m,18H),1.03(d,J＝6.8Hz,4H)。31P NMR(202MHz,乙腈-d3)δ150.95。19F NMR(376MHz,乙腈-d3)δ-77.04。
方案8
Figure BDA0002885421910002061
化合物235：将化合物234(5g，7.75mmol)添加至反应烧瓶中。将起始材料溶解于二氯甲烷中，并且经由注射器添加三甲胺(4.23ml，31mmol)。将三氟乙酸乙酯(2.75g，19.38mmol)逐滴添加至反应物中。通过TLC(5％MeOH/DCM)检查反应物，使用磷钼酸显色，并且减压浓缩。将残余物溶解于二氯甲烷中，添加至分液漏斗中，并且将有机层用饱和碳酸氢钠洗涤。分离有机层并且用盐水溶液洗涤。随后分离有机层并且经硫酸钠干燥。滤出固体，浓缩母液且置于高真空下，得到(4.32g 75％)235。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.36(d,J＝2.6Hz,2H),9.36(s,1H),7.71(d,J＝8.1Hz,2H),7.36(d,J＝8.4Hz,4H),7.31(t,J＝7.6Hz,4H),7.27-7.20(m,10H),6.89(d,J＝8.5Hz,8H),5.78(d,J＝3.6Hz,2H),5.27(dd,J＝8.1,2.1Hz,2H),5.10(dd,J＝6.7,2.7Hz,2H),4.16(m,2H),3.95(m,2H),3.88(m,2H),3.73(s,13H),3.55(m,4H),3.36(m,1H),3.28(d,J＝4.4Hz,1H),3.22(dd,J＝10.9,2.8Hz,2H),3.14(m,3H),2.11(s,2H),1.48(m,8H),1.36-1.19(m,8H)。C38H42F3N3O9的质量计算值：741.76，实验值：740.2(M-H)。
化合物236：将化合物235(4.3g，5.8mmol)添加至反应烧瓶中，抽空并且用氩气净化。将起始材料溶解于二氯甲烷中，并且经由注射器添加二异丙基乙胺(2.02ml，11.6mmol)。添加N,N-二异丙基氯亚磷酰胺2-氰基乙酯(1.93ml，8.7mmol)并且将反应物在室温下搅拌1至2小时。通过TLC(75％EtOAc/己烷)检查反应物并且减压浓缩。将残余物溶解于乙酸乙酯中，添加至分液漏斗中，并且将有机层用饱和碳酸氢钠洗涤。分离有机层并且用盐水溶液洗涤。随后分离有机层并且经硫酸钠干燥。滤出固体并且浓缩母液。通过硅胶快速色谱(10％至100％EtOAc/己烷)纯化残余物，合并产物级分并且减压浓缩，得到(4.62g，85％)236。1H NMR(400MHz,乙腈-d3)δ9.06(s,1H),7.74(d,J＝8.1Hz,1H),7.49-7.39(m,2H),7.39-7.21(m,7H),6.93-6.83(m,4H),5.84(dd,J＝7.0,3.2Hz,1H),5.21(m,1H),4.45(m,1H),4.20-3.97(m,3H),3.91-3.79(m,1H),3.77(d,J＝2.4Hz,7H),3.63(m,4H),3.48-3.31(m,3H),3.23(m,1H),2.67(m,1H),2.52(t,J＝6.0Hz,1H),2.08(d,J＝1.9Hz,1H),1.64-1.45(m,4H),1.42-1.28(m,4H),1.27-1.09(m,9H),1.05(d,J＝6.7Hz,3H)。31P NMR(162MHz,乙腈-d3)δ149.53,149.06。19F NMR(376MHz,乙腈-d3)δ-83.43,-83.89(d,J＝2.4Hz)。
实例3：配体(例如亲脂性部分)与siRNA的合成后缀合
方案9
Figure BDA0002885421910002071
方案10
Figure BDA0002885421910002081
各种配体，包括各种亲脂性部分，可经由合成后缀合方法与siRNA剂缀合，如方案9及10中所示。
实例4：用于5’-缀合的亲脂性亚磷酰胺的合成
方案11
Figure BDA0002885421910002082
化合物101a-g：在肽偶联条件下，用烷基羧酸处理化合物100(1g)。将烷基羧酸加入二氯甲烷中并且用HBTU及DIEA处理几分钟。将胺添加至反应混合物中并且搅拌2小时。通过TLC监测反应物，用碳酸氢盐水溶液及盐水洗涤。将有机层经硫酸钠干燥，并且通过硅胶色谱纯化粗产物，得到化合物101a-g。如实例1(方案4)中所示，通过在DIEA存在下用胺基酸酯试剂处理这些分子来制备这些分子的亚磷酰胺，得到化合物102a-g。
方案12
Figure BDA0002885421910002091
如方案12中所示，通过如实例1中所示用亚磷酰胺试剂治疗醇来制备亚磷酰胺，得到化合物104a-g：
实例5：硫代胆固醇胺基酸酯及CPG的合成
方案13. 4-羟基-L-脯氨醇-硫代胆固醇亚磷酰胺的合成
Figure BDA0002885421910002092
N-(6-{2-[双-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-4-羟基-吡咯啶-1-基}-6-氧代-己基)-3-(吡啶-2-基二硫基)-丙酰胺(7)
如方案13中所示，将胺5(7.7g，14.5mmol)溶解于无水二氯甲烷(40mL)中并且冷却至0℃。向溶液中依次添加三乙胺(3.0g，4.2mL，30mmol)及3-(吡啶-2-基二硫基)-丙酸琥珀酸酯6(SPDP)(4.5g，14.4mmol)。使反应温度达到环境温度且再搅拌16小时。通过TLC(10％MeOH/CHCl3，Rf＝0.6)确定反应完成。将反应混合物用二氯甲烷稀释并且用饱和NaHCO3、水及随后盐水洗涤。将有机层经硫酸钠干燥，过滤且真空浓缩，得到粗产物。在硅胶柱色谱后，获得呈白色泡沫固体状的化合物7(10.58g，78％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.45(d,1H),7.9(m,1H),7.8(m,1H),7.76(m,1H),7.3(m,4H),7.18(m,5H),6.86(m,4H),4.98(d,-OH,1H),4.38(m,1H),4.1(m,1H)(s,6H),3.56(m,1H),3.46(m,1H),3.21-3.34(m,3H),3.14(m,1H),3(m,2H),2.48(m,2H),2.2(m,2H),1.8-2.02(m,2H),1.1-1.5(4H)。13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ.171.32,169.97,159.36,158.31,158.18,149.80,145.27,138.08,136.1,135.9,129.8,128.0,127.7,121.4,119.3,113.3,85.338,68.7,55.3,34.75,34.28,29.1,26.3,24.36。
4-羟基-L-脯氨醇-硫代胆固醇-DMT-醇(8)
在氩气下，将化合物7(7.5g，10.28mmol)溶解于无水二氯甲烷(75mL)中并且冷却至0℃。向此溶液中添加二异丙基乙胺(2.71g，3.66mL，21mmol)，随后添加硫代胆固醇(4.145g，10.28mmol)。使反应混合物达到环境温度并且再搅拌16小时。通过TLC(100％乙酸乙酯，Rf＝0.6)确定反应完成。减压浓缩反应混合物并且对残余物进行硅胶柱色谱。用4L乙酸乙酯洗脱后，用5％MeOH/二氯甲烷(2L)洗脱柱，获得呈白色泡沫固体状的化合物8(8g，76％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.88(m,1H),7.3(m,4H),7.17(m,5H),6.84(m,4H),5.3(bs,1H),4.89(d,-OH),4.38(m,1H),4.1(m,1H),3.72(s,6H),3.56(m,1H),3.32(m,1H),3.14(m,1H),3(m,3H),2.84(m,2H),2.64(m,1H),2.42(m,2H),2.2(m,3H),1.8-2.0(m,7H),0.8-1.54(m,35H),0.62(s,3H)。13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ170.8,158.0,157.9,155.6,145.0,139.7,135.8,135.7,129.5,127.7,127.5,121.7,113.1,113.0,85.7,85.1,72.7,68.5,63.3,60.72,56.1,55.5,55.28,54.9,49.4,41.8,36.5,35.2,31.3,30.35,27.7,27.3,26.0,24.1,23.8,23.2,22.6,22.3,21.11,20.5,19.43,18.9,18.5,14.4,11.6。
4-羟基-L-脯氨醇-硫代胆固醇亚磷酰胺(9)
将化合物8(5.7g，5.58mmol)与无水甲苯(50mL)共蒸发。向残余物中添加N,N-四异丙基四唑铵(0.315g，2.79mmol)，并且将混合物在真空烘箱中在40℃下经P2O5干燥过夜。将反应混合物溶解于二氯甲烷(20mL)中，并且添加2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰胺(2.48g，2.72mL，8.25mmol)。将反应混合物在环境温度下搅拌过夜。通过TLC(Rf＝0.9，在乙酸乙酯中)确定反应完成。将反应混合物用二氯甲烷(50mL)稀释并且用5％NaHCO3(50mL)及盐水(50mL)洗涤。有机层经无水Na2SO4干燥，过滤且减压浓缩。残余物在硅胶上(50:49:1，EtOAc:己烷:三乙胺)纯化，得到呈白色泡沫固体状的9(6.1g，89％)。1H NMR(400MHz,C6D6):δ7.62(m,2H),7.45(m,5H),7.24(m,2H),7.1(m,1H),6.82(m,4H),5.64(m,1H),5.38(m,1H),4.7(m,1H),4.54(m,2H),3.78(m,2H),3.5(m,3H),3.36(m,9H),3.22(m,4H),3.06(m,3H),2.72(m,1H),2.32-2.54(m,5H),1.8-2.2(m,10H),1.08-1.74(m,28H),1.3(m,6H),0.94(m,12H),0.67(s,3H)。31P NMR(161.82MHz,C6D6):δ146.05,145.91,145.66,145.1613C NMR(100MHz,C6D6):δ171.43,171.25,169.87,159.25,159.11,146.08,141.59,136.66,136.6,130.62,130.54,128.63,127.53,127.02,121.53,117.73,117.57,113.66,113.57,86.59,86.54,64.36,58.56,58.37,58.30,56.96,56.51,56.07,54.86,54.77,50.57,50.27,43.48,43.35,42.55,40.13,39.9,39.75,39.56,38.70,36.94,36.64,36.29,36.19,35.90,34.58,32.24,32.08,29.48,29.03,28.98,28.6,28.38,26.54,24.68,24.61,24.54,23.6,23.0,22.74,21.26,20.03,19.9,19.38,19.01,12.06。
方案14.用硫代胆固醇固定的聚合物支撑物的合成
Figure BDA0002885421910002121
4-羟基-L-脯氨醇-硫代胆固醇-琥珀酸酯(10)
如方案14中所示，将化合物8(2.2g，2.15mmol)与琥珀酸酐(0.323g，3.23mmol)及DMAP(0.026g，0.215mmol)混合，并且在40℃下真空干燥过夜。将混合物溶解于无水二氯甲烷(10mL)中。随后添加三乙胺(0.708g，0.976mL，7mmol)，并且在氩气气氛下在室温下搅拌溶液16小时。随后将其用二氯甲烷(50mL)稀释，并且用冰冷的柠檬酸水溶液(5％wt.，25mL)及水(2x25mL)洗涤。有机相经无水硫酸钠干燥并且浓缩至干。通过快速硅胶柱色谱纯化粗产物，得到呈白色泡沫固体状的化合物10(2.2g，92％产率；Rf＝0.6s，在10％MeOH/CHCl3中)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.22(bs,1H),7.84(m,1H),7.25(m,4H),7.2(m,5H),6.86(m,4H),5.36(m,2H),4.18(bs,1H),3.72(s,6H),3.4-3.6(m,2H),3.2(m,1H),3.0(m,4H),2.84(m,2H),2.64(m,2H),2.4-2.52(m,12H),2.2(m,6H),1.9(m,8H),0.8-1.52(m,28H),0.65(s,3H)。13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ173.35,171.94,170.63,169.64,157.99,144.96,141.02,135.72,129.61,127.81,127.55,113.12,56.15,54.99,52.28,49.58,49.06,41.82,36.17,34.97,33.41,33.09,31.32,27.39,23.16,22.68,22.39,20.56,18.95,18.54,11.66,6.02,5.0
具有固定化硫代胆固醇的固体支撑物(11)
将琥珀酸酯10(2.1g，1.9mmol)溶解于二氯乙烷(8mL)中。向该溶液中添加DMAP(0.228g，1.9mmol)。依次添加含2,2’-二硫基-双(5-硝基吡啶)(0.58g，1.9mmol)的乙腈/二氯乙烷(3:1，8mL)。向所得溶液中添加含三苯基膦(0.49g，1.9mmol)的乙腈(4ml)。反应混合物变成亮橙色。使用腕式震荡器(5min)短暂搅拌溶液。添加长链烷基胺-CPG(LCAA-CPG)(12g，1860μmol，155μm/g)。将悬浮液搅拌4小时。将CPG通过烧结漏斗过滤，并且依次用乙腈、二氯甲烷及乙醚洗涤。使用乙酸酐/吡啶掩蔽未反应的氨基。通过采用UV测量来测量CPG11的负载能力。(57μM/g)。
实例6：通过点击化学合成2’-O亲脂性缀合物
方案15
Figure BDA0002885421910002131
化合物22a的合成：将市售炔丙基U 20a(5.8g，10mmol)溶解于THF(40mL)中，并且添加叔丁醇(40mL)，随后添加硫酸铜(1g)。向此混合物中添加抗坏血酸钠水溶液，随后添加己基叠氮化物。将混合物在室温下搅拌过夜。反应的TLC显示次日完成，并且反应物在旋转蒸发器中浓缩。将残余物溶解于二氯甲烷(100mL)中，溶液通过硅藻土过滤，并且将滤液在浓缩及柱纯化后，得到呈白色固体状的纯产物22a(6.99g，96％)。
化合物22b的合成：使用用于U的类似方法，将炔丙基C 20b(6.2g，10mmol)转化成呈白色固体状的相应点击产物22b(5.9g，78％)。
化合物22c的合成：使用用于U的类似方法，将炔丙基A 20c(7.1g，10mmol)转化成呈白色固体状的相应点击产物22c(7.9g，96％)。
化合物22d的合成：使用对于U所描述的类似方法，将炔丙基G22d(6.9g，10mmol)转化成呈灰白色粉末状的相应点击产物22d(7.9g，96％)。
胺基磷酸酯23a-d的合成：化合物22a-d在DIEA存在下用亚磷酰胺试剂处理，得到23a-d。
实例7：经核碱基修饰的缀合物(嘧啶)的合成
1. 5-碘尿苷衍生物的合成
方案16.2’-O-甲基-5-碘尿苷亚磷酰胺(4)的合成
Figure BDA0002885421910002141
2’-O-甲基-5-碘尿苷(2)
在室温下，将ICl(8.6mL，174mmol)添加至2’-O-甲基尿苷1(25.0g，96.8mmol)于MeOH(400mL)中的溶液中。使反应混合物回流15小时。真空浓缩所得混合物。将DCM(200mL)添加至获得的粗残余物(58.1g)中，随后通过过滤收集沉淀且用DCM洗涤，得到呈白色粉末状的化合物2(36.7g，99％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:3.31(s,2H),3.37(s,3H),3.53-3.59(m,1H),3.67-3.72(m,1H),3.78(t,J＝4.5Hz,1H),3.85(qu,J＝3.0Hz,1H),4.10(q,J＝6.0Hz,1H),5.12(d,J＝6.0Hz,1H),5.30(t,J＝6.0Hz,1H),5.78(d,J＝4.0Hz,1H),8.52(s,1H),11.69(s,1H)。
5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-甲基-5-碘尿苷(3)
在Ar氛围下，在0℃下将DMTrCl(33.9g，100mmol)添加至化合物3(36.6g，95.3mmol)于无水吡啶(400mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌14小时。随后，将反应物用MeOH淬灭且用EtOAc稀释。将有机层用水及盐水洗涤，经Na2SO4干燥且真空浓缩。通过柱色谱(0％-50％EtOAc在正己烷中)来纯化粗残余物(108g)，以给出呈白色泡沫状的化合物3(53.4g，82％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:3.17(dd,J＝3.0,10.5Hz,1H),3.17(dd,J＝5.0,10.5Hz,1H),3.39(s,3H),3.73(s,6H),3.91-3.97(m,2H),4.15(q,J＝6.5Hz,1H),5.19(d,J＝6.5Hz,1H),5.78(d,J＝4.0Hz,1H),6.87-7.41(m,13H),7.99(s,1H),11.77(s,1H)。
3’-O-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦基]-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-甲基-5-碘尿苷(4)
在Ar氛围下，在0℃下将DIPEA(1.2mL，7.30mmol)及i-Pr2NP(Cl)O(CH2)2CN(0.39mL，1.75mmol)添加至化合物3(1.00g，1.46mmol)于无水DCM(15mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌2小时。反应物随后用饱和NaHCO3淬灭并且用EtOAc萃取。将合并的有机层用水及盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且真空浓缩。通过柱色谱(60％EtOAc在正己烷中)来纯化粗残余物(1.46g)，以给出呈白色泡沫状的化合物4(841mg，65％)。
方案17. 2’-脱氧-2’-(R)-氟-5-碘尿苷亚磷酰胺(8)的合成
Figure BDA0002885421910002151
2’-脱氧-2’-(R)-氟-5-碘尿苷(6)
在室温下，将ICl(7.3mL，146mmol)添加至2’-脱氧-2’-氟尿苷5(20.0g，81.2mmol)于MeOH(400mL)中的溶液中。使反应混合物回流17小时。真空浓缩所得混合物。将DCM(200mL)添加至获得的粗残余物(49.1g)，随后通过过滤收集沉淀并且用DCM洗涤，得到呈白色粉末状的化合物6(29.6g，97％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:3.56-3.61(m,1H),3.77-3.82(m,1H),3.86-3.89(m,1H),4.09-4.21(m,1H),5.01(ddd,J＝1.5,5.0,53.0Hz,1H),5.37(t,J＝4.5Hz,1H),5.58(d,J＝6.5Hz,1H),5.84(dd,J＝1.5,17.0Hz,1H),8.51(s,1H),11.71(s,1H)。
2’-脱氧-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-(R)-氟-5-碘尿苷(7)
在Ar氛围下，在0℃下将DMTrCl(28.1g，83.0mmol)添加至化合物6(29.4g，79.0mmol)于无水吡啶(400mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌2小时。随后，将反应物用MeOH淬灭且用EtOAc稀释。将有机层用水及盐水洗涤，经Na2SO4干燥且真空浓缩。通过柱色谱(0％-50％EtOAc在正己烷中)来纯化粗残余物(98.8g)，以给出呈黄色泡沫状的化合物7(49.5g，93％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:3.20-3.25(m,2H),3.72(s,6H),3.97-4.01(m,1H),4.26-4.36(m,1H),5.16(dd,J＝4.5,53.0Hz,1H),5.60(d,J＝7.0Hz,1H),5.82(d,J＝20.5Hz,1H),6.85-7.41(m,13H),8.06(s,1H),11.81(s,1H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:55.0,62.4,68.1(d,J＝13.0Hz),69.7,81.3,85.6,89.4(d,J＝28.0Hz),93.3(d,J＝146Hz),113.2,126.7,127.6,127.9,129.7,135.3,135.4,144.7,145.0,149.8,158.0,158.1,160.6；C30H29FIN2O7(MH+)的HRMS计算值675.0998。
3’-O-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦基]-2’-脱氧-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-(R)-氟-5-碘尿苷(8)
在Ar氛围下，在0℃下将DIPEA(1.5mL，8.90mmol)及i-Pr2NP(Cl)O(CH2)2CN(0.48mL，2.14mmol)添加至化合物7(1.20g，1.78mmol)于无水DCM(15mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌2小时。将反应物随后用饱和NaHCO3淬灭且用EtOAc萃取。将合并的有机层用水及盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且真空浓缩。通过柱色谱(60％EtOAc在正己烷中)来纯化粗残余物(1.71g)，以给出呈白色泡沫状的化合物8(1.29g，83％)。
方案18.LNA-5-碘尿苷亚磷酰胺12的合成
Figure BDA0002885421910002171
化合物12的合成：化合物12(LNA衍生物)经由与方案2中的化合物8类似的方法合成
2. 5-碘胞苷衍生物的合成
方案19. 2’-O-甲基-5-碘胞苷亚磷酰胺(15)的合成
Figure BDA0002885421910002172
5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-甲基-5-碘胞苷(13)
在Ar氛围下，在0℃下将Et3N(8.1mL，58.2mmol)及TMSCl(1.8mL，14.6mmol)添加至3(5.00g，7.28mmol)于无水MeCN(50mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌18小时。随后减压浓缩反应混合物。将残余物溶解于DCM中并且用水及盐水洗涤，经Na2SO4干燥。蒸发溶剂形成泡沫(6.21g)，将其在Ar氛围下溶解于无水MeCN(50mL)中。随后，在-40℃下，将Et3N(15.3mL，110mmol)、1,2,4-三唑(5.04g，73.0mmol)及POCl3(1.3mL，14.6mmol)添加至此溶液中。将反应混合物在0℃下搅拌3小时，用饱和NaHCO3淬灭并且用EtOAc萃取。将有机层用H2O及盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且真空浓缩。随后，在室温下将28％NH3水溶液(3.0mL)添加至获得的粗材料(6.32g)于THF(18mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌15小时。将反应混合物溶解于DCM中。将有机层用水及盐水洗涤，经Na2SO4干燥且真空浓缩。通过柱色谱(0％-10％MeOH在DCM中)来纯化粗残余物(6.10g)，以给出呈白色泡沫状的化合物13(3.29g，66％，3步)。
N4-苯甲酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-甲基-5-碘胞苷(14)
在Ar氛围下，在室温下将Bz2O(1.02g，4.49mmol)添加至化合物13(2.80g，4.08mmol)于无水DMF(10mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌15小时。随后，真空浓缩反应混合物。通过柱色谱(30％-50％EtOAc在正己烷中)来纯化粗残余物(4.14g)，以给出呈黄色泡沫状的化合物14(1.84g，57％)。
N4-苯甲酰基-3’-O-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦基]-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-甲基-5-碘胞苷(15)
在Ar氛围下，在0℃下将DIPEA(0.54mL，3.17mmol)及i-Pr2NP(Cl)O(CH2)2CN(0.17mL，0.769mmol)添加至化合物14(500mg，0.633mmol)于无水DCM(5.0mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌3小时。将反应物随后用饱和NaHCO3淬灭且用EtOAc萃取。将合并的有机层用水及盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且真空浓缩。通过柱色谱(20％-40％EtOAc在正己烷中)来纯化粗残余物(677mg)，以给出呈白色泡沫状的化合物15(400mg，64％)。
方案20. 2’-脱氧-2’-(R)-氟-5-碘尿苷亚磷酰胺(18)的合成
Figure BDA0002885421910002181
2’-脱氧-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-(R)-氟-5-碘胞苷(16)
在Ar氛围下，在0℃下将Et3N(3.5mL，24.9mmol)及TMSCl(0.79mL，6.23mmol)添加至7(2.10g，3.11mmol)于无水MeCN(20mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌15小时。随后减压浓缩反应混合物。将残余物溶解于DCM中，用水及盐水洗涤，并且经Na2SO4干燥。蒸发溶剂形成泡沫(2.50g)，将其在Ar氛围下溶解于无水MeCN(20mL)中。随后，在-40℃下将Et3N(6.5mL，46.7mmol)、1,2,4-三唑(2.15g，31.1mmol)及POCl3(0.57mL，6.23mmol)添加至此溶液中。将反应混合物在0℃下搅拌3小时，用饱和NaHCO3淬灭并且用EtOAc萃取。将有机层用H2O及盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且真空浓缩。随后，在室温下将28％NH3水溶液(1.5mL)添加至获得的粗材料(2.49g)于THF(9.0mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌15小时。将反应混合物溶解于DCM中。将有机层用水及盐水洗涤，经Na2SO4干燥且真空浓缩。通过柱色谱(0％-10％MeOH在DCM中)来纯化粗残余物(2.88g)，以给出呈棕色泡沫状的化合物16(1.48g，70％，3步)。
N4-苯甲酰基-2’-脱氧-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-(R)-氟-5-碘胞苷(17)
在Ar氛围下，在室温下将Bz2O(480mg，2.12mmol)添加至化合物16(1.30g，1.93mmol)于无水DMF(8.0mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌15小时。随后，真空浓缩反应混合物。通过柱色谱(30％-50％EtOAc在正己烷中)来纯化粗残余物(2.00g)，以给出呈黄色泡沫状的化合物17(889mg，59％)。
N4-苯甲酰基-3’-O-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦基]-2’-脱氧-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-(R)-氟-5-碘-胞苷(18)
在Ar氛围下，在0℃下将DIPEA(0.29mL，1.67mmol)及i-Pr2NP(Cl)O(CH2)2CN(90μL，0.401mmol)添加至化合物17(260mg，0.334mmol)于无水DCM(5.0mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌3小时。反应物随后用饱和NaHCO3淬灭并且用EtOAc萃取。将合并的有机层用水及盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且真空浓缩。通过柱色谱(20％-40％EtOAc在正己烷中)来纯化粗残余物(375mg)，以给出呈白色泡沫状的化合物18(280mg，86％)。
方案21.LNA-5-碘胞苷亚磷酰胺(21)的合成
Figure BDA0002885421910002201
化合物21的合成：使用与方案20中的化合物18类似的方法合成化合物21。
3.配体缀合的硼酸酯的合成
方案22
Figure BDA0002885421910002202
(E)-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊-2-基)烯丙基胺基甲酸叔丁酯(22)
在Ar氛围下，在0℃下将含炔丙胺(5.0g，90.8mmol)的无水DCM(100mL)添加至Et3N(25.3mL，182mmol)及二碳酸二叔丁酯(22.9mL，99.9mmol)于无水DCM(200mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌3小时。将反应物随后用饱和NH4Cl淬灭且用EtOAc稀释。将有机层用饱和NH4Cl及盐水洗涤，经Na2SO4干燥且真空浓缩，得到呈棕色油状的粗N-Boc-炔丙胺(12.6g)。随后，在Ar氛围下，在室温下将频哪醇硼烷(17.8mL，123mmol)、Et3N(1.1mL，8.18mmol)及ZrCp2HCl(2.11g，8.18mmol)添加至此粗材料中。使反应混合物回流15小时。随后在0℃下用饱和NH4Cl淬灭反应物，并且用EtOAc稀释此所得混合物。将有机层用饱和NH4Cl及盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且真空浓缩。通过柱色谱(10％-20％EtOAc在正己烷中)来纯化粗残余物(35.9g)，以给出呈黄色油状的化合物22(14.0g，54％，2步)。
方案23
Figure BDA0002885421910002211
(E)-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊-2-基)烯丙基胺基甲酸胆固醇酯(24)
将化合物22(2.60g，9.18mmol)溶解于CF3COOH/DCM(9:1，100mL)中并且在室温下搅拌3小时。接着真空浓缩所得混合物且通过共蒸发(3x甲苯，3x DCM)移除剩余的CF3COOH，得到呈棕色油状的粗TFA铵盐(3.01g)。在Ar氛围下，在室温下将Et3N(3.8mL，27.5mmol)及氯甲酸胆固醇酯(4.33g，9.64mmol)添加至此粗胺于无水DCM(50mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌3小时。随后用饱和NaHCO3淬灭反应物。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且真空浓缩。通过柱色谱(二氧化硅100g；溶剂：10％-20％EtOAc在正己烷中)来纯化粗残余物(6.90g)，以给出呈白色泡沫状的化合物24(4.76g，87％，2步)。
方案24
Figure BDA0002885421910002221
4.通过铃木-宫浦交叉偶联缀合方案25
Figure BDA0002885421910002222
方案26
Figure BDA0002885421910002231
如方案25-26中所示，将寡核苷酸的单链与配体(诸如亲脂性部分)缀合，纯化产物，随后与互补链杂交，得到siRNA缀合物。
方案27.在CPG上缀合
Figure BDA0002885421910002232
方案27展示将配体(诸如亲脂性部分)与附接至CPG的RNA缀合的方法。
实例8：官能化的生物可裂解接头及亚磷酰胺
方案28.各种碳水化合物(半乳糖、半乳糖胺、葡萄糖、葡糖胺、甘露糖、甘露糖胺衍生物或戊糖衍生物)。
Figure BDA0002885421910002241
Figure BDA0002885421910002251
在固体支撑物上合成siRNA缀合物，连续添加方案28中所示的可裂解接头中的一个或多个，并且随后与互补链杂交，如图3中所示。
实例9.官能化的可裂解接头及亚磷酰胺
方案29.各种经修饰的碳水化合物(半乳糖、半乳糖胺、葡萄糖、葡糖胺、甘露糖、甘露糖胺衍生物的二糖或三糖)
Figure BDA0002885421910002252
Figure BDA0002885421910002261
在固体支撑物上合成siRNA缀合物，连续添加方案29中所示的可裂解接头中的一个或多个，并且随后与互补链杂交，如图3中所示。
实例10：官能化的蛋白酶可裂解接头及亚磷酰胺
方案30
Figure BDA0002885421910002262
在固体支撑物上合成siRNA缀合物，连续添加方案30中所示的可裂解接头中的一个或多个，并且随后与互补链杂交，如图3中所示。
实例11：小鼠眼中的mRNA敲低
用表1a中所列的siRNA缀合物在野生型C57BL/6小鼠(n＝5)中研究β联蛋白基因沉默，随后以7.5μg/眼(1.5μL)玻璃体内注射，在第14天处死小鼠。结果显示于图4中。
表1a.用于小鼠玻璃体内注射的siRNA双链体。
Figure BDA0002885421910002271
Figure BDA0002885421910002281
*斜体的大写及小写字母分别表示对腺苷、胞苷、鸟苷及尿苷的2’-脱氧-2’-氟(2′-F)及2’-O-甲基(2′-OMe)糖修饰；s表示硫代磷酸酯(PS)键；VP-乙烯基膦酸酯；Uhd，2’-O-十六烷基尿苷’；Tam，2’-O-(N-甲基乙酰胺)胸苷
Figure BDA0002885421910002282
表1b.表1a中所列的siRNA双链体的有义链修饰的简要描述。
Figure BDA0002885421910002283
Figure BDA0002885421910002291
实例12：CNS中的mRNA敲低
表2.CNS研究中用于鞘内注射的siRNA双链体
Figure BDA0002885421910002292
Nf表示2’-脱氧-2’-氟(2′-F)，小写字母表示2′-O-甲基(2′-OMe)核苷酸；s表示硫代磷酸酯(PS)键；VP，乙烯基膦酸酯；Uhd，2’-O-十六烷基尿苷’；Tam，2’-O-(N-甲基乙酰胺)胸苷；靶基因转录物：SOD1，超氧化歧化酶1；b-cat，β-联蛋白。
Figure BDA0002885421910002301
在以0.9mg剂量的单次鞘内注射后，与内源性对照及β联蛋白处理组相比，用表2中所列的siRNA缀合物研究斯普拉-道来大鼠皮质中SOD1 mRNA的基因沉默(平均值±SD水平)。结果显示于图5中。
在以0.9mg剂量的单次鞘内注射后，与内源性对照及β联蛋白处理组相比，用表2中所列的siRNA缀合物研究斯普拉-道来大鼠小脑中SOD1 mRNA的基因沉默(平均值±SD水平)。结果显示于图6中。
在以0.9mg剂量的单次鞘内注射后，与内源性对照及β联蛋白处理组相比，用表2中所列的siRNA缀合物研究斯普拉-道来大鼠颈椎中SOD1 mRNA的基因沉默(平均值±SD水平)。结果显示于图7中。
在以0.9mg剂量的单次鞘内注射后，与内源性对照及β联蛋白处理组相比，用表2中所列的siRNA缀合物研究斯普拉-道来大鼠腰椎中SOD1 mRNA的基因沉默(平均值±SD水平)。结果显示于图8中。
在以0.9mg剂量的单次鞘内注射后，与内源性对照及β联蛋白处理组相比，用表2中所列的siRNA缀合物研究斯普拉-道来大鼠胸椎中SOD1 mRNA的基因沉默(平均值±SD水平)。结果显示于图9中。
实例13：亲脂性修饰(C16)在siRNA序列中的位置影响
使用GalNAc缀合物(基于两个F12序列，如表3中所示)在小鼠肝细胞中评估亲脂性修饰的位置在整个siRNA序列中对有义链及反义链的影响。将细胞与2.5及250nM浓度的各siRNA缀合物(列于表3中)一起孵育以进行自由摄取(无转染剂)，并且在24小时后通过RT-qPCR测量F12 mRNA(如图10及图11中所示)。将每孔2.5μL来自表3的各siRNA添加至384孔盘中含有约5x103PMH细胞的40μL William’s E培养基(生命技术公司(Life Technology))中。在RNA纯化之前，将细胞在37℃，5％CO2下孵育24小时。将值绘制为未处理对照细胞的分数。各样品以技术性一式二份运行，并且各点代表2个生物样品的平均值±％误差。GAPDH充当内部对照，并且相对未处理的对照绘制剩余F12 mRNA的值。在初级食蟹猴肝细胞的一个内部位置具有C16修饰的F12 siRNA的体外活性显示在siRNA双链体中存在耐受C16-缀合物的区域并且所有位置的活性并不同等。
表3.用于在整个siRNA序列(F12)中进行亲脂性修饰(C16)的位置影响的siRNA
Figure BDA0002885421910002311
Figure BDA0002885421910002321
Figure BDA0002885421910002331
Figure BDA0002885421910002341
Figure BDA0002885421910002351
Figure BDA0002885421910002361
Figure BDA0002885421910002371
Figure BDA0002885421910002381
*斜体的大写及小写字母分别表示对腺苷、胞苷、鸟苷及尿苷的2’-脱氧-2’-氟(2′-F)及2’-O-甲基(2′-OMe)糖修饰；s表示硫代磷酸酯(PS)键；VP-乙烯基膦酸酯乙烯基膦酸酯；Nhd，2’-O-十六烷基；Tam，2’-O-(N-甲基乙酰胺)胸苷。
Figure BDA0002885421910002391
实例14.C16 siRNA缀合物的血浆蛋白结合。
使用电泳迁移率变化测定(EMSA)确定具有亲脂性修饰的siRNA双链体的蛋白质(使用人类血清白蛋白)结合特征。将双链体与人类血清白蛋白一起孵育，并且确定未结合的部分。关于方案的详情如下。将储备浓度为10μM的双链体稀释至在1x PBS中含有0、20％或90％血清的0.5μM(20μL总体积)的最终浓度。将样品混合，离心30秒，并且随后在室温下孵育10分钟。在孵育完成后，将4μL 6x EMSA凝胶加载溶液添加至各样品中，离心30秒，并且将12μL各样品加载于26孔BioRad 10％PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)上。凝胶在100伏下运行1小时。在运行完成后，从外壳中移出凝胶且在50mL 10％TBE(Tris碱、硼酸及EDTA)中洗涤。洗涤完成后，将5μL SYBR Gold添加至凝胶中，使其在室温下孵育10分钟，并且再在50mL10％TBE中洗涤凝胶。使用Gel Doc XR+凝胶记录系统使用以下参数读取凝胶：成像应用设置为SYBR Gold，尺寸设置为Bio-Rad标准凝胶，曝光设置为自动用于强烈的条带，高光饱和像素转为1并且颜色设置为灰色。检测、分子量分析及输出均被禁用。一旦获得干净的凝胶照片，使用Image Lab 5.2处理图像。手动设置泳道及条带以测量条带强度。每个样品的条带强度相对于PBS标准化以获得未结合的siRNA的分数。从此测量结果确定相对疏水性并且绘制在图12中。双链体的一些区域呈现中等蛋白质结合，并且此在体外转化为更好的活性(参见实例13)
实例15：血浆蛋白结合的Kd值(与疏水性的相关性)的测定-较低的数字表示紧密结合。
人类血清白蛋白与寡核苷酸的Kd测定方法：将BioRad 10％TBE凝胶在100伏下预运行20分钟。将储备浓度为10μM的双链体稀释至含有各种浓度人类血清白蛋白(0μM至1000μM，增量为100)的0.5μM(20μL总体积)的最终浓度。将样品混合，离心30秒，并且随后在室温下孵育10分钟。在孵育完成后，将4μL 6x EMSA凝胶加载溶液添加至每个样品中，离心30秒，并且将12μL各样品加载于26孔BioRad 10％TBE凝胶上。将凝胶在50伏下运行约20分钟，以使整个样品加载至凝胶上。一旦样品完全加载，将凝胶在100伏下运行1小时。在运行完成后，从外壳中移出凝胶并且在50mL 10％TBE中洗涤。洗涤完成后，将5μL SYBR Gold添加至凝胶中，使其在室温下孵育10分钟，并且再在50mL 10％TBE中洗涤凝胶。使用Gel Doc XR+凝胶记录系统使用以下参数读取凝胶：成像应用设置为SYBR Gold，尺寸设置为Bio-Rad标准凝胶，曝光设置为自动用于强烈的条带，高光饱和像素转为1并且颜色设置为灰色。检测、分子量分析及输出均被禁用。一旦获得干净的凝胶照片，使用Image Lab 5.2处理图像。手动设置泳道及条带以测量条带强度。每个样品的条带强度相对于无HSA的双链体标准化，以获得结合的siRNA相对于HSA浓度的分数。结果显示于表4-5中。
表4.
ID HSA结合的Kd值
AD-64228 NA
AD-74957 8.94μm
AD-74954 155μm
A-131350 266.4
A-150425 353.4
表5.
Figure BDA0002885421910002411
实例16：siRNA缀合物的鞘内递送(IT)-大鼠中的单剂量时程
方案16-A.用于CNS研究中的鞘内注射的方案及siRNA双链体
Figure BDA0002885421910002412
在0.9mg剂量的单次鞘内注射后，用上述方案16-A中所示的表中所列的siRNA缀合物研究大鼠中的SOD1基因沉默及β-联蛋白基因沉默。结果显示于图13-15中。
图13B显示所测试的脑及脊髓的所有区域。图13A及13C显示在大鼠中siRNA双链体的单次IT给药后SOD1在图13B中所示的各种区域中沉默的结果。如图13A及13C中所示，在所测试的脑及脊髓的所有区域中均见到持久的SOD1 mRNA沉默。图14A-14B显示在单次IT给药后β-联蛋白沉默的结果。如图14A-14B中所示，在所测试的脑及脊髓的所有区域中均见到持久的β-联蛋白沉默。图15显示在大鼠中siRNA双链体的单次IT给药后SOD1在各个区域中沉默的结果。图15A显示与未缀合的siRNA水平相比，CSF中的缀合的siRNA水平。如图所示，对于缀合的siRNA，发现CSF的快速siRNA清除。图15B显示与未缀合的siRNA水平相比，脑中的缀合的siRNA水平。如图所示，发现缀合的siRNA在脑中具有优于未缀合的siRNA的摄取及稳定性。图15C显示与未缀合的siRNA水平及对照siRNA水平相比，小脑中的缀合的siRNA水平。如图所示，缀合的siRNA在脑中的摄取增加导致mRNA敲低的显著改进，从而表明靶向沉默。图15A-15C示出在具有SOD1 siRNA缀合物的脑中观察到更高的药物水平及稳固的沉默。
实例17：进一步改进SOD1 siRNA
表6.
Figure BDA0002885421910002421
Figure BDA0002885421910002431
表6显示用不同化学方法修饰的SOD1 siRNA。对照为aCSF。图16A-16B显示用不同剂量的不同化学方法修饰的SOD1 siRNA使SOD1沉默的结果。如图16A-16B所示，与亲本SOD1siRNA相比，用经修饰的SOD1 siRNA在低10倍的剂量水平下实现优异的沉默。
实例18：评估CNS siRNA缀合物向非人类灵长类动物(NHP)递送的转化-单剂量NHP设计
方案18-A.用于CNS研究中的鞘内注射的方案及siRNA双链体
Figure BDA0002885421910002432
在72mg推注剂量的单次鞘内注射后，用上述方案18-A中所示的表中所列的siRNA缀合物研究非人类灵长类动物中的β-联蛋白基因沉默。结果显示于图17-23中。
图17显示在第31天，在示例性siRNA双链体的单次鞘内(IT)给药后，非人类灵长类动物(NHP)的各种脊髓及脑区中的β-联蛋白siRNA水平。该图示出，在第31天时间点，在所有测试组织中仍存在显著的siRNA水平，尽管siRNA摄取在各种CNS区域之间变化，并且在肝脏中也观察到siRNA。图18显示在第31天在NHP中示例性siRNA双链体的单次鞘内给药后β-联蛋白mRNA沉默的结果。如图所示，靶向β-联蛋白的siRNA缀合物在31天时间点在CNS中(在整个脊髓及脑区中)产生稳固的敲低。图19显示说明在单次IT给药后β-联蛋白siRNA在非人类灵长类动物的整个CNS中的分布的图像。图20显示说明神经元中siRNA摄取的图像。如图所示，MAP2为神经元标志物，并且用siRNA抗体探测β-联蛋白(CTNNB)siRNA。图21显示说明在单次IT给药后定位于小胶质细胞的siRNA缀合物的图像。如图所示，Iba1为小胶质细胞标志物，并且用siRNA抗体探测β-联蛋白(CTNNB)siRNA。图22显示说明在单次IT给药后定位于星形胶质细胞的siRNA缀合物的图像。如图所示，GFAP为星形胶质细胞标志物，并且用siRNA抗体探测β-联蛋白(CTNNB)siRNA。图23比较在大鼠及NHP中在区室标度剂量下观察到的基因沉默活性。
总之，在IT施用后，在大鼠及NHP的CNS中观察到靶mRNA的持久沉默。沉默延长至研究结束。具有不同化学性质的siRNA的进一步优化设计使得效力提高大于10倍。在所检查的所有CNS组织中观察到组织摄取，其中药物水平在ng/g至mg/g范围内。在大鼠及NHP研究中，发现鞘内施用新颖的siRNA缀合物通常具有良好的耐受性。
实例19：亲脂体与siRNA的内部缀合
方案31
Figure BDA0002885421910002451
方案31示出了亲脂体与siRNA双链体内部缀合的合成方案。在方案31中，亲脂部分R可以是C6-C30醇(例如，己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇、十三烷醇、十四烷醇、十五烷醇、十六烷醇、十七烷醇、十八烷醇、油醇、亚油醇、花生四烯醇、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯醇、视黄醇、维生素E、胆固醇等)。
方案32
Figure BDA0002885421910002452
方案32示出了亲脂体与siRNA双链体内部缀合的替代性合成方案。在方案32中，亲脂部分R可以是C6-C30醇(例如，己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇、十三烷醇、十四烷醇、十五烷醇、十六烷醇、十七烷醇、十八烷醇、油醇、亚油醇、花生四烯醇、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯醇、视黄醇、维生素E、胆固醇等)。
实例20：亲脂性部分与siRNA的合成后缀合
方案33
Figure BDA0002885421910002461
方案33示出了亲脂体与siRNA双链体的合成后内部缀合的方案。在方案33中，R或COR＝C6-C30酸(例如，己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、维生素A、维生素E、胆固醇等。COOR＝C6-C30醇(例如，己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇、十三烷醇、十四烷醇、十五烷醇、十六烷醇、十七烷醇、十八烷醇、油醇、亚油醇、花生四烯醇、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯醇、视黄醇、维生素E、胆固醇等)。
方案34
Figure BDA0002885421910002471
方案34示出了亲脂体与siRNA双链体的合成后内部缀合的替代性方案。在方案34中，R、COR或COOR＝C6-C30酸(例如，己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、维生素A、维生素E、胆固醇等)。COOR＝C6-C30醇(例如，己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇、十三烷醇、十四烷醇、十五烷醇、十六烷醇、十七烷醇、十八烷醇、油醇、亚油醇、花生四烯醇、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯醇、视黄醇、维生素E、胆固醇等)。
实例21：小鼠内部脂质缀合物的SAR
在小鼠中研究具有亲脂性内部缀合的siRNA的结构活性关系。此实例中的序列显示于下表7中。
表7
Figure BDA0002885421910002472
Figure BDA0002885421910002481
Figure BDA0002885421910002491
小鼠1号内部脂质缀合物的SAR。图24显示在以3μg或7.5μg的剂量施用表7中所示的各种示例性siRNA双链体后，在第14天小鼠眼中TTR mRNA水平的结果。如上表7中所示，siRNA是通过在有义链的内部位置缀合亲脂性部分(油基、C16、C14、C12或C10)来修饰的。如图24中所示，具有亲脂性缀合的siRNA的TTR敲低能力为：油基(C18)≥C16>C14>C12>C10。此结果说明疏水性对siRNA的基因沉默活性的影响。
Figure BDA0002885421910002492
小鼠2号内部脂质缀合物的SAR。图25显示在以7.5μg的剂量施用表7中所示的各种示例性siRNA双链体后，在第14天小鼠眼中TTR mRNA水平的结果。如图25所示，与油基(C18)、花生四烯酸及维生素A缀合物缀合的siRNA具有比其他缀合物更好的TTR敲低能力。
Figure BDA0002885421910002501
小鼠中具有内部C16缀合物的5’AS链SAR。图26显示在以7.5μg的剂量玻璃体内施用表7中所示的各种示例性siRNA双链体后，在第14天小鼠眼中TTR mRNA水平的结果。如上表7中所示，siRNA是通过缀合在有义链的内部位置的亲脂性部分(C16)及在反义链的5’端的各种修饰(例如，2个手性PS；2’-OMe；VP；1个手性PS；PO3；DNA；RNA；2’-F；磷酸酯前药)来修饰。
Figure BDA0002885421910002502
参考文献
本文提及的所有公开和专利，包括下面列出的那些条目，特此以全文引用的方式并入，如同各个公开或专利明确地并且独立地指示为以引用的方式并入一样。在有冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。

Claims (56)

1.一种双链iRNA剂，其包含：
与靶基因互补的反义链；
与所述反义链互补的有义链；以及
任选地经由接头或载体与至少一个链上的一个或多个内部位置缀合的一个或多个亲脂性部分。
2.如权利要求1所述的双链iRNA剂，其中通过logKow测量的该亲脂性部分的亲脂性超过0。
3.如权利要求1所述的双链iRNA剂，其中通过该双链iRNA剂的血浆蛋白结合测定中的未结合分数测量的该双链iRNA剂的疏水性超过0.2。
4.如权利要求3所述的双链iRNA剂，其中该血浆蛋白结合测定是使用人类血清白蛋白的电泳迁移率变化测定。
5.如权利要求1所述的双链iRNA剂，其中这些内部位置包括除该链各端的末端两个位置之外的所有位置。
6.如权利要求5所述的双链iRNA剂，其中这些内部位置包括除该链各端的末端三个位置之外的所有位置。
7.如权利要求5或6所述的双链iRNA剂，其中这些内部位置不包括该有义链的裂解位点区。
8.如权利要求7所述的双链iRNA剂，其中这些内部位置不包括从该有义链的5’端计数的位置9-12。
9.如权利要求7所述的双链iRNA剂，其中这些内部位置不包括从该有义链的3’端计数的位置11-13。
10.如权利要求5或6所述的双链iRNA剂，其中这些内部位置不包括该反义链的裂解位点区。
11.如权利要求10所述的双链iRNA剂，其中这些内部位置不包括从该反义链的5’端计数的位置12-14。
12.如权利要求5或6所述的双链iRNA剂，其中这些内部位置不包括该有义链上从3’端计数的位置11-13以及该反义链上从5’端计数的位置12-14。
13.如权利要求1所述的双链iRNA剂，其中一个或多个亲脂性部分与以下内部位置中的一个或多个缀合：从各链的5’端计数，有义链上的位置4-8和13-18，以及反义链上的位置6-10和15-18。
14.如权利要求13所述的双链iRNA剂，其中一个或多个亲脂性部分与以下内部位置中的一个或多个缀合：从各链的5’端计数，该有义链上的位置5、6、7、15和17，以及该反义链上的位置15和17。
15.如权利要求1至14中任一项所述的双链iRNA剂，其中所述有义链以及反义链的长度各自为15至30个核苷酸。
16.如权利要求1至14中任一项所述的双链iRNA剂，其中所述有义链以及反义链的长度各自为19至25个核苷酸。
17.如权利要求1至14中任一项所述的双链iRNA剂，其中所述有义链以及反义链的长度各自为21至23个核苷酸。
18.如权利要求17所述的双链iRNA剂，其中该有义链的长度为21个核苷酸，并且这些反义链的长度为23个核苷酸，其中这些链形成21个连续碱基对的双链区并且在3’端具有2个核苷酸长的单链突出端。
19.如权利要求1所述的双链iRNA剂，其中该亲脂性部分是脂肪族、脂环族或聚脂环化合物。
20.如权利要求19所述的双链iRNA剂，其中该亲脂性部分是脂质、胆固醇、视黄酸、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪。
21.如权利要求19所述的双链iRNA剂，其中该亲脂性部分含有饱和或不饱和C4-C30烃链以及选自由以下组成的组的任选的官能团：羟基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、叠氮基以及炔烃。
22.如权利要求21所述的双链iRNA剂，其中该亲脂性部分含有饱和或不饱和C6-C18烃链。
23.如权利要求22所述的双链iRNA剂，其中该亲脂性部分含有饱和或不饱和C16烃链。
24.如权利要求1至23中任一项所述的双链iRNA剂，其中该亲脂性部分经由载体缀合，该载体替换该一个或多个内部位置中的一个或多个核苷酸。
25.如权利要求24所述的双链iRNA剂，其中该载体是选自由以下组成的组的环状基团：吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基以及十氢化萘基；或是基于丝氨醇主链或二乙醇胺主链的非环状部分。
26.如权利要求1至25中任一项所述的双链iRNA剂，其中该亲脂性部分经由接头与该双链iRNA剂缀合，该接头含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、酰胺、马来酰亚胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺酰胺键、点击反应的产物或氨基甲酸酯。
27.如权利要求1至26中任一项所述的双链iRNA剂，其中所述iRNA剂在这些末端中的至少一个上包含单链突出端。
28.如权利要求27所述的双链iRNA剂，其中所述单链突出端的长度为1、2或3个核苷酸。
29.如权利要求1至28中任一项所述的双链iRNA剂，其中该亲脂性部分与核碱基、糖部分或核苷间键缀合。
30.如权利要求1至29中任一项所述的双链iRNA剂，其进一步包含在该反义链的5’端的磷酸酯或磷酸酯模拟物。
31.如权利要求30所述的双链iRNA剂，其中该磷酸酯模拟物是5’-乙烯基膦酸酯(VP)。
32.如权利要求1至31中任一项所述的双链iRNA剂，其进一步包含靶向配体，该靶向配体靶向介导向CNS组织递送的受体。
33.如权利要求32所述的双链iRNA剂，其中该靶向配体选自由以下组成的组：血管肽-2、脂蛋白受体相关蛋白(LRP)配体、bEnd.3细胞结合配体、运铁蛋白受体(TfR)配体、甘露糖受体配体、葡萄糖转运蛋白以及LDL受体配体。
34.如权利要求1至31中任一项所述的双链iRNA剂，其进一步包含靶向配体，该靶向配体靶向介导向眼组织递送的受体。
35.如权利要求34所述的双链iRNA剂，其中该靶向配体选自由以下组成的组：反式视黄醇、RGD肽、LDL受体配体以及基于碳水化合物的配体。
36.如权利要求35所述的双链iRNA剂，其中该RGD肽为H-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-Cys-OH或Cyclo(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)。
37.如权利要求1至36中任一项所述的双链iRNA剂，其进一步包含靶向肝组织的靶向配体。
38.如权利要求37所述的双链iRNA剂，其中该靶向配体是GalNAc缀合物。
39.如权利要求1至38中任一项所述的双链iRNA剂，其中该亲脂性部分或靶向配体经由选自由以下组成的组的生物可裂解接头缀合：DNA，RNA，二硫化物，酰胺，半乳糖胺、葡糖胺、葡萄糖、半乳糖、甘露糖的官能化单糖或寡糖，以及其组合。
40.如权利要求1至39中任一项所述的双链iRNA剂，其中该有义链的3’端经由端帽受保护，该端帽是具有胺的环状基团，所述环状基团选自由以下组成的组：吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基以及十氢化萘基。
41.一种降低细胞中靶基因的表达的方法，该方法包括使所述细胞与双链iRNA剂接触，该双链iRNA剂包含：
与靶基因互补的反义链；
与所述反义链互补的有义链；以及
任选地经由接头或载体与至少一个链上的一个或多个内部位置缀合的一个或多个亲脂性部分。
42.如权利要求41所述的方法，其中该细胞为肝外细胞。
43.如权利要求41所述的方法，其中通过logKow测量的该亲脂性部分的亲脂性超过0。
44.如权利要求41所述的方法，其中通过该双链iRNA剂的血浆蛋白结合测定中的未结合分数测量的该双链iRNA剂的疏水性超过0.2。
45.如权利要求44所述的方法，其中该血浆蛋白结合测定是使用人类血清白蛋白的电泳迁移率变化测定。
46.如权利要求41所述的方法，其中该亲脂性部分含有饱和或不饱和C16烃链。
47.一种降低受试者内靶基因的表达的方法，该方法包括向该受试者施用双链iRNA剂，该双链iRNA剂包含：
与靶基因互补的反义链；
与所述反义链互补的有义链；以及
任选地经由接头或载体与至少一个链上的一个或多个内部位置缀合的一个或多个亲脂性部分。
48.如权利要求47所述的方法，其中该双链iRNA剂是肝外施用。
49.如权利要求48所述的方法，其中该双链iRNA剂是鞘内施用。
50.如权利要求49所述的方法，其中该方法降低脑或脊柱组织中靶基因的表达。
51.如权利要求50所述的方法，其中该脑或脊柱组织选自由以下组成的组：皮质、小脑、颈椎、腰椎以及胸椎。
52.如权利要求48所述的方法，其中该靶基因选自由以下组成的组：APP、ATXN2、C9orf72、TARDBP、MAPT(Tau)、HTT、SNCA、FUS、ATXN3、ATXN1、SCA1、SCA7、SCA8、MeCP2、PRNP、SOD1、DMPK以及TTR。
53.如权利要求52所述的方法，其中该双链iRNA剂是玻璃体内施用。
54.如权利要求53所述的方法，其中该方法降低眼组织中靶基因的表达。
55.一种治疗患有CNS障碍的受试者的方法，该方法包括：
向该受试者施用治疗有效量的如权利要求1至40中任一项所述的双链RNAi剂，从而治疗该受试者。
56.如权利要求55所述的方法，其中该CNS障碍选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞叶型痴呆、亨廷顿病、帕金森病、脊髓小脑病、朊病毒病以及拉福拉病。
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